BR112017007923B1

BR112017007923B1 - Método para produzir manipulação genética mediada por reações multiplex com rna em uma célula receptora, construção de ácido nucleico,cassete de expressão, vetor, célula receptora e célula geneticamente modificada

Info

Publication number: BR112017007923B1
Application number: BR112017007923-2A
Authority: BR
Inventors: Yinong Yang; Kabin Xie
Original assignee: The Penn State Research Foundation
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2023-12-12
Also published as: BR112017007923A2; WO2016061481A1; US11702667B2; CN107027313A; CA2964796A1; EP3207139A1; CN107027313B; US20190330647A1; US10308947B2; US20160264981A1; CA2964796C

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR MANIPULAÇÃO GENÉTICA MEDIADA POR REAÇÕES MULTIPLEX COM RNA EM UMA CÉLULA RECEPTORA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR, CÉLULA RECEPTORA, CÉLULA GENETICAMENTE MODIFICADA, TECIDO, PLANTA OU ANIMAL, PROGÊNIE DE PLANTA OU ANIMAL E MÉTODO PARA MODIFICAR UM SÍTIO ALVO NO GENOMA DE UMA CÉLULA. A invenção inclui materiais e métodos para gerar numerosos pequenos RNAs a partir de uma construção polinucleotídica (gene sintético) para facilitar a reação multiplex guiada por RNA na edição de genoma, modificação, inibição de expressão e outras tecnologias com base no RNA. A construção do gene/polinucleotídeo sintético codifica componentes de RNA policistrônicos separados pelo RNAt e, preferencialmente, também inclui componentes regulatórios, tais como um promotor ou terminador para formar um cassete de expressão. Uma vez transcrito em uma célula, o transcrito é processado pela célula a múltiplas moléculas de RNA pelo sistema de processamento endógeno de RNAt. O sistema pode ser aplicado para qualquer método de manipulação de genes baseado no RNA, incluindo a edição de genoma mediada por RNA, silenciamento de genes mediado por microRNA artificial, manipulação genética por RNA mediada por pequenos RNAs, silenciamento de genes de RNA dupla fita, mecanismos antisense e semelhantes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Esta invenção refere-se à métodos para alvejar genes e editar genomas no campo da biologia molecular e da engenharia genética. Mais especificamente, a invenção descreve o uso do sistema de processamento do RNAt para permitir a engenharia de genomas guiado por, ou com base em reações multiplex com RNA.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Metodologias para alvejar genes ou editar precisamente o genoma são de grande importância para a caracterização funcional de genes de plantas ou animais. Há poucos anos, nucleases com especificidade de sequências foram desenvolvidas para aumentar a eficiência de alvejar genes ou editar genomas em sistemas animais ou microbianos.

[0003] Recentemente, uma nova ferramenta de edição de genoma foi desenvolvida em sistemas microbianos e de mamíferos com base no sistema de nucleases associadas à agrupamentos regularmente espaçados de repetições palindrômicas curtas (CRISPR). A nuclease associada à CRISPR é parte da imunidade adaptativa em bactéria e em Archea. A endonuclease Cas9, um componente do sistema CRISPR/Cas de Streptococcus pyogenes do tipo II, forma um complexo com duas moléculas curtas de RNA chamadas CRISPR RNA (crRNA) e crRNA transativadora (transcrRNA), que guia a nuclease para clivar DNA não-próprios em ambas fitas em sítio específico. O heterodúplex crRNA- transcrRNA poderiam ser substituídos por um RNA quimérico (assim chamado de RNA guia (RNAg)), o qual pode ser programado para alvejar sítios específicos. A restrição mínima para programar RNAg-Cas9 é, pelo menos, o pareamento de 15 bases entre a 5’-RNA construído e o DNA alvo sem erro de pareamento, e um motivo NGG (assim chamado de motivo adjacente protoespaçador ou MAP) segue a região de pareamento entre as bases na sequência do DNA alvo. Geralmente, é usado de 15-22 nt na ponta 5’ da região do RNAg para dirigir a nuclease Cas9 para produzir o pareamento fita dupla no sítio específico. O sistema CRISPR/Cas tem sido demonstrado para editar o genoma de humano, camundongo, peixe-zebra, levedura e bactéria. Diferente de células animais, leveduras ou bacterianas, com as quais moléculas recombinantes (DNA, RNA ou proteína) poderiam ser diretamente transformadas para edição de genoma mediado por Cas9, o plasmídeo de DNA recombinante é tipicamente introduzido nas células vegetais via transformação mediada por Agrobacterium, bombardeamento biolística, ou transformação por protoplastos, devido à presença da parede celular. Desta forma, ferramentas moleculares especializadas e métodos precisam ser criados para facilitar a construção de DNA plasmidial e sua introdução, assim como a expressão eficiente de Cas9 e RNAgs para edição de genomas em células vegetais ou animais. Composições e métodos para produzir e usar o sistema CRISPR-Cas estão descritos na patente U.S. No. 8,697,359, intitulada "CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS", a qual está incorporada aqui em sua totalidade.

[0004] Em princípio, a manipulação genética multiplex poderia ser obtida pela expressão de múltiplos RNAgs com Cas9 (ou efetores derivados de Cas9) para os sítios alvo correspondentes. Devido às limitações com métodos de introdução e capacidade dos atuais dispositivos de expressão de RNAg no entanto, a produção numerosa simultânea de RNAgs em organismos vegetais, animais ou microbianos é ainda um desafio.

[0005] É um objetivo da presente invenção prover uma estratégia para usar o sistema de processamento celular endógeno do RNAt como abordagem eficiente e precisa para produzir numerosos RNAgs a partir de um único gene sintético/construção polinucleotídica, desta forma, aprimorando a capacidade de edição multiplex de CRISPR/Cas9 ou de outras ferramentas de manipulação genética mediada por RNA para engenharia genômica.

[0006] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se à uma construção de polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor ou célula receptora modificada compreendendo um ácido nucleico como descrito, supra.

[0007] É ainda um objetivo, característica ou vantagem da presente invenção prover composições ou métodos para manipular múltiplos genes alvo, ou múltiplas posições dentro de um único alvo gene com a introdução de um único cassete de expressão, que inclui sequências para utilizar o sistema do RNAt na célula receptora.

[0008] Objetivos adicionais, características e vantagens podem tornar-se óbvias baseados na divulgação aqui contida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] Os requerentes têm produzido materiais e métodos para produzir numerosos pequenos RNAs a partir de uma única construção polinucleotídica (gene sintético) para facilitar a edição multiplex de genomas, inibição da expressão, modificação genética e epigenética guiadas por RNA, e outras tecnologias baseadas no RNA. A construção sintética gene/polinucleotídeo codifica componentes policistrônicos de RNA separados por RNAst, e preferencialmente também inclui componentes regulatórios, tais como um promotor ou terminador para formar um cassete de expressão. Uma vez transcrito em uma célula, o transcrito é processado pela célula em múltiplas moléculas de RNA pelo sistema de processamento endógeno do RNAt.

[0010] Métodos da invenção podem ser usados para melhorar qualquer edição de genoma e tecnologia moduladora baseado no RNA, permitindo a geração e separação de reações multiplex com RNA com uma única construção polinucleotídica, e pelo sistema de processamento endógeno do RNAt. Tais métodos podem incluir, mas não estão limitados a, edição de genoma mediado por Cas9, silenciamento gênico mediado por microRNA artificial, e outros mecanismos mediados por RNA e seus semelhantes.

[0011] De acordo com a invenção, um método para produzir manipulação genética multiplex com RNA em uma célula receptora inclui prover uma sequência polinucleotídica heteróloga para manipulação genética mediada por duas ou mais sequências de RNA em tandem, com uma ou mais sequências de clivagem do RNAt (pré-RNAt). O polinucleotídeo é introduzido na célula receptora por quaisquer das numerosas técnicas padrão, e após a expressão, o sistema de processamento do RNAt da referida célula receptora cliva o polinucleotídeo heterólogo nas sequências do RNAt. Em particular, a invenção provê as sequências de clivagem do RNAt para a atividade nucleolítica do RNA, tais como no splicing do pré-RNAt, na atividade de endonuclease da ponta 3’ do pré-RNAm, na atividade de clivagem do pré-RNAt, e/ou na atividade de clivagem do RNA pré- ribossomal. As sequências de manipulação genética do RNA e as sequências de clivagem do RNA estão operacionalmente ligadas às sequências regulatórias para expressão em uma célula receptora, tais como sequências promotoras e terminadoras.

[0012] Uma sequência de clivagem do RNAt inclui qualquer sequência e/ou motivo estrutural que interage ativamente com, e é clivado por, um sistema endógeno do RNAt da célula, tais como RNAse P, RNAse Z e RNAse E (bactérias). Isto pode incluir elementos de reconhecimento estrutural, tais como uma cauda aceptora, braço D-loop, T Psi C loop, assim como motivos específicos de sequências. Existem numerosas sequências ativas de RNAt, e motivos conhecidos e disponíveis aos especialistas na arte através de fontes, tais como o programa tRNA-SE disponível no site lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/ ou, no site trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/Organisms (para todos os organismos), ou, no site plantrna.ibmp.cnrs.fr/ (para plantas). Vários artigos e recursos no Genbank estão também disponíveis e são citados aqui.

[0013] A invenção também inclui construções polinucleotídicas para manipulação genética multiplex com RNA, construções de expressão, vetores e células receptoras que tenham sido manipuladas. As construções compreendem uma sequência polinucleotídica que codifica duas ou mais sequências para manipulação genética mediada por RNA, em tandem, com uma sequência que codifica uma sequência de clivagem do RNAt. Em uma forma de realização, a sequência de manipulação genética mediada por RNA inclui um RNA guia para a edição do genoma mediada por CAS9. O RNA guia, ou RNAg é introduzido junto com uma endonuclease, neste caso, a nuclease (Cas) associada à CRISPR, Cas9. O RNA guia provê a sequência scaffold e espaçadora complementares ao sítio alvo. Em outra realização, a sequência de RNA para manipulação genética é um RNA de interferência, tal como um siRNA, ou uma sequência de microRNA desenhada para o silenciamento gênico, de acordo com os métodos convencionais na técnica. A construção também inclui uma ou mais sequências de clivagem do RNAt, as quais podem ser processadas ativamente pelo sistema de clivagem do RNAt endógeno dentro da célula. A construção é preferencialmente uma construção de expressão ou gene sintético que inclui sequências promotoras e terminadoras. Surpreendentemente, o requerente verificou que, quando utilizado com um sistema CRISPR, os componentes de clivagem do RNA proporcionam uma expressão até trinta vezes mais elevada, provavelmente devido a elementos promotores de RNAt internos.

[0014] A invenção inclui também células e progênies das mesmas que foram geneticamente manipuladas, tais células podem incluir inserções ou deleções genômicas ou manipulação da expressão gênica por silenciamento de genes. A progênie de tais células pode ser utilizada para desenvolver linhagens e materiais de reprodução de plantas e animais. Em algumas formas de realização, as células são células humanas.

[0015] Enquanto que múltiplas formas de realização sejam reveladas, ainda outras formas de realização da presente invenção tornam-se evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição detalhada que se segue, que mostra e descreve formas de realização ilustrativas da invenção. Consequentemente, os desenhos e a descrição detalhados devem ser considerados como ilustrativos por natureza e não restritivos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

[0016] Figura 1. Engenharia do sistema de RNAt endógeno para a edição multiplex do genoma com CRISPR/Cas9. (A) O pré-RNAt eucariótico com a cauda líder 5 ' e uma cauda final 3' é clivado pela RNase P e pela RNase Z em locais específicos. (B) Transcrição do gene de RNAt com RNA polimerase III (Pol III). Os elementos do box A e do box B no gene de RNAt funcionam como elementos transcricionais internos e estão ligados pelo fator de transcrição IIIC (TFIIIC), que recruta TFIIIB, e Pol III para iniciar a transcrição. (C) Representação esquemática do método PTG/Cas9 para alvejar simultaneamente múltiplos sítios. O PTG sintético consiste de unidades RNAt-RNAg dispostas em tandem com cada RNAg contendo espaçador específico do alvo (marcado como diamante com cor diferente) e, sequências scaffold conservadas de RNAg (retângulo). O RNAt contendo os elementos box A e box B são apresentados como retângulos redondos. O transcrito primário de PTG é clivado pela RNase P endógena e RNase Z (marcada como tesoura) para liberar RNAgs maduros e RNAt (linhas vermelhas de estrutura em trevo). Os RNAgs maduros excisados direcionam Cas9 para múltiplos alvos.

[0017] Figura 2. Excisão precisa de RNAgs funcionais in vivo a partir de genes PTG sintéticos. (A) A arquitetura de dois genes sgRNA e quatro PTGs para produzir um RNAg. (B) Sequência e estrutura secundária de RNA predita da fusão RNAt-RNAg-RNAt do gene PTG (SEQ ID NO: 87). As bases da região do RNAt são indicadas com cor vermelha e, a extremidade 5' líder do RNAt é mostrado em letra minúscula. O RNAg é indicado em preto e a sequência espaçadora de RNAg é apresentada como N. (C-F) Exame de RNAgs maduros produzidos a partir de sgRNA ou PTGs com cRT- PCR. Os RNAs totais dos protoplastos que expressam o vetor vazio foram utilizados como controle (CK). As setas indicam RNAgs maduros amplificados por cRT-PCR, e os asteriscos indicam os RNAr amplificados não especificamente. (G) Resumo dos locais de excisão em PTG (SEQ ID NO: 88), de acordo com as extremidades de RNAg mapeadas a partir de cRT-PCR (Ver Apêndice SI, Figuras S3-S5). As setas indicam os locais de clivagem em PTG para liberar RNAg. As extremidades 5 'do RNAg maduro foram excisadas do PTG exatamente no sítio de fusão RNAt-RNAg em todos os resultados de cRT-PCR, enquanto que as suas extremidades 3' trocaram 1-4 nt com a cauda 5' líder do RNAt (letras minúsculas). (H) RNAg produzido a partir de U3p: sgRNA (SEQ ID NO: 89). Todos os U3p:sgRNA detectados produziram RNAg que iniciam com o ribonucleotídeo A e terminaram com múltiplos Us. (I) Introdução de indels nos locais desejados por PTG1:Cas9 ou PTG2:Cas9 em protoplastos de arroz como mostrado por PCR/RE. As setas indicam fragmentos mutados resistentes à digestão com RE. A freqüência indel é indicada na parte inferior. (J) Expressão relativa de sgRNA1/2 e PTG1/2 em protoplastos de arroz. Os dados representam a média ± DP. ND, não detectado. CK, controle com vetor vazio.

[0018] Figura 18. Mapa esquemático do vetor de pSico-RNAssg- EF1a-mCherry-T2A-Cas9. A sequência guia ou os genes PTG podem ser expressos após a inserção nos sítios de BbsI deste vetor. As letras vermelhas indicaram as caudas no sítio de clonagem.

[0019] Figura 19. Os RNAgs maduros com as sequências guia desejadas foram precisamente produzidos a partir de genes hPTG. (A) Eletroforese de produtos de cRT-PCR em gel de acrilamida. A seta vermelha indica os RNAgs maduros produzidos a partir de hPTG1 e hPTG2. Vec, controle do vetor vazio. (B) Cromatografia de sequências maduras de RNAg, como revelado por cRT-PCR e sequenciamento de DNA. A seta indica o primeiro nucleotídeo na cauda 5 'de RNAgs maduros. (C) O local de clivagem mapeado em hPTG1 e hPTG2, de acordo com resultados de cRT-PCR. A tesoura indica o local clivado do sistema de processamento de RNAt. Letra azul, RNAt; Letra vermelha, sequência guia de RNAg; Letra minúscula, sequência scaffold de RNAg; Sublinhado, terminador Pol III.

[0020] Figura 20. Deleção seletiva de fragmento cromossômico no loci HDAC. (A e B) a deleção de fragmentos cromossômicos foram revelados por produtos de PCR truncados (indicados por setas) nos respectivos loci de HDAC em células humanas que expressam as construções de Cas9-hPTG. (C) Eficiência da deleção de construções de hPTG expressando número diferente de RNAgs.

[0021] Figura 21. Sequências de DNA dos amplicons com as deleções cromossômicas nos loci do gene HDAC.

[0022] Figura 22. Diagrama esquemático de um sistema de processamento de genes policristrônicos de RNAt-RNAg (PTG) e desenho de PTGs para alvejar quatro MPKs de arroz. A: Um gene de RNAt-RNAg policistrônico (PTG) consiste em repetições de RNAt-RNAg em tandem com um promotor Pol III para iniciar a transcrição, que é interrompida por um terminador Pol III. A RNase P e a RNase Z endógenas da célula podem reconhecer a estrutura secundária do RNAt dentro do transcrito primário e cortar múltiplos RNAgs funcionais do transcrito. Os RNAgs processados podem se complexar com a endonuclease Cas9 para alvejar simultaneamente múltiplos sítios genômicos independentes. B: Oito RNAgs foram desenhados para alvejar quatro genes MPK de arroz proximamente relacionados para nocaute do gene. A deleção cromossômica pode ocorrer em cada gene em adição à pequenas inserções e deleções de fragmentos de nucleotídeos por end-joining não-homólogo porque cada gene é alvo de dois RNAgs. C: Um total de oito PTG co-expressando de um a oito RNAgs foram utilizados neste estudo. PTG2 e PTG6 têm como alvo MPK5. PTG3, PTG4 e PTG5 têm como alvo MPK1, MPK2 e MPK6, respectivamente. PTG7 e PTG8 têm como alvo MPK1/MPK5 e MPK2/MPK6 para criar mutantes duplos. PTG9 co-expressou oito RNAgs para alvejar simultaneamente todos os quatro genes MPK.

[0023] Figura 23. Plantas de arroz da geração T1 de quatro linhagens PTGb9 carregam oito mutações bialélicas em quatro genes. A: Detecção de mutações em cinco sítios via ensaio de PCR-RE. O produto de PCR do DNA mutado não pode ser digerido pela enzima de restrição apropriada (RE; nome azul e sublinhado em B). Os produtos de PCR dos genes correspondentes em todas as quatro plantas T1 são resistentes à digestão (seta vermelha) e as tesouras indicam mutações indel nestes locais. Note que MPK2 possui dois sítios EcoNI e a digestão dos produtos de PCR, a partir do DNA mutado, produz duas bandas ao invés de vez de três bandas como no DNA controle do tipo selvagem. CK: DNA controle tipo selvagem. B: mutações indel exatas em todos os oito sítios alvo nas plantas T1 de quatro linhagens PTGb9. As sequências foram obtidas por sequenciamento direto do produto de PCR ou clones TA, no caso das sequências mpk6 para as plantas 1-2. Letras maiúsculas menores a e b atrás do número da planta indicam alelos diferentes. As sequências mostram que os sítios RE (sublinhado azul) e todos os sítios alvo restantes são mutados. As tesouras indicam o sítio DSB previsto com 3 pb acima do MAP (marcado em letras vermelhas). As sequencias protespaçadoras usadas para alvo são destacadas em verde. Os traços indicam nucleotídeos deletados quando comparados com o tipo selvagem, e as letras minúsculas indicam nucleotídeos inseridos ou substituídos. MPK1 WT (SEQ ID NO: 79); MPK1 1-2a (SEQ ID NO: 135); MPK1 1-2b (SEQ ID NO:136); MPK1 2-1 (SEQ ID NO:137); MPK1 3-2a (SEQ ID NO:138); MPK1 3-2b (SEQ ID NO:139); MPK1 4-2 (SEQ ID NO:140); MPK2 WT (SEQ ID NO:81); MPK2 1-2 (SEQ ID NO:141); MPK2 2-1 (SEQ ID NO:142); MPK2 3-1 (SEQ ID NO:143); MPK2 4-2 (SEQ ID NO:144); MPK2 4-2b (SEQ ID NO:145);MPK5 WT (SEQ ID NO: 82); MPK5 1-2 (SEQ ID NO:146); MPK5 2-1 (SEQ ID NO:147); MPK5 3-2 (SEQ ID NO:148); MPK5 4-2 (SEQ ID NO:149); MPK6 WT (SEQ ID NO:84); MPK6 1-2a (SEQ ID NO:150); MPK6 1-2b (SEQ ID NO:151); MPK6 2-1 (SEQ ID NO:152); MPK6 3-2 (SEQ ID NO:153); MPK6 4-2a (SEQ ID NO:154); MPK6 4-2b (SEQ ID NO:155).

[0024] Figura 24. Inserções e deleções induzidas por PTG/Cas9 e sua frequência. O resumo é mostrado das mutações indel detectadas e o quão frequentes foram observadas em uma amostra de 54 sequências de eventos mutacionais independentes. O box inserido mostra as frequências calculadas de todas as inserções versus todas as deleções.

[0025] Figura 25. Herança da deleção cromossômica em plantas da geração T1 e T2. A: Detecção do comprimento total (MPK5) e dos alelos de deleção cromossômica (Δ) em plantas mutantes da geração T0. Uma deleção cromossômica no locus de MPK5 alvo é mostrada por um produto de PCR truncado (seta azul) em comparação com um produto de PCR de comprimento total (seta verde). As linhagens 5, 4 e 6 são heterozigóticas para a deleção, como indicado pela amplificação do produto de PCR completo e truncado. B: Herança da deleção cromossômica na geração T1. Note que cada planta 4-2 e 6-1 herdou apenas um dos dois alelos e tornou-se homozigótica. C: Herança da deleção fixa na geração T2. Apenas o produto de PCR truncado que indica a deleção foi detectado na progênie da planta 6-1. CK: DNA controle tipo selvagem.

[0026] Figura 26. Mutações no locus MPK1 e MPK6 tendem a preservar o quadro aberto de leitura (ORF) da sequência. A: Frequência de mutações que preservam a ORF versus mutações que não preservam em oito sítios alvo em quatro genes PTGb9 em plantas T1. B: Frequência de mutações que preservam a ORF quando considerando apenas sítios alvo em éxons. C: Sequência predita da proteína MPK1 dos alelos mutantes (em letras minúsculas) (SEQ ID NOs 156-158) em comparação com a sequência do tipo selvagem (letras maiúsculas) (SEQ ID NO: 80). As mutações em MPK1 deletam de um a cinco aminoácidos na proteína MPK1, mas mantêm os domínios kinase preditos da proteína intactos, que começam no aminoácido 67 na proteína do tipo selvagem. D: Sequência predita de proteína MPK5 dos alelos mutantes (SEQ ID NOs 159-162) em comparação com a sequência do tipo selvagem (SEQ ID NO: 83). As mutações em todos os alelos produzem uma parada prematura da sequência da proteína antes dos domínios da proteína quinase preditos da proteína do tipo selvagem, iniciando a partir do aminoácido 35. E: Plantas da geração T0 PTGb3 a partir de calos homozigóticos para deleção cromossômica em MPK1, em comparação com um vetor controle vazio. As plantas maduras 4-A e 4-B permaneceram gravemente anãs e estéreis, em comparação com o controle. A barra de escala é de 5 cm na foto principal e de 1 cm no inserto magnificado.

[0027] Figura 27. Diagrama esquemático mostrando que os sítios alvos de quatro genes MPK. Os retângulos em branco indicam as regiões 5 ' não traduzida do primeiro éxon, e os retângulos preenchidos com preto, indicam os éxons codificantes da proteína. As regiões protospaçadoras usadas como sítios alvo para os RNAgs são marcadas com barras vermelhas. Os locais de enzimas de restrição utilizados para a detecção de eventos de mutação em ensaios PCR-RE estão marcados com barras azuis. Note que MPK2 possui dois sítios EcoNI e a digestão do produto de PCR a partir de DNA mutado produz duas bandas, ao invés de três bandas. Os primers usados para amplificação das regiões alvo estão marcadas com setas pretas.

[0028] Figura 28. Detecção de mutagênese em calos PTGb3 e nas linhagens PTGb5 de plantas. A: A edição bem sucedida e completa de MPK1 em quatro peças de calos transgênicos independentes foi confirmada pelo ensaio PCR-RE (seta vermelha). O calo da linhagem 4 carrega uma deleção cromossômica em MPK1, como mostrado pelo produto de PCR truncado (Δ). B: O ensaio PCR-RE confirmou a edição bem sucedida e completa de MPK6 em plantas PTGb5 da geração T0, à medida que o produto de PCR é indigerível (seta vermelha). CK: DNA controle tipo selvagem.

[0029] Figura 29. Detecção de mutagênese nas linhagens das plantas PTGb2 e PTGb4. A: O ensaio de PCR-RE confirmou a edição bem sucedida e completa no locus MPK5 de plantas PTGb2 transformadas já que o produto de PCR de todas as nove linhagens independentes foi resistente à digestão com a enzima apropriada (seta vermelha). B: Similarmente, os ensaios de PCR-RE confirmaram a edição completa de MPK2 de todas as treze linhagens examinadas de PTGb4. Note que MPK2 possui dois sítios EcoNI e a digestão de produto de PCR a partir de DNA mutado produz duas bandas, e que o padrão de banda incomum das linhagens 9, 10 e 13 é o resultado de deleções mais longas no locus MPK2. C: Produto de PCR não digerido das linhagens 9 a 13. O produto de PCR truncado (Δ) detectado nas linhagens 9, 10 e 13 indica deleções cromossômicas. CK: DNA controle tipo selvagem.

[0030] Figura 30. Detecção de mutagênese nas linhagens PTGb8. A banda resistente à digestão (setas vermelhas) no locus MPK6 e MPK2 indicam linhagens com edição do genoma bem sucedida. Note que o número total de linhagens com edição bem sucedida poderia teoricamente ser mais elevado, visto que apenas dois dos quatro sítios alvo de RNAg poderiam ser examinados por ensaio PCR-RE, e que a MPK2 possui dois sítios EcoNI e, a digestão do produto de PCR do DNA mutado produz duas bandas. Os boxes verdes indicam linhagens transgênicas que possuem mutações simultâneas em ambos sítios e são linhagens putativas duplo nocautes MPK6/MPK2. CK: DNA controle tipo selvagem.

[0031] Figura 31. Plantas T1 livres de transgênes de linhagens PTGb9. A presença do dispositivo de edição genômica (U3:PTG e um fragmento de 1 kb de Cas9) foi triada em plantas T0 e T1 de linhagens PTGb9. Enquanto as linhagens T0 contêm uma cópia do dispositivo de edição do genoma nos seus genomas, a autopolinização das linhagens T0 permite a remoção do dispositivo de edição do genoma das plantas da geração T1. Os DNAs genômicos das plantas 2-1, 3-2 e 4-2 (setas azuis) não contêm qualquer fragmento detectável de U3: PTG ou Cas9. O produto controle do PCR foi prontamente amplificado a partir do gene endógeno de arroz LOC_Os05g49730, indicando que os DNAs utilizados têm qualidade suficiente para o PCR. WT: DNA controle tipo selvagem.

[0032] Figura 32. Sequência da deleção cromossômica em MPK5. É mostrado o resultado do sequenciamento do fragmento truncado (Δ) da linhagem 4 de PTGb9 (SEQ ID NO: 163). O DNA foi precisamente ligado nos dois sítios de quebra em dupla fita preditos dos sítios alvo dos protospaçadores (verde destacado, verde sublinhado) a 3 pb após o MAP (letras vermelhas, vermelho sublinhado) produzindo uma deleção cromossômica de 727 pb no locus MPK5.

[0033] Figura 33. Padrão de hereditariedade dos alelos total e truncado de MPK5. Oito plantas T1 da linhagem 4, dez plantas T1 da linhagem 5 e nove plantas T1 da linhagem 6 foram triadas quanto à herança do alelo total (MPK5) ou mpk5 (Δ) truncado. As plantas foram categorizadas em heterozigotos (H), quando contêm ambos os alelos, homozigotos para o completo (F), se apenas o produto de PCR mais longo foi detectado, ou homozigoto para deleção (D), se apenas o produto de PCR truncado fosse detectado. CK: DNA controle tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0034] A tecnologia provê um método para manipular simultaneamente múltiplos genes ou sequências de DNA com base na edição de genomas guiados por RNA ou silenciamento gênico através de um único cassete de expressão polinucleotídico. Geralmente, a edição convencional do genoma, ou a tecnologia de silenciamento de genes, é capaz de manipular apenas um alvo gênico. Os métodos atuais para a edição multiplex de genoma envolvem múltiplos promotores/terminadores e fases de clonagem complicadas.

[0035] A invenção do requerente provê uma abordagem simples, precisa e eficaz para produzir múltiplos pequenos RNAs (ex, RNAg de Cas9, siRNA ou miRNA) in vivo, a partir de uma construção polinucleotídica (gene sintético) e assim equipa as ferramentas atuais (como o sistema CRISPR/Cas9, RNAi) com a habilidade de manipular alvos múltiplos. Como uma plataforma geral, este método também simplifica e melhora a capacidade e a fidelidade da edição de genoma mediado por RNAg:Cas9/Cas9- nickase, RNAg: edição de epigenoma/marcação/ativação/repressão gênica mediada por Cas9 desativadora, silenciamento gênico mediado por RNAds, silenciamento gênico mediado por microRNA artificial e outros pequenos RNAs.

[0036] Em plantas, esta tecnologia pode ser usada para melhorar a produtividade da colheita, qualidade, tolerância ao estresse, resistência a insetos e doenças e/ou resistência a herbicida manipulando simultaneamente múltiplos genes essenciais ou loci de caracteres quantitativos (QTLs). Em animais, esta tecnologia pode ser utilizada para aumentar a fertilidade, a saúde e o bem-estar de animais e ajudar no desenvolvimento de linhagens fundadoras com caracteres melhorados, tais como ganho de peso, eficiência alimentar, etc. Em humanos, esta tecnologia pode facilitar a introdução de múltiplos RNAs mediada por vírus devido ao seu tamanho compacto e, pode ser usado para tratar ou melhorar vários estados patológicos. Uma vez que esta tecnologia é baseada no sistema de processamento do RNAt, que existe em todos os organismos, as suas aplicações na engenharia do genoma estende-se aos micróbios, animais e seres humanos para a biotecnologia industrial e médica.

Definições

[0037] A prática dos métodos, assim como a preparação e uso das composições aqui descritas empregam, a menos quando indicado de outro modo, técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, estrutura e análise de cromatina, química computacional, cultura celular, DNA recombinante e campos relacionados para os especialistas na arte. Estas técnicas são inteiramente explicadas na literatura. Ver por exemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; 3d ed., 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 e atualizações periódicas; a série METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Terceira edição, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P. M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

[0038] Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são utilizados indiferentemente e referem- se a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, na conformação linear ou circular, e na forma de fita simples ou dupla. Para os objetivos da presente divulgação, estes termos não devem ser interpretados como limitantes em relação ao comprimento de um polímero. Os termos podem abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como nucleotídeos que são modificados nas porções da base, no açúcar e/ou no fosfato (por exemplo, esqueletos fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo particular tem a mesma especificidade de pareamento de bases; isto é, um análogo de A fará par de bases com T.

[0039] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados indiferentemente para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. O termo também se aplica a polímeros de aminoácidos, nos quais um ou mais aminoácidos são análogos químicos ou derivados modificados de um aminoácido correspondente que ocorre naturalmente.

[0040] "Ligação" refere-se a uma interação não-covalente específica de sequência entre macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes de uma interação de ligação devem ser específicos da sequência (por exemplo, contatos com resíduos de fosfato em uma estrutura de DNA), desde que a interação como um todo seja específica da sequência. Tais interações são geralmente caracterizadas por uma constante de dissociação (Kd) de 10-6 M-1 ou inferior. "Afinidade" refere-se à força de ligação: a afinidade de ligação aumentada está correlacionada com uma Kd inferior.

[0041] Uma "proteína de ligação" é uma proteína que é capaz de se ligar não covalentemente a outra molécula. Uma proteína de ligação pode ligar-se a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação a DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação a RNA) e/ou uma molécula de proteína (proteína de ligação a proteína). No caso de uma proteína de ligação a proteína, ela pode ligar-se a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode ligar-se a uma ou mais moléculas de uma proteína diferente ou proteínas. Uma proteína de ligação pode ter mais do que um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, as proteínas zinc-finger têm atividade de ligação a DNA, ligação a RNA e de ligação a proteínas.

[0042] O termo "sequência" refere-se a uma sequência de nucleotídeos de qualquer comprimento, que pode ser DNA ou RNA; pode ser linear, circular ou ramificada e pode ser fita simples ou fita dupla. O termo "sequência doadora" refere-se a uma sequência nucleotídica que é inserida em um genoma. Uma sequência doadora pode ser de qualquer comprimento, por exemplo, entre 2 e 10.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer valor inteiro entre eles ou acima), preferencialmente entre cerca de 100 e 1.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer número inteiro entre eles), mais preferencialmente entre cerca de 200 e 500 nucleotídeos de comprimento.

[0043] As técnicas para determinar a identidade da sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos são conhecidas na técnica. Tipicamente, tais técnicas incluem a determinação da sequência nucleotídica do RNAm para um gene e/ou a determinação da sequência de aminoácidos assim codificada, e a comparação destas sequências com uma segunda sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos. As sequências genômicas podem também ser determinadas e comparadas desta forma. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata de nucleotídeos com nucleotídeos, ou aminoácido com aminoácido de duas sequências polinucleotídicas ou sequências polipeptídicas, respectivamente.

[0044] Duas ou mais sequências (polinucleotídeo ou aminoácido) podem ser comparadas determinando a sua percentagem de identidade. A percentagem de identidade de duas sequências, quer sejam sequências de ácidos nucleicos quer seja de aminoácidos, é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências de ácido nucleico é provido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981). Este algoritmo pode ser aplicado nas sequências de aminoácidos usando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, e normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Uma implementação exemplar deste algoritmo para determinar a percentagem de identidade de uma sequência é fornecida por Genetics Computer Group (Madison, Wis.) na aplicação da utilidade "BestFit". Os parâmetros padrão para este método são descritos no Manual Wisconsin Sequence Analysis Package Program, Versão 8 (1995) (disponível a partir de Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Um método preferido para estabelecer a percentagem de identidade no contexto da presente divulgação é utilizar o pacote de programas MPSRCH com direitos autorais da Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok e distribuído pela IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif.). A partir deste conjunto de pacotes, o algoritmo de Smith-Waterman pode ser empregado, no qual os parâmetros predefinidos são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade de abertura de gap de 12, penalidade de extensão de abertura de um, e intervalo de seis). A partir dos dados gerados, o valor "Match" reflete a identidade da sequência. Outros programas adequados para calcular a percentagem de identidade ou similaridade entre sequências são geralmente conhecidos na arte, por exemplo, outro programa de alinhamento é o BLAST, utilizado com os parâmetros predefinidos. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados usando os seguintes parâmetros predefinidos: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Detalhes destes programas podem ser encontrados no seguinte endereço na Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Com relação às sequências aqui descritas, o intervalo de graus desejados de identidade de sequência é de aproximadamente 80% a 100% e qualquer valor inteiro entre eles. Tipicamente, as percentagens de identidade entre sequências são pelo menos 7075%, preferencialmente de 80-82%, mais preferencialmente de 85-90%, ainda mais preferencialmente 92%, ainda mais preferencialmente 95% e mais preferencialmente 98% de identidade de sequência. Alternativamente, o grau de similaridade de sequências entre polinucleotídeos pode ser determinado por hibridação de polinucleotídeos em condições que permitem a formação de dúplex estáveis entre regiões homólogas, seguido por digestão com nucleases de cadeia simples específicas e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Duas sequências de ácido nucleico ou duas sequências polipeptídicas são substancialmente homólogas uma à outra quando as sequências exibem, pelo menos, cerca de 70% - 75%, preferencialmente 80%-82%, mais preferencialmente 85%- 90%, ainda mais preferencialmente 92%, ainda mais preferencialmente 95% e mais preferivelmente 98% de identidade de sequência ao longo de um comprimento definido de moléculas, conforme determinado utilizando os métodos acima. Tal como aqui utilizado, substancialmente homólogo refere-se também às sequências que mostram identidade completa com uma sequência de DNA ou de polipeptídeo especificadas. As sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridação Southern sob, por exemplo, condições estringentes, como definido para esse sistema particular. A definição de condições de hibridação apropriadas está na especialidade da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editores B. D. Hames e S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington DC.; IRL Press).

[0045] A hibridação seletiva de dois fragmentos de ácido nucleico pode ser determinada como se segue. O grau de identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico afeta a eficiência e força dos eventos de hibridação entre tais moléculas. Uma sequência de ácido nucleico parcialmente idêntica inibirá, pelo menos parcialmente, a hibridação de uma sequência completamente idêntica a uma molécula alvo. A inibição da hibridação da sequência completamente idêntica pode ser avaliada utilizando ensaios de hibridação que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Southern blot (DNA), Northern blot (RNA), hibridação em solução ou semelhantes, ver Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, NY). Tais ensaios podem ser conduzidos utilizando graus variados de seletividade, por exemplo, utilizando condições que variam de baixa a alta estringência. Se condições de baixa estringência forem empregadas, a ausência de ligação não específica pode ser avaliada utilizando uma sonda secundária que não possui nem mesmo grau de identidade parcial de sequência (por exemplo, uma sonda com menos de cerca de 30% de identidade de sequência com a molécula alvo), de tal modo que, na ausência de eventos de ligação não específicos, a sonda secundária não hibridiza com o alvo.

[0046] Quando se utiliza um sistema de detecção à base de hibridação, uma sonda de ácido nucleico é escolhida que seja complementar a uma sequência referência de ácido nucleico, e depois, por seleção de condições apropriadas, a sonda e a sequência referência hibridizam seletivamente, ou se ligam uma à outra para formar uma molécula dúplex. Uma molécula de ácido nucleico que é capaz de hibridizar seletivamente a uma sequência de referência em condições de hibridização moderadamente estringentes, tipicamente hibridiza em condições que permitem a detecção de uma sequência ácido nucleico alvo de, pelo menos, cerca de 10-14 nucleotídeos de comprimento possuindo, pelo menos, aproximadamente 70% de identidade de sequência com a sequência da sonda selecionada de ácido nucleico. As condições de hibridação estringentes tipicamente permitem a detecção de sequências alvo de ácido nucleico de, pelo menos, cerca de 10-14 nucleotídeos de comprimento possuindo uma identidade de sequências superior a cerca de 9095% com a sequência da sonda do ácido nucleico selecionado. As condições de hibridação úteis para hibridação da sonda/sequência de referência, em que a sonda e a sequência de referência têm um grau específico de identidade de sequência, podem ser determinadas como é conhecido na técnica (ver, por exemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press).

[0047] As condições para a hibridação são bem conhecidas pelos especialistas na técnica. A estringência da hibridação refere-se ao grau com o qual as condições de hibridação desfavorecem a formação de híbridos que contém nucleotídeos não pareados, com maior estringência correlacionada com menor tolerância para híbridos que não pareiam. Os fatores que afetam a estringência da hibridação são bem conhecidos pelos especialistas na técnica e incluem, mas não estão limitados a, temperatura, pH, força iônica e concentração de solventes orgânicos, tais como, por exemplo, formamida e dimetilsulfoxido. Como é conhecido pelos especialistas na técnica, a estringência da hibridação é aumentada com temperaturas mais elevadas, menor força iônica e menor concentração do solvente.

[0048] Com relação às condições de estringência para hibridação, é bem conhecido na arte que numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para estabelecer estringência particular variando, por exemplo, os seguintes fatores: o comprimento e a natureza das sequências, a composição de base das várias sequências, concentrações de sais e outros componentes da solução de hibridização, a presença ou ausência de agentes bloqueadores nas soluções de hibridização (eg, sulfato de dextran e polietilenoglicol), parâmetros de temperatura e tempo de reação de hibridação, bem como, condições de lavagem variáveis. A seleção de um conjunto particular de condições de hibridação é selecionada de acordo com métodos padrão na arte (ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0049] "Clivagem" refere-se à quebra da estrutura covalente de uma molécula de DNA. A clivagem pode ser iniciada por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitado a, hidrólise enzimática ou química de uma ligação fosfodiéster. Tanto a clivagem fita simples e fita dupla são possíveis, e a clivagem da fita dupla pode ocorrer como resultado de dois eventos distintos de clivagem de fita simples. A clivagem do DNA pode resultar na produção de pontas cegas ou não niveladas. Em certas formas de realização, são utilizados polipeptídeos de fusão para clivagem direcionada de DNA fita dupla.

[0050] Um "cromossomo" é um complexo de cromatina compreendendo toda ou uma porção do genoma de uma célula. O genoma de uma célula é frequentemente caracterizado por seu cariótipo, o qual é a coleção de todos os cromossomos que compõem o genoma da célula. O genoma de uma célula pode compreender um ou mais cromossomos.

[0051] Um "sítio alvo" ou "sequência alvo" é uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de um ácido nucleico à qual uma molécula de ligação se ligará, desde que existam condições suficientes para a ligação. Por exemplo, a sequência 5'-GAATTC-3 'é um sítio alvo para a endonuclease de restrição Eco RI.

[0052] Uma molécula "exógena" ou "heteróloga" é uma molécula que não está normalmente presente em uma célula, mas pode ser introduzida em uma célula por um ou mais métodos genéticos, bioquímicos ou outros. A "presença normal na célula" é determinada com relação ao estágio particular de desenvolvimento e às condições ambientais da célula. Assim, por exemplo, uma molécula que está presente apenas durante o desenvolvimento embrionário do músculo é uma molécula exógena em relação a uma célula muscular adulta. De modo semelhante, uma molécula induzida por choque térmico é uma molécula exógena em relação a uma célula não sujeita a choque térmico.

[0053] Em contraste, uma molécula "endógena" é aquela que está normalmente presente em uma célula particular em determinado estágio de desenvolvimento em condições ambientais particulares. Por exemplo, um ácido nucleico endógeno pode compreender um cromossomo, o genoma de uma mitocôndria, cloroplasto ou outra organela, ou um ácido nucleico epissomal de ocorrência natural. Moléculas endógenas adicionais podem incluir proteínas, por exemplo, fatores de transcrição e enzimas.

[0054] "Expressão gênica" refere-se à conversão da informação, contida em um gene, em um produto gênico. Um produto gênico pode ser o produto transcricional direto de um gene (por exemplo, RNAm, RNAt, RNAr, RNA antisense, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um RNAm. Os produtos gênicos também incluem RNAs que são modificados, por processos tais como capeamento, poliadenilação, metilação e edição, e proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ribosilação de ADP, miristilação e glicosilação.

[0055] "Modulação" da expressão gênica refere-se a uma alteração na atividade de um gene. A modulação da expressão pode incluir, mas não está limitada a, ativação de genes e repressão de genes.

[0056] Os termos "ligação operativa" e "ligados operativamente" (ou "ligados operativamente") são utilizados indiferentemente com referência a uma justaposição de dois ou mais componentes (tais como elementos de sequência), nos quais os componentes estão dispostos de tal modo que ambos os componentes funcionam normalmente e permitem a possibilidade de, pelo menos, um dos componentes poder mediar uma função que é exercida sobre pelo menos um dos outros componentes. A título ilustrativo, uma sequência regulatória transcricional, tal como um promotor, está operacionalmente ligada a uma sequência codificadora, se a sequência regulatória transcricional controlar o nível de transcrição da sequência codificadora em resposta à presença ou ausência de um ou mais fatores regulatórios transcricionais. Uma sequência regulatória transcricional é geralmente ligada operativamente em cis com uma sequência codificadora, mas não necessita estar diretamente adjacente a ela. Por exemplo, um amplificador é uma sequência regulatória transcricional que está operacionalmente ligada a uma sequência codificadora, mesmo que não sejam contíguas.

[0057] Tal como aqui utilizado, os termos "região codante" e "sequência de codificação" são utilizados indiferentemente, e referem-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo e, quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas expressa o polipeptídeo codificado. Os limites de uma região codante são geralmente determinados por um códon de início da tradução na sua extremidade 5 'e um códon de parada da tradução na sua extremidade 3'.

[0058] Uma "sequência regulatória" é uma sequência de nucleotídeos que regula a expressão de uma sequência regulatória à qual está operacionalmente ligada. Exemplos não limitativos de sequências regulatórias incluem promotores, amplificadores, sítios de iniciação de transcrição, sítios de início de tradução, sítios de parada de tradução e terminadores de transcrição.

[0059] Um polinucleotídeo que inclui uma região codante pode incluir nucleotídeos heterólogos que flanqueiam um ou ambos os lados da região codante. Tal como aqui utilizado, "nucleotídeos heterólogos" referem-se a nucleotídeos que não estão normalmente presentes flanqueando uma região codante que está presente em uma célula tipo selvagem. Por exemplo, uma região codante presente em um micróbio tipo selvagem e que codifica um polipeptídeo Cas9 está flanqueada por sequências homólogas, e qualquer outra sequência nucleotídica flanqueando a região codante é considerada como sendo heteróloga. Exemplos de nucleotídeos heterólogos incluem, mas não estão limitados a sequências regulatórias. Tipicamente, os nucleotídeos heterólogos estão presentes em um polinucleotídeo aqui revelado através do uso de metodologias genéticas e/ou recombinantes convencionais bem conhecidas pelos especialistas na arte. Um polinucleotídeo aqui revelado pode ser incluído em um vetor adequado.

[0060] Tal como aqui utilizado, "célula geneticamente modificada" refere-se a uma célula, que foi alterada "pela mão do homem". Uma célula geneticamente modificada inclui uma célula, calo, tecido, planta ou animal no qual foi introduzido um polinucleotídeo exógeno. Célula geneticamente modificada, também se refere a uma célula que foi geneticamente manipulada, de tal forma que os nucleotídeos endógenos foram alterados para incluir uma mutação, tal como uma deleção, uma inserção, uma transição, uma transversão ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, uma região codante endógena poderia ser deletada. Tais mutações podem resultar em um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos diferente do que foi codificado pelo polipeptídeo endógeno. Outro exemplo de uma célula geneticamente modificada, calo, tecido, planta ou animal é aquele que tem uma sequência reguladora alterada, tal como um promotor, para resultar em expressão aumentada ou diminuída de uma região codante endógena ligada operativamente.

[0061] Salvo especificação em contrário, "a", "um", "o" e "pelo menos um" são usados indiferentemente e significam um ou mais de um.

[0062] Também aqui, as recitações de intervalos numéricos por pontos finais incluem todos os números subordinados dentro desse intervalo (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5, etc.).

[0063] Tal como aqui utilizado, o termo "sequência de clivagem de RNAt" refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos reconhecida e excisada por uma endonuclease de processamento de RNAt, tal como RNase P, RNase Z ou RNAase E.

[0064] Tal como aqui utilizado, o termo "endonuclease de processamento de RNAt" refere-se à enzima que é responsável pelo reconhecimento dos locais de corte contidos no precursor do RNAt, e, à clivagem dos íntrons presentes no precursor do RNAt. A endonuclease de corte do RNAt de Archea reconhece o motivo bulge-hélice-bulge no precursor do RNAt de Archea. A endonuclease de corte do RNAt eucariótico reconhece os sítios de corte contidos no precursor do RNAt medindo a distância do domínio maduro aos sítios de corte.

[0065] A expressão "RNA antisense" designa um RNA que é capaz de se ligar a uma sequência nucleica alvo (DNA ou RNA), de modo a limitar ou impedir o seu funcionamento; em particular, RNAs antisense são capazes de se ligar a RNA mensageiro alvo, de modo a impedir a sua tradução (ver, por exemplo, Tafech et al. (2006) Curr. Med. Chem. 13: 863-881).

[0066] A expressão "RNA de interferência" designa um RNA capaz de prevenir ou limitar a expressão de um gene alvo pelo fenômeno da interferência (ver, por exemplo, Tafech et al. (2006) Curr. Med. Chem. 13: 863-881).

Métodos e composições da invenção RNAt

[0067] As características gerais de um RNAt são bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Preferencialmente, é formado um RNAt de uma única cadeia de ribonucleotídeo que é capaz de enovelar para adotar uma estrutura secundária característica, denominada trevo. Esta estrutura secundária característica compreende: (i) uma cauda aceptora constituída pelos primeiros 7 ribonucleotídeos da extremidade 5’ da cadeia ribonucleotídica, e, os 7 ribonucleotídeos que precedem os últimos 4 ribonucleotídeos da extremidade 3' da cadeia ribonucleotídica, formando assim uma estrutura de cadeia dupla compreendendo 6 ou 7 pares de ribonucleotídeos, sendo possível que os ribonucleotídeos constituídos pelo primeiro ribonucleotídeo da extremidade 5' da cadeia ribonucleotídica, e o ribonucleotídeo que precede os últimos 4 ribonucleotídeos da extremidade 3' da cadeia ribonucleotídica não sejam pareados; (ii) um braço D constituído por 4 pares de ribonucleotídeos e um D em loop constituído por 8 a 10 ribonucleotídeos, formado pelo enovalamento de uma parte da cadeia ribonucleotídica que segue os primeiros 7 ribonucleotídeos da extremidade 5 ' da cadeia ribonucleotídica; (iii) uma cauda do anticódon constituído por 5 pares de ribonucleotídeos, e um loop do anticódon constituído por 7 ribonucleotídeos (cauda-loop do anticódon), formado pelo enovelamento de uma parte da cadeia ribonucleotídica que segue o braço D e o D loop; (iv) um loop variável constituído por 4 a 21 ribonucleotídeos e formado por uma parte da cadeia ribonucleotídica que segue a cauda do anticódon e o loop do anticódon; (v) um braço T constituído por 5 pares de ribonucleotídeos, e um T loop constituído por 8 ribonucleotídeos, formado pelo enovelamento de uma parte da cadeia ribonucleotídica que segue o loop variável e precede os ribonucleotídeos da extremidade 3' da cadeia ribonucleotídica, o quais estão envolvidos na constituição da cauda aceptora.

[0068] Do mesmo modo preferencialmente, a partir da extremidade 5' na direção da extremidade 3' estão presentes 2 ribonucleotídeos entre os primeiros 7 ribonucleotídeos da extremidade 5' da cadeia ribonucleotídica e o braço D e um loop, está presente 1 ribonucleotídeo entre o braço D e o loop, por um lado, e a cauda e o loop do anticódon por outro lado, e 1 ribonucleotídeo está presente entre a cauda e o loop do anticódon, por um lado, e o loop variável, por outro lado.

[0069] Ainda preferencialmente, e de acordo com a quantidade bem conhecida por especialistas na técnica e definida por Sprinzl et al. (1998) "Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes". Nucleic Acids Res. 26: 148-153, o RNAt compreende 17 ribonucleotídeos, garantindo a estrutura tridimensional do RNAt e reconhecimento pelas enzimas celulares, nomeadamente: U.sub.8, A.sub.14, (A or G).sub.15, G.sub.18, G.sub.19, A.sub.21, G.sub.53, U.sub.54, U.sub.55, C.sub.56, (A or G).sub.57, A.sub.58, (C or U).sub.60,C.sub.61, C.sub.74, C.sub.75, A.sub.76. Os ribonucleotídeos indicados correspondem à sequência do RNAt tal como transcrito antes de quaisquer modificações pós-transcricionais de certos ribonucleotídeos pela maquinaria celular.

[0070] Em particular, o RNAt acima definido pode ser selecionado do grupo constituído por RNAt de Archea, bactéria, vírus, protozoário, fungos, algas, plantas ou animais.

[0071] Os RNAt que podem ser usados de acordo com a invenção também incluem todos os RNAt descritos por Sprinzl et al. (1998) "Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes". Nucleic Acids Res. 26: 148-153 or those available on the site: http://www.uni-bayreuth.de/departments/biochemie/trna/.

[0072] No contexto da invenção, o termo "RNAt" também inclui estruturas obtidas por modificação de um RNAt, tal como definido acima ou variantes naturais de um RNAt tal como definido acima, desde que essas estruturas modificadas ou essas variantes retenham as funcionalidades do RNAt não modificado, identificados especialmente na interação com proteínas como o fator EF-Tu (ver, for exemplo, Rodnina et al.(2005) FEBS. Lett. 579: 938-942) ou CCAse (ver, por exemplo, Augustin et al. (2003) J. Mol. Biol. 328: 985-994). Existem numerosas sequências ativas de RNAt e motivos conhecidos, e disponíveis para os especialistas na técnica através de fontes, tais como o programa tRNA-SE disponível no site lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/, ou no site trna.bioinf.uni- leipzig.de/DataOutput/Organisms (para todos os organismos), ou no site plantrna.ibmp.cnrs.fr/ (para plantas). Numerosos artigos e recursos do Genbank estão também disponíveis e são ditos aqui.

[0073] Um substrato para uma endonuclease de RNAse de RNAt pode ser produzido por qualquer método bem conhecido por um especialista na técnica. Por exemplo, o substrato pode ser sintetizado quimicamente utilizando fosforamidite ou outra solução ou métodos em fase sólida. Descrições detalhadas da química utilizada para formar polinucleotídeos pelo método de fosforamidite são bem conhecidas (ver, ex., Caruthers et al., U.S. Pat. Nos. 4,458,066 e 4,415,732; Caruthers et al., 1982, Genetic Engineering 4:1-17; User’s Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, 1990, pages 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237; Ojwang, et al., 1997, Biochemistry, 36:6033-6045). Após a síntese, o substrato pode ser purificado utilizando técnicas padrão conhecidas pelos especialistas na técnica (ver Hwang et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(23):12997-13002, e referências citadas). Dependendo do comprimento do substrato e do método da sua síntese, tais técnicas de purificação incluem, mas não estão limitadas a, cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa ("HPLC de fase reversa"), cromatografia líquida de rápido desempenho ("FPLC"), e purificação em gel.

[0074] Existem vários recursos de RNAse disponíveis para os especialistas na arte incluindo os seguintes: RNase E 1. Soderbom F, Svard SG, Kirsebom LA. 2005. RNase E cleavage in the 5' leader of a tRNA precursor. J Mol Biol 352(1): 2227. 2. Nakajima N, Ozeki H, Shimura Y. 1981. Organization and structure of an E. coli tRNA operon containing seven tRNA genes. Cell 23(1): 239-249. 3. Li Z, Deutscher MP. 2002. RNase E plays an essential role in the maturation of Escherichia coli tRNA precursors. RNA 8(1): 97-109. RNase P 1. Kirsebom LA. 2007. RNase P RNA mediated cleavage: substrate recognition and catalysis. Biochimie 89(10): 1183-1194. 2. Gutmann B, Gobert A, Giege P. 2012. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes Dev. 26(10): 1022-1027. 3. Forster AC, Altman S. 1990. External guide sequences for an RNA enzyme. Science 249(4970): 783-786. 4. Yuan Y, Altman S. 1995. Substrate recognition by human RNase P: identification of small, model substrates for the enzyme. EMBO J 14(1): 159-168. RNase Z 1. Kruszka K, Barneche F, Guyot R, Ailhas J, Meneau I, Schiffer S, Marchfelder A, Echeverria M. 2003. Plant dicistronic tRNA-snoRNA genes: a new mode of expression of the small nucleolar RNAs processed by RNase Z. EMBO J 22(3): 621632. 2. Schiffer S, Rosch S, Marchfelder A. 2002. Assigning a function to a conserved group of proteins: the tRNA 3'- processing enzymes. EMBO J 21(11): 2769-2777. 3. Barbezier N, Canino G, Rodor J, Jobet E, Saez-Vasquez J, Marchfelder A, Echeverria M. 2009. Processing of a dicistronic tRNA-snoRNA precursor: combined analysis in vitro and in vivo reveals alternate pathways and coupling to assembly of snoRNP. Plant Physiol 150(3): 1598-1610. 4. Canino G, Bocian E, Barbezier N, Echeverria M, Forner J, Binder S, Marchfelder A. 2009. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiol 150(3): 1494-1502.

[0075] Tal como aqui utilizado, a frase "um substrato para uma endonuclease para a extremidade 3' do pré-RNAm" refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos reconhecida e excisada por uma endonuclease para a extremidade 3' do pré-RNAm. Por exemplo, uma sequência nucleotídica compreendendo um hexanucleotídeo com a sequência AAUAAA antes, e um elemento de sequência rico em G/U depois do local de clivagem pode ser utilizada como um substrato para endonuclease para a extremidade 3’ do pré-RNAm em um ensaio aqui descrito. Uma sequência de nucleotídeos reconhecida e excisada por uma endonuclease para a extremidade 3’ do pré-RNAm pode compreender 10 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos. 45 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 55 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 65 nucleotídeos, 75 nucleotídeos. 100 nucleotídeos, 125 nucleotídeos, 150 nucleotídeos ou mais. Em uma forma de realização específica, os substratos para endonuclease para a extremidade 3’ do pré- RNAm utilizada nos ensaios aqui descritos compreendem um sítio de clivagem e de poliadenilação.

Vetores e ácidos nucleicos

[0076] Uma variedade de ácidos nucleicos pode ser introduzida em células para fins da invenção. Tal como aqui utilizado, o termo ácido nucleico inclui DNA, RNA e análogos de ácido nucleico, e ácidos nucleicos que são de fita dupla ou fita simples (isto é, uma fita simples senso ou antissenso). Os análogos de ácido nucleico podem ser modificados na porção de base, na porção do açúcar ou na estrutura de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridação ou solubilidade do ácido nucleico. As modificações na porção da base incluem desoxiuridina para desoxitimidina, e 5-metil-2'- desoxicitidina e 5-bromo-2'-doxicitidina para desoxicitidina. As modificações da porção do açúcar incluem a modificação da 2' hidroxila do açúcar ribose para formar açúcares 2'-O-metil ou 2'-O-alil. O esqueleto de desoxirribose fosfato pode ser modificado para produzir ácidos nucleicos morfolino, em que cada porção de base está ligada a um anel morfolino de seis membros, ou ácidos nucleicos peptídicos, em que o esqueleto de desoxifosfato é substituído por um esqueleto de pseudopeptídeo, e as quatro bases são mantidas. Ver, Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3):187; and Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5. Adicionalmente, o esqueleto de desoxifosfato pode ser substituído por, por exemplo, um esqueleto de fosforotioato ou fosforoditioato, um fosforoamidito ou um esqueleto de alquil fosfotriéster.

[0077] A sequência de ácido nucleico pode ser operacionalmente ligada a uma região regulatória, tal como um promotor. As regiões regulatórias podem ser regiões regulatórias de porcos, ou podem ser de outras espécies. Tal como aqui utilizado, operacionalmente ligada refere-se ao posicionamento de uma região regulatória em relação a uma sequência de ácido nucleico, de tal modo que permita ou facilite a transcrição do ácido nucleico alvo.

[0078] Qualquer tipo de promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico alvo. Exemplos de promotores incluem, sem limitação, promotores tecido- específicos, promotores constitutivos, promotores indutíveis e promotores que respondem ou não respondem a um estímulo particular. Os promotores tecido-específicos adequados podem resultar na expressão preferencial de um transcrito de ácido nucleico em células beta e incluem, por exemplo, o promotor de insulina humana. Outros promotores específicos de tecidos podem resultar em expressão preferencial, por exemplo, em hepatócitos ou tecido cardíaco e podem incluir os promotores da albumina e da cadeia pesada de alfa-miosina, respectivamente. Em outras formas de realização, pode ser utilizado um promotor que facilite a expressão de uma molécula de ácido nucleico sem especificidade significativa tecidual ou temporal (isto é, um promotor constitutivo). Por exemplo, pode ser utilizado um promotor de beta-actina, tal como o promotor do gene beta-actina de galinha, promotor de ubiquitina, promotor de miniCAGs, promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou promotor de 3-fosfoglicerato-quinase (PGK), assim como promotores virais, tais como o promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-TK), o promotor SV40 ou um promotor de citomegalovírus (CMV). Em algumas formas de realização, a fusão do promotor do gene da beta- actina de galinha e o amplificador do CMV é usada como um promotor. Ver, por exemplo, Xu et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12:563; and Kiwaki et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7:821.

[0079] Regiões regulatórias adicionais que podem ser úteis em construções de ácido nucleico incluem, mas não estão limitadas a, sequências de poliadenilação, sequências de controle de tradução (por exemplo, um segmento de entrada interno ao ribossoma, SEIR), amplificadores, elementos indutíveis ou íntrons. Tais regiões regulatórias podem não ser necessárias, embora possam aumentar a expressão afetando a transcrição, a estabilidade do RNAm, a eficiência da tradução, ou semelhantes. Tais regiões regulatórias podem ser incluídas em uma construção de ácido nucleico, como desejado para obter ótima expressão dos ácidos nucleicos na(s) célula(s). No entanto, a expressão suficiente pode às vezes ser obtida sem tais elementos adicionais.

[0080] Pode ser usada uma construção de ácido nucleico que codifica peptídeos sinais ou marcadores selecionáveis. Os peptídeos sinais podem ser utilizados de modo que um polipeptídeo codificado seja direcionado para uma localização celular particular (por exemplo, a superfície celular). Exemplos não limitantes de marcadores seletivos incluem puromicina, ganciclovir, adenosina desaminase (ADA), aminoglicósido fosfotransferase (neo, G418, APH), dihidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosftransferase, timidina quinase (TK) e xantina-guanina fosforibosiltransferase (XGPRT). Tais marcadores são úteis para a seleção de transformantes estáveis em cultura. Outros marcadores selecionáveis incluem polipeptídeos fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente ou a proteína amarela fluorescente.

[0081] Os ácidos nucleicos podem ser incorporados nos vetores. Um vetor é um termo amplo que inclui qualquer segmento específico de DNA que é desenhado para se deslocar de um carreador para um DNA alvo. Um vetor refere-se a um vetor de expressão, ou um sistema de vetor, que é um conjunto de componentes necessários para provocar a inserção de DNA em um genoma ou outra sequência de DNA alvo, tal como um epissoma, plasmídeo ou mesmo um segmento de DNA do fago viral. Sistemas vetores, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus, vírus adeno-associados e vírus integrantes de fagos) e vetores não virais (por exemplo, transposons) utilizados para introdução de genes em animais têm dois componentes básicos: 1) um vetor constituído por DNA (ou RNA, que é transcrita inversamente em um DNAc) e 2) uma transposase, recombinase ou outra enzima integrase que reconhece tanto o vetor, quanto a sequência alvo de DNA, e insere o vetor na sequência de DNA alvo. Os vetores contêm frequentemente um ou mais cassetes de expressão, que compreendem uma ou mais sequências de controle de expressão, em que uma sequência de controle de expressão é uma sequência de DNA que controla e regula a transcrição e/ou a tradução de outra sequência de DNA ou RNAm, respectivamente.

[0082] São conhecidos muitos tipos diferentes de vetores. Por exemplo, são conhecidos vetores plasmidiais e virais, ex.: vetores retrovirais.

[0083] As construções de polinucleotídeos podem ser introduzidas no genoma de uma célula hospedeira ou receptora desejada por uma variedade de técnicas convencionais. Para revisão de tais técnicas ver, por exemplo, Weissbach & Weissbach Methods for Cell, Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; e Grierson & Corey, Cell Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 79. Por exemplo, a construção de DNA pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula utilizando técnicas, tais como, eletroporação e microinjecção, ou as construções de DNA podem ser introduzidas diretamente em tecido vegetal ou animal utilizando métodos de biolística, tais como bombardeamento de partículas de DNA (ver, Eg, Klein et al (1987) Nature 327: 70-73).

[0084] Alternativamente, as construções de DNA podem ser combinadas com regiões flanqueadoras adequadas de DNA-T e introduzidas em um vetor hospedeiro convencional de Agrobacterium tumefaciens. As técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e uso de vetores binários, estão bem descritas na literatura científica. Ver, por exemplo, Horsch et al (1984) Science 233: 496-498, e Fraley et al (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 80: 4803. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens direcionarão a inserção da construção e do marcador adjacente no DNA celular quando a célula é infectada pelas bactérias usando o vetor de DNA-T binário (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) ou o procedimento de co-cultivo (Horsch et al (1985) Science 227:1229-1231). Ver Hernalsteen et al (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al (1989) Cell Mol. Biol. 12:31-40; and Gould et al (1991) Cell Physiol. 95:426-434.

[0085] Os processos alternativos de transferência de genes e métodos de transformação incluem, mas não estão limitados a, a transformação de protoplastos através da absorção de DNA “nus” mediada por cálcio, polietileno glicol (PEG) ou eletroporação,(ver Paszkowski et al. (1984) EMBO J3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; and Shimamoto (1989) Nature 338:274-276) e eletroporação de tecidos celulares, vegetais ou animais (D'Halluin et al. (1992) Cell, 4:14951505). Métodos adicionais para a transformação de células incluem microinjecção, absorção de DNA mediada por carboneto de silício (Kaeppler et al. (1990) Cell Reporter 9:415-418), e bombardeamento com microprojéctil (ver Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; e Gordon-Kamm et al. (1990) Cell 2:603-618).

[0086] Uma célula, calo, tecido vegetal ou animal transformado pode ser identificado e isolado selecionando ou rastreando a construção celular, vegetal ou animal para caracteres codificados pelos genes marcadores presentes no DNA transformado. Por exemplo, a seleção pode ser realizada cultivando a célula construída em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida, ao qual a construção do gene transformante confere resistência. Além disso, as células transformadas podem também ser identificadas por rastreio das atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes β-glucuronidase, luciferase, B ou C1) que podem estar presentes nas construções de ácido nucleico recombinantes. Tais metodologias de seleção e rastreio são bem conhecidas pelos especialistas na técnica.

[0087] Os métodos físicos e bioquímicos também podem ser utilizados para identificar transformantes contendo construções de genes inseridos. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a: 1) análise por Southern ou amplificação por PCR para detectar e determinar a estrutura do inserto de DNA recombinante; 2) Northern blot, proteção RNAse S1, amplificação de extensão de primers ou PCR com transcriptase reversa para detectar e examinar transcritos de RNA das construções gênicas; 3) ensaios enzimáticos para detectar atividade de enzima ou ribozima, em que tais produtos gênicos são codificados pela construção gênica; 4) eletroforese em gel de proteína, técnicas de Western blot, imunoprecipitação ou imunoensaios ligados a enzimas, nos quais os produtos de construção de genes são proteínas. Técnicas adicionais, tais como hibridação in situ, coloração com enzimas e imuno- coloração, podem também ser utilizadas para detectar a presença ou expressão da construção recombinante em órgãos e tecidos específicos de células, plantas ou animais. Os métodos para realizar todos estes ensaios são bem conhecidos pelos especialistas na técnica.

[0088] As mudanças genômicas incluindo polinucleotídeos exógenos que são incorporados de forma estável em células, ou indels criados por edição de genes podem ser introduzidas em outras células, tecidos, plantas ou animais utilizando, por exemplo, técnicas de cruzamento padrão.

[0089] Células geneticamente modificadas que são produzidas por quaisquer das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira ou tecidos animais, o qual possui o genótipo transformado e, portanto, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração dependem da manipulação de certas fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente dependendo de um marcador biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido em conjunto com as sequências nucleotídicas desejadas. A regeneração de plantas ou animais de cultura de protoplastos está descrita em Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Cell, plant or animal Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calos, órgãos, pólens, embriões ou partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al (1987) Ann. Rev. of Cell, planta ou animal Phys. 38:467-486.

[0090] Os ácidos nucleicos introduzidos em uma célula podem ser utilizados para conferir caracteres desejados em, essencialmente qualquer célula, planta ou animal. Uma grande variedade de sistemas de células, plantas ou animais pode ser modificada para as características fisiológicas e agronômicas desejadas aqui descritas utilizando as construções de ácido nucleico da presente descrição e os vários métodos de transformação mencionados acima. Em formas de realização preferidas, as células alvo, para engenharia em plantas, podem incluir, mas não estão limitadas a, células monocotiledôneas e dicotiledôneas, plantas ou animais, tais como culturas incluindo culturas de grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), cultura de frutos (ex.: tomate, maçã, pêra, morango, laranja), cultura de forrageiras (por exemplo, alfafa), tubérculos (por exemplo, cenoura, batata, açúcar de beterraba, inhame), hortaliças folhosas (por exemplo, alface, espinafre); Célula de floração, planta ou animais (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), árvores coníferas ou pinheiros (Por exemplo, pinheiro, abeto); Células, plantas ou animais utilizados na fitorremediação (por exemplo, células, plantas ou animais que acumulam metais pesados); Culturas de oleaginosas (por exemplo, girassol, sementes de canola) e células, plantas ou animais utilizados para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). Assim, os métodos e composições divulgados têm utilização em vasta gama de células, plantas ou animais, incluindo, mas não se limitando a, espécies dos gêneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Glycine, Hordeum, Lactuca, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorgo, Triticum, Vitis, Vigna e Zea. Um especialista na técnica reconhecerá que, após o cassete de expressão ser incorporado de forma estável em células de plantas ou animais transgênicos e confirmado como operável, este pode ser introduzido em outra célula de planta ou animal por cruzamento sexual. Qualquer uma de um número de técnicas de reprodução padrão podem ser usadas dependendo da espécie a ser cruzada.

[0091] Os efeitos da manipulação de genes utilizando os métodos aqui revelados podem ser observados por, por exemplo, transferências de Northern do RNA (por exemplo, RNAm) isolados dos tecidos de interesse. Tipicamente, se a quantidade de RNAm tiver aumentado, pode-se assumir que o gene endógeno correspondente está sendo expresso a uma taxa maior do que antes. Podem ser utilizados outros métodos de medição da atividade dos genes. Diferentes tipos de ensaios enzimáticos podem ser usados, dependendo do substrato utilizado e do método de detecção do aumento ou diminuição de um produto ou subproduto da reação. Além disso, os níveis de e/ou proteínas expressas podem ser medidos imunoquimicamente, isto é, ELISA, RIA, EIA e outros ensaios baseados em anticorpos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, tais como por ensaios de detecção eletroforética (tanto com coloração quanto por Western Blotting). O transgene pode ser expresso seletivamente em alguns tecidos ou em alguns estágios de desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso substancialmente em todas as células, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de expressão combinatória também é aplicável.

[0092] A presente divulgação abrange ainda a progênie, clones, linhagens celulares ou células da célula transgênica descrita acima, em que a referida progênie, clone, linhagem celular ou célula tem o transgene ou construção de genes ou foi editado.

Vetores plasmidiais para alvos gênicos e edição de genoma

[0093] De acordo com um aspecto da invenção, são providas composições que permitem alvejar genes e a edição de genoma em células. Em um aspecto, são providos vetores específicos de edição de genoma guiados por RNA. Em uma forma de realização preferida, os vetores incluem um primeiro elemento regulatório operável em uma célula vegetal ou animal, operacionalmente ligados a, pelo menos, uma sequência nucleotídica codificando um RNA guia do sistema CRISPR-Cas que hibridiza com a sequência alvo; E um segundo elemento regulatório operável em uma célula vegetal ou animal operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease associada a CRISPR tipo II. A sequência de nucleotídeos que codifica um RNA guia do sistema CRISPR-Cas e a sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease associada a CRISPR tipo II.podem estar no mesmo ou em vetores diferentes do sistema. O RNA guia direciona a sequência alvo, e a nuclease associada à CRISPR cliva a molécula de DNA, em que e a expressão de, pelo menos, um produto gênico é alterada.

[0094] Em uma forma de realização preferida, os vetores incluem uma sequência de nucleotídeos compreendendo um promotor de RNA polimerase III dependente de DNA, em que o referido promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de RNAg e a uma sequência de terminador Pol III, em que a referida molécula de RNAg inclui uma sequência alvo de DNA; e, uma sequência de nucleotídeos compreendendo um promotor de RNA polimerase II dependente de DNA operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma nuclease associada a CRISPR de tipo II. A nuclease associada à CRISPR é preferencialmente uma proteína Cas9.

[0095] Em outra forma de realização, são providos vetores para a expressão transitória mediada por Agrobacterium ou por transformação estável em tecidos vegetais ou animais. Em particular, os vetores plasmidiais para expressão transitória em protoplastos, culturas de tecidos contêm: (1) um promotor de RNA polimerase III dependente de DNA (Pol III) (por exemplo, U3 snoRNA de arroz ou promotor U6) para controlar a expressão de moléculas de RNAg manipuladas na célula, planta ou célula animal, onde a transcrição foi terminada por um terminador Pol III (Term Pol III), 2) um promotor de RNA polimerase II dependente de DNA (Pol II) (ex., promotor 35S) para controlar a expressão da proteína Cas9; (3) sítio múltiplo de clonagem (SMC) localizado entre o promotor Pol III e RNAg scaffold, que é usado para inserir uma sequência de DNA de 15-30 pb para produzir um RNAg modificado. Para facilitar a transformação mediada por Agrobacterium são fornecidos vetores binários (por exemplo, o vetor pCAMBIA 1300), em que os cassetes de RNAg/Cas 9 são inseridos nas células de plantas, animais e fungos através da transformação por Agrobacterium. Para programar o RNAg, uma sequência de DNA sintético de 15-30 pb de comprimento complementar à sequência do genoma alvo pode ser inserida no local SMC do vetor.

Métodos para introduzir construções engenheiradas de RNAg-Cas9 em células para edição do genoma e modificação genética.

[0096] De acordo com outro aspecto da invenção, as construções gênicas que transportam nuclease RNAg-Cas9 podem ser introduzidas em células por vários métodos, os quais incluem, mas não estão limitados a, transformação de protoplastos mediada por PEG ou por eletroporação, cultura de tecidos ou celular, transformação de tecidos vegetais ou animais por bombardeamento biolístico, ou transformação transiente e estável mediada por Agrobacterium. A transformação pode ser transformação transiente ou estável.

[0097] As sequências do gene alvo para edição do genoma e para modificação genética podem ser selecionadas utilizando métodos conhecidos na arte, e como descrito em outra parte neste pedido. Em uma forma de realização preferida, as sequências alvo são identificadas que incluem, ou que são próximas ao motivo adjacente protoespaçadores (MAP). Uma vez identificada, a sequência específica pode ser alvejada através da síntese de um par de oligonucleotídeos de DNA específicos do alvo com ligantes de clonagem apropriados, e fosforilação, anelamento e ligação dos oligonucleotídeos em um vetor plasmidial digerido, tal como aqui descrito. O vetor plasmidial compreendendo os oligonucleotídeos específicos do alvo pode então ser utilizados para a transformação de uma célula, planta ou animal.

Métodos para desenhar RNAgs específicos com risco mínimo de errar o alvo

[0098] De acordo com um aspecto, a invenção proporciona métodos para desenhar sequências de DNA/RNA que guiam a nuclease Cas9 para alvejar um local desejado com alta especificidade. A especificidade de RNAg construído pode ser calculada por alinhamento de sequência da sua sequência espaçadora com a sequência genômica do organismo alvo.

[0099] Abordagens para produzir plantas ou animais não transgênicos, geneticamente modificados.

[0100] Utilizando os vetores plasmidiais e os métodos de introdução acima mencionados, células de plantas ou animais construídos geneticamente podem ser produzidas através do endereçamento específico de genes e edição de genoma. Em muitos casos, as culturas geneticamente modificadas resultantes não contêm genes estranhos e, basicamente, são não transgênicas. Uma sequência de DNA que codifica RNAg pode ser desenhada para alvejar especificamente quaisquer genes ou sequências de DNA para mutação direcionada através da inserção ou deleção, ou outras modificações (ex., ativação e repressão transcricional, metilação e desmetilação, marcação) através desta tecnologia. A capacidade de criar, de forma eficiente e específica, mutações ou modificações direcionadas no genoma de células, plantas ou animais, facilita o desenvolvimento de muitas novas progênies com características melhoradas ou novas. Uma vez que as construções de genes CRISPR/Cas são apenas expressas transientemente em protoplastos e, não estão integradas no genoma, plantas ou animais geneticamente modificados regenerados a partir de protoplastos não contêm DNA exógeno e são basicamente não transgênicos. Adicionalmente, plantas ou animais livres de transgenes podem ser obtidos por segregação genética após o retrocruzamento ou autofecundação de linhagens transgênicas com genoma editado.

Outras técnicas de manipulação genética baseadas em RNA

[0101] A invenção é igualmente aplicável a outras técnicas de manipulação genética mediadas por RNA, tais como inibição da expressão gênica baseada em RNA. Tipicamente, um cassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução, de pelo menos um polipeptídeo, é incluída na invenção.

[0102] Em algumas formas de realização da presente invenção, uma célula é transformada com um cassete de expressão, que é capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão do polipeptídeo. O termo "expressão", tal como aqui utilizado, refere-se à biossíntese de um produto gênico, incluindo a transcrição e/ou tradução do referido produto gênico. A "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo, a partir de uma molécula de DNA, refere-se à transcrição e tradução da sequência codante para produzir a proteína ou o polipeptídeo, enquanto a "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de RNA refere-se à tradução da sequência codificadora de RNA para produzir a proteína ou o polipeptídeo.

[0103] Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão de um polipeptídeo incluem supressão/cosupressão de sentido, em que um cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA correspondente a todo ou parte de um RNA mensageiro que codifica o polipeptídeo na orientação "senso”, e a superexpressão da molécula de RNA pode resultar na expressão reduzida no gene nativo; A supressão antissenso, na qual o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo, ou parte, de um RNA mensageiro que codifica o polipeptídeo sintase ACC e a superexpressão da molécula de RNA antissenso pode resultar em expressão reduzida do gene nativo; RNA de interferência de fita dupla, em que uma molécula de RNA senso, como descrita acima para a cosupressão, e uma molécula de RNA antissenso, a qual é completa ou parcialmente complementar à molécula de RNA senso são expressas na mesma célula, resultando na inibição da expressão dos RNAs mensageiros endógenos, RNA de interferência em hairpin e RNA de interferência em hairpin contendo íntron, onde a cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA que hibrida com ela própria para formar uma estrutura em hairpin, que compreende uma região em loop de fita simples e, uma cauda de pares de bases; Pequenos RNAs de interferência ou MicroRNA, onde o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA que é modelada em um gene de miRNA endógeno.

[0104] Além disso, a edição multiplex de genoma mediada por RNAg descrita nesta invenção pode ser utilizada em conjunto com uma proteína Cas inativa para ativação transcricional e repressão de múltiplos genes, edição de epigenoma (ex, metilação e demetilação) de múltiplos locais ou genes, marcação de elementos do genoma, e outras manipulações genéticas multiplex nos organismos vivos.

EXEMPLO 1

[0105] O sistema CRISPR/Cas9 está sendo aproveitado como uma ferramenta poderosa para engenharia genômica em pesquisa básica, terapia molecular e melhoramento de culturas. Este sistema utiliza um pequeno RNA guia (RNAg) para dirigir a endonuclease Cas9 para um local de DNA específico, pelo que a sua capacidade de direcionamento é largamente restringida pelo dispositivo de expressão de RNAg. Os requerentes desenvolveram uma estratégia geral para produzir numerosos RNAgs a partir de um único gene policistrônico. O sistema de processamento de RNAt endógeno, que cliva precisamente ambas extremidades do precursor de RNAt, foi construído como uma plataforma simples e robusta para aumentar a capacidade de edição para atingir o alvo e capacidade de edição multiplex do sistema CRISPR/Cas9. Os requerentes aqui demonstram que os genes sintéticos com arquitetura RNAt-RNAg em tandem foram eficiente e precisamente processados em RNAgs com sequências alvo 5' desejadas in vivo, que direcionavam Cas9 para editar múltiplos alvos cromossomais. Utilizando esta estratégia, a edição multiplex de genomas e a deleção de fragmentos cromossômicos foram facilmente obtidos em plantas trangênicas estáveis de arroz com uma elevada eficiência (até 100%). Como o RNAt e seu sistema de processamento são praticamente conservados em todos os organismos vivos, esse método pode ser amplamente utilizado para aumentar a capacidade de atingir o alvo e de eficiência de edição dos kits de ferramentas CRISPR / Cas9.

[0106] Os organismos superiores frequentemente empregam redes genéticas complicadas com genes funcionalmente redundantes para ajustar os processos celulares. Desta forma, as ferramentas moleculares com a capacidade de manipular simultaneamente múltiplos genes são de grande valor tanto na pesquisa básica quanto nas aplicações práticas da engenharia genética. Recentemente, o sistema bacteriano tipo II agrupado com repetições palindrômicas curtas (CRISPR) e o sistema de proteínas associadas a CRISPR (Cas) emergem como ferramenta promissora para este propósito. A endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, acoplada com um RNA guia artificial (RNAg), é capaz de alcançar a sequência de DNA de 5'-N20-NGG- 3' (N indica qualquer base) em que N20 é o mesmo que 20 bases da sequência 5’ do RNAg (referida como espaçador de RNAg a partir daqui) e NGG é o motivo adjacente protospaçador (MAP) (1-3). A simples regra programável guiada por RNA e a alta ocorrência de MAP em genomas permitiram que Cas9-RNAg alvejasse prontamente quase todos os elementos genéticos para a edição do genoma. Devido à sua simplicidade e alta eficiência, as ferramentas baseadas em Cas9 foram desenvolvidas rapidamente para a edição do genoma/epigenoma, regulação da transcrição e outras aplicações na engenharia genética (4-6).

[0107] Em princípio, a edição multiplex do genoma pode ser conseguida expressando Cas9 (ou efetores derivados de Cas9) juntamente com múltiplos RNAgs para os respectivos sítios alvo. Os métodos de introdução convencionais envolvem microinjecção ou expressão de construções de genes contendo múltiplos RNAgs individuais (RNAgi) que expressam cassetes para edição multiplex de genoma (2, 3, 7-11). A microinjecção direta de RNAgs sintetizados in vitro e da proteína Cas9 (ou RNAm de Cas9) na célula ou no embrião é adequada apenas para poucos sistemas. Como resultado, a estratégia mais comum é inserir múltiplos cassetes de expressão de RNAgi em uma construção plasmidial ou utilizar construções múltiplas. O tamanho típico de um cassete de expressão de RNAgi é de cerca de 400-500 pb e consiste em um promotor de RNA Polimerase III (Pol III), RNAg e terminador Pol III. Devido à limitação do método de introdução e da capacidade do vetor plasmidial, a produção simultânea de numerosos RNAgs seria um desafio com tal estratégia de expressão de RNAg para a maioria dos organismos. Além disso, o RNA transcrito Pol III eucariótico é obrigado a iniciar com um ribonucleotídeo específico que pode reduzir os sítios alvos de Cas9/RNAg. Uma estratégia avançada é compactar múltiplos RNAgs em um gene sintético e construir um sistema de processamento de RNA para excisar RNAgs individuais do transcrito primário. O único método comprovado baseado nessa estratégia é a expressão da endoribonuclease Csy4 (endo-RNase) com Cas9 para processar um transcrito contendo RNAgs fundidos com RNA que cliva Csy4 (12, 13). No entanto, métodos mais robustos e precisos para a produção simultânea de múltiplos gRNAs são necessários para melhorar a capacidade de edição multiplex e facilitar aplicações Cas9 mais sofisticadas.

[0108] O RNA é um componente celular fundamental e sua produção é garantida pelos sistemas de processamento de RNA conservados e precisos em diferentes organismos. Isto nos inspirou a desenvolver um sistema endógeno de processamento de RNA para produzir múltiplos RNAgs a partir de um único transcrito, ao invés de introduzir quaisquer RNases adicionais junto com componentes Cas9/RNAg. Os requerentes aqui demonstram que múltiplos RNAgs poderiam ser produzidos eficientemente a partir de um único gene sintético com a arquitetura RNAt-RNAg após a excisão precisa de transcritos in vivo pelas RNases endógenas. Esta estratégia de expressão de RNAg mostrou não só permitir atingir alvos em reação multiplex, mas também a melhorar a eficiência de edição do sistema CRISPR/Cas9 em plantas. Como o sistema de processamento de RNAt existe virtualmente em todos os organismos, esta estratégia poderia ser amplamente utilizada para aumentar a capacidade de edição multiplex das ferramentas CRISPR/Cas9 para a engenharia genômica.

Resultados Estratégia para construir o sistema de processamento de RNAt para produzir numerosos RNAgs

[0109] Para produzir simultaneamente múltiplos RNAgs de um transcrito primário, objetivamos compactar um grupo de RNAgs com diferentes espaçadores em um gene policistrônico e sequestrar o sistema de processamento de RNA endógeno para a clivagem deste transcrito em RNAgs individuais no núcleo. Em busca de RNA e endo-RNases, que potencialmente satisfaçam este requisito, RNAt atraiu nossa atenção para as suas características de acordo. (I) No nucleoplasma, o precursor do RNAt (pré-RNAt) é clivado em sítios específicos em eucariotos por RNase P e RNase Z (ou RNase E em bactéria) para remover sequências 5 'e 3' extras (Fig. 1A), respectivamente (14-18). (II) RNase P e RNase Z reconhecem a estrutura do RNAt, independentemente da sequência do pré-RNAt (17, 18). Estudos anteriores revelaram que apenas a cauda aceptora, o braço D- loop e o braço T^C-loop do RNAt são necessários para a clivagem da RNase P e RNase Z do pré-tRNA (16-19). (III) o RNAt foi encontrado na unidade de transcrição policistrônica em bactérias (20) e, ocasionalmente em eucariotos (19, 21), sugerindo que o sistema de processamento de RNAt é provavelmente utilizado como mecanismo intrínseco para produzir diferentes pequenos RNAs (ex, snoRNA) com RNAt a partir de um único gene policistrônico (19). (IV) Uma vez que o RNAt é um dos componentes celulares mais abundantes, o sistema de processamento endógeno do RNAt deve ser robusto para processar uma grande quantidade de substratos. (V) Os genes do RNAt contêm elementos promotores internos (box A e B) para recrutar o complexo RNA polimerase III (Pol III) (Fig. 1B) (22, 23). Assim, a sequência do RNAt também pode funcionar como potencial amplificador da transcrição para Pol III. Com base nestas características, temos a hipótese de que o sistema de RNAt endógeno poderia ser construído como uma plataforma geral para o processamento preciso de RNAgs.

[0110] Para utilizar o sistema de RNAt endógeno para a edição multiplex do genoma com Cas9/RNAg, desenhamos o gene policistrônico RNAt-RNAg (PTG) para a produção simultânea de numerosos RNAgs. Conforme ilustrado na Fig. 1C, este gene PTG consiste em repetições em tandem de RNAt-RNAg e seria transcrito como um gene snoRNA ou sgRNA normal sob o controle do promotor Pol III. As RNAases endógenas de processamento de RNAt (por exemplo, RNase P e RNase Z em plantas) reconheceriam os componentes de RNAt e excisariam RNAgs individuais a partir do transcrito PTG. Os RNAgs resultantes dirigiriam então Cas9 para múltiplos locais alvo para a edição do genoma (Fig. 1C).

Processamento preciso de PTG para produzir RNAgs funcionais com sequências alvo desejadas

[0111] Para explorar se o gene PTG sintético seria transcrito, processado e funcionaria como previmos (Fig. 1C), sintetizamos quatro genes PTG com uma estrutura de RNAt-RNAg (PTG1 e PTG2) ou RNAt-RNAg-RNAt (PTG1.1 e PTG2.1, Fig. 2A). Estes quatro genes PTG foram desenhados para produzir RNAg1 (PTG1 e PTG1.1) e RNAg2 (PTG2 e PTG2.1) que foram testados previamente (24) com genes sgRNA (sgRNA1 e sgRNA2) na edição do genoma mediada por Cas9 (Exemplo 2, Figura 5A, e ver a sequência do gene na Tabela 2.1). Ambos os RNAgs direcionaram o gene de arroz MPK5 que codifica uma proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK) envolvida em vias de sinalização biótica e abiótica. Estes PTGs foram construídos com um gene pre- RNAtGly de 77 pb de comprimento que reconhece o códon GGC e está amplamente presente entre vários genomas (25). A sequência pré-RNAtGly escolhida consiste na fita 5’ líder (5'- AACAAA-3', 6 pb) e RNAt maduro (71 pb) (Figura 2B). Essa fusão de RNAt-RNAg em PTGs mimetiza o di-cistron nativo RNAt- snoRNA43 em plantas (19).

[0112] Neste estudo, utilizamos um vetor plasmidial (Exemplo 2, Fig. 6) em que o sgRNA ou PTG é expresso com o promotor de snoRNA U3 de arroz (U3p), e Cas9 é expresso com um promotor de ubiquitina de arroz mais a região 5' não traduzida completa (UBIp). Após a transfecção de protoplastos de arroz com plasmídeos contendo U3p:sgRNA ou U3p:PTG, realizou-se a PCR de transcrição reversa circularizada (26, 27) para mapear as extremidades 5' e 3' dos RNAgs maduros (Ver Apêndice SI, Fig. S7 e Tabela S2 para os princípios de cRT-PCR). Os RNAgs maduros com o tamanho esperado foram detectados de protoplastos expressando PTGs ou sgRNAs (Fig. 2C-2F). Contudo, o transcrito fundido de RNAt-RNAg dos PTGs não foi detectável por cRT-PCR, provavelmente devido ao sistema de processamento de RNAt altamente robusto que clivou a maioria (se não todos) dos transcritos primários de PTGs. A análise de sequência dos produtos de cRT-PCR revelou que todos os quatro transcritos de PTG foram precisamente clivados na junção RNAt-RNAg e produziram RNAgs maduros contendo as sequências 5’ espaçadoras desejadas sem nucleotídes extras (Fig. 2G e Exemplo 2, Figuras 8 e 9). Por outro lado, a extremidade final 3’ de RNAgs maduros carregam a cauda poli U de 1-7 nucleotídeos de comprimento a partir do líder RNAt, se ele precedia o terminador PolIII (sgRNA, PTG1 and PTG2, ver exemplo 2, Fig. 8), ou ribonucleotídeos de 1-4 nt do RNAt-líder quando precedeu o RNAt (PTG1.1 e PTG2.1, ver Exemplo 2, Fig. 9). Os dados de cRT-PCR também confirmaram que os RNAgs transcritos do U3p: sgRNA foram obrigados a iniciar com o nucleotídeo A, enquanto que U3p:PTGs produziram RNAgs sem restrição do primeiro nucleotídeo (Exemplo 2, Figuras 8 e 9). Em resumo, os RNAgs produzidos do PTG são os mesmos que os sgRNAs, mas não são obrigados a iniciar com um nucleotídeo específico (Fig. 2G e 2H).

[0113] A funcionalidade de PTG1 e PTG2 foi confirmada examinando as mutações de inserção/deleção (indel) introduzidas por reparação não homóloga end joining (NHEJ) no sítio previsto de clivagem de Cas9:gRNA. Uma vez que os alvos de RNAg1 e RNAg2 contém os sítios da enzima de restrição KpnI e SacI (Exemplo 2, Fig. 5A), respectivamente, as mutações induzidas por PTG1/Cas9 e PTG2/Cas9 podiam ser prontamente analisadas pela digestão de produtos de PCR abrangendo os sítios alvo com RE correspondente (ensaio de PCR/RE). Em protoplastos de arroz transfectados com PTG1/Cas9 e PTG2/Cas9, observou-se que 15% e 9% dos sítios alvo continham indels, respectivamente (Figura 2I), os quais são ligeiramente superiores à taxa de mutação das construções de sgRNA:Cas9 utilizadas previamente (24). Consistente com a nossa hipótese de que o RNAt pode funcionar como um amplificador transcricional para Pol III, o RT-PCR quantitativo com primer específicos de RNAg revelou que os níveis dos transcritos de PTG1 e PTG2 eram cerca de 3 e 31 vezes mais elevados do que os de sgRNA1 e sgRNA2 em protoplastos (Fig. 2J), respectivamente. Tomados em conjunto, nossos resultados demonstraram que o sistema endógeno de RNAt poderia ser utilizado como uma ferramenta precisa e robusta para produzir RNAgs de PTG para edição de genoma mediada por Cas9.

Edição eficiente multiplex de genoma em protoplastos de arroz via PTG/Cas9

[0114] Para testar a capacidade de direcionamento e a eficiência do sistema de PTG, até oito RNAgs (RNAg1-RNAg8, Exemplo 2, Tabela 2.3 e Fig. 5) foram colocados em série para construir PTGs para direcionar quatro MAPKs homólogas de arroz (MPK1 2/5/6) que podem funcionar redundantemente em diversas vias de sinalização celular. Estes RNAgs foram divididos em quatro pares, e cada par direcionou dois sítios genômicos dentro de um locus gênico com uma distância de 350-750 pb entre eles (Exemplo 2, Fig. 5). Combinando diferentes pares de RNAg, desenhamos genes PTG codificando RNAgs 2 (PTG3/4/5/6), 4 (PTG7/8) e 8 (PTG9) direcionados simultaneamente 1, 2 e 4 loci de MPK, correspondentemente (Fig. 3A e Exemplo 2, Tabela 2.1). Esperávamos que tal desenho pudesse resultar em uma deleção de fragmentos curtos cromossômicos entre dois sítios de corte de Cas9 e, nos permitiu examinar prontamente a eficácia de PTGs.

[0115] Para sintetizar o PTG com arquitetura RNAt-RNAg repetitiva, desenhamos uma abordagem escalável e flexível para reunir PTGs a partir de componentes de PCR com base no princípio da estratégia de montagem do Golden Gate (28) (ver Exemplo 2, Figuras 10 e 11 para detalhes). A nossa abordagem de montagem genética permitiu síntese rápida de PTGs com diferentes combinações de RNAgs a partir de oligonucleotídeos primer comuns. Utilizando uma montagem de um ou dois passos, sintetizamos genes PTG3-PTG9 e que foram clonados em vetores que expressam CRISPR/Cas9 (Exemplo 2, Fig. 6 e Tabela 2.12.3).

[0116] Foram então transfectados protoplastos de arroz com estes plasmídeos contendo ambos U3p:PTG3-PTG9 como UBIp:Cas9. As deleções dos fragmentos cromossômicos em quatro loci MAPK, que foram revelados por amplificação de produtos de PCR truncados com primer específicos de alvo, foram detectadas em protoplastos que expressam PTGs respectivos, com eficiência de 4% a 45% (Figura 3B). Embora 8 RNAgs fossem simultaneamente produzidos a partir de PTG9, eles ainda guiaram Cas9 para eficientemente excisar fragmentos cromossômicos em todos os quatro loci alvo com 4% - 20% de frequência (Figura 3B). A eficiência de deleção dos fragmentos nos loci MPK5 foi ainda confirmada por PCR quantitativo utilizando primer que englobam o sítio de corte de RNAg2 (SI Apêndice, Tabela S4). O sequenciamento destes produtos de PCR truncados confirmou que os fragmentos entre dois sítios de corte de RNAg/Cas9 foram excisados dos loci alvo, com ou sem indels adicionais (Fig. 3C). Em geral, a eficiência de deleção de fragmentos foi negativamente correlacionada com a distância entre dois sítios de corte pareados (eficiência correlacionada r = -0,95) apesar de diferentes RNAgs poderem ter eficiências variáveis. Observou-se que o número total de RNAgs em um PTG afetou a eficiência da deleção com grau variável em alvos diferentes em protoplastos (Figura 3B). Em três loci alvo (MPK2/5/6), os PTGs (PTG4/5/6) contendo 2 RNAgs mostraram apenas uma eficiência ligeiramente superior aos PTGs com 4 (PTG7/8) e 8 (PTG9) RNAgs. Mas no locus MPK1, PTG3 (2 RNAgs) mostrou frequência ~ 2 vezes maior de deleção do que PTG7 (4 RNAg) ou PTG9 (8 RNAgs). Tal redução da eficiência de PTGs com maior número de RNAgs foi provavelmente devido à competição por Cas9 entre RNAgs. No entanto, o PTG com arquitetura RNAt-RNAg organizados em tandem é capaz de produzir simultaneamente numerosos RNAgs e guiar Cas9 a alvos múltiplos cromossômicos com elevada eficiência.

Melhorando a edição multiplex de genomas em plantas transgênicas estáveis com PTG/Cas9

[0117] Como muitas plantas, incluindo culturas importantes como o arroz, não puderam ser facilmente regeneradas a partir de protoplastos, usamos a transformação convencional mediada por Agrobacterium para produzir linhagens transgênicas estáveis, e avaliamos a eficácia do sistema PTG/Cas9 para edição multiplex de genoma em plantas de arroz intactas. A frequência de mutagênese em alvos de RNAg1 e RNAg2 em plantas transgênicas que expressam sgRNA1:Cas9, sgRNA2:Cas9, PTG6:Cas9 ou PTG7: Cas9 foram examinadas na geração de T0. Dentre a geração T0 de sgRNA1: Cas9 (n = 32) e plantas sgRNA2: Cas9 (n = 20), 44% e 60% delas carregaram indels, enquanto que 13% e 20% delas tiveram mutações bialélicas, respectivamente (Tabela 1 e Exemplo 2, Fig. 12). Em contraste, indels em ambos os alvos foram detectados em todas as plantas PTG6:Cas9 (100%, n = 17), incluindo 35% (RNAg1) e 76% (RNAg2) de mutações bialélicas (Tabela 1 e Exemplo 2, Fig. 13). Mas a deleção de fragmentos cromossômicos entre os sítios alvos de RNAg1 e RNAg2 não foi detectada por PCR em plantas PTG6:Cas9, o que pode ocorrer com uma frequência mais baixa em calos/plantas regenerados do que em protoplastos. No entanto, os resultados mostraram que PTG6 não apenas expressou dois RNAgs simultaneamente, mas também aumentou a eficiência de mutagênese em alvos individuais do que o sgRNA (teste de t- student, P <0,01, Tabela 1 e Exemplo 2, Figuras 12 e 13).

[0118] Quando o número total de alvos aumentou para quatro nas plantas PTG7:Cas9, observou-se uma frequência indel comparável às plantas sgRNA1:Cas9 no sítio RNAg1, mas foi encontrada uma frequência significativamente maior de indels do que sgRNA2:Cas9 no sítio RNAg2 (Tabela 1 e Exemplo 2, Fig. 14). Interessantemente, obteve-se uma linhagem PTG7:Cas9 (6%) carregando deleção bialélica de ~ 350 bp em MPK1, e deleção monoalélica de ~ 750 bp em MPK5 (Fig. 4A e 4B). Isto nos levou a examinar mais a eficiência de todos os oito RNAgs nas linhagens PTG9:Cas9. Em cinco alvos de RNAg (RNAg1/2/3/5/7), cuja mutação destruíra sítios RE, 50% (n = 14) de linhagens T0 PTG9: Cas9 transportaram mutações bialélicas em todos os cinco alvos (Exemplo 2, Fig. 15) . Interessantemente, os ensaios de PCR/RE sugeriram que estes cinco RNAgs exibiram uma eficiência comparável, e todos eles mostraram atividades de mutagênese significativamente mais elevadas do que as observadas nas linhagens sgRNA1/2:Cas9 (Tabela 1). O sequenciamento Sanger dos fragmentos de quatro loci MPK de plantas PTG9:Cas9 confirmou que as mutações foram introduzidas em todos os oito sítios (Exemplo 2, Fig. 16). Contudo, a deleção de fragmentos foi detectada apenas em loci MPK2 e MPK5 em duas linhagens PTG9:Cas9 (Exemplo 2, Fig. 15). Em comparação com os protoplastos, a eficiência da deleção de fragmentos cromossômicos alvos entre sítios de corte de RNAg/Cas9 pareados é mais baixa em plantas transgênicas, o que pode ser devido a expressão relativamente mais baixa de RNAgs e Cas9 em plantas de arroz calos regeneradas (tipicamente, apenas uma única cópia do transgene é integrada no genoma do arroz após a transformação mediada por Agrobacterium). Nossos dados demonstram que o método PTG não apenas aumenta o número de RNAg e os locais de alvo, mas também provavelmente aumenta a eficiência de mutagênese em sítios individuais, especialmente quando múltiplos RNAg são expressos usando PTG. Para substanciar ainda mais a elevada eficiência da mutagênese com PTG/Cas9, sintetizou-se PTG10 com dois RNAgs (RNAg9 e RNAg10) para alvejar o gene da fitoeno-desaturase de arroz (FDS) (Exemplo 2, Fig. 13A). O FDS é frequentemente utilizado como um alvo gênico conveniente para examinar a eficiência do nocaute porque as plantas com FDS funcionalmente nulo levariam a um fenótipo foto-branqueado visível. Surpreendentemente, todas as plântulas transgênicas PTG10:Cas9 (geração T0, n = 15) regeneradas dos calos apresentaram fenótipo de foto- branqueamento, e 13 delas foram completamente albinas, indicando que estas plantas apresentavam FDS funcionalmente nulo (Figura 4C). Apesar de termos identificado apenas uma linhagem contendo deleções cromossômicas entre dois sítios alvo de RNAg, o sequenciamento dos alvos FDS de todas as linhagens confirmaram que os indels foram introduzidos nos sítios alvo (Exemplo 2, Fig. 13). Comparando estes dados com a eficiência anteriormente relatada do sistema sgRNA/Cas9 (9, 11, 29-32), para nosso conhecimento, a abordagem PTG/Cas9 produziu a maior eficiência de mutagênese direcionada (até 100%, Fig. 4 e Tabela 1) em plantas. Nossos resultados também demonstram que atingir um gene com dois RNAgs usando PTG aumentará grandemente a eficiência completa do gene nocaute.

Discussão

[0119] Desenvolvemos uma estratégia geral e uma plataforma para produzir múltiplos RNAgs a partir de um único gene PTG sintético através do sequestro do sistema endógeno de processamento de RNAt (Figura 1). Nós também fornecemos um contexto para desenhar, sintetizar e utilizar PTG para edição multiplex de genoma com Cas9. Estes PTG foram expressos com promotores de Pol III (por exemplo, U3p) da mesma maneira que os genes de sgRNA, mas não foram obrigados a iniciar com um nucleotídeo específico (Fig. 2). Como resultado, os atuais vetores de CRISPR/Cas9 para expressar sgRNA podiam ser utilizados diretamente para expressar PTG para a edição multiplex de genoma, como foi demonstrado neste estudo. Ao produzir múltiplos RNAgs a partir de um único gene policistrônico, a tecnologia PTG poderia ser utilizada para melhorar a mutagênese simultânea de múltiplos loci genômicos, ou a deleção de fragmentos cromossômicos curtos (Fig. 3 e 4). Tal abordagem de engenharia de genomas pode levar ao nocaute simultâneo de múltiplos genes codificadores de proteínas, ou à deleção de regiões de RNA não codantes, e outros elementos genéticos. Em adição à deleção/mutagênese direcionada, a abordagem com PTG poderia facilitar outras aplicações baseadas em Cas9, em que múltiplos RNAgs são necessários. Por exemplo, PTG poderia ser utilizada com Cas9 nickase para melhorar a fidelidade de alcance ao alvo (13, 33, 34) ou com o ativador ou repressor transcricional de Cas9 desativado para manipular múltiplas expressões gênicas (35, 36). Dada a alta precisão e capacidade de processamento da RNase P e da RNase Z que nós observamos (Figura 2), o sistema de processamento de RNAt também poderia ser utilizado como uma plataforma geral para produzir outros RNAs regulatórios (por exemplo, curtos RNA hairpins ou microRNA artificial) a partir de um único gene sintético. Estas diferentes classes de RNAs regulatórios, como RNAg e curtos RNA em hairpin, também poderia ser compactado em um único gene policistrônico para desenvolver dispositivo mais sofisticado para a engenharia genética.

[0120] Recentemente, transcritos policistrônicos que fusionaram RNAg com um RNA de 28 nt (referido como RNAg-28nt) foram utilizados com sucesso para guiar Cas9 para alvejar até quatro alvos em células humanas (12, 13). O gene sintético com arquitetura RNAg-28nt produziu RNAgs maduros com sequência extra de 28 nt na extremidade 3'e também necessitou co- expressão com a endonuclease Csy4 de Pseudomonas aeruginosa para clivar o transcrito. Em comparação com a estratégia de RNAg-28nt, nossa abordagem utiliza o robusto sistema de processamento de RNAt endógeno que permite a produção precisa de RNAgs com apenas seqüência extra de 1-4 nt na extremidade 3' do RNAg (Figuras 1 e 2), e não traz risco adicional da toxicidade da endonuclease Csy4 para os receptores. Dado o número extremamente grande de genes de RNAt com sequências variáveis, e pelo fato de que a RNase P e a RNase Z reconhecerem precisamente substratos de RNA com estruturas tipo RNAt (18, 37), existem muitas escolhas de sequência de RNAt a ser incorporadas em PTG. Além disso, o sistema de processamento de RNAt é universal em todos os organismos vivos, assim a tecnologia de PTG poderia ser adaptada diretamente a outros organismos para a engenharia de genoma mediada por Cas9.

[0121] Quando vários DSBs foram gerados por PTG/Cas9 em plantas de arroz, os indels resultantes da reparação de NHEJ propensa a erro ocorreram com mais frequência do que asdeleções de fragmentos geradas pela união direta de dois DSBs (Exemplo 2, Fig. 14 e 15). Até hoje, o mecanismo molecular pelo qual dois DSBs se ligam diretamente para gerar translocação cromossômica ou deleção de fragmentos in vivo é largamente não esclarecido. Nós especulamos que o processo que leva a tal transtorno cromossômico pode exigir dois DSBs no mesmo intervalo de tempo e é provável que seja determinado pela interação altamente dinâmica entre corte de RNAg/Cas9 e o reparo endógeno de DNA e também pela distância entre DSBs. Devido às diferenças na introdução, expressão e atividade de RNAgs e Cas9, não é surpreendente ver algumas discrepâncias na frequência de deleção de fragmentos entre protoplastos (Fig. 3B) e plantas transgênicas estáveis, e entre diferentes linhagens PTG transgênicas (Fig. 4A e Exemplo 2, Fig. 13-15). Como a tecnologia PTG permite gerar muitos DSBs em DNAs genômicos, ela pode fornecer uma ferramenta eficiente para ajudar a dissecar o processo molecular de deleção cromossômica. Mais importante ainda, a tecnologia PTG melhora significativamente a capacidade de edição multiplex e a eficiência, e espera-se que facilite aplicações Cas9 mais sofisticadas, tais como mutagênese direcionada e deleção de genes redundantes ou de elementos genéticos, modulação transcricional de múltiplos genes e vias, modificação e rotulagem de numerosos sítios genômicos, integração sítio- específico e substituição de genes.

Materiais e Métodos Materiais vegetais

[0122] Cultivares de arroz (Oryza sativa L. ssp) Kitaake e Nipponbare foram usados neste estudo. Plantas de arroz foram cultivadas em casa de vegetação ou em câmera de crescimento a 28°C dia/23°C à noite com 12 horas de luz.

Construção do vetor plasmidial

[0123] Os plasmídeos vetoriais pRGE32 foi usado para expressar transientemente U3p:sgRNA ou U3p:PTG junto com UBI:Cas9 em protoplastos de arroz e pRGEB32 foi usado para a transformação de arroz mediada por Agrobacterium (Exemplo 2, Fig. 6). Ver exemplo 2, métodos SI para os detalhes sobre a construção do vetor plasmidial.

Construções de expressão sgRNA:Cas9 e PTG:Cas9

[0124] As construções U3p:sgRNA1 e U3p:sgRNA2 foram feitas como descrito anteriormente (24). As sequências espaçadoras específicas para RNAg3-RNAg8 (Exemplo 2, Tabela 2.3) foram selecionadas utilizando a base de dados CRISPR-PLANT no site genome.arizona.edu\crispr\ (38). Os genes PTG e as construções U3p:PTG foram gerados como descrito no Exemplo 2, Métodos SI, Fig. 10-11 e Tabela 2.3. Os PTG sintetizados foram inseridos no vetor pRGE32 digerido com BsaI ou no pRGEB32 para a expressão transiente de protoplastos, ou transformação estável de arroz, respectivamente. As sequências dos genes sgRNA1, sgRNA2 e PTG utilizados neste estudo foram listadas no Exemplo 2, Tabela 2.1.

Transfecção de protoplastos de arroz

[0125] A preparação de protoplastos de arroz e a transfecção foram feitas tal como descrevemos anteriormente (24). Resumidamente, 20μg de DNA plasmidial foram usados para transfectar 2x105 protoplastos com eficiência de transfecção de ~40%-50%. Os DNAs genômicos totais de arroz foram extraídos de amostras de protoplastos 36h após a transfecção, e depois usados para análise por PCR e da sequência.

Transformação de arroz mediada por Agrobacterium

[0126] Plantas transgênicas de arroz foram geradas pela transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens usando calos derivados de sementes maduras de arroz de acordo com um protocolo convencional (39).

Extração de DNA genômico e ensaio de PCR/RE

[0127] O DNA genômico de arroz foi extraído como descrito anteriormente com o método CTAB (24). Para detectar a mutagênese nos sítios desejados, as regiões alvo foram amplificadas com primer específicos (Ver Exemplo 2, Tabela 2.2 para sequências de primer) usando GoTaq DNA polimerase (Promega). O produto de PCR foi separado em gel de agarose a 1% e corado com brometo de etídio para detectar a deleção do fragmento cromossômico. Para detectar indel em sítios específicos com PCR /RE, os produtos de PCR que englobam os sítios alvo foram digeridos com as enzimas de restrição apropriadas (RE) durante 5 horas, e depois analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%, e coloração com brometo de etídio. Os géis corados foram visualizados utilizando o sistema Gel Doc XRS (Bio-Rad) e quantificados com o programa Quantity One 4.6 (Bio-Rad). Os produtos de PCR selecionados foram clonados no vector pGEM T-easy (Promega) para sequenciamento de DNA.

Extração de RNA, cRT-PCR e PCR quantitativo

[0128] Ver Exemplo 2, métodos SI para detalhes.

Número de acesso do gene no Genebank

[0129] Os genes e o número de acesso RefSeq no Genebank são as seguintes: MPK1, Os06g0154500; MPK2, Os08g0157000; MPK5, Os03g0285800; MPK6, Os10g0533600; UBI, Os02g0161900; e PDS, Os03g0184000. Referências 1 .Jinek M, et al. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337(6096):816-821. 2 .Cong L, et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339(6121):819-823. 3 .Mali P, et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339(6121):823-826. 4 .Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013) Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods 10(10):957-963. 5 .Sander JD, Joung JK (2014) CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 32(4):347- 355. 6 .Hsu PD, Lander ES, Zhang F (2014) Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157(6):1262-1278. 7 .Wang H, et al. 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[0130] A frequência de mutação (Mut.) e mutação bialélica (Bi-Mut) em sítios alvos em linhagens transgênicas foi examinado e calculado baseado nos ensaios de PCR/RE (Exemplo 2, Fig. S8-S11). As frequências de edição nos alvos RNAg1 e RNAg2 foram comparadas entre plantas sgRNA e PTG. **, teste t- student P<0.001, * teste t-student P<0.05; n.a, não aplicado.

EXEMPLO 2 Informação Suporte (SI) Construção do vetor plasmidial

[0131] Para construir pRGE32, o fragmento UBIp de arroz foi amplificado a partir de DNA genômico da cultivar Nipponbare com um par de primer específicos (UBI-F e UBI-R, ver Tabela S2 para sequências iniciadoras). Após a amplificação do fragmento U3p-gRNA de pRGE31 (plasmídeo Addgene 50929) com os primer UGW-U3-F e UGW-gRNA-R, os fragmentos U3p-RNAg e UBIp foram unidos por PCR de extensão sobreposta com os primer UGW-U3-F e UBI-R. Desta forma, pRGE32 foi construído por Gibson Cloning (New England Biolabs) para substituir o fragmento U3p-RNAg-35S em pRGE31 com U3p-RNAg-UBIp. O vetor binário pRGEB32 (ver Fig. 6 para mapa do vetor) utilizado para a transformação de arroz mediada por Agrobacterium foi criado inserindo o fragmento U3p-RNAg-UBIp-Cas9 de pRGE32 em pCAMBIA1301-BsaI com Gibson Cloning (New England Biolabs). O pCAMBIA1300-BsaI é derivado de pCAMBIA1300 após a remoção de todos os sítios BsaI através de mutagênese dirigida. Os primer utilizados na construção de plasmídeos estão listados na Tabela 2.2.

[0132] O plasmídeo pGTR, que contém um fragmento RNAg-RNAt fusionado, foi utilizado como molde para sintetizar PTG neste estudo. Para construir o pGTR, o fragmento de RNAg scaffold foi amplificado por PCR utilizando um par de primer específicos (Bsa-RNAg-F e RNAg-R), enquanto que o fragmento RNAtGli foi amplificado como um dímero iniciador de g-RNAt-F e RNAt-R. Em seguida, estes dois fragmentos foram fusionados como RNAg-RNAt com sobreposição da extensão de PCR utilizando os primer Bsa-RNAg-F e RNAt-R. O produto da sobreposição de PCR foi separado e purificado em um gel de agarose, e depois inserido no pGEM-T easy (Promega) para gerar o plasmídeo pGTR. A sequência de fusão RNAg-RNAt em pGTR é apresentada na Tabela S1. Os primer utilizados na construção dos plasmídeos estão listados na Tabela 2.2.

Extração de RNA total, cRT-PCR e PCR quantitativo

[0133] Os RNAs totais foram extraídos de protoplastos utilizando o Reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. O cRT-PCR foi esquematicamente representado na Fig. 7 e realizada como se segue. Para circularizar o RNA, 1 μg de RNA total foi incubada em uma reação de 20 μl contendo 1 x tampão T4 RNA ligase (New England Biolabs), 50 μM de ATP, 10% de PEG8000, 20 U de inibidor de RNase (New England Biolabs) e 10 U de T4 RNA ligase (New England Biolabs). A ligação foi realizada a 25°C durante 4 h. Em seguida, 10 U de DNase I (New England Biolabs) foram adicionados à reação de ligação para remover a contaminação do DNA genômico a 25°C por 20 min. Em seguida, o RNA circularizado foi purificado com Reagente TRIzol (Life Technologies) e dissolvido em água livre de nuclease. Um total de 200 ng de RNA circularizado foi misturado com dNTP 0.5 mM e 1 μM de oligos específicos para o espaçador de RNAg (RNAg1-R e RNAg2-R, ver Tabela S2) e desnaturado a 70°C durante 5 min. Após resfriar em gelo, foram adicionados tampão de transcriptase reversa MuMLV 1 x, 20 U de inibidor de RNase (New England Biolabs) e 10 U de MuMLV transcriptase reversa (New England Biolabs) para sintetizar o primeiro DNAc a 42°C durante 1 hora. Os controles negativos sem adição de MuMLV transcriptase reversa (-RT) foram também realizados para todas as amostras. Após a transcrição reversa, MuMLV foi inativado a 70°C durante 10 min. Em seguida realizou-se a PCR com a seguinte reação de 50 μl: um vigésimo do primeiro DNAc, tampão 1X Phusion HF, 0.2 mM dNTPs, 0.5 μM de primer diretos, 0.5 μM primer reversos e 1U de DNA polimerase Phusion (Thermo Scientific). Os produtos de PCR resultantes foram analisados com eletroforese em gel de agarose a 2%. Os produtos de cRT- PCR foram então sequenciados após clonagem no vector pGEM-T easy (Promega). Ver tabela 2.2 para as sequências dos primers usados no cRT-PCR.

[0134] Para o RT-PCR quantitativo, os RNA totais tratados com DNase I foram transcritos inversamente para produzir DNAcs utilizando um iniciador específico RNAg-R juntamente com MuMLV (New England Biolabs), de acordo com as instruções do fabricante. O PCR em tempo real foi realizado usando GoTaq qPCR Master Mix (Promega) no sistema StepOnePlus Realtime PCR (Life technologies). Os primers RNAg1-F e RNAg-R foram utilizados para sgRNA1 e PTG1, e RNAg2-F e RNAg-R foram utilizados para sgRNA2 e PTG2. O gene UBI de arroz foi utilizado como referência interna para quantificação relativa. Ver Tabela S2 para sequências de primers.

[0135] Para quantificar a eficiência de deleção, o PCR quantitativo foi realizado utilizando 10 ng do DNA genômico como molde para amplificar os fragmentos genômico dentro dos loci MPK5 ou UBI. Um par de primer específicos (MPK5-qF e MPK5-R611, Tabela S2) que englobam o sítio de corte de RNAg2 foram utilizados para amplificar cópias de MPK5 não contendo deleção de fragmento (Fig. S1A). A quantidade relativa (RQ) do fragmento MPK5 sem deleção foi calculada utilizando UBI como um gene de referência. Uma vez que apenas os fragmentos MPK5 sem deleção foram amplificados, a eficiência de deleção do fragmento pode ser estimada em 100% -RQ (Tabela 2.4).

Síntese de genes RNAt-RNAg (PTG) policistrônico pela montagem Golden Gate

[0136] Os genes PTG foram sintetizados com base no princípio da montagem de Golden Gate (GG), a qual é amplamente utilizada para montar partes de DNA como efetores do tipo ativador de transcrição personalizado (TALE). Nossa abordagem de montagem permite sintetizar PTGs com diferentes combinações de RNAgs usando os mesmos componentes. Por exemplo, fizemos PTG3-PTG9 com o mesmo conjunto de oligonucleotídeos (Tabela S3). Pela reação hierárquica de montagem GG, dois PTGs poderiam ser unidos para criar um PTG mais longo (como PTG9). PTGs com não mais do que 6 RNAgs (por exemplo PTG1-PTG8) poderia ser sintetizado por um passo de montagem GG (Nível 1, Fig. 10), enquanto que PTGs com mais de 6 RNAgs (por exemplo, PTG9) requerem dois ou mais passos de montagem GG (Nível 2, Fig. 11). Os diagramas esquemáticos da abordagem de síntese de PTG são mostrados na Fig. 10 e 11, e os detalhes da concepção de primer, montagem de GG e construção de plasmídeos são descritos como se segue.

Passo 1. Desenho dos primers para amplificar partes de RNAg- RNAt

[0137] Para ligar várias partes de DNA em uma ordem desejada, a montagem de GG requer caudas distintas de 4 pb para ligar duas partes de DNA após digestão com BsaI (ou outras endonucleases de tipo II, tais como AarI, BbsI, BsmAI, BsmBI). O espaçador de RNAg é a única sequência única em PTG (Fig. 1C), desta forma os PTGs devem ser divididos em partes de DNA dentro da região espaçadora de RNAg. Conforme ilustrado na Fig. 10A e 10B, um espaçador de RNAg foi dividido em duas partes com cauda de 4 pb e cada metade do espaçador foi sintetizada dentro de oligonucleotídeos com um sítio BsaI. Os detalhes para desenhar primer específicos de RNAg são descritos abaixo: 1.1 Selecionar uma sequência longa de 4 pb dentro de cada espaçador de RNAg como caudas de BsaI na montagem GG. A sobreposição pode ser quaisquer 4 nucleotídeos consecutivos do espaçador de RNAg. Note que as partes de DNA que se reuniram na mesma reação de GG devem ter uma cauda distinta de 4 pb e não podem ser 5'-GGCA-3 'ou 5'- AAAC-3' que são utilizadas em adaptadores terminais para clonagem em pRGE32 e pRGEB32 (Fig. 6). 1.2 Desenhar as sequências dos primers como segue (ver também Fig. 6): Neste exemplo, o 9° ao 12° nucleotídeo de um espaçador de 20 nts da RNAg [x] é escolhido da cauda BsaI para clonagem GG: Nota: Quaisquer 4 nucleotídeos consecutivos no espaçador podem ser selecionados como cauda para a montagem GG. Isso permite a seleção de uma cauda específica para cada parte de DNA na montagem GG. As duas bases terminais 5' (mostradas em minúsculas) são nucleotídeos adicionados aleatoriamente para melhorar a digestão por BsaI de produtos de PCR. A cor vermelha indica a sequência complementar reversa ao espaçador. As letras minúsculas na extremidade 3' indicam bases que se anelam ao RNAg (iniciador direto) ou com RNAt (iniciador reverso).

Passo 2. Montagem GG nível 1 (Construção de genes PTG1-PTG8)

[0138] Ver Fig. S6C para a estratégia geral do nível 1 de montagem GG de PTGs. 2.1. Configurar reações de PCR de 50μl para amplificar partes de DNA para construção de PTG.

[0139] Para construir PTG usado neste estudo, os primers forward e reverso para amplificar partes do nível 1 foram adicionados da seguinte forma:

[0140] Os PCRs foram corridos com o seguinte programa: 2.2. Os produtos de PCR foram purificados com o kit Spin Column PCR Products Purification kit (BioBasic). 2.3. Partes individuais foram unidas por montagem GG com a seguin te reação:

[0141] Para as reações de montagem GG para construir PTG1-PTG8, as partes do nível 1 foram adicionadas da seguinte forma: 2.4. As reações de GG foram realizadas em termociclador (Bio-Rad) por incubação a 37° C, 5 min e 20° C, 10 min durante 30-50 ciclos; E depois mantida a 20°C durante 1 hora. 2.5. O produto da reação GG foi diluído em 180μl de H20. 2.6. Os produtos da montagem GG nível 1 foram amplificados em reação de PCR de 50 μl:

[0142] O PCR foi corrido em termiciclador (Bio-Rad) com o seguinte programa: 2.7. Purificar o produto de PCR com o kit Spin Column PCR Products Purification (Bio Basic). 2.8. Digerir o produto de PCR purificado com Fok I (NEB). 2.9. Separar os produtos digeridos com Fok I em gel de agarose a 1%; Excisar as bandas de DNA com o tamanho esperado do gel e, em seguida, purificá-las com o kit Spin Column DNA Gel Extraction Kit (Bio Basic). 2.10. Ligar o fragmento GG digerido com Fok I nos vetores pRGE32 ou pRGEB32 digeridos com BsaI com T4 DNA ligase (NEB). 2.11. Transformar o produto de ligação em E. coli DH5α, purificar os plasmídeos recombinantes e confirmar as construções por sequenciamento Sanger.

Nível 3. Montagem GG nível 2 (construir PTG9 por montagem GG em dois passos)

[0143] O diagrama esquemático da montagem GG de nível 2 é mostrado na Fig.11. A montagem GG nível 2 é usada para sintetizar PTGs com mais de seis gRNAs. Tal PTG comprido é construído unindo dois PTGs menores (partes de nível 2). Estes dois PTGs pequenos são sintetizados por montagem GG de nível 1 e contêm um RNAg que se sobrepõe, como uma ponte (RNAg ponte, Fig. 11) para ligar as partes de nível 2 em uma próxima reação de montagem. Para amplificar as partes de nível 2 a partir de PTG montados no nível 1, um par de primers específicos, que se anelam apenas ao espaçador de RNAg ponte, é necessário para o PCR com os primers adaptadores terminais (S5AD5-F e S3AD5-R). Neste estudo, o PTG9 foi sintetizado com esta abordagem e RNAg7 foi utilizado como o RNAg ponte. 3.1. Desenhar primers espaçadores específicos de RNAg ponte para amplificar partes do nível 2.

[0144] Quaisquer 4-bp consecutivos podem ser selecionados como cauda para a montagem do GG. Neste exemplo, N9-N10-N11-N12 foi selecionado com cauda. Nota: As duas bases terminais 5' (mostradas em letras minúsculas) são nucleotídeos adicionados aleatoriamente para melhorar a digestão por Bsa I de produtos de PCR. A cor vermelha indica a sequência complementar reversa ao espaçador. 3.2. Montar reações GG com as seguintes partes do nível 1 geradas a partir de 2.1.-2.2

[0145] A montagem GG nível 1 foi conduzida da mesma maneira que os passos 2.4.-2.5. 3.3. Amplificar partes do DNA do nível 2 com os seguintes primers e moldes:

[0146] A condição do PCR é a mesma que o passo 2.6. 3.4. Separar os produtos de PCR em gel de agarose a 1%. Excise as bandas de PCR com o tamanho esperado a partir do gel e purifique-as com o kit Spin Column DNA Extraction Gel (Bio Basic). 3.5. Configurar as reações de montagem do GG para unir duas partes de DNA (L2-P1 e L2-P2). 3.6. Realizar as reações de montagem GG em um termociclador (Bio-Rad), utilizando o seguinte programa: 37°C, 5 min; 20°C, 10 min durante 25 ciclos; e 20°C durante 1 hora. 3.7. Amplificar os produtos montados GG nível 2 com S5AD5- F e S3AD5-R, em seguida, insira o produto amplificado em pRGE32 ou pRGEB32 utilizando o mesmo procedimento como passos 2.6-2.11. Tabelas Exemplo 2 Tabela 2.1. Sequência de genes sintéticos usados neste estudo

[0147] As sequências estão anotadas como segue: Os últimos 10pb de U3p (SEQ ID NO:14: sublinhado) RNAg scaffold: negrito pre-RNAt (SEQ ID NO:13): em caixa, negrito itálico. RNAg espaçador: itálico Terminador PolIII (TTTT..T): fundo cinza Tabela 2.2. Primers usados para construção de plasmídeos, cRT-PCR e genotipagem Tabela 2.3. Oligos nucleotídeos usados para sintetizar genes PTG

[0148] a As letras nos boxes indicam as sequências da cauda na montagem Golden Gate.

[0149] b As duas primeiras letras são nucleotídeos adicionados aleatoriamente. As sequências em negrito itálico indicam os locais BsaI (5'-GGTCTCN-3', N indica qualquer nucleotídeo), as sequências sublinhadas são parte do RNAg espaçador enquanto que as sequências em negrito são caudas, após digestão com BsaI. Consulte Métodos SI para obter detalhes sobre o desenho do primer e montagem do PTG. As sequências em letras minúsculas são específicas para o RNAg scaffold (5'-gttttagagctagaa-3 ', em primers forward) ou RNAt (5'-tgcaccagccggg-3', em primers reversos). Tabela 2.4. Determinação da frequência de deleção do fragmento cromossomal no locus MPK5 em protoplastos de arroz por qPCR

[0150] A eficiência de deleção do fragmento no locus MPK5 foi estimada com qPCR utilizando DNA genômico como molde e um par de primers específicos que englobam o sítio de corte de RNA2g dentro de MPK5 (Figura S1A). Como o locus MPK5 com deleção de fragmento não seria amplificado, a eficiência de deleção (Del.) poderia ser estimada com 100% -QR. Os mesmos DNAs genômicos na Fig. 3B foram usados e o gene UBI serve como referência para quantificação relativa. Ct, ciclo thereshold; DP, desvio padrão; QR, quantidade relativa; QR-Min e QR-Max indicam o intervalo de confiança de 95% de QR.

EXEMPLO 3 RNAt policistrônico e CRISPR RNA guia permitem a engenharia genômica multiplex altamente eficiente em células humanas

[0151] Durante os últimos três anos, as repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e proteínas nucleases associadas à CRISPR têm emergido como as ferramentas mais poderosas para a edição de genomas em muitos organismos (1-4). A endonuclease Cas, mais comumente utilizada para a edição do genoma, é a Cas9 de Streptococcus pyogenes (referido como Cas9 daqui em diante). A proteína Cas9 é guiada por um RNA guia curto artificial (RNAg) para clivar o DNA, cuja sequência é complementar à extremidade 5' do RNAg e precedida com o motivo adjacente protospaçador (MAP, 5'-NGG-3') 5-7). Este simples sistema de alvejar o DNA guiado por RNA melhorou fundamentalmente a nossa capacidade de acessar sítios genômicos específicos para manipulação genética. O sistema CRISPR-Cas9 foi desenvolvido para mutagênese dirigida, integração do fragmento de DNA sítio específica e a manipulação precisa de cromossomos, tais como deleção e translocações de grandes segmentos, etc. A nuclease defeituosa Cas9 (Cas9d) e RNAg foram também manipulados para controlar a expressão de genes alvo (8-11) e marcar loci específicos dos cromossomos (12) in vivo. Estas ferramentas baseadas em Cas9 facilitam muito a pesquisa básica e a prática da biotecnologia em vários campos da medicina e da agricultura.

[0152] A engenharia genômica mediada por Cas9, robusta e eficiente, requer o controle da expressão de Cas9 e de RNAg in vivo. A expressão de Cas9 poderia ser controlada de forma rápida e precisa utilizando o promotor de DNA Polymerase II, enquanto que a expressão eficiente de RNAg, que é um pequeno RNA não codificante, continua a ser um gargalo. Particularmente, muitas aplicações baseadas em Cas9 requerem expressão simultânea de múltiplos RNAgs. Por exemplo, é necessário um par de RNAgs para editar um sítio na edição de genoma mediada pela nickase Cas9 (9,14) e por dCas9-FokI (15,16), que ajuda a reduzir o risco de erro ao alvo, associado ao sistema original CRISPR-Cas9. Na regulação transcricional mediada por dCas9, são necessários múltiplos RNAgs para a ativação ou supressão robusta de genes, ou para a geração de dispositivo sofisticado de circuito transcricional (10,17,18). Geralmente, a expressão de RNAg é conduzida por promotores de polimerase III, tais como os promotores de genes snoRNA U3 e U6, amplamente utilizados. Contudo, estes promotores Pol III transcrevem o RNAg a partir de nucleotídeos específicos. Por exemplo, o promotor U3 transcrito do "A" e do promotor U6 inicia uma transcrição com "G". Isto restringe o espaçador alvo de Cas9-RNAg. Portanto, é necessária uma estratégia de expressão de RNAg mais robusta para aumentar a capacidade das ferramentas CRISPR-Cas9.

[0153] Recentemente, demonstramos que o sistema de processamento de RNA transportador endógeno (RNAt) poderia ser projetado para aumentar a capacidade multiplex de alvejar de Cas9 (19). Múltiplos RNAgs foram expressos em tandem a partir de um gene artificial policistrônico RNAt-RNAg (PTG). As RNases endógenas P e Z reconhecem o RNAt e clivam precisamente o PTG para liberar RNAst e RNAgs. Este sistema não só permite a expressão simultânea de muitos RNAgs, mas também aumenta a transcrição de Pol III uma vez que o RNAt também atua como um amplificador interno ou promotor. O sistema PTG foi implementado em plantas, mas especulamos que seria funcional em todos os organismos porque o sistema de processamento de RNAt é altamente conservado em todos os organismos vivos. Neste estudo, adaptamos a tecnologia Cas9-PTG para a edição do genoma humano. Os genes de PTG foram feitos para expressar simultaneamente de 2 a 6 RNAgs para a edição precisa do genoma de um a quatro genes da histona desacetilase (HDAC). Nosso estudo demonstra que o sistema de RNAt poderia ser construído como uma ferramenta versátil para a edição eficiente e multiplex do genoma em sistemas humanos e animais.

MATERIAIS E MÉTODOS Construção do vetor plasmidial

[0154] Para construir o vector pSicoR-sgRNAs-mCherry-Cas9, o fragmento puromicina em pSico-EF1-mCh-Puro (Addgene Plasmid 31845) (20) foi fusionado com o fragmento NLS-Cas9-NLS de pX260 (Addgene Plasmid 42229). Em seguida, o RNAg scaffold com o sítio de clonagem contendo dois sítios BbsI foi inserido acima do promotor U6. V O esquema do vector pSico-sgRNA- mCherry-Cas9 é mostrado na Figura 18.

Montagem dos genes PTG

[0155] Para editar genes HDAC (HDAC1/2/3/4/6) em células humanas, um par de sítios alvo separados por 250-500 pb foi selecionado para cada gene com base na presença de MAP e na especificidade de sequência protospaçadora (Tabela 3.1). Um total de sete genes PTG (hPTG1 a hPTG7, Tabela 3.2) foram montados in vitro utilizando oligonucleotídeos sintetizados (Tabela 3.3). A síntese in vitro dos genes hPTG foi realizada como descrito anteriormente (19).

Cultura celular e transfecção

[0156] Células de rim embrionário humano 293 (HEK293) foram cultivadas em DMEM (Sigma) com 10% de soro bovino fetal (Atlanta Biologicals), 10 unid/mL de penicilina e 10 μg/mL de estreptomicina (Gibco). O meio de cultura foi substituído a cada 2 dias e foi sub-cultivado quando as células atingiram de 80% a 90% de confluência.

[0157] Para transfecção, células HEK293 foram crescidas em placas de seis poços a 3x105 células por poço. Depois de atingir 70% de confluência, as células foram transfectadas com plasmídeos e polietilenimina (PEI). Resumidamente, as células foram alimentadas com meio de cultura fresco uma hora antes da transfecção. Em seguida, adicionaram-se 3 μg de DNA plasmidial e 12 μg de PEI em cada poço. As células transfectadas foram incubadas durante 5 horas em um incubador de CO2 e cultivadas durante 48 horas adicionais com meio de cultura fresco.

cRT-PCR e RT-PCR quantitativo

[0158] Os RNAs totais foram extraídos de células HEK293 com Reagente Trizol (Life Technologies) e tratados com DNase I (New England Labs). Para amplificar o RNAg, foi feito o cRT- PCR, tal como descrito anteriormente. Resumidamente, o RNA total foi auto-ligado com T4 RNA ligase (New England Labs), e depois purificado com Reagente Trizol. O RNA total ligado foi transcrito inversamente utilizando primers específicos de RNAg e transcriptase reversa de MMLV (New England Labs). O cDNA foi amplificado utilizando primers específicos (ver Tabela 3.3 para sequências) e clonados em pGEM-T easy (Promega) para sequenciamento Sanger. Extração de DNA e PCR

[0159] As células transfectadas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e lisadas em tampão de lise (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM e EDTA 10 mM) e o DNA genômico foi então precipitado com isopropanol. Para detectar a deleção de fragmentos entre dois sítios alvo dentro de cada gene, os primers de PCR que abrangem os sítios alvos foram concebidos para cada gene HDAC (Tabela S2). As amplificações por PCR foram realizadas em reações contendo 800 ng de DNA genômico, 0,2 mM de dNTP, 0.4 uM de primers, 1 x tampão de PCR e 1 unidade de DreamTaq DNA polimerase (Thermo Fisher Scientific). O produto de PCR foi separado em gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etídio para detectar a deleção do fragmento cromossômico. A eficiência de eliminação de fragmentos foi estimada com ImagemJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Adicionalmente, o fragmento de PCR foi clonado em pGEM-T easy (Promega) para sequenciamento Sanger.

RESULTADOS E DISCUSSÃO PTG permite a produção eficiente de múltiplos RNAgs em células humanas

[0160] Demonstramos anteriormente que o PTG com RNAt-RNAgs em tandem não só permitiu o processamento preciso e a produção eficiente de múltiplos RNAgs, mas também permitiu Cas9 alvejar simultaneamente múltiplos sítios genômicos em plantas. Especulamos que os genes de PTG também devem aumentar a eficácia de alvo CRISPR/Cas9 em animais porque o RNAt e seu sistema de processamento é altamente conservado em todos os organismos vivos. Para demonstrar a utilidade do PTG para a edição do genoma no sistema animal, primeiro examinamos a precisão de excisão do RNAg dos transgenes hPTG1 e hPTG2 em células humanas. Cada um dos genes PTG artificiais codifica dois RNAgs. Enquanto hPTG1 expressa HDAC1-sg1 e HDAC2-sg2, hPTG2 expressa HDAC2-sg1 e HDAC2-sg2 (Tabela 3.2).

[0161] Após a transfecção das construções hPTG1 e hPTG2 em células HEK293, realizou-se cRT-PCR para mapear a extremidade 5 'e 3' de RNAgs maduros. Os produtos de cDNA previstos com tamanho esperado de RNAg simples (~ 96nt) foram detectados no cRT-PCR, apesar da presença de alguns produtos amplificados não especificamente. (Figura 19A). Conforme ilustrado nas Figuras 19A e 19C, o sequenciamento de DNA destes produtos de cDNA indicou que os RNAgs maduros foram processados precisamente a partir de genes hPTG com a extremidade 5' desejada, a qual contém sequências que guiam o direcionamento. Como observamos anteriormente em plantas, o RNAg derivado de PTG tem dois nucleotídeos adicionais (5'-AA-3 ') nas extremidades 3', se preceder o RNAt, ou tem dois T adicionais, se preceder um terminador Pol III. Detectamos também uma poliadenilação putativa na extremidade 3' do HDAC2-sg2 maduro. Estes resultados sugerem que os genes PTG podem ser processados pelo sistema de processamento de RNAt humano para produzir múltiplos RNAgs.

Cas9-PTG permite a edição multiplex de genomas em células humanas

[0162] Para examinar a eficiência do método PTG para a edição multiplex do genoma, células humanas foram transfectadas com sete construções plasmídicas que expressam diferentes genes hPTG e Cas9. Estes genes hPTG codificam RNAgs múltiplos direcionados para cinco genes HDAC localizados em diferentes cromossomos. hPTG1 a hPTG 5 foram utilizados para alvejar dois sítios genômicos para cada gene dentro de HDAC1, 2, 3, 4 e 6; e hPTG6 e hPTG7 foram desenhados para simultaneamente alvejar HDAC3 e 2, respectivamente (Tabela 3.2). Como usamos dois RNAgs para editar um gene, a eficiência de Cas9-PTG pode ser estimada pela medição da frequência de deleção de fragmento cromossômico dentro de cada gene alvo. Como previsto, foram detectadas amplicons de PCR truncados em todas as amostras (Figura 20). A análise da sequência de DNA confirmou ainda que estas deleções cromossômicas foram introduzidas por Cas9-PTG em células transfectadas (Figura 21). As frequências de deleção entre dois sítios alvos de RNAg foram de 40-50% com base no cálculo da intensidade da banda de DNA. Curiosamente, a eficiência de diferentes genes hPTG com número variável de alvos foram comparáveis. Por exemplo, hPTG2 (2 RNAgs) e hPTG6 (6 RNAgs) resultaram em deleção de fragmento do locus HDAC2 a ~ 40% de frequência, apesar da sua diferença nos números de RNAg. Nossos resultados demonstram que o método PTG pode ser usado para expressar eficientemente múltiplos RNAgs e edição simultânea de múltiplos sítios, não só em plantas, mas também em células humanas. Uma vez que a estratégia PTG não utiliza múltiplos promotores e terminadores, isto reduz drasticamente o tamanho da construção de RNAg. Como resultado, é mais adequado e eficaz para vários propósitos de edição do genoma, tais como a introdução mediada por vírus de múltiplos RNAgs para terapia gênica humana. REFERÊNCIAS 1 .Doudna, J.A. and Charpentier, E. (2014) Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 346, 1258096. 2 .Hsu, P.D., Lander, E.S. and Zhang, F. (2014) Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 157, 1262-1278. 3 .Sander, J.D. and Joung, J.K. (2014) CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol., 32, 347-355. 4 .Mali, P., Esvelt, K.M. and Church, G.M. (2013) Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat. Methods, 10, 957963. 5 .Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A. and Charpentier, E. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 816-821. 6 .Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E. and Church, G.M. (2013) RNA- guided human genome engineering via Cas9. Science, 339, 823826. 7 .Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A. et al. 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(2015) Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. PNAS, 112, 3570-3575. 20 .Salomonis, N., Schlieve, C.R., Pereira, L., Wahlquist, C., Colas, A., Zambon, A.C., Vranizan, K., Spindler, M.J., Pico, A.R., Cline, M.S. et al. (2010) Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. PNAS, 107, 10514-10519. TABELAS E LEGENDAS DAS FIGURAS Tabela 3.1. Sequências dos alvos para edição do genoma Tabela 3.2. Estrutura dos genes hPTG Tabela 3.3A Primers usados para a síntese de hPTG Tabela 3.3B Sequência dos primers para genotipagem

EXEMPLO 4 Caracterização de mutações hereditárias em múltiplos genes de arroz proximamente relacionados criados pela edição de genoma mediada por PTG/Cas9

[0163] Neste estudo, demonstramos que PTG/Cas9 é uma ferramenta poderosa para mutar genes proximamente relacionados, criando de uma a oito mutações em diferentes combinações de quatro genes da proteína quinase associada a mitógeno (MPK) de arroz, com eficiência de 66 a 100%. PTG/Cas9 foi removido por autopolinização e as plantas T1 e T2 livres de transgenes carregaram todas as oito mutações ou deleções cromossômicas. As mutações induzidas resultaram de deleção ou inserção de múltiplos pares de bases e, por vezes, de deleções cromossômicas. Demonstramos que PTG/Cas9 produz, de forma confiável, múltiplas mutações que podem ser transmitidas de forma estável para as gerações subsequentes.

[0164] Novas ferramentas de edição do genoma, recentemente, tem prometido mutar quase qualquer gene em um determinado genoma. A mutação de genes é conseguida induzindo uma quebra de dupla fita (DSB) no sítio alvo, a qual é reparada pela célula. A via de ligação não-homóloga (NHEJ) imperfeita é a via de reparação prevalente do DSB e a sua natureza errônea leva a inserções ou deleções (indels) de nucleotídeos durante o reparo. Estes indels podem causar nocaute de genes, se as mutações impedirem ou alterarem a transcrição do gene ou da tradução. Uma reparação mais precisa através da recombinação homóloga é, teoricamente, possível se um modelo doador, com homologia suficiente ao sítio DSB estiver presente, mas plantas superiores possuem baixa taxa de recombinação de homologia intrínseca (Voytas, 2013). As principais ferramentas para conseguir DSBs sítio-direcionados em um genoma são as nucleases zinc-finger (ZFNs), nucleases efetoras tipo ativadoras de transcrição (TALENs) e, mais recentemente, as repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e o sitema proteína associada à CRISPR 9 nuclease (Cas9). A capacidade de alvejar de ZFNs e TALENs depende da interação proteína:DNA e, portanto, novos domínios de ligação têm de ser construídos para alterar o sítio alvo das nucleases (Voytas, 2013). O sistema CRISPR/Cas9 é muito mais fácil de programar porque a endonuclease Cas9 pode ser reciclada para cortar um sítio alvo diferente com base nas interações RNA:DNA do chamado RNA guia único (RNAg, Jinek et al., 2012). As 20 bases na extremidade 5' do RNAg (espaçador RNAg) são complementares à sequência alvo do DNA genômico (protoespaçador) ao lado do motivo adjacente ao protoespaçador (MAP, 5'-NGG-3' no caso de Cas9 de Streptococcus pyogenes, Jinek et al., 2012, Cong et al., 2013, Mali et al., 2013). O sistema CRISPR/Cas9 tem sido utilizado com sucesso na edição de genomas de Arabidopsis, tabaco, N. benthamiana, batata, tomate, soja, laranja doce, hepáticas, milho, sorgo, trigo e arroz para nocaute de genes (Brooks et al., 2014; Cai et al., 2015; Jia and Wang, 2014; Jiang et al., 2013; Li et al., 2013; Miao et al., 2013; Shan et al., 2013; Sugano et al., 2014; Xie and Yang, 2013).

[0165] Além de seu desenho fácil, o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado para alvejar praticamente qualquer gene. Ao usar SpCas9, 97.1% de todas as unidades de transcrição em Arabidopsis, e 89.6% das unidades de transcrição em arroz podem ser alvejadas com espaçadores RNAg altamente específicos (Xie et al., 2014a). Os genes restantes poderiam ainda ser alvo de variantes de Cas9 com diferentes requisitos de MAP para RNAgs específicos.

[0166] Uma das maiores vantagens do sistema CRISPR/Cas9 pode ser a sua capacidade para edição multiplex de genomas. A endonuclease Cas9 pode, teoricamente, alvejar múltiplos alvos simultaneamente, se vários RNAgs estão co-expressos. Isso permite que pesquisadores alvejem vários genes para nocauteá- los, e para criar duplo, triplo, ou até mesmo décuplo mutantes em uma única etapa. No entanto, a maioria dos vetores de edição multiplex utiliza vários cassetes de expressão de RNAg que conduzem cada RNAg com o seu próprio promotor Pol III e terminador (Li et al., 2013, Lowder et al., 2015, Ma et al., 2015a). Cada cassete de expressão de RNAg individual tem comprimento típico de 500 a 820 pb, e deixa a edição multiplex de genoma em plantas ainda um desafio porque o número de RNAgs expressáveis simultâneos é limitado pela capacidade do vetor e pela eficiência de clonagem. Mesmo que mais de seis destes cassetes de expressão possam ser criados, a montagem é ineficaz e falha frequentemente (Lowder et al., 2015). As técnicas comuns de transformação de plantas tipicamente fornecem o dispositivo de edição do genoma, como os plasmídeos, por transfecção de protoplastos ou bombardeamento de partículas, ou T- DNA via Agrobacterium. A expressão de múltiplos RNAgs a partir de uma única transcrição, ao invés de vários cassetes individuais, é uma alternativa promissora para superar esta limitação.

[0167] Nós já melhoramos a capacidade multiplex de CRISPR/Cas9 na edição de genoma introduzindo um gene RNAt-RNAg policistrônico (PTG) que produz múltiplos RNAgs a partir de um único gene artificial (Figura 1, Xie et al., 2015). Este gene consiste em sequências de RNAt-RNAg dispostas em tandem, precedidas por um promotor Pol III e seguidas por um terminador Pol III. A sequência de RNAt utilizada, pretRNA de glicina de arroz, como revelado nos Exemplos 1 e 2 foi utilizada com sucesso em vários organismos, incluindo C. elegans, moscas da fruta e células de mamíferos para edição multiplex de genomas. Cada repetição em tandem tem menos de 180 pb de comprimento comparado com, pelo menos 500 pb necessários para um cassete individual. Cada RNAg pode conter um espaçador único que reconhece um alvo diferente, permitindo alvejar, simultaneamente, múltiplos sítios genômicos em uma transformação (Figura 22). A RNase P e a RNase Z endógenas reconhecem a estrutura secundária do RNAt (Barbezier et al., 2009, Canino et al., 2009, Gutmann et al., 2012, Phizicky and Hopper, 2010, Schiffer et al.2002) e cortam o RNAt em locais específicos para liberar RNAgs maduros, que direcionam a endonuclease Cas9 para múltiplos alvos específicos (Figura 22). Além disso, a expressão de RNAgs com um PTG é até 30 vezes superior à expressão com um simples promotor Pol III, provavelmente porque os boxes A e B do RNAt podem aumentar a transcrição do transcrito primário de PTG (Xie et al. 2015). A capacidade de mutar simultaneamente vários genes é especialmente útil para analisar genes proximamente relacionados, os quais tendem a apresentar funções semelhantes ou sobrepostas. Atualmente, os pesquisadores precisam encontrar linhagens mutantes confiáveis e cruzá-las para obter mutantes de ordem dupla ou superior. A tecnologia PTG/Cas9 pode melhorar significativamente a análise de genes proximamente relacionados porque um número elevado de genes múltiplos pode ser eficientemente alvejado em uma única transformação.

[0168] Neste estudo, testamos a capacidade de PTG/Cas9 de criar recursos mutantes para estudar genes proximamente relacionados mutando, com êxito, quatro membros da família gênica da PROTEÍNA QUINASE ASSOCIADA A MITÓGENO (MPK) tipo TEY de arroz em combinações de mutantes único, duplo e quádruplo com até oito RNAgs co-expressos. As MPKs são importantes transdutores de sinal, que são conhecidos por terem funções parcialmente sobrepostas em Arabidopsis (Beckers et al., 2009; Pitzschke et al., 2009). Mostramos ainda que as mutações induzidas têm grande variedade, e que mutações e deleções cromossômicas são confiavelmente herdadas por futuras gerações livres de transgenes. Descobrimos, no exemplo de MPK1, que os genes essenciais são mais difíceis de nocautear, uma vez que as mutações tendem a preservar o quadro aberto de leitura existente. Este estudo demonstra que genes proximamente relacionados podem ser editados e mutados simultaneamente com a tecnologia PTG/Cas9 multiplex, e, mutantes de genes múltiplos isentos de transgene podem ser obtidos por herança estável para estudar complexas famílias de genes e redes de genes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Processo altamente eficiente para alvejar quatro genes MPK de arroz proximamente relacionados com PTG/Cas9

[0169] Desenhamos construções genéticas para transformação mediada por Agrobacterium para mutar MPKs de arroz responsivos a estresse, de maneira simples ou com combinações, e explorar se os PTGs podem produzir mutações estáveis de maneira confiável para dissecar a função de genes proximamente relacionados e famílias gênicas (Tabela 1). Os genes ortólogos de MPK em Arabidopsis se sobrepõem em suas funções e, em parte, compensam em mutantes únicos (Asai et al, 2002; Beckers et al., 2009). As construções gênicas portadoras de PTG/Cas9 foram desenhadas para alvejar genes MPK únicos, ou combinações destes, em mutantes duplos e quádruplos (Tabela 4.1). PTGb3, PTGb4, PTGb5 e PTGb6 carregaram Cas9 dirigido por um promotor ubiquitina de arroz (UBIp:Cas9), e PTGs dirigidos pelo promotor de U3 de arroz (U3p:PTG) para alvejar MPK1, MPK2, MPK6 e MPK5, respectivamente, para a criação de mutantes simples (Tabela 4.1). Os PTGs para mutantes simples codificaram dois RNAgs alvejando um gene. Uma construção adicional, PTGb2, alvejou MPK5 com apenas um RNAg no protospaçador 2 (PS2; Figura 17). PTGb7 e PTGb8 continham PTGs com cada quatro RNAgs direcionados para MPK5/MPK1 e MPK6/MPK2 para criar mutantes duplos (Tabela 4.1). Escolhemos estes pares de genes MPK com base na sua estreita relação filogenética na família MPK de arroz (Reyna and Yang, 2006). A criação de mutantes duplos de genes MPK de arroz pode ajudar a descobrir funcionalidades redundantes e semelhantes à observada anteriormente em Arabidopsis. PTGb9 incluiu um PTG de oito RNAgs para mutar todos os quatro genes MPK de arroz proximamente relacionados em um único evento de transformação.

[0170] Nosso estudo anterior confirmou a funcionalidade de todos os RNAgs utilizados em protoplastos de arroz e determinou a eficiência de mutação (86 - 100%) de PTGb6 (MPK5), PTGb7 (MPK5/1) e PTGb9 (MPK5/1/6/2) em plantas transgênicas de arroz produzidas por transformação mediada por Agrobacterium (Xie et al., 2015). Neste estudo, nós alvejamos MPK1, MPK2, MPK6 e MPK6/2 para investigar se poderíamos mutar estes genes de MPK únicos, e em combinação, com porcentagem elevada similar de plantas com genoma editado. A transformação com PTGb3 (MPK1), PTGb4 (MPK2) e PTGb5 (MPK6), cada, proporcionaram eficiência de edição de genoma de 100% para as linhagens testadas (Tabela 4.1, Figuras 28 e 29). No entanto, as eficiências foram menores quando atingiu MPK6 e MPK2 simultaneamente (PTGb8), com 83% para o MPK6, e 66% para o locus MPK2 (Figura 30). Testamos a eficiência de transformação em apenas um dos dois sítios alvo por gene porque apenas um protospaçador forneceu um sítio conveniente para enzima de restrição (RE) para o ensaio PCR-RE (Figura 27). Portanto, a eficiência real de edição para PTGb8 poderia ser maior do que a medida 83% e 66%, se todos os quatro sítios alvo fossem considerados. O principal objetivo da transformação PTGb8 era obter duplos mutantes mpk6/mpk2. Uma percentagem elevada de 66% mostrou a edição do genoma em ambos os genes, o que produziu duplos mutantes putativos (Figura 30). Destas linhagens mutantes duplas putativas, 75% apresentaram mutações bialélicas em MPK6 e MPK1, simultaneamente.

[0171] Enquanto que a transformação com PTGb4, PTGb6, PTGb2, PTGb7, PTGb8 e PTGb9 produziu uma abundância de células de calo resistentes à higromicina e de edição putativas, os esforços para mutar apenas MPK1 com PTGb3, ou MPK6 com PTGb5 foram menos bem sucedidos. Podemos recuperar apenas quatro calos resistentes à higromicina para PTGb3, e dois calos resistentes para PTGb5 de um total de 600 calos transformados para cada construção (três repetições independentes de 200 calos para cada vetor). No entanto, mostramos que a pequena percentagem de linhagens recuperadas foi mutada com eficiência de 100% (Tabela 4.1; figura 28). Desta forma, PTG/Cas9 pode ser construído para induzir mutações específicas de genes em genes proximamente relacionados, e as combinações daqueles com eficiências de 66 - 100%. Um objetivo crítico para estudar fenótipos que podem ser mascarados por genes redundantes é obter, com êxito, múltiplos genes mutados em uma única linhagem. A análise de PTGb8 mostrou que 50% de todas as linhagens obtidas carregavam mutações bialélicas em ambos os genes alvo. Nosso estudo anterior alcançou eficiência ainda maior ao editar quatro genes simultaneamente, com 86% de todas as linhagens portadoras de mutações bialélicas em todos os quatro genes alvo (Xie et al., 2015). Esta alta frequência de mutações bialélicas em todos os alvos deve minimizar o tempo e o esforço para detectar múltiplos eventos nocaute. Nossos resultados indicam que a tecnologia PTG/Cas9 é uma ferramenta viável para investigar a função de famílias gênicas ou genes redundantes nocauteando genes múltiplos.

Plantas de arroz T1 livres de transgenes herdaram dos pais todas as oito mutações induzidas simultaneamente

[0172] Depois de mostrarmos anteriormente que PTG/Cas9 pode simultaneamente induzir mutações em oito sítios genômicos usando apenas um único evento de transformação (Xie et al., 2015), investigamos agora se essas mutações poderiam ser herdadas na próxima geração quando o dispositivo de edição do genoma foi removido. Optamos por analisar as sementes de plantas T0 PTGb9 auto-polinizadas, que anteriormente apresentatam mutações bialélicas. A geração T1 destes mutantes bialélicos é fácil de genotipar porque cinco dos oito sítios genômicos alvo englobam sítios RE que foram destruídos em ambos os alelos pelas mutações introduzidas (Figura 23; Figura 27). A autopolinização também poderia remover o dispositivo de edição do genoma através da segregação genética do fragmento de T-DNA. Quaisquer mutações detectadas nessas plantas livres de transgenes devem ser o resultado da herança porque o dispositivo de edição do genoma não está mais presente para induzir novas mutações. Analisamos uma planta da geração T1 de quatro linhagens PTGb9 diferentes com três plantas livres de transgene. O sistema PTG/Cas9 funcional consiste em um RNAg múltiplo codificando PTG e a proteína Cas9. Uma planta livre de transgenes não deve conter qualquer DNA que codifique tanto a proteína PTG ou a proteína Cas9. Os PCRs com primers amplificando o cassete U3:PTG e um fragmento de 1 kb do gene Cas9 confirmaram que as plantas 2-1, 3-2 e 4-2 não têm o dispositivo de edição do genoma (Figura 31, setas azuis). Em contraste, as plantas parentais transgênicas (T0) das quatro linhagens T1 mostraram a presença de U3:PTG e DNA Cas9 nos seus DNAs genômicos (figura 31). Primers que amplificam um gene endógeno de arroz confirmaram que o DNA em todas as amostras era de boa qualidade, já que o produto de PCR poderia ser prontamente amplificado a partir de DNAs genômicos extraídos de plantas transgênicas e livres de transgenes (figura 30, controle).

[0173] Para genotipar a mutação das linhagens da geração T1, amplificamos pedaços dos quatro genes que englobam os oito protospaçadores alvejados para ensaio PCR-RE. A progênie T1 das linhagens T0 PTGb9 bialélicas deve produzir um produto de PCR completamente indigerível durante o ensaio PCR-RE, se ambos os alelos mutados forem herdados como esperado. De fato, o ensaio de PCR-RE verificou que a mutação transportada nos protoespaçadores PS3, PS5, PS2, PS1 e PS7 (figura 27) era normalmente transmitida para a geração T1 (Figura 23A, 23B). Embora a RE apropriada digira o produto de PCR a partir de DNA do tipo selvagem, o tratamento não afetou o produto de PCR de qualquer das progênies testadas de plantas T0 bialélicas, indicando mutações que destroem o sítio RE (Figura 23A, setas vermelhas). Testamos ainda se as mutações também poderiam ser encontradas nos três restantes sítios alvo. Uma vez que não é possível detectar mutações em PS4, PS6 e PS8 (Figura 22) com um ensaio de PCR-RE e, um ensaio de T7 Endonucelase I não é adequado para detectar mutações homozigotas (Xie et al., 2014b), decidimos sequenciar diretamente os produtos de PCR. Os resultados do sequenciamento direto de produtos do PCR também podem informar sobre a zigosidade das plantas mutantes T1. O resultado do sequenciamento consiste em picos únicos distintos se ambos os alelos carregarem a mesma mutação e forem homozigotos. Se o gene carregar uma mutação diferente em cada alelo e for heterozigoto, o resultado consistirá por picos duplos ambíguos, geralmente iniciando a partir do sítio alvo de Cas9. Picos duplos de mutações heterozigóticas podem ser decifrados com decodificação de sequência degenerada (Ma et al., 2015b). O sequenciamento dos produtos de PCR revelou mutações em todos os oito sítios alvo genômicos dos quatro genes MPK em plantas de geração T1 de PTGb9 e confirmou que oito mutações são fielmente herdadas nas gerações futuras (Figura 23B). No entanto, cada planta tinha grau diferente de heterozigosidade. A planta 2-1 carregou oito mutações homozigóticas em todos os quatro genes. A planta 3-2 era homozigota para mpk2, mpk5 e mpk6, mas heterozigota para PS4 em mpk1. Planta 1-2 foi homozigota para mpk2 e mpk5, mas heterozigota em todas as quatro regiões PS de mpk1 e mpk6. A planta 4-2 carregou mutações homozigotas para mpk1 e mpk5, mas é heterozigota para PS6 de mpk2, e PS7 de mpk6 (Figura 18b). Além de carregar oito mutações, três das plantas da geração Tl examinadas também estavam livres de transgene, como visto pela ausência de fragmentos detectáveis U3:PTG e Cas9 a partir do DNA genômico (figura 31).

[0174] Mostramos que a tecnologia PTG/Cas9 é uma ferramenta altamente eficiente para mutar vários membros de uma família gênica simultaneamente e com eficiências de até 100% (Tabela 4.1), e que a geração T1 livre de transgenes carrega mutações em todos os sítios alvo (Figura 23; Figura 30). Recentemente, Lowder et al. (2015) mostraram que seu sistema modular, baseado em cassetes de expressão individuais para apenas um RNAg (cada cassete tem até 820 pb de comprimento), pode ser agrupado em oito cassetes, mas a montagem de seis ou mais cassetes frequentemente falhou e foi ineficiente. Além disso, o trabalho apenas analisou construções expressando até três RNAgs simultaneamente e não se sabe se a expressão de mais RNAgs com cassetes individuais resulta na eficácia satisfatória de edição do genoma (Lowder et al., 2015). Nossos PTGs, ao contrário, expressam múltiplos RNAgs de um único cassete de expressão e sequestraram a maquinaria robusta de processamento de RNAt endógeno para converter a transcrição primária em múltiplos RNAgs funcionais (Figura 22). Mesmo quando oito RNAgs foram expressos simultaneamente a partir de um PTG, foi conseguida eficiência de edição de 86% em todos os oito sítios alvo nas linhagens transgênicas estáveis (Tabela 1, Xie et al., 2015). Portanto, PTG/Cas9 é um dispositivo de edição de genoma altamente eficiente, o qual permite mutagênese rápida e confiável de múltiplos genes.

PTG/Cas9 produz variedade de mutações

[0175] A maioria dos estudos anteriores usando o sistema CRISPR/Cas9 em Arabidopsis e arroz relataram forte tendência para mutações indel de 1 pb nos genes alvo de plantas T0 estavelmente transformadas (Endo et al., 2014, Feng et al., 2014, Hyun et al., 2014, Mikami et al., 2015, Zhang et al., 2014). Em contraste, outros estudos identificaram deleções mais longas (^ 3 pb) como principal tipo mutacional (Xu et al., 2015, Zhou et al., 2014). Analisamos todos os resultados de sequenciamento disponíveis (n = 54) de linhagens PTG/Cas9 T0 mutadas para investigar se o nosso sistema de edição multiplex do genoma produz, principalmente, indels de 1 pb, ou maior variedade de mutações. As mutações induzidas por PTG/Cas9, em um total de 54 sítios independentes, foram ligeiramente tendenciosas para inserções de 1 pb (29.6%, Figura 24), mas em grau muito menor do que os relatos anteriores (37- 54%, Feng et al., 2014; Zhang et al., 2014). Um estudo recente encontrou TALENs (nucleases efetoras tipo ativadoras de transcrição) para produzir 69.9% deleções com 81.1% afetando múltiplos pares de bases (Zhang et al., 2015). No entanto, a eficiência total de mutação TALENs atingiu apenas 25%, embora os scaffolds tenham sido otimizados para alvejarem arroz (Zhang et al., 2015). No nosso sistema PTG/Cas9, as deleções representaram 64.8% das mutações detectadas (Figura 24) com 59.3% de todas as mutações detectadas afetando múltiplos pares de bases. Esta taxa de mutação mostra que PTG/Cas9 enriquece a variedade de mutações semelhantes aos TALENs (Figura 24), mas exibe, com vantagem, eficiência de endereçamento muito mais elevada em sítios genômicos múltiplos com 66-100% (Tabela 4.1). As deleções exibiram a maior variedade em tipos de mutação com até 74 pb afetados (Tabela 4.2). Em contraste, as inserções e conversões foram observadas apenas para até 4 ou 3 pb, respectivamente. A variedade de mutações foi maior para o locus MPK5 e MPK6 (74 a 1, e 48 a 1 pb) em comparação com MPK1 e MPK2 (15 a 1 pb, e 11 a 1 pb), sugerindo que a região alvo influencia, pelo menos parcialmente, a variedade da mutação (Tabela 4.2).

[0176] Zhang et al. (2015) alegaram que a diferença de tipos de mutação entre TALENs e CRISPR/Cas9 se deve à natureza do DSB. Os TALENs produzem duas quebras de cadeia simples espaçadas para induzir o DSB, enquanto que a proteína Cas9 corta ambas as cadeias na mesma posição. No entanto, parece possível mudar o padrão mutacional de CRISPR/Cas9 aumentando sua eficiência de edição (Tabela 4.2, Figura 24). Os primeiros resultados de CRISPR/Cas9 em protoplastos, nos quais a expressão dos componentes é considerada alta, mostraram grande variedade de padrões mutacionais (Li et al., 2013, Xie and Yang, 2013). O sistema PTG aumenta drasticamente a quantidade de RNAgs dentro da célula, em comparação com o método convencional (Xie et al., 2015). Nós admitimos a hipótese que o alto título de RNAgs causa alta eficiência e enriquecimento observado para mutações de múltiplos pares de bases. O sistema PTG/Cas9 é uma ferramenta preferível para TALENs, mesmo quando é necessário mutar múltiplos pares de bases, pois fornece um dispositivo de edição multiplex de genoma fácil de usar, com alta eficiência e variedade de mutações. Além disso, é possível programar o sistema PTG/Cas9 para eliminar vários fragmentos cromossômicos menores ou maiores. Isso permite aos pesquisadores remover genes inteiros ou elementos regulatórios do genoma.

Deleções cromossômicas de genes MPK de arroz induzidas por PTG são herdados fielmente pelas gerações T1 e T2

[0177] PTGs provêem uma maneira conveniente e eficiente para expressar múltiplos RNAgs simultaneamente. Alvejar uma região cromossômica com dois RNAgs pode resultar na deleção do fragmento entre ambos os sítios. A nossa pesquisa anterior mostrou que PTG/Cas9 pode induzir a deleção cromossômica em protoplastos transientemente transformados e em calos de arroz estavelmente transformados (Xie et al., 2015). Mas até agora, não se sabia se as próximas gerações herdariam essas deleções induzidas por PTG e se a herança segue a genética mendeliana. Nós analisamos a progênie T1 de linhagens PTGb9 que eram heterozigotas para uma deleção de fragmento em MPK5 para tratar esta questão. Assumimos um alelo de comprimento completo se o produto de PCR dos primers, flanqueando ambos os sítios alvo fosse do mesmo tamanho que o predito para a sequência do tipo selvagem. Por outro lado, um produto de PCR de 727 pb menor indicaria uma deleção cromossômica. A ocorrência simultânea de ambas as bandas foi interpretada como heterozigosidade. As linhagens T0 PTGb9 4, 5 e 6 carregavam um gene MPK5 de tamanho completo em um alelo, e uma cópia com deleção de 727 pb no outro alelo, como confirmado por sequenciamento (Figura 25A; figura 32). A deleção ocorreu como ligação exata dos locais de quebra preditos PS1 e PS2, três pb acima dos motivos adjacentes protospaçadores (figura 32). A linhagem 3 foi selecionada como controle e é homozigota para o gene de comprimento completo (Figura 25A).

[0178] A genotipagem de duas plantas T1 de cada linhagem já revelou que a deleção cromossômica foi fielmente herdada (Figura 25B). As plantas T1 4-2 e 6-1 eram homozigotas tanto para o alelo de comprimento completo como para o alelo com deleção, respectivamente, mostrando que cada alelo pode ser fixado no genoma por autopolinização.

[0179] Para investigar se o alelo de comprimento total e de deleção seria herdado por plantas T1 por herança mendeliana, analisamos posteriormente a progênie das linhagens 4, 5 e 6. A proporção esperada para plantas T0 heterozigotas na progênie T1 seria 1:2:1 para D:H:F (D: deleção, homozigoto, H: heterozigoto, F: comprimento total, homozigoto). Testamos um subconjunto de oito plantas T1 da linhagem 4, dez plantas T1 da linhagem 5 e nove plantas T1 da linhagem 6. A linhagem 4 e a linhagem 6 apresentaram razões que se ajustaram aproximadamente à expectativa com 0.8:2:0.4 (D:H:F ) e 1.5:2:1 (D:H:F), respectivamente, enquanto que a progênie da linhagem 5 foi ligeiramente enriquecida em plantas heterozigotas com proporção 0.25:2:0.25 (D:H:F; figura 33). A ligeira taxa de desvio na linhagem 5 pode ser o resultado do pequeno número de progênies testadas. Mas mesmo que o subconjunto fosse pequeno, detectamos, de todas as linhagens testadas, pelo menos uma planta T1 homozigota para a deleção ou homozigota para o alelo de comprimento completo (figura 33). Adicionalmente, a planta T1 6-1, que era homozigota para a deleção produziu uma progênie T2 mostrando apenas o fragmento de menor tamanho com a deleção (Figura 25C). Este resultado demonstra ainda que 6-1 é de fato uma planta portadora de deleção homozigota no gene MPK5, e que estas deleções podem ser herdadas para a geração T2.

[0180] Deste modo, demonstramos que alvejar um único gene com dois RNAgs codificados por PTG pode causar deleções cromossômicas na geração T0, que podem ser herdadas em gerações futuras por herança mendeliana. Se uma planta T0 for heterozigota para a deleção, sua autopolinização pode produzir progênie com deleção homozigota e as gerações subsequentes permanecerão homozigotas, como mostrado pela progênie da planta 6-1. Um relatório anterior sobre deleções cromossômicas semelhantes em tabaco mostrou deleções apenas em transfecções de protoplastos (Gao et al., 2015). Outro relatório mostrou deleções maiores em plantas de arroz da geração T0, mas não demonstrou herança da deleção para futuras gerações (Zhou et al., 2014). Além disso, ambos os estudos utilizaram sistemas que expressam cada RNAg com seu próprio promotor e terminador, o que limitou o número de RNAgs que poderiam ser coexpressos simultaneamente a dois RNAgs em tabaco, e quatro RNAgs no estudo do arroz (Gao et al., 2015; Zhou et al., 2014). O novo sistema PTG/Cas9 utilizado neste estudo permite a expressão de um número muito maior de RNAgs e também aumenta a titulação de RNAgs dentro das células (Xie et al., 2015). Teoricamente, nosso sistema poderia permitir quatro deleções cromossômicas quando oito RNAgs são simultaneamente coexpressos, e duas deleções quando quatro RNAgs são coexpressos. Em linhagens T0 de PTGb7 (quatro RNAgs em um PTG), contudo, detectamos anteriormente apenas uma linhagem que carregou, simultaneamente, uma deleção monoalélica em MPK1, e deleção bialélica em MPK5 (Xie et al., 2015). As linhagens T0 de PTGb9 (oito RNAgs em um PTG) mostraram uma tendência semelhante com deleção de fragmento em MPK5, mas não nos outros três genes alvo de MPK (Xie et al., 2015). É provável que um grande número de plantas com genoma editado possa ser necessário para identificar uma linhagem com deleção simultânea de dois ou quatro genes. Além disso, outros fatores, além da eficiência de alvejar genes podem também afetar a formação de deleção cromossômica. As deleções foram detectadas principalmente em MPK5, sugerindo um potencial efeito posicional na eficiência de deleção de fragmentos. É também possível que as deleções cromossômicas em dois ou mais genes MPK proximamente relacionados levem a fenótipos drásticos ou prejudiciais, considerando a importância das MPKs no desenvolvimento das plantas e na resposta ao stress. Tais fenótipos letais podem impedir a formação de deleções múltiplas em uma única planta regenerada.

Mutações que podem preservar a função proteica são favorecidas por MPK1 e MPK6

[0181] De acordo com a especulação anterior de que, mutações ou deleções em alguns genes de MPK de arroz são desfavoráveis, detectamos um enriquecimento de mutações em MPK1 e MPK6, que pode ser dividido por três, sem resquício, nas quatro plantas T1 da linhagem PTGb9 analisadas (Figura 26). Tais mutações são susceptíveis de preservar o quadro aberto de leitura da sequência codante porque três bases constituem a unidade de codificação para um aminoácido. Em contraste, todas as mutações detectadas em MPK2 e MPK5 foram indels que são susceptíveis de interromper o quadro aberto de leitura da sequência. 67% das mutações de MPK1 afetaram três, ou múltiplos de três, pares de bases (Figura 26A), e mutações em MPK6 tiveram tendência ainda maior deste tipo de mutação, com 75% (Figura 25A). No entanto, quando considerando apenas mutações em éxons, 100% das mutações em MPK1 preservam o quadro aberto de leitura, mas apenas 66.7% em MPK6 (Figura 26B). Este resultado sugere que a manutenção de uma proteína funcional pode ser mais importante para o gene MPK1 do que para o gene MPK6 em plantas de arroz.

[0182] Para prever o efeito das mutações em MPK1, traduzimos a sequência codante dos mutantes em uma sequência de proteínas, e comparamos os primeiros 60 aminoácidos com a sequência do tipo selvagem (Figura 26C). A planta 1-2 possuía dois alelos mutantes diferentes, dos quais um traduzido em uma proteína encurtada em cinco aminoácidos (QATLS; 1-2a), e outra em uma proteína encurtada em um aminoácido (S; 1-2b). As plantas 2-1, 3-2 e 4-2 carregam uma mutação de nucleotídeo diferente de 1-2b, mas traduzem para a mesma sequência de proteína, que é encurtada por uma serina na posição 45 (Figura 26C). Uma análise com InterProScan revelou que as mutações de todas as três sequências de proteína deixam os domínios de proteína quinase preditos intactos, que começam no aminoácido 67 na proteína do tipo selvagem. Em contraste com os resultados dos alelos mpk1, todos os alelos mpk5 detectados nas linhagens PTGb9 resultaram em paradas prematuras das proteínas mpk5, antes dos domínios de proteína quinase preditos da proteína do tipo selvagem, iniciando no aminoácido 35 (Figura 26D).

[0183] Os resultados indicam que a MPK1 desempenha um papel importante no arroz, e as mutações no gene MPK1 produzem um fenótipo prejudicial ou letal. Na verdade, nós encontramos problemas quando tentamos mutar calos com PTGb3 (dois RNAgs alvejando MPK1). Enquanto a linhagem 1 de PTGb3 (PTGb3-1) e PTGb3-2 produziram plântulas normais em meio de regeneração, o calo das linhagens PTGb3-3 e PTGb3-4 ficaram pretos neste meio, e praticamente morreram. PTGb3-3 não foi capaz de regenerar as plântulas. Curiosamente, embora o calo da linhagem PTGb3-4 tenha uma deleção homozigota no gene MPK1 (Figura 28A), foi possível recuperar duas plântulas do meio de regeneração (Figura 26E). No entanto, as plântulas recuperadas permaneceram gravemente anãs e apenas produziram uma panícula estéril, suportando a hipótese de que o nocaute de MPK1 causa efeitos prejudiciais ou letais (Figura 26E). Não observamos quaisquer efeitos negativos nas linhagens de PTGb7 e PTGb9, que também alvejam MPK1. Contudo, tal como mostrado para PTGb9, todas as plantas mutantes T1 analisadas carregaram alelos mpk1 com mutações que preservam o quadro aberto de leitura existente (Figura 26C). Estas outras linhagens podem carregar uma proteína mpk1 mutada, mas ainda funcional, que protege as plântulas dos fenótipos prejudiciais observados das linhagens PTGb3-3 e PTGb3-4. Relatórios anteriores de outros grupos usaram uma linhagem celular mutante nocaute mpk1 em sua pesquisa, que foi induzida pela inserção do retrotransposon Tos17 (Kishi-Kaboshi et al., 2010; Kurusu et al., 2005). É provável que MPK1 possa desempenhar um papel até agora não descoberto e essencial na diferenciação dos tecidos ou no desenvolvimento das plantas.

[0184] Uma diferença de mutações induzidas por nucleases, em comparação com a mutação de inserção via T-DNA ou Tos17, é que nucleases como CRISPR/Cas9 apenas cortam o DNA, mas a mutação que provoca o nocaute é dependente do mecanismo de reparação da célula. Verificamos que, no caso de MPK1, as mutações em gerações T1 viáveis sempre preservam o quadro aberto de leitura existente (Figura 26B), e que a deleção cromossômica de MPK1 provocou a morte prematura de calos ou a produção de plantas severamente anãs e estéreis (Figura 26E). Enquanto que o nocaute de um gene verdadeiramente essencial é, por definição, impossível por causa da letalidade, parece que CRISPR/Cas9 também falha em produzir, confiavelmente, nocautes para genes importantes, mas não verdadeiramente essenciais. Isto pode causar problemas para analisar famílias gênicas ou genes redundantes quando nocautear vários membros, podendo causar um fenótipo drástico, mas o sistema de mutação e a transformação selecionam para o quadro aberto de leitura preservando mutações em um ou mais dos genes alvo. Mesmo que o pesquisador deseje descobrir esse fenótipo drástico, ele pode permanecer não detectado porque as mutações são incapazes de nocautear todos os genes. Shi et al. (2015) fizeram observações similares na tentativa de identificar genes essenciais em células cancerosas por seleção negativa. Quando alvejaram genes essenciais anteriormente conhecidos na região 5’ codante dos éxons com CRISPR/Cas9, as mutações induzidas frequentemente preservaram o quadro aberto de leitura existente e as variantes permaneceram funcionais (Shi et al., 2015). Eles superaram essa limitação alvejando diretamente domínios proteicos, ao invés da porção 5’ do éxon e conseguiram fenótipos de seleção negativos mais severos com esta estratégia. Por conseguinte, sugere-se alvejar domínios protéicos chave com PTG/Cas9 para aumentar a possibilidade de gerar verdadeiros mutantes nocautes ao estudar famílias gênicas ou genes redundantes. Alternativamente, mutação mono- alélicas ou linhagens mutantes heterozigotas podem ser geradas e utilizadas para estudar genes essenciais ou letais.

MATERIAIS E MÉTODOS Materiais vegetais e condições de crescimento

[0185] A cultivar de arroz Kitaake (Oryza sativa spp. japonica) foi utilizada neste estudo. As sementes foram secadas por 36-48h a 45°C em um desidratador de alimentos para quebrar a dormência antes da germinação em água quente a 37°C durante dois dias. As sementes germinadas foram plantadas em solo METROMIX 360 (SUNGRO HORTICULTURE, Agawam, MA) e cultivadas em estufa com 12 h de luz suplementar por dia a 28°C dia / 23°C temperatura noturna. As plantas foram fertilizadas com 0.25% de uréia e 0.1% de solução de ferro Sprint, após a primeira semana, e fertilizadas com 0.25% de ureia nas semanas subsequentes até a floração.

Construções gênicas de PTG/Cas9

[0186] As construções de PTG PTGb6, PTGb7 e PTGb9 foram previamente descritas (Xie et al., 2015). PTGb3, PTGb4, PTGb5, PTGb2 e PTGb8 foram construídas inserindo os PTGs anteriormente descritos e montados PTG3, PTG4, PTG5, PTG2 e PTG8 (Xie et al., 2015) em vetor binário pRGEB32 digerido com BsaI (Addgene Plasmid # 63142).

Transformação de arroz mediada por Agrobacterium

[0187] Os vetores binários foram transformados por eletroporação na cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens. Os calos de arroz derivados de sementes maduras da cultivar Kitaake foram transformados com o método mediado por Agrobacterium, de acordo com o protocolo anteriormente descrito (Hiei and Komari, 2008).

Extração de DNA genômico

[0188] O DNA genômico foi extraído de 100-200 μl de volume de material de folha macerada com N2 adicionando 0.9 ml de tampão CTAB pré-aquecido (sorbitol 140 mM, Tris-HCl 220 mM pH 8.0, EDTA 22 mM, NaCl 800 mM, sarkosil 34 mM e CTAB 22 mM) e incubado a 65°C durante 1 h em um tubo de reação de 1.5 ml. A amostra foi agitada em vortex após adição de 400 μl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misturada em um rotador durante 20 minutos à temperatura ambiente, antes da centrifugação a 12.000 rpm durante 15 min. 2/3 de volume de isopropanol foi adicionado à fase aquosa superior antes da incubação a -20°C durante 30 minutos para precipitar o DNA. O DNA foi sedimentado por centrifugação a 12.000 rpm de 30 segundos a 5 min, e o sedimento lavado com etanol 70% antes da incubação com tampão TE contendo 0.1 mg/ml de RNase a a 37°C por 30 min. O DNA foi de novo precipitado adicionando 1/10 volume de acetato de sódio 3M, pH 5.2, e de 2-2,5 volumes de etanol absoluto, e incubado a -20°C durante a noite. O DNA foi sedimentado e lavado com etanol 70% antes de dissolver o sedimento seco em uma quantidade apropriada de tampão TE. A concentração foi medida por um espectrofotômetro.

Genotipagem da progênie com genoma editado

[0189] Todos os PCR foram realizados com GOTAQ DNA Polimerase em GOTAQ Reaction Buffer (PROMEGA, Madison, WI). Os produtos de PCR e as digestões foram analisados por eletrofese com gel de agarose a 1%, e corados com brometo de etídio. Os primers utilizados para a genotipagem podem ser encontrados na Tabela 4.1 suplementar. A presença ou ausência do dispositivo de edição do genoma na progênie foi detectada por PCR com primers específicos para U3p:PTG. As deleções cromossômicas foram detectadas por PCR com primers flanqueando os dois sítios alvo de cada gene. O tamanho do produto diminuiu por um número específico de pares de bases se ocorreu uma deleção cromossômica. Os indels resultantes dos eventos de edição de genoma em sítios alvo com sítios RE foram detectados por ensaio de PCR-RE. Os produtos de PCR que englobam os sítios alvo foram digeridos com a RE apropriada durante 2-3 h. O DNA mutado não podia ser digerido pelas REs. Os produtos de PCR selecionados foram sequenciados para determinar a mutação específica. Os picos duplos produzidos por diferentes mutações em cada alelo foram dissolvidos usando decodificação de sequência degenerada (Ma et al., 2015b). Se os picos duplos não puderam ser decodificados, o produto de PCR foi clonado no vetor PGEM-T EASY (PROMEGA, Madison, WI) por clonagem TA para sequenciamento de alelos simples.

Alinhamento das sequências proteicas e predição de domínios funcionais

[0190] As sequências das proteínas preditas dos alelos mutantes mpk1 e mpk5 foram alinhadas com a sua sequência do tipo selvagem correspondente (MSU RGAP Release 7) pela ferramenta de alinhamento de sequências múltiplas Clustal Omega (Li et al., 2015). Os domínios das proteínas funcionais das sequências foram preditos com a ferramenta da web InterProScan (Jones et al., 2014).

Números de acesso dos genes

[0191] Os números de acessos RefSeq do Genbank dos genes alvo são Os06g0154500 (MPK1), Os08g0157000 (MPK2), Os03g0285800 (MPK5), e Os10g0533600 (MPK6) TABELAS Tabela 4.1: Desenho e eficiência de construções de genes PTG/Cas9 para alvejar quatro genes de MPK proximamente relacionados. 1 Descrito anteriormente em Xie et al., PNAS 2015 2 Percentagem de linhagens T0 com genoma editado em relaçao ao número total de linhagens T0 testadas Numero total de linhagens testadas entre parênteses. Tabela 4.2: Resumo dos tipos de mutações induzidas por PTG/Cas9 observadas em todos os produtos de PCR sequenciados a partir das plantas mutantes. Tabela 4.3: Oligonucleotídeos utilizados no estudo e suas finalidades.

[0192] MPK1-F2 (SEQ ID NO:174); MPK1-R2 (SEQ ID:175); MPK2- nbF (SEQ ID NO:176); MPK2-R2 (SEQ ID NO:177); MPK5-F256 (SEQ ID NO:178); MPK5-nbR (SEQ ID NO:179); MPK6-F (SEQ ID NO:180); MPK6-R (SEQ ID NO:181); UGW-U3-F (SEQ ID NO:182); UGW-gRNA-R (SEQ ID NO:183); gtCas9-F (SEQ ID NO:184); gtCas9-R (SEQ ID NO:185); controle-F (SEQ ID NO:186); controle-R (SEQ ID NO:187). LITERATURA CITADA Asai, T., Tena, G., Plotnikova, J., Willmann, M.R., Chiu, W.- L., Gomez-Gomez, L., Boller, T., Ausubel, F.M., and Sheen, J. (2002). MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature 415, 977-983. Barbezier, N., Canino, G., Rodor, J., Jobet, E., Saez-Vasquez, J., Marchfelder, A., and Echeverría, M. (2009). Processing of a dicistronic tRNA-snoRNA precursor: combined analysis in vitro and in vivo reveals alternate pathways and coupling to assembly of snoRNP. Plant Physiol. 150, 1598-1610. Beckers, G.J.M., Jaskiewicz, M., Liu, Y., Underwood, W.R., He, S.Y., Zhang, S., and Conrath, U. 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Claims

1. Método para produzir manipulação genética mediada por reações multiplex com RNA em uma célula receptora caracterizado por compreender:obter uma construção polinucleotídica que codifica duas ou mais sequências guiadas por RNA, dispostas em tandem, com uma ou mais sequências de clivagem de RNAt, em que cada sequência guiada por RNA compreende uma sequência espaçadora 5’ que hibridiza a uma sequência alvo e em que a referida sequência de clivagem do RNAt inclui uma cauda aceptora pré-RNAt, um braço D-loop e um braço T’PC-loop; e introduzir a referida construção polinucleotídica na referida célula receptora na presença de uma nuclease associada à CRISPR, de modo que o sistema de processamento do RNAt da referida célula receptora clive o transcrito produzido a partir da construção polinucleotídica transcrita nas sequências do RNAt para liberar sequências guiadas por RNA.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas sequências guiadas por RNA atingirem múltiplos sítios em um único gene na referida célula receptora.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas sequências guiadas por RNA atingirem múltiplos genes diferentes na referida célula receptora.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida manipulação genética mediada por RNA ser a edição de genoma guiada por RNA, que pode incluir mutação dirigida, reparo dependente de homologia, ativação e repressão transcricional, edição de epigenoma, e/ou marcação genômica.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de clivagem do RNAt incluir um sítio ativo para uma ou mais dentre RNase P e/ou RNase Z e/ou RNase E.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de clivagem do RNAt ser a SEQ ID: 13, 188 ou 189.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido RNA guia compreender ainda uma sequência de RNA scaffold.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida construção polinucleotídica incluir um RNA-RNAt guia de RNAt.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida célula receptora ser uma célula vegetal.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida célula receptora ser uma célula animal.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida célula receptora ser uma célula microbiana.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida célula receptora ser uma célula humana.

13. Construção de ácido nucleico para manipulação genômica mediada por reações multiplex com RNA em uma célula receptora caracterizada por compreender: duas ou mais sequências guiadas por RNA, dispostas em tandem, com uma ou mais sequências de clivagem de RNAt, em que cada sequência guiada por RNA compreende uma sequência espaçadora 5’ que hibridiza a uma sequência alvo e em que a referida sequência de clivagem do RNAt inclui uma cauda aceptora pré-RNAt, um braço D-loop e um braço T’PC-loop.

14. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por as referidas sequências guiadas por RNA atingirem múltiplos sítios em um único gene na referida célula receptora.

15. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por as referidas sequências guiadas por RNA atingirem múltiplos genes diferentes na referida célula receptora.

16. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por a referida sequência de clivagem de RNAt incluir um sítio ativo para uma ou mais dentre RNase P e/ou RNase Z e/ou RNase E.

17. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por a referida sequência de clivagem de RNAt ser a SEQ ID NO: 13, 188 ou 189.

18. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o referido RNA guia compreender ainda uma sequência de RNA scaffold.

19. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por a referida construção de ácido nucleico incluir um RNA-RNAt guia de RNAt.

20. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por ainda compreender elementos regulatórios para a expressão do referido ácido nucleico na referida célula receptora.

21. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por a referida construção compreender uma sequência promotora operacionalmente ligada às referidas sequências guiadas por RNA e a referida sequência de clivagem de RNAt.

22. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por ainda compreender uma sequência terminadora.

23. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por a referida sequência promotora ser um promotor Pol III.

24. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a referida sequência terminadora ser um terminador Pol III.

25. Cassete de expressão caracterizado por compreender a construção de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 13.

26. Vetor caracterizado por compreender o cassete de expressão conforme definido na reivindicação 25.

27. Célula receptora microbiana caracterizada por compreender a construção de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 13.

28. Célula microbiana geneticamente modificada caracterizada por compreender uma inserção ou deleção genômica, a referida célula tendo sido editada pela introdução da conforme definida na reivindicação 13.