[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

BR112017006736B1 - Anticorpos anti-miostatina e formulação farmacêutica - Google Patents

Anticorpos anti-miostatina e formulação farmacêutica Download PDF

Info

Publication number
BR112017006736B1
BR112017006736B1 BR112017006736-6A BR112017006736A BR112017006736B1 BR 112017006736 B1 BR112017006736 B1 BR 112017006736B1 BR 112017006736 A BR112017006736 A BR 112017006736A BR 112017006736 B1 BR112017006736 B1 BR 112017006736B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
myostatin
acid sequence
Prior art date
Application number
BR112017006736-6A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112017006736A2 (pt
Inventor
Yoshinao Ruike
Taichi Kuramochi
Hiroyasu Muramatsu
Atsunori Ueyama
Tomoyuki Igawa
Hitoshi Katada
Yuji Hori
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority claimed from PCT/JP2015/006323 external-priority patent/WO2016098357A1/en
Publication of BR112017006736A2 publication Critical patent/BR112017006736A2/pt
Publication of BR112017006736B1 publication Critical patent/BR112017006736B1/pt

Links

Abstract

ANTICORPOS ANTIMIOSTATINA, POLIPEPTÍDEOS CONTENDO REGIÕES FC VARIANTES, E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO. A presente invenção refere-se a anticoroos antimiostatina e métodos de produção e utilização dos mesmos. Os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos antimiostatina e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos também são providos. A descrição também provê polipeptídeos contendo uma região Fc variante e métodos de produção e utilização dos mesmos. Os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos também são providos.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a anticorpos antimiostatina e métodos de utilização dos mesmos. A presente invenção também se refere a polipeptídeos contendo as regiões Fc variantes e métodos de utilização dos mesmos.
TÉCNICA ANTERIOR
[002] Miostatina, também referida como fator 8 de diferenciação e crescimento (GDF8), é uma proteína secretada e é um membro da superfamília de proteínas do fator de transformação do crescimento beta (TGF-beta). Os membros desta superfamília possuem propriedades reguladoras do crescimento e morfogênicas (veja, por exemplo, NPL1, NPL2 e PTL1). A miostatina é expressada primariamente no músculo esquelético em desenvolvimento e do adulto e funciona como um regulador negativo do crescimento muscular. A superexpressão sistêmica da miostatina em camundongos adultos leva à perda de massa muscular (veja, por exemplo, NPL3) enquanto que, reciprocamente, a miostatina em um camundongo knockout caracteriza- se por hipertrofia e hiperplasia do músculo esquelético resultando em massa muscular maior em duas ou três vezes do que as suas ninhadas do tipo selvagem (veja, por exemplo, NPL4).
[003] Como outros membros da família TGF-beta, a miostatina é sintetizada como uma grande proteína precursora contendo um domínio de propeptídeo N-terminal e um domínio C-terminal considerado como a molécula ativa (veja, por exemplo, NPL5; PTL2). Duas moléculas da precursora da miostatina são covalentemente ligadas através de uma ponte dissulfeto única no domínio do fator de crescimento C-terminal. A miostatina ativa madura (homodímero ligado ao dissulfeto consistindo do domínio do fator de crescimento C-terminal) é liberada da precursora da miostatina através de múltiplas etapas de processamento proteolítico. Na primeira etapa da via de ativação da miostatina, uma ligação de peptídeo entre o domínio do propeptídeo N-terminal e o domínio do fator de crescimento C-terminal, Arg266-Asp267, é clivada por uma convertase de proproteína do tipo furina em ambas as cadeias do precursor homodimérico porém os três peptídeos resultantes (dois propeptídeo e uma miostatina madura (isto é, um homodímero ligado ao dissulfeto consistindo nos domínios do fator de crescimento)) permanecem associados, formando um complexo inativo não covalente que é referido como "miostatina latente". A miostatina madura pode ser então liberada da miostatina latente através de degradação do propeptídeo. Os membros da família de metaloproteinases da proteína morfogenética óssea 1 (BMP1) clivam uma única ligação peptídica dentro do propeptídeo, Arg98-Asp99, com a liberação concomitante da miostatina ativa, madura, um homodímero (veja, por exemplo, NPL6). Além do mais, a miostatina latente pode ser ativada in vitro através da dissociação do complexo seja com ácido ou também com tratamento térmico (veja, por exemplo, NPL7).
[004] A miostatina exerce os seus efeitos através de uma família do receptor do heterotetrâmero da quinase da serina/treonina da transmembrana, a ativação da qual aumenta a transfosforilação do receptor, levando ao estímulo da atividade da quinase serina/treonina. Mostrou-se que a via da miostatina envolve um dímero ativo de miostatina que se liga ao receptor da ativina do tipo IIB (ActRIIB) com alta afinidade, que então recruta e ativa a transfosforilação do receptor de baixa afinidade, a quinase do tipo ativina 4 (ALK4) ou quinase do tipo ativina 5 (ALK5). Também se mostrou que as proteínas Smad 2 e Smad 3 são subsequentemente ativadas e formam complexos com Smad 4, os quais são então translocados ao núcleo para a ativação da transcrição do gene alvo. Demonstrou-se que ActRIIB é capaz de mediar a influência da miostatina in vivo, como expressão de uma forma negativa dominante de ActRIIB em camundongos que imita o gene de knockout da miostatina (veja, por exemplo, NPL8).
[005] Vários distúrbios ou condições estão associados com a perda de massa muscular (isto é, perda de ou dano funcional do tecido muscular), tal como distrofia muscular (MD; incluindo distrofia muscular de Duchenne), esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular, atrofia de órgãos, fragilidade, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), sarcopenia e caquexia resultando de câncer ou outros distúrbios, assim como doença renal, insuficiência ou doença cardíaca e doença hepática. Os pacientes se beneficiarão a partir de um aumento de massa muscular e/ou força muscular; no entanto, existem atualmente disponíveis tratamentos limitados para estes distúrbios. Sendo assim, devido a seu papel como um regulador negativo de crescimento muscular esquelético, a miostatina se torna um alvo desejável para a intervenção terapêutica ou profilática para tais distúrbios ou condições, ou para monitorar a progressão de tais distúrbios ou condições. Em particular, os agentes que inibem a atividade da miostatina podem ser terapeuticamente benéficos.
[006] A inibição da expressão de miostatina leva tanto à hiperplasia quanto à hipertrofia muscular (NPL9). A miostatina regula negativamente a regeneração muscular depois de lesão e a falta de miostatina em camundongos nulos em miostatina resulta em regeneração muscular acelerada (veja, por exemplo, NPL10). Mostrou- se que os anticorpos antimiostatina (GDF8) descritos em, por exemplo, PTL3, PTL4, PTL5, PTL6 e PTL7, e PTL8, PTL9 e PTL10 se ligam à miostatina e inibem a atividade da miostatina in vitro e in vivo, incluindo a atividade da miostatina associada com a regulação negativa de massa muscular esquelética. Os anticorpos que neutralizam a miostatina aumentam o peso corporal, a massa muscular esquelética e o tamanho dos músculos e a força no músculo esquelético de camundongos do tipo selvagem (veja, por exemplo, NPL11) e os camundongos mdx, um modelo para distrofia muscular (veja, por exemplo, NPL12; NPL13). No entanto, estes anticorpos da técnica anterior são todos específicos para a miostatina madura porém não para a miostatina latente, e as estratégias descritas para inibir a atividade da miostatina utilizaram anticorpos que podem se ligar a e neutralizar a miostatina madura.
[007] Os anticorpos estão chamando a atenção como produtos farmacêuticos uma vez que eles são altamente estáveis no sangue e têm poucos efeitos colaterais (veja, por exemplo, NPL14 e NPL15). Quase todos os anticorpos terapêuticos atualmente no mercado são anticorpos da subclasse de IgG1 humana. Uma das funções conhecidas dos anticorpos da classe IgG é a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (a seguir denotada como atividade ADCC) (veja, por exemplo, NPL16). Para um anticorpo exibir a atividade ADCC, a região Fc do anticorpo deve se ligar a um receptor gama de Fc (a seguir denotado como R gama de Fc) que é um receptor de ligação ao anticorpo presente na superfície de células efetoras tais como células exterminadoras, células exterminadoras naturais e macrófagos ativados.
[008] Em seres humanos, as isoformas RIa gama de Fc (CD64A), RIIa gama de Fc (CD32A), RIIb gama de Fc (CD32B), RIIIa gama de Fc (CD16A) e RIIIb gama de Fc (CD16B) foram reportadas como família da proteína R gama de Fc e os respectivos alótipos também foram reportados (veja, por exemplo, NPL17). RIa gama de Fc, RIIa gama de Fc e RIIIa gama de Fc são chamados R gama de Fc de ativação uma vez que eles têm funções imunologicamente ativas e RIIb gama de Fc é chamado R gama de Fc uma vez que ele tem funções imunossupressoras (veja, por exemplo, NPL18).
[009] Na ligação entre a região Fc e R gama de Fc, vários resíduos de aminoácido na região dobradiça do anticorpo e domínio CH2, e um açúcar ligado a Asn na posição 297 (numeração EU) ligado ao domínio CH2 se mostraram importantes (veja, por exemplo, NPL19, NPL20 e NPL21]). Várias variantes que têm propriedades de ligação a R gama de Fc, principalmente anticorpos com mutações introduzidas nestes sítios, foram estudadas até agora; e variantes da região Fc tendo maiores atividades de ligação em relação à ativação de R gama de Fc foram obtidas (veja, por exemplo, PTL11, PTL12, PTL13 e PTL14).
[0010] Quando uma R gama de Fc de ativação é reticulada com um complexo imune, ela fosforila os motivos de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAMs) contidos no domínio intracelular ou cadeia gama comum de FcR (um parceiro de interação), ativa um SYK transdutor de sinal e ativa uma resposta imune inflamatória ao iniciar uma cascata de sinal de ativação (veja, por exemplo, NPL22).
[0011] RIIb gama de Fc é a única R gama de Fc expressada nas células B (veja, por exemplo, NPL23). Relatou-se que a interação da região Fc de anticorpo com RIIb gama de Fc suprime a resposta imune primária das células B (veja, por exemplo, NPL24). Além disso, reporta- se que quando RIIb gama de Fc em células B e receptor da célula B (BCR) são reticulados através de um complexo imune no sangue, a ativação da célula B e a produção de anticorpo por células B é suprimida (veja, por exemplo, NPL25). Nesta transdução de sinal imunossupressor mediado por BCR e RIIb gama de Fc, o motivo inibidor com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) contido no domínio intracelular de RIIb gama de Fc é necessário (veja, por exemplo, NPL26 e NPL27). Quando ITIM é fosforilado mediante a sinalização, recruta-se a 5-fosfatase de polifosfato inositol contendo SH2 (SHIP), a transdução de outra R gama de Fc de cascatas do sinal de ativação é inibida e a resposta imune inflamatória é suprimida (veja, por exemplo, NPL28). Além disso, reportou-se que a agregação de RIIb gama de Fc sozinha suprime de forma transitória o influxo de cálcio devido à reticulação de BCR e a proliferação da célula B de uma maneira independente de BCR sem incluir a apoptose das células B que produzem IgM (veja, por exemplo, NPL29).
[0012] RIIb gama de Fc também é expressada em células dendríticas, macrófagos, neutrófilos ativados, mastócitos e basófilos. RIIb gama de Fc inibe as funções de R gama de Fc de ativação tal como fagocitose e liberação de citoquinas inflamatórias nestas células, e suprime as respostas imunes inflamatórias (veja, por exemplo, NPL30).
[0013] A importância das funções imunossuppressoras de RIIb gama de Fc foi elucidada até agora através de estudos usando camundongos knockout com RIIb gama de Fc. Existem relatos de que nos camundongos knockout com RIIb gama de Fc, a imunidade humoral não é adequadamente regulada (veja, por exemplo, NPL31), a sensibilidade em relação à artrite induzida por colágeno (CIA) é aumentada (veja, por exemplo, NPL32), sintomas do tipo lúpus são apresentados e sintomas do tipo síndrome de Goodpasture são apresentados (veja, por exemplo, NPL33).
[0014] De forma adicional, relatou-se que a inadequação reguladora de RIIb gama de Fc está relacionada a doenças autoimunes humanas. Por exemplo, a relação entre polimorfismo genético na região de transmembrana e a região promotora de RIIb gama de Fc, e a frequência do desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (veja, por exemplo, NPL34, NPL35, NPL36, NPL37 e NPL38), e diminuição da expressão de RIIb gama de Fc na superfície de células B em pacientes com SLE (veja, por exemplo, NPL39 e NPL40) foram reportadas.
[0015] A partir de modelos de camundongo e achados clínicos como tais, RIIb gama de Fc é considerado ter o papel de controle de doenças autoimunes e doenças inflamatórias através do envolvimento em particular com células B, e é uma molécula alvo promissora para controlar doenças autoimunes e doenças inflamatórias.
[0016] IgG1, principalmente usada como um anticorpo terapêutico comercialmente disponível, é conhecida por se ligar não apenas a RIIb gama de Fc, mas também fortemente a R gama de Fc de ativação (veja, por exemplo, NPL41). Pode ser possível desenvolver anticorpos terapêuticos tendo propriedades imunossupressoras melhores em comparação com aqueles de IgG1, através da utilização de uma região Fc com ligação de RIIb gama de Fc aumentada ou seletividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorada comparado com R gama de Fc de ativação. Por exemplo, sugeriu-se que a utilização de um anticorpo tendo uma região variável que se liga a BCR e uma Fc com ligação RIIb gama de Fc melhorada pode inibir a ativação da célula B (veja, por exemplo, NPL42). Reportou-se que a reticulação de RIIb gama de Fc em células B e IgE ligado a um receptor de célula B suprime a diferenciação de células B em células de plasma, as quais como um resultado causam a supressão da produção de IgE; e em camundongos transplantados com PBMC humano, concentrações de IgG e IgM humana são mantidas enquanto que a concentração de IgE humana é diminuída (veja, por exemplo, NPL43). Além de IgE, reportou-se que quando RIIb gama de Fc e CD79b que é uma molécula constituinte de um complexo receptor de célula B são reticulados por um anticorpo, a proliferação de célula B é suprimida in vitro, e os sintomas de artrite são aliviados no modelo de artrite colagenose (veja, por exemplo, NPL44).
[0017] Além de células B, reportou-se que a reticulação de RI epsilon de Fc e RIIb gama de Fc em mastócitos usando moléculas, nas quais a porção Fc de uma IgG com ligação de RIIb gama de Fc aumentada é fundida à porção Fc de IgE que se liga a um RI épsilon de FC do receptor de IgE, causa a fosforilação de RIIb gama de Fc, com isso suprimindo o influxo de cálcio dependente de RI épsilon de Fc. Isto sugere que a inibição da degranulação através do estímulo de RIIb gama de Fc é possível ao se aumentar a ligação de RIIb gama de Fc (veja, por exemplo, NPL45).
[0018] Consequentemente, sugere-se que um anticorpo tendo uma Fc com atividade de ligação da RIIb gama de Fc melhorada é promissor como um agente terapêutico para doenças inflamatórias tal como uma doença autoimune.
[0019] Além disso, reportou-se que a ativação de macrófagos e células dendríticas através do receptor 4 do tipo Toll devido ao estímulo de LPS é suprimida na presença de um complexo imune de anticorpo- antígeno, e este efeito é também sugerido como ações do complexo imune através de RIIb gama de Fc (veja, por exemplo, NPL46 e NPL47). Deste modo, espera-se que a utilização de anticorpos com ligação RIIb gama de Fc aumentada permita o melhoramento de ações de supressão do sinal de ativação mediado por TLR; sendo assim, sugeriu-se que tais anticorpos são promissores como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias tais como as doenças autoimunes.
[0020] De forma adicional, sugeriu-se que os mutantes com ligação RIIb gama de Fc aumentada são agentes terapêuticos promissores para o câncer, assim como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias tais como as doenças autoimunes. Até agora, verificou-se que RIIb gama de Fc tem um papel importante na atividade agonista de anticorpos agonistas contra a superfamília do receptor anti-TNF. Especificamente, sugeriu-se que a interação com RIIb gama de Fc é necessária para a atividade agonista de anticorpos contra CD40, DR4, DR5, CD30 e CD137, que estão incluídos na família do receptor TNF (veja, por exemplo, NPL48, NPL49, NPL50, NPL51, NPL52, NPL53 e NPL54). NPL55 mostra que a utilização de anticorpos com ligação RIIb gama de Fc aumentada aumenta o efeito antitumoral de anticorpos anti- CD40. Consequentemente, espera-se que os anticorpos com RIIb gama de Fc aumentada tenham um efeito de aumentar a atividade agonista de anticorpos agonistas incluindo anticorpos contra a superfamília do receptor anti-TNF.
[0021] Além disso, mostrou-se que a proliferação celular é suprimida quando se usa um anticorpo que reconhece o kit, um tipo de receptor tirosina quinase (RTK), para reticular RIIb gama de Fc e kit em células que expressam kit. Os efeitos similares foram reportados mesmo nos casos onde este Kit é constitutivamente ativado e tem mutações que causam oncogênese (veja, por exemplo, NPL56). Deste modo, espera-se que a utilização de anticorpos com ligação RIIb gama de Fc melhorada pode melhorar efeitos inibidores em células que que expressam RTK tendo mutações constitutivamente ativadas.
[0022] Reportaram-se anticorpos tendo uma Fc com atividade de ligação da RIIb gama de Fc melhorada (veja, por exemplo, NPL57). Nesta Literatura, a atividade de ligação RIIb gama de Fc melhorou através da adição de alterações tais como S267E/L328F, G236D/S267E e S239D/S267E a uma região Fc de anticorpo. Dentre elas, o anticorpo introduzido com a mutação S267E/L328F se liga mais intensamente a RIIb gama de Fc, e mantém o mesmo nível de ligação a RIa gama de Fc e RIIa gama de Fc do tipo H no qual um resíduo na posição 131 de RIIa gama de Fc é His como aquela de IgG1 que ocorre naturalmente. No entanto, um outro relatório mostra que esta alteração melhora a ligação a RIIa gama de Fc do tipo R no qual um resíduo na posição 131 de RIIa gama de Fc é Arg várias centenas de vezes ao mesmo nível de ligação RIIb gama de Fc, o que significa que a seletividade de ligação a RIIb gama de Fc não aumentou em comparação com RIIa gama de Fc do tipo R (veja, por exemplo, PTL15).
[0023] Apenas o efeito do aumento da ligação de RIIa gama de Fc e não do aumento da ligação de RIIb gama de Fc é considerado por ter influência em células tais como plaquetas que expressam RIIa gama de Fc mas não expressam RIIb gama de Fc (veja, por exemplo, NPL58). Por exemplo, o grupo de pacientes que foi administrado bevacizumabe, um anticorpo contra VEGF, é conhecido por ter um risco aumentado de tromboembolismo (veja, por exemplo, NPL59). Além disso, o tromboembolismo foi observado de uma forma similar em testes de desenvolvimento clínico de anticorpos contra o ligante CD40 e o estudo clínico foi descontinuado (veja, por exemplo, NPL60). Em ambos os casos desses anticorpos, estudos posteriores usando modelos animais e tais sugeriram que os anticorpos administrados agregam plaquetas através da ligação RIIa gama de Fc nas plaquetas e formam coágulos sanguíneos (veja, por exemplo, NPL61 e NPL62). No lúpus eritematoso sistêmico que é uma doença autoimune, as plaquetas são ativadas através de um mecanismo dependente de RIIa gama de Fc e a ativação da plaqueta foi reportada para correlacionar com a gravidade dos sintomas (veja, por exemplo, NPL63). A administração de um anticorpo com ligação RIIa gama de Fc aumentada a tais pacientes que já tinham um alto risco para desenvolver tromboembolismo aumentará o risco para desenvolver tromboembolismo, sendo assim é extremamente perigoso.
[0024] Além disso, reportou-se que os anticorpos com ligação RIIa gama de Fc aumentada aumentam a fagocitose celular dependente de anticorpo mediado por macrófago (ADCP) (veja, por exemplo, NPL64). Quando os antígenos a serem ligados pelos anticorpos são fagocitados pelos macrófagos, os próprios anticorpos também são considerados fagocitados ao mesmo tempo. Quando os anticorpos são administrados como produtos farmacêuticos, supõe-se que fragmentos de peptídeo derivados a partir dos anticorpos administrados são propensos a serem apresentados como um antígeno, com isso aumentando o risco de produção de anticorpos contra anticorpos terapêuticos (anticorpos antiterapêuticos). Mais especificamente, aumentar a ligação RIIa gama de Fc aumentará o risco de produção de anticorpos contra os anticorpos terapêuticos, e isto diminuirá notavelmente o seu valor como produto farmacêutico. Além disso, sugeriu-se que RIIb gama de Fc em células dendríticas contribuíram para a tolerância periférica através da inibição da ativação da célula dendrítica causada por complexos imunes formados entre os antígenos e anticorpos ou através da supressão da apresentação de antígeno a células T através dos receptores gama de Fc (veja, por exemplo, NPL65). Já que se espera RIIa gama de Fc em células dendríticas, quando os anticorpos tendo um Fc com ligação seletiva aumentada a RIIb gama de Fc são usados como produtos farmacêuticos, os antígenos não são prontamente apresentados pelas células dendríticas e tais são devido à ligação seletiva aumentada a RIIb gama de Fc, e o risco de produção de anticorpo antifármaco pode ser relativamente diminuído. Tais anticorpos também podem ser úteis neste caso.
[0025] Mais especificamente, o valor como produtos farmacêuticos será consideravelmente reduzido quando a ligação RIIa gama de Fc é aumentada, o que leva ao risco aumentado de formação de trombo através da agregação plaquetária e risco aumentado da produção de anticorpo antiterapêutico devido a uma imunogenicidade aumentada.
[0026] A partir de tal ponto de vista, a variante Fc mencionada acima com a ligação RIIb gama de Fc aumentada mostra a ligação RIIa gama de Fc do tipo R significativamente aumentada comparada com aquela de uma IgG1 que ocorre naturalmente. Deste modo, o seu valor como um produto farmacêutico para os pacientes que carregam RIIa gama de Fc do tipo r é consideravelmente reduzido. Os tipos H e R de RIIa gama de Fc são observados em Caucasianos e Norte-Americanos de origem Africana com aproximadamente a mesma frequência (veja, por exemplo, NPL66 e NPL67). Deste modo, quando esta variante de Fc foi usada para o tratamento de doenças autoimunes, o número de pacientes que podem usá-lo de forma segura enquanto usufrui de seus efeitos como um produto farmacêutico será limitado.
[0027] Além disso, em células dendríticas deficientes em RIIb gama de Fc ou células dendríticas nas quais a interação entre RIIb gama de Fc e a porção Fc do anticorpo é inibida por um anticorpo anti-RIIb gama de Fc, reportou-se que as células dendríticas amadurecem (veja, por exemplo, NPL68 e NPL69). Este relatório sugere que RIIb gama de Fc está ativamente suprimindo a maturação de células dendríticas em um estado de equilíbrio onde a inflamação e tal não acontecem e ativação não acontece. RIIa gama de Fc é expressada na superfície da célula dendrítica além da RIIb gama de Fc; deste modo, mesmo se a ligação a RIIb gama de Fc inibidora for aumentada e se a ligação a R gama de Fc de ativação tal como RIIa gama de Fc também for aumentada, a maturação de células dendríticas pode ser promovida como um resultado. Mais especificamente, melhora não apenas a ligação de RIIb gama de Fc mas também se considera importante a razão da atividade de ligação da RIIb gama de Fc relativa à atividade de ligação a RIIa gama de Fc em prover os anticorpos com uma ação imunossupressora.
[0028] Deste modo, quando se considera a geração de um produto farmacêutico que utiliza a RIIb gama de ação supressora mediada pela ligação a Fc, existe uma necessidade por uma variante de Fc que não apenas tenha RIIb gama de atividade de ligação a Fc aumentada, mas também tenha ligação a ambos alótipos dos tipos H e R de RIIa gama de Fc que são mantidos em um nível similar ou são enfraquecidos para um nível menor do que aquele de uma IgG1 que ocorre naturalmente.
[0029] Enquanto isso, reportaram-se até agora os casos onde as alterações de aminoácido foram introduzidas na região Fc para aumentar a RIIb gama de seletividade de ligação a Fc (veja, por exemplo, NPL70). No entanto, todas as variantes reconhecidas por aumentar a seletividade da RIIb gama de Fc conforme reportados nesta literatura mostraram ligação da RIIb gama de Fc diminuída quando comparada com aquela de uma IgG1 que ocorre naturalmente. Deste modo, considera-se ser difícil para essas variantes induzir de fato uma reação imunossupressora mediada por RIIb gama de Fc mais intensamente do que IgG1.
[0030] Além disso, já que RIIb gama de Fc tem um papel importante nos anticorpos agonistas mencionados acima, espera-se que ao melhorar a sua atividade de ligação, melhore a atividade agonista. No entanto, quando se melhora a ligação RIIa gama de Fc de forma similar, atividades não pretendidas tais como a atividade ADCC e a atividade ADCP serão exibidas, e isto pode causar efeitos colaterais. Também a partir de tal ponto de vista, prefere-se ser capaz de melhorar seletivamente RIIb gama de atividade de ligação a Fc.
[0031] A partir desses resultados, a produção de anticorpos terapêuticos a serem usados para tratar doenças autoimunes e câncer utilizando RIIb gama de Fc, o importante é que quando comparado com aqueles de uma IgG que ocorre naturalmente, as atividades de ligação a ambos os alótipos de RIIa gama de Fc são mantidas ou diminuídas e a ligação de RIIb gama de Fc é melhorada. No entanto, RIIb gama de Fc compartilha 93% de identidade da sequência na região extracelular com aquela de RIIa gama de Fc a qual é uma da R gama de Fc de ativação, e eles são muito similares estruturalmente. Existem alótipos de RIIa gama de Fc, tipo H e tipo R, nos quais o aminoácido na posição 131 é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e ainda cada um deles reage de forma diferente com os anticorpos (veja, por exemplo, NPL71). Deste modo, o problema difícil pode ser produzir uma variante da região Fc com ligação seletiva RIIb gama de Fc melhorada quando se compara a cada alótipo de RIIa gama de Fc, que envolve distinguir sequências altamente homólogas entre RIIa gama de Fc e RIIb gama de Fc. Apesar daquelas dificuldades, várias variantes da região Fc foram identificadas até agora, o que tem atividade de ligação seletiva a RIIb gama de Fc conforme comparado a RIIa gama de Fc, ao se conduzir análise de modificação compreensiva de aminoácido na região Fc (veja, por exemplo, PTL16, PTL17, PTL18, PTL19 e PTL20).
[0032] Houve um relatório em uma variante da região Fc com seletividade de ligação por RIIb gama de Fc em relação a R gama de Fc humana até agora, enquanto que não houve nenhum relatório em uma variante da região Fc com a seletividade de ligação por RIIb gama de Fc em relação a R gama de Fc de macaco. Devido à ausência de tal variante Fc, os efeitos da variante Fc que se ligam de forma seletiva a RIIb gama de Fc não foram completamente testadas ainda em macaco.
[0033] Além do mencionado acima, reporta-se que ao modificar a carga dos resíduos de aminoácido que podem ser expostos na superfície de um anticorpo de modo a aumentar ou diminuir o ponto isoelétrico (pI) do anticorpo, é possível regular a meia-vida do anticorpo no sangue (veja, por exemplo, PTL21 e PTL22). Eles mostram que é possível prolongar a meia-vida do plasma de um anticorpo ao se reduzir o pl do anticorpo e vice-versa.
[0034] Além disso, reporta-se que a incorporação de um antígeno nas células pode ser promovida ao se modificar a carga de resíduos de aminoácido especificados particularmente em seu domínio CH3 para aumentar o pI do anticorpo (veja, por exemplo, PTL23). Além disso, também se reportou que modificar a carga de resíduos de aminoácido na região constante (principalmente domínio CH1) de um anticorpo para reduzir pI pode prolongar a meia-vida do anticorpo no plasma (veja, por exemplo, PTL24).
Lista de Citação Literatura de Patente
[0035] [PTL1] PATENTE NORTE-AMERICANA NO. 5.827.733
[0036] [PTL2] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 1994/021681
[0037] [PTL3] PATENTE NORTE-AMERICANA NO. 6.096.506
[0038] [PTL4] PATENTE NORTE-AMERICANA NO. 7.261.893
[0039] [PTL5] PATENTE NORTE-AMERICANA NO. 7.320.789
[0040] [PTL6] PATENTE NORTE-AMERICANA NO. 7.807.159
[0041] [PTL7] PATENTE NORTE-AMERICANA NO. 7.888.486
[0042] [PTL8] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2005/094446
[0043] [PTL9] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2007/047112
[0044] [PTL10] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2010/070094
[0045] [PTL11] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2000/042072
[0046] [PTL12] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2006/019447
[0047] [PTL13] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2004/099249
[0048] [PTL14] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2004/029207
[0049] [PTL15] PUBLICAÇÃO DO PEDIDO DE PATENTE NORTE- AMERICANO NO. US2009/0136485
[0050] [PTL16] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2012/115241
[0051] [PTL17] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2013/047752
[0052] [PTL18] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2013/125667
[0053] [PTL19] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2014/030728
[0054] [PTL20] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2014/163101
[0055] [PTL21] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2007/114319
[0056] [PTL22] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2009/041643
[0057] [PTL23] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2014/145159
[0058] [PTL24] PUBLICAÇÃO INTERNACIONAL WO 2012/016227
Literatura não Patente
[0059] [NPL1] KINGSLEY ET AL., GENES DEV. 8(2):133-146 (1994)
[0060] [NPL2] HOODLESS ET AL., CURR. TOP. MICROBIOL. IMMUNOL. 228:235-272 (1998)
[0061] [NPL3] ZIMMERS ET AL., SCIENCE 296(5572):1486-1488 (2002)
[0062] [NPL4] MCPHERRON ET AL., NATURE 387(6628):83-90 (1997)
[0063] [NPL5] MCPHERRON AND LEE, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 94(23):12457-12461 (1997)
[0064] [NPL6] SZLAMA ET AL., FEBS J 280(16):3822-3839 (2013)
[0065] [NPL7] LEE, PLOS ONE 3(2):E1628 (2008)
[0066] [NPL8] LEE, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 98(16):9306- 9311 (2001)
[0067] [NPL9] MCPHERRON ET AL., NATURE 387(6628):83-90 (1997)
[0068] [NPL10] MCCROSKERY ET AL., J CELL SCI. 118(15):3531- 3541 (2005)
[0069] [NPL11] WHITTEMORE ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 300(4):965-971 (2003)
[0070] [NPL12] BOGDANOVICH ET AL., NATURE 420(6914):418- 421 (2002)
[0071] [NPL13] WAGNER., ANN. NEUROL. 52(6):832-836 (2002)
[0072] [NPL14] REICHERT ET AL., NAT. BIOTECHNOL. 23:1073 1078 (2005)
[0073] [NPL15] PAVLOU ET AL., EUR. J. PHARM. BIOPHARM. 59:389-396 (2005)
[0074] [NPL16] CLARK ET AL., CHEM. IMMUNOL. 65:88-110 (1997)
[0075] [NPL17] JEFFERIS ET AL., IMMUNOL. LETT. 82:57-65 (2002)
[0076] [NPL18] SMITH ET AL., NAT. REV. IMMUNOL. 10:328-343 (2010)
[0077] [NPL19] RADAEV ET AL., J. BIOL. CHEM. 276:16478-16483 (2001)
[0078] [NPL20] GREENWOOD ET AL., EUR. J. IMMUNOL. 23:1098-1104 (1993)
[0079] [NPL21] MORGAN ET AL., IMMUNOLOGY 86:319-324 (1995)
[0080] [NPL22] NIMMERJAHN ET AL., NAT. REV. IMMUNOL. 8:34 47 (2008)
[0081] [NPL23] AMIGORENA ET AL., EUR. J. IMMUNOL. 19:1379 1385 (1989)
[0082] [NPL24] SINCLAIR, J. EXP. MED. 129:1183-1201 (1969)
[0083] [NPL25] HEYMAN, IMMUNOL. LETT. 88:157-161 (2003)
[0084] [NPL26] AMIGORENA ET AL., SCIENCE 256:1808-1812 (1992)
[0085] [NPL27] MUTA ET AL., NATURE 368:70-73 (1994)
[0086] [NPL28] RAVETCH, SCIENCE 290:84-89 (2000)
[0087] [NPL29] FOURNIER ET AL., J. IMMUNOL. 181:5350-5359 (2008)
[0088] [NPL30] SMITH ET AL., NAT. REV. IMMUNOL. 10:328-343 (2010)
[0089] [NPL31] J. IMMUNOL. 163:618-622 (1999)
[0090] [NPL32] YUASA ET AL., J. EXP. MED. 189:187-194 (1999)
[0091] [NPL33] NAKAMURA ET AL., J. EXP. MED. 191:899-906 (2000)
[0092] [NPL34] BLANK, HUM. GENET. 117:220-227 (2005)
[0093] [NPL35] OLFERIEV ET AL., J. BIOL. CHEM. 282:1738-1746 (2007)
[0094] [NPL36] CHEN ET AL., ARTHRITIS RHEUM. 54:3908-3917 (2006)
[0095] [NPL37] FLOTO ET AL., NAT. MED. 11:1056-1058 (2005)
[0096] [NPL38] LI ET AL., J. IMMUNOL. 176:5321-5328 (2006)
[0097] [NPL39] MACKAY ET AL., J. EXP. MED. 203:2157-2164 (2006)
[0098] [NPL40] YANG ET AL., J. IMMUNOL. 178:3272-3280 (2007)
[0099] [NPL41] BRUHNS ET AL., BLOOD 113:3716-3725 (2009)
[00100] [NPL42] CHU ET AL., MOL. IMMUNOL. 45:3926-3933 (2008)
[00101] [NPL43] CHU ET AL., J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL. 129:1102-1115 (2012)
[00102] [NPL44] VERI ET AL., ARTHRITIS RHEUM. 62:1933-1943 (2010)
[00103] [NPL45] CEMERSKI ET AL., IMMUNOL. LETT. 143:34-43 (2012)
[00104] [NPL46] WENINK ET AL., J. IMMUNOL. 183:4509-4520 (2009)
[00105] [NPL47] ZHANG ET AL., J. IMMUNOL. 182:554-562 (2009)
[00106] [NPL48] RAVETCH, SCIENCE 333:1030-1034 (2011)
[00107] [NPL49] WILSON ET AL., CANCER CELL 19:101-113 (2011)
[00108] [NPL50] KOHRT ET AL., J. CLIN. INVEST. 122:1066-1075 (2012)
[00109] [NPL51] XU ET AL., J. IMMUNOL. 171:562-568 (2003)
[00110] [NPL52] ZHANG ET AL., BLOOD 108:705-710 (2006)
[00111] [NPL53] CHUNTHARAPAI ET AL., J. IMMUNOL. 166:4891 4898 (2001)
[00112] [NPL54] RAVETCH ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 109:10966-10971 (2012)
[00113] [NPL55] RAVETCH, SCIENCE 333:1030-1034 (2011)
[00114] [NPL56] CEMERSKI ET AL., IMMUNOL. LETT. 143:28-33 (2002)
[00115] [NPL57] CHU ET AL., MOL. IMMUNOL. 45:3926-3933 (2008)
[00116] [NPL58] SMITH ET AL., NAT. REV. IMMUNOL. 10:328-343 (2010)
[00117] [NPL59] SCAPPATICCI ET AL., J. NATL. CANCER. INST. 99:1232-1239 (2007)
[00118] [NPL60] ARTHRITIS RHEUM. 48:719-727 (2003)
[00119] [NPL61] MEYER ET AL., J. THROMB. HAEMOST. 7:171 181 (2008)
[00120] [NPL62] ROBLES-CARRILLO ET AL., J. IMMUNOL. 185:1577-1583 (2010)
[00121] [NPL63] DUFFAU ET AL., SCI. TRANSL. MED. 2:47RA63 (2010)
[00122] [NPL64] RICHARDS ET AL, MOL. CANCER THER. 7:2517 2527 (2008)
[00123] [NPL65] DESAI ET AL., J. IMMUNOL. 178:6217-6226 (2007)
[00124] [NPL66] SALMON ET AL., J. CLIN. INVEST. 97:1348-1354 (1996)
[00125] [NPL67] MANGER ET AL., ARTHRITIS RHEUM. 41:1181 1189 (1998)
[00126] [NPL68] BORUCHOV ET AL., J. CLIN. INVEST. 115:2914 2923 (2005)
[00127] [NPL69] DHODAPKAR ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 102:2910-2915 (2005)
[00128] [NPL70] ARMOUR ET AL., MOL. IMMUNOL. 40:585-593 (2003)
[00129] [NPL71] WARMERDAM ET AL., J. EXP. MED. 172:19-25 (1990)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00130] A invenção provê anticorpos antimiostatina e métodos de utilização dos mesmos. A invenção também provê proteínas contendo uma região Fc variante e métodos de utilização dos mesmos.
[00131] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção se liga à miostatina latente. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga a um epítopo dentro de um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78). Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção inibe a ativação da miostatina. Em modalidades adicionais, o anticorpo bloqueia a liberação da miostatina madura a partir da miostatina latente. Em modalidades adicionais, o anticorpo bloqueia a liberação proteolítica de miostatina madura. Em modalidades adicionais, o anticorpo bloqueia uma liberação espontânea de miostatina madura. Em modalidades adicionais, o anticorpo não se liga à miostatina madura. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 13. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 13. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 2a. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 11a. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 11a. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 2a, 11a ou 13. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a, 11a ou 13.
[00132] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção se liga à miostatina latente com maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em algumas modalidades, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina latente com maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção se liga a um fragmento de polipeptídeo consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78) com maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorpo descrito na Tabela 13 com uma maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 13 com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 13 com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorpo descrito na Tabela 2a com uma maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorpo descrito na Tabela 2a com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 11a com uma maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorpo descrito na Tabela 11a com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 11a com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 2a, 11a ou 13 com uma maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorpo descrito na Tabela 2a, 11a ou 13 com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a, 11a ou 13 com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8.
[00133] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo provido no presente documento. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo descrito na Tabela 13. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 13. Em algumas modalidades, o anticorpo compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo descrito na Tabela 2a. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a. Em algumas modalidades, o anticorpo compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo descrito na Tabela 11a. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 11a. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo descrito na Tabela 2a, 11a ou 13. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a, 11a ou 13. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga a miostatina latente com uma maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga a miostatina latente com uma maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga a um fragmento de polipeptídeo consistindo em aminoácidos 21-100 de propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78) com maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Métodos para avaliar a capacidade de um anticorpo em competir com um anticorpo de referência por ligação da miostatina latente são descritos no presente documento e conhecidos na técnica.
[00134] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção é um fragmento de anticorpo que se liga à miostatina. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção é um fragmento de anticorpo que se liga à miostatina latente. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção é um fragmento de anticorpo que se liga a um fragmento de polipeptídeo consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78). Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção é um anticorpo de IgG de comprimento total.
[00135] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina da invenção compreende:
[00136] (a) (i) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128), (ii) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131), e (iii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127);
[00137] (b) (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2DIS, em que X1 é S ou H, X2 é Y, T, D ou E (SEQ ID NO: 126), (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127), e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128);
[00138] (c) (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2DIS, em que X1 é S ou H, X2 é Y, T, D ou E (SEQ ID NO: 126), (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127), (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128), (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2SQX3VX4X5X6NWLS, em que X1 é Q ou T, X2 é S ou T, X3 é S ou E, X4 é Y ou F, X5 é D ou H, X6 é N, D, A ou E (SEQ ID NO: 129); (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido WAX1TLAX2, em que X1 é S ou E, X2 é S, Y, F ou W (SEQ ID NO: 130); e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131);
[00139] (d) (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2SQX3VX4X5X6NWLS, em que X1 é Q ou T, X2 é S ou T, X3 é S ou E, X4 é Y ou F, X5 é D ou H, X6 é N, D, A ou E (SEQ ID NO: 129); (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido WAX1TLAX2, em que X1 é S ou E, X2 é S, Y, F ou W (SEQ ID NO: 130); e (iii) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131). Em algumas modalidades, o anticorpo de (b) também compreende um FR1 framework de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 132-134; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 135-136; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 137; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 138. Em algumas modalidades, o anticorpo de (d), também compreende um FR1 framework de domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 139; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-141; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 142-143; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 144.
[00140] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compreende (a) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128), (b) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131), e (c) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127).
[00141] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compreende (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2DIS, em que X1 é S ou H, X2 é Y, T, D ou E (SEQ ID NO: 126), (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127), e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128). Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende um FR1 framework de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 132-134; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 135-136; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 137; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:138. Em modalidades adicionais, o anticorpo de forma adicional compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2SQX3VX4X5X6NWLS, em que X1 é Q ou T, X2 é S ou T, X3 é S ou E, X4 é Y ou F, X5 é D ou H, X6 é N, D, A ou E (SEQ ID NO: 129); (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido WAX1TLAX2, em que X1 é S ou E, X2 é S, Y, F ou W (SEQ ID NO: 130); e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131).
[00142] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2SQX3VX4X5X6NWLS, em que X1 é Q ou T, X2 é S ou T, X3 é S ou E, X4 é Y ou F, X5 é D ou H, X6 é N, D, A ou E (SEQ ID NO: 129); (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido WAX1TLAX2, em que X1 é S ou E, X2 é S, Y, F ou W (SEQ ID NO: 130); e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131). Em uma modalidade adicional, o anticorpo também compreende um FR1 framework de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 139; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-141; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 142-143; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 144.
[00143] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compreende um FR1 framework de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 132-134; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 135-136; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 137; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 138. Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compreende um FR1 framework de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 139; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-141; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 142-143; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 144.
[00144] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina isolado da presente invenção compreende (a) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34, e 8695; (b) uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38, e 96-99; ou (c) uma sequência VH como em (a) e uma sequência VL como em (b). Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende uma sequência VH de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34, e 86-95. Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende uma sequência VL de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38, e 96-99. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência VH de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95. Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende uma sequência VH de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95; e uma sequência VL de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99.
[00145] A invenção também provê ácidos nucleicos isolados codificando um anticorpo antimiostatina da presente invenção. A invenção também provê células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico da presente invenção. A invenção também provê um método de produção de um anticorpo que compreende cultivar uma célula hospedeira da presente invenção de modo que o anticorpo seja produzido.
[00146] Em alguns aspectos, a invenção provê um método de produção um anticorpo antimiostatina compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção de modo que o anticorpo seja produzido; ou (b) imunizar um animal contra um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende a região correspondendo aos aminoácidos nas posições 21 a 100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78).
[00147] A invenção também provê um método de produção um anticorpo antimiostatina. Em algumas modalidades, o método compreende imunizar um animal contra um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende a região correspondendo aos aminoácidos nas posições 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78).
[00148] A invenção também provê uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo antimiostatina da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00149] A invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes e métodos de fabricação e utilização dos mesmos.
[00150] Em uma modalidade, a invenção provê polipeptídeos de ligação a RIIb gama de Fc compreendendo regiões Fc variantes e métodos de utilização dos mesmos. Em algumas modalidades, uma região Fc variante com RIIb gama de atividade de ligação aumentada a Fc da presente invenção compreende pelo menos uma alteração de aminoácido em uma região Fc parente. Em modalidades adicionais, a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIb gama de Fc de macaco]/[Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc de macaco] é 2,0 ou maior. Em modalidades adicionais, a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIIa gama de Fc de macaco]/[Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc de macaco] é 0,5 ou menor. Em modalidades adicionais, a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIb gama de Fc humano]/[Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc humano] é 2,0 ou maior. Em modalidades adicionais, a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIIa gama de Fc humano]/[Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc humano] é 0,5 ou menor. Em modalidades adicionais, a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIa gama de Fc humano (tipo H)]/[Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo H)] é 5,0 ou menor. Em modalidades adicionais, a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIa gama de Fc humano (tipo R)]/[Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo R)] é 5,0 ou menor. Em uma outra modalidade, o Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc de macaco é 1,0x10-6 M ou menor. Em uma outra modalidade, o Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc de macaco é 5,0x10-7 M ou maior. Em uma outra modalidade, o Valor KD da região Fc variante parar RIIb gama de Fc humano é 2,0x10-6 M ou menor. Em uma outra modalidade, o Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc humano é 1,0x10-6 M ou maior. Em uma outra modalidade, o Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo H) é 1,0x10-7 M ou maior. Em uma outra modalidade, o Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo R) é 2,0x10-7 M ou maior.
[00151] Em algumas modalidades, uma região Fc variante com RIIb gama de Atividade de ligação a Fc aumentado da presente invenção compreende pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com a numeração EU.
[00152] Em modalidades adicionais, a região Fc variante com RIIb gama de Atividade de ligação a Fc aumentada compreende pelo menos duas alterações de aminoácido compreendendo: (a) uma alteração de aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) posição 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396; (ii) posição: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396; ou (iii) posição 268, 295, 326 e 330; de acordo com a numeração EU.
[00153] Em modalidades adicionais, a região Fc variante com RIIb gama de atividade de ligação a Fc aumentada compreende pelo menos duas alterações de aminoácido compreendendo: (a) uma alteração de aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com a numeração EU.
[00154] Em modalidades adicionais, a região Fc variante com RIIb gama de atividade de ligação a Fc aumentada compreende pelo menos duas alterações de aminoácido compreendendo: (a) uma alteração de aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396, de acordo com a numeração EU.
[00155] Em modalidades adicionais, a região Fc variante com RIIb gama de atividade de ligação a Fc aumentada compreende pelo menos duas alterações de aminoácido compreendendo: (a) uma alteração de aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 268, 295, 326 e 330 de acordo com a numeração EU.
[00156] Em algumas modalidades, a região Fc variante com RIIb gama de atividade de ligação a Fc aumentada compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 231; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 232; (c) Asp na posição 233; (d) Trp, Tyr na posição 234; (e) Trp na posição 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val na posição 236; (g) Asp, Tyr na posição 237; (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr na posição 238; (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val na posição 239; (j) Ile na posição 264; (k) Phe na posição 266; (l) Ala, His, Leu na posição 267; (m) Asp, Glu na posição 268; (n) Asp, Glu, Gly na posição 271; (o) Leu na posição 295; (p) Leu na posição 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu na posição 325; (r) Thr na posição 326; (s) Ile, Asn na posição 327; (t) Thr na posição 328; (u) Lys, Arg na posição 330; (v) Glu na posição 331; (w) Asp na posição 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr na posição 334; e (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 396; de acordo com a numeração EU.
[00157] Em modalidades adicionais, a região Fc variante com RIIb gama de atividade de ligação a Fc aumentada compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) Gly, Thr na posição 231; (b) Asp na posição 232; (c) Trp na posição 235; (d) Asn, Thr na posição 236; (e) Val na posição 239; (f) Asp, Glu na posição 268; (g) Leu na posição 295; (h) Leu na posição 298; (i) Thr na posição 326; (j) Lys, Arg na posição 330, e (k) Lys, Met na posição 396; de acordo com a numeração EU.
[00158] Em uma outra modalidade, a invenção provê um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com um ponto isoelétrico (pl) aumentado e um método de utilização do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado compreende pelo menos duas alterações de aminoácido em uma região Fc parente. Em modalidades adicionais, cada uma das alterações de aminoácido aumenta o ponto isoelétrico (pI) da região Fc variante comparada com aquela da região Fc parente. Em modalidades adicionais, o aminoácido pode ser exposto na superfície da região Fc variante. Em modalidades adicionais, um polipeptídeo compreende a região Fc variante e um domínio de ligação ao antígeno. Em modalidades adicionais, a atividade de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno muda de acordo com condições de concentração iônica. Em modalidades adicionais, a região Fc variante com pI aumentado da presente invenção compreende pelo menos duas alterações de aminoácido de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 e 431 de acordo com a numeração EU. Em modalidades adicionais, a região Fc variante com pl aumentado compreende Arg ou Lys em cada uma das posições selecionadas.
[00159] Em algumas modalidades, a região Fc variante da presente invenção compreende alterações de aminoácido descrito nas Tabelas 14-30.
[00160] Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreende a região Fc variante da presente invenção. Em modalidades adicionais, a região Fc parente é derivada de IgG1 humana. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo é um anticorpo. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc.
[00161] A invenção provê um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 229-381.
[00162] A invenção também provê ácido nucleico isolado codificando o polipeptídeo compreendendo a região Fc variante da presente invenção. A invenção também provê uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico da presente invenção. A invenção também provê um método de produção um polipeptídeo compreendendo a região Fc variante compreendendo cultivar o hospedeiro da presente invenção de modo que o polipeptídeo seja produzido.
[00163] A invenção também provê uma formulação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc variante da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00164] Especificamente, a presente invenção se refere a:
[00165] [1] Um anticorpo isolado que se liga a miostatina latente, em que o anticorpo inibe a ativação de miostatina.
[00166] [2] O anticorpo de [1], em que o anticorpo:
[00167] (a) bloqueia a liberação de miostatina madura a partir de miostatina latente;
[00168] (b) bloqueia a liberação proteolítica de miostatina madura;
[00169] (c) bloqueia a liberação espontânea de miostatina madura; ou
[00170] (d) não se liga à miostatina madura; ou se liga a um epítopo dentro de um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78).
[00171] [3] O anticorpo de [1] ou [2], em que o anticorpo compete por ligação da miostatina latente com, ou liga o mesmo epítopo como, um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito nas Tabelas 2a, 11a ou 13.
[00172] [4] O anticorpo de qualquer uma das [1] a [3], o qual se liga a miostatina latente com maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico, ou que se liga a miostatina latente com maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8.
[00173] [5] O anticorpo de qualquer uma das [1] a [4], o qual é (a) um anticorpo monoclonal, (b) um anticorpo humano, humanizado ou quimérico; (c) um anticorpo de IgG de comprimento total ou (d) um fragmento de anticorpo que se liga a miostatina.
[00174] [6] O anticorpo de qualquer uma das [1] a [5], em que o anticorpo compreende:
[00175] (a) (i) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128), (ii) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131), e (iii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127);
[00176] (b) (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2DIS, em que X1 é S ou H, X2 é Y, T, D ou E (SEQ ID NO: 126), (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127), e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128);
[00177] (c) (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2DIS, em que X1 é S ou H, X2 é Y, T, D ou E (SEQ ID NO: 126), (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7, em que X1 é Y ou H, X2 é S ou K, X3 é T, M ou K, X4 é Y ou K, X5 é A, M ou E, X6 é S ou E, X7 é G ou K (SEQ ID NO: 127), (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido GVPAX1SX2GGDX3, em que X1 é Y ou H, X2 é T ou H, X3 é L ou K (SEQ ID NO: 128), (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2SQX3VX4X5X6NWLS, em que X1 é Q ou T, X2 é S ou T, X3 é S ou E, X4 é Y ou F, X5 é D ou H, X6 é N, D, A ou E (SEQ ID NO: 129); (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido WAX1TLAX2, em que X1 é S ou E, X2 é S, Y, F ou W (SEQ ID NO: 130); e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131); ou
[00178] (d) (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido X1X2SQX3VX4X5X6NWLS, em que X1 é Q ou T, X2 é S ou T, X3 é S ou E, X4 é Y ou F, X5 é D ou H, X6 é N, D, A ou E (SEQ ID NO: 129); (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido WAX1TLAX2, em que X1 é S ou E, X2 é S, Y, F ou W (SEQ ID NO: 130); e (iii) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido AGGYGGGX1YA, em que X1 é L ou R (SEQ ID NO: 131).
[00179] [7] O anticorpo de [6](b), compreendendo também um FR1 framework de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 132-134; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 135-136; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 137; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 138.
[00180] [8] O anticorpo de [6](d), compreendendo também um FR1 framework de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 139; FR2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-141; FR3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 142-143; e FR4 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 144.
[00181] [9] O anticorpo de qualquer uma das [1] a [5], compreendendo (a) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34, e 86-95; (b) uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99; ou (c) uma sequência VH de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95, e uma sequência VL de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99.
[00182] [10] Um ácido nucleico isolado codificando o anticorpo de qualquer uma das [1] a [9].
[00183] [11] Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de [10].
[00184] [12] Um método de produção um anticorpo antimiostatina compreendendo:
[00185] (a) cultivar a célula hospedeira de [11] de modo que o anticorpo seja produzido; ou
[00186] (b) imunizar um animal contra um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende a região correspondendo aos aminoácidos nas posições 21 a 100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78).
[00187] [13] Uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer uma das [1] a [9] e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00188] [14] Um polipeptídeo compreendendo a região Fc variante compreendendo pelo menos uma alteração de aminoácido em uma região Fc parente, em que a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIb gama de Fc de macaco]/[Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc de macaco] é 2,0 ou maior, e a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIIa gama de Fc de macaco]/[Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc de macaco] é 0,5 ou menor.
[00189] [15] O polipeptídeo de [14], adicionalmente em que a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIb gama de Fc humano]/[Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc humano] é 2,0 ou maior, e a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIIa gama de Fc humano]/[Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc humano] é 0,5 ou menor.
[00190] [16] O polipeptídeo de [15], adicionalmente em que a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIa gama de Fc humano (tipo H)]/[Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo H)] é 5,0 ou menor.
[00191] [17] O polipeptídeo de [16], adicionalmente em que a razão de [Valor KD da região Fc parente para RIIa gama de Fc humano (tipo R)]/[Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo R)] é 5,0 ou menor.
[00192] [18] O polipeptídeo de [14], em que o Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc de macaco é 1,0x10-6 M ou menor, e o Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc de macaco é 5,0x10-7 M ou maior.
[00193] [19] O polipeptídeo de [15], em que o Valor KD da região Fc variante para RIIb gama de Fc humano é 2,0x10-6 M ou menor, e o Valor KD da região Fc variante para RIIIa gama de Fc humano é 1,0x10-6 M ou maior.
[00194] [20] O polipeptídeo de [16], em que o Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo H) é 1,0x10-7 M ou maior.
[00195] [21] O polipeptídeo de [17], em que o Valor KD da região Fc variante para RIIa gama de Fc humano (tipo R) é 2,0x10-7 M ou maior.
[00196] [22] O polipeptídeo de qualquer uma das [14] a [21], em que a região Fc variante compreende pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com a numeração EU.
[00197] [23] O polipeptídeo de [22], em que a região Fc variante compreende pelo menos duas alterações de aminoácido compreendendo:
[00198] (a) uma alteração de aminoácido na posição 236, e
[00199] (b) pelo menos uma alteração de aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00200] (i) posição 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396;
[00201] (ii) posição: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396; ou
[00202] (iii) posição 268, 295, 326 e 330;
[00203] de acordo com a numeração EU.
[00204] [24] O polipeptídeo de acordo com [22] ou [23], em que a região Fc variante compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em:
[00205] (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 231,
[00206] (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 232,
[00207] (c) Asp na posição 233,
[00208] (d) Trp, Tyr na posição 234,
[00209] (e) Trp na posição 235,
[00210] (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val na posição 236,
[00211] (g) Asp, Tyr na posição 237,
[00212] (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr na posição 238,
[00213] (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val na posição 239,
[00214] (j) Ile na posição 264,
[00215] (k) Phe na posição 266,
[00216] (l) Ala, His, Leu na posição 267,
[00217] (m) Asp, Glu na posição 268,
[00218] (n) Asp, Glu, Gly na posição 271,
[00219] (o) Leu na posição 295,
[00220] (p) Leu na posição 298,
[00221] (q) Glu, Phe, Ile, Leu na posição 325,
[00222] (r) Thr na posição 326,
[00223] (s) Ile, Asn na posição 327,
[00224] (t) Thr na posição 328,
[00225] (u) Lys, Arg na posição 330,
[00226] (v) Glu na posição 331,
[00227] (w) Asp na posição 332,
[00228] (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr na posição 334, e
[00229] (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 396;
[00230] de acordo com a numeração EU.
[00231] [25] O polipeptídeo de acordo com [24], em que a região Fc variante compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em:
[00232] (a) Gly, Thr na posição 231,
[00233] (b) Asp na posição 232,
[00234] (c) Trp na posição 235,
[00235] (d) Asn, Thr na posição 236,
[00236] (e) Val na posição 239,
[00237] (f) Asp, Glu na posição 268,
[00238] (g) Leu na posição 295,
[00239] (h) Leu na posição 298,
[00240] (i) Thr na posição 326,
[00241] (j) Lys, Arg na posição 330, e
[00242] (k) Lys, Met na posição 396;
[00243] de acordo com a numeração EU.
[00244] [26] Um polipeptídeo compreendendo a região Fc variante compreendendo pelo menos duas alterações de aminoácido em uma região Fc parente, em que cada uma das alterações de aminoácido aumenta o ponto isoelétrico (pI) da região Fc variante quando se compara com aquele da região Fc parente.
[00245] [27] O polipeptídeo de [26], em que as alterações do aminoácido são expostas na superfície da região Fc variante.
[00246] [28] O polipeptídeo de [26] ou [27], compreendendo também um domínio de ligação ao antígeno.
[00247] [29] O polipeptídeo de [28] em que atividade de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno muda de acordo com condições de concentração iônica.
[00248] [30] O polipeptídeo de qualquer uma das [26] a [29], em que a região Fc variante compreende pelo menos duas alterações de aminoácido de pelo menos duas posições selecionada a partir do grupo consistindo em: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 e 431, de acordo com a numeração EU.
[00249] [31] O polipeptídeo de [30], em que a região Fc variante compreende Arg ou Lys em cada uma das posições selecionadas.
[00250] [32] Um polipeptídeo compreendendo a região Fc variante compreendendo alterações de aminoácido descrito nas Tabelas 14-30.
[00251] [33] O polipeptídeo de qualquer uma das [14] a [32], em que a região Fc parente é derivada de IgG1 humana.
[00252] [34] O polipeptídeo de qualquer uma das [14] a [33] em que o polipeptídeo é um anticorpo ou uma proteína de fusão Fc.
[00253] [35] Um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 229-381.
[00254] [36] Um ácido nucleico isolado codificando o polipeptídeo de qualquer uma das [14] a [35].
[00255] [37] Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de [36].
[00256] [38] Um método de produção um polipeptídeo compreendendo a região Fc variante, o método compreendendo cultivar a célula hospedeira de [37] de modo que o polipeptídeo seja produzido.
[00257] [39] Uma formulação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das [14] a [35] e um veículo farmaceuticamente aceitável.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00258] [Fig. 1]
[00259] A Figura 1 ilustra a inibição da ativação proteolítica de miostatina latente através do anticorpo da miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 3. A atividade da miostatina ativa liberada da miostatina latente pela protease BMP1 foi medida na presença de um anticorpo de miostatina antilatente, usando ensaio HEK Blue.
[00260] [Fig. 2]
[00261] A Figura 2 ilustra a inibição da ativação espontânea de miostatina latente através do anticorpo da miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 4. A atividade da miostatina ativa liberada da miostatina latente através de incubação a 37 graus C foi medida na presença de anticorpo de miostatina antilatente, usando ensaio HEK Blue.
[00262] [Fig. 3]
[00263] A Figura 3 ilustra a ligação do anticorpo de miostatina antilatente ao domínio de propeptídeo, conforme descrito no Exemplo 5.
[00264] [Fig. 4]
[00265] A Figura 4 ilustra a análise Western Blot contra o propeptídeo de miostatina, conforme descrito no Exemplo 6. A clivagem proteolítica do propeptídeo de miostatina pelo BMP1 foi avaliada na presença e ausência do anticorpo de miostatina antilatente.
[00266] [Fig. 5]
[00267] As Figuras 5A-5C ilustram sensorgramas BIACORE (marca registrada) de anticorpo de miostatina antilatente MST1032-G1m em relação à miostatina latente humana (A), miostatina latente de macaco cinomolgo (B) e miostatina latente de camundongo (C), conforme descrito no Exemplo 7.
[00268] [Fig. 6]
[00269] A Figura 6 ilustra a inibição da ativação proteolítica e espontânea de miostatina latente através do anticorpo humanizado de miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 8. A atividade da miostatina ativa liberada da miostatina latente pela protease BMP1 (proteolítica) ou através de incubação a 37 graus C sem BMP1 (espontâneo) foi medida na presença de anticorpo de miostatina antilatente, usando ensaio HEK Blue.
[00270] [Fig. 7]
[00271] A Figura 7 ilustra sensorgramas BIACORE (marca registrada) de variantes substituídas de histidina do anticorpo de miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 9. Os complexos de anticorpo/antígeno foram deixados dissociar em pH7,4, seguidos pela dissociação adicional em pH5,8 (apontado por uma seta) para avaliar as interações dependentes de pH. Os anticorpos testados neste experimento são: Ab001 (curva sólida preta), Ab002 (curva com traços curtos preta), Ab003 (curva pontilhada preta), Ab004 (curva com traços curtos cinza), Ab005 (curva sólida cinza), Ab006 (curva com traços longos cinza) e Ab007 (curva com traços longos preta).
[00272] [Fig. 8]
[00273] A Figura 8 ilustra a inibição da ativação proteolítica e espontânea de miostatina latente pelos anticorpos de miostatina antilatente dependente de pH, conforme descrito no Exemplo 11. A atividade da miostatina ativa liberada da miostatina latente pela protease BMP1 (proteolítica) ou através de incubação a 37 graus C sem BMP1 (espontâneo) foi medida na presença de anticorpos de miostatina antilatente, usando ensaio HEK Blue. Os anticorpos MS1032LO01-SG1, MS1032LO02-SG1, MS1032LO03-SG1 e MS1032LO04-SG1 são descritos respectivamente como MSLO-01, MSLO-02, MSLO-03 e MSLO-04 na Figura. A inibição comparável da ativação proteolítica e espontânea de miostatina latente ao MS1032LO00-SG1 foi alcançada por MS1032LO01-SG1, MS1032LO02-SG1, MS1032LO03-SG1 e MS1032LO04-SG1.
[00274] [Fig. 9]
[00275] As Figuras 9A-9F ilustram sensorgramas BIACORE (marca registrada) de anticorpo de miostatina antilatente dependente de pH, conforme descrito no Exemplo 12. Os parâmetros cinéticos de MST1032-SG1 (A), MS1032LO00-SG1 (B), MS1032LO01-SG1 (C), MS1032LO02-SG1 (D), MS1032LO03-SG1 (E) e MS1032LO04-SG1 (F) foram medidos em pH neutro e pH acídico.
[00276] [Fig. 10]
[00277] A Figura 10 ilustra a duração do tempo da concentração da miostatina no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina em camundongos, conforme descrito no Exemplo 13. Os efeitos da absorção celular mediada por R gama de Fc dos complexos de anticorpo/antígeno na depuração de miostatina in vivo foram avaliados ao se comparar anticorpos antimiostatina com a ligação R gama de Fc (MS1032LO00-SG1) e anticorpos antimiostatina com a ligação R gama de Fc abolida (MS1032LO00-F760).
[00278] [Fig. 11]
[00279] A Figura 11 ilustra a duração do tempo da concentração de miostatina no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina em camundongos, conforme descrito no Exemplo 14. Os efeitos da ligação do anticorpo antimiostatina dependente de pH na depuração de miostatina in vivo foram avaliados ao se comparar o anticorpo antimiostatina dependente de pH (MS1032LO01-SG1 ou MS1032LO01-F760) e anticorpo antimiostatina não dependente de pH (MS1032LO00-SG1 ou MS1032LO00-F760).
[00280] [Fig. 12]
[00281] A Figura 12 ilustra a atividade de ligação do anticorpo de miostatina antilatente MST1032 a miostatina latente e GDF11, conforme descrito no Exemplo 16.
[00282] [Fig. 13]
[00283] A Figura 13 ilustra a atividade inibidora do anticorpo de miostatina antilatente MST1032 contra a ativação proteolítica e espontânea de GDF11, conforme descrito no Exemplo 17. A atividade de GDF11 ativo liberada pela protease BMP1 (proteolítica) ou através de incubação a 37 graus C sem BMP1 (espontâneo) foi medida na presença de anticorpo de miostatina antilatente, usando ensaio HEK Blue.
[00284] [Fig. 14]
[00285] A Figura 14 ilustra a inibição da ativação proteolítica de miostatina latente através do anticorpo da miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 19. A atividade da miostatina ativa liberada da miostatina latente pela protease BMP1 protease foi medida na presença de anticorpo de miostatina antilatente, usando ensaio HEK Blue.
[00286] [Fig. 15]
[00287] A Figura 15 ilustra o tempo de duração da concentração de miostatina no plasma miostatina depois da administração intravenosa de anticorpos de miostatina antilatente em camundongos, conforme descrito no Exemplo 20. Os efeitos da dependência de pH na depuração da miostatina in vivo foram avaliados ao se comparar o anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) e anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH diferentes (MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 e MS1032LO25-SG1).
[00288] [Fig. 16]
[00289] As Figuras 16A e 16B ilustram o tempo de duração da concentração da miostatina no plasma depois da administração intravenosa de anticorpos de miostatina antilatente em macaco cinomolgo, conforme descrito no Exemplo 21. (A) O efeito da dependência do pH e da engenharia de Fc na depuração da miostatina in vivo foi avaliado ao se comparar anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) e anticorpos de miostatina antilatente dependente de pH com engenharia de Fc (MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06- SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06- SG1033, MS1032LO06-SG1034). (B) O efeito da engenharia de Fc na depuração de miostatina in vivo foi avaliado ao se comparar os anticorpos de miostatina antilatente (MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077).
[00290] [Fig. 17]
[00291] A Figura 17 ilustra a atividade inibidora na ativação de miostatina latente através de anticorpos de miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 22. As quantidades de miostatina madura liberada da miostatina latente pela protease BMP1 foram medidas na presença de anticorpos de miostatina antilatente (MST1032, MST1504, MST1538, MST1551, MST1558, MST1572 e MST1573).
[00292] [Fig. 18A]
[00293] A Figura 18A ilustra um diagrama esquemático de fragmentos de miostatina latente de 100 aminoácidos cada, designados para o mapeamento do epítopo de anticorpos de miostatina antilatente, conforme descrito no Exemplo 22.
[00294] [Fig. 18B]
[00295] A Figura 18B ilustra a análise de Western blot contra fragmentos de miostatina latente humana marcados com GST (GST- hMSTN) por um anticorpo anti-GST, conforme descrito no Exemplo 22. Cada linha indica: 1, GST-hMSTN 1-100aa; 2, GST-hMSTN 21-120aa; 3, GST-hMSTN 41-140aa; 4, GST-hMSTN 61-160aa; 5, GST-hMSTN 81-180aa; 6, GST-hMSTN 101-200aa; 7, GST-hMSTN 121-220aa; 8, GST-hMSTN 141-241aa; 9, controle GST.
[00296] [Fig. 18C]
[00297] A Figura 18C ilustra a análise de Western blot contra fragmentos de miostatina latente humana marcados com GST (GST- hMSTN) por anticorpos de miostatina antilatente (MST1032, MST1538, MST1572 e MST1573), conforme descrito no Exemplo 22. Cada linha indica: 1, GST-hMSTN 1-100aa; 2, GST-hMSTN 21-120aa; 3, GST- hMSTN 41-140aa; 4, GST-hMSTN 61-160aa; 5, GST-hMSTN 81-180aa; 6, GST-hMSTN 101-200aa; 7, GST-hMSTN 121-220aa; 8, GST-hMSTN 141-241aa; 9, GST controle; 10, miostatina latente humana (100ng).
[00298] [Fig. 18D]
[00299] A Figura 18D ilustra os resultados sumarizados da análise de Western blot e posições de epítopo deduzidas para os anticorpos de miostatina antilatente (MST1032, MST1538, MST1572 e MST1573), conforme descrito no Exemplo 22.
[00300] [Fig. 19]
[00301] A Figura 19 ilustra um alinhamento de sequências de aminoácido de RIIa gama de Fc1 de cinomolgo (cino), RIIa gama de Fc2, RIIa gama de Fc3, RIIb gama de Fc, RIIa gama de FcH humano, RIIa gama de FcR e RIIb gama de Fc. As regiões quadradas indicam resíduos putativos que interagem com o domínio Fc.
[00302] [Fig. 20]
[00303] A Figura 20 ilustra o tempo de duração da concentração total de miostatina no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com uma variante Fc melhorada com RIIb gama de Fc em todos os R gama de Fc de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 24. Os efeitos das variantes Fc melhoradas com RIIb gama de Fc na eliminação de antígeno através de RIIb gama de Fc humano foram avaliados.
[00304] [Fig. 21]
[00305] Figura 21 ilustra o tempo de duração da concentração de anticorpo no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com uma variante de Fc melhorado com RIIb gama de Fc em todos os R gama de Fc humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 24. Os efeitos de variantes de Fc melhorado com RIIb gama de Fc na farmacocinética do anticorpo foram avaliados.
[00306] [Fig. 22]
[00307] As Figuras 22A e 22B ilustram o tempo de duração da concentração da miostatina no plasma depois da administração intravenosa de anticorpos de miostatina antilatente em macaco cinomolgo, conforme descrito no Exemplo 25. (A) O efeito da dependência do pH e da engenharia de Fc na depuração de miostatina in vivo foi avaliado ao comparar o anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) e os anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH com engenharia de Fc (MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033, MS1032LO06-SG1034). (B) O efeito da engenharia de Fc na depuração de miostatina in vivo foi avaliado ao se comparar os anticorpos de miostatina antilatente (MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077).
[00308] [Fig. 23A]
[00309] A Figura 23A ilustra o tempo de duração da concentração total de miostatina no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com uma variante de Fc com pl aumentado em FcRn humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 26. Os efeitos de variantes de Fc com pl aumentado na eliminação de antígeno foram avaliados.
[00310] [Fig. 23B]
[00311] A Figura 23B ilustra o tempo de duração da concentração de anticorpo no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com uma variante de Fc com pl aumentado em FcRn humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 26. Os efeitos de variantes de Fc com pl aumentado na farmacocinética do anticorpo foram avaliados.
[00312] [Fig. 24A]
[00313] A Figura 24A ilustra o tempo de duração da concentração total de miostatina no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com uma variante de Fc com pl aumentado em FcRn humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 26. Os efeitos de variantes de Fc com pl aumentado na eliminação de antígeno foram avaliados. Neste ensaio, um excesso de imunoglobulina humana normal foi coadministrado com o anticorpo antimiostatina de modo a imitar a situação do plasma humano.
[00314] [Fig. 24B]
[00315] A Figura 24B ilustra o tempo de duração da concentração de anticorpo no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com uma variante de Fc com pl aumentado em FcRn humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 26. Os efeitos de variantes de Fc com pl aumentado na farmacocinética do anticorpo foram avaliados. Neste ensaio, um excesso de imunoglobulina humana normal foi coadministrado com o anticorpo antimiostatina de modo a imitar a situação do plasma humano.
[00316] [Fig. 25]
[00317] A Figura 25 ilustra o tempo de duração da concentração total de miostatina no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com um RIIb gama de variante de Fc melhorada com Fc em RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 27. Os efeitos de RIIb gama de variantes de Fc melhoradas com Fc na eliminação de antígeno através de RIIb gama de Fc humano foram avaliados.
[00318] [Fig. 26]
[00319] A Figura 26 ilustra o tempo de duração da concentração de anticorpo no plasma depois da administração intravenosa de um anticorpo antimiostatina com um RIIb gama de variante de Fc melhorada com Fc em RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos, conforme descrito no Exemplo 27. Os efeitos de RIIb gama de variantes de Fc melhoradas com Fc na farmacocinética do anticorpo foram avaliados.
[00320] [Fig. 27]
[00321] A Figura 27 ilustra os resultados da análise de imagens celulares dos anticorpos antimiostatina com um RIIb gama de variante de Fc melhorada com Fc, conforme descrito no Exemplo 29. Cada anticorpo foi complexado com miostatina marcada com fluorescência e absorção intracelular do composto antígeno-anticorpo nas células que expressam RIIb gama de Fc humano foi medida.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES
[00322] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados no presente documento são geralmente compreendidos e comumente empregados usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tal como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Anticorpos monoclonais: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. DEFINIÇÕES
[00323] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), e March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), proveem a um versado na técnica com um guia geral para muitos dos termos usados no presente pedido de patente. Todas as referências citadas no presente documento, incluindo pedidos de patente e publicações são incorporados a título de referência em sua totalidade.
[00324] Com a finalidade de interpretar este relatório descritivo, as definições que seguem se aplicarão e quando adequado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. Deve-se entender que a terminologia usada no presente documento é para a finalidade de descrever modalidades específicas apenas e não pretende ser limitante. No caso de que qualquer definição apresentada abaixo entrar em conflito com qualquer documento incorporado no presente documento a título de referência, a definição apresentada abaixo deve prevalecer.
[00325] Um "framework humano aceptador" para as finalidades do presente documento é um framework compreendendo a sequência de aminoácido de um framework de domínio variável de cadeia leve (VL) ou framework de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivado de um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano, conforme definido abaixo. Um framework humano aceptador "derivado a partir de" um framework de imunoglobulina humana ou a framework de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido da mesma, ou ele pode conter mudanças na sequência de aminoácido. Em algumas modalidades, o número de mudanças de aminoácido é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas modalidades, o framework humano aceptador de VL é idêntico em sequência ao framework de imunoglobulina humana de Vl ou sequência de framework de consenso humano.
[00326] "Afinidade" se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, conforme usada no presente documento, a "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação entre os membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. As modalidades ilustrativas e exemplificadoras específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.
[00327] Um anticorpo de "afinidade maturada" se refere a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), comparado a um anticorpo parental que não possui tais alterações, tais alterações que resultam em um melhoramento na afinidade do anticorpo por antígeno.
[00328] Os termos "anticorpo antimiostatina" e "um anticorpo que se liga à miostatina" se referem a um anticorpo que é capaz de ligar a miostatina com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente para diagnóstico e/ou agente terapêutico no direcionamento da miostatina. Em uma modalidade, a extensão de ligação de um anticorpo antimiostatina e uma proteína não-miostatina não relacionada é de menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo à miostatina conforme medido, por exemplo, através de um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga à miostatina tem uma constante de dissociação (Kd) de 1 microM ou menos, 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos, 0,1 nM ou menos, 0,01 nM ou menos, ou 0,001 nM ou menos (por exemplo, 108 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina se liga a um epítopo de miostatina que é conservado entre as miostatinas de diferentes espécies.
[00329] O termo "anticorpo" no presente documento é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo porém sem se limitar a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo à medida que eles exibem a atividade de ligação ao antígeno desejada.
[00330] Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmento de anticorpos incluem porém não se limitam a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir do fragmento de anticorpos.
[00331] Um "anticorpo que se liga ao mesmo epítopo" como um anticorpo referência se refere a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e/ou reciprocamente, o anticorpo referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição. Um ensaio de competição exemplificador é provido no presente documento.
[00332] O termo anticorpo "quimérico" se refere a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[00333] A "classe" de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco principais classes de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas ainda podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente.
[00334] O termo "agente citotóxico" conforme usado no presente documento se refere a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou causa morte ou destruição celular. Os agentes citotóxicos incluem, porém não se limitam a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes ou fármacos quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposideo), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes de intercalação); agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos dos mesmos tais como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de plantas ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos; e os vários agentes antitumorais ou agentes anticâncer revelados abaixo.
[00335] As "funções efetoras" se referem àquelas atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente complementar (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; infrarregulação dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor da célula B); e ativação da célula B.
[00336] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[00337] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante capaz de ser ligado por um anticorpo. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo que direciona aquele antígeno e inclui aminoácidos específicos que contatam diretamente o anticorpo. Os determinantes do epítopo podem incluir grupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou sulfonila, e podem ter três características estruturais dimensionais específicas, e/ou características de carga específica. Em geral, os anticorpos específicos para um antígeno alvo específico serão preferencialmente reconhecem um epítopo no antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.
[00338] O "receptor de Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcR é um FcR nativo humano. Em algumas modalidades, um FcR é um que liga um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses de R gama de FcI, R gama de FcII e R gama de FcIII, incluindo variantes alélicas e alternadamente formas divididas daqueles receptores. Os receptores R gama de FcII incluem RIIa gama de Fc (um "receptor de ativação") e RIIb gama de Fc (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácido similares que diferem primariamente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. A RIIa gama de Fc receptor de ativação contém um motivo de ativação baseado na tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático. RIIb gama de Fc receptor de inibição contém um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptora (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (Veja, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997).) FcRs are reviewed, por exemplo, in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Other FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, estão abrangidos pelo termo "FcR" no presente documento.
[00339] O termo "receptor Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e regulação da homeostase das imunoglobulinas. Conhecem-se os métodos de medição da ligação ao FcRn (veja, por exemplo, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15(7):637- 640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.). A ligação ao FcRn humano in vivo e a meia- vida do soro de FcRn humano de alta afinidade que liga os polipeptídeos pode ser ensaiada, por exemplo, em camundongos transgênicos or linhagens celulares humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas aos quais os polipeptídeos com a região Fc variante são administrados. A publicação internacional WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída aos FcRs. Veja também, por exemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
[00340] O termo "região Fc" no presente documento é usado para definir uma região c-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fcs de sequência nativa e variantes da região Fc. Em uma modalidade, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, ao terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que seja especificado de outra forma no presente documento, a numeração dos resíduos de aminoácido na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[00341] O termo "anticorpo compreendendo a região Fc" se refere a um anticorpo que compreende uma Região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o Sistema de Numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica o anticorpo. Consequentemente, a composição compreendendo um anticorpo tendo uma região Fc de acordo com esta invenção pode compreender um anticorpo com K447, com todo o K447 removido, ou uma mistura dos anticorpos com e sem o resíduo K447.
[00342] "Framework" ou "FR" se refere a resíduos de domínio variável diferente de resíduos de região hipervariável (HVR). O FR de um domínio variável geralmente consiste de quarto domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmemente aparecem na sequência que segue em VH (ou VL): FR1- H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[00343] Os termos "anticorpo de comprimento total" , "anticorpo intacto" e "anticorpo total" são usados no presente documento de forma intercambiável para se referir a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definida no presente documento.
[00344] Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. As "funções efetoras" exemplificadoras incluem ligação a C1q; CDC; ligação ao receptor Fc; ADCC; fagocitose; infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor da célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um anticorpo domínio variável) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conforme revelado, por exemplo, em definições no presente documento.
[00345] Os termos "célula hospedeira","linhagem da célula hospedeira" e "cultura da célula hospedeira" são usados de forma intercambiável e se referem a células nas quais o ácido nucleico foi introduzido, incluindo a progenia de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas" as quais incluem a célula primária transformada e progenia derivadas destas sem relação ao número de passagens. A progenia pode não ser completamente idêntica no teor de ácido nucleico em uma célula parental, porém pode conter mutações. A progenia mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada estão incluídas no presente documento.
[00346] Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácido que corresponde àquele de um anticorpo produzido por um humano ou uma célula humana ou derivedo de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências que codificam anticorpo humano. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano.
[00347] Um "framework de consenso humano" é um framework que representa os resíduos de aminoácido que ocorrem mais comumente em uma seleção de sequências de framework de VL ou VH de imunoglobulina humana. Em geral, a seleção sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo conforme em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Em uma modalidade, para o VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I conforme em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para o VH, o subgrupo é o subgrupo III conforme em Kabat et al., supra.
[00348] Um anticorpo "humanizado" se refere a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácido a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácido a partir de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todas das HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àqueles de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas das FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que sofreu humanização.
[00349] O termo "região hipervariável" ou "HVR" conforme usado no presente documento se refere a cada uma das regiões de um anticorpo de domínio variável que são hipervariáveis em sequência ("regiões determinantes de complementariedade" ou "CDRs") e/ou forma formam laços estruturalmente definidos ("laços hipervariáveis") e/ou contêm os resíduos que contactam o antígeno ("contatos do antígeno"). Em geral, os anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplificadoras no presente documento incluem: (a) laços hipervariáveis que ocorrem em resíduos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem em resíduos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos de antígeno que ocorrem em resíduos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b), e/ou (c), incluindo resíduos HVR de aminoácido 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).
[00350] A menos que indicado de outra forma, os resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente documento de acordo com Kabat et al., supra.
[00351] Um "imunoconjugado" é um anticorpo conjugado em uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo porém sem se limitar a um agente citotóxico.
[00352] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero. Os mamíferos incluem, porém não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vaca, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[00353] Um anticorpo "isolado" é um que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado a mais do que 95% ou 99% de pureza, conforme determinado através de, por exemplo, eletroforética (por exemplo, SDS- PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfica (por exemplo, HPLC de fase reversa ou troca iônica). Para a revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, veja, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[00354] Um ácido nucleico "isolado" se refere a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que ordinariamente contêm a molécula de ácido nucleico, porém a molécula de ácido nucleico está presente extracromosomicamente ou em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.
[00355] "Ácido nucleico isolado codificando um anticorpo antimiostatina" se refere a um ou mais molécula de ácido nucleicos codificando cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou fragmentos dos mesmos), incluindo tais moléculas de ácido nucleico(s) em um vetor único ou vetores separados, e tais moléculas de ácido nucleico(s) presente em uma ou mais localizações em uma célula hospedeira.
[00356] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações que ocorrem naturalmente ou aparecendo durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes em geral estando presentes em quantidades menores. Em contraste a preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal está direcionado contra um determinante único em um antígeno. Sendo assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo conforme sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretada como produção necessária do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo porém sem se limitar ao método de hibridoma, métodos do DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todo ou parte da localização da imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplificadores para produzir anticorpos monoclonais sendo descritos no presente documento.
[00357] Um "anticorpo puro" se refere a um anticorpo que não é conjugado a uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção citotóxica) ou radiomarcador. O anticorpo puro pode estar presente em uma formulação farmacêutica.
[00358] "Anticorpos nativos" se referem a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos de IgG nativa são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150,000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. A partir do terminal N ao C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada um domínio pesado variável ou um domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínio constantes (CH1, CH2 e CH3). Similarmente, a partir do terminal N ao C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada um domínio leve variável ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kappa (kappa) e lambda (lambda), com base na sequência de aminoácido de seu domínio constante.
[00359] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. A região Fcs humana de sequência nativa inclui uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alótipos A e não A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa assim como variantes que ocorrem naturalmente das mesmas.
[00360] O termo "bula" é usado para se referir a instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm a informação sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos sobre o uso de tais produtos terapêuticos.
[00361] "Percentual (%) da identidade da sequência de aminoácido" com relação a uma sequência de polipeptídeo referência é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidato que são idênticos com os resíduos de aminoácido na sequência de polipeptídeo referência, depois de alingar as sequências e as lacunas de introdução, caso necessário, para alcançar a identidade da sequência percentual máxima, e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para finalidades de determiningação da sequência de aminoácido percentual pode ser alcançado de várias formas que são conhecidas na técnica, por exemplo, usando software de computador publicamente disponível tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR) software. Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para a finalidade no presente documento, no entanto, os valores de % da identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador de comparação sequencial ALIGN-2. O programa de computador de comparação sequencial ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc., e o código fonte foi preenchido com a documentação do usuário no US Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob o US Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível a partir da Genentech, Inc., South San Francisco, California, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação sequencial são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[00362] Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações da sequência de aminoácido, o % da sequência de aminoácidoidentity de uma dada sequência de aminoácido A a, com, ou contra uma dada sequência de aminoácido B (a qual pode ser alternadamente ser nomeada como uma dada sequência de aminoácido A que tem ou compreende um certo % da identidade da sequência de aminoácido a, com, ou contra uma dada sequência de aminoácido B) é calculada como segue: 100 vezes a fração X/Y; onde X é o número de resíduos de aminoácido classificados como pares idênticos pelo programa de alinhamento sequencial ALIGN-2 naquele alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será notado que onde o comprimento da sequência de aminoácido A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácido B, o % da identidade da sequência de aminoácido de A para B não será igual ao % da identidade da sequência de aminoácido de B para A. A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % da identidade da sequência de aminoácido usados no presente documento são obtidos conforme descritos no parágrafo imediatamente precedente usando o programa de computador ALIGN-2.
[00363] O termo "formulação farmacêutica" se refere a uma preparação a qual está em tal forma de modo a permitir a atividade biológica de um ingrediente ativo contido no presente documento para ser eficaz e o qual não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qua a formulação será administrada.
[00364] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, o qual é não tóxico a um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, porém não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[00365] O termo "miostatina", conforme usado no presente documento, pode se referir a qualquer miostatina nativa a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). A menos que indicado de outra forma, o termo "miostatina " se refere a uma proteína miostatina humana tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 e contendo o domínio de propeptídeo terminal de miostatina humana conforme mostrada na SEQ ID NO: 75 ou 78. O termo abrange miostatina não processada de "comprimento total" assim como qualquer forma de miostatina que resulta do processamento na célula. O termo também abrange variantes que ocorrem naturalmente de miostatina, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. A sequência de aminoácido de uma miostatina humana exemplificadora (promiostatina) é mostrada na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácido de um domínio do fator de crescimento C-terminal exemplificador de miostatina humana é mostrada na SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácido de um domínio de propeptídeo N-terminal exemplificadora de miostatina humana é mostrada na SEQ ID NO: 75 ou 78. A miostatina madura ativa é um homodímero ligado ao dissulfeto consistindo em dois C-terminais do domínio do fator de crescimento. A miostatina latente inativa é um complexo associado de forma não covalente de dois propeptídeos e a miostatina madura. Conforme revelado no presente documento, os anticorpos da invenção ligam miostatina inativa latente, porém não ligam o homodímero de miostatina ativa madura. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção ligam um epítopo dentro de um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO:78), porém não ligam o homodímero da miostatina ativa madura. A sequência de aminoácido de um macaco cinomolgo e a miostatina de murino (promiostatina) são mostradas na SEQ ID NO: 3 e 5, respectivamente. A sequência de aminoácido de um domínio do fator de crescimento C-terminal exemplificador de macaco cinomolgo e miostatina de murino são mostradas na SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente. A sequência de aminoácido de um domínio de propeptídeo N-terminal exemplificador N-terminal de macaco cinomolgo e miostatina de murino são mostradas na SEQ ID NO: 76 ou 79, e 77 ou 80, respectivamente. GDF-11 (BMP-11) é uma molécula aproximadamente relacionada à miostatina, ambas as quais são membros da superfamília TGF-beta. Similarmente à miostatina, GDF11 é sintetizado como um polipeptídeo precursor primeiro e depois clivado em um prodomínio N-terminal e GDF11 maduro C-terminal. A sequência de aminoácido de GDF11 humano (precursor) é mostrada na SEQ ID NO: 81. A sequência de aminoácido de GDF11 humano maduro C- terminal é mostrada na SEQ ID NO: 82. A sequência de aminoácido de um prodomínio N-terminal de GDF11 humano é mostrada na SEQ ID NO: 83 ou 84. As sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 78, 79, 80, 81 e 84 incluem uma sequêcia de sinal. Os aminoácidos 1- 24 deles correspondem a ela e eles são removidos durante o processamento na célula.
[00366] Conforme usado no presente documento, "tratamento" (e as variações gramaticais dos mesmos como "tratar" ou "tratando") se referem à intervenção clínica em uma tentativa para alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser realizado seja para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, porém não se limitam a, prevenir ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenir a metástase, diminuir a taxa da progressão da doença, melhora ou paliação do estado de doença e a remissão ou prognose melhorada. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para mostrar a progressão de uma doença.
[00367] O termo "região variável" ou "domínio variável" se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo em geral têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de framework conservadas (FRs) e as três regiões hipervariáveis (HVRs). (Veja, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Um domínio VH ou VL único pode ser suficiente para conferir a especificidade da ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que ligam um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que liga o antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
[00368] Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácido que difere a partir daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido (alteração), preferivelmente uma ou mais substituição (ões) de aminoácido. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fc de sequência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácido, e preferivelmente de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante no presente documento possuirá preferivelmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta.
[00369] O termo "vetor," conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual ele está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual ela foi introduzida. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles são operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como "vetores de expressão".
II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS
[00370] Em um aspecto, a invenção está baseada, em parte, em anticorpos antimiostatina e usos dos mesmos. Em certas modalidades, os anticorpos que se ligam à miostatina são providos. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de uma doença.
[00371] Em um outro aspecto, a invenção está baseada, em parte, em polipeptídeos compreendendo variantes da região Fc e usos dos mesmos. Em uma modalidade, os polipeptídeos compreendendo variantes da região Fc com RIIb gama de atividade de ligação a Fc melhorada são providos. Em uma outra modalidade, os polipeptídeos compreendendo variantes da região Fc com pI aumentado são providos. Em modalidades específicas, os polipeptídeos da invenção são anticorpos. Os polipeptídeos compreendendo a região Fc variante da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de doenças.
A. Anticorpos antimiostatina e Polipeptídeos compreendendo variantes da região Fc exemplificadores
[00372] Em um aspecto, a invenção provê anticorpos isolados que se ligam à miostatina. Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção se liga à miostatina latente. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina da presente invenção se liga ao propeptídeo de miostatina (humano: SEQ ID NO: 75 ou 78; macaco cinomolgo: SEQ ID NO: 76 ou 79; camundongo: SEQ ID NO: 77 ou 80). Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga a um epítopo dentro de um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78). O propeptídeo está contido na miostatina latente como um dos componentes, conforme descrito acima. Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção inibe a ativação da miostatina. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina bloqueia a liberação de miostatina madura a partir da miostatina latente. Relatou-se que a miostatina madura é liberada através de processos proteolíticos e não proteolíticos a partir da miostatina latente. O anticorpo antimiostatina da presente invenção pode bloquear a liberação proteolítica e/ou liberação não proteolítica da miostatina madura a partir da miostatina latente. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina bloqueia a clivagem proteolítica da miostatina latente. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina bloqueia o acesso de uma protease à miostatina latente (especialmente, ao sítio da clivagem proteolítica (Arg98-Asp99) da miostatina latente). Em modalidades adicionais, a protease pode ser uma metalloprotease da família BMP1/TLD tal como BMP1, TED, proteína 1 do tipo toloide (TLL-1) ou proteína 2 do tipo toloide (TLL-2). Em uma outra modalidade, o anticorpo antimiostatina bloqueia a liberação não proteolítica da miostatina madura a partir da miostatina latente. A liberação não proteolítica conforme usada no presente documento significa uma liberação espontânea da miostatina madura a partir da miostatina latente, a qual não está acompanhada pela clivagem proteolítica da miostatina latente. A liberação não proteolítica inclui, por exemplo, uma liberação de miostatina madura ao incubar a miostatina latente por exemplo, em 37 graus C na ausência de uma protease que cliva a miostatina latente. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina da presente invenção não se liga à miostatina madura. Em algumas modalidades, o anticorpo antimiostatina se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 2a. Em algumas modalidades, o anticorpo antimiostatina compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo descrito na Tabela 2a. Em modalidades adicionais, um anticorpo antimiostatina compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito na Tabela 2a. Em algumas modalidades, o anticorpo antimiostatina competes por ligação a um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78) com um anticorpo descrito na Tabela 2a. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 11a ou 13. Em algumas modalidades, o anticorpo antimiostatina compete por ligação da miostatina latente com um anticorpo descrito na Tabela 11a ou 13. Em algumas modalidades, o anticorpo antimiostatina compete por ligação a um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78) com um anticorpo descrito na Tabela 11a ou 13.
[00373] Em algumas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção se liga à miostatina latente e inibe a ativação da miostatina. Em modalidades adicionais, o anticorpo: (a) bloqueia a liberação da miostatina madura a partir da miostatina latente; (b) bloqueia a liberação proteolítica da miostatina madura; (c) bloqueia a liberação espontânea da miostatina madura; or (d) não se liga à miostatina madura; ou se liga a um epítopo dentro de um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78). Em modalidades adicionais, o anticorpo compete por ligação da miostatina latente, ou liga o mesmo epítopo como, um anticorpo compreendendo um par VH e VL descrito nas Tabelas 2a, 11a ou 13. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga à miostatina latente com maior afinidade em pH neutro (por exemplo, pH7,4) do que em pH acídico (por exemplo, pH5,8). Em modalidades adicionais, o anticorpo é (a) um anticorpo monoclonal, (b) um anticorpo humano, humanizado ou quimérico; (c) um anticorpo de IgG de comprimento total ou (d) um fragmento de anticorpo que se liga à miostatina latente ou propeptídeo de miostatina.
[00374] Em uma outra modalidade, um anticorpo antimiostatina da presente invenção não se liga a GDF11. Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção não inibe a ativação de GDF11. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina não bloqueia a liberação de GDF11 madura a partir de GDF11 latente. O anticorpo antimiostatina da presente invenção não bloqueia seja a liberação proteolítica ou liberação não proteolítica de GDF11 madura a partir de GDF11 latente. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina não bloqueia a clivagem proteolítica de GDF11 latente. Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina não bloqueia o acesso de uma protease ao GDF11 latente (especialmente, ao sítio de clivagem proteolítica de GDF11 latente). Em modalidades adicionais, a protease pode ser uma metalloprotease da família BMP1/TLD tal como BMP1, TED, proteína 1 do tipo toloide (TLL-1) ou proteína 2 do tipo toloide (TLL-2). A liberação não proteolítica conforme usada no presente documento significa a liberação espontânea de GDF11 madura a partir de GDF11 latente, que não é acompanhada pela clivagem proteolítica de GDF11 latente. A liberação não proteolítica inclui, por exemplo, uma liberação de GDF11 madura ao incubar GDF11 latente por exemplo, em 37 graus C na ausência de uma protease que cliva o GDF11 latente. A maioria dos anticorpos antimiostatina conhecidos até hoje não eram específicos para miostatina. Estes anticorpos têm alta afinidade por outros membros da superfamília TGF-beta, tal como GDF11 e neutralizam as atividades biológicas deles. GDF11 tem um papel importante durante a embriogênese e é responsável pela transformação homeótica do esqueleto axial. Os camundongos knockout com GDF11 homozigótico são camundongos letais, perinatais com uma cópia do tipo selvagem do gene GDF11 são viáveis, porém têm defeitos esqueletais. Uma vez que GDF11 tem um papel importante durante a embriogênese, um antagonista que inibe o seu GDF11 coloca riscos teóricos de segurança que poderiam apresentar tanto toxicidade em pacientes tratados quanto toxicidade reprodutiva em, por exemplo, mulheres com potencial reprodutivo. Sendo assim, há uma necessidade por uma inibição específica da atividade da miostatina em tratamentos de distúrbios associados com a miostatina, particularmente em mulheres com potencial reprodutivo.
[00375] Em um outro aspecto, a invenção provê anticorpos antimiostatina que exibe características de ligação dependente de pH. Conforme usada no presente documento, a expressão "ligação dependente de pH" significa que o anticorpo exibe "ligação reduzida à miostatina em pH acídico conforme comparado a sua ligação em pH neutro" (para finalidade da presente revelação, ambas as expressões podem ser usadas de forma intercambiável). Por exemplo, os anticorpos "com características de ligação dependente de pH" incluem anticorpos que se ligam à miostatina com maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção se ligam à miostatina com pelo menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou mais vezes com maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam à miostatina (por exemplo, miostatina latente ou miostatina de propeptídeo) com maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8. Em modalidades adicionais, os anticorpos se ligam à miostatina com pelo menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou mais vezes com maior afinidade em pH7,4 do que em pH5,8.
[00376] Quando um antígeno é uma proteína solúvel, a ligação de um anticorpo ao antígeno pode resultar em uma meia-vida estendida do antígeno no plasma (isto é, depuração reduzida do antígeno a partir do plasma), já que o anticorpo pode ter uma meia-vida mais longa no plasma do que para o próprio antígeno e pode servir como um veículo para o antígeno. Isto é devido à reciclagem do complexo de antígeno- anticorpo pela FcRn através da via endossômica na célula (Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9): 715-725 (2007)). No entanto, espera-se que um anticorpo com características de ligação dependente de pH, que se ligam a seu antígeno em ambiente extracelular neutro enquanto libera o antígeno em compartimentos endossômicos acídicos seguindo a sua entrada nas células, tenha propriedades superiores em termos de neutralização de antígeno e depuração relativa a sua contraparte que se liga de uma forma independente de pH (Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825).
[00377] A "afinidade" de um anticorpo por miostatina, para finalidades da presente revelação, está expressada em termos do KD do anticorpo. O KD de um anticorpo se refere a constante de dissociação do equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno. Maior o valor de KD é para uma ligação de anticorpo a seu antígeno, mais fraca é sua afinidade de ligação para aquele antígeno específico. Consequentemente, conforme usada no presente documento, a expressão "maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico" (ou a expressão equivalente "ligação dependente de pH") significa que o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH acídico é maior do que o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH neutro. Por exemplo, no contexto da presente invenção, considera-se que um anticorpo se liga à miostatina com maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico caso o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH acídico seja pelo menos 2 vezes maior do que o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH neutro. Sendo assim, a presente invenção inclui anticorpos que se ligam à miostatina em pH acídico com um KD que é pelo menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou mais vezes maior do que o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH neutro. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH neutro pode ser 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH acídico pode ser 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, ou maior.
[00378] Em modalidades adicionais, considera-se que um anticorpo se liga à miostatina (por exemplo, miostatina latente ou miostatina de propeptídeo) com uma maior afinidade em pH neutro do que em pH acídico caso o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH5,8 é pelo menos 2 vezes maior do que o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH7,4. Em algumas modalidades, os anticorpos providos se ligam à miostatina em pH5,8 com um KD que é pelo menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ou mais vezes maior do que o KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH7,4. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH7,4 pode ser 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 1012 M, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH5,8 pode ser 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, ou maior.
[00379] As propriedades de ligação de um anticorpo por um antígeno específico também podem ser expressadas em termos do kd do anticorpo. O kd de um anticorpo se refere à constante da taxa de dissociação do anticorpo com relação a um antígeno específico e é expressado em termos de segundos recíprocos (isto é, sec-1). Um aumento no valor de kd significa ligação mais fraca de um anticorpo ao seu antígeno. A presente invenção deste modo inclui anticorpos que se ligam à miostatina com um valor de kd maior em pH acídico do que em pH neutro. A presente invenção inclui anticorpos que se ligam à miostatina em pH acídico com um kd que é pelo menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou mais vezes maior do que o kd da ligação do anticorpo à miostatina em pH neutro. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH neutro pode ser 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH acídico pode ser 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s, ou maior. A invenção também inclui anticorpos que se ligam à miostatina (por exemplo, miostatina latente ou miostatina de propeptídeo) com um valor de kd maior em pH5,8 do que em pH7,4. A invenção inclui anticorpos que se ligam à miostatina em pH5,8 com um kd que é pelo menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou mais vezes maior do que o kd da ligação do anticorpo à miostatina em pH7,4. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH7,4 pode ser 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH5,8 pode ser 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s, ou maior.
[00380] Em certos exemplos, uma "ligação reduzida à miostatina em pH acídico conforme comparado a sua ligação em pH neutro" é expressada em termos de uma razão do valor de KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH acídico ao valor de KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH neutro (ou vice-versa). Por exemplo, um anticorpo pode ser referido como exibindo "ligação reduzida à miostatina em pH acídico conforme comparado a sua ligação em pH neutro", para finalidades da presente invenção, caso o anticorpo exiba uma razão de KD acídico/neutro de 2 ou maior. Em certas modalidades, a razão de KD de pH5,8/pH7,4 para um anticorpo antimiostatina da presente invenção é 2 ou maior. Em certas modalidades exemplificadoras, a razão de KD acícico/neutro para um anticorpo da presente invenção pode ser 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH neutro pode ser 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH acídico pode ser 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, ou maior. Em exemplos adicionais, um anticorpo pode ser referido como exibindo "ligação reduzida à miostatina (por exemplo, miostatina latente) em pH acídico conforme comparado a sua ligação em pH neutro", caso o anticorpo exiba uma razão de KD pH5,8/pH7,4 2 ou maior. Em certas modalidades exemplificadoras, a razão KD de pH5,8/pH7,4 para o anticorpo pode ser 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH7,4 pode ser 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 1010 M, 10-11 M, 10-12 M, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH5,8 pode ser 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, ou maior.
[00381] Em certos exemplos, a "ligação reduzida à miostatina em pH acídico confome comparado a sua ligação em pH neutro" é expressada em termos da razão do valor de KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH acídico to o valor de KD da ligação do anticorpo à miostatina em pH neutro (ou vice-versa). Por exemplo, um anticorpo pode ser referido como exibindo "ligação reduzida à miostatina em pH acídico conforme comparado a sua ligação em pH neutro", para finalidades da presente invenção, caso o anticorpo exiba uma razão de kd acídico/neutro de 2 ou maior. Em certas modalidades exemplificadoras, a razão de kd pH5,8/pH7,4 para um anticorpo da presente invenção é 2 ou maior. Em certas modalidades exemplificadoras, a razão de kd acídico/neutro para um anticorpo da presente invenção pode ser 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH neutro pode ser 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH acídico pode ser 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s, ou maior. Em certas modalidades exemplificadoras, a razão de kd pH5,8/pH7,4 para um anticorpo da presente invenção pode ser 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH7,4 pode ser 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s, ou menos. Em uma outra modalidade, o valor de KD do anticorpo em pH5,8 pode ser 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s, ou maior.
[00382] Conforme usada no presente documento, a expressão "pH acídico" significa um pH de 4,0 a 6,5. A expressão "pH acídico" inclui valores de pH de qualquer um de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 e 6,5, Em aspectos específicos, o "pH acídico" é 5,8.
[00383] Conforme usada no presente documento, a expressão "pH neutro" significa um pH de 6,7 a cerca de 10,0. A expressão "pH neutro" inclui valores de pH de qualquer um de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 e 10,0. Em aspectos específicos, o "pH neutro" é 7,4.
[00384] Valores KD, e valores kd, conforme expressados no presente documento, podem ser determinados usando um biossensor com base em ressonância plasmônica de superfície para caracterizar interações anticorpo-antígeno. (Veja, por exemplo, Exemplo 7, no presente documento.) Valores KD e valores kd podem ser determinados a 25 graus C ou 37 graus C.
[00385] Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção se liga à miostatina de mais de uma espécie. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina de um animal humano e não humano. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina a partir de humano, camundongo e macaco (por exemplo, cinomolgo, macaco reso, sagui, chimpanzé ou babuíno).
[00386] Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção se liga à miostatina latente de mais de uma espécie. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina latente a partir de um animal humano e não humano. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina latente a partir de humano, camundongo e macaco.
[00387] Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção se liga à miostatina de propeptídeo de mais de uma espécie. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina de propeptídeo a partir de um animal humano e não humano. Em modalidades adicionais, o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina de propeptídeo a partir de humano, camundongo e macaco.
[00388] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo antimiostatina que forma um complexo imune (isto é complexo de antígeno-anticorpo) com miostatina. Em certas modalidades, dois ou mais anticorpos antimiostatina se ligam a duas ou mais moléculas de miostatina para formar um complexo imune. Isto é possível porque a miostatina existe como um homodímero contendo duas moléculas de miostatina enquanto um anticorpo tem dois sítios de ligação ao antígeno. O anticorpo antimiostatina pode se ligar ao mesmo epítopo em uma molécula de miostatina ou pode se ligar a diferentes epítopos em uma molécula de miostatina, muito como um anticorpo biespecífico. Em geral, quando dois ou mais anticorpos formam um complexo imune com dois ou mais antígenos, o complexo imune resultante pode se ligar fortemente aos receptores Fc que existem em superfícies celulares devido a efeitos de avidez através das regiões Fcs dos anticorpos no complexo e pode então ser tomado na célula com alta eficiência. Sendo assim, o anticorpo antimiostatina mencionado acima capaz de formar um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos antimiostatina e duas ou mais moléculas de miostatina podem levar a uma rápida depuração de miostatina a partir de plasma em um corpo vivo, através da forte ligação aos receptores Fc devido a seus efeitos de avidez.
[00389] Além disso, acredita-se que um anticorpo com características de ligação dependente de pH tem propriedades superiores em termos de neutralização de antígeno e depuração relativa a sua contraparte que se liga de uma forma independente de pH (Igawa et al., Nature Biotech. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al. mAbs 5(6):851-859 (2013); WO 2009/125825). Deste modo, espera-se que um anticorpo tendo ambas as propriedades acima, isto é, um anticorpo que tem características de ligação dependente de pH e que forma um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos com dois ou mais antígenos, tenha propriedades ainda mais superiores para eliminação altamente acelerada de antígenos a partir de plasma (WO 2013/081143).
[00390] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114-115, 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69, 122-124, 129; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125, 130; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131.
[00391] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00392] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs) selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs:114-115; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-124; (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 125; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00393] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 122; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 123; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74.
[00394] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 127; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 129; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131.
[00395] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114-115, 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a HVR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114-115, 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128.
[00396] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60; e (c) uma HVR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60; e (c) uma HVR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64.
[00397] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114-115; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121 e HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) a HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114-115; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121.
[00398] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63 e HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63, HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63.
[00399] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 127; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 127. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 127; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128.
[00400] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69,122-124, 129; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125, 130; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6569,122-124, 129; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125, 130; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131.
[00401] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72; e (c) uma HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00402] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-124; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 125; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-124; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 125; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00403] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 122; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 122; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 123; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 123; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74.
[00404] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 129; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 129; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO 131.
[00405] Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114,115,126 (ii) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127 e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69, 122-124, 129, (ii) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125, 130 e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131.
[00406] Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69, (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, e (c) uma HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00407] Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114-115, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120, e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-124, (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 125, e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00408] Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 122, (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71, e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 123, (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71, e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74.
[00409] Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 126, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 127, e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 129, (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130, e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131.
[00410] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114-115, 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69, 122-124, 129; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125, 130; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131.
[00411] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114-115; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69, 122-124; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00412] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114-115; (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 121; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-124; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 125; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00413] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 122; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 123; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74.
[00414] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 126; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 127; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 128; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 129; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131.
[00415] Em certas modalidades, qualquer um ou mais aminoácidos de um anticorpo antimiostatina conforme provido acima são substituídos nas posições de HVR que seguem: (a) na HVR-H1 (SEQ ID NO: 55), nas posições 1 e 2; (b) na HVR-H2 (SEQ ID NO: 58), nas posições 4, 7, 8, 10, 11, 12 e 16; (c) na HVR-H3 (SEQ ID NO: 61), nas posições 5, 7 e 11; (d) na HVR-L1 (SEQ ID NO: 65), nas posições 1, 2, 5, 7, 8 e 9; (e) na HVR-L2 (SEQ ID NO:70), nas posições 3 e 7; e (f) na HVR-L3 (SEQ ID NO:73), na posição 8.
[00416] Em certas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido de um anticorpo antimiostatina são substituições conservadoras, conforme provido no presente documento. Em certas modalidades, qualquer uma ou mais das substituições que seguem podem ser produzidas em qualquer combinação: (a) na HVR-H1 (SEQ ID NO: 55), S1H; Y2T, D ou E; (b) na HVR-H2 (SEQ ID NO: 58), Y4H; S7K; T8M ou K; Y10K; A11M ou E; S12E; G16K; (c) na HVR-H3 (SEQ ID NO: 61), Y5H; T7H; L11K; (d) na HVR-L1 (SEQ ID NO: 65), Q1T; S2T; S5E; Y7F; D8H; N9D ou A ou E; (e) na HVR-L2 (SEQ ID NO: 70), S3E; S7Y, F ou W; e (f) na HVR-L3 (SEQ ID NO: 73), L8R.
[00417] Todas as possíveis combinações das substituições acima estão abrangidas pelas sequências consenso das SEQ ID NOs: 126, 127, 128, 129, 130 e 131 para HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, respectivamente.
[00418] Em qualquer uma das modalidades acima, um anticorpo antimiostatina pode ser humanizado. Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina compreende HVRs como em qualquer uma das modalidades acima, e ainda compreende um framework aceptador humano, por exemplo, um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano. Em uma outra modalidade, um anticorpo antimiostatina compreende HVRs como em qualquer uma das modalidades acima, e ainda compreende um VH ou VL compreendendo uma sequência FR. Em uma modalidade adicional, o anticorpo antimiostatina compreende as sequências FR de domínio variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve: para o domínio variável de cadeia pesada, a FR1 compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 132-134, FR2 compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 135-136, FR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 137, FR4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 138. Para o domínio variável de cadeia leve, FR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 139, FR2 compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-141, FR3 compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 142-143, FR4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 144.
[00419] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo antimiostatina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-162; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163-168; (c) uma HVR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175-180; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 181-186; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192.
[00420] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-162; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163-168; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192, e a HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163-168. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-162; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163-168; e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174.
[00421] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175-180; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 181-186; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192. Em uma modalidade, o anticorpo compreende (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175-180; (b) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 181-186; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192.
[00422] Em um outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-162, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163-168, e (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175-180, (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 181-186, e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192.
[00423] Em um outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 157-162; (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163-168; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 169-174; (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175-180; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 181-186; e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 187-192.
[00424] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência de domínio variável (VH) de cadeia pesada tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácidode qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% our 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30 e 32-34. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30 e 32-34, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, e (c) uma HVR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64.
[00425] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência de domínio variável (VH) de cadeia pesada tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, 114-115, 126, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, 116-120, 127, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64, 121, 128.
[00426] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácidode qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 1630, 32, 33 e 34. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32, 33 e 34. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32, 33, and 34, incluindo modificações pós- translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-57, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58-60, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-64.
[00427] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácidode qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114-115, 126, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-120, 127, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 121, 128.
[00428] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácidoda SEQ ID NO: 86. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado naSEQ ID NO: 86. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH in SEQ ID NO: 86, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63. Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácidoda SEQ ID NO: 92. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 92. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 92, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, e (c) a HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 63.
[00429] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende a VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99. Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99, incluindo modificações pós- translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69, 122-124, 129; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72, 125, 130; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74, 131.
[00430] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende a VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35, 36, 37 e 38. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35, 36, 37 e 38. Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35, 36, 37 e 38, incluindo modificações pós- translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65-69; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70-72; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73-74.
[00431] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende a VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99. Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs. Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-124, 129; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 125, 130; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 131.
[00432] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende a VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 96. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 96. Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs. Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 96, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 122; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74. Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende a VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 97. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 97. Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs. Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 97, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 123; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74.
[00433] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende uma VH conforme em qualquer uma das modalidades providas acima, e uma VL conforme em qualquer uma das modalidades providas acima. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 32-34 e 86-95 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 3538 e 96-99, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30, 3234 e 86-95 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31, 35-38 e 96-99, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências.
[00434] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende uma VH conforme em qualquer uma das modalidades providas acima, e uma VL conforme em qualquer uma das modalidades providas acima. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30 e 32-34 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31 e 35-38, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 16-30 e 32-34 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 31 e 35-38, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências.
[00435] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende uma VH conforme em qualquer uma das modalidades providas acima, e uma VL conforme em qualquer uma das modalidades providas acima. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-95 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 96-99, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende uma VH conforme em qualquer uma das modalidades providas acima, e uma VL conforme em qualquer uma das modalidades providas acima. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL na SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 96, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL na SEQ ID NO: 92 e SEQ ID NO: 97, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências.
[00436] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina compreende uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 145150. Em certas modalidades, uma sequência VH com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 145-150. Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VH em qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 145-150, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 157162, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58, 163-168, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61, 169-174.
[00437] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade da sequência à sequência de aminoácidode qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 151-156. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções relativas à sequência referência, porém um anticorpo antimiostatina compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar à miostatina. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 151-156. Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antimiostatina compreende a sequência VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 151-156, incluindo modificações pós-translacionais daquela sequência. Em uma modalidade específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 65, 175180; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70, 181-186; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 73, 187-192.
[00438] Em um outro aspecto, um anticorpo antimiostatina é provido, em que o anticorpo compreende uma VH conforme em qualquer uma das modalidades providas acima, e uma VL conforme em qualquer uma das modalidades providas acima. Em uma modalidade, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 145-150 e qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 151-156, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais daquelas sequências.
[00439] Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção compreende a VH conforme em qualquer uma das modalidades providas acima e uma região constante de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 193, 195-198, 227, 228, 229-381. Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da presente invenção compreende a VL conforme em qualquer uma das modalidades providas acima, e uma região constante de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8 e 10.
[00440] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo antimiostatina provido no presente documento. Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito na Tabela 2a. Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito nas Tabelas 11a ou 13. Em certas modalidades, um anticorpo que é provido se liga a um epítopo dentro de um fragmento de propeptídeo de miostatina consistindo em aminoácidos 21-100 da SEQ ID NO: 78. Alternadamente, o anticorpo liga um fragmento de propeptídeo de miostatina consistindo em aminoácidos 21-80, 41-100, 21-60, 41-80, 61100, 21-40, 41-60, 61-80 ou 81-100, da SEQ ID NO: 78.
[00441] Em um aspecto adicional da invenção, um anticorpo antimiostatina de acordo com qualquer uma das modalidades acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacorpo ou F(ab')2. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG de comprimento total, por exemplo, um anticorpo de IgG1 ou IgG4 intacto ou outra classe de anticorpo ou isotipo como definidos no presente documento.
[00442] Em um aspecto adicional, um anticorpo antimiostatina de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode incorporar qualquer uma das características, de forma única ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1-7 abaixo.
1. Afinidade do Anticorpo
[00443] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento tem uma constante de dissociação (Kd) de 1 microM ou menos, 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos, 0,1 nM ou menos, 0,01 nM ou menos ou 0,001 nM ou menos (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
[00444] Em uma modalidade, Kd é medido por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA). Em uma modalidade, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação da solução de Fabs por antígeno é medida ao se equilibrar Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado, depois capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (veja, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para se estabelecer condições para o ensaio, as placas multipoços MICROTITER (marca registrada) (Thermo Scientific) são revestidas de um dia para o outro com 5 microg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH9,6), e subsequentemente bloqueado com 2% (p/v) de albumina do soro bovino em PBS por duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23 graus C). Em uma placa não absorvente (Nunc #269620), antígeno [125I] 100 pM ou 26 pM é misturado com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é então incubado de um dia para o outro; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para assegurar que o equilíbrio seja alcançado. A seguir, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com polissorbato 20 0,1% (TWEEN-20 (marca registrada)) em PBS. Quando as placas foram secas, 150 microl/poço de (MICROSCINT-20 TM; Packard) cintilante são adicionados e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT TM (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que proporciona menos do que ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitivos.
[00445] De acordo com uma outra modalidade, Kd é medido usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE (marca registrada). Por exemplo, um ensaio usando um BIACORE (marca registrada) -2000 ou um BIACORE (marca registrada) -3000 (BIACORE (marca registrada), Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25 graus C com chips CM5 de antígeno imobilizado em ~10 unidades de resposta (RU). Em uma modalidade, os chips biossensores de dextrana carboximetilada (CM5, BIACORE (marca registrada), Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH4,8, para 5 microg/ml (~0,2 microM) antes da injeção em uma taxa de vazão de 5 microl/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Em seguida à injeção de antígeno, etanolamina 1 M é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para medições cinéticas, duas diluições em série em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo polissorbato 20 0,05% (TWEEN-20TM) (PBST) a 25 graus C em uma taxa de vazão de aproximadamente 25 microl/min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de ligação Langmuir um-a-um simples (BIACORE (marca registrada) Evaluation Software version 3.2) ao ajustar de forma simultânea os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação do equilíbrio (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Veja, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Se a taxa de associação "on-rate" excede 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância plamônica de superfície acima, depois a taxa de associação "on-rate" pode ser determinada usando uma técnica de temperagem fluorescente que mede o aumento e a diminuição na intensidade da emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passa banda) a 25 graus C de um anticorpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) em PBS, pH7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno em um espectrofotômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro 8000-series SLM-AMINCO TM (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.
2. Fragmento de anticorpos
[00446] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluem, porém não se limitam a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv e scFv e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, veja Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, veja, por exemplo, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); veja também, WO 1993/16185; e as Patentes Norte- Americanas Nos.5,571,894 e 5,587,458. Para a discussão dos fragmentos Fab e F(ab')2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor selvagem e tendo meia-vida in vivo aumentada, veja Patente Norte-Americana No.5,869,046.
[00447] Diacorpos são fragmento de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Veja, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[00448] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpos compreendendo todos ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todos ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; veja, por exemplo, Patente Norte-Americana No.6,248,516.
[00449] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, porém, sem se limitar à digestão proteolítica de um anticorpo intacto assim como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente documento.
3. Anticorpos quiméricos e humanizados
[00450] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana No.4,816,567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada a partir de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo de "classe trocada" no qual a classe ou subclasse foi mudada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.
[00451] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade em humanos, enquanto retém a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Em geral, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas a partir de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções das mesmas) are derived from sequências de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos com resíduos correspondentes a partir de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[00452] Anticorpos humanizados e métodos de produzir os mesmos são revisados, por exemplo, em Almagro, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), e também são descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:1002910033 (1989); Patentes Norte-Americanas Nos.5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 e 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante da especificidade (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (descrevendo "renovação"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (descrevendo "embaralhamento de FR"); e Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (descrevendo a abordagem da "seleção guiada" ao embaralhamento de FR).
[00453] As regiões de framework humano que podem ser usadas para humanização incluem porém não se limitam a: regiões framework selecionadas usando o método de "melhor ajuste" (veja, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões framework derivadas a partir da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (veja, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); e Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)); regiões framework maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões framework da linha germinativa humana (veja, por exemplo, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões framework derivadas de bibliotecas de rastreamento de FR (veja, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Anticorpos humanos
[00454] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-374 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
[00455] Os anticorpos humanos podem ser preparados através da administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais contêm tipicamente todas ou uma porção da localização da imunoglobulina humana, a qual substitui a localização da imunoglobulina endógena, ou que estão presentes de forma extracromossômica ou integradas aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, a localização da imunoglobulina endógena foi em geral inativada. Para a revisão de métodos para obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, veja Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Veja também, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos.6,075,181 e 6,150,584 descrevendo a tecnologia XENOMOUSETM; Patente Norte- Americana No.5,770,429 descrevendo a tecnologia HuMab (marca registrada); Patente Norte-Americana No.7,041,870 descrevendo a tecnologia K-M MOUSE (marca registrada) e a publicação do Pedido de Patente Norte-Americano No. US 2007/0061900, descrevendo a tecnologia VelociMouse (marca registrada)). As regiões variáveis humanas a partir de anticorpos intactos gerados por tais animais também podem ser modificados, por exemplo, através da combinação com uma região constante humana diferente.
[00456] Os anticorpos humanos também foram produzidos por métodos baseados em hibridoma. As linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Veja, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Anticorpo monoclonal Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991).) Os anticorpos humanos gerados através da tecnologia de hibridoma da célula B humana também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006). Os métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana No.7,189,826 (descrevendo a produção de anticorpos de IgM humana monoclonal a partir de linhagens celulares de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (descrevendo hibridomas humano- humano). A tecnologia do hibridoma humano (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) e Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191 (2005).
[00457] Os anticorpos humanos também podem ser gerados ao isolar as sequências de domínio variável do clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem ser então combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas para a seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpo estão descritas abaixo.
5. Anticorpos derivados de biblioteca
[00458] Os anticorpos da invenção podem ser isolados ao se rastrear as bibliotecas combinatórias por anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fagos e rastrear tais bibliotecas por anticorpos possuindo as características de ligação desejadas. Tais métodos são revistos, por exemplo, em Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2000); O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e descritos adicionalmente, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
[00459] Em certos métodos de exibição de fagos, os repertórios dos genes VH e VL são separadamente clonados através de reação em cadeia polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que foram então rastreados por fago de ligação ao antígeno, conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Os fagos tipicamente exibem fragmentos de anticorpos, sejam fragmentos de cadeia única Fv (scFv) ou como fragmentos Fab. As bibliotecas a partir de fontes imunizadas proveem anticorpos de alta afinidade ao imunógeno sem a necessidade de construir hibridomas. Alternadamente, o repertório puro pode ser clonado (por exemplo, a partir de humanos) para prover uma única fonte de anticorpos a uma ampla faixa de antígenos não próprios e também auto-antígenos sem qualquer imunização conforme descrita por Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Finalmente, as bibliotecas puras também podem ser produzidas sinteticamente ao se clonar os segmentos do gene V a partir de células tronco, e usar iniciadores de PCR contendo a sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para alcançar a redisposição in vitro, conforme descrito por Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992). As publicações de patente descrevendo as bibliotecas de fagos de anticorpo humano incluem, por exemplo: Patente Norte-Americana No.5,750,373, e Publicações Norte-Americanas Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.
[00460] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpo humano são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos no presente documento.
6. Anticorpos multiespecíficos
[00461] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação por pelo menos dois diferentes sítios. Em certas modalidades, uma das especificidades de ligação é para a miostatina e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois diferentes epítopos de miostatina. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam a miostatina. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos.
[00462] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, porém não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina tendo diferentes especificidades (veja, Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)), publicação internacional WO 1993/08829, e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e a engenharia "knob-in-hole" (veja, por exemplo, Patente Norte-Americana No.5,731,168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de engenharia para produzir moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpo (publicação internacional WO 2009/089004A1); reticular dois ou mais anticorpos ou fragmentos (veja, por exemplo, Patente Norte-Americana No.4,676,980, e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); usando zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (veja, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)); usando a tecnologia "diacorpo" para produzir framentos de anticorpo biespecífico (veja, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); e usar dímeros de cadeia única de Fv (sFv) (veja, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)); e preparar anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
[00463] Os anticorpos engenheirados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo "anticorpos de polvo" também são incluídos no presente documento (veja, por exemplo, publicação Norte-Americana 2006/0025576A1).
[00464] O anticorpo ou fragmento no presente documento também inclui um "FAb de ação dupla" ou "DAF" compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga à miostatina assim como um outro, diferente antígeno (veja, publicação Norte-Americana 2008/0069820, por exemplo).
7. Variantes de Anticorpo
[00465] Em certas modalidades, contemplam-se as variantes da sequência de aminoácido dos anticorpos providos no presente documento. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácido de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações adequadas na sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo, ou através da síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções a partir de, e/ou inserções nos e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser produzida para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.
a. Variantes de Substituição, Inserção e Deleção
[00466] Em certas modalidades, são providas variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições de aminoácido. Os sítios de interesse para a mutagênese substitucional incluem as HVRs e FRs. Substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1 sob o cabeçalho de "substituições preferidas". As mudanças mais substanciais são providas na Tabela 1 sob o cabeçalho de "substituições exemplificadoras" e conforme adicionalmente descrito abaixo em referência a classes de cadeia lateral de aminoácido. As substituições de aminoácido podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos rastreados por uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhorada. [Tabela 1]
[00467] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicas: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicas neutras: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicas: Asp, Glu; (4) básicas: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromáticas: Trp, Tyr, Phe. As substituições não conservadoras implicarão na troca de um membro de um desses grupos por um membro de um outro grupo.
[00468] Um tipo de variante substitucional envolve substituir um ou mais dos resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou anticorpo humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo adicional terão modificações (por exemplo, aumentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) relativa ao anticorpo parental e/ou terão certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parenta. Uma variante substitucional exemplificadora é um anticorpo de afinidade maturado, que pode ser gerado de forma conveniente, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade com base em exibição de fagos, tais como aquelas descritas no presente documento. Em resumo, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos em fagos e rastreados por uma atividade biológica específica (por exemplo, afinidade de ligação).
[00469] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser produzidas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade ao anticorpo. Tais alterações podem ser produzidas em "hotspots" de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (veja, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que contactam o antígeno, com a VH ou VL variante resultante sendo testada por afinidade de ligação. A maturação da afinidade através da construção e re-seleção a partir de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) Em algumas modalidades da maturação de afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer variedade de métodos (por exemplo, PCR propenso a erro, embaralhamento de cadeias ou mutagênese direcionada pelo oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então rastreada para identificar quaisquer variantes de anticorpo com a afinidade desejada. Um outro método para introduzir a diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4-6 resíduos em um momento) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação do antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando a mutagênese ou modelagem do rastreamento de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente direcionadas.
[00470] Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs à medida que tais alterações não reduzem substancialmente a capacidade do anticorpo para ligar o antígeno. Por exemplo, as alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme providas no presente documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser produzidas em HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar for a dos resíduos de contato com o antígeno nas HVRs. Em certas modalidades das sequências de VH e VL variantes providas acima, cada HVR é tanto inalterada ou contém não mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácido.
[00471] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionados para a mutagênese é chamado "mutagênese do rastreamento da alanina" conforme descrito por Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com antígeno é afetada. As substituições adicionais podem ser introduzidas nas localizações de aminoácido demonstrando a sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternadamente, ou de forma adicional, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno- anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. Variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[00472] As inserções da sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxil-terminal que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão aos N- ou C-terminais do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do anticorpo.
b. Variantes de glicosilação
[00473] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento é alterado para aumentar ou diminuir a extensão a qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser conseguida de forma conveniente através da alteração da sequência de aminoácido de modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos.
[00474] No local onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato ligado a ele pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamífero compreendem tipicamente um oligossacarídeo ramificado, biantenário que é geralmente ligado por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Veja, por exemplo, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose, e ácido siálico, assim como fucose ligada a uma GlcNAc no "tronco" da estrutura de oligossacarídeo biantenário. Em algumas modalidades, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser produzidas de modo a criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.
[00475] Em uma modalidade, variantes de anticorpo são providas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose ligada (diretamente ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada através do cálculo da quantidade médica de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, relativa à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas de manose complexas, híbridas e altas) conforme medidas pela espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrita na publicação internacional 2008/077546, por exemplo. Asn297 se refere ao resíduo de asparagina localizado em cerca da posição 297 na região Fc (Numeração EU de resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado cerca de +/- 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações da sequência nos anticorpos. Tais variantes de fucosilaão podem ter função melhorada de ADCC. Veja, por exemplo, Publicações Norte-Americanas Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpo "defucosiladas" ou "deficientes de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem as células de CHO Lec13 deficientes na fucosilação da proteína (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente Norte-Americano No. 2003/0157108 A1, Presta, L; e Publicação Internacional WO 2004/056312, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, tal como gene alfa-1,6- fucosiltransferase, FUT8, células de CHO knockout (veja, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006); e publicação internacional WO 2003/085107).
[00476] Variantes de anticorpos são providos adicionalmente com oligossacarídeos bissectados, por exemplo, no qual um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpo são descritos, por exemplo, na publicação internacional WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente Norte-Americana No.6.602.684 (Umana et al.); e Pedido Norte-Americano US 2005/0123546 (Umana et al.). Variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc também são providos. Tais variantes de anticorpo podem ter função de CDC melhorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, na publicação internacional WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Variantes da região Fc
[00477] Em certas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácido podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo provido no presente documento, com isso gerando uma variante de região Fc. A variante da região Fc pode compreender a sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc da IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, a substituição) em uma ou mais posições de aminoácido.
[00478] Em certas modalidades, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, porém não todas as funções efetoras, o que a torna um candidato desejável para aplicações nas quais a meia- vida do anticorpo in vivo é importante, ainda certas funções efetoras (tal como complementar e ADCC) são desnecessárias ou deletérias. Os ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação do receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo careça de ligação do R gama Fc (portanto provavelmente carecendo de atividade ADCC), porém retém a capacidade de ligação FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressar apenas RIII gama de Fc, enquanto que os monócitos expressam RI gama de Fc, RII gama de Fc e RIII gama de Fc. A expressão FcR em células hematopoiéticas é sumarizada na Tabela 3 na página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Os exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente Norte-Americana No.5.500.362 (veja, por exemplo, Hellstrom, et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:70597063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:14991502 (1985); 5.821.337 (veja Bruggemann, et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternadamente, os métodos de ensaio não radioativos podem ser empregados (veja, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTITM para a citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); e ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96 (marca registrada) (Promega, Madison, WI)). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternadamente, ou de forma adicional, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Os ensaios de ligação C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Veja, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c na publicação internacional WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação complementar, um ensaio CDC pode ser realizado (veja, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); and Cragg, Blood 103:2738-2743 (2004)). A ligação FcRn e as determinações de depuração/meia-vida in vitro também podem ser realizadas usando métodos na técnica (veja, por exemplo, Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
[00479] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente Norte-Americana No.6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a assim chamada mutante Fc "DANA" com substituição de resíduos 265 e 297 para alanina (Patente Norte-Americana No.7.332.581).
[00480] Certas variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída a FcRs são descritas. (Veja, por exemplo, Patente Norte- Americana No.6,737,056; publicação internacional WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
[00481] Em certas modalidades, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácido que melhoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (Numeração EU de resíduos).
[00482] Em algumas modalidades, as alterações são produzidas na região Fc que resultam em ligação C1q alterada (isto é, seja melhorada ou diminuída) e/ou citotoxicidade dependente complementar (CDC), por exemplo, conforme descrita na Patente Norte-Americana No.6,194,551, WO 1999/51642, e Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
[00483] Os anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos no Pedido de Patente Norte-Americano US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Aqueles anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nas mesmas que melhoram a ligação da região Fc a FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições em uma ou mais de resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo da região Fc 434 (Patente Norte- Americana No.7.371.826). Veja também, Duncan, Nature 322:738-40 (1988); Patentes Norte-Americanas Nos.5.648.260 e 5.624.821; e publicação internacional WO 1994/29351 com relação a outros exemplos de variantes da região Fc.
d. Variantes de anticorpo engenheiradas com cisteína
[00484] Em certas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos engenheirados com cisteína, por exemplo, "thioMAbs," nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos com resíduos de cisteína. Em modalidades específicas, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Ao substituir aqueles resíduos com cisteína, os grupos tiol reativos são assim posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções de fármaco ou porções de ligante- fármaco, para criar um imunoconjugado, conforme descrito adicionalmente no presente documento. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos resíduos que seguem podem ser substituídos com cisteína: V205 (Numeração Kabat) da cadeia leve; A118 (Numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (Numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Os anticorpos engenheirados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte- Americana No.7.521.541.
e. Derivados de Anticorpo
[00485] Em certas modalidades, um anticorpo provido no presente documento pode ser ainda modificado para conter porções não proteináceas adicionais que conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As porções adequadas para a derivatização do anticorpo incluem porém não se limitam a polímeros solúveis em água. Os exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, porém não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (seja homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligado ao anticorpo pode variar e caso mais de um polímero esteja ligado, eles podem ser as mesmas ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para a derivatização pode ser determinado com base em considerações incluindo, porém sem se limitar às propriedades particulares ou funções do anticorpo a serem melhoradas, caso o derivado de anticorpo seja usado em uma terapia sob as condições definidas, etc.
[00486] Em uma outra modalidade, os conjugados de um anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos através da exposição à radiação são providos. Em uma modalidade, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, porém não se limita a, comprimentos de onda que não danificam células ordinárias, porém que aquecem a porção não proteinácea a uma temperatura na qual as células proximais à porção anticorpo-não proteinácea são mortas.
8. Regiões Fc Variantes
[00487] Em um aspecto, a invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é um anticorpo. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc. Em certas modalidades, a região Fc variante compreende pelo menos uma alteração do resíduo de aminoácido (por exemplo, substituição) comparada à sequência correspondente na região Fc de uma sequência variante nativa ou de referência (algumas vezes coletivamente referida no presente documento como uma região Fc "parental"). Em certas modalidades, a região Fc variante da invenção tem atividade de ligação melhorada por RIIb gama de Fc de macaco comparado à região de Fc parental. Em modalidades específicas, o RIIb gama de Fc de macaco é RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 223).
[00488] Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental para RIIb gama de Fc de macaco]/[Valor KD de uma região Fc variante para RIIb gama de Fc de macaco] pode ser 2,0 ou maior, 3,0 ou maior, 4,0 ou maior, 5,0 ou maior, 6,0 ou maior, 7,0 ou maior, 8,0 ou maior, 9,0 ou maior, 10 ou maior, 15 ou maior, 20 ou maior, 25 ou maior, 30 ou maior, 40 ou maior ou 50 ou maior. Em modalidades adicionais, a região Fc variante tem atividade de ligação dimunuída para RIIIa gama de Fc de macaco. Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental para RIIIa gama de Fc de macaco]/[Valor KD de uma região Fc variante para RIIIa gama de Fc de macaco] pode ser 0,50 ou menor, 0,40 ou menor, 0,30 ou menor, 0,20 ou menor, 0,10 ou menor, 0,09 ou menor, 0,08 ou menor, 0,07 ou menor, 0,06 ou menor, 0,05 ou menor, 0,04 ou menor, 0,03 ou menor, 0,02 ou menor, ou 0,01 ou menor. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc de macaco tem a sequência da SEQ ID NO:223 (macaco cinomolgo). Em certas modalidades, a RIIIa gama de Fc de macaco tem a sequência da SEQ ID NO:224 (macaco cinomolgo).
[00489] Em modalidades adicionais, a região Fc variante tem atividade de ligação melhorada por RIIb gama de Fc humano. Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental para RIIb gama de Fc humano]/[Valor KD de uma região Fc variante para RIIb gama de Fc humano] pode ser 2,0 ou maior, 3,0 ou maior, 4,0 ou maior, 5,0 ou maior, 6,0 ou maior, 7,0 ou maior, 8,0 ou maior, 9,0 ou maior, 10 ou maior, 15 ou maior, 20 ou maior, 25 ou maior, 30 ou maior, 40 ou maior, ou 50 ou maior. Em modalidades adicionais, a região Fc variante tem atividade de ligação dimunuída por RIIIa gama de Fc humano. Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental para RIIIa gama de Fc humano]/[Valor KD de uma região Fc variante para RIIIa gama de Fc humano] pode ser 0,50 ou menor, 0,40 ou menor, 0,30 ou menor, 0,20 ou menor, 0,10 ou menor, 0,09 ou menor, 0,08 ou menor, 0,07 ou menor, 0,06 ou menor, 0,05 ou menor, 0,04 ou menor, 0,03 ou menor, 0,02 ou menor, ou 0,01 ou menor. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc humano tem a sequência da SEQ ID NOS:212, 213 ou 214. Em certas modalidades, a RIIIa gama de Fc humano tem a sequência da SEQ ID NO:215, 216, 217 ou 218.
[00490] Em modalidades adicionais, a região Fc variante tem atividade de ligação dimunuída por RIa gama de Fc humano (tipo H). Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental para RIa gama de Fc humano (tipo H)]/[Valor KD de uma região Fc variante para RIa gama de Fc humano(tipo H)] pode ser 5,0 ou menor, 4,0 ou menor, 3,0 ou menor, 2,0 ou menor, 1,0 ou menor, 0,9 ou menor, 0,8 ou menor, 0,7 ou menor, 0,6 ou menor, 0,5 ou menor, 0,4 ou menor, 0,3 ou menor, 0,2 ou menor, ou 0,1 ou menor. Em modalidades adicionais, a região Fc variante tem atividade de ligação dimunuída por RIa gama de Fc humano (tipo R). Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental para RIa gama de Fc humano (tipo R)]/[Valor KD de uma região Fc variante para RIa gama de Fc humano (tipo R)] pode ser 5,0 ou menor,4,0 ou menor, 3,0 ou menor, 2,0 ou menor, 1,0 ou menor, 0,9 ou menor, 0,8 ou menor, 0,7 ou menor, 0,6 ou menor, 0,5 ou menor, 0,4 ou menor, 0,3 ou menor, 0,2 ou menor, ou 0,1 ou menor. Em certas modalidades, a RIa gama de Fc humano (tipo H) tem a sequência da SEQ ID NO:211. Em certas modalidades, a RIa gama de Fc humano (tipo R) tem a sequência da SEQ ID NO:210.
[00491] Em certas modalidades, a razão de [Valor KD de uma região de Fc parental for RIIa gama de Fc de macaco]/[Valor KD of uma região Fc variante for RIIa gama de Fc de macaco] pode ser 2,0 ou maior, 3,0 ou maior, 4,0 ou maior, 5,0 ou maior, 6,0 ou maior, 7,0 ou maior, 8,0 ou maior, 9,0 ou maior, 10 ou maior, 15 ou maior, 20 ou maior, 25 ou maior, 30 ou maior, 40 ou maior, or 50 ou maior. Em certas modalidades, RIIa gama de Fc de macaco é selecionado a partir de RIIa1 gama de Fc de macaco (por exemplo, RIIa1 gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:220)), RIIa gama de Fc de macaco2 (por exemplo, RIIa2 gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:221)), e RIIa3 gama de Fc de macaco (por exemplo, RIIa3 gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:222).
[00492] Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIIb gama de Fc de macaco pode ser 1,0x10-6 M ou menor, 9,0x10-7 M ou menor, 8,0x10-7 M ou menor, 7,0x10-7 M ou menor, 6,0x10-7 M ou menor, 5,0x10-7 M ou menor, 4,0x10-7 M ou menor, 3,0x10-7 M ou menor, 2,0x10-7 M ou menor, ou 1,0x10-7 M ou menor. Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIIIa gama de Fc de macaco pode ser 5,0x10-7 M ou maior, 6,0x10-7 M ou maior, 7,0x10-7 M ou maior, 8,0x10-7 M ou maior, 9,0x10-7 M ou maior, 1,0x10-6 M ou maior, 2,0x10-6 M ou maior, 3,0x10-6 M ou maior, 4,0x10- 6 M ou maior, 5,0x10-6 M ou maior, 6,0x10-6 M ou maior, 7,0x10-6 M ou maior, 8,0x10-6 M ou maior, 9,0x10-6 M ou maior, ou 1,0x10-5 M ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIIb gama de Fc humano pode ser 2,0x10-6 M ou menor, 1,0x10-6 M ou menor, 9,0x10-7 M ou menor, 8,0x10-7 M ou menor, 7,0x10-7 M ou menor, 6,0x10-7 M ou menor, 5,0x10-7 M ou menor, 4,0x10-7 M ou menor, 3,0x10-7 M ou menor, 2,0x10-7 M ou menor, ou 1,0x10-7 M ou menor. Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIIIa gama de Fc humano pode ser 1,0x10-6 M ou maior, 2,0x10-6 M ou maior, 3,0x10-6 M ou maior, 4,0x10-6 M ou maior, 5,0x10-6 M ou maior, 6,0x10-6 M ou maior, 7,0x10-6 M ou maior, 8,0x10-6 M ou maior, 9,0x10- 6 M ou maior, 1,0x10-5 M ou maior, 2,0x10-5 M ou maior, 3,0x10-5 M ou maior, 4,0x10-5 M ou maior, ou 5,0x10-5 M ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIa gama de Fc humano (tipo H) pode ser 1,0x10-7 M ou maior, 2,0x10-7 M ou maior, 3,0x10-7 M ou maior, 4,0x10-7 M ou maior, 5,0x10-7 M ou maior, 6,0x10- 7 M ou maior, 7,0x10-7 M ou maior, 8,0x10-7 M ou maior, 9,0x10-7 M ou maior, 1,0x10-6 M ou maior, 2,0x10-6 M ou maior, 3,0x10-6 M ou maior, 4,0x10-6 M ou maior, or 5,0x10-6 M ou maior. Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIa gama de Fc humano (tipo R) pode ser 2,0x10-7 M ou maior, 3,0x10-7 M ou maior, 4,0x10-7 M ou maior, 5,0x10-7 M ou maior, 6,0x10-7 M ou maior, 7,0x10-7 M ou maior, 8,0x10-7 M ou maior, 9,0x10-7 M ou maior, 1,0x10-6 M ou maior, 2,0x10- 6 M ou maior, 3,0x10-6 M ou maior, 4,0x10-6 M ou maior, ou 5,0x10-6 M ou maior.
[00493] Em uma outra modalidade, o valor de KD de uma região Fc variante para RIIa gama de Fc de macaco pode ser 1,0x10-6 M ou menor, 9,0x10-7 M ou menor, 8,0x10-7 M ou menor, 7,0x10-7 M ou menor, 6,0x10-7 M ou menor, 5,0x10-7 M ou menor, 4,0x10-7 M ou menor, 3,0x10-7 M ou menor, 2,0x10-7 M ou menor, ou 1,0x10-7 M ou menor. Em certas modalidades, RIIa gama de Fc de macaco pode ser selecionado a partir de qualquer um de RIIa1 gama de Fc de macaco, RIIa2 gama de Fc de macaco, e RIIa3 gama de Fc de macaco.
[00494] Quando se desenvolve um produto farmacêutico para o tratamento de doenças humanas, a avaliação de sua eficácia e segurança em macaco são importantes devido a sua proximidade biológica ao humano. A partir de tais pontos de vista, um produto farmacêutico a ser desenvolvido é preferível ter reatividade cruzada em ambos humano e macaco na atividade de ligação alvo.
[00495] "Receptores gama de Fc" (no presente documento, referidos como receptores gama de Fc, R ou FcgR gama de Fc) se refere a receptores que podem se ligar à região Fc de anticorpos monoclonais de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e praticamente significa qualquer membro da família de proteínas codificadas pelos genes receptores gama de Fc. Em humanos, esta família inclui RI gama de Fc (CD64) incluindo isoformas RIa gama de Fc, RIb gama de Fc, e RIc gama de Fc; RII gama de Fc (CD32) incluindo isoformas RIIa gama de Fc (incluindo alotipos H131 (tipo H) e R131 (tipo R)), RIIb gama de Fc (incluindo RIIb-1 gama de Fc e RIIb-2 gama de Fc), e RIIc gama de Fc; e RIII gama de Fc (CD16) incluindo isoformas RIIIa gama de Fc (incluindo alotipos V158 e F158), e RIIIb gama de Fc (incluindo alotipos RIIIb-NA1 gama de Fc e RIIIb-NA2 gama de Fc), e quaisquer Rs gama de Fc humanos, isoformas R gama de Fc ou alotipos a serem descobertos, porém não se limita a eles. RIIb1 gama de Fc e RIIb2 gama de Fc foram relatados como variantes splicing de RIIb gama de Fc humano. Além disso, uma variante splicing nomeada RIIb3 gama de Fc foi reportada (J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385). Além dessas variantes splicing, RIIb gama de Fc humano inclui todas as variantes splicing registradas em NCBI, as quais são NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1 e NP_003992.3. Além disso, RIIb gama de Fc humano inclui cada polimorfismo genético anteriormente reportado, assim como RIIb gama de Fc (Arthritis Rheum. 48:3242-3252 (2003); Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14:2881-2892 (2005); e Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46:1242-1254 (2002)), e cada polimorfismo genético que será reportado no futuro.
[00496] Em RIIa gama de Fc, existem alotipos, um onde o aminoácido na posição 131 de RIIa gama de Fc é histidina (tipo H) e o outro onde o aminoácido na posição 131 é substituído com arginina (tipo R) (Warrmerdam, J. Exp. Med. 172:19-25 (1990)).
[00497] A R gama de Fc inclui Rs gama de Fc derivado de humano, camundongo, rato, coelho e macaco, porém não se limitam a estes, e podem ser derivados a partir de qualquer organismo. Rs gama de Fc de camundongo incluem RI gama de Fc (CD64), RII gama de Fc (CD32), RIII gama de Fc (CD16), e RIII-2 gama de Fc (CD16-2), e quaisquer isoformas de Rs gama de Fc ou isoformas R gama de Fc, porém não se limitam a estas. A menos que especificado de outra forma, o termo "R gama de Fc de macaco" ou variação da mesma, se refere a RIIa1 gama de Fc de cinomolgo (SEQ ID NO:220), RIIa2 gama de Fc (SEQ ID NO:221), RIIa3 gama de Fc (SEQ ID NO:222), RIIb gama de Fc (SEQ ID NO:223), ou RIIIaS gama de Fc (SEQ ID NO:224).
[00498] A sequência de polinucleotídeo de RI gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 199 (NM_000566.3); a sequência de polinucleotídeo de RIa gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 200 (BC020823.1) ou SEQ ID NO:201 (NM_001136219.1); a sequência de polinucleotídeo de RIIb gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 202 (BC146678.1) ou SEQ ID NO:203 (NM_004001.3); a sequência de polinucleotídeo de RIIIa gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 204 (BC033678.1) ou SEQ ID NO:205 (NM_001127593.1); e a sequência de polinucleotídeo de RIIIb gama de Fc de humano é estabelecida na SEQ ID NO: 206 (BC128562.1).
[00499] A sequência de aminoácido de RI gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 207 (NP_000557.1); a sequência de aminoácido de RIa gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 208 (AAH20823.1), SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210 ou SEQ ID NO:211; a sequência de aminoácido de RIIb gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 212 (AAI46679.1), SEQ ID NO: 213 ou SEQ ID NO:214; a sequência de aminoácido de RIIIa gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 215 (AAH33678.1), SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217 ou SEQ ID NO:218; e a sequência de aminoácido de RIIIb gama de Fc humano é estabelecida na SEQ ID NO: 219 (AAI28563.1).
[00500] A sequência de aminoácido de RIIa gama de Fc de macaco cinomolgo é estabelecida na SEQ ID NO: 220 (RIIa1 gama de Fc), SEQ ID NO:221 (RIIa2 gama de Fc) ou SEQ ID NO:222 (RIIa3 gama de Fc); a sequência de aminoácido de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo é estabelecida na SEQ ID NO: 223; e a sequência de aminoácido de RIIIa gama de Fc de macaco cinomolgo é estabelecida na SEQ ID NO: 224.
[00501] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos contendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorada comparada a um polipeptídeo de ligação a RIIb gama de Fc de referência. Em aspectos adicionais, o polipeptídeo da invenção compreende pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00502] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo pelo menos duas alterações de aminoácidos compreendendo: (a) uma alteração do aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00503] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo uma alteração do aminoácido na posição 236 de acordo com Numeração EU.
[00504] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo pelo menos duas alterações dos aminoácidos compreendendo: (a) uma alteração do aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396, de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante compreende uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396, de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante compreende uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 268, 295, 326 e 330, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00505] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo a alteração do aminoácidos de qualquer uma das que seguem (1)-(37): (1) posições 231, 236, 239, 268 e 330; (2) posições 231, 236, 239, 268, 295 e 330; (3) posições 231, 236, 268 e 330; (4) posições 231, 236, 268, 295 e 330; (5) posições 232, 236, 239, 268, 295 e 330; (6) posições 232, 236, 268, 295 e 330; (7) posições 232, 236, 268 e 330; (8) posições 235, 236, 268, 295, 326 e 330; (9) posições 235, 236, 268, 295 e 330; (10) posições 235, 236, 268 e 330; (11) posições 235, 236, 268, 330 e 396; (12) posições 235, 236, 268 e 396; (13) posições 236, 239, 268, 295, 298 e 330; (14) posições 236, 239, 268, 295, 326 e 330; (15) posições 236, 239, 268, 295 e 330; (16) posições 236, 239, 268, 298 e 330; (17) posições 236, 239, 268, 326 e 330; (18) posições 236, 239, 268 e 330; (19) posições 236, 239, 268, 330 e 396; (20) posições 236, 239, 268 e 396; (21) posições 236 e 268; (22) posições 236, 268 e 295; (23) posições 236, 268, 295, 298 e 330; (24) posições 236, 268, 295, 326 e 330; (25) posições 236, 268, 295, 326, 330 e 396; (26) posições 236, 268, 295 e 330; (27) posições 236, 268, 295, 330 e 396; (28) posições 236, 268, 298 e 330; (29) posições 236, 268, 298 e 396; (30) posições 236, 268, 326 e 330; (31) posições 236, 268, 326, 330 e 396; (32) posições 236, 268 e 330; (33) posições 236, 268, 330 e 396; (34) posições 236, 268 e 396; (35) posições 236 e 295; (36) posições 236, 330 e 396; e (37) posições 236 e 396, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00506] Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 231; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 232; (c) Asp na posição 233; (d) Trp, Tyr na posição 234; (e) Trp na posição 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val na posição 236; (g) Asp, Tyr na posição 237; (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr na posição 238; (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val na posição 239; (j) Ile na posição 264; (k) Phe na posição 266; (l) Ala, His, Leu na posição 267; (m) Asp, Glu na posição 268; (n) Asp, Glu, Gly na posição 271; (o) Leu na posição 295; (p) Leu na posição 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu na posição 325; (r) Thr na posição 326; (s) Ile, Asn na posição 327; (t) Thr na posição 328; (u) Lys, Arg na posição 330; (v) Glu na posição 331; (w) Asp na posição 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr na posição 334; and (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 396; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00507] Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende pelo menos uma alteração do aminoácido (por exemplo, substituição) selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) Gly, Thr na posição 231; (b) Asp na posição 232; (c) Trp na posição 235; (d) Asn, Thr na posição 236; (e) Val na posição 239; (f) Asp, Glu na posição 268; (g) Leu na posição 295; (h) Leu na posição 298; (i) Thr na posição 326; (j) Lys, Arg na posição 330; and (k) Lys, Met na posição 396; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asn na posição 236, Glu na posição 268, Lys na posição 330, e Met na posição 396; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asn na posição 236, Asp na posição 268, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asn na posição 236, Asp na posição 268, Leu na posição 295, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Thr na posição 236, Asp na posição 268, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asn na posição 236, Asp na posição 268, Leu na posição 295, Thr na posição 326, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Trp na posição 235, Asn na posição 236, Asp na posição 268, Leu na posição 295, Thr na posição 326, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU.
[00508] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo e uma alteração do aminoácido na posição 238 de acordo com Numeração EU.
[00509] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 234, 238, 250, 264, 267, 307 e 330 de acordo com Numeração EU. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 234, 250, 264, 267, 307 e 330 de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00510] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreendendo a alteração do aminoácidos de qualquer uma das que seguem (1)-(9): (1) posições 234, 238, 250, 307 e 330; (2) posições 234, 238, 250, 264, 307 e 330; (3) posições 234, 238, 250, 264, 267, 307 e 330; (4) posições 234, 238, 250, 267, 307 e 330; (5) posições 238, 250, 264, 307 e 330; (6) posições 238, 250, 264, 267, 307 e 330; (7) posições 238, 250, 267, 307 e 330; (8) posições 238, 250 e 307; e (9) posições 238, 250, 307 e 330, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00511] Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende pelo menos uma alteração do aminoácido (por exemplo, substituição) selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) Tyr na posição 234; (b) Asp na posição 238; (c) Val na posição 250, (d) Ile na posição 264; (e) Ala na posição 267; (f) Pro na posição 307; e (g) Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asp na posição 238; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asp na posição 238, Val na posição 250, e Pro na posição 307; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asp na posição 238, Val na posição 250, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asp na posição 238, Val na posição 250, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, a região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado compreende a alteração dos aminoácidos (por exemplo, substituições) de: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00512] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos isolados compreendendo regiões Fc variantes com ponto isoelétrico aumentado (pI). Em certas modalidades, uma região Fc variante descrita no presente documento compreende pelo menos duas alterações dos aminoácidos em uma região Fc parental. Em certas modalidades, cada uma das alterações dos aminoácidos aumenta o ponto isoelétrico (pI) de uma região Fc variante comparada com aquela da região Fc parental. Eles estão baseados nos achados que a eliminação do antígeno a partir de plasma pode ser promovida com um anticorpo cujo pI foi aumentado pela modificação de pelo menos dois resíduos de aminoácido, por exemplo quando o anticorpo é administrado in vivo.
[00513] Na presente invenção, pI pode ser tanto pl teórico ou pl experitalmente determinado. O valor de pI pode ser determinado, por exemplo, pela focalização isoelétrica conhecida daqueles versados na técnica. O valor de um pl teórico pode ser calculado, por exemplo, usando software de análise de gene e sequência de aminoácido (Genetyx, etc.).
[00514] Em uma modalidade, o valor de pI pode ser aumentado, por exemplo, pelo menos em 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, ou mais, pelo menos em 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou mais, pelo menos em 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, ou mais, ou pelo menos em 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 3,0 ou mais, conforme comparado antes da modificação.
[00515] Em certas modalidades, o aminoácido para pl aumentado pode ser exposto na superfície da região Fc variante. Na presente invenção, um aminoácido que pode ser exposto na superfície geralmente se refere a um resíduo de aminoácido localizado em uma superfície de um polipeptídeo constituindo uma região Fc variante. Um resíduo de aminoácido localizado em uma superfície de um polipeptídeo se refere a um resíduo de aminoácido cuja cadeia lateral pode estar em contato com moléculas de solvente (as quais em geral são na maior parte moléculas de água). No entanto, a cadeia lateral não tem necessariamente que estar totalmente em contato com moléculas de solvente, e quando mesmo uma porção da cadeia lateral está em contato com as moléculas de solvente, o aminoácido é definido como um "resíduo de aminoácido localizado na superfície". Os resíduos de aminoácido localizados em uma superfície de um polipeptídeo também incluem resíduos de aminoácido localizados perto da superfície e com isso podem ter uma influência de carga elétrica a partir de um outro resíduo de aminoácido cuja cadeia lateral, mesmo parcialmente, está em contato com as moléculas de solvente. Aqueles versados na técnica podem preparar um modelo de homologia de um polipeptídeo por exemplo, usando softwares comercialmente disponíveis. Alternadamente, é possível usar métodos conhecidos daqueles versados na técnica, tal como cristalografia de raios X. Os resíduos de aminoácido que podem ser expostos na superfície são determinados, por exemplo, usando coordenadas a partir de um modelo tridimensional usando um programa de computador tal como programa InsightII (Accelrys). Os sítios que podem ser expostos na superfície podem ser determinados usando algoritmos conhecidos no campo técnico (por exemplo, Lee and Richards (J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)); Connolly (J. Appl. Cryst. 16:548-558 (1983)). Os sítios que podem ser expostos na superfície podem ser determinados usando software adequado para modelagem de proteína e informação de estrutura tridimensional. O software disponível para tais finalidades inclui, por exemplo, o software SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Quando um algoritmo necessita de um parâmetro de tamanho de usuário, o "tamanho" de uma sona que é usada no cálculo pode ser ajustado até cerca de 1.4 Angstrom ou menos em raio. Além disso, os métodos para determiner as regiões que podem ser expostas na superfície usando software para computadores pessoais foram descritos por Pacios (Comput. Chem. 18(4):377-386 (1994); J. Mol. Model. 1:46-53 (1995)). Com base em tal informação conforme descrita acima, os resíduos de aminoácido adequados localizados em uma superfície de um polipeptídeo que constitui uma região Fc variante podem ser selecionados.
[00516] Em certas modalidades, um polipeptídeo compreende tanto uma região Fc variante e um domínio de ligação ao antígeno. Em modalidades adicionais, o antígeno é um antígeno solúvel. Em uma modalidade, o antígeno está presente em fluidos biológicos (por exemplo, plasma, fluido intersticial, fluido linfático, fluido ascítico e fluido pleural) de indivíduos. O antígeno também pode ser um antígeno de membrana.
[00517] Em modalidades adicionais, a atividade de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno muda de acordo com condições de concentração iônica. Em uma modalidade, a concentração iônica não está particularmente limitada e se refere a concentração iônica de hidrogênio (pH) ou concentração iônica de metal. No presente documento, os íons metálicos se referem aos íons de elementos do grupo I exceto hidrogênio, tais como metais alcalinos e elementos do grupo de cobre, elementos do grupo II tais como metais alcalinos terrosos e elementos do grupo de zinco, elementos do grupo III exceto boro, elementos do grupo IV exceto carbono e silício, elementos do grupo VIII tais como elementos do grupo de ferro e elementos do grupo platina, elementos que pertencem ao subgrupo A de grupos V, VI e VII, e elementos metálicos tais como antimônio, bismuto e polônio. Na presente invenção, os íons metálicos incluem, por exemplo, íon de cálcio, conforme descrito na publicação internacional WO 2012/073992 e WO 2013/125667. Em uma modalidade, "condição de concentração iônica" pode ser uma condição que foca em diferenças no comportamento biológico de um domínio de ligação ao antígeno entre uma baixa concentração iônica e uma alta concentração iônica. Além disso, a "atividade de ligação ao antígeno de um domínio de ligação ao antígeno muda de acordo com condições de concentração iônica" significa que a atividade de ligação ao antígeno de um domínio de ligação ao antígeno muda entre uma baixa concentração iônica e uma alta concentração iônica (tal domínio de ligação ao antígeno é referido no presente documento como "domínio de ligação ao antígeno dependente de concentração"). A atividade de ligação ao antígeno de um domínio de ligação ao antígeno sob uma alta condição de concentração iônica pode ser maior (mais forte) ou menor (mais fraca) do que aquela sob uma baixa condição de concentração iônica. Em uma modalidade, os domínios de ligação ao antígeno dependentes de concentração (tais como domínios de ligação ao antígeno dependentes de pH ou domínios de ligação ao antígeno dependentes da concentração iônica de cálcio) podem ser obtidos por métodos conhecidos, por exemplo, descritos na publicação internacional WO 2009/125825, WO 2012/073992 e WO 2013/046722.
[00518] Na presente invenção, a atividade de ligação ao antígeno de um domínio de ligação ao antígeno sob uma condição de concentração iônica alta de cálcio pode ser maior do que sob uma condição de concentração iônica baixa de cálcio. As concentrações iônicas altas de cálcio não particularmente limitadas, porém podem ser uma concentração selecionada entre 100 microM e 10 mM, entre 200 microM e 5 mM, entre 400 microM e 3 mM, entre 200 microM e 2 mM, entre 400 microM e 1 mM, or entre 500 microM e 2,5 mM, que é preferível estar perto da concentração de plasma (sangue) do íon de cálcio in vivo. Enquanto isso, as concentrações iônicas baixas de cálcio não particularemnte limitadas, porém podem ser uma concentração selecionada entre 0,1 microM e 30 microM, entre 0,2 microM e 20 microM, entre 0,5 microM e 10 microM, entre 1 microM e 5 microM, ou entre 2 microM e 4 microM, que é preferível estar perto da concentração de íon de cálcio em endossomas precoces in vivo.
[00519] Em uma modalidade, a razão entre as atividades de ligação ao antígeno sob uma condição de concentração iônica baixa de cálcio e uma condição de concentração iônica alta de cálcio não está limitada porém a razão da constante de dissociação (KD) sob uma condição de concentração iônica baixa de cálcio ao KD sob uma condição de concentração iônica alta de cálcio, isto é, KD (condição de concentração iônica baixa de cácio)/KD (condição de concentração iônica alta de cálcio), é 2 ou mais, 10 ou mais, or 40 ou mais. O limite superior da razão pode ser 400, 1000 ou 10000, à medida que tal domínio de ligação ao antígeno pode ser produzido por técnicas conhecidas daqueles versados na técnica. Alternadamente, por exemplo, a taxa constante de dissociação (kd) pode ser usada no lugar da KD. Neste caso, a razão da kd sob uma condição de concentração iônica baixa de cálcio para a kd sob uma condição de concentração iônica alta de cálcio, isto é, kd (condição de concentração iônica baixa de cálcio)/kd (condição de concentração iônica alta de cálcio), é 2 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, ou 30 ou mais. O limite superior da razão pode ser 50, 100 ou 200, à medido que o domínio de ligação ao antígeno possa ser produzido com base no conhecimento comum daqueles versados na técnica.
[00520] Na presente invenção, a atividade de ligação ao antígeno de um domínio de ligação ao antígeno sob uma concentração iônica com baixo hidrogênio (pH neutro) pode ser maior do que sob uma concentração iônica com alto hidrogênio (pH acídico). O pH acídico pode ser, por exemplo, um pH selecionado a partir de pH4,0 a pH6,5, selecionado a partir de pH4,5 a pH6,5, selecionado a partir de pH5,0 a pH6,5, ou selecionado a partir de pH5,5 a pH6,5, o qual é preferível por estar perto do pH in vivo em endossomas precoces. O pH acídico também pode ser, por exemplo, pH5,8 ou pH6,0. Em modalidades específicas, o pH acídico é pH5,8. Enquanto isso, o pH neutro pode ser, por exemplo, um pH selecionado a partir de pH6,7 a pH10,0, selecionado a partir de pH6,7 a pH9,5, selecionado a partir de pH7,0 a pH9,0, ou selecionado a partir de pH7,0 a pH8,0, o que é preferível estar perto ao pH in vivo no plasma (sangue). O pH neutro também pode ser, por exemplo, pH7,4 ou pH7,0. Em modalidades específicas, o pH neutro é pH7.4.
[00521] Em uma modalidade, a razão entre as atividades de ligação ao antígeno sob uma condição de pH acídico e uma condição de pH neutro não está limitada porém a razão da constante de dissociação (KD) son uma condição de pH acídico na KD sob uma condição de pH neutro, isto é, KD (condição de pH acídico)/KD (condição de pH neutro), é 2 ou mais, 10 ou mais, ou 40 ou mais. O limite superior da razão pode ser 400, 1000, ou 10000, à medida que tal domínio de ligação ao antígeno pode ser produzido por técnicas conhecidas daqueles versados na técnica. Alternadamente, por exemplo, a taxa constante de dissociação (kd) pode ser usada no lugar da KD. Neste caso, a razão da kd son uma condição de pH acídico na kd sob uma condição de pH neutro, isto é, kd (condição de pH acídico)/kd (condição de pH neutro) é 2 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, ou 30 ou mais. O limite superior da razão pode ser 50, 100, or 200, à medida que o domínio de ligação ao antígeno possa ser produzido com base no conhecimento técnico comum daqueles versados na técnica.
[00522] Em uma modalidade, por exemplo, pelo menos um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0, e/ou pelo menos um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 é inserido no domínio de ligação ao antígeno, conforme descrito na publicação internacional WO 2009/125825. O aminoácido pode ser substituído e/ou inserido em qualquer sítio à medida que a atividade de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno se torne mais fraca sob uma condição de pH acídico do que uma condição de pH neutro conforme comparado a antes da substituição ou inserção. Quando o domínio de ligação ao antígeno tem uma região variável ou CDR, o sítio pode estar dentro da região variável ou CDR. O número de aminoácidos que são substituídos ou inseridos pode ser adequadamente determinado por aqueles versados na técnica; e o número pode ser um ou mais. Aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 podem ser usados para mudar a atividade de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno de acordo com a condição de concentração iônica do hidrogênio. Tais aminoácidos incluem, por exemplo, aminoácidos naturais tais como His (H) e Glu (E), e aminoácidos não naturais tais como análogos de histidina (US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21), e 3,5-I2-Tyr (pKa 7,38) (Heyl et al., Bioorg. Med. Chem. 11(17):3761-3768 (2003)). Aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 6,0-7,0 também pdoem ser usados, os quais incluem, por exemplo, His (H).
[00523] Em uma outra modalidade, os domínios de ligação ao antígeno preferíveis para uma região Fc variante com pl aumentado são descritos e podem ser obtidos por métodos descritos nos Pedidos de Patente Japoneses JP2015-021371 e JP2015-185254.
[00524] Em certas modalidades, a região Fc variante com pl aumentado compreende pelo menos duas alterações dos aminoácidos de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 e 431, de acordo com Numeração EU.
[00525] Em modalidades adicionais, a região Fc variante com pl aumentado compreende pelo menos duas alterações dos aminoácidos de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 e 413, de acordo com Numeração EU.
[00526] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com pl aumentado compreendendo a alteração dos aminoácidos de qualquer uma das que seguem (1)-(10): (1) posições 311 e 341; (2) posições 311 e 343; (3) posições 311, 343 e 413; (4) posições 311, 384 e 413; (5) posições 311 e 399; (6) posições 311 e 401; (7) posições 311 e 413; (8) posições 400 e 413; (9) posições 401 e 413; e (10) posições 402 e 413; de acordo com Numeração EU.
[00527] Um método para aumentar o pI de uma proteína é, por exemplo, para reduzir o número de aminoácidos com uma cadeia lateral negativamente carregada (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) e/ou para aumentar o número de aminoácidos com uma cadeia lateral positivamente carregada (por exemplo, arginina, lisina e histidina) em uma condição de pH neutro. Aminoácidos com uma cadeia lateral negativamente carregada têm uma carga negativa representada como -1 em uma condição de pH que é suficientemente maior do que o seu pKa de cadeia lateral, a qual é uma teoria bem conhecida daqueles versados na técnica. Por exemplo, o pKa teórico para uma cadeia lateral de ácido aspártico é 3,9, e a cadeia lateral tem uma carga negativa representada como -1 em uma condição de pH neutro (por exemplo, em uma solução de pH7,0). Reciprocamente, os aminoácidos com uma cadeia lateral positivamente carregada têm uma carga positiva representada como +1 em uma condição de pH que é suficientemente menor do que o seu pKa da cadeia lateral. Por exemplo, o pKa teórico para a cadeia lateral de arginina é 12,5, e a cadeia lateral tem uma carga positiva representada como +1 em uma condição de pH neutro (por exemplo, em uma solução de pH7,0). Enquanto isso, os aminoácidos cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga em uma condição de pH neutro (por exemplo, em uma solução de pH7,0) são conhecidos por incluir 15 tipos de aminoácidos naturais, isto é, alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptofano e tirosina. Obviamente, entende-se que os aminoácidos para aumentar o pI podem ser aminoácidos não naturais.
[00528] A partir de acima, um método para aumentar o pI de uma proteína em uma condição de pH neutro (por exemplo, em uma solução de pH7,0) pode conferir uma alteração de carga de +1 em uma proteína de interesse, por exemplo, ao substituir aminoácidos com cadeias laterais não carregadas para ácido aspártico ou ácido glutâmico (cuja cadeia lateral tem uma carga negativa de -1) na sequência de aminoácido da proteína. Além disso, uma alteração de carga de +1 pode ser conferida à proteína, por exemplo, ao substituir arginina ou lisina (cuja cadeia lateral tem uma carga positiva de +1) por aminoácidos cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga. Além do mais, uma alteração de carga de +2 pode ser conferida em um momento à proteína ao substituir arginina ou lisina (cuja cadeia lateral tem uma carga positiva de +1) por ácido aspártico ou ácido glutâmico (cuja cadeia lateral tem uma carga negativa de -1). Alternadamente, para aumentar o pI de uma proteína, os aminoácidos com uma cadeia lateral sem nenhuma carga e/ou preferivelmente aminoácidos com uma cadeia laterais positivamente carregadas podem ser adicionados ou inseridos na sequência de aminoácido da proteína, ou aminoácidos com uma cadeia lateral sem nenhuma carga e/ou preferivelmente aminoácidos com uma cadeia lateral negativamente carregada presente na sequência de aminoácido da proteína podem ser deletados. Deve-se entender que, por exemplo, os resíduos de aminoácido N-terminal e C-terminal de uma proteína têm uma carga derivada da cadeia principal (NH3+ do grupo amino no N- terminal e COO- do grupo carbonila no C-terminal) além de suas cargas derivadas de cadeia lateral. Sendo assim, o pI de uma proteína também pode ser aumentado ao efetuar nos grupos funcionais derivados da cadeia principal alguma adição, deleção, substituição ou inserção.
[00529] A substituição de um aminoácido para aumentar o pl inclui, por exemplo, substituição de um aminoácido cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga para um aminoácido tendo uma cadeia lateral negativamente carregada, substituição de um aminoácido tendo uma cadeia lateral positivamente carregada para um aminoácido cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga, e substituição de um aminoácido tendo uma cadeia lateral positivamente carregada por um aminoácido tendo uma cadeia lateral negativamente carregada na sequência de aminoácido de uma região Fc parental, que são realizadas sozinhas ou em combinações adequadas.
[00530] A inserção ou adição de um aminoácido para aumentar o pl inclui, por exemplo, inserção ou adição de um aminoácido cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga, e/ou inserção or adição de um aminoácido tendo uma cadeia lateral positivamente carregada na sequência de aminoácido de uma região Fc parental, que são realizadas sozinhas ou em combinações adequadas.
[00531] A deleção de um aminoácido para aumentar o pl inclui, por exemplo, deleção de um aminoácido cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga, e/ou deleção de um aminoácido tendo uma cadeia lateral negativamente carregada na sequência de aminoácido de uma região Fc parental, que são realizadas sozinhas ou em combinações adequadas.
[00532] Em uma modalidade, os aminoácidos naturais usados para aumentar o pI podem ser classificaos como segue: (a) um aminoácido com uma cadeia lateral negativamente carregada pode ser Glu (E) ou Asp (D); (b) um aminoácido cuja cadeia lateral não tem nenhuma carga pode ser Ala (A), Asn (N), Cys (C), Gln (Q), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) ou Val (V); e (c) um aminoácido com uma cadeia lateral positivamente carregada pode ser His (H), Lys (K) ou Arg (R). Em uma modalidade, a inserção ou modificação do aminoácido depois da modificação é Lys (K) ou Arg (R).
[00533] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos isolados compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado e pl aumentado. Em certas modalidades, uma região Fc variante descrita no presente documento compreende pelo menos duas alterações dos aminoácidos em uma região Fc parental.
[00534] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado e pl aumentado compreendendo pelo menos três alterações dos aminoácidos compreendendo: (a) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com Numeração EU, e (b) pelo menos duas alterações dos aminoácidos de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 e 431, de acordo com Numeração EU.
[00535] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado e pl aumentado, e que compreendem pelo menos três alterações dos aminoácidos compreendendo: (a) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 235, 236, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396, de acordo com Numeração EU, e (b) pelo menos duas alterações dos aminoácidos de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 e 413, de acordo com Numeração EU.
[00536] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado e pl aumentado compreendendo a alteração dos aminoácidos de qualquer uma das que seguem (1)-(9): (1) posições 235, 236, 268, 295, 311, 326, 330 e 343; (2) posições 236, 268, 295, 311, 326, 330 e 343; (3) posições 236, 268, 295, 311, 330 e 413; (4) posições 236, 268, 311, 330, 396 e 399; (5) posições 236, 268, 311, 330 e 343; (6) posições 236, 268, 311, 330, 343 e 413; (7) posições 236, 268, 311, 330, 384 e 413; (8) posições 236, 268, 311, 330 e 413; e (9) posições 236, 268, 330, 396, 400 e 413; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00537] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado e pl aumentado compreendendo pelo menos três alterações dos aminoácidos compreendendo: (a) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 234, 238, 250, 264, 267, 307 e 330, e (b) pelo menos duas alterações dos aminoácidos de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 e 431, de acordo com Numeração EU. Em modalidades adicionais, os polipeptídeos compreendem pelo menos duas alterações dos aminoácidos de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 e 413, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00538] Em um outro aspecto, a invenção provê polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado e pl aumentado compreendendo a alteração dos aminoácidos de qualquer uma das que seguem (1)-(16): (1) posições 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 e 343; (2) posições 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 e 413; (3) posições 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 e 343; (4) posições 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 e 413; (5) posições 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 e 343; (6) posições 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 e 413; (7) posições 234, 238, 250, 307, 311, 330 e 343; (8) posições 234, 238, 250, 307, 311, 330 e 413; (9) posições 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 e 343; (10) posições 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 e 413; (11) posições 238, 250, 264, 307, 311, 330 e 343; (12) posições 238, 250, 264, 307, 311, 330 e 413; (13) posições 238, 250, 267, 307, 311, 330 e 343; (14) posições 238, 250, 267, 307, 311, 330 e 413; (15) posições 238, 250, 307, 311, 330 e 343; e (16) posições 238, 250, 307, 311, 330 e 413; de acordo com Numeração EU.
[00539] Em uma modalidade adicional, a região Fc variante compreende a alteração dos aminoácidos selecionados a partir de qualquer alteração única, combinação de alterações únicas ou combinação de alterações descritas nas Tabelas 14-30.
[00540] Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreende uma região Fc variante da presente invenção. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo é uma região constante de cadeia pesada de anticorpo. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo é uma cadeia pesada de anticorpo. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo é um anticorpo. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc.
[00541] Em uma modalidade adicional, a invenção provê um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 229-381.
[00542] A "região Fc parental" conforme usada no presente documento se refere a uma região Fc antes da introdução da alteração do(s) aminoácido(s) descritos no presente documento. Os exemplos preferidos da região Fc parental incluem regiões Fc derivadas de anticorpos nativos. Os anticorpos incluem, por exemplo, IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e IgM, ou tais. Os anticorpos podem ser derivados de humano ou macaco (por exemplo, cinomolgo, macaco reso, sagui, chimpanzé ou babuíno). Anticorpos nativos também podem incluir mutações que ocorrem naturalmente. Uma pluralidade de sequências de alotipo de IgGs devido ao polimorfismo genético é descrita em "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, e qualquer uma delas pode ser usada na presente invenção. Em particular, para IgG1 humana, a sequência de aminoácido nas posições 356 a 358 (Numeração EU) pode ser tanto DEL ou EEM. Os exemplos preferidos da região Fc parental incluem regiões Fc derivadas de uma região constante de cadeia pesada of IgG1 humana (SEQ ID NO: 195), IgG2 humana (SEQ ID NO: 196), IgG3 humana (SEQ ID NO: 197) e IgG4 humana (SEQ ID NO: 198). Um outro exemplo preferido da região Fc parental é uma região Fc derivada de uma região constante de cadeia pesada SG1 (SEQ ID NO: 9). Além disso, a região Fc parental pode ser uma região Fc produzida através da adição de uma alteração do(s) aminoácido(s) diferentes da alteração do(s) aminoácido(s) descritos no presente documento para uma região Fc derivada de um anticorpo nativo.
[00543] Além disso, a alteração do aminoácidos realizada para outra(s) finalidade(s) pode ser combinada em uma região Fc variante descrita no presente documento. Por exemplo, as substituições de aminoácido que melhoram a atividade de ligação a FcRn (Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12):1759- 1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010); publicação internacional WO 2006/019447; WO 2006/053301; e WO 2009/086320), e substituições de aminoácido para melhorar a heterogeneidade ou estabilidade de anticorpo (publicação internacional WO 2009/041613) podem ser adicionadas. Alternadamente, os polipeptídeos com a propriedade de promover a depuração do antígeno, que são descritos na publicação internacional WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 ou WO 2013/180201, polipeptídeos com a propriedade de ligação específica a um tecido alvo, que são descritos na publicação internacional WO 2013/180200, polipeptídeos com a propriedade para ligação repetida em uma pluralidade de moléculas de antígeno, que são descritos na publicação internacional WO 2009/125825, WO 2012/073992 ou WO 2013/047752, podem ser combinados com uma região Fc variante descrita no presente documento. Alternadamente, com o objetivo de conferir a capacidade de ligação a outros antígenos, a alteração dos aminoácidos revelada no Pedido Europeu EP1752471 e EP1772465 pode ser combinada em CH3 de uma região Fc variante descrita no presente documento. Alternadamente, com o objetivo de aumentar a retenção de plasma, a alteração dos aminoácidos que diminui o pI da região constante (WO 2012/016227) pode ser combinada em uma região Fc variante descrita no presente documento. Alternadamente, com o objetivo de promover a absorção nas células, a alteração dos aminoácidos que aumentam o pI da região constante (WO 2014/145159) pode ser combinada em uma região Fc variante descrita no presente documento. Alternadamente, com o objetivo de promover a eliminação de uma molécula alvo a partir de plasma, a alteração dos aminoácidos que aumentam o pI da região constante (Pedidos de Patente Japoneses números JP2015-021371 e JP2015-185254) pode ser combinada em uma região Fc variante descrita no presente documento. Em uma modalidade, tal alteração pode incluir, por exemplo, substituição em pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em 311, 343, 384, 399, 400 e 413 de acordo com Numeração EU. Em uma modalidade adicional, tal substituição pode ser uma substituição de um aminoácido com Lys ou Arg em cada posição.
[00544] A alteração dos aminoácidos para aumentar a atividade de ligação d FcRn humano sob pH acídico também pode ser combinada em uma região Fc variante descrita no presente documento. Especificamente, tais alterações podem incluir, por exemplo, substituição de Leu por Met na posição 428 e substituição de Ser por Asn na posição 434, de acordo com Numeração EU (Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010)); substituição de Ala por Asn na posição 434 (Deng et al., Metab. Dispos. 38(4):600-605 (2010)); substituição de Tyr por Met na posição 252, substituição de Thr por Ser na posição 254 e substituição de Glu por Thr na posição 256 (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)); substituição de Gln por Thr na posição 250 e substituição de Leu por Met na posição 428 (Hinton et al., J. Immunol.176(1):346-356 (2006)); substituição de His por Asn na posição 434 (Zheng et al., Clin. Pharmacol. Ther. 89(2):283- 290 (2011), e alterações descritas na publicação internacional WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, ou WO 2002/060919. Tais alterações podem incluir, por exemplo, pelo menos uma alteração selecionada a partir do grupo consistindo da substituição de Leu por Met na posição 428, substituição de Ala por Asn na posição 434 e substituição de Thr por Tyr na posição 436. Aquelas alterações podem ainda incluir a substituição de Arg por Gln na posição 438 e/ou substituição de Glu por Ser na posição 440 (Pedidos de Patente Japoneses números JP2015-021371 e JP2015-185254).
[00545] Dois ou mais polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante descritos no presente documento podem ser incluídos em umamolécula, em que dois polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes são associadas, como em um anticorpo. O tipo de anticorpo não está limitado e IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), e IgM, ou tais podem ser usados.
[00546] Os dois polipeptídeos associados compreendendo regiões Fc variantes podem ser polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes nas quais a mesma alteração do(s) aminoácido(s) foi introduzida (a seguir, referidos como regiões Fc variantes homólogas), ou polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes nas quais uma alteração diferente do(s) aminoácido(s) foi introduzida, ou alternadamente polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes onde a alteração do(s) aminoácido(s) foi introduzida em apenas uma das regiões Fc (a seguir, referidos como polipeptídeos heterólogos compreendendo regiões Fc variantes). Uma das alterações preferíveis dos aminoácidos é uma alteração na estrutura do laço a partir de posições 233 a 239 (Numeração EU) no domínio CH2 da região Fc, que é envolvida na ligação com RIIb gama de Fc e RIIa gama de Fc. Preferivelmente, uma alteração é introduzida na estrutura do laço do domínio CH2 de uma das regiões Fc que aumentam a atividade de ligação a RIIb gama de Fc e/ou seletividade, e uma outra alteração é introduzida na estrutura do laço do domínio CH2 da outra região Fc que a desestabiliza. Exemplos da alteração dos aminoácidos que pode desestabilizar a estrutura de laço do domínio CH2 pode ser substituição de pelo menos um aminoácido selecionado a partir de aminoácidos nas posições 235, 236, 237, 238 e 239 por um outro aminoácido. Especificamente, ele pode ser desestabilizado, por exemplo, ao alterar o aminoácido na posição 235 para Asp, Gln, Glu ou Thr, alterar o aminoácido na posição 236 para Asn, alterar o aminoácido na posição 237 para Phe ou Trp, alterar o aminoácido na posição 238 para Glu, Gly ou Asn, e alterar o aminoácido na posição 239 para Asp ou Glu, de acordo com Numeração EU.
[00547] Para a associação de polipeptídeos heterólogos compreendendo regiões Fc variantes, uma técnica para suprimir a associação não pretendida de polipeptídeos homólogos compreendendo regiões Fc variantes ao introduzir a repulsão eletrostática na interface do domínio CH2 ou CH3 da região Fc pode ser aplicada, conforme descrito na publicação internacional WO 2006/106905.
[00548] Exemplos de resíduos de aminoácido em contato na interface do domínio CH2 ou CH3 da região Fc incluem o resíduo na posição 356 (Numeração EU), o resíduo na posição 439 (Numeração EU), o resíduo na posição 357 (Numeração EU), o resíduo na posição 370 (Numeração EU), o resíduo na posição 399 (Numeração EU), e o resíduo na posição 409 (Numeração EU) no domínio CH3.
[00549] Mais especificamente, por exemplo, a região Fc na qual um a três pares de resíduos de aminoácido selecionado a partir de (1) a (3) mostrados abaixo têm a mesma carga pode ser produzida: (1) resíduos de aminoácido nas posições 356 e 439 (Numeração EU) no domínio CH3; (2) resíduos de aminoácido nas posições 357 e 370 (Numeração EU) no domínio CH3; e (3) resíduos de aminoácido nas posições 399 e 409 (Numeração EU) no domínio CH3.
[00550] Além disso, polipeptídeos heterólogos compreendendo regiões Fc variantes podem ser produzidos, em que um a três pares dos resíduos de aminoácido selecionado a partir de (1) a (3) indicados acima têm a mesma carga no domínio CH3 na primeira região Fc, e os pares de resíduos de aminoácido selecionados na primeira região Fc mencionada acima também têm a mesma carga no domínio CH3 da segunda região Fc, contanto que as cargas na primeira e segunda regiões Fc são opostas.
[00551] Nas regiões Fc mencionadas acima, por exemplo, resíduos negativamente carregados de aminoácido são preferivelmente selecionados a partir de ácido glutâmico (E) e ácido aspártico (D), e resíduos positivamente carregados de aminoácido são preferivelmente selecionados a partir de lisina (K), arginina (R) e histidina (H).
[00552] Outras técnicas conhecidas podem ser usadas adicionalmente para a associação de polipeptídeos heterólogos compreendendo regiões Fc variantes. Especificamente, tal técnica é conduzida ao substituir uma cadeia lateral de aminoácido presente em uma das regiões Fc com uma cadeia lateral maior (knob; que significa "protuberância"), e substituir uma cadeia lateral de aminoácido presente na região Fc com uma cadeia lateral menor (hole; que significa "nulo"), para colocar o knob dentro do hole. Isto pode promover a associação eficiente entre polipeptídeos contendo a região Fc tendo as diferentes sequências de aminoácido uma da outra (publicação internacional WO 1996/027011; Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621 (1996); Merchant et al., Nat.Biotech. 16, 677-681 (1998)).
[00553] Além disso, outras técnicas conhecidas também podem ser usadas para a associação heteróloga de polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes. A associação de polipeptídeos compreendendo uma região Fc pode ser induzida de forma eficiente usando heterodímeros do domínio CH3 engenheirados através da troca da fita (Davis et al., Prot. Eng. Des. & Sel., 23:195-202 (2010)). Esta técnica também pode ser usada para induzir de forma eficiente a associação entre polipeptídeos contendo a região Fc tendo as diferentes sequências de aminoácido.
[00554] Além disso, as técnicas de produção de anticorpo heterodimerizado que usam a associação de anticorpo CH1 e CL, e a associação de VH e VL, que são descritas na publicação internacional WO 2011/028952, também podem ser usadas.
[00555] Como com o método descrito na publicação internacional 2008/119353 e WO 2011/131746, também é possível usar a técnica de produção de anticorpos heterodimerizados através da produção de dois tipos de anticorpos homodimerizados antecipadamente, incubando os anticorpos sob condições de redução para dissociá-los e deixá-los novamente para a associação.
[00556] Como com o método descrito em Strop (J. Mol. Biol. 420:204219 (2012)), também é possível usar a técnica de produção de anticorpos heterodimerizados ao introduzir resíduos carregados tais como Lys, Arg, Glu e Asp de modo que a repulsão eletrostática seja introduzida nos domínios CH3.
[00557] Além disso, como com o método descrito na publicação internacional 2012/058768, também é possível usar a técnica de produção de anticorpos heterodimerizados através da adição de alterações aos domínios CH2 e CH3.
[00558] Quando se expressam simultaneamente dois polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante a qual tem diferentes sequências de aminoácido, de modo a produzir polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes heterólogas, polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes homólogas também são geralmente produzidas como impurezas. Em tais casos, os polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes heterólogas podem ser eficientemente obtidos através de sua separação e purificação dos polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes homólogas usando técnicas conhecidas. Um método foi relatado para separar e purificar de forma eficiente anticorpos heterodimerizados a partir de anticorpos homodimerizados usando cromatografia de troca iônica, ao introduzir a alteração do aminoácidos nas regiões variáveis dos dois tipos de cadeia pesada de anticorpos para criar uma diferença em pontos isoelétricos entre os anticorpos homodimerizados e os anticorpos heterodimerizados (publicação internacional WO 2007/114325). Reportou-se um outro método para purificar anticorpos heterodimerizados usando a cromatografia da proteína A, através da construção de um anticorpo heterodimerizado compreendendo dois tipos de cadeias pesadas derivados de IgG2a de camundongo que se liga à proteína A e IgG2b de rato que não se liga à proteína A (publicação internacional WO 1998/050431 e WO 1995/033844).
[00559] Além disso, um anticorpo heterodimerizado pode ser purificado de forma eficiente usando a cromatografia da proteína A, ao substituir resíduos de aminoácido nas posições 435 e 436 (Numeração EU), que estão localizados no sítio de ligação à proteína A de uma cadeia pesada de anticorpo, com aminoácidos tais como Tyr ou His, para render as afinidades de ligação à proteína A.
[00560] Na presente invenção, a alteração do aminoácido significa qualquer substituição, deleção, adição, inserção e modificação, ou uma combinação das mesmas. Na presente invenção, a alteração do aminoácido pode ser refraseada como a mutação do aminoácido.
[00561] Quando se substituem resíduos de aminoácido, a substituição a um resíduo de aminoácido diferente pode ser realizada com o objetivo de alterar os aspectos tais como (a)-(c) descritos abaixo: (a) estrutura principal de polipeptídeo na região da estrutura pregueada ou estrutura helicoidal; (b) carga elétrica ou hidrofobicidade no sítio alvo; ou (c) tamanho de uma cadeia lateral.
[00562] Resíduos de aminoácido são classificados nos grupos que seguem com base nas suas propriedades da cadeia lateral geral: (a) hidrofóbicas: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu e Ile; (b) hidrofílicas neutras: Cys, Ser, Thr, Asn e Gln; (c) acídicas: Asp e Glu; (d) básicas: His, Lys e Arg; (e) resíduos que afetam a orientação de cadeia: Gly e Pro; e (f) aromáticas: Trp, Tyr e Phe.
[00563] A alteração dos aminoácidos é produzida por vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Tais métodos incluem o método de mutagênese direcionado no sítio (Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-275 (1995); Zoller, Meth. Enzymol. 100:468-500 (1983); Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)); Kramer and Fritz, Methods Enzymol. 154: 350-367 (1987); e Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)), o método de mutação por PCR, e o método de mutação em cassete, porém não se limitam a estes.
[00564] O número da alteração dos aminoácidos introduzidos em uma região Fc não é limitado. Em certas modalidades, ele pode ser 1, 2 ou menos, 3 ou menos, 4 ou menos, 5 ou menos, 6 ou menos, 8 ou menos, 10 ou menos, 12 ou menos, 14 ou menos, 16 ou menos, 18 ou menos, or 20 ou menos.
[00565] A modificação de aminoácido inclui modificação pós- translacional. Uma modificação pós-translacional específica pode ser adição ou deleção de uma cadeia de açúcar. Por exemplo, o resíduo de aminoácido na posição 297 (Numeração EU) na região constante de IgG1 pode ser modificada pela cadeia de açúcar. A estrutura cadeia de açúcar para a modificação não é limitada. Por exemplo, o ácido siálico pode ser adicionado à cadeia de açúcar de uma região Fc (MAbs 2010 Sep-Oct, 2(5): 519-527). Em geral, anticorpos expressados em células eucarióticas compreendem a glicosilação na região constante. Por exemplo, sabe-se que algum tipo of cadeia de açúcar é normalmente adicionado a anticorpos expressados em células tais como células de mamíferos que produzem anticorpo que ocorre naturalmente ou células eucarióticas transformadas com um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando um anticorpo.
[00566] As células eucarióticas mostradas aqui incluem células de levedura e células animais. Por exemplo, as células CHO e as células HEK293 são células animais representativas usadas na transformação com um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando anticorpo. Por outro lado, regiões constantes sem a glicosilação também são incluídas na presente invenção. Anticorpos cuja região constante não é glicosilada podem ser obtidos ao expressar um gene codificando anticorpo em células procarióticas tais como Escherichia coli.
[00567] Além disso, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da presente invenção pode ser quimicamente modificado com várias moléculas tal como polietileno glicol (PEG) e substâncias citotóxicas. Os métodos para tal modificação química de um polipeptídeo são estabelecidas na técnica.
[00568] Em um aspecto, a invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é um anticorpo. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc. Em um aspecto, a invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo é um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado. A origem de um anticorpo não é particularmente limitada, porém os exemplos incluem um anticorpo humano, um anticorpo de camundongo, um anticorpo de rato, e um anticorpo de coelho. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc.
[00569] As regiões variáveis de anticorpos que compreendem uma região Fc variante provida no presente documento e os motivos de ligação à proteína das proteínas de fusão Fc compreendendo uma região Fc variante podem reconhecer qualquer antígeno. Exemplos de antígenos que podem ser ligados por tais anticorpos e proteínas de fusão incluem, porém não se limitam a ligantes (citoquinas, quimiocinas e tais), receptores, antígenos do câncer, antígenos MHC, antígenos de diferenciação, imunoglobulinas e complexos imunes contendo parcialmente as imunoglobulinas.
[00570] Exemplos de citoquinas que podem ser ligados por um anticorpo ou proteína de fusão contendo uma região Fc variante da invenção, e/ou fundidas de forma recombinante com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante revelada incluem porém não se limitam a, interleucinas 1 a 18, fatores de estimulação de colônia (G- CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferons (IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, etc.), fatores de crescimento (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF, etc.), fatores de necrose tumoral (TNF-alfa e TNF-beta), linfotoxina, eritropoietina, leptina, SCF, TPO, MCAF e BMP.
[00571] Exemplos de quimiocinas que podem ser ligados por um anticorpo ou proteína de fusão contendo uma região Fc variante da invenção, e/ou fundidos de forma recombinante com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante revelada incluem, porém não se limitam a, quimiocinas CC tal como CCL1 a CCL28, quimiocinas CXC tal como CXCL1 a CXCL17, quimiocinas C tais como XCL1 a XCL2, e quimiocinas CX3C tal como CX3CL1.
[00572] Exemplos de receptores que podem ser ligados por um anticorpo ou proteína de fusão contendo uma região Fc variante da invenção, e/ou fundidos de forma recombinante com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante revelada incluem porém não se limitam a, receptores que pertencem a famílias de receptor tais como a família do receptor do fator de crescimento hematopoiético, família do receptor de citoquina, família do receptor do tipo tirosina quinase, família do receptor do tipo serina/treonina quinase, família do receptor TNF, família do receptor acoplado à proteína G, família do receptor do tipo âncora GPI, família do receptor do tipo tirosina fosfatase, família do fator de adesão e família do receptor hormonal. Os receptores que pertencem a essas famílias de receptor e as suas características foram descritas em muitos documentos tais como Cooke , ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV; Patthy (Cell 61(1):13-14 (1990)); Ullrich (Cell 61(2):203-212 (1990)); Massague (Cell 69(6):1067-1070 (1992)); Miyajima et al. (Annu. Rev. Immunol. 10:295-331 (1992)); Taga et al. (FASEB J. 6:3387-3396 (1992)); Fantl et al. (Annu. Rev. Biochem. 62:453-481 (1993)); Smith et al. (Cell 76(6):959-962 (1994)); e Flower (Biochim. Biophys. Acta 1422(3): 207-234 (1999)).
[00573] Exemplos de receptores específicos que pertencem às famílias de receptor mencionadas acima incluem receptores de eritropoietina humana ou de camundongo (EPO) (Jones et al., Blood 76(1):31-35 (1990); D'Andrea et al., Cell 57(2):277-285 (1989)), receptores do fator de estimulação de colônia de granulócito humano ou de camundongo (G-CSF) (Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(22):8702-8706 (1990), mG-CSFR; Fukunaga et al., Cell 61(2): 341350 (1990)), receptores de trombopoietina humana ou de camundongo (TPO) (Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89(12):5640-5644 (1992); Skoda et al., EMBO J. 12(7):2645-2653 (1993)), receptores de insulina humana ou de camundongo (Ullrich et al., Nature 313(6005):756-761 (1985)), receptores do ligante Flt-3 humano ou de camundongo (Small et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(2):459-463 (1994)), receptores do fator de crescimento derivado de plaquetas humanas ou de camundongo (PDGF) (Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85(10):3435-3439 (1988)), receptores de (IFN)-alfa e beta interferon humano ou de camundongo (Uze et al., Cell 60(2): 225-234 (1990); Novick et al., Cell 77(3):391-400 (1994)), receptores de leptina humana ou de camundongo, receptores do hormônio do crescimento humano ou de camundongo (GH), receptores da interleucina (IL)-10 humana ou de camundongo, receptores do fator de crescimento do tipo insulina (IGF)-I humana ou de camundongo, receptores do fator inibidor de leucemia (LIF) humano ou de camundongo e receptores do fator neurotrófico ciliar (CNTF) humano ou de camundongo.
[00574] Antígenos do câncer são antígenos que são expressados como células que se tornam malignas, e elas também são chamadas antígenos específicos de tumor. As cadeias de açúcar anormais que aparecem nas superficies celulares ou moléculas de proteína quando as células se tornam cancerosas também são antígenos do câncer, e elas também são chamadas antígenos do câncer de cadeia de açúcar. Exemplos de antígenos do câncer que podem ser ligados por um anticorpo ou proteína de fusão contendo uma região Fc variante da invenção incluem porém não se limitam a, GPC3 que é um receptor que pertence à família do receptor do tipo âncora GPI mencionado acima e também é expressado em vários cânceres incluindo câncer hepático (Midorikawa et al., Int. J. Cancer 103(4):455-465 (2003)), assim como EpCAM que é expressado em vários cânceres incluindo câncer pulmonar (Linnenbach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1):27-31 (1989)), CA19-9, CA15-3, e SSEA-1 de sialila (SLX).
[00575] Os antígenos MHC são aproximadamente classificados nos antígenos MHC da classe I e antígenos MHC da classe II. Os antígenos MHC da classe I incluem antígenos MHC da classe I HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G e -H, e antígenos MHC da classe II incluem HLA-DR, -DQ e -DP.
[00576] Exemplos dos antígenos de diferenciação que podem ser ligados por um anticorpo ou proteína de fusão contendo uma região Fc variante da invenção, e/ou fundidos de forma recombinante com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante revelada incluem porém não se limitam a, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126 e CDw130.
[00577] Imunoglobulinas incluem IgA, IgM, IgD, IgG e IgE. Os complexos imunes incluem um componente de pelo menos qualquer uma das imunoglobulinas.
[00578] Outros exemplos de antígenos que podem ser ligados por um anticorpo ou proteína de fusão contendo uma região Fc variante da invenção, e/ou fundidos de forma recombinante com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante revelada incluem porém não se limitam a, 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, ativina, ativina A, ativina AB, ativina B, ativina C, ativina RIA, ativina RIA ALK-2, ativina RIB ALK- 4, ativina RIIA, ativina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, peptídeo atrial natriurético, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, fator de estimulação do linfócito B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4, BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, fator neurotrófico derivado de ossos, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator complementar 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno associado ao câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR11, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C- Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado ao tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC- SIGN, fator regulador complementar (fator acelerador Decay), des(1-3)- IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E- selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação do fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF- 19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio estimulador de folículo, fractalquina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio de liberação dohormônio de crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína envelope HCMV gB, glicoproteína envelope HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína do vírus herpes simplex (HSV) gB, glicoproteína HSV gD, HGFA, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA- DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio de crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de ligação IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF- I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (IFN)- alfa, IFN-beta, IFN-gama, inibina, iNOS, cadeia da insulina A, cadeia da insulina B, fator de crescimento 1 do tipo insulina, alfa integrina2, alfa integrina 3, alfa integrina 4, alfa4/beta1 integrina, alfa4/beta7 integrina, alfa5 (alfa V) integrina, alfa5/beta1 integrina, alfa5/beta3 integrina, alfa integrina 6, beta intergrina 1, beta integrina 2, gama interferon , IP-10, I- TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis-Y, antígeno associado Lewis- Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L- selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor beta linfotoxina, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASES, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP- 7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, substância de inibição de Mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Caderina, NCA 90, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4, ou -6, neurturina, fator de crescimento nervoso (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio da paratiroide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placental (PLAP), PIGF, PLP, PP14, proinsulina, prorelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específica da próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, relaxina de cadeia A, relaxina de cadeia B, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, albumina do soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína 72 associada ao tumor), TARC, TCA-3, receptor da célula T (por exemplo, alfa/beta receptor da célula T), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina do tipo testis PLAP, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan específica, TGF-betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF- betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF- beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 do timo, hormônio estimulador da tiroide, Tie, TIMP, TIQ, fator tecidual, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRANCE/RANK ODF, ligante OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (CD30 ligante CD153), TNFSF9 (4-1BB ligante CD137 ligante), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL- R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno CA125 associado a tumor, antígeno que expressam carboidratos associados a Lewis-Y associado a tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, uroquinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE- Caderina, VE-caderina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno viral, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrina, fator von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, A-beta, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado LDL, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, cininogênio de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator tecidual, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, e S1P; e receptores para fatores hormonais e de crescimento.
[00579] Conforme discutido no presente documento, uma ou mais alterações de resíduo de aminoácido são deixadas nas sequências de aminoácido constituindo as regiões variáveis à medida que as suas atividades de ligação ao antígeno sejam mantidas. Quando se altera a sequência de aminoácido de região variável, não há particularmente limitação no sítio de alteração e número de aminoácidos alterados. Por exemplo, os aminoácidos presentes em CDR e/ou FR podem ser alterados adequadamente. Quando se alteram aminoácidos em uma região variável, a atividade de ligação é preferivelmente mantida sem limitação particular; e por exemplo, conforme comparado a alteração anterior, a atividade de ligação pode ser 50% ou mais, 80% ou mais e 100% ou mais. Além disso, a atividade de ligação pode ser aumentada pela alteração dos aminoácidos. Por exemplo, a atividade de ligação pode ser 2, 5, 10 vezes maior do que antes da alteração. A alteração da sequência de aminoácido pode ser pelo menos uma da substituição, adição, deleção e modificação do resíduo de aminoácido.
[00580] Por exemplo, a modificação da glutamina N-terminal de uma região variável no ácido piroglutâmico através da piroglutamilação é uma modificação bem conhecida daqueles versados na técnica. Sendo assim, quando o N terminal de cadeia pesada é glutamine, anticorpos descritos no presente documento podem compreender as regiões variáveis nas quais a glutamina é modificada no ácido piroglutâmico.
[00581] As regiões variáveis de anticorpo descritas no presente documento podem ter quaisquer sequências e elas podem ser regiões variáveis de anticorpo de qualquer origem, tal como anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de cabra, anticorpos de camelo, anticorpos humanizados produzidos pela humanização desses anticorpos não humanos e anticorpos humanos. Além disso, estes anticorpos podem ter várias substituições de aminoácido introduzidas em suas regiões variáveis para melhorar a sua ligação ao antígeno, farmacocinética, estabilidade e imunogenicidade. As regiões variáveis podem ser capzes de ligar antígenos repetidamente devido a sua dependência de pH na ligação ao antígeno (publicação internacional WO 2009/125825).
[00582] A cadeia kappa e a cadeia lambda estão presentes em regiões constantes de cadeia leve de anticorpo e qualquer uma é aceitável. Além disso, elas podem ter alguma alteração dos aminoácidos tais como substituições, deleções, adições e/ou inserções.
[00583] Além disso, os polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes descritas no presente documento podem ser produzidas nas proteínas de fusão Fc ao se ligar a outras proteínas tais como peptídeos fisiologicamente ativos. Tais proteínas de fusão podem ser um multimero de pelo menos dois polipeptídeos compreendendo as regiões Fc variantes. Exemplos das outras proteínas incluem receptores, moléculas de adesão, ligantes e enzimas, porém não se limitam a estas.
[00584] Exemplos de proteínas de fusão Fc incluem proteínas fundidas com uma região Fc a um receptor que se liga a uma molécula alvo, incluindo proteína de fusão Fc-TNFR, proteína de fusão Fc-IL1R, proteína de fusão Fc-VEGFR e proteína de fusão Fc-CTLA4 (Economides et al,. Nat. Med. 9(1):47-52 (2003); Dumont et al., BioDrugs. 20(3):151-60 (2006)). Além disso, as proteínas a serem fundidas podem ser outras moléculas que têm uma atividade de ligação alvo, por exemplo, scFvs (publicação internacional WO 2005/037989), anticorpos de domínio único (publicações internacionais WO 2004/058821; WO 2003/002609), moléculas do tipo anticorpo (Davinder, Curr. Op. Biotech. 17:653-658 (2006); Current Opinion in Biotechnology 18:1-10 (2007); Nygren et al., Curr. Op. Struct. Biol. 7:463-469 (1997); and Hoss. Protein Science 15:14-27 (2006)) tais como DARPins (publicação WO 2002/020565), Affibody (publicação internacional WO 1995/001937), Avimer (publicações internacionais WO 2004/044011; WO 2005/040229), e Adnectina (publicação internacional WO 2002/032925). Além disso, anticorpos e proteínas de fusão Fc podem ser multiespecíficos e podem se ligar a múltiplos tipos de moléculas ou epítopos alvo.
B. Métodos recombinantes e Composições
[00585] Anticorpos podem ser produzidos usando métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descritos na Patente Norte-Americana No.4.816.567. Em uma modalidade, ácido nucleico isolado codificando um anticorpo antimiostatina descrito no presente documento é provido. Em uma outra modalidade, ácido nucleico isolado codificando um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante ou uma região Fc parental descrita no presente documento é provido. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácido compreendendo a VL e/ou uma sequência de aminoácido compreendendo a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma modalidade adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico são providos. Em uma modalidade adicional, uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico é provida. Em uma modalidade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácido compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo a VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucarióticac, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, uma célula Y0, NS0 e Sp20). Em uma modalidade, um método de produção um anticorpo antimiostatina é provido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo, conforme provido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo, e opcionalmente recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira). Em uma outra modalidade, um método de produção de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante ou uma região Fc parental é provido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um polipeptídeo tal como, um anticorpo, região Fc ou região Fc variante, conforme provido acima, sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo, e opcionalmente recuperar o polipeptídeo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).
[00586] Para a produção recombinante de um anticorpo antimiostatina, ácidos nucleicos codificando um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para adicionalmente clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Para a produção recombinante de uma região Fc, ácido nucleico codificando uma região Fc é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser amplamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[00587] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificando anticorpo incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas no presente documento. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmento de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, veja, por exemplo, Patentes Norte- Americanas Nos.5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Veja também, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmento de anticorpos em E. coli.) Depois da expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta de célula bacteriana em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
[00588] Além dos procariotas, os micróbios eucarióticos tais como fungos ou leveduras filamentosos são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão para vetores codificando anticorpo, incluindo cepas de fungo e levedura cujas vias de glicosilação foram "humanizadas" resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Veja Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
[00589] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Os exemplos de células de invertebrado incluem células de planta e inseto. Numerosas cepas bacilovirais foram identificadas as quais podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[00590] As culturas de célula de planta também podem ser utilizadas como hospedeiras. Veja, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos.5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas).
[00591] As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares de hospedeiro de mamífero úteis são a linhagem CV1 renal de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem renal embrionária humana (células 293 ou 293 conforme descritas, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células renais de bebê hamster (BHK); células sertoli de camundongo (células TM4 conforme descritas, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células renais de macaco (CV1); células renais de macaco verde Africano (VERO-76); células de carcinoma humano cervical (HELA); células renais de canino (MDCK; células hepaticas de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células hepáticas humanas (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); TRI cells, conforme descritas, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares de hospedeiro mamífero úteis incluem células de ovário do hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares de hospedeiro mamífero adequadas para a produção de anticorpo, veja, por exemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
[00592] Anticorpos com características dependentes de pH podem ser obtidos usando métodos de rastreamento e/ou métodos de mutagênese por exemplo, conforme descrito na publicação internacional 2009/125825. Os métodos de rastreamento podem compreender qualquer processo pelo qual um anticorpo tendo características de ligação dependente de pH é identificado dentro de uma população de anticorpos específicos para um antígeno específico. Em certas modalidades, os métodos de rastreamento podem compreender medir um ou mais parâmetros de ligação (por exemplo, KD ou kd) de anticorpos individuais dentro de uma população inicial de anticorpos ambos em pH acídico e pH neutro. Os parâmetros de ligação dos anticorpos podem ser medidos usando, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, ou qualquer outro método analítico que permite a avaliação quantitativa ou qualitativa das características de ligação de um anticorpo para um antígeno específico. Em certas modalidades, os métodos de rastreamento podem compreender identificar um anticorpo que se liga a um antígeno com uma razão de KD acídico/neutro de 2 ou maior. Em modalidades adicionais, os métodos de rastreamento podem compreender identificar um anticorpo que se liga a um antígeno com uma razão de KD com pH5,8/pH7,4 de 2 ou maior. Alternadamente, os métodos de rastreamento podem compreender identificar um anticorpo que se liga a um antígeno com uma razão de kd acídico/neutro de 2 ou maior. Em modalidades adicionais, os métodos de rastreamento podem compreender identificar um anticorpo que se liga a um antígeno com uma razão kd com pH5,8/pH7,4 de 2 ou maior.
[00593] Em uma outra modalidade, os métodos de mutagênese podem compreender incorporar uma deleção, substituição ou adição de um aminoácido dentro da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo para aumentar a ligação dependente de pH do anticorpo a um antígeno. Em certas modalidades, a mutagênese pode ser realizada dentro de um ou mais domínios variáveis do anticorpo, por exemplo, dentro de uma ou mais HVRs (por exemplo, CDRs). Por exemplo, a mutagênese pode compreender substituir um aminoácido dentro de uma ou mais HVRs (por exemplo, CDRs) do anticorpo com um outro aminoácido. Em certas modalidades, a mutagênese pode compreender substituir um ou mais aminoácidos em pelo menos uma HVR (por exemplo, CDR) do anticorpo com a histidina. Em certas modalidades, a "ligação dependente de pH melhorada" significa que a versão mutada do anticorpo exibe uma razão de KD acídica/neutra maior, ou uma razão de kd acídica/neutra maior, do que a versão original "parental" (isto é, a menos dependente de pH) do anticorpo antes da mutagênese. Em certas modalidades, a versão mutada do anticorpo tem uma razão de KD acídica/neutra de 2 ou maior. Em certas modalidades, a versão mutada do anticorpo tem uma razão de KD com pH5,8/pH7,4 de 2 ou maior. Alternadamente, a versão mutada do anticorpo tem uma razão kd acídica/neutra de 2 ou maior. Em modalidades adicionais, a versão mutada do anticorpo tem uma razão de kd com pH5,8/pH7,4 de 2 ou maior.
[00594] Anticorpos policlonais são preferivelmente desenvolvidos em animais através de injeções subcutâneoas (sc) ou intraperitoneais (ip) múltiplas do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante em uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina do soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes.
[00595] Animais (geralmente mamíferos não humanos) são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados através da combinação, por exemplo, 100 microg ou 5 microg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução de forma intradérmica em múltiplos sítios. Um mês mais tarde, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é ensaiado para o título de anticorpo. Os animais são estimulados até o platô do título. Preferivelmente, o animal é estimulado com o conjugado do mesmo antígeno, porém conjugado em uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação. Os conjugados também podem ser produzidos em cultura celular recombinante como fusões de proteína. Além do mais, os agentes agregatórios tal como alumínio são adequadamente usados para melhorar a resposta imune.
[00596] Anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mutações possíveis que ocorrem naturalmente e/ou modificações pós-translacionais (por exemplo, isomerizações, amidações) que podem estar presentes em quantidades menores. Sendo assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.
[00597] Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando o método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256(5517):495-497 (1975). No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro adequsdo, tal como um hamster, é imunizado como acima descrito para elicitor linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para a imunização. Alternadamente, os linfócitos podem ser imunizados vitro.
[00598] O agente imunizante tipicamente incluirá a proteína antigênica ou uma variante de fusão da mesma. Geralmente, os linfócitos de sangue periférico (PBLs) são tanto usados caso as células de origem humana sejam desejadas ou células de baço ou de linfonodo sejam usadas caso as fontes de mamífero não humano sejam desejadas. Os linfócitos são então fundidos com uma linhagem celular imortalizada usando um agente de focalização adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103).
[00599] As linhagens celulares imortalizadas são geralmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origem de roedor, bovino e humana. Geralmente, as linhagens celulares de mieloma de rato ou camundongo são empregadas. As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e desenvolvidas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém ums ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais, não fundidas. Por exemplo, caso as células de mieloma parentais careçam da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluem tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), as quais são substâncias que previnem o crescimento de células deficientes de HGPRT.
[00600] As células de mieloma imortalizadas preferidas são aquelas que fundem eficientemente, sustentam a produção estável de alto nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT. Dentre estas, as linhagens de mieloma de murino são as preferidas, tais como aquelas derivadas de tumors de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, e células SP-2 (e derivados dos mesmos, por exemplo, X63-Ag8-653) disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas, Virginia USA. As linhagens celulares de heteromieloma de camundongo-humano e de mieloma humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor et al. J. Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)).
[00601] O meio de cultura no qual as células de hibridoma são desenvolvidas para a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada pela imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade de ligação pode ser determinada pela análise Scatchard de Munson, Anal. Biochem. 107(1):220-239 (1980).
[00602] Depois das células de hibridoma serem identificadas as quais produzem anticorpos da especifidade, afinidade e/ou atividade de afinidade, os clones podem ser subclonados pela limitação dos procedimentos de diluição e desenvolvidos por métodos padrão (Goding, supra). Os meios de cultura adequados para esta finalidade incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser desenvolvidas in vivo como tumores em um mamífero.
[00603] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados a partir do meio de cultura, o fluido ascítico ou soro através de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencional tais como, por exemplo, A-Sefarose de proteína, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.
[00604] Anticorpos podem ser produzidos através da imunização de um animal hospedeiro adequado contra um antígeno. Em uma modalidade, o antígeno é um polipeptídeo compreendendo a miostatina de comprimento total. Em uma modalidade, o antígeno é um polipeptídeo compreendendo miostatina latente. Em uma modalidade, o antígeno é um polipeptídeo compreendendo um propeptídeo de miostatina. Em uma modalidade, o antígeno é um polipeptídeo compreendendo a região que corresponde aos aminoácidos nas posições 21 a 100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78). Em uma modalidade, o antígeno é um polipeptídeo compreendendo aminoácidos nas posições 21-80, 41-100, 21-60, 41-80, 61-100, 21-40, 41-60, 61-80 ou 81-100 do propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78). Também incluídos na presente invenção estão os anticorpos produzidos através da imunização de um animal contra o antígeno. Os anticorpos podem incorporar qualquer uma das características, sozinhos ou em combinação, conforme descrito em "Anticorpos Antimiostatina Exemplificadores" acima.
[00605] Uma região Fc pode ser obtida pela eluição adicional da fração adsorvida na coluna da proteína A depois de digerir parcialmente os anticorpos monoclonais de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou tais usando uma tal como pepsina. A protease não é particularmente limitada à medida que ela pode digerir um anticorpo de comprimento total de modo que Fab e F(ab')2 serão produzidos de uma forma restritiva ao ajustar adequadamente as condições da reação enzimática tal como pH, e exemplos incluem pepsina e papaína.
[00606] Além disso, a presente invenção provê um método para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorada em comparação com um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental, a qual compreende introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental. Em alguns aspectos, o polipeptídeo produzido é um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo é um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado. Em alguns aspectos, o polipeptídeo produzido é uma proteína de fusão Fc.
[00607] Em certas modalidades, o método de produção compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir as atividades de ligação a RIIb gama de Fc de macaco do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com a atividade de ligação a RIIb gama de Fc de macaco melhorada em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00608] Em certas modalidades, o método de produção compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir as atividades de ligação a RIIIa gama de Fc de macaco do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIIa gama de Fc de macaco diminuída em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00609] Em certas modalidades, o método de produção compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir as atividades de ligação da RIIb gama de Fc humano do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc humano melhorada em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00610] Em certas modalidades, o método de produção compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir as atividades de ligação a RIIIa gama de Fc humano do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIIa gama de Fc humano diminuída em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00611] Em certas modalidades, o método de produção compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir as atividades de ligação a RIa gama de Fc humano (tipo H) do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIa gama de Fc humano diminuída (tipo H) em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00612] Em certas modalidades, o método de produção compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos uma alteração do aminoácido na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir as atividades a RIa gama de Fc humano (tipo R) do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIa gama de Fc humano diminuída (tipo R) em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00613] Em um aspecto, pelo menos um aminoácido é alterado no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00614] Em um outro aspecto, um aminoácido é alterado no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, na posição 236.
[00615] Em um outro aspecto, pelo menos dois aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, as alterações compreendendo: (a) uma alteração do aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334 e 396, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, A RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00616] Em um outro aspecto, pelo menos dois aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, as alterações compreendendo: (a) uma alteração do aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330 e 396, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00617] Em um outro aspecto, pelo menos dois aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, as alterações compreendendo: (a) uma alteração do aminoácido na posição 236, e (b) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 268, 295, 326 e 330, de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00618] Em um outro aspecto, os aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, nas posições de qualquer uma das que seguem (1)-(37): (1) nas posições 231, 236, 239, 268 e 330; (2) nas posições 231, 236, 239, 268, 295 e 330; (3) nas posições 231, 236, 268 e 330; (4) nas posições 231, 236, 268, 295 e 330; (5) nas posições 232, 236, 239, 268, 295 e 330; (6) nas posições 232, 236, 268, 295 e 330; (7) nas posições 232, 236, 268 e 330; (8) nas posições 235, 236, 268, 295, 326 e 330; (9) nas posições 235, 236, 268, 295 e 330; (10) nas posições 235, 236, 268 e 330; (11) nas posições 235, 236, 268, 330 e 396; (12) nas posições 235, 236, 268 e 396; (13) nas posições 236, 239, 268, 295, 298 e 330; (14) nas posições 236, 239, 268, 295, 326 e 330; (15) nas posições 236, 239, 268, 295 e 330; (16) nas posições 236, 239, 268, 298 e 330; (17) nas posições 236, 239, 268, 326 e 330; (18) nas posições 236, 239, 268 e 330; (19) nas posições 236, 239, 268, 330 e 396; (20) nas posições 236, 239, 268 e 396; (21) nas posições 236 e 268; (22) nas posições 236, 268 e 295; (23) nas posições 236, 268, 295, 298 e 330; (24) nas posições 236, 268, 295, 326 e 330; (25) nas posições 236, 268, 295, 326, 330 e 396; (26) nas posições 236, 268, 295 e 330; (27) nas posições 236, 268, 295, 330 e 396; (28) nas posições 236, 268, 298 e 330; (29) nas posições 236, 268, 298 e 396; (30) nas posições 236, 268, 326 e 330; (31) nas posições 236, 268, 326, 330 e 396; (32) nas posições 236, 268 e 330; (33) nas posições 236, 268, 330 e 396; (34) nas posições 236, 268 e 396; (35) nas posições 236 e 295; (36) nas posições 236, 330 e 396; and (37) nas posições 236 e 396; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00619] Em um aspecto adicional, uma alteração do aminoácido no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é selecionado em cada posição a partir do grupo consistindo em: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 231; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 232; (c) Asp na posição 233; (d) Trp, Tyr na posição 234; (e) Trp na posição 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val na posição 236; (g) Asp, Tyr na posição 237; (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr na posição 238; (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val na posição 239; (j) Ile na posição 264; (k) Phe na posição 266; (l) Ala, His, Leu na posição 267; (m) Asp, Glu na posição 268; (n) Asp, Glu, Gly na posição 271; (o) Leu na posição 295; (p) Leu na posição 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu na posição 325; (r) Thr na posição 326; (s) Ile, Asn na posição 327; (t) Thr na posição 328; (u) Lys, Arg na posição 330; (v) Glu na posição 331; (w) Asp na posição 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr na posição 334; e (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr na posição 396; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00620] Em um aspecto adicional, uma alteração do aminoácido no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é selecionado em cada posição a partir do grupo consistindo em: (a) Gly, Thr na posição 231; (b) Asp na posição 232; (c) Trp na posição 235; (d) Asn, Thr na posição 236; (e) Val na posição 239; (f) Asp, Glu na posição 268; (g) Leu na posição 295; (h) Leu na posição 298; (i) Thr na posição 326; (j) Lys, Arg na posição 330, and (k) Lys, Met na posição 396; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00621] Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asn na posição 236, Glu na posição 268, Lys na posição 330, e Met na posição 396; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asn na posição 236, Asp na posição 268, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asn na posição 236, Asp na posição 268, Leu na posição 295, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Thr na posição 236, Asp na posição 268, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asn na posição 236, Asp na posição 268, Leu na posição 295, Thr na posição 326, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Trp na posição 235, Asn na posição 236, Asp na posição 268, Leu na posição 295, Thr na posição 326, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU.
[00622] Em um aspecto, pelo menos um aminoácido é alterado no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 234, 238, 250, 264, 267, 307 e 330 de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00623] Em um outro aspecto, um aminoácido é alterado no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, na posição 238.
[00624] Em um outro aspecto, pelo menos dois aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, as alterações compreendendo: (i) uma alteração do aminoácido na posição 238, e (ii) pelo menos uma alteração do aminoácido de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: 234, 250, 264, 267, 307 e 330 de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00625] Em um outro aspecto, os aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, nas posições de qualquer uma das que seguem (1)-(9): (1) nas posições 234, 238, 250, 307 e 330; (2) nas posições 234, 238, 250, 264, 307 e 330; (3) nas posições 234, 238, 250, 264, 267, 307 e 330; (4) nas posições 234, 238, 250, 267, 307 e 330; (5) nas posições 238, 250, 264, 307 e 330; (6) nas posições 238, 250, 264, 267, 307 e 330; (7) nas posições 238, 250, 267, 307 e 330; (8) nas posições 238, 250 e 307; e (9) nas posições 238, 250, 307 e 330; de acordo com Numeração EU.
[00626] Em um aspecto adicional, uma alteração do aminoácido no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é selecionado em cada posição a partir do grupo consistindo em: (a) Tyr na posição 234; (b) Asp na posição 238; (c) Val na posição 250; (d) Ile na posição 264; (e) Ala na posição 267; (f) Pro na posição 307; e (g) Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asp na posição 238; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asp na posição 238, Val na posição 250, e Pro na posição 307; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asp na posição 238, Val na posição 250, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asp na posição 238, Val na posição 250, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com atividade de ligação a RIIb gama de Fc melhorado, é: Tyr na posição 234, Asp na posição 238, Val na posição 250, Ile na posição 264, Ala na posição 267, Pro na posição 307, e Lys na posição 330; de acordo com Numeração EU. Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc de macaco cinomolgo (SEQ ID NO:223). Em certas modalidades, a RIIb gama de Fc tem a sequência de RIIb gama de Fc humano (por exemplo, SEQ ID NOS:212, 213 ou 214).
[00627] Além disso, a presente invenção provê um método para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado em comparação com um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental, que compreende introduzir pelo menos duas alterações dos aminoácidos na região Fc parental.
[00628] Em certas modalidades, o método de produção para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provido no presente documento compreende as etapas que seguem: (a) preparar um polipeptídeo compreendendo a região Fc parental; (b) introduzir pelo menos duas alterações dos aminoácidos na região Fc parental dentro do polipeptídeo; (c) medir os pIs do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc na etapa (b); e (d) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado em comparação com o polipeptídeo correspondente compreendendo a região Fc parental.
[00629] Em um aspecto, pelo menos dois aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 e 431, de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo produzido compreende uma região Fc variante com pl aumentado, de pelo menos duas posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402 e 413, de acordo com Numeração EU.
[00630] Em um outro aspecto, os aminoácidos são alterados no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, nas posições de qualquer uma das que seguem (1)-(10): (1) nas posições 311 e 341; (2) nas posições 311 e 343; (3) nas posições 311, 343 e 413; (4) nas posições 311, 384 e 413; (5) nas posições 311 e 399; (6) nas posições 311 e 401; (7) nas posições 311 e 413; (8) nas posições 400 e 413; (9) nas posições 401 e 413; e (10) nas posições 402 e 413; de acordo com Numeração EU.
[00631] Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 400 e Lys na posição 413; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 311 e Lys na posição 413; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 311 e Arg na posição 399; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 311 e Arg na posição 343; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 311 and Arg na posição 413; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 311, Arg na posição 343, e Arg na posição 413; de acordo com Numeração EU. Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é: Arg na posição 311, Arg na posição 384, e Arg na posição 413; de acordo com Numeração EU.
[00632] Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com pl aumentado, é selecionada a partir de Lys ou Arg em cada posição.
[00633] Em um aspecto adicional, a alteração dos aminoácidos nos métodos de produção mencionados acima é selecionada a partir de qualquer alteração única, combinação de alterações únicas, ou combinação de alterações descrita nas Tabelas 14-30.
[00634] Opcionalmente, as etapas adicionais que seguem podem ser incluídas no método mencionado acima para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante, quando o polipeptídeo ainda compreende um domínio de ligação ao antígeno: (e) avaliar a farmacocinética do antígeno no plasma, depois da administração do polipeptídeo compreendendo a região Fc parental e o polipeptídeo compreendendo a região Fc variante em animais tais como camundongos, ratos, coelhos, cães, macacos e humanos; e (f) selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante com capacidade aumentada da eliminação de antígeno a partir de plasma em comparação com o polipeptídeo compreendendo a região Fc parental.
[00635] Polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante produzidos por qualquer um dos métodos mencionados acima ou outros métodod conhecidos na técnica são incluídos na presente invenção.
C. Ensaios
[00636] Anticorpos antimiostatina providos no presente documento podem ser identificados, rastreados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
[00637] Regiões Fc variantes providas no presente documento podem ser identificadas, rastreadas ou caracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios descritos no presente documento ou de outra forma conhecidos na técnica.
1. Ensaios de ligação e outros ensaios
[00638] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado por sua atividade de ligação ao antígeno, através de métodos conhecidos tais como ELISA, Western blot, BIACORE (marca registrada), etc. Em um aspecto, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção é testado por sua atividade de ligação ao receptor Fc, através de métodos conhecidos tais como BIACORE (marca registrada), etc.
[00639] Em um outro aspecto, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete por ligação à miostatina com qualquer anticorpo antimiostatina descrito no presente documento. Em certas modalidades, quando tal anticorpo competidor está presente em excesso, ele bloqueia (por exemplo, reduz) a ligação do anticorpo de referência à miostatina em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais. Em alguns exemplos, a ligação é inibida em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais. Em certas modalidades, tal anticorpo competidor que se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou um epítopo conformacional) que está ligado por um anticorpo antimiostatina descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo antimiostatina descrito nas Tabelas 2a, 11a ou 13). Em aspectos adicionais, o anticorpo de referência tem um par VH e VL descrito na Tabela 2a, 11a ou 13. Os métodos exemplificadores detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são providos em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[00640] Em um ensaio de competição exemplificador, a miostatina latente imobilizada ou o propeptídeo de miostatina é incubado em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga à miostatina e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado por sua capacidade em competir com o primeiro anticorpo para ligação à miostatina. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como um controle, a miostatina imobilizada é incubada em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, porém não o segundo anticorpo não marcado. Depois da incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo à miostatina, o anticorpo não ligado em excesso é removido e a quantidade de marcador associado com a miostatina imobilizada é medida. Caso a quantidade de marcador associado com miostatina imobilizada seja substancialmente reduzida na amostra teste relativa à amostra de controle, depois que indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação à miostatina. Veja, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[00641] Ensaios para determinar a atividade de ligação de um polipeptídeo contendo uma região Fc variante em relação a um ou mais dos membros da família R gama de Fc são descritos no presente documento ou de outra forma conhecidos na técnica. Tais ensaios de ligação incluem porém não se limitam a análise BIACORE (marca registrada), que utiliza o fenômeno da ressonância plasmônica de superfície (SPR), rastreamento de Ensaio homogêneo de proximidade amplificada luminescente (ALPHA), ELISA e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11): 4005-4010).
[00642] Em uma modalidade, a análise BIACORE (marca registrada) pode ser usada para avaliar se a atividade de ligação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante está aumentada ou mantida ou diminuída com relação a um membro da família R gama de Fc específico. Por exemplo, ao observer se há uma diminuição ou um aumento no valor da constante de dissociação (KD) obtido a partir da análise de sensorgrama, onde vários Rs gama de Fc são submetidos à interação como um analito com polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante imobilizada ou capturada no chip sensor usando métodos conhecidos e reagentes tais como Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos de cadeia anti-lamda, anticorpos de cadeia anti-kappa, peptídeos antigênicos, proteínas antigênicas). Alterações na atividade de ligação também podem ser determinadas ao se comparer mudanças no valor da unidade de ressonância (RU) no sensorgrama antes ou depois que um ou mais tipos de Rs gama de Fc são submetidos à interação como analitos com os polipeptídeos capturados compreendendo a região Fc variante. Alternadamente, R gama de Fc pode ser imobilizada ou capturada nos chips sensores e os polipeptídeos compreendendo a região Fc variante são usados como um analito.
[00643] Na análise BIACORE (marca registrada), uma das substâncias (o ligante) em observação de uma interação é imobilizada em uma película fina de ouro em um chip sensor, e ao cintilar a luz a partir do lado reverse do chip sensor de modo que a reflexão total aconteça na interface entre a película fina de ouro e vidro, uma porção de intensidade de reflexão reduzida é formada na luz reletida (sinal SPR). Quando a outra das substâncias (o analito) em observação de uma interação é feita flutuar na superfície do chip sensor e o ligante se liga ao analito, a massa da molécula ligante imobilizada aumenta e o índice refrativo do solvente na superfície do chip sensor muda. A posição das mudanças do sinal SPR como um resultado desta mudança no índice refrativo (por outro lado, a posição do sinal retorna quando esta ligação se dissocia). O sistema BIACORE (marca registrada) indica a quantidade de mudança mencionada acima ou mais especificamente o tempo variável de massa ao diagramar a mudança em massa na superfície do chip sensor na ordenada como os dados de medição (sensorgrama). A quantidade de analito ligado ao ligante preso na superfície do chip sensor é determinada a partir do sensorgrama. Os parâmetros cinéticos tais como constantes de taxa de associação (ka) e constantes de taxa de dissociação (kd) são determinados a partir das curvas do sensorgrama, e as constantes de dissociação (KD) são determinadas a partir da razão destas constantes. No método BIACORE (marca registrada), um método para medir a inibição é preferivelmente usado. Um exemplo do método para medir a inibição é descrito em Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11):4005-4010 (2006).
[00644] O rastreamento ALPHA é realizado pela tecnologia ALPHA a qual usa duas esferas, uma doadora e uma aceitadora, com base nos princípios que seguem. Os sinais luminescentes são detectados apenas quando as moléculas ligadas a esferas doadoras interagem fisicamente com moléculas ligadas a esferas aceitadoras e as duas esferas estão em proximidade uma com a outra. O fotossensibilizador excitado a laser nas esferas doadoras converte o oxigênio do ambiente em oxigênio singleto no estado excitado. O oxigênio singleto é dispersado em torno das esferas doadoras e quando ele alcança as esferas aceitadoras adjacentes, a reação quimioluminescente é induzida nas esferas e a luz é finalmente emitida. Quando as moléculas ligadas a esferas doadoras não interagem com as moléculas ligadas às esferas aceitadoras, a reação quimioluminescente não acontece devido ao oxigênio singleto produzido pelas esferas doadoras não alcançar as esferas aceitadoras.
[00645] Por exemplo, um complexo de polipeptídeo biotinilado está ligado a esferas doadoras e o receptor gama de Fc marcado com glutationa S transferase (GST) está ligado a esferas aceitadoras. Na ausência de um complexo de polipeptídeo competidor compreendendo uma região Fc variante, o complexo de polipeptídeo compreendendo a região Fc parental interage com o receptor gama de Fc e produz sinais de 520-620 nm. O complexo de polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante não marcada compete com o complexo de polipeptídeo compreendendo a região Fc parental para a interação com o receptor gama de Fc. As atividades de ligação relativas podem ser determinadas pela quantificação da diminuição em fluorescência observada como um resultado da competição. A biotinilação do complexo de polipeptídeos tais como anticorpos usando Sulfo-NHS- biotina e tais é bem conhecida. O método de expressão do receptor gama de Fc e GST em uma célula que carrega um gene de fusão produzido pela fusão de um polinucleotídeo codificando o receptor gama de Fc em estrutura com um polinucleotídeo codificando GST em um vetor expressível, e realizando a purificação usando uma coluna de glutationa é adequadamente adotado como um método para marcar um receptor gama de Fc com GST. Os sinais obtidos são preferivelmente analisados, por exemplo, ao ajustá-los em um modelo de competição de um sítio o qual usa uma análise de regressão não linear usando software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
[00646] Uma região Fc variante with atividade de ligação a R gama de Fc diminuída se refere a uma região Fc que se liga a R gama de Fc com atividade de ligação essencialmente mais fraca do que a região Fc parental quando os ensaios são realizados usando substancialmente a mesma quantidade de uma região Fc parental correspondente e uma região Fc variante. Além disso, uma região Fc variante com atividade de ligação a R gama de Fc aumentada se refere a uma região Fc que se liga a R gama de Fc com a atividade de ligação essencialmente mais forte do que a região Fc parental correspondente quando os ensaios são realizados usando substancialmente a mesma quantidade de uma região Fc parental e uma região Fc variante. Uma região Fc variante com atividade de ligação a R gama de Fc mantida se refere a uma região Fc que se liga a R gama de Fc com a atividade de ligação equivalente ou essencialmente não diferente daquela de uma região Fc parental quando ensaios são realizados usando substancialmente a mesma quantidade da região Fc parental correspondente e o polipeptídeo contendo a região Fc variante.
[00647] A relação se as atividades de ligação de uma região Fc em relação a várias Rs gama de Fc foram aumentadas ou diminuídas pode ser determinada a partir do aumento ou diminuição em uma quantidade de ligação das várias Rs gama de Fc à região Fc, que foram determinadas de acordo com o método de medição mencionado acima. Aqui, a quantidade de ligação das várias Rs gama de Fc à região Fc pode ser avaliada como um valor obtido através da divisão da diferença nos valores RU dos sensorgramas que mudaram antes e depois da interação de várias Rs gama de Fc como o analito com a região Fc, pela diferença nos valores RU de sensorgramas que mudaram antes e depois de capturar as regiões Fcs nos chips sensores.
[00648] Na presente invenção, a atividade de ligação a RIIb gama de Fc aumentada preferivelmente significa, por exemplo, que a razão de [Valor de KD de uma região de Fc parental para RIIb gama de Fc]/[Valor de KD de uma região Fc variante para RIIb gama de Fc] nos valores KD medidos pelo método de medição mencionado acima preferivelmente se torna 2,0 ou maior, 3.0 ou maior, 4.0 ou maior, 5,0 ou maior, 6.0 ou maior, 7.0 ou maior, 8.0 ou maior, 9.0 ou maior, 10 ou maior, 15 ou maior, 20 ou maior, 25 ou maior, 30 ou maior, 35 ou maior, 40 ou maior, 45 ou maior, ou ainda 50 ou maior, 55 ou maior, 60 ou maior, 65 ou maior, 70 ou maior, 75 ou maior, 80 ou maior, 85 ou maior, 90 ou maior, 95 ou maior, ou 100 ou maior.
[00649] O valor de KD (mol/L) de uma região Fc variante decrito no presente documento para RIIb gama de Fc é preferivelmente menor do que aquele da região Fc parental para RIIb gama de Fc, e pode ser, por exemplo, 2.0x10-6 M ou menor, 1.0x10-6 M ou menor, 9.0x10-7 M ou menor, 8.0x10-7 M ou menor, 7.0x10-7 M ou menor, 6.0x10-7 M ou menor, 5.0x10-7 M ou menor, 4.0x10-7 M ou menor, 3.0x10-7 M ou menor, 2.0x10-7 M ou menor, 1.0x10-7 M ou menor, 9.0x10-8 M ou menor, 8.0x10-8 M ou menor, 7.0x10-8 M ou menor, 6.0x10-8 M ou menor, 5.0x10-8 M ou menor.
[00650] Além disso, uma região Fc variante com seletividade de ligação aumentada a RIIb gama de Fc comparada a RIIa gama de Fc se refere a uma região Fc onde: (a) atividade de ligação a RIIb gama de Fc é aumentada, e atividade de ligação a RIIa gama de Fc é mantida ou diminuída; (b) atividade de ligação a RIIb gama de Fc é aumentada e a atividade de ligação a RIIa gama de Fc também é aumentada, porém o grau de aumento da atividade de ligação a RIIa gama de Fc é menor do que o grau de aumento da atividade de ligação a RIIb gama de Fc; ou (c) atividade de ligação a RIIb gama de Fc é diminuída e atividade de ligação a RIIa gama de Fc também é diminuída, porém o grau de diminuição da atividade de ligação a RIIb gama de Fc é menor do que o grau de diminuição da atividade de ligação a RIIa gama de Fc. A relação se uma região Fc variante melhorou ou não a seletividade de ligação por RIIb gama de Fc em vez daquela por RIIa gama de Fc pode ser determinada, por exemplo, ao comparar a razão do valor de KD para RIIa gama de Fc ao valor de KD para RIIb gama de Fc da região Fc variante (a razão de [Valor de KD de uma região Fc variante para RIIa gama de Fc]/[Valor de KD de uma região Fc variante para RIIb gama de Fc]), com a razão do valor de KD para RIIa gama de Fc ao valor de KD para RIIb gama de Fc da região Fc parental (a razão de [Valor de KD da região Fc parental para RIIa gama de Fc]/[Valor de KD da região Fc parental para RIIb gama de Fc]), que são determinados de acordo com os exemplos mencionados aima. Especificamente, quando a razão de KD para a região Fc variante é maior do que aquela da região Fc parental, a região Fc variante pode ser determinada para ter uma seletividade de ligação melhorada por RIIb gama de Fc em vez de para RIIa gama de Fc em comparação com a região Fc parental. Especialmente em humanos, a atividade de ligação a RIIb gama de Fc é provável a correlacionar com a atividade de ligação a RIIa gama de Fc (tipo R) do que a RIIa gama de Fc (tipo H) uma vez que a sequência de aminoácido de RIIb gama de Fc compartilha maior identidade com RIIa gama de Fc (tipo R) do que a RIIa gama de Fc (tipo H). Deste modo, encontrar a alteração do(s) aminoácido(s) que podem aumentar a seletividade de ligação a RIIb gama de Fc humano comparada a RIa gama de Fc humano (tipo R) é importante para aumentar a seletividade de ligação a RIIb gama de Fc comparada a RIIa gama de Fc em humanos.
[00651] Quando uma região Fc variante da presente invenção tem maior atividade de ligação contra RIIb gama de Fc e menor atividade de ligação contra RIII gama de Fc (tal como RIIIa gama de Fc ou RIIIb gama de Fc) comparada àquela da região Fc parental, a região Fc variante pode ser entendida como específica da RIIb gama de Fc. 2. Ensaios de atividade
[00652] Em um aspecto, os ensaios são providos para identificar anticorpos antimiostatina tendo atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, inibir a ativação de miostatina, bloquear a liberação de miostatina madura a partir da miostatina latente, inibir a clivagem proteolítica de miostatina latente, bloquear o acesso da protease à miostatina latente, etc. Anticorpos tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro também são providos. Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é testado por tal atividade biológica.
[00653] Em certas modalidades, determina-se se um anticorpo teste inibe a clivagem de miostatina latente através da detecção do produto de clivagem de miostatina latente (miostatina) usando um método conhecido na técnica tal como eletroforese, cromatografia, análise imunoblot, um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ou espectrometria de massa, depois uma protease que pode clivar a miostatina latente é contactada com a miostatina latente na presença ou ausência do anticorpo teste (veja, por exemplo, Thies et al., Growth Factors 18(4):251-259 (2001)). No local onde uma quantidade diminuída do produto de clivagem de miostatina latente (por exemplo, propeptídeo de miostatina humana) é detectada na presença de (ou seguindo o contato com) o anticorpo teste, o anticorpo teste é identificado como um anticorpo que pode inibir a clivagem de miostatina latente. Em certas modalidades, determina-se se um anticorpo teste bloqueia o acesso de uma protease à miostatina latente através dos métodos para a detecção das interações de proteína entre a protease e a miostatina latente, por exemplo, ELISAs ou BIACORE (marca registrada). No local onde uma interação diminuída entre a protease e miostatina latente é detectada na presença de (ou segundo contato com) o anticorpo teste, o anticorpo teste é identificado como um anticorpo que pode bloquear o acesso da protease à miostatina latente.
[00654] Em certas modalidades, determina-se se um anticorpo teste bloqueia a liberação da miostatina madura a partir da miostatina latente através da detecção da atividade da miostatina madura, por exemplo, a atividade de ligação a um receptor de miostatina, ou a atividade de mediação da transdução de sinal em uma célula que expressa um receptor de miostatina (por exemplo, ActRIIb). As células úteis para tal ensaio podem ser aquelas que expressam um receptor de miostatina endógeno, por exemplo, miócitos L6, ou podem ser aqueles que são geneticamente modificados, de forma transitória ou estável, para expressar um transgene codificando um receptor de miostatina, por exemplo, um receptor de ativina tal como receptor de ativina tipo II (Thies et al, Supra). A ligação de miostatina a um receptor de miostatina pode ser detectada usando um ensaio de ligação ao receptor. A transdução de sinal mediada por miostatina pode ser detectada em qualquer nível na via de transdução de sinal, por exemplo, ao examinar a fosforilação de um polipeptídeo Smad, examinar a expressão de um gene regulado de miostatina incluindo um gene repórter ou medir a proliferação da célula dependente de miostatina. No local onde uma atividade da miostatina Madura diminuída é detectada na presença de (ou seguindo contato com) o anticorpo teste, o anticorpo teste é identificado como um anticorpo que pode bloquear a liberação de miostatina madura a partir da miostatina latente.
[00655] A inibição da ativação da miostatina também pode ser detectada e/ou medida usando os métodos expostos e exemplificdos nos exemplos de trabalho. Ao usar os ensaios destes ou outros tipos adequados, os anticorpos teste podem ser rastreados a partir daqueles capazes de inibir a ativação de miostatina. Em certas modalidades, a inibição da ativação da miostatina inclui pelo menos uma diminuição 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% ou maior na ativação da miostatina no ensaio quando se compara a um controle negativo sob condições similares. Em algumas modalidades, ela se refere à inibição da ativação da miostatina em pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou maior.
[00656] Em um outro aspecto, os ensaios para identificar anticorpos antimiostatina que formam um complexo imune (isto é, um complexo de antígeno-anticorpo) com miostatina são providos. Os anticorpos tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro também são providos.
[00657] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é testado para tal atividade biológica.
[00658] Em certas modalidades, a formação de um complexo imune é avaliada por um método tal como cromatografia por exclusão de tamanho (filtração em gel), ultracentrifugação, dispersão de luz, microscópio eletrônico ou espectrometria de massa (Mol. Immunol. 39:77-84 (2002), Mol. Immunol. 47:357-364 (2009)). Esses métodos faze muso da propriedade de que um complexo imune é uma molécula maior do que um anticorpo sozinho ou um antígeno sozinho. Quando um complexo grande contendo dois ou mais anticorpos e dois ou mais antígenos (por exemplo, moléculas de miostatina) é detectado na presença de um anticorpo teste e um antígeno, o anticorpo teste é identificado como um anticorpo que pode formar um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos e duas ou mais moléculas de miostatina. Em uma outra modalidade, a formação de um complexo imune é avaliada por um método tal como, ELISA, FACS ou SPR (ensaio de ressonância plamônica de superfície; por exemplo, usando BIACORE (marca registrada)) (Shields et al., J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604 (2001); Singh et al., J. Immunol. Methods 50:109-114 (1982); Suzuki et al., J. Immunol. 184(4):1968-1976 (2010); Luo et al., mAbs 1(5):491-504 (2009)). Esses métodos fazem uso da propriedade de que um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos e dois ou mais antígenos podem se ligar mais fortemente a um receptor Fc ou um componente complementar do que um anticorpo ou antígeno sozinho. Quando se detecta uma ligação aumentada a um receptor Fc ou um componente complementar na presença de ambos um anticorpo teste e um antígeno comparado na presença de um anticorpo sozinho, o anticorpo teste é identificado como um anticorpo que pode formar um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos e duas ou mais moléculas de miostatina. Em uma outra modalidade, a formação de um complexo imune é avaliada pela administração de um anticorpo teste a um animal (por exemplo, um camundongo) e medir a depuração de antígeno a partir de plasma. Conforme descrito acima, espera-se que um anticorpo que forma um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos com dois ou mais antígenos acelere a eliminação de antígenos a partir de plasma. Deste modo, no local onde uma eliminação acelerada de miostatina a partir de plasma é observada em um camundongo administrado com anticorpo teste comparado a um camundongo administrado com anticorpo de referência, o anticorpo teste é identificado como um anticorpo que pode formar um complexo imune contendo dois ou mais anticorpos e duas ou mais moléculas de miostatina de forma mais eficiente do que o anticorpo de referência.
D. Imunoconjugados
[00659] Em algumas modalidades, a invenção provê imunoconjugados compreendendo um anticorpo antimiostatina no presente documento conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou fármacos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas da proteína, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou fragmentos dos mesmos), ou isótopos radioativos.
[00660] Em algumas modalidades, a invenção provê imunoconjugados compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante no presente documento conjugada a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou fármacos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (toxinas da proteína, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou fragmentos dos mesmos), ou isótopos radioativos.
[00661] Em uma modalidade, um imunoconjugado é um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a um ou mais fármacos, incluindo porém sem se limitar a um maitansinoide (veja Patentes Norte-americanas Nos.5,208,020, 5,416,064 e Patente EP 0 425 235 B1); uma auristatina tal como porções d fármaco monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (veja Patentes Norte-americanas Nos.5,635,483 and 5,780,588 e 7,498,298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivado da mesma (veja Patentes Norte-americanas Nos.5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 e 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); and Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorrubicina (veja Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); e Patente Norte-americana No.6,630,579); metotrexato; vindesina; um taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.
[00662] Em uma outra modalidade, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente documento conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo porém sem se limitar a difteria da cadeia A, fragmentos ativos de não ligação da toxina da difteria, exotoxina da cadeia A (a partir de Pseudomonas aeruginosa), ricina de cadeia A, abrina de cadeia A, modecina de cadeia A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e um tricoteceno.
[00663] Em uma outra modalidade, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente documento conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para a detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo tc99m ou I123, ou um marcador spin para a produção de imagens por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecido como produção de imagens por ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês e ferro.
[00664] Conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína funcional tal como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCl adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis- azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrita em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminepentaacético marcado com carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplificador para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Veja a publicação internacional WO 1994/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil em ácido, um ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); a Patente Norte- americana No.5,208,020) pode ser usada.
[00665] Os imunoconjugados ou ADCs no presente documento contemplam expressamente, porém não se limitam a tais conjugados preparados com reagentes reticulados incluindo, porém sem se limitar a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, a partir da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).
E. Métodos e Composições para Diagnóstico e Detecção
[00666] Em certas modalidades, qualquer um dos anticorpos antimiostatina providos no presente documento é útil para detectar a presença de miostatina em uma amostra biológica. O termo "detectar" conforme usado no presente documento abrange detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como soro, sangue total, plasma, amostra de biopsia, amostra de tecido, suspensão celular, saliva, esputo, fluido oral, fluido cerebroespinhal, líquido amniótico, fluido ascítico, leite, colostro, secreção da glândula mamária, linfa, urina, suor, fluido lacrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido da lente ocular ou muco.
[00667] Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina para utilização em um método de dianóstico ou detecção é provido. Em um aspecto adicional, um método de detecção da presença de miostatina latente ou propeptídeo de miostatina em uma amostra biológica é provido. Em certas modalidades, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo antimiostatina conforme descrito no presente documento sob condições permissivas para a ligação do anticorpo antimiostatina à miostatina, e detectar se um complexo está formado entre o anticorpo antimiostatina e a miostatina. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina é usado para selecionar sujeitos elegíveis para a terapia com um anticorpo antimiostatina, por exemplo, onde a miostatina é um biomarcador para a seleção de pacientes.
[00668] Em certas modalidades, anticorpos antimiostatina marcados são providos. Os marcadores incluem, porém não se limitam a, marcadores ou porções que são detectadas diretamente (tal como marcadores fluorescente, cromofóricos, denso em elétrons, quimioluminescentes e radioativos), assim como porções, tal como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Os marcadores exemplificadores incluem, porém não se limitam aos radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos tal como quelatos de terra rara ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana (Patente Norte-americana No.4,737,456), luciferina, 2,3-diidroftalazinadionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo, por exemplo, oxidase de glicose, oxidase de galactose e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas tal como uricase e xantina oxidase, acopladas com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.
F. Formulações farmacêuticas
[00669] Formulações farmacêuticas de um anticorpo antimiostatina conforme descrito no presente documento são preparadas através da mistura de tal anticorpo tendo o grau desejado de pureza com um ou mais veículo opcional farmaceuticamente aceitável (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
[00670] Formulações farmacêuticas de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante conforme descrito no presente documento são preparadas através da mistura de tal polipeptídeo tendo o grau desejado de pureza com um ou mais veículo opcional farmaceuticamente aceitável na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
[00671] Veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos a recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, porém não se limitam a: tampões tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos tal como polietileno glicol (PEG). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplificadores no presente documento também incluem agentes de dispersão instersticial de fármaco tal como glicoproteínas de hialuronidase solúveis neutras-ativas (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúvel humana, tal como rHuPH20 (HYLENEX (marca registrada), Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplificadoras e métodos de utilização, incluindo rHuPH20, são descritos na Publicação de Pedidos de Patente Norte- Americanos Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais tal como condroitinases.
[00672] As formulações de anticorpo liofilizado exemplificadoras são descritas na Patente Norte-americana No.6,267,958. As formulações de anticorpo aquoso incluem aquelas descritas na Patente Norte- americana No.6,171,586 e publicação internacional WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.
[00673] A formulação no presente documento também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação específica sendo tratada, preferivelmente aquelas com atividades complementares que não afetam de forma adversa uma a outra. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.
[00674] Os ingredientes ativos podem ser colocados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através das técnicas de coacervação através da polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[00675] Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Os exemplos adequados das preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de atigos formatados, por exemplo, películas ou microcápsulas.
[00676] As formulações a serem usadas para a administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser prontamente cumprida, por exemplo, através de filtração com membranas de filtração estéreis.
G. Métodos terapêuticos e Composições
[00677] Qualquer um dos anticorpos antimiostatina providos no presente documento podem ser usados em métodos terapêuticos. Da mesma forma, qualquer um dos polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante providos no presente documento podem ser usados em métodos terapêuticos.
[00678] Em um aspecto, um anticorpo antimiostatina para utilização como um medicamento é provido. Em aspectos adicionais, um anticorpo antimiostatina para utilização no tratamento de uma doença é provido. Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina para utilização em um método de tratamento é provido. Em certas modalidades, a invenção provê um anticorpo antimiostatina para utilização em um método de tratamento de um indivíduo tendo uma doença compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo antimiostatina. Em uma modalidade, o método também compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferivelmente um ser humano.
[00679] Um anticorpo antimiostatina da presente invenção pode exibir características de ligação dependente de pH. Em modalidades adicionais, a invenção provê um anticorpo antimiostatina para utilização no aumento da depuração da miostatinaa partir de plasma. Em certas modalidades, a invenção provê um anticorpo antimiostatina para utilização em um método no aumento da depuração da miostatina a partir de plasma em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo antimiostatina para aumentar a depuração da miostatina a partir de plasma. Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina com características de ligação dependente de pH aumenta a depuração da miostatina a partir de plasma, comparado a um anticorpo antimiostatina convencional que não tem características de ligação dependente de pH. Em uma modalidade adicional, um anticorpo antimiostatina com a característica de ligação dependente de pH entre ligação a pH5.8 e pH7.4 aumenta a depuração da miostatina a partir de plasma, comparado a um anticorpo antimiostatina convencional que não tem características de ligação dependente de pH. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferivelmente um ser humano.
[00680] Em um aspecto adicional, a invenção provê a utilização de um anticorpo antimiostatina na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento é para o tratamento de uma doença. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para utilização em um método de tratamento de uma doença compreendendo administrar a um indivíduo tendo uma doença uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma modalidade, o método também compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.
[00681] Um anticorpo antimiostatina da presente invenção pode exibir características de ligação dependente de pH. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para aumentar a depuração da miostatina a partir de plasma. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para utilização em um método no aumento da depuração da miostatina a partir de plasma em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do medicamento para aumentar a depuração damiostatina a partir de plasma. Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina com características de ligação dependente de pH aumenta a depuração da miostatina a partir de plasma, comparado a um anticorpo antimiostatina convencional que não tem características de ligação dependente de pH. Em uma modalidade adicional, o anticorpo antimiostatina exibe diferentes características de ligação dependente de pH entre pH5.8 e pH7.4. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferivelmente um ser humano.
[00682] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para tratar uma doença. Em uma modalidade, o método compreende administrar a um indivíduo tendo tal doença uma quantidade eficaz de um anticorpo antimiostatina provido no presente documento. Em uma modalidade, o método também compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. O "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.
[00683] Um anticorpo antimiostatina da presente invenção pode exibir características de ligação dependente de pH. Em uma modalidade adicional, a invenção provê um método é para aumentar a depuração da miostatina a partir de plasma em um indivíduo. Em uma modalidade, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antimiostatina provido no presente documento para aumentar a depuração da miostatina a partir de plasma. Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina com características de ligação dependente de pH aumenta a depuração da miostatina a partir de plasma, comparado a um anticorpo antimiostatina convencional que não tem características de ligação dependente de pH. Em uma modalidade adicional, o anticorpo antimiostatina exibe diferentes características de ligação dependente de pH entre pH5.8 e pH7.4. Em uma modalidade, um "indivíduo" é um ser humano.
[00684] Em um aspecto adicional, a invenção provê formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos antimiostatina providos no presente documento, por exemplo, para utilização em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos antimiostatina provido no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, a formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos antimiostatina providos no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00685] Em um aspecto adicional, a formulação farmacêutica é para o tratamento de uma doença. Um anticorpo antimiostatina da presente invenção pode exibir características de ligação dependente de pH. Em uma modalidade adicional, a formulação farmacêutica é para aumentar a depuração da miostatina a partir de plasma. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é administrada a um indivíduo tendo uma doença. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferivelmente um ser humano.
[00686] Em um aspecto adicional, a invenção provê métodos para preparar um medicamento ou uma formulação farmacêutica, compreendendo misturar qualquer um dos anticorpos antimiostatina providos no presente documento com um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, para utilização em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma modalidade, os métodos para preparar um medicamento ou uma formulação farmacêutica também compreendem adicionar pelo menos um agente terapêutico adicional ao medicamento ou formulação farmacêutica.
[00687] Qualquer polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provido no presente documento pode ser usado em métodos terapêuticos. Em um aspecto adicional, a invenção provê formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo compreendendo qualquer um dos polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes providas no presente documento, por exemplo, para utilização em métodos terapêuticos. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende um polipeptídeo compreendendo qualquer um dos polipeptídeos compreendendo regiões Fc variantes providas no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, a formulação farmacêutica compreende um polipeptídeo compreendendo qualquer uma das variantes da região Fc providas no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00688] Em um aspecto, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para utilização como um medicamento é provido. Em aspectos adicionais, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para utilização no tratamento de um distúrbio é provido. Em certas modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para utilização em um método de tratamento é provido. Em certas modalidades, a invenção provê um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para utilização em um método de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provida no presente documento. Em uma modalidade, o método também compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em uma modalidade, o "indivíduo" é um ser humano.
[00689] Em um aspecto adicional, a invenção provê a utilização de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento é para o tratamento de um distúrbio. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é um anticorpo. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para utilização em um método de tratamento de um distúrbio compreendendo administrar a um indivíduo tendo o distúrbio a ser tratado com uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma modalidade, o método também compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em uma modalidade, o "indivíduo" é um ser humano.
[00690] Em um aspecto adicional, a invenção provê um método para tratar um distúrbio. Em uma modalidade, o método compreende administrar a um indivíduo tendo tal distúrbio uma quantidade eficaz de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante. Em uma modalidade, o método também compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em uma modalidade, o "indivíduo" é um ser humano.
[00691] Em um aspecto adicional, a invenção provê formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provido no presente documento, para utilização em um método terapêutico tal como qualquer um dos métodos terapêuticos descritos no presente documento. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provida no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, a formulação farmacêutica compreende um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provida no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00692] Em um aspecto adicional, a formulação farmacêutica é para o tratamento de um distúrbio. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é administrada a um indivíduo tendo um distúrbio. Em uma modalidade, o "indivíduo" é um ser humano.
[00693] Anticorpos que foram modificados para ter atividade de ligação a Rs gama de Fc aumentada incluindo RIIb gama de Fc através da modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido pode promover a eliminação de antígeno a partir do plasma, conforme descrito ou sugerido, por exemplo, nas publicações internacionais WO 2013/047752, WO 2013/125667, WO 2014/030728 ou WO 2014/163101.
[00694] Sem se ater a uma teoria específica, um anticorpo tendo uma atividade de ligação a R gama de Fc aumentada sob uma condição de pH neutro é rapidamente tomado nas células junto com o seu antígeno complexado com o anticorpo, e como um resultado, a eliminação de antígeno a partir de plasma pode ser promovida quando o anticorpo é administrado in vivo.
[00695] Anticorpos que foram modificados para ter um pl aumentado por modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido que pode ser exposto na superfície do anticorpo podem ser incorporados mais rapidamente nas células ou podem promover a eliminação de antígeno a partir do plasma, conforme descrito ou sugerido, por exemplo, nas publicações WO 2007/114319, WO 2009/041643, WO 2014/145159 ou WO 2012/016227.
[00696] Sem se ater a uma teoria específica, acredita-se que o pH de fluidos biológicos (por exemplo, plasma) está em uma faixa de pH neutro. Em fluidos biológicos, a carga positiva líquida de um anticorpo com pl aumentado é aumentada devido ao pl aumentado, e como um resultado o anticorpo é mais fortemente atraído por interação fisicoquímica Coulomb à superfície celular endotelial que tem uma carga negativa líquida comparado a um anticorpo que não tem um pI aumentado. Isso significa, através de tal ligação não específica, a absorção nas células do anticorpo complexada com o seu antígeno é aumentada, o que resulta no aumento da eliminação de antígeno a partir de plasma. Espera-se que esses fenômenos ocorram comumente in vivo, sem considerar o tipo celular, tipo de tecido, tipo de órgão, etc.
[00697] No presente documento, o aumento da eliminação de antígeno a partir de plasma significa, por exemplo, que a taxa de eliminação de antígeno a partir de plasma é aumentada conforme comparado àquela quando um polipeptídeo compreendendo uma região Fc correspondente que ainda não foi modificada foi administrada. O aumento da eliminação de antígeno a partir de plasma pode ser avaliado, por exemplo, ao medir a concentração do antígeno no plasma. Vários métodos para medir a concentração de antígeno no plasma são conhecidos na técnica.
[00698] Em modalidades adicionais, a invenção provê um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para utilização na promoção da eliminação de um antígeno a partir de plasma. Em certas modalidades, a invenção provê um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para utilização em um método de promoção da eliminação de um antígeno a partir de plasma em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para promover a eliminação de um antígeno a partir de plasma. Naquelas modalidades, é preferível que o polipeptídeo também compreenda um domínio de ligação ao antígeno. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferivelmente um ser humano.
[00699] Em um aspecto adicional, a invenção provê a utilização de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante na fabricação ou preparação de um medicamento. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é um anticorpo. Em alguns aspectos, o polipeptídeo é uma proteína de fusão Fc. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para promover a eliminação de um antígeno a partir de plasma. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para utilização em um método de promoção da eliminação de um antígeno a partir de plasma em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de o medicamento para promover a eliminação de um antígeno a partir de plasma. Naquelas modalidades, é preferível que o polipeptídeo também compreenda um domínio de ligação ao antígeno. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.
[00700] Em uma modalidade adicional, a invenção provê um método para promover a eliminação de um antígeno a partir de plasma em um indivíduo. Em uma modalidade, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante para promover a eliminação de um antígeno a partir de plasma. Naquelas modalidades, é preferível que o polipeptídeo também compreenda um domínio de ligação ao antígeno. Em uma modalidade, um "indivíduo" é um ser humano.
[00701] Em um aspecto adicional, a invenção provê formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante provida no presente documento. Em uma modalidade adicional, a formulação farmacêutica é para promover a eliminação de um antígeno a partir de plasma. Naquela modalidade, é preferível que o polipeptídeo também compreenda um domínio de ligação ao antígeno.
[00702] Em uma modalidade, quando se compara a antes da modificação de aminoácido, um anticorpo tendo uma região Fc variante da presente invenção aumenta a eliminação de antígeno a partir de plasma, por exemplo, em pelo menos 1,1 vezes, 1,25 vezes, 1,5 vezes, 1,75 vezes, 2,0 vezes, 2,25 vezes, 2,5 vezes, 2,75 vezes, 3,0 vezes, 3,25 vezes, 3,5 vezes, 3,75 vezes, 4,0 vezes, 4.25 vezes, 4,5 vezes, 4,75 vezes, 5,0 vezes, 5,5 vezes, 6,0 vezes, 6,5 vezes, 7,0 vezes, 7,5 vezes, 8,0 vezes, 8,5 vezes, 9,0 vezes, 9,5 vezes ou 10,0 vezes ou mais, quando o anticorpo é administrado in vivo.
[00703] Em um aspecto adicional, a invenção provê métodos para preparar um medicamento ou uma formulação farmacêutica, compreendendo misturar qualquer um dos polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante provida no presente documento com um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, para utilização em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma modalidade, os métodos para preparar um medicamento ou uma formulação farmacêutica também compreendem adicionar pelo menos um agente terapêutico adicional ao medicamento ou formulação farmacêutica.
[00704] Anticorpos da invenção podem ser usados tanto sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00705] Da mesma forma, polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante da invenção podem ser usados tanto sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00706] Tais terapias de combinação notadas acima abrangem a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas ou formulações separadas), e administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo ou polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção pode ocorrer antes da, simultaneamente e/ou em seguida à administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma modalidade, a administração do anticorpo antimiostatina e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias.
[00707] Em uma outra modalidade, a administração do polipeptídeo compreendendo a região Fc variante e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias.
[00708] Um anticorpo ou um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção (e opcionalmente qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, caso desejado para a administração intralesional para tratamento local. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, com injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é rápida ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, porém sem se limitar a administrações únicas ou múltiplas durante vários momentos, a administração em bolus e a infusão no pulso são contempladas no presente documento.
[00709] Anticorpos ou polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante da invenção podem ser formulados, dosados e administrados de uma forma consistente com a boa prática médica. Os fatores para a consideração neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos aos praticantes médicos. O anticorpo não precisa, porém é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes dependem da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente documento, ou em qualquer dosagem e através de qualquer via que é empiricamente/clinicamente determinada ser adequada.
[00710] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem adequada de um anticorpo da invenção (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá no tipo de doença a ser tratada, o tipo de anticorpo, o tipo de polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante, a gravidade e o curso da doença, caso o anticorpo ou polipeptídeo compreendendo a região Fc variante, seja administrado para finalidades preventivas ou terapêuticas, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo ou polipeptídeo compreendendo a região Fc variante, e a discrição do médico. O anticorpo ou polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 microg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0.1mg/kg-10mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem inicial para a administração ao paciente, sejam, por exemplo, uma ou mais administrações separadas ou através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 microg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente prolongado até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. Uma dosagem exemplificadora do anticorpo ou polipeptídeo compreendendo a região Fc variante estaria na faixa de cerca de 0.05 mg/kg até cerca de 10 mg/kg. Sendo assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4.0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas de forma intermitente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba de cerca de duas até cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo ou polipeptídeo compreendendo a região Fc variante). Uma dose de carga maior inicial, seguida por uma ou mais doses menores podem ser administradas. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais e ensaios.
[00711] Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser realizados usando um imunoconjugado da invenção no lugar ou além de um anticorpo antimiostatina.
[00712] Entende-se da mesma forma que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser realizados usando um imunoconjugado da invenção no lugar ou além de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante provida no presente documento.
H. Artigos de fabricação
[00713] Em um outro aspecto da invenção, um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima é provido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado com o recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente carrega uma composição a qual é por si só ou combinada com uma outra composição eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e podem ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem um fixador perfurado por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou a bula indica que a composição é usada para tartar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico ou de outra forma terapêutico. O artigo de fabricação nesta modalidade da invenção também pode compreender a bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. Alternadamente, ou de forma adicional, o artigo de fabricação também pode compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), tampão fosfato salino, solução Ringer e solução de dextrose. Ele ainda pode incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista commercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[00714] Deve se entender que qualquer um dos artigos de fabricação acima pode incluir um imunoconjugado da invenção no lugar ou além de um anticorpo antimiostatina.
EXEMPLOS
[00715] Os que seguem são exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral provida acima.
EXEMPLO 1 Expressão e purificação da forma latente e madura da miostatina de humano, macaco cinomolgo e camundongo
[00716] Miostatina latente humana (também descrita no presente documento como forma latente de miostatina humana) (SEQ ID NO: 1) foi expressada de forma transitória usando células FreeStyle293-F (células FS293-F) (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA). O meio condicionado contendo a forma latente de miostatina humana expressada foi acidificado até pH6.8 e diluído com 1/2 vol de água milliQ, seguida pela aplicação a uma coluna de troca aniônica Q- sepharose FF (GE healthcare, Uppsala, Sweden). A fração de passagem foi ajustada até pH5,0 e aplicada a uma coluna de troca catiônica SP-sepharose HP (GE healthcare, Uppsala, Sweden), e depois eluída com um gradiente de NaCl. As frações contendo a forma latente de miostatina humana foram coletadas e subsequentemente submetidas a uma coluna de filtração em gel Superdex 200 (GE healthcare, Uppsala, Sweden) equilibradas com 1x PBS. As frações contendo a forma latente de miostatina humana foram então agrupadas e armazenadas a -80 graus C.
[00717] A miostatina humana madura (também descrita no presente documento como forma madura de miostatina humana) (SEQ ID NO: 2) foi purificada a partir da forma purificada latente de miostatina humana. A forma latente de miostatina humana foi acidificada pela adição de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) e aplicada a uma coluna de fase reversa Vydac 214TP C4 (Grace, Deerfield, IL, USA) e eluída com um gradiente TFA/CH3CN. As frações contendo miostatina madura humana foram agrupadas, secas e armazenadas a -80 graus C. Para reconstituir, a miostatina madura humana foi dissolvida em HCl 4mM.
[00718] Expressão e purificação de forma latente e madura da miostatina a partir do macaco cinomolgo (cinomolgo ou cino) (SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente) e camundongo (SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente) foram todas realizadas exatamente da mesma forma como a contraparte humana. A homologia da sequência de forma Madura dentre a humana, cino e de camundongo são 100% idênticas, deste modo, qualquer uma miostatina madura sem considerar a espécie foi usada como miostatina madura em todos os experimentos necessários.
EXEMPLO 2 Identificação de anticorpo antimiostatina latente
[00719] Os anticorpos de miostatina antilatente foram preparados, selecionados e ensaiados como a seguir.
[00720] Coelhos NSW de doze a dezesseis semanas foram imunizados intradermicamente com a miostatina latente de camundongo e/ou miostatina latente humana (50-100 microg/dose/coelho). Esta dose foi repetida 3-4 vezes durante um período de um mês. Uma semana depois da imunização final, o baço e sangue a partir do coelho imunizado foram coletados. As células B específicas do antígeno foram coradas com antígeno marcado, classificadas com classificador celular FCM (FACS aria III, BD), e colocadas em placas com 96 poços em uma densidade de uma célula/poço junto com 25,000 células/poço de células EL4 (Coleção Europeia de Culturas de Células) e com meio condicionado com célula T de coelho diluído 20 vezes, e foram cultivados por 7-12 dias. As células EL4 foram tratadas com mitomicina C (Sigma) por 2 horas e lavadas 3 vezes antecipadamente. O meio condicionado com célula T de coelho foi preparado ao se cultivar os timócitos de coelho em RPMI-1640 contendo Phytohemagglutinin-M (Roche), forbol 12-miristato 13-acetato (Sigma) e FBS 2%. Depois da cultivação, os sobrenadantes de cultura de célula B foram coletados para análise adicional e os péletes foram criopreservados.
[00721] Um ensaio ELISA foi usado para testar a especificidade dos anticorpos em um sobrenadante de cultura de célula B. A estreptavidina (GeneScript) foi usada em MAXISorp de 384 poços (Nunc) a 50nM em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram então bloqueadas com Blocking One (Nacalai Tesque) diluídas 5 vezes. A miostatina latente humana ou de camundongo foi marcada com NHS- PEG4-Biotina (PIERCE) e foi adicionada às placas bloqueadas ELISA, incubadas por 1 hora, e lavadas com tampão trifosfatado salino com Tween-20 0,05% (TBS-T). Os sobrenadantes de cultura de célula B foram adicionados nas placas ELISA, incubados por 1 hora, e lavados com TBS-T. A ligação foi detectada por peroxidase de rábano silvestre de IgG de cabra anti-coelho (BETHYL) seguido pela adição de ABTS (KPL).
[00722] Um total de 17,818 linhagens de célula B foram rastreadas por especificidade de ligação à miostatina latente humana e/ou de camundongo e 299 linhagens foram selecionadas e designadas MST0255-287, 630-632, 677-759, 910, 932-1048, 1050-1055, 1057- 1066, 1068, 1070-1073, 1075-1110, 1113-1119. RNA foi purificado a partir de péletes de célula correspondente usando kits ZR-96 Quick- RNA (ZYMO RESEARCH).
[00723] DNA codificando as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de cada linhagem celular selecionada foi amplificado através de PCR por transcrição reversa e clonado nos vetores de expressão com a sequência da região constante de cadeia pesada G1m (SEQ ID NO: 50 (a sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 7)) e com a sequência da região constante de cadeia leve k0MTC ou k0MC (SEQ ID NO: 53 or 194 (a sequência de aminoácido (ambas são as mesmas) é mostrada na SEQ ID NO: 8)), respectivamente. Os anticorpos recombinantes foram expressados de forma transitória usando as células FreeStyle FS293-F e 293fectina (Life technologies), de acordo com as instruções do fabricante. O sobrenadante da cultura e os anticorpos recombinantes foram usados para o rastreamento. Os anticorpos recombinants foram purificados com proteína A (GE Healthcare) e eluídos em D-PBS ou tampão His (histidina 20mM, NaCl 150mM, pH6.0). A cromatografia por exclusão de tamanho ainda foi conduzida para remover o componente de alto peso molecular e/ou componente de baixo peso molecular, caso necessário.
EXEMPLO 3 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (HEK Blue Assay (ativação BMP1))
[00724] Um ensaio do gene repórter foi usado para avaliar a atividade biológica de miostatina ativa in vitro. As células TGF-beta HEK-BlueTM (Invivogen) que expressam genes repórter induzíveis (SBE) por elementos de ligação a Smad3/4, permitem a detecção da miostatina bioativa ao monitorar a ativação dos receptores da ativina tipo 1 e tipo 2. A miostatina ativa estimula a produção de SEAP que é secretada no sobrenadante cellular. A quantidade de SEAP secretada é então avaliada usando QUANTIBlueTM (Invivogen).
[00725] As células TGF-beta HEK-BlueTM foram mantidas em meio DMEM (Gibco) suplementado com soro fetal bovino 10%, 50 microg/mL de estreptomicina, 50 U/mL de penicilina, 100 microg/mL de NormocinTM, 30microg/mL de Blasticidina, 200 microg/mL de HygroGoldTM e 100 microg/mL de ZeocinTM. Durante o ensaio funcional, as células foram modificadas para testar o meio (DMEM com soro de albumina bovina 0,1%, estreptomicina, penicilina e NormocinTM) e semeadas em uma placa de 96 poços. A miostatina latente humana, de cinomolgo ou de camundongo foi incubada com BMP1 humano recombinante (R&D Systems) e anticorpo antilatente em 37 graus C de um dia para o outro. As misturas de amostra foram transferidas às células. Depois de uma incubação de 24 horas, os sobrenadantes celulares foram misturados com QUANTIBlueTM e a densidade ótica a 620 nm foi medida em uma leitora de placa colorimétrica. Como mostrada na Figura 1, mAb MST1032-G1m (veja Tabela 2a para sequências de aminoácido e nucleotídeo) preveniram a ativação mediada pela protease de miostatina latente humana, de cinomolgo e de camundongo, conforme refletido por concentrações diminuídas de SEAP secretada. MST1032-G1m mostrou a atividade de inibição quase comparável contra a miostatina latente humana, de cinomolgo e de camundongo. Tabela 2a [Tabela 2b]
EXEMPLO 4 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (HEK Blue Assay (Ativação espontânea))
[00726] Miostatina latente humana, de cinomolgo ou de camundongo foi incubada com o anticorpo de miostatina antilatente em 37 graus C de um dia para o outro e as misturas de amostra foram transferidas a células TGF-beta HEK-BlueTM. Depois de uma incubação de 24 horas, o sobrenadante celular foi misturado com QUANTIBlueTM e a densidade ótica a 620 nm foi medida em uma leitora de placa colorimétrica. Como mostrada na Figura 2, a liberação de miostatina ativa a partir da forma latente foi detectada depois da incubação em 37 graus C. A presença de mAb MST1032-G1m, a ativação da miostatina foi inibida e assim um nível baixo de SEAP foi detectado no sobrenadante celular. MST1032- G1m inibiu a ativação espontânea da miostatina latente, e mostrou quase comparável atividade de inibição contra a miostatina latente humana, de cinomolgo e de camundongo.
EXEMPLO 5 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (ELISA)
[00727] As placas ELISA não revestidas (placa NUNC-IMMUNO superfície MAXISORP, Nalge Nunc International) foram revestidas com 20 microL de estreptavidina 50nM (GenScript) por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas com PBST três vezes e bloqueadas com 50 microL de Blocking One 20% (Nacalai Tesque) de um dia para o outro. No dia seguinte, cada poço de cada placa foi incubado com miostatina madura biotinilada, miostatina latente biotinilada humana ou de camundongo ou propeptídeo de miostatina de camundongo recombinante biotinilada- proteína de quimera Fc (R&D Systems) em 4nM/poço/20 microL por 2 horas. Depois da lavagem, 20 microL da amostra de anticorpo foram adicionados aos poços e as placas foram deixadas por 1 hora. As placas foram lavadas e 20 microL de peroxidase de rábano silvestre de IgG anti-humano (HRP) (Abcam) diluídos em tampão fosfato salino HEPES foram adicionados, e as placas foram deixadas por mais uma hora. As placas foram então lavadas novamente, e depois 50 microL ABTS (KPL) foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas por 1 hora. O sinal foi detectado a 405 nm em uma leitora de placa colorimétrica. Os resultados do experimento de ligação são mostrados na Figura 3. MST1032-G1m ligado à miostatina latente (isto é, o complexo não covalente de miostatina madura e propeptídeos) e o propeptídeo, porém não se ligam à miostatina madura. Esses resultados mostram que MST1032-G1m se liga especificamente ao propeptídeo de miostatina (por exemplo, a porção de propeptídeo), mas não à miostatina ativa (por exemplo, região madura).
EXEMPLO 6 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (Western Blot)
[00728] A miostatina latente de camundongo foi incubada com BMP1 humano recombinante (R&D Systems), com ou sem MST1032-G1m em 37 graus C de um dia para o outro. As amostras foram então misturadas com tampão de amostra SDS-PAGE com 4x de redução (Wako) e aquecidas a 95 graus C por 5 minutos e depois carregadas para a eletroforese em gel SDS. As proteínas foram transferidas à membrana através do sistema de transferência Trans-Blot (marca registrada) TurboTM (Bio-rad). O propeptídeo de miostatina foi detectado usando um anticoroo de propeptídeo de GDF8 de ovelha anticamundongo (R&D Systems), que foi detectado por IgG-HRP antiovelha (Santa Cruz). A membrana foi incubada com substrato ECL e produzida uma imagem usando um ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). Conforme mostrado na Figura 4, a clivagem de propeptídeo através de BMP1 foi inibida por MST1032-G1m.
EXEMPLO 7 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (BIACORE (marca registrada))
[00729] Os parâmetros cinéticos de anticorpos de miostatina antilatente contra miostatina latente humana, de macaco cinomolgo (cino) e de camundongo foram avaliados em 37 graus C a pH7.4 usando um instrumento T200 BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare). ProA/G (Pierce) foi imobilizado em todas as células de fluxo de um chip CM4 usando o kit de acoplamento de amina (GE Healthcare). Anticorpo de miostatina antilatente e analitos foram preparados em ACES pH7.4 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1,2 mM, Tween 20 0,05%, NaN3 0,05%). O anticorpo foi capturado na superfície do sensor por ProA/G. Os níveis de captura de anticorpo eram tipicamente 150 a 220 unidades de ressonância (RU). Depois, a miostatina latente humana, de cino ou de camundongo foi injetada em 3.125 a 50 nM preparada em uma diluição série em duas vezes, seguida pela dissociação. A superfície do sensor foi regenerada com NaOH 25 mM. Os parâmetros cinéticos foram determinados pelo processamento e ajuste dos dados em um modelo de ligação 1:1 usando BIACORE (marca registrada) T200 Evaluation software, versão 2.0 (GE Healthcare). Os sensorgramas são mostrados na Figura 5. A taxa de associação (ka), taxa de dissociação (kd), afinidade de ligação (KD) são listadas na Tabela 3. Os parâmetros cinéticos de MST1032-G1m em relação a miostatina latente humana, de cino e de camundongo eram comparáveis. Tabela 3
EXEMPLO 8 Humanização de anticorpo de miostatina antilatente
[00730] Resíduos de aminoácido de uma região variável de anticorpo são numerados de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
[00731] Regiões variáveis das cadeias pesadas e leves para anticorpos MST1032 humanizados foram designadas. Alguns dos anticorpos MST1032 humanizados contêm retro mutação na região de framework. Os polinucleotídeos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve designadas foram sintetizadas por GenScript Inc., e foram clonados nos vetores de expressão contendo a sequência da região constante de cadeia pesada SG1 (SEQ ID NO: 52 (a sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 9)) e a sequência da região constante de cadeia leve SK1 (SEQ ID NO: 54 (a sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 10)), respectivamente. Anticorpos humanizados foram expressadas de forma transitória em células FS293-F e as análises HEK Blue Assay e BIACORE (marca registrada) foram realizadas conforme descrito acima. Conforme mostrada na Figura 6 e Tabela 4, e comparada às Figuras 1 e 2, o anticorpo humanizado (MS1032LO00-SG1) mostrou a atividade de inibição comparável e afinidade ao anticorpo quimérico (MST1032- G1m). Tabela 4
EXEMPLO 9 Geração de anticorpo de miostatina antilatente dependente de pH
[00732] Para gerar anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH, a mutagênese de rastreamento de histidina foi conduzida para todas as CDRs de mAb MS1032LO00-SG1. Cada aminoácido nas CDRs foi mutado individualmente na histidina usando kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Inc. ou Takara Bio company) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de confirmar através de sequenciamento que cada variante foi mutado corretamente, as variantes foram expressada de forma transitória e purificadas pelo método descrito acima. Todas as variantes substituídas por histidina foram avaliadas por um ensaio modificado BIACORE (marca registrada) conforme comparado ao descrito acima. Em resumo, uma fase de dissociação adicional no pH5.8 foi integrada no ensaio BIACORE (marca registrada) imediatamente depois da fase de dissociação em pH7.4. Isto é para avaliar a dissociação dependente de pH entre anticorpo (Ab) e antígeno (Ag) a partir dos complexos formados no pH7.4 conforme oposto à dissociadção correspondente em pH5.8. A taxa de dissociação no tampão a pH5.8 foi determinada ao processor e ajustar os dados usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0 (BioLogic Software).
[00733] Conforme mostrada na figura 7, o anticorpo parental (Ab001) não mostrou nenhuma redução na resposta de ligação no pH5.8 comparado à taxa de dissociação no pH7.4. Várias substituições de histidine única resultaram em uma redução moderada a forte na resposta d eligação no pH5.8 comparado à taxa de dissociação no pH7.4. A taxa de dissociação no pH5.8 para cada uma das variantes de substituição da histidina única são mostradas na Tabela 5. Conforme mostrado na tabela 5, Ab002 mostrou a taxa de dissociação mais rápida do complexo Ab/Ag no pH5.8, mais do que 200 vezes mais rápido do que o anticorpo parental (Ab001). Anticorpos com uma combinação dessas mutações nas CDRs foram então gerados. As sequências de CDR dos anticorpos contendo essas várias mutações são mostradas na Tabela 6. Tabela 5 Tabela 6
EXEMPLO 10 Aumento da afinidade do anticorpo de miostatina antilatente dependente de pH
[00734] Para identificar mutações que melhoram a afinidade no pH7.4 e/ou a atividade de inibição in vitro, mais do que 500 variantes foram geradas para a cadeia pesada e leve respectivamente, usando pelo menos uma variante gerada no Exemplo 9 como um modelo. Essas variantes tinham cada aminoácido nas CDRs substituído com 18 outros aminoácidos, excluindo o aminoácido original e a cisteína. A capacidade de ligação de variantes à miostatina latente humana foi avaliada em 37 graus C sob pH7.4 usando instrumento 4000 BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare). O sobrenadante da cultura contendo variantes nas células FS293-F foi preparado com tampão ACES pH7.4 contendo 10mg/ml de BSA e 0.1mg/ml de carboximetil dextrana (CMD). Cada anticorpo foi capturado nas células de fluxo até que o nível de captura alcançasse cerca de 200 RU. Depois a miostatina latente humana 25 nM foi injetada sobre as células de fluxo. Uma fase de dissociação adicional no pH5.8 foi integrada no ensaio BIACORE (marca registrada) imediatamente depois da fase de dissociação no pH7.4. Esta fase de dissociação adicional avalia a dissociação dependente de pH entre anticorpo (Ab) e antígeno (Ag) a partir dos complexos formados no pH7.4. A superfície da célula de fluxo foi regenerada com NaOH 25 mM. Os parâmetros cinéticos foram determinados usando BIACORE (marca registrada) 4000 Evaluation software, versão 2.0 (GE Healthcare). A análise da dissociação adicional no pH5.8 foi realizada usando Scrubber2 (BioLogic Software).
[00735] Variantes com afinidade melhorada no pH7.4 e/ou atividade de inibição in vitro foram selecionados e combinados com mutações que melhoram a dependência de pH identificada no Exemplo 9. Depois da combinação destas mutações, quatro variantes (MS1032LO01, 02, 03 e 04) foram selecionadas e expressadas de forma transitória em SG1 ou F760 (SEQ ID NO: 11 e 51) para a análise cinética de ligação BIACORE (marca registrada), ensaios in vitro e/ou in vivo. Ambos o SG1 e F760 são região constantes humanas de cadeia pesada. As afinidades de ligação de SG1 contra Rs gama de Fc humano são comparáveis para a região constante de IgG1 natural, mas aquela de F760 é abolida pela modificação de Fc (também descrita no presente documento como Fc silencioso). As sequências de aminoácido e nucleotídeo das quatro variantes de antimiostatina são mostradas na Tabela 2a.
EXEMPLO 11 Caracterização de variantes MS1032 dependentes de pH (HEK Blue Assay (BMP1 e Ativação espontânea))
[00736] Todos os ajustes experimentais eram os mesmos como no Exemplos 3 e 4. Conforme mostrado na figura 8, todas as variantes mostraram a atividade de inibição comparável contra a miostatina latente humana a MS1032LO00-SG1.
EXEMPLO 12 Caracterização de variantes MS1032 dependentes de pH (BIACORE (marca registrada))
[00737] Todos os ajustes experimentais eram os mesmos como no Exemplo 7, exceto pelas mediões que também eram realizadas em tampão ACES pH5.8 além da condição de ACES pH7.4. Alguns anticorpos foram medidos apenas contra a miostatina latente humana. O nível de captura de anticorpo foi intentado em 185 RU e 18.5 RU, para ensaio de avidez e ensaio de afinidade, respectivamente. Os parâmetros cinéticos foram determinados usando o ajuste de ligação 1:1 usando BIACORE (marca registrada) T200 Evaluation software, versão 2.0 (GE Healthcare). Os sensorgramas de todos os anticorpos contra a miostatina latente humana com a condição de avidez são mostrados na Figura 9, e ka, kd e KD calculados a partir de diferentes condições são listados nas Tabelas 7-10. Sob a condição de avidez, todos os anticorpos exceto MS1032LO00-SG1 mostraram uma taxa de dissociação mais rápida sob pH acídico do que em pH neutro. Sob a condição de afinidade, todos os anticorpos exceto MS1032LO00-SG1 mostraram uma fraca interação com a miostatina latente sob pH acídico e deste modo, os parâmetros cinéticos não foram determinados. Tabela 7 Tabela 8 Tabela 9 Tabela 10
EXEMPLO 13
[00738] Comparação da concentração de miostatina total no plasma entre anticorpos com ligação a R gama de Fc e ligação abolida a R gama de Fc em camundongos
Teste in vivo usando camundongos C.B-17 SCID
[00739] O acúmulo de miostatina endógena foi avaliado in vivo mediante a administração do anticorpo de miostatina antilatente em camundongos C.B-17 SCID (In Vivo, Singapore). Um anticorpo de miostatina antilatente (3mg/ml) foi administrado em uma dose única de 10 ml/kg na veia caudal. O sangue foi coletado 5 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois da administração. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 14,000 rpm em 4 graus C por 10 minutos para separar o plasma. O plasma separado foi armazenado em ou abaixo de -80 graus C até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatentes usados foram MS1032LO00-SG1 e MS1032LO00-F760.
Medição da concentração da miostatina total no plasma através de eletroquimioluminescência (ECL)
[00740] A concentração de miostatina total no plasma de camundongo foi medida por ECL. As placas imobilizadas com miostatina anti-madura foram preparadas pela dispensação de anticorpo de miostatina antimadura RK35 (conforme descrita na publicação internacional 2009/058346) em uma placa de 96 poços MULTI-ARRAY(Meso Scale Discovery) e incubadas de um dia para o outro a 4 graus C. As amostras da curva de calibração da miostatina madura e as amostras do plasma de camundongo diluídos 40 vezes ou mais foram preparados. As amostras foram misturadas em uma solução acídica (0.2 M Glicina-HCl, pH2.5) para dissociar a miostatina madura de sua proteína de ligação (tal como propeptídeo). Subsequentemente, as amostras foram adicionadas em uma placa imobilizada de miostatina antimadura, e deixadas se ligar por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. A seguir, O anticorpo de miostatina antimadura marcado com SULFO TAG RK22 (conforme descrito na publicação internacional 2009/058346) foi adicionado e a placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. O tampão T (x4) (Meso Scale Discovery) foi imediatamente adicionado à placa e o sinal foi detectado pelo SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). A concentração da miostatina madura foi calculada com base na respostada curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O tempo de duração da concentração total da miostatina no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente medido por este método é mostrado na Figura 10.
Efeito da ligação de R gama Fc no acúmulo de miostatina in vivo
[00741] Depois da administração do anticorpo MS1032LO00-F760, a concentração de miostatina total no plasma no dia 28 acumulou 248 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Em contraste, depois da administração de MS1032LO00-SG1, a concentração de miostatina total no plasma no dia 28 acumulou 37 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Uma diferença de aproximadamente 7 vezes da concentração de miostatina total no plasma no dia 28 foi observada entre MS1032LO00-F760 (Fc silencioso) e MS1032LO00-SG1 devido à ligação a R gama de Fc. Em IL-6R humano solúvel (hsIL-6R), nenhuma diferença significativa na concentração de hsIL-6R no plasma foi observada entre o anticorpo F760 anti-hsIL-6R (Fc silencioso) e -SG1 conforme descrito na publicação internacional 2013/125667. Já que hsIL-6R é um antígeno monomérico, o complexo anticorpo-hsIL-6R contém apenas 1 Fc. Deste modo, o resultado na publicação internacional WO 2013/125667 sugeriu que um complexo de anticorpo- antígeno com 1 Fc não tem ligação significativa a R gama de Fc in vivo para acelerar a absorção do complexo imune pelas células. Por outro lado, um anticorpo de antígeno multimérico (tal como miostatina), pode produzir um grande complexo imune e o complexo anticorpo-antígeno contém mais do que 2 Fc. Deste modo, uma diferença significativa na concentração de antígeno no plasma pode ser observada entre F760 e SG1 devido a forte ligação de avidez contra R gama de Fc. O resultado sugere que MST1032 pode formar um grande complexo immune que contém mais do que 2 anticorpos com miostatina.
EXEMPLO 14 Comparação da concentração de miostatina total no plasma entre anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH e anticorpo de miostatina antilatente dependente de pH em camundongos Teste in vivo usando camundongos C.B-17 SCID
[00742] O acúmulo in vivo de miostatina de camundongo endógena foi avaliada depois de administrar anticorpo de miostatina antilatente nos camundongos C.B-17 SCID (In Vivos, Singapore) conforme descritas no Exemplo 13. Os anticorpos de miostatina antilatente usados foram MS1032LO01-SG1 e MS1032LO01-F760.
Medição da concentração da miostatina total no plasma por ECL
[00743] A concentração de miostatina total no plasma de camundongo foi medida por ECL conforme descrito no Exemplo 13. O tempo de duração da concentração de miostatina total no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente conforme medido por este método é mostrado na Figura 11.
Efeito da ligação da miostatina dependente de pH no acúmulo de miostatina in vivo
[00744] Os anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH (MS1032LO01-SG1 e MS1032LO01-F760) foram testados in vivo e a comparação da concentração de miostatina total no plasma foi feita. Os resultados de medição da concentração da miostatina total depois da administração de MS1032LO00-SG1 d MS1032LO00-F760 descritos no Exemplo 13 também são mostrados na Figura 11. MS1032LO00 é um anticorpo não dependente de pH e MS1032LO01 é um anticorpo dependente de pH. Conforme mostrado na figura 11, a concentração da miostatina total depois da administração de MS1032LO01-F760 foi reduzida comparado a MS1032LO00-F760 devido à ligação dependente de pH. Além disso, a concentração da miostatina total depois da administração de MS1032LO01-SG1 foi dramaticamente reduzida comparada àquela da MS1032LO00-SG1 devido à ligação dependente de pH e absorção celular aumentada pela ligação a R gama de Fc. Espera-se que MS1032LO01-SG1 tenha uma propriedade superior de melhoramento da depuração da miostatina a partir do plasma como um "anticorpo de varredura".
EXEMPLO 15 Expressão e purificação de GDF11 latente de humano e camundongo
[00745] GDF11 humano com Flag-tag no N-terminal (também descrito no presente documento como Flag-hGDF11, GDF11 latente humano, hGDF11, ou GDF11 humano, SEQ ID NO: 85) foram expressados de forma transitória usando células FreeStyle293-F (Thermo Fisher). O meio condicionado expressando Flag-hGDF11 foi aplicado a uma coluna com uma resina de afinidade anti-Flag M2 (Sigma) e eluído com peptídeo Flag (Sigma). As frações contendo Flag- hGDF11 foram coletadas e subsequentemente submetidas a uma coluna de filtração em gel Superdex 200 (GE healthcare) equilibrada com 1x PBS. As frações contendo o Flag-hGDF11 foram então agrupadas e armazenadas a -80 graus C.
EXEMPLO 16 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (ELISA)
[00746] As placas ELISA não revestidas (placa NUNC-IMMUNO superfície MAXISORP, Nalge Nunc International) foram revestidas com 20 microL de estreptavidina 50nM (GenScript) por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas com PBST três vezes e bloqueadas com 50 microL de Blocking One 20% (Nacalai Tesque) de um dia para o outro. No dia seguinte, cada poço das placas foi incubado com miostatina latente humana biotinilada a 2nM/poço/20 microL ou GDF11 latente humana biotinilada a 20nM/poço/20 microL por 2 horas. Depois da lavagem, 20 microL da amostra de anticorpo foram adicionados aos poços e as placas foram deixadas por 1 hora. As placas foram lavadas e 20 microL de peroxidase de rábano silvestre de IgG anti-humano (HRP) (Abcam) diluídos no tampão fosfato salino HEPES foram adicionados e as placas foram deixadas por mais uma hora. Os poços foram lavados novamente, e depois 50 microL ABTS (KPL) foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas por 1 hora. O sinal foi detectado a 405 nm em uma leitora de placa colorimétrica. Os resultados do experimento de ligação são mostrados na Figura 12. MST1032-G1m ligado à miostatina latente (isto é, complexo não covalente de miostatina madura e propeptídeos), porém não se ligou a hGDF11. Esses resultados mostram que MST1032-G1m se liga especificamente a miostatina, não a hGDF11.
EXEMPLO 17 Caracterização de anticorpo de miostatina antilatente (HEK Blue Assay (BMP1 e ativação espontânea))
[00747] Um ensaio de gene repórter foi usado para avaliar a atividade biológica de GDF11 ativo in vitro. As células TGF-beta HEK- BlueTM (Invivogen) que expressam um gene repórter SEAP induzível por elemento de ligação (SBE) a Smad3/4, permitem a detecção de GDF11 bioativo através da monitoração dos receptores de ativação da ativina tipo 1 e tipo 2. O GDF11 ativo estimula a produção e a secreção de SEAP no sobrenadante celular. A quantidade de SEAP secretado é então avaliado usando QUANTIBlueTM (Invivogen).
[00748] As células TGF-beta HEK-BlueTM foram mantidas em meio DMEM (Gibco) suplementado com soro fetal bovino 10%, 50 microg/mL de estreptomicina, 50 U/mL de penicilina, 100 microg/mL de NormocinTM, 30 microg/mL de Blasticidina, 200 microg/mL de HygroGoldTM e 100 microg/mL de ZeocinTM. Durante o ensaio funcional, as células foram mudadas para o meio (DMEM com albumina de soro bovino 0,1%, estreptomicina, penicilina e NormocinTM) e semeadas em uma placa de 96 poços. GDF11 humano foi incubado com ou sem BMP1 humano recombinante (Calbiochem) e o anticorpo antilatente (MST1032-G1m) em 37 graus C de um dia para o outro. As misturas de amostra foram transferidas às células. Depois de uma incubação de 24 horas, o sobrenadante celular foi misturado comQUANTIBlueTM e a densidade ótica a 620 nm foi medida em uma leitora de placa colorimétrica. Como mostrada na Figura 13, MST1032-G1m não preveniu a protease ou ativação espontânea de GDF11 humano e assim falhou para inibir a secreção de SEAP.
EXEMPLO 18 Otimização adicional de variantes de MS1032 para aumentar o efeito de varredura
[00749] Como o anticorpo dependente de pH, MS1032LO01-SG1, mostrou eficácia superior em camundongo, a otimização adicional foi conduzida para aumentar a dependência do pH, aumentar a absorção nas células, para aumentar a estabilidade e assim introduzir mutações nas CDRs de anticorpo ou mudar as regiões de framework. Mais de uma centena de variantes foi avaliada e um BIACORE (marca registrada) e/ou HEK Blue Assay conforme descrito acima e MS1032LO06-SG1, MS1032LO07-SG1, MS1032LO10-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO12-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1, MS1032LO23-SG1, MS1032LO24-SG1, MS1032LO25-SG1, e MS1032LO26-SG1 foram gerados. As suas sequências de aminoácido e nucleotídeo que geram anticorpos são mostradas na Tabela 11. Tabela 11ac Tabela 11b
[00750] A afinidade de ligação da variante MS1032 à miostatina latente de humano, macaco cinomolgo (cino) ou camundongo em pH7.4 e pH5.8 foi determinada em 37 graus C usando BIACORE (marca registrada) instrumento T200 (GE Healthcare) para avaliar o efeito do pH na ligação do antígeno. ProA/G (Pierce) foi imobilizado em todas as células de fluxo de um chip CM4 usando um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare). Todos os anticorpos e analitos foram preparados em tampão ACES pH7.4 ou pH5.8 contendo 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3. Cada anticorpo foi capturado em uma superfície do sensor pelo proA/G. Os níveis de captura de anticorpo eram tipicamente 130 a 240 unidades de ressonância (RU). Miostatina latente humana, de cino e de camundongo foi injetada em 3.125 a 50 nM preparada por diluição serial por duas vezes, seguida pela dissociação. A superfície do sensor foi regenerada em cada ciclo com Glicina HCl 10 mM pH1.5. A afinidade de ligação foi determinada através do processamento e ajuste dos dados a um modelo de ligação 1:1 usando BIACORE (marca registrada) T200 Evaluation software, versão 2.0 (GE Healthcare).
[00751] A afinidade (KD) de ligação de variantes MS1032 à miostatina latente de humano, macaco cinomolgo (cino e camundongo em pH7.4 e pH5.8 é mostrada na Tabela 12. Todas as variantes mostraram uma razão KD ((KD no pH5.8)/(KD no pH7.4)) de mais de 5, indicando a ligação dependente de pH à miostatina latente. Tabela 12
EXEMPLO 19 Avaliação da atividade de neutralização de variantes adicionalmente otimizadas em HEK Blue Assay
[00752] Avaliou-se a atividade de neutralização de MS1032LO06- SG1, MS1032LO07-SG1, MS1032LO10-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO12-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1, MS1032LO23-SG1 e MS1032LO25-SG1 contra a miostatina latente humana conforme descritas no Exemplo 3. Conforme mostrado na Fig. 14, todas as variantes mostraram atividade comparável ao MS1032LO01-SG1.
EXEMPLO 20 Comparação de concentração de miostatina total no plasma entre anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH e anticorpos de miostatina antilatentes dependentes de pH diferentes em camundongos Teste in vivo usando camundongos C.B-17 SCID
[00753] O acúmulo de miostatina endógena foi avaliada in vivo mediante a administração de anticorpo de miostatina antilatente em camundongos C.B-17 SCID (In Vivos, Singapore). Um anticorpo de miostatina antilatente (3mg/ml) foi administrado em uma única dose de 10 ml/kg na veia caudal. O sangue foi coletado 5 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois da administração. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 14,000 rpm em 4 graus C por 10 minutos para separar o plasma. O plasma separado foi armazenado em ou abaixo de -80 graus C até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatentes testados eram MS1032LO00-SG1, MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 e MS1032LO25-SG1.
Medição da concentração da miostatina total no plasma por eletroquimioluminescência (ECL)
[00754] A concentraçao de miostatina total no plasma de camundongo foi medida por ECL. As placas imobilizadas com miostatina anti-madura foram preparadas ao se dispensar anticorpo de miostatina antimadura biotinilada RK35 (conforme descrito na publicação internacional 2009/058346) em uma placa de estreptavidina de 96 poços MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) e incubada em tampão de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. As amostras da curva de calibração da miostatina madura e as amostras do plasma de camundongo diluídas 40 vezes ou mais foram preparadas. As amostras foram misturadas em uma solução acídica (0.2 M Glicina-HCl, pH2.5) para dissociar a miostatina madura de sua proteína de ligação (tal como propeptídeo). Subsequentemente, as amostras foram adicionadas em uma placa imobilizada de miostatina anti-madura, e deixadas se ligar por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. A seguir, o anticorpo de miostatina anti-madura marcado com SULFO TAGRK22 (conforme descrito na publicação internacional 2009/058346) foi adicionado e a placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. O tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foi imediatamente adicionado na placa e o sinal foi detectado por SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). A concentração da miostatina madura foi calculada com base na resposta da curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O tempo de duração da concentração total da miostatina no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente medida por este método é mostrada na Figura 15.
Efeito da ligação de miostatina dependente de pH no acúmulo de miostatina em estudo de camundongos in vivo
[00755] O efeito da dependência do pH no acúmulo da miostatina em camundongos foi comparado usando anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) e diferentes anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH (MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 e MS1032LO25-SG1). A introdução da dependência do pH acelera significativamente a depuração da miostatina a partir do plasma do camundongo SCID. Conforme mostrado na figura 15, anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH (MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 e MS1032LO25-SG1) poderiam reduzir o acúmulo de miostatina comparado a anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) no dia 28.
EXEMPLO 21
[00756] Comparação de concentração de miostatina total no plasma entre anticorpo de miostatina antilatente não dependente de pH e anticorpos de miostatina antilatentes com ambas a engenharia de pH e Fc em macaco cinomolgo
Teste in vivo usando macaco cinomolgo
[00757] O acúmulo de miostatina endógena foi avaliada in vivo mediante a administração de anticorpo de miostatina antilatente em uma Macaca fascicularis de 2-4 anos (macaco cinomolgo) da Cambodia (Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd., Japan). Um nível de dose de30 mg/kg foi injetado na veia cefálica da pata dianteira usando uma seringa descartável, tubo de extensão, agulha permanente, e bomba de infusão. A velocidade de dosagem era de 30 minutos por corpo. O sangue foi coletado antes do início da dosagem e 5 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias depois do final da dosagem, ou 5 minutos e 2, 4 e 7 horas e 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias depois do final da dosagem. O sangue foi retirado da veia femural com uma seringa contendo heparina de sódio. O sangue foi imediatamente resfriado em gelo, e o plasma foi obtido através de centrifugação em 4 graus C, 1700xg por 10 minutos. As amostras de plasma foram armazenadas em um freezer (faixa aceitável: -70 graus C ou abaixo) até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatentes usados foram MS1032LO00-SG1, MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033 e MS1032LO06-SG1034 (no presente documento, SG1012, SG1016, SG1029, SG1031, SG1033 e SG1034 são as regiões constantes de cadeia pesada contruídas com base em SG1 conforme descrito abaixo).
[00758] Um nível de dose de 2mg/kg foi administrado na veia cefálica da pata dianteira ou veia safena usando uma seringa descartável, e agulha permanente para os anticorpos de miostatina antilatentes MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19- SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077 (no presente documento, SG1079, SG1071, SG1080, SG1074, SG1081 e SG1077 são as regiões constantes de cadeia pesada construídas com base em SG1 conforme descrito abaixo). O sangue foi coletado antes do início da dosagem e 5 minutos e 2, 4 e 7 horas e 1, 2, 3, 7, 14 dias depois do final da dosagem. O sangue foi processado conforme descrito acima. As amostras de plasma foram armazenadas em um freezer (faixa aceitável: -70 graus C ou abaixo) até a medição.
Medição da concentração da miostatina total no plasma por eletroquimioluminescência (ECL)
[00759] A concentração de miostatina total no plasma de macaco foi medida por ECL conforme descrita no Exemplo 20. O tempo de duração da concentração de miostatina total no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente como medida por este método é mostrada na Figura 16.
Medição de ADA em plasma de macaco usando eletroquimioluminescência (ECL)
[00760] O fármaco biotinilado foi revestido em uma placa de estreptavidina de 96 poços MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) e incubado em tampão (Candor) por 2 horas em temperatura ambiente. As amostras de plasma de macaco foram diluídas 20 vezes em tampão low cross antes da adição na placa. As amostras foram incubadas de um dia para o outro a 4oC. No dia seguinte, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem antes da adição de anticorpo secundário de IgG anti macaco marcado com SULFO TAG (Thermo Fisher Scientific). Depois de incubação por uma horaem temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem. O tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foi imediatamente adicionado à placa e o sinal foi detectado usando um SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
Efeito da engenharia dependente de pH e de Fc no acúmulo de miostatina em macacos in vivo
[00761] No macaco cinomolgo, a administração do anticorpo não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) resultou em pelo menos um aumento de 60 vezes na concentração de miostatina a partir da linha de base no dia 28. No dia 28, os anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH MS1032LO06-SG1012 e MS1032LO06-SG1033 resultaram em um aumento de 3 vezes e 8 vezes a partir da linha de base, respectivamente. No dia 28, os anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06- SG1031 e MS1032LO06-SG1034 poderiam rastrear o antígeno para abaixo da llinha de base. A razão para a forte varredura de MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031 e MS1032LO06- SG1034 é um aumento na absorção não específica na célula devido ao aumento no agrupamento de carga positiva do anticorpo e um aumento em absorção celular mediada por R gama de Fc devido a ligação aumentada a R gama de Fc.
[00762] Administração de anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077 reduziram a concentração de miostatina para abaixo do limite de detecção (<0.25ng/mL) a partir do dia 1 em macaco cinomolgo. No dia 14, a concentração de miostatina aumentou acima do limite de detecção para MS1032LO19-SG1079 e MS1032LO19-SG1071 enquanto que a concentração de miostatina permaneceu abaixo do limite de detecção para MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077. A supressão mais fraca de MS1032LO19-SG1079 e MS1032LO19-SG1071 poderia ser devida à diferença nas mutações de pl.
[00763] Os dados sugerem que a forte varredura de miostatina a partir do plasma poderia ser alcançada pelas mutações que aumentam a ligação a RIIb gama de Fc ou combinam as mutações que aumentam a carga positiva do anticorpo e aumentam a ligação ao RIIb gama de Fc. Acredita-se que a forte varredura da miostatina pode ser alcançada em humanos ao se combinar as mutações que aumentam a carga positiva do anticorpo e aumentam a ligação a R gama de Fc.
EXEMPLO 22 Mapeamento de epítopo de anticorpos de miostatina antilatentes
[00764] Anticorpos de miostatina latente anti-humanos adicionais foram gerados para o mapeamento de seus epítopos de ligação correspondentes. Dois coelhos NZW foram imunizados e colhidos conforme descrito no Exemplo 2. 1760 Linhagens de célula B que produzem anticorpo identificadas foram adicionalmente rastreadas por sua capacidade em bloquear a ativação mediada por BMP1 da miostatina latente humana. Em resumo, O sobrenadante da célula B contendo anticorpos secretados foram incubados com miostatina latente humana na presença de BMP1 humano recombinante (R&D Systems) em 37 graus C de um dia para o outro. 50 microL da mistura de reação foram então transferidos para placa de 96 poços Meso Scale Discovery MULTI-ARRAY revestidas com anticorpo de miostatina antimadura RK35 (conforme descrita na publicação internacional 2009/058346). Depois de 1 hora de incubação em temperatura ambiente com agitação, as placas foram incubadas com anticorpo de miostatina antimadura biotinilada RK22 (conforme descrita na publicação internacional 2009/058346) seguida por estreptavidina marcada com SULFO. O tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foi então adicionado à placa e o sinal ECL foi detectado pelo SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). 94 linhagens mostrando diferentes níveis de atividades de neutralização foram selecionadas para a análise a jusante (MST1495-MST1588). As regiões variáveis destas linhagens selecionadas foram clonadas conforme descritas no Exemplo 2, exceto que um vetor de expressão com a sequência da região constante de cadeia pesada F1332m (SEQ ID NO: 193) foi usado.
[00765] A atividade inibidora na ativação da miostatina latente humana foi adicionalmente avaliada para um painel de 7 anticorpos de miostatina antilatentes (MST1032, MST1504, MST1538, MST1551, MST1558, MST1572 e MST1573; os identificadores de sequência para as sequências de aminoácido destes anticorpos são mostrados na Tabeça 13). Conforme mostrado na figura 17, todos os anticorpos foram capazes de inibir a ativação mediada por BMP1 da miostatina latente humana de uma forma dependente de dose. Tabela 13
[00766] 4 anticorpos que funcionaram bem no Western blotting foram selecionados para o mapeamento de epítopo. Fragmentos da região de codificação de propeptídeo N-terminal da miostatina latente humana foram clonados em um vetor pGEX4.1 de modo a produzir fragmentos de propeptídeo marcados com GST de 100 aminoácidos cada, com sobreposição de 80 aminoácidos (Figura 18A). A expressão da proteína foi induzida em células competentes de BL21 transformado com Overnight Express Autoinduction System (Merck Millipore) e a proteína foi extraída usando o reagente de extração de proteína BugBuster (Novagen). A expressão dos fragmentos de proteína desejados em cerca de 37kDa foram verificados pela análise de Western blotting conforme descritas no Exemplo 6 (anticorpo anti-GST (Abcam)) (Figure 18B). Quando testados com anticorpos de miostatina latente anti-humana, conforme mostrado na figura 18C, embora todos os 4 anticorpos poderiam inibir a ativação da miostatina latente, eles reconhecem diferentes epítopos na miostatina latente humana. O anticorpo MST1032 poderia detector os primeiros cinco fragmentos, nenhuma faixa foi detectada depois da remoção do aminoácido 81-100 (SEQ ID NO:78). Ambos os anticorpos MST1538 e MST1572 se ligam aos três primeiros fragmentos apenas, nenhuma faixa foi detectada na ausência de aminoácido 41-60 da SEQ ID NO:78. O anticorpo MST1573 apenas se ligou fortemente aos dois primeiros fragmentos, sugerindo que o seu epítopo cai dentro do aminoácido 21-40 da SEQ ID NO:78 (Figura 18D).
EXEMPLO 23 Desenvolvimento de novas variantes de Fc melhoradas com RIIb gama de Fc
[00767] Neste exemplo, a engenharia de Fc para aumentar a depuração de miostatina é ilustrada.
[00768] Demonstrou-se na publicação internacional WO 2013/125667 que a depuração de um antígeno solúvel pode ser aumentada por sua administração de moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc exibindo uma afinidade aumentada por RIIb gama de Fc. Além disso, as variantes Fc que mostram a ligação melhorada a RIIb gama de Fc humano foram ilustradas na publicação internacional WO 2012/115241 e WO 2014/030728. Também foi ilustrado que essas variantes de Fc podem mostrar ligação seletivamente aumentada a RIIb gama de Fc humano e ligação diminuída a outras Rs gama de Fc ativas. Este aumento seletivo da ligação de RIIb gama de Fc pode ser favorável não apenas para a depuração do antígeno solúvel, mas também para diminuir o risco de funções efetoras indesejadas e resposta imune.
[00769] Para o desenvolvimento de um fármaco de anticorpo, a eficácia, farmacocinética e a segurança devem ser avaliadas em animais não humanos nos quais o fármaco é farmacologicamente ativo. Ele é ativo apenas em seres hunanos, as abordagens alternativas tal como o uso de um anticorpo substituto devem ser consideradas (Int. J. Tox. 28: 230-253 (2009)). No entanto, não seria fácil precisamente predizer os efeitos da interação entre a região Fc e Rs gama de Fc em seres humanos usando um anticorpo substituto, devido a padrões de expressão e/ou funções de Rs gama de Fc em animais não humanos, de modo que os resultados obtidos em animais não humanos poderiam ser extrapolados em seres humanos.
[00770] Deste modo, as variantes Fc que exibem a reatividade cruzada a Rs de humano e cinoFc gama Rs seriam desenvolvidos neste estudo.
[00771] O gene de cadeia pesada da variante RIIb gama de Fc humano melhorado revelado na publicação internacional WO 2012/115241 foi gerado ao substituir Pro na posição 238 na Numeração EU com Asp na cadeia pesada de MS1032LO06-SG1 que é nomeada M103205H795-SG1 (VH, SEQ ID NO: 86; CH, SEQ ID NO: 9). A cadeia pesada resultante é referida como M103205H795-MY009 (VH, SEQ ID NO: 86; CH, SEQ ID NO: 252). Como a cadeia leve do anticorpo, M103202L889-SK1 (VL, SEQ ID NO: 96; CL, SEQ ID NO: 10) foi usado. O anticorpo recombinante foi expressado de acordo com o método mostrado no Exemplo 30.
[00772] Os domínios extracelulares de Rs gama de Fc foram preparados do modo que segue. A síntese dos genes para o domínio extracelular de Rs gama de Fc humano foi realizada nos métodos conhecidos daqueles versados na técnica com base na informação registrada na NCBI. Especificamente, RIIa gama de Fc estava baseado no número de acesso da sequência de NCBI # NM_001136219.1, RIIb gama de Fc estava em NM_004001.3, RIIIa gama de Fc estava em NM_001127593.1, respectivamente. Alotipos de RIIa gama de Fc e RIIIa gama de Fc foram preparados de acordo com os relatórios sobre polimorfismo para RIIa gama de Fc (J. Exp. Med. 172:19-25 (1990)) e para RIIIa gama de Fc (J. Clin. Invest. 100(5):1059-1070 (1997)), respectivamente. A síntese do gene para o domínio extracelular de Rs gama de Fc do macaco cinomolgo foi construída através da clonagem de cDNA de cada Rs gama de Fc a partir dos macacos cinomolgos usando o método conhecido daqueles versados na técnica. As sequências de aminoácido dos domínios extracelulares construídos de Rs gama de Fc foram mostrados na lista de sequência: (SEQ ID NO 210 para RIIR gama de Fc humano, SEQ ID NO 211 for human Fc gamma RIIaH, SEQ ID NO 214 para RIIb gama de Fc humano, SEQ ID NO 217 para RIIIa gama de Fc humanoF, SEQ ID NO 218 para RIIIa gama de Fc humanoV, SEQ ID NO 220 para RIIa1 gama de Fc cino, SEQ ID NO 221 para RIIa2 para gama de Fc cino, SEQ ID NO 222 para RIIa3 gama de Fc de cino, SEQ ID NO 223 para RIIb gama de Fc de cino, SEQ ID NO 224 para RIIIaS gama Fc de cino). Então a marcação His-tag foi adicionada ao C-terminal e cada gene obtido foi inserido no vetor de expressão designado para a expressão de célula de mamífero. Um vetor de expressão foi introduzido nas células FreeStyle293 derivadas de célula renal embrionária humana (Invitrogen) para expressar a proteína- alvo. Depois da cultura, o sobrenadante de cultura resultante foi filtrado e purificado através das quatro etapas em princípio. A cromatografia em troca catiônica usando SP Sepharose FF foi realizada como a primeira etapa, uma cromatografia de afinidade contra a His-tag (HisTrap HP) como a segunda etapa, uma cromatografia em coluna de filtração em gel (Superdex200) como a terceira etapa e a filtração estéril como a quarta etapa. A absorvância em 280 nm das proteínas purificadas foram medidas usando um espectrofotômetro e a concentração da proteína purificada foi determinada usando um coeficiente de extinção calculado pelo método de PACE (Protein Science 4:2411-2423 (1995)).
[00773] A análise cinética das interações entre estes anticorpos e R gama de Fc foi realizada usando BIACORE (marca registrada) T200 ou BIACORE (marca registrada) 4000 (GE Healthcare). HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado como o tampão de execução e a temperatura de medição foi ajustada para 25 graus C. Um chip produzido pela imobilização da proteína A, proteína A/G ou cadeia leve kappa de IgG de camundongo anti-humano (BD Biosciences) em um chip sensor CM4 ou CM5 da série S (GE Healthcare) através do método de acoplamento da amina foi usado. Um anticorpo de interesse foi capturado neste chip para interagir com cada R gama de Fc que foi diluído com o tampão de execução e a ligação ao anticorpo foi medida. Depois da medição, o anticorpo capturado no chip fo lavado ao deixar a reação com 10 mM glicina-HCl, pH1.5 e 25 mM NaOH de modo que o chip foi regenerado e usado repetidamente. Os sensorgramas obtidos como resultados de medição foram analisados pelo modelo de ligação 1:1 Langmuir usando o software de avaliação BIACORE (marca registrada) para calcular a constante da taxa de ligação ka (L/mol/s) e a constante da taxa de dissociação kd (1/s), e a constante de dissociação KD (mol/L) foi calculada a partir desses valores. Já que a ligação de MS1032LO06- MY009 a RIIaH gama de Fc, RIIIa gama de Fc humanoV, e RIIIaS gama de Fc cynoFc era fraca, os parâmetros cinéticos tal como KD não poderiam ser calculados a partir do método analítico mencionado acima. Com relação a tais interações, os valores KD foram calculados usando o modelo de ligação 1:1 que segue descrito em BIACORE (marca registrada) T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE.
[00774] O comportamento das moléculas de interação de acordo com o modelo de ligação 1:1 em BIACORE (marca registrada) pode ser descrito pela Equação 1: Req =C x R max/(KD+C)+RI, em que, Req é um gráfico de níveis de ligação de estado estável, C é concentração, RI é índice refrativo em massa na amostra, e Rmax é capacidade de ligação ao analito da superfície. Quando esta equação é redisposta, KD pode ser expressado como Equação 2: KD=C x Rmax/(Req - RI) - C. KD pode ser calculada ao substituir os valores de Rmax, RI, e C na Equação 1 ou Equação 2. A partir das condições de medição atuais, RI=0, C=2 micromol/L pode ser usado. Além disso, o valor Rmax obtido quando do ajutes global do sensorgrama obtido como um resultado da análise da interação de cada R gama de Fc com IgG1 usando o modelo de ligação Langmuir 1:1 foi dividido pela quantidade de SG1 capturado, isto foi multiplicado pela quantidade de MY009 capturado, e o valor resultante que foi usado como Rmax. Este cálculo é baseado na hipótese de que a quantidade limite de cada R gama de Fc que pode ser ligada por SG1 permanece não modificada para todas as variantes produzidas pela introdução de mutações no SG1, e o Rmax no momento da medição é proporcional à quantidade de anticorpo ligado no chip no momento da medição. Req foi definido como a quantidade de ligação de cada R gama de Fc para cada variante no chip sensor observado no momento da medição.
[00775] Tabela 14 mostra o resultado da análise cinética de SG1 e MY009 contra Rs gama de FC humano e cinco. Os Valores KD nas células preenchidas em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente oor análise cinética. Os valores dd KD em vezes foram calculadis ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc
[00776] Conforme mostrado na tabela 14, a variante MY009 melhorada com RIIb gama de Fc humano não mostrou ligação melhorada a cinoRIIb gama de Fc mas mostra ligação melhorada aRIIb gama de Fc humano. A sua afinidade a cynoRIIb gama de Fc foi desse modo diminuída em 0,4 vezes comparada a SG1, indicando que a variante MY 009 não tem reatividade cruzada a Rs gama de cinoFc.
[00777] O desenvolvimento de variante de Fc que mostra ligação melhorada a ambos RIIb gama de Fc humano e cino, de forma ideal, a nova variante de Fc deve ter ligação melhorada a ambos RIIb gama de Fc humano e cino de forma seletiva e uma ligação diminuída a outras Rs gama de Fc. No entanto, devido aos resíduos de ligação Fc putatives em cinoRIIb gama de Fc serem completamente os mesmos que outro allotipo de cinoRIIa gama de Fc(Figura 19), é teoricamente impossível alcançar o aumento seletivo da ligação de cinoRIIb gama de sobre cinoRII a gama de Fc.
[00778] De modo a obter uma nova variante Fc que mostra seletivamente ligação melhorada a ambas RIIb gama de Fc de cino e humano, os resultados do estudo de mutagênese compreensiva realizados na publicação internacional WO 2012/115241 foram usados. No estudo de mutagênese compreensiva, as mutações compreensivas foram introduzidas em todas as posições na ligação do R gama das regiões Fc em anticorpos IgG1 e a ligação a cada R gama de Fc foi analisada de forma compreensiva conforme mostrado nos procedimentos que seguem. Tabela 14 Reatividade cruzada a um variante RIIb gama de Fc humano melhorado a gama Rs Legenda: KD (M) para cino FcgRs / KD (M) para humano FcgRs
[00779] A região variável de um anticorpo 3 glipicano compreendendo a CDR de GpH7 que é um anticorpo 3 antiglipicano com cinética de plasma melhorada revelada na publicação internacional WO 2009/041062 foi usada como a região variável de cadeia pesada do anticorpo (GpH7: SEQ ID NO: 225). Similarmente, para a cadeia leve do anticorpo, GpL16-k0 (SEQ ID NO: 226) do anticorpo glipicano 3 com cinética de plasma melhorada revelada na publicação internacional WO 2009/041062 foi usado. Além disso, B3 (SEQ ID NO: 228) no qual uma mutação de K439E foi introduzida em G1d (SEQ ID NO: 227) produzido pela remoção de Gly e Lys C terminal da IgG1 foi usado como a região constante da cadeia H do anticorpo. Esta cadeia pesada, que foi produzida pela fusão de GpH7 e B3, é referida como GpH7-B3 (VH, SEQ ID NO: 225; CH, SEQ ID NO: 228).
[00780] Com relação a GpH7-B3, os resíduos de aminoácido que são considerados por estarem envolvidos na ligação do R gama Fc e os resíduos de aminoácido circundantes (posições 234 a 239, 265 a 271, 295, 296, 298, 300 e 324 a 337, de acordo com Numeração EU) foram substituídos respectivamente com 18 resíduos de aminoácido excluindo o resíduo original de aminoácido e Cys. Essas variantes de Fc são referidas como variantes de B3. As variantes de B3 foram expressadas e os anticorpos purificados com a ligação da proteína A para cada R gama de Fc (RIIa gama de Fctipo H, RIIa gama de Fctipo R, RIIb gama de Fc, e RIIIaF gama de Fc) foram avaliadas de forma compreensiva como a seguir. Análise de interação entre cada anticorpo alterado e o receptor gama de Fc preparado como mencionado acima foi realizada usando BIACORE (marca registrada) T100 (GE Healthcare), BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare), BIACORE (marca registrada) A100, or BIACORE (marca registrada) 4000. HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado como o tampão de execução e a temperatura de medição foiajustada para 25 graus C. Chips produzidos pela imobilização da proteína A (Thermo Scientific), proteína A/G (Thermo Scientific) ou Proteina L (ACTIGEN ou BioVision) pelo método de acoplamento da amina a um chip sensor CM5 ou CM4 da série S (GE Healthcare) foram usados. Depois da captura dos anticorpos de interesse nesses chips sensores, um receptor gama de Fc diluído com o tampão de execução foi deixado interagir, a quantidade ligada a um anticorpo foi medida. No entanto, já que a quantidade de receptor gama de Fc ligado depende da quantidade dos anticorpos capturados, a quantidade de receptor gama de Fc ligado foi dividida pela quantidade de cada anticorpo capturado para obter os valores corretos e esses valores foram comparados. Além disso, anticorpos capturados nos chips foram lavados por 10 mM glicina- HCl, pH1.5, e os chips foram regenerados e usados repetidamente. O valor da quantidade de Ligação do R gama Fc de cada variante B3 foi dividida pelo valor da quantidade de Ligação do R gama Fc do anticorpo parental B3 (um anticorpo tendo a sequência de uma igG1 humana que ocorre naturalmente nas posições 234 a 239, 265 a 271, 295, 296, 298, 300 e 324 a 337, de acordo com Numeração EU). O valor obtido pela multiplicação deste valor por 100 foi usada como um indicador da atividade de ligação relativa a R gama de Fc de cada variante.
[00781] Tabela 15 mostra o perfil de ligação de substituições promissoras selecionadas com base nos critérios que seguem (mais do que 40% para RIIb gama de Fc humano, menor do que 100% para RIIaR gama de Fc e RIIaH gama de Fc, menos do que 10 % para RIIIa gama de Fc humanoF, comparado àqueles do anticorpo parental B3). Tabela 15
[00782] Na etapa a seguir, a reatividade cruzada dessas substituições para Rs gama cinoFc foi avaliada. Essas 16 mutações foram introduzidas em M103205H795-SG1. As variantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como cadeia leve e a sua afinidade a RIIa1, IIa2, IIa3, IIb, IIIaS gama de cino Fc foram analisadas.
[00783] A Tabela 16 mostra o perfil de ligação destas 16 variantes a Rs gama cinoFc. O valor da quantidade de Ligação do R gama Fc foi obtido pela divisão da quantidade de R gama de Fc ligado pela quantidade de cada anticorpo capturado. Este valor foi também normalizado usando o valor para SG1 como 100. Tabela 16
[00784] Dentre essas 16 variantes selecionadas de Fc, apenas MY001 manteve a ligação a cinoRIIb gama de Fc em 85% comparado a SG1. Adicionalmente MY001 mostrou a ligação reduzida a cinoRIIIaS gama Fc e a sua ligação a RIIa1, IIa2 e IIa3 gama de Fc é mantida. Como um resultado, a mutação G236N é a única substituição que mostra similar perfil de ligação a ambos Rs gama de Fc humano e cino.
[00785] Embora a substituição de G236N mostra a reatividade cruzada a ambos Rs gama de Fc de humano e cino, sua afinidade a RIIb gama de Fc é menor do que SG1 (75% para RIIb gama de Fc humano e 85% para cinoRIIb gama de Fc, respectivamente). De modo a aumentar a sua afinidade a RIIb gama de Fc, substituições adicionais foram avaliadas. Especificamente, as substituições que mostraram ligação aumentada da ligação a RIIb gama de Fc humano, reduziram a ligação a RIIIa gama de Fc humano e aumentaram a seletividade a RIIb gama de Fc humano sobre RIa gama de Fc humano foram selecionadas com base no resultado de estudo de mutagênese compreensivo (Tabela 17). Tabela 17
[00786] Dentre essas substituições, L234W e L234Y foram selecionados para aumentar a seletividade a RIIb gama de Fc humano sobre RIIa gama de FC humano. E G236A, G236S, A330R, A330K e P331E foram selecionados para diminuir a ligação a RIIIa gama de Fc humano. Todas as outras substituições foram selecionadas para aumentar a ligação a RIIb gama de Fc humano. A reatividade cruzada das substituições selecionadasto cynoFc gamma Rs foram avaliadas. Além disso, três substituições, P396M, V264I e E233D também foram avaliadas. As substituições foram introduzidas em M103205H795-SG1 e as variantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como cadeia leve.
[00787] A Tabela 18 mostra a análise cinética de substituições selecionadas incluindo G236N contra ambos Rs gama de Fc humano e de cino. Especificamente, as substituições foram introduzidas em M103205H795-SG1. As variantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como cadeia leve e a sua afinidade a RIIa1, IIa2, IIa3, IIb, IIIaS gama de Fc cino foram analisadas.
[00788] Os Valores KD em células preenchidas em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente ou análise cinética. Os valores dd KD em vezes foram calculadis ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc
[00789] G236N mostrou afinidade de ligação comparável a RIIa1 gama cinoFc, RIIa2 gama cinoFc, RIIa3 gama cinoFc, e RIIb gama de cinoFc a SG1. Embora a afinidade a RIIb gama de Fc humano é reduzida até 0,6 vez, as afinidades a RIIaH gama de Fc humano e RIIaR gama de Fc humano são reduzidas até 0,2 vez e 0,1 vez, respectivamente, indicando que esta substituição tem alta seletividade a RIIb gama de Fc humano sobre RIIa gama de Fc humano. Além disso, as suas afinidades a RIIIaS gama cinoFc e RIIIa gama de Fc humanoV são 0,03 vez e 0,04 vez, respectivamente, o que é favorável para eliminar a atividade ADCC. Com base neste resultado, G236N mostrou reatividade cruzada quase ideal a Rs gama de Fc humano e cinoFc embora a sua afinidade a ambos RIIb gama de Fc humano e cinoFc deve ser aumentada.
[00790] Dentre as substituições adicionais avaliadas, S298L, G236A, P331E, E233D, K334Y, K334M, L235W, S239V, K334I, L234W, K328T, Q295L, K334V, K326T, P396M, I332D, H268E, P271G, S267A e H268D mostraram ligação aumentada a ambos RIIb gama de Fc humano e cino. Especificamente, H268D mostrou o maior efeito (7 vezes para RIIb gama de Fc humano e 5.3 vez para RIIb gama de Fc cino). Com relação ao efeito da redução na ligação de RIIIa gama de Fc, G236S, A330K, e G236D mostraram menos do que 0,5 vez de afinidade comparado a SG1.
[00791] De modo a aumentar a afinidade a ambos RIIb gama de Fc humano e cino de MY001, as combinações de substituições listadas na Tabela 18 foram avaliadas. Especificamente, as substituições foram introduzidas em M103205H795-SG1. As variantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como a cadeia leve e sua afinidade foi analisada. A Tabela 19 mostra o resultado da análise cinética contra Rs gama de FC humano e cino. Os Valores de KD em células preenchidas em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente por análise cinética. Os valores de KD em vezes foram calculados ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc Tabela 18 Tabela 19
[00792] Todas as variantes suprimiram as afinidades a RIIIa gama de Fc humanoV por menos do que 0.26 vez e e RIIIaS gama de Fc cino por menos do que 0.42 vez comparado a SG1. Além disso, todas as variantes exceto para MY047, MY051 e MY141 mosrtaram de forma bem-sucedida a ligação a ambos RIIb gama de Fc humano e cino comparado a MY001 e a sua ligação a RIa gama de Fc humano foi mantida até menos do que 2 vezes comparado a SG1. Dentre estes, MY201, MY210, MY206, MY144, MY103, MY212, MY105, MY205, MY109, MY107, MY209, MY101, MY518, MY198 e MY197 mostraram a ligação aumentada a ambos RIIb gama de Fc humano e cino em mais do que 4 vezes comparado a SG1. Acima de todos, MY205, MY209, MY198 e MY197 mostraram a ligação aumentada a ambos RIIb gama de Fc humano e cino em mais do que 7 vezes.
[00793] Ilustrou-se na publicação internacional WO2014030728 que as substituições na posição 396 no domínio CH3 aumentaram a afinidade a RIIb gama de Fc humano. A mutagênese compreensiva foi introduzida na posição 396 de M103205H795-MY052, que contém substituições G236N/H268E/P396M. As variantes resultantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como cadeia leve e a sua afinidade a Rs gama de Fc humano e cino foi avaliada (Tabela 20). Os valores dd KD em vezes foram calculados ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc.
[00794] Dentre as substituições testadas, P396I, P396K e P396L mantiveram a ligação de RIIb gama de Fc humano em mais do que 5 vezes comparado a SG1 e apenas a substituição P396L aumentou a afinidade a RIIb gama de Fc humano comparado a MY052. Com relação à ligação a RIIb gama de Fc cino, MY052 parental mostrou a afinidade mais alta que é um aumento de 3.9 vezes a partir de SG1.
[00795] Já que G236N mostrou reatividade cruzada ideal a Rs gama Rs humano e de cino, outras substituições na posição 236 que não foram avaliadas nos exemplos precedentes foram testados. Especificamente, Asn in M103205H795-MY201 foi substituído com Met, His, Val, Gln, Leu, Thr, and Ile. As variantes resultantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 a cadeia leve e sua afinidade a Rs gama de Fc humano e de cino foi avaliada (Tabela 21). Os Valores KD em células preenchidas em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente por análise cinética. Os valores dd KD em vezes foram calculados ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc Tabela 20 Tabela 21 Tabela 22
[00796] Embora todas as variantes mostraram afinidade diminuída a RIIb gama de Fc humano e de cino comparado ao MY201, MY265 parental, que é substituído ao substituir Asn com Thr na posição 236 de MY201, mantiveram ligação aumentada em 2.1 vezes por RIIb gama de Fc humano e 3.1 vezes por RIIb gama de Fc cino, respectivamente comparado a SG1. MY265 também manteve ligação reduzida a ambos RIIIa gama de Fc humano e de cino. Embora a afinidade a RIIaH gama de Fc humano e RIIaR gama de Fc foi aumentada em mais de 2.5 vezes comparado a SG1, G236T é a segunda substituição favorável na posição 236.
[00797] De modo a melhorar a seletividade e a afinidade de MY265 a RIIb gama de Fc humano, o estudo de mutagênes compreensivo na posição 231 e 232 foi realizado. Especificamente, as posições 231 e 232 de M103205H795-MY265 foram substituídas com 18 resíduos de aminoácido excluindo o aminoácido original e Cys. As variantes resultantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como cadeia leve e sua afinidade a Rs gama de Fc humano e de cino foi avaliada (Tabela 22). Os valores dd KD em vezes foram calculados ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc
[00798] Com relação à afinidade a RIIb gama de Fc, a adição de A231T, A231M, A231V, A231G, A231F, A231I, A231L, A231, A231W, P232V, P232Y, P232F, P232M, P232I, P232W, P232L aumentou a ligação a ambos RIIb gama de Fc humano e de cino comparado a MY265 parental. Acima de tudo, a adição de A231T e A231G reduziram a ligação a RIIaR gama de Fc humano comparado a MY265.
[00799] A combinação das substituições que não foi substituída foi avaliada nos exemplos presentes. As substituições foram testadas e que revelaram ser promissoras foram introduzidas em M103205H795- SG1 em combinação. As variantes resultantes foram expressadas usando M103202L889-SK1 como cadeia leve e sua afinidade a Rs gama de Fc humano e de cino foi avaliada. A tabela 23 mostra o resultado e os Valores KD em células preenchidas em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente por análise cinética. Os valores dd KD em vezes foram calculados ao dividir o valor de KD de SG1 pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc. Os valores para MY209 foi foi selecionado como uma variante promissora na Tabela 19 foram mostrados novamente para comparação.
[00800] Dentre as variantes testadas, apenas MY213 mostrou maior afinidade de ligação a ambos RIIb gama de Fc humano e de cino coparado a MY209. No entanto, as afinidades de MY213 a RIIaH gama de Fc humano e RIIaR gama de Fc humano são maiores do que aquela de MY209. Tabela 23A Tabela 23B [Tabela 24]
EXEMPLO 24
[00801] Avaliação da depuração de miostatina usando variantes Fc aumentadas com RIIb gama de Fc em todos os R gama de Fc humanos de camundongos transgênicos
[00802] O efeito da depuração de miostatina através da variante Fc aumentada por RIIb gama de Fc construído no Exemplo 23 foi avaliado em um camundongo no qual todas Rs gama de Fc de murino foram deletados e Rs gama de Fc humano, codificados como transgenes, foram inseridos no genoma do camundongo (Proc. Natl. Acad. Sci., 2012, 109, 6181). Nestes camundongos, todas Rs gama de Fc de camundongo são substituídas com as humanas de modo que o aumento do efeito da afinidade a RIIb gama de Fc humano na depuração de antígeno solúvel possa ser avaliada no camundongo. Além disso, as substituições crescentes de pI foram avaliadas em combinação com variantes FC aumentadas com RIIb gama de Fc construídos no Exemplo 23.
Preparação e perfil de variantes testadas
[00803] Os 8 anticorpos testados e seus perfis de ligação são sumarizados na Tabela 24. A cadeia pesada, MS103205H795-PK2, foi preparade ao introduzir substituições crescentes de pl (S400R/D413K) em MS103205H795-MY101. MS103205H795-MY351, MS103205H795- MY344, MS103205H795-MY335 foram preparados ao introduzir outras substituições crescentes de pl (Q311R/D413K) em MS103205H795- MY201, MS103205H795-MY205, MS103205H795-MY265, respectivamente. Todas as variantes de MS1032LO06 foram expressadas com M103202L889-SK1 como cadeia leve de acordo com o método mostrado no Exemplo 23 e as suas afinidades a Rs gama de Fc humano e de cino foram avaliadas usando o método no Exemplo 23.
[00804] Com base na análise SPR sumarizada na Tabela 24, confirmou-se que as substituições crescentes de pl não afetam a ligação do R gama Fc de variantes aumentadas com RIIb gama de Fc. MY101 e PK2, que foram preparados ao introduzir S400R/D413K no MY101, mostram 9 vezes e 8 vezes a ligação aumentada de RIIb gama de Fc humano, respectivamente. As afinidades de MY101 e PK2 a RIa gama de Fc humano permaneceram comparáveis a SG1. Com relação a outros Rs gama de Fc humano e de cino, elas mostram o mesmo perfil de ligação. Similarmente, MY351 mostrou perfil de ligação similar com aquele de MY201 parental, MY344 com aquele de MY205 parental, e MY335 com aquele de MY265 parental (Tabela 21), respectivamente. Esses resultados indicam que ambos os pares de substituições crescentes de pl, S400R/D413K ou Q311R/D413K, não afetam as afinidades a Rs gama de Fc humano e de cino.
Estudo PK em todos os R gama de Fc humano de camundongos transgênicos
[00805] Teste in vivo usando todos os R gama de Fc humano Fc de camundongos transgênicos
[00806] A eliminação de miostatina e anticorpo de miostatina antilatente foi avaliada in vivo mediante a administração de anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente humana em todos os R gama de Fc humano de camundongos transgênicos (Figuras 20 e 21). Um anticorpo de miostatina antilatente (0.3 mg/ml) e miostatina latente (0.05 mg/ml) foram administrados em uma dose única de 10 ml/kg na veia caudal. Um anticorpo anti-CD4 (1 mg/ml) foi administrado três vezes (a cada 10 dias) em uma dose de 10 ml/kg na veia caudal para suprimir o anticorpo anti-fármaco. O sangue foi coletado em 5 minutos, 15 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois da administração. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 15,000 rpm em 4 graus C por 5 minutos para separar o plasma. O plasma separado foi armazenado em ou abaixo de -20 graus C até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatente usados foram MS1032LO06-SG1, MS1032LO06-MY101, MS1032LO06-PK2, MS1032LO06-MY201, MS1032LO06-MY351, MS1032LO06-MY205, MS1032LO06-MY344 e MS1032LO06-MY335.
[00807] Medição da concentração da miostatina total no plasma por eletroquimioluminescência (ECL)
[00808] A concentraçao de miostatina total no plasma de camundongo foi medida por ECL. As placas imobilizadas com anticorpo de miostatina antimadura foram preparadas pela dispensação de anticorpo de miostatina antimadura RK35 (publicação internacional WO 2009058346) em uma placa de 96 poços MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) e incubadas de um dia para o outro a 4 graus C. As amostras da curva de calibração da miostatina madura e as amostras do plasma de camundongo diluídas 4 vezes ou mais foram preparadas. As amostras foram misturadas em uma solução acídica (0.2 M Glicina-HCl, pH2.5) para dissociar a miostatina madura de sua proteína de ligação (tal como propeptídeo). Subsequentemente, as amostras foram adicionadas em uma placa imobilizada com anticorpo de miostatina anti-madura, e deixadas se ligar por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. A seguir, o anticorpo de miostatina antimadura marcado com BIOTIN TAG RK22 (publicação internacional WO 2009/058346) foi adicionado e a placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. A seguir, estreptavidina marcada com SULFO TAG (Meso Scale Discovery) foi adicionada e a placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem. O tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foi imediatamente adicionado à placa e o sinal foi detectado por SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). A concentração da miostatina madura foi calculada com base na respostada curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O tempo de duração da concentração total da miostatina no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente and miostatina latente medida por este método é mostrada na Figura 20.
[00809] Medição da concentração do anticorpo de miostatina antilatente no plasma através de cromatografia líquida em alto desempenho-espectrometria de massa por eletropulverização tandem (LC/ESI-MS/MS)
[00810] A concentração do anticorpo de miostatina antilatente no plasma de camundongo foi medida por LC/ESI-MS/MS. As concentrações dos padrões de calibração eram de 1.56 25, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 e 200 microg/mL em camundongos plasma. O três microL dos padrões de calibração e amostras de plasma foram adicionados a 50 microL de Ab-Capture Mag (ProteNova), de deixados incubar por 2 horas em temperatura ambiente. Depois disso, as esferas magnéticas foram recuperadas e lavadas duas vezes com 0.2 mL de 10 mmol/L de PBS com 0.05% Tween 20. Subsequentemente, as esferas magnéticas foram lavadas com 10 mmol/L de PBS para assegurar a remoção de Tween 20. Depois da lavagem, as esferas magnéticas foram suspensas em 25 microL de 7.5 mol/L Urea, 8 mmol/L de ditiotreitol e 1 microg/mL de lisozima (clara do ovo) em 50 mmol/L de bicarbonato de amônio e as amostras suspensas foram incubadas por 45 minutos a 56 graus C. Depois, 2 microL de 500 mmol/L de iodoacetoamida foram adicionados e as amostras foram incubadas por 30 minutos em 37 graus C no escuro. A seguir, a digestão de Lisil Endopeptidase foi realizada ao adicionar 150 microL de 0.67 microg/mL de Lisil Endopeptidase para a bioquímica (Wako) em 50 mmol/L de bicarbonato de amônio e as amostras foram incubadas por 3 h em 37 graus C. Subsequentemente, a digestão tríptica foi realizada ao adicionar 10 microL de 10 microg/mL de tripsina modificada pelo grau de sequenciamento (Promega) em 50 mmol/L de bicarbonato de amônio. As amostras foram deixadas digerir sob misturação de um dia para o outro em 37 graus C, e temperadas ao adicionar 5 microL de ácido trifluoroacético 10%. Cinquenta microL de amostras da digestão foram submetidas à análise por LC/ESI-MS/MS. LC/ESI-MS/MS foi realizada usando Xevo instrumento quadruplo triplo TQ-S (Waters) equipado com 2D I-class UPLC (Waters). O peptídeo específico de anticorpo de miostatina antilatente YAFGQGTK e peptídeo específico de Lisozima GTDVQAWIR como um padrão interno foram monitorados pela monitoração da reação selecionada (SRM). A transição da SRM foi de [M+2H]2+ (m/z 436.2) para y8 ion (m/z 637.3) para o anticorpo de miostatina antilatente, e [M+2H]2+ (m/z 523.3) para y8 ion (m/z 545.3) para a lisozima. A curva de calibração interna foi construída pela regressão linear ponderada (1/x or 1/x2) usando a área de pico em gráfico em oposição às concentrações. A concentração no plasma de camundongo foi calculada a partir da curva de calibração usando o software analítico Masslynx Ver.4.1 (Waters). O tempo de duração da concentração de anticorpo no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente medida por este método é mostrado na Figura 21.
Efeito de pl e Ligação do R gama Fc na concentração de miostatina in vivo
[00811] Depois da administração de MS1032LO06-SG1, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 5 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Em contraste, depois da administração de MS1032LO06-MY101, MS1032LO06-MY201 e MS1032LO06-MY205, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 28-200 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Além disso, depois da administração de MS1032LO06-PK2, MS1032LO06-MY351, MS1032LO06-MY344 e MS1032LO06-MY335, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 361419 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Por outro lados, a diferença em cada concentração de anticorpo em cada ponto de amostragem comparado a MS1032LO06- SG1's estava aproximadamente dentro de 2 vezes e as variantes de pI não aumentaram a eliminação de anticorpo a partir de plasma. Ambas a ligação de RIIb gama de Fc humano aumentou os anticorpos e as substituições crescentes de pI aumentaram a eliminação de miostatina, mas não de anticorpos.
[00812] As variantes altas de pI têm mais carga positiva no plasma. Já que esta carga positiva interage com a superfície celular de carga negativa, o complexo imune de antígeno-anticorpo de variantes de pl alto chegam próximo à superfície celular, o que resultou na absorção celular aumentada do complexo imune de antígeno-anticorpo de variantes de pl alto.
EXEMPLO 25 Avaliação da depuração de miostatina usando variantes Fc aumentadas com RIIb gama de Fc em macaco
[00813] O efeito da ligação aumentada de variants Fc desenvolvidas no Exemplo 23 a RIIb gama de Fc de cino na varredura de miostatina foi avaliado no macaco cinomolgo. E o efeito de combinação com substituições crescentes de pl também foi avaliado.
Preparação e perfil das variantes testadas
[00814] Os 14 anticorpos testados e os seus perfis de ligação são sumarizados na Tabela 25. Reportou-se que a variante Fc com a ligação aumentada a FcRn em pH acídico melhora a meia-vida do anticorpo in vivo (J. Biol. Chem. 2006 281:23514-23524 (2006); Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010), Clin Pharm. & Thera. 89(2):283-290 (2011)). Para melhorar a meia-vida do anticorpo sem ligação ao fator reumatoide, combinaram-se essas substituições com RIIb gama de Fc aumentado com variantes Fc aumentadas em pI.
[00815] A cadeia pesada, MS103205H795-SG1012, MS103205H795- SG1029, MS103205 H795-SG1031, MS103205H795-SG1033, MS103205H795-SG1034 foi preparada ao introduzir a substituição de N434A na MS103205H795-MY101, MS103205 H795-MY344, MS103205H795-MY351, MS103205H795-MY201, MS103205H795- MY335, respectivamente. MS103205H795-SG1016 foi preparado ao introduzir substituições crescentes de pl (Q311R/D399K) em MS103205H795-SG1012. MS103240H795-SG1071 e MS103240H795- SG1079 foram preparados ao introduzir as substituições M428L/N434A/Y436T/ Q438R/S440E e substituições N434A/Q438R/S440E em MS103240 H795-MY344 respectivamente (MS103240H795: VH, SEQ ID NO; 92).
[00816] MS103240H795-SG1074 e MS103240H795-SG1077 foram preparados ao introduzir substituições crescentes de plQ311R/P343R e substituições M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E em MS103240H795- MY209 e MS103240H795-MY518, respectivamente. MS103240H795- SG1080 e MS103240H795-SG1081 foram preparados ao introduzir substituições crescentes de plQ311R/P343R e substituições N434A/Q438R/S440E em MS103240H795-MY209 e MS103240H795- MY518, respectivamente. MS103240H795-SG1071 foi preparado ao introduzir substituições crescentes de plQ311R/D413K e substituições M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E em MS103240H795-MY205. MS103240H795-SG1079 foi preparado ao introduzir substituições crescentes de plQ311R/D413K e substituições N434A/Q438R/S440E em MS103240H795-MY205. Essas variantes de MS1032LO06 e variantes de MS1032LO19 foram expressadas com M103202L889-SK1 e M103202L1045-SK1 respectivamente (M103202L1045: VL, SEQ ID NO: 97) como cadeia leve de acordo com o método mostrado no Exemplo 30 a as suas afinidades e Rs gama de Fc humano e de cino foram avaliadas usando o método no Exemplo 23. Neste exemplo, o valor de cada D para cada variante Fc foi calculado ao dividir o valor de KD do SG1 parental pelo valor de KD da variante para cada R gama de Fc Por exemplo, os valores de KD para MS1032LO06-SG1012 e MS1032LO19-SG1071 foram calculados ao dividir os valores KD de MS1032LO06-SG1 e MS1032LO19-SG1 pelos valores KD de MS1032LO06-SG1012 e MS1032LO19-SG1071 respectivamente. Tabela 25
[00817] Os resultados da análise SPR são sumarizados na Tabela 25. Dentre essas variantes, SG1012, SG1016, SG1074 e SG1080 mostram a afinidade mais forte a RIIb gama de Fc humano, que tem a afinidade aumentada em 10 vezes a RIIb gama de Fc humano comparado a SG1.
29.2. Estudo PK em macaco Teste in vivo usando macaco cinomolgo
[00818] O acúmulo de miostatina endógena foi avaliado in vivo mediante a administração de anticorpo de miostatina antilatente em Macaca fascicularis de 2-4 anos (macaco cinomolgo) da Cambodia (Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd., Japan). Um nível de dose de 30mg/kg foi injetado na veia cefálica da pata dianteira usando uma seringa descartável, tubo de extensão, agulha permanente, e bomba de infusão. A velocidade de dosagem era de 30 minutos por corpo. O sangue foi coletado antes do início da dosagem em tanto 5 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias depois do final da dosagem, ou 5 minutos e 2, 4 e 7 horas e 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias depois do final da dosagem. O sangue foi retirado da veia femural com uma seringa contendo heparina sódica. O sangue foi imediatamente resfriado em gelo, e o plasma foi obtido através de centrifugação em 4 graus C, 1700xg por 10 minutos. As amostras de plasma foram armazenadas em um freezer (faixa aceitável: -70 graus C ou abaixo) até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatente usados foram MS1032LO00-SG1, MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033 e MS1032LO06-SG1034 (no presente documento, SG1012, SG1016, SG1029, SG1031, SG1033 e SG1034 são a região constante de cadeia pesada construída com base em SG1 conforme descrito abaixo).
[00819] Um nível de dose de 2mg/kg foi administrado na veia cefálica da pata dianteira ou veia safena usando uma seringa descartável, e agulha permanente para os anticorpos de miostatina antilatentes MS1032LO19- SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19- SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077 (no presente documento, SG1079, SG1071, SG1080, SG1074, SG1081 e SG1077 são a região constante de cadeia pesada construída com base em SG1 conforme descrito abaixo). O sangue foi coletado antes do início da dosagem e 5 minutos e 2, 4 e 7 horas e 1, 2, 3, 7, 14 dias depois do final da dosagem. O sangue foi processado conforme descrito acima. As amostras de plasma foram armazenadas em um freezer (faixa aceitável: - 70 graus C ou abaixo) até a medição.
Medição da concentração da miostatina total no plasma por eletroquimioluminescência (ECL)
[00820] A concentraçao de miostatina total no plasma de macaco foi medida por ECL conforme descrita no Exemplo 20. O tempo de duração da concentração de miostatina total no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente como medida por este método é mostrada na Figura 22.
Medição de ADA em plasma de macaco usando eletroquimioluminescência (ECL)
[00821] O fármaco biotinilado foi revestido em uma placa de estreptavidina de 96 poços MULTI-ARRAY(Meso Scale Discovery) e incubado em tampão cruzado baixo (Candor) por 2 horas em temperatura ambiente. As amostras do plasma de macaco foram diluídas 20 vezes em tampão cruzado baixo antes da adição à placa. As amostras foram incubadas de um dia para o outro a 4oC. No dia seguinte, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem antes da adição de anticorpo secundário de IgG marcado com SULFO TAG (Thermo Fisher Scientific). Depois de incubação por uma hora em temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem. O tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foi imediatamente adicionado à placa e o sinal foi detectado usando um SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
Efeito da engenharia dependente de pH e de Fc no acúmulo de miostatina em macaco in vivo
[00822] No macaco cinomolgo, a administração de anticorpo não dependente de pH (MS1032LO00-SG1) resultou em pelo menos um aumento de 60 vezes na concentração de miostatina a partir da linha de base no dia 28. No dia 28, os anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH MS1032LO06-SG1012 e MS1032LO06-SG1033 resultaram em um aumento de 3 vezes e 8 vezes a partir da linha de base respectivamente. A forte varredura foi principalmente contribuída pelo aumento na afinidade ao RIIb gama de Fc de macaco cinomologo. No dia 28, os anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031 e MS1032LO06- SG1034 poderiam rastrear antígeno até abaixo da linha de base. A razão para a forte varredura de MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06- SG1031 e MS1032LO06-SG1034 são um aumento em absorção não específica na célula devido ao aumento no agrupamento da carga positiva do anticorpo e um aumento em absorção celular mediada por R gama de Fc devido a ligação aumentada a R gama de Fc.
[00823] Administração de anticorpos de miostatina antilatente dependentes de pH MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077 reduziram a concentração de miostatina para abaixo do limite de detecção (<0.25ng/mL) a partir do dia 1 em macaco cinomolgo. No dia 14, a concentração de miostatina aumentou acima do limite de detecção para MS1032LO19-SG1079 e MS1032LO19-SG1071 enquanto que a concentração de miostatina permaneceu abaixo do limite de detecção para MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 e MS1032LO19-SG1077. A supressão mais fraca de MS1032LO19-SG1079 e MS1032LO19-SG1071 poderia ser devida à diferença nas mutações de pl.
[00824] Os dados sugerem que a forte varredura de miostatina a partir do plasma poderia ser alcançada pelas mutações que aumentam a ligação a RIIb gama de Fc ou combinar mutações que aumentam carga positiva do anticorpo e aumentam a ligação a RIIb gama de Fc. Espera-se que a forte varredura de miostatina poderia ser alcançada em humanos ao se combinar as mutações que aumentam carga positiva do anticorpo e aumentam a ligação a R gama de Fc.
EXEMPLO 26 Rastreamento das substituições aumentadas por pI para aumentar a depuração da miostatina.
[00825] Para aumentar a depuração da miostatina, as substituições aumentadas por pI em porção Fc do anticorpo foram avaliadas neste exemplo. O método para adicionar substituições de aminoácido à região constante do anticorpo para aumentar o pI não é particularmente limitado, mas por exemplo, ele pode ser realizado pelo método descrito na publicação internacional WO 2014/145159. Como no caso da região variável, as substituições de aminoácido introduzidas na região constante são preferivelmente aquelas que diminuem o número de aminoácidos negativamente carregados (tal como ácido aspártico e ácido glutâmico) enquanto aumentam os aminoácidos positivamente carregados (tal como arginina e lisina). Além disso, as substituições de aminoácido podem ser introduzidas em qualquer posição na região constante do anticorpo, e podem ser uma substituição única de aminoácido ou uma combinação de múltiplas substituições de aminoácido. Sem limitação particular, os sítios para introduzir as substituições de aminoácido são preferivelmente posições onde as cadeias laterais de aminoácido podem ser expostas na superfície molecular do anticorpo. Os exemplos particularmente preferíveis incluem o método para introduzir uma combinação de múltiplas substituições de aminoácido em tais posições que podem ser expostas na molécula superficial no anticorpo. Alternadamente, as múltiplas substituições de aminoácido introduzidas aqui são preferivelmente posições de modo que elas estejam estruturalmente próximas uma a outra. Além disso, sem limitação particular, as múltiplas substituições de aminoácido introduzidas no presente documento são preferivelmente substituições aos aminoácidos positivamente carregados, de modo que eles preferivelmente resultam em um estado onde múltiplas cargas positivas estão presentes em posições estruturalmente proximais.
Preparação e perfil de variantes testadas
[00826] Os anticorpos testados são sumarizados na Tabela 26. A cadeia pesada, MS103205H795-SG141 foi preparada ao introduzir substituições crescentes de plQ311R/D399R em MS103205H795-SG1. Outras variantes da cadeia pesada também foram preparadas ao introduzir respectivas substituições representadas na Tabela 26 em MS103205H795-SG1. Todas as variantes de MS1032LO06 foram expressadas com M103202L889-SK1 como cadeia leve de acordo com o método mostrado no Exemplo 30.
[00827] Ensaio de ligação a RII gama de Fc de camundongo de variantes de Fc aumentadas com pI usando BIACORE (marca registrada)
[00828] Com relação aos anticorpos contendo variantes da região Fc, os ensaios de ligação entre RII gama de Fc de camundongo solúvel e complexos de antígeno-anticorpo foram realizados usando BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare). RII gama de Fc de camundongo solúvel foi produzido na forma de uma molécula marcada com His por um método conhecido daqueles versados na técnica. Uma quantidade adequada de anticorpo anti-His foi fixada no Chip Sensor CM5 (GE Healthcare) pelo método de acoplamento de amina usando um kit de captura His (GE Healthcare) para capturar RII gama de Fc de camundongo. A seguir, um complexo de anticorpo-antígeno e um tampão de execução (como uma solução de referência) foram injetados e a interação foi deixada acontecer com o RII gama de Fc de camundongo capturado no chip sensor. Ácido N-(2-acetamido)-2- aminoetanossulfônico 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1,2 mM e 0.05% (p/v) Tween 20 no pH7.4 foi usado como o tampão de execução, e o respectivo tampão também foi usado para diluir o RII gama de Fc de camundongo solúvel. Para regenerar o chip sensor, glicina-HCl 10mM no pH1.5 foi usado. Todas as medições foram realizadas em 25 graus C. As analyses foram realizadas com base na ligação (RU) calculada a partir de sensorgramas obtidos pelas medições, e os valores relativos quando a quantidade de ligação de SG1 foi definida como 1.00 são mostrados. Para calcular os parâmetros, o BIACORE (marca registrada) T100 Evaluation Software (GE Healthcare) foi usado.
[00829] Os resultados de análise SPR são resumidos na Tabela 26. Poucas variantes de Fc foram mostradas para ter afinidade melhorada em relação a RII gama de Fc de camundongo fixada no chip sensor de BIACORE (marca registrada).
[00830] Enquanto não está restrito a uma teoria específica, este resultado pode ser explicado como segue. O chip sensor BIACORE (marca registrada) é conhecido por ser negativamente carregado e este estado carregado pode ser considerado por parecer a superfície celular de membrana. Mais especificamente, a afinidade de um complexo de antígeno-anticorpo por RII gama de Fc de camundongo fixado no sensor chip BIACORE negativamente carregado (marca registrada) é suposto parecer a maneira na qual o complexo de antígeno-anticorpo se liga a RII gama de Fc de camundongo presente em uma superfície de membrana celular negativamente carregada. Tabela 26
[00831] Aqui, os anticorpos produzidos ao introduzir as modificações crescentes em pI na região Fc são anticorpos nos quais a carga da região Fc está mais para o lado positivo quando se compara com a introdução anterior das modificações. Deste modo, a interação coulômbica entre a região Fc (carga positiva) e a superfície do chip sensor (carga negativa) pode ser considerada por ser fortalecida pelas modificações de aminoácido crescentes em pl. Além disso, espera-se que tais efeitos aconteçam similarmente na mesma superfície de membrana celular negativamente carregada; deste modo, também se espera mostrar um efeito da acelaração da velocidade da absorção nas células in vivo.
[00832] Dentre as variantes de Fc aumentadas em pl com a substituição de aminoácido a partir de SG1, o complexo de antígeno- anticorpo produzido por SG141, P1499m, P1501m e P1540m mostra a ligação mais alta a RIIb gama de Fc humano. Supõe-se que as substituições de aminoácido em Q311R/D399R, Q311R/P343R, Q311R/D413R e D401R/D413K têm forte efeito de carga na ligação a RIIb gama de Fc humano no chip sensor.
[00833] Absorção celular de variantes de Fc aumentadas em pl
[00834] Para avaliar a taxa de absorção intracelular em uma linhagem celular que expressa RIIb gama de Fc humano, em seguida ao ensaio foi realizada. Uma linhagem celular de MDCK (renal canina Madin-Darby) que expressa constitutivamente RIIb gama de Fc humano foi produziad por métodos conhecidos. Ao usar essas células, a absorção intracelular de complexos de antígeno-anticorpo foi avaliada.
[00835] Especificamente, pHrodoRed (Life Technlogies) foi usado para marcar a miostatina latente humana (antígeno) de acordo com um protocolo estabelecido, e complexos de antígeno-anticorpo foram formados em uma solução de cultura com a concentração de anticorpo sendo de 10 mg/mL e a concentração de antígeno sendo de 2.5 mg/mL. A solução de cultura contendo os complexos de antígeno-anticorpo foi adicionada às placas de cultura das células MDCK mencionadas acima que expressam constitutivamente RIIb gama de Fc humano e incubadas por uma hora, e então a intensidade da fluorescência do antígeno tomada nas células foi quantificada usando InCell Analyzer 6000 (GE healthcare). A quantidade de antígeno tomada foi apresentada como valores relativos ao valor de SG1 que é tomado como 1.00.
[00836] Os resultados de quantificação da absorção celular foram sumarizados na Tabela 26. A forte fluorescência derivada do antígeno nas células foi observada em várias variantes de Fc.
[00837] Enquanto não se restringe a uma teoria específica, este resultado pode ser explicado como segue.
[00838] O antígeno e anticorpos adicionaos à solução de cultura celular formam complexos de antígeno-anticorpo na solução de cultura. Os complexos de antígeno-anticorpo se ligam a RIIb gama de Fc humano expressada na membrana celular através da região Fc do anticorpo e são tomados nas células de um modo dependente de receptor. Os anticorpos usados neste experimento se ligam ao antígeno de um modo dependente de pH; desta forma, o anticorpo pode dissociar a partir do antígeno nos endossomos (condições de pH acídico) dentro das células. Já que o antígeno dissociado é marcado com pHrodoRed conforme descrito antes, ele fluoresce nos endossomos. Sendo assim, acredita-se que uma forte intensidade de fluorescência dentro da célula indica que a absorção dos complexos de antígeno-anticorpo nas células está acontecendo mais rapidamente ou em maiores quantidades.
[00839] Dentre as variantes de Fc aumentadas em pl com as duas substituições de aminoácido a partir de SG1, o complexo de antígeno- anticorpo produzido por SG141, P1375m, P1378m, P1499m, P1524m, P1525m, P1532m, P1533m, P1540m, P1541m e P1543m mostra absorção mais forte do antígeno nas células. Supõe-se que as substituições de aminoácido em Q311R/D399R, Q311R/D413K, S400R/D413K, Q311R/P343R, Q311R/G341R, Q311R/G341K, Q311R/D401R, Q311R/D401K, D401R/D413K, D401K/D413K e G402K/D413K têm efeito de carga forte na absorção do complexo de antígeno-anticorpo nas células.
Estudo PK em FcRn humano de camundongo transgênico Teste in vivo usando FcRn humano de camundongos transgênicos
[00840] A eliminação de miostatina e anticorpo de miostatina antilatente foi avaliada in vivo mediante a co-administração de anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente em FcRn humano de camundongos transgênicos no qual o FcRn de camundongo foi substituído com FcRn humano. Um anticorpo de miostatina antilatente (0.1 mg/ml) e camundongo miostatina latente (0.05 mg/ml) foram administrados em uma dose única de 10 ml/kg na veia caudal no experimento PK-2 (descrito na Figura 23). Um anticorpo de miostatina antilatente (0.3 mg/ml), miostatina latente humana (0.05 mg/ml) e imunoglobulina normal humana (CSL Behring AG) (100 mg/ml) foram administrados em uma dose única de 10 ml/kg na veia caudal no experimento PK-4 (descrito na Figura 24). O sangue foi coletado em 5 minutos, 15min, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 dia, 2dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois da administração no experimento PK-2. O sangue foi coletado em 5 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 dia, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 30 dias depois da administração no experimento PK- 4. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 15,000 rpm em 4 graus C por 5 minutos para separar o plasma. O plasma separado foi armazenado em ou abaixo de -20 graus C até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatente usados foram MS1032LO06-SG1, MS1032LO06-P1375m, MS1032LO06-P1378m, MS1032LO06- P1383m no experimento PK-2, e MS1032LO06-P1375m, MS1032LO06-P1499m no experimento PK-4.
Medição da concentração da miostatina total no plasma por eletroquimioluminescência (ECL)
[00841] A concentraçao de miostatina total no plasma de camundongo foi medida por ECL conforme descrito no Exemplo 24 (Ravetch PK). O tempo de duração da concentração total da miostatina no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente e latent miostatina medida por este método é mostrada nas Figuras 23A e 24A.
[00842] Medição da concentração do anticorpo de miostatina antilatente no plasma através do ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA)
[00843] A concentração de anticorpo de miostatina antilatente no plasma de camundongo foi medida por ELISA no experimento PK-2. A IgG anti-humana (específica da cadeia gama) do fragmento F(ab')2 de anticorpo (Sigma) foi dispensada em um Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) e deixada permanecer de um dia para o outro a 4 graus C para preparar placas imobilizadas por IgG anti-humana. As amostras de curva de calibração tendo concentrações de plasma de 2,5, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078 e 0,039 microg/ml, e as amostras de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas. Depois, as amostras foram dispensadas nas placas imobilizadas com IgG anti-humana e deixadas permanecer por 1 hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, o conjugado de IgG de cabra anti-humana (específica da cadeia gama) e biotina (Southern Biotech) foi adicionado para reagir por 1 hora em temperatura ambiente. Depois, estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi adicionada para reagir por uma hora em temperatura ambiente e a reação cromogênica foi realizada usando substrato TMB One Component HRP Microwell (BioFX Laboratories) como um substrato. Depois de parar a reação com ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), a absorvência em 450 nm foi medida por uma leitora de microplacas. A concentração no plasma de camundongo foi calculada a partir da absorvência da curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O tempo de duração da concentração de anticorpo no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente e a miostatina latente medida por este método é mostrada na Figura 23B.
[00844] A concentração de anticorpo de miostatina antilatente no plasma de camundongo foi medida por um Gyrolab BioaffyTM CD (Gyros) no experimento PK-4. Anticorpo de FC da IgG anti-humana biotinilada foi passado sobre a coluna de esferas de estreptavidina dentro da microestrutura dos CDs. Amostras da curva de calibração tendo concentrações de plasma of 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 e 32 microg/ml que aumentam as concentrações de plasma de 5 mg/mL de imunoglobulina normal humana (CSL Behring AG) e 200 microg/ml da miostatina latente do camundongo e as amostras do plasma do camundongo diluídas 25 vezes ou mais aumentando as concentrações de plasma de 200 microg/ml da miostatina latente dos camundongos foram preparadas. Depois, as amostras foram adicionadas nos CDs e passadas sobre a coluna de esferas. Subsequentemente, o anticorpo monoclonal de IgG de cabra anti-humana marcada com Alexa (BETHYL) foi adicionada nos CDs e passados sobre a coluna de esferas. A concentração no plasma de camundongo foi calculada a partir da resposta da curva de calibração usando o programa Gyrolab Evaluator. O tempo de duração da concentração do anticorpo no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente medida por este método é mostrada na Figura 24B.
Efeito da pl na concentração de miostatina in vivo
[00845] Depois da administração de MS1032LO06-SG1, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 12 horas comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos no experimento PK-2. Em contraste, depois da administração de MS1032LO06-P1375m, MS1032LO06-P1378m e MS1032LO06- P1383m, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 26-67 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos no experimento PK-2. Concentração do anticorpo de MS1032LO06-P1378m e MS1032LO06-P1383m diminuiu mais do que 3 vezes comparado àquela de MS1032LO06-SG1, embora a diferença na concentração de MS1032LO06-P1375m em cada ponto de amostragem comparado a MS1032LO06-SG1 estava dentro de 2 vezes no experimento PK-2. As variantes pI as substituições de aminoácido em Q311R/D413K mostraram o aumento da eliminação de miostatina a partir do plasma sem o aumento da eliminação do anticorpo a partir do plasma.
[00846] Além disso, a concentração de miostatina total e concentração do anticorpo depois da administração de MS1032LO06- P1499m foi avaliadaa sob a co-administração de imunoglobulina normal humana ao plasma humano mímico. Depois da administração de MS1032LO06-P1375m e MS1032LO06-P1499m, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 3,4 e 5,3 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos, e a concentração de miostatina total e concentração do anticorpo em cada ponto de amostragem em MS1032LO06-P1499m estava dentro de 1,5 vezes comparado àquela em MS1032LO06-P1375m no experimento PK-4. As variantes pI incluindo as substituições de aminoácido em Q311R/P343R também mostraram a eliminação de miostatina a partir do plasma sem o aumento da eliminação do anticorpo a partir do plasma.
[00847] Variantes de pI alto têm mais carga positiva no plasma. Já que esta carga positiva interage com a superfície celular da carga negativa, o complexo imune antígeno-anticorpo de variantes de pI alto chega próximo à superfície celular, resultando na absorção celular aumentada do complexo imune antígeno-anticorpo de variantes de pl alto.
EXEMPLO 27 Substituições de pl aumentado em combinação com variante Fc aumentado com RIIb gama de Fc
[00848] O efeito da depuração de miostatina através da variante Fc aumentada por RIIb gama de Fc em combinação com outras substituições crescentes de pl foi avaliado em RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos. RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos foi gerado através da microinjeção do vetor BAC (cromossomo artificial bacteriano) contendo todos os exons do gene FCGR2B humano nos pronúcleos de ovos fertilizados de C57BL/6N através de técnicas padronizadas (veja, por exemplo, J. Immunol., 2015 Oct 1; 195(7): 3198-205). Os camundongos deficientes de RIIb gama de Fc de camundongo foram gerados usando nucleases de dedo de zinco (ZFNs) que foi designado para direcionar o exon 1. A RIIb gama de Fc de camundongo humanizado foi estabelecida ao se cruzar RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos com RIIb gama de Fc de camundongos KO. Ao usar este camundongo, a combinação do aumento do efeito de afinidade a RIIb gama de Fc humano e aumento de pI na depuração de antígeno solúvel pode ser avaliada.
Preparação e perfil de variantes testadas
[00849] Os 7 anticorpos testados e seus perfis de ligação são sumarizados na Tabela 27. A cadeia pesada, MS103205H795-MY352, MS103205H795-PK55, MS103205H795-PK56, MS103205H795-PK57, foi preparada ao introduzir substituições crescentes de plQ311R/D413R, Q311R/P343R, Q311R/P343R/D413R, Q311R/N384R/D413R, respectivamente no MS103205H795-MY201. Todas as variantes de MS1032LO06 foram expressadas com M103202L889-SK1 como cadeia leve de acordo com o método mostrado no Exemplo 30 e as suas afinidades a Rs gama de Fc humano e de cino foram avaliadas usando o método no Exemplo 23. Tabela 27
[00850] Com base na análise de SPR sumarizada na Tabela 27, confirmou-se que as substituições crescentes de pl não afetam a ligação do R gama Fc de variantes aumentadas com RIIb gama de Fc. MY201 e MY351, que foram preparadas ao introduzir Q311R/D413K no MY201, mostram 6 vezes e 5 vezes a ligação aumentada de RIIb gama de Fc humano, respectivamente. Com relação a outros Rs gama de Fc humano e de cino, eles mostram quase o mesmo perfil de ligação. Similarmente, MY352, PK55, PK56 e PK57 mostravam perfil de ligação similar com MY201 parental (Tabela 27). Esses resultados indicam que qualquer par de substituições crescentes de pl não afeta as afinidades contra Rs gama de FC humano e cino.
Estudo PK em RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos Teste in vivo usando RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos
[00851] A eliminação de miostatina e anticorpo de miostatina antilatente foram avaliados in vivo mediante a coadministração de anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente humana em RIIb gama de Fc humano de camundongos transgênicos no qual o RII gama de Fc de camundongo foi substituído com RIIb gama de Fc humano. Um anticorpo de miostatina antilatente (0,3 mg/ml) e miostatina latente (0,05 mg/ml) foram administrados em uma dose única de 10 ml/kg na veia caudal. O sangue foi coletado em 5 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 dia, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois da administração. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 15,000 rpm em 4 graus C por 5 minutos para separar o plasma. O plasma separado foi armazenado em ou abaixo de -20 graus C até a medição. Os anticorpos de miostatina antilatente usados foram MS1032LO06-SG1, MS1032LO06-MY201, MS1032LO06-MY351, MS1032LO06-MY352, MS1032LO06-PK55, MS1032LO06-PK56 e MS1032LO06-PK57.
Medição da concentração da miostatina total no plasma por eletroquimioluminescência
[00852] A concentraçao de miostatina total no plasma de camundongo foi medida por eletroquimioluminescência (ECL) conforme descrito no Exemplo 24. O tempo de duração da concentração total da miostatina no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente medida por este método é mostrado na Figura 25.
[00853] Medição da concentração do anticorpo de miostatina antilatente no plasma através de ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA)
[00854] A concentração de anticorpo de miostatina antilatente no plasma de camundongo foi medida por ELISA. O fragmento de anticorpo F(ab') 2 de IgG anti-humana (específica da cadeia gama) (Sigma) foi dispensado em um Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) e deixado permanecer de um dia para o outro em 4 graus C para preparar placas imobilizadas com IgG anti-humana. As amostras da curva de calibração tendo concentrações de plasma de 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, e 0.039 microg/ml, e as amostras de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas. Depois, as amostras foram dispensadas nas placas imobilizadas em IgG antihumana e deixadas permanecer por 1 hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, o conjugado de biotina de IgG de cabra anti- humano (específico da cadeia gama) (Southern Biotech) foi adicionado para reagir por 1 hora em temperatura ambiente. Depois, estreptavidina- PolyHRP80 (Tecnologia de Detecção Estereoespecífica) foi adicionado para reagir por uma hora em temperatura ambiente, e a reação cromogênica foi realizada usando substrato TMB One Component HRP Microwell (BioFX Laboratories) como um substrato. Depois de parar a reação com ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), a absorvência a 450 nm foi medida por uma leitora de microplacas. A concentração no plasma de camundongo foi calculada a partir da absorvência da curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O tempo de duração da concentração do anticorpo no plasma depois da administração intravenosa do anticorpo de miostatina antilatente e miostatina latente medida por este método é mostrada na Figura 26.
Efeito do pl e ligação do R gama Fc na concentração de miostatina in vivo
[00855] Depois da administração de MS1032LO06-MY201, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 8 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Em contraste, depois da administração de MS1032LO06-PK57, a concentração de miostatina total no plasma em 7 horas diminuiu 376 vezes comparado à concentração de miostatina total no plasma em 5 minutos. Outras variants de pl alto mostraram aumento similar da eliminação de miostatina a partir de plasma. A concentração do anticorpo de variants de pl alto em 28 dias diminuiu 2-3 vezes comparado à concentração do anticorpo de MS1032LO06-SG1, e as variantes de pI mostraram leve aumento da eliminação de anticorpo a partir de plasma.
[00856] As variantes de pl alto têm mais carga positiva no plasma. Já que esta carga positiva interage com a superfície celular de carga negativa, o complexo imune antígeno-anticorpo de variantes de alto pI chega perto da superfícice celular, resultou na absorção celular aumentada de complexo imune antígeno-anticorpo de variantes de alto pI.
EXEMPLO 28 Desenvolvimento de variantes de Fc aumentadas com RIIb gama de Fc humano
[00857] As variantes de Fc aumentadas com RIIb gama de Fc humano com a região variável de antimiostatina foram construídas e sua afinidade por Rs gama de Fc humano foi avaliada. Especificamente, as variantes de Fc aumentada com RIIb gama de Fc humano foram construídas ao introduzir substituições no MS103240H795-SG1 (VH, SEQ ID NO: 92; CH, SEQ ID NO: 9) em combinação com substituições T250V/T307P. Além disso, as substituições (Q311R/D413K ou Q311R/P343R) também foram introduzidas. As variantes foram expressadas usando M103202L1045-SK1 como cadeia leve e sua afinidade a Rs gama de Fc humano foi analisada de acordo com o método mostrado no Exemplo 30. A Tabela 28 mostra o resultado da análise cinética contra Rs gama de FC humano e cino. Os Valores KD em células preenchidas em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente por análise cinética.
[00858] Todas as variantes avaliadas mostraram afinidade aumentada a RIIb gama de Fc humano e reduziram a ligação a RIIaR gama de Fc humano, RIIaH gama de Fc, RIIIaV gama de Fc comparado a SG1. A afinidade a RIIb gama de Fc humano varia entre 4.1 vezes e 30,5 vezes aumenta comparado a SG1. A afinidade a RIIaR gama de Fc humano estava entre 0,02 vez e 0,22 vez. As afinidades a RIIaH gama de Fc hunano e RIIIa gama de Fc humanoV eram menores do que 0,04 vez e 0,012 vez, respectivamente. Revelou-se que as substituições (T250V/T307P) não afetam o perfil de ligação a Rs gama de Fc humano ao comparer as afinidades de MY009 (P238D) e MY214 (P238D/T250V/T307P). Por outro lado, ambos o par de substituições crescentes de pl (Q311R/D413K e Q311R/P343R) diminuíram a afinidade de ligação em cerca de 0,5 vez comparado às variantes que não contêm as substituições crescentes de pl. Por exemplo, embora TT14 mostrou 30,5 vezes com maior afinidade a RIIb gama de Fc humano, ele mostrou apenas 16,1 vezes e 14,5 vezes aumentam em combinação com Q311R/D413K (TT33) e Q311R/P343R (TT32), respectivamente.
[00859] Além disso, as substituições usadas no Exemplo 25 para melhorar a meia-vida de anticorpo e reduzir a ligação ao fator reumatoide foram introduzidas em variantes de Fc aumentadas com RIIb gama de Fc humano e sua afinidade contra Rs gama de Fc foram analisadas (Tabela 29). Nesta análise de SPR, todos os dados foram obtidos usando cadeia leve kappa de IgG de camundongo anti-humano para capturar os anticorpos de interesse. A Tabela 30 mostra o resultado e os valores KD em células preenchidos em cinza foram calculados usando [Equação 2] já que a sua afinidade era muito fraca para ser determinada corretamente por análise cinética. Tabela 28 Tabela 29 Tabela 30
[00860] SG1 e TT33 foram avaliadas novamente nesta medição na qual o método de captura era diferente daquele na Tabela 28. Como um resultado, os valores "KD fold" de TT33 eram consistentes com aqueles obtidos com a Tabela 28 (16.1 vezes na Tabela 28 e 15.7 vezes na Tabela 30 contra RIIb gama de Fc humano). TT92 e TT93, que foram construídos ao introduzir N434A/Q438R/S440E e M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E em TT33, mostraram perfil de lgação comparável a TT33. Similarmente, TT90 e TT91 derivados de TT32, TT72 e TT73 derivados de TT31, TT70 e TT71 derivados de TT30, TT68 e TT69 derivados de TT21, e TT66 e TT67 derivados de TT20 mostram perfil de ligação comparável àqueles de anticorpos parentais mostrados na Tabela 28. Esses resultados indicam que substituições para melhorar a meia-vida do anticorpo e reduzir a ligação ao fator reumatoide não afetam o perfil de ligação de variantes aumentadas com RIIb gama de Fc humano contra Rs gama de Fc humano.
EXEMPLO 29 Análise para a produção de imagens de variantes de Fc aumentadas com RIIb gama de Fc
[00861] Para avaliar a absorção intracelular do complexo de antígeno-anticorpo formado pelo anticorpo descrito no Exemplo 28, o ensaio de produção de imagens descrito no Exemplo 26 foi realizado. Para evitar a saturação do sinal, os complexos de antígeno-anticorpo foram formados em uma solução de cultura com a concentração de anticorpo sendo de 1.25 mg/mL e a concentração de antígeno sendo de 0.34 mg/mL neste exemplo.
[00862] Os resultados do ensaio são mostrados na Figura 27. Ao aumentar a afinidade de ligação a RIIb gama de Fc humano, a absorção celular de complexo de antígeno-anticorpo foi aumentada. No caso de TT14, que foi aumentado em 30 vezes aumentou a afinidade de ligação a RIIb gama de Fc humano comparado com SG1, a intensidade do antígeno fluorescente dentro das células era de 7.5 vezes de aumento com aquela de SG1.
[00863] Embora as substituições crescentes de pl (Q311R/D413K e Q311R/P343R) diminuíram a afinidade de ligação a RIIb gama de Fc humano em cerca de 0,5 vez comparado às variantes que não contêm as substituições crescentes de pl, a absorção celular do complexo antígeno-anticorpo de variantes Fc com substituições de pl aumentado foi aumentada comparada a variantes Fc sem as substituições com pl aumentado. TT33 mostra um aumento de 36 vezes na absorção de antígeno anticorpo nas células comparado a SG1, enquanto seu TT14 parental mostra um aumento de 7.5 vezes na absorção celular. Além disso, TT33 mostra absorção cellular comparável do complexo de antígeno-anticorpo nas células comparado a SG1071, SG1074, SG1077, SG1079, SG1080 e SG1081 que mostra uma forte varredura no macaco cinomolgo. Esses resultados sugerem que a combinação de substituições de pl aumentado com variantes Fc aumentadas com RIIb gama de Fc é uma ferramenta ponderosa para o rastreamento do antígeno.
EXEMPLO 30 Construção dos vetores de expressão do anticorpo; e a expressão e purificação de anticorpos
[00864] A síntese de genes de comprimento total codificando as sequências de nucleotídeo da cadeia H e cadeia L das regiões variáveis do anticorpo foi realizada pelos métodos de produção conhecidos daqueles versados na técnica usando Assemble PCR e tais. A introdução de substituições de aminoácido foi realizada pelos métodos conhecidos daqueles versados na técnica usando PCR ou tal. O fragmento de plasmídeo obtido foi inserido em um vetor de expressão de célula animal e o vetor de expressão de cadeia H e vetor de expressão de cadeia L foram produzidos. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão obtido foi determinada por métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Os plasmídeos produzidos foram introduzidos de forma transitória na linhagem celular HEK293H derivada de células de câncer renal embrionário humano (Invitrogen) ou nas células FreeStyle293 (Invitrogen) para expressão do anticorpo. O sobrenadante de cultura obtido foi coletado e depois passado através de um filtro de 0,22 micrometro MILLEX(R)-GV (Millipore), ou através através de um filtro de 0,45 micrometro MILLEX(R)-GV (Millipore) para obter o sobrenadante de cultura. Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido pelos métodos conhecidos daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) ou Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para a concentração dos anticorpos purificados, a sua absorvência a 280 nm foi medida usando um espectrofotômetro. A partir do valor obtido, o coeficiente de extinção calculado pelos métodos tal como PACE foi usado para calcular a concentração do anticorpo (Protein Sci. 4:24112423 (1995)).
[00865] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em detalhes a título de ilustração e exemplo com a finalidade de clareza do entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. As revelações de todas as patentes e a literatura específica citadas no presente documento são expressamente incorporadas em sua totalidade a título de referência.

Claims (4)

1. Anticorpo isolado se liga à miostatina latente, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a ativação da miostatina, e em que o anticorpo compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 12 e a sequência VL de SEQ ID NO: 14.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) o anticorpo: (a) bloqueia a liberação de miostatina madura a partir da miostatina latente; (b) bloqueia a liberação proteolítica da miostatina madura; (c) bloqueia a liberação espontânea de miostatina madura; e/ou (d) não se liga à miostatina madura; ou se liga a um epítopo dentro de um fragmento consistindo em aminoácidos 21-100 de propeptídeo de miostatina (SEQ ID NO: 78); (ii) o anticorpo se liga à miostatina latente com maior afinidade no pH neutro do que no pH acídico, ou que se liga à miostatina latente com maior afinidade no pH 7,4 do que no pH 5,8; e/ou (iii) o anticorpo é (a) um anticorpo monoclonal, (b) um anticorpo quimérico; (c) um anticorpo de IgG de comprimento total ou (d) um fragmento de anticorpo que se liga à miostatina.
3. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
BR112017006736-6A 2014-12-19 2015-12-18 Anticorpos anti-miostatina e formulação farmacêutica BR112017006736B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-257636 2014-12-19
JP2014257636 2014-12-19
PCT/JP2015/006323 WO2016098357A1 (en) 2014-12-19 2015-12-18 Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112017006736A2 BR112017006736A2 (pt) 2017-12-19
BR112017006736B1 true BR112017006736B1 (pt) 2024-07-30

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11454633B2 (en) Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
JP7342177B2 (ja) 抗ミオスタチン抗体および使用方法
AU2016372934B2 (en) Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
BR112017006736B1 (pt) Anticorpos anti-miostatina e formulação farmacêutica
EA044612B1 (ru) Антитела к миостатину и способы их применения
EA041641B1 (ru) Антитела к миостатину, полипептиды, содержащие варианты fc-областей, и способы их применения
EA040713B1 (ru) Антитело к миостатину и способы его получения, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, клетка-хозяин и фармацевтическая композиция для увеличения клиренса миостатина