BR112017004770B1 - VIRUS-LIKE PARTICLE COMPRISES A FLAVIVIRUS ENVELOPE PROTEIN, ITS PRODUCTION METHOD, COMPOSITION THAT COMPRISES IT AND METHOD OF PRODUCING AN ANTIBODY - Google Patents
VIRUS-LIKE PARTICLE COMPRISES A FLAVIVIRUS ENVELOPE PROTEIN, ITS PRODUCTION METHOD, COMPOSITION THAT COMPRISES IT AND METHOD OF PRODUCING AN ANTIBODY Download PDFInfo
- Publication number
- BR112017004770B1 BR112017004770B1 BR112017004770-5A BR112017004770A BR112017004770B1 BR 112017004770 B1 BR112017004770 B1 BR 112017004770B1 BR 112017004770 A BR112017004770 A BR 112017004770A BR 112017004770 B1 BR112017004770 B1 BR 112017004770B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- virus
- particle
- fact
- seq
- flavivirus
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 title claims abstract description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 title claims description 26
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 title claims description 26
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 4
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical class N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 7
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 3
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 26
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 26
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000710827 Dengue virus 1 Species 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 241000710815 Dengue virus 2 Species 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 241000710872 Dengue virus 3 Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000120506 Bluetongue virus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102220500491 Cytosolic iron-sulfur assembly component 3_K86A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000710844 Dengue virus 4 Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- 101000708009 Homo sapiens Sentrin-specific protease 8 Proteins 0.000 description 2
- 241001250104 Physalis mottle virus Species 0.000 description 2
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000714203 Rabbit hemorrhagic disease virus Species 0.000 description 2
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 2
- 102100031407 Sentrin-specific protease 8 Human genes 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 241000709710 Swine vesicular disease virus Species 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 7-[[(2s)-2,6-bis(2-methoxyethoxycarbonylamino)hexanoyl]amino]heptoxy-methylphosphinic acid Chemical compound COCCOC(=O)NCCCC[C@H](NC(=O)OCCOC)C(=O)NCCCCCCCOP(C)(O)=O WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000157282 Aesculus Species 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 241001529459 Enterovirus A71 Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001455578 Indian peanut clump virus Species 0.000 description 1
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 1
- 241000134304 Influenza A virus H3N2 Species 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000721576 Melopsittacus undulatus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 102220475742 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX6_R85A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700033496 Recombivax HB Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000352457 Shivajiella indica Species 0.000 description 1
- 102220520515 Sulfotransferase 1E1_K85A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 239000000430 cytokine receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003968 dna methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000010181 horse chestnut Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003407 pegaptanib Drugs 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Abstract
PARTÍCULA TIPO FLAVIVÍRUS. O presente pedido refere-se à provisão de uma partícula tipo vírus, compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de flavivírus, e uma composição ou vacina compreendendo as mesmas, seu uso na prevenção ou tratamento de infecção por flavivírus. A proteína estrutural de flavivírus contém pelo menos uma alteração de aminoácido na região de envoltório. Exemplos de flavivírus contêm vírus de dengue.FLAVIVIRUS-LIKE PARTICLE. The present application relates to the provision of a virus-like particle, comprising one or more flavivirus structural proteins, and a composition or vaccine comprising the same, their use in the prevention or treatment of flavivirus infection. The flavivirus structural protein contains at least one amino acid change in the envelope region. Examples of flaviviruses contain dengue viruses.
Description
[001] O presente pedido refere-se a uma partícula tipo vírus compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de flavivírus, e uma composição ou vacina compreendendo as mesmas, seu uso em medicina, particularmente na prevenção ou tratamento de infecção por flavivírus.[001] The present application relates to a virus-like particle comprising one or more flavivirus structural proteins, and a composition or vaccine comprising the same, its use in medicine, particularly in the prevention or treatment of flavivirus infection.
[002] Flavivírus compreende mais de 70 vírus diferentes, muitos dos quais são artrópodes e transmitidos por mosquitos ou carrapatos.[002] Flavivirus comprises more than 70 different viruses, many of which are arthropods and transmitted by mosquitoes or ticks.
[003] Flavivírus é um gênero de vírus da família Flaviviridae. Este gênero inclui o vírus do Nilo Ocidental (WNV), vírus de dengue (DENV), vírus de encefalite provocada por carrapato (TBEV), vírus da febre amarela (YFV), encefalite japonesa (JEV), vírus da hepatite C (HCV) e outros diversos vírus que podem causar encefalite ou doenças hemorrágicas.[003] Flavivirus is a genus of viruses in the Flaviviridae family. This genus includes West Nile virus (WNV), dengue virus (DENV), tick-borne encephalitis virus (TBEV), yellow fever virus (YFV), Japanese encephalitis virus (JEV), hepatitis C virus (HCV) and other various viruses that can cause encephalitis or hemorrhagic diseases.
[004] Febre de dengue é uma doença trazida pelo mosquito, provocada pelo flavivírus, e que tem se espalhado mais para áreas tropicais e muitas áreas subtropicais. A doença é causada por quatro vírus relacionados de perto, o vírus de dengue 1, incluindo subtipos I a IV, vírus de dengue 2, incluindo subtipos Asiático I, Asiático II, Cosmopolita, Americano e Americano/Asiático, Vírus de dengue 3, incluindo subtipos I a IV, e Vírus de dengue 4, incluindo subtipos I a III. Embora a Dengue seja o flavivírus mais importante, em relação à incidência global da doença, o desenvolvimento e uso de vacinas contra o vírus tem sido impedido até agora, pelo risco de eventos teoricamente adversos relacionados à vacina, tais como aumento da imunidade da infecção e o requisito para induzir uma resposta imune protetora de longa duração contra todos os quatro sorotipos de dengue simultaneamente.[004] Dengue fever is a disease brought by mosquitoes, caused by the flavivirus, and which has spread more to tropical areas and many subtropical areas. The disease is caused by four closely related viruses, dengue virus 1, including subtypes I to IV, dengue virus 2, including subtypes Asian I, Asian II, Cosmopolitan, American and American/Asian, dengue virus 3, including subtypes I to IV, and Dengue virus 4, including subtypes I to III. Although Dengue is the most important flavivirus in relation to the global incidence of the disease, the development and use of vaccines against the virus has been impeded until now, due to the risk of theoretically adverse events related to the vaccine, such as increased immunity to the infection and the requirement to induce a long-lasting protective immune response against all four dengue serotypes simultaneously.
[005] Não existe terapia eficaz de dengue, e a prevenção contra a febre de dengue é atualmente limitada às medidas de controle do vetor. Uma vacina contra a dengue, dessa maneira, representaria um grande avanço no controle da doença.[005] There is no effective dengue therapy, and prevention against dengue fever is currently limited to vector control measures. A vaccine against dengue, in this way, would represent a major advance in controlling the disease.
[006] Embora nenhuma vacina licenciada contra a dengue esteja disponível, diversos candidatos à vacina são atualmente avaliados em estudos clínicos. WHO indica que a crescente epidemia global de dengue é de preocupação aumentada, e uma vacina segura e eficaz é urgentemente necessária. (http://www.who.int/imunização/pesquisa/desenvolvimento/dengue_vac inas/en/) e Vacina 30 (2012) 4301-4306)[006] Although no licensed dengue vaccine is available, several vaccine candidates are currently evaluated in clinical studies. WHO indicates that the growing global dengue epidemic is of increased concern, and a safe and effective vaccine is urgently needed. (http://www.who.int/imunização/pesquisa/desenvolvimento/dengue_vac inas/en/) and Vacina 30 (2012) 4301-4306)
[007] Partículas tipo vírus (VLPs) são estruturas de multiproteínas que imitam a organização e conformação de vírus nativos autênticos, mas não infecciosos porque eles não contêm qualquer genoma viral, potencialmente rendendo vacinas candidatas mais seguras. Uma pequena quantidade de vacinas profiláticas baseadas em VLP é atualmente comercializada no mundo inteiro: GlaxoSmithKline’s EngerixR (vírus da hepatite B) e CervarixR (papilomavírus de ser humano), e Merck and Co., Inc.’s Recombivax HBR (vírus da hepatite B) e GardasilR (papilomavírus de ser humano) são alguns exemplos. Outras vacinas candidatas, baseadas em VLP, estão em testes clínicos, ou sendo submetidas à avaliação pré-clínica, tais como, vírus da gripe, parvovírus, Norwalk e vários VLPs quiméricos. Muitos outros são ainda restritos à pesquisa fundamental em pequena escala, a despeito de seu sucesso em testes pré-clínicos. As implicações da produção de VLP em grande escala são discutidas no contexto de controle, monitoração e otimização do processo. Os principais desafios técnicos, a montante e a jusante, são identificados e discutidos desta maneira. "Bomba arrasa quarteirão" (blockbusters) de vacina baseada em VLP bem sucedidas, são resumidamente apresentadas concomitantemente com os últimos resultados de testes clínicos, e os recentes desenvolvimentos de VLP quimérico baseado em tecnologia para vacinação terapêutica ou profilática.[007] Virus-like particles (VLPs) are multi-protein structures that mimic the organization and conformation of authentic native viruses, but are non-infectious because they do not contain any viral genome, potentially yielding safer vaccine candidates. A small number of VLP-based prophylactic vaccines are currently marketed worldwide: GlaxoSmithKline's EngerixR (hepatitis B virus) and CervarixR (human papillomavirus), and Merck and Co., Inc.'s Recombivax HBR (hepatitis B virus ) and GardasilR (human papillomavirus) are some examples. Other vaccine candidates, based on VLP, are in clinical trials, or undergoing preclinical evaluation, such as influenza virus, parvovirus, Norwalk and several chimeric VLPs. Many others are still restricted to small-scale fundamental research, despite their success in preclinical testing. The implications of large-scale VLP production are discussed in the context of process control, monitoring and optimization. The main technical challenges, upstream and downstream, are identified and discussed in this way. Successful VLP-based vaccine blockbusters are briefly presented concurrently with the latest clinical trial results, and recent developments of chimeric VLP-based technology for therapeutic or prophylactic vaccination.
[008] Até agora, vacinas baseadas em VLP têm sido produzidas para mais de 30 vírus diferentes que infectam o ser humano e outros animais. Os exemplos incluem AAV (vírus Adenoassociado), H5N3 (gripe dos pássaros (Avian)), BFDV (vírus da doença de frangote Budgerigar), BTV (vírus da Língua Azul (Bluetongue)), Ebola, Enterovírus 71, GHPV (vírus de polioma hemorrágico de ganso), HBV (vírus de Hepatite B), HCV (vírus de Hepatite C), HDV (vírus de Hepatite δ), HEV (vírus de Hepatite E), HIV, HPV (papilomavírus de ser humano), IBDV (vírus de doença infecciosa relativa à bolsa), Influenza A, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, poliamavírus JC, Margurg, MS2, IPCV (vírus de grumos de castanha da Índia), NDV (vírus da doença Newcastle), No (Norovírus), Nv (vírus Norwalk), PhMV (vírus Physalis mottle), Polimavírus, PPV (parvovírus do porco), RHDV (vírus de doença hemorrágica de coelho), Rotavirus, SARS, SIV (vírus de imunodeficiência de símio), SV40 (vírus de símio 40), SVDV (Vírus de doença vesicular de suíno) e assim por diante. (Expert Rev. Vacinas 9(10), 1149-1176, 2010).[008] To date, VLP-based vaccines have been produced for more than 30 different viruses that infect humans and other animals. Examples include AAV (Adeno-associated virus), H5N3 (bird flu (Avian)), BFDV (Budgerigar chicken disease virus), BTV (Bluetongue virus), Ebola, Enterovirus 71, GHPV (polyoma virus). goose haemorrhagic virus), HBV (Hepatitis B virus), HCV (Hepatitis C virus), HDV (Hepatitis δ virus), HEV (Hepatitis E virus), HIV, HPV (human papillomavirus), IBDV (Hepatitis E virus) of infectious disease related to the pouch), Influenza A, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, polyamavirus JC, Margurg, MS2, IPCV (Horse chestnut groat virus), NDV (Newcastle disease virus), No (Norovirus), Nv (Norwalk virus), PhMV (Physalis mottle virus), Polymavirus, PPV (pig parvovirus), RHDV (rabbit hemorrhagic disease virus), Rotavirus, SARS, SIV (simian immunodeficiency virus), SV40 (simian virus 40), SVDV (Swine vesicular disease virus) and so on. (Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010).
[009] NPTL1 Vacina 30 (2012) 4301-4306[009] NPTL1 Vaccine 30 (2012) 4301-4306
[0010] NPTL2 Expert Rev. Vacinas 9(10), 1149-1176, 2010[0010] NPTL2 Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010
[0011] Em um primeiro aspecto, o presente pedido provê uma partícula tipo vírus, compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de flavivírus, caracterizadas pelo fato de que a região de envoltório de proteína estrutural de flavivírus contém, pelo menos, uma alteração da sequência de aminoácidos.[0011] In a first aspect, the present application provides a virus-like particle, comprising one or more flavivirus structural proteins, characterized by the fact that the flavivirus structural protein envelope region contains at least one alteration of the sequence of amino acids.
[0012] Em um segundo aspecto, o presente pedido provê uma molécula de ácido nucleico, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos, que codifica a proteína estrutural de flavivírus contida na partícula tipo vírus, provida no primeiro aspecto do presente pedido.[0012] In a second aspect, the present application provides a nucleic acid molecule, comprising or consisting of a nucleotide sequence, which encodes the flavivirus structural protein contained in the virus-like particle, provided in the first aspect of the present application.
[0013] Em um terceiro aspecto, o presente pedido provê uma composição ou vacina, compreendendo a partícula tipo vírus provido no primeiro aspecto, e/ou a molécula de ácido nucleico provida no segundo aspecto.[0013] In a third aspect, the present application provides a composition or vaccine, comprising the virus-like particle provided in the first aspect, and/or the nucleic acid molecule provided in the second aspect.
[0014] Em um quarto aspecto, o presente pedido provê um método de produzir um anticorpo ou antissoro compreendendo um anticorpo neutralizando, compreendendo contatar a partícula tipo vírus, provido no primeiro aspecto do presente pedido, e/ou a molécula de ácido nucleico provida ara um mamífero, no segundo aspecto do presente pedido.[0014] In a fourth aspect, the present application provides a method of producing an antibody or antiserum comprising a neutralizing antibody, comprising contacting the virus-like particle, provided in the first aspect of the present application, and/or the nucleic acid molecule provided to a mammal, in the second aspect of the present application.
[0015] Em um quinto aspecto, o presente pedido provê um método de tratar ou prevenir infecção por flavivírus, ou um método de induzir e/ou intensificar a resposta imune contra um flavivírus, em um mamífero, compreendendo administrar para o mamífero a composição provida no terceiro aspecto do presente pedido.[0015] In a fifth aspect, the present application provides a method of treating or preventing flavivirus infection, or a method of inducing and/or enhancing an immune response against a flavivirus, in a mammal, comprising administering to the mammal the provided composition in the third aspect of this request.
[0016] Em um sexto aspecto, o presente pedido provê um método de produzir a partícula tipo vírus provida no primeiro aspecto do presente pedido, compreendendo: fazer cultura de uma célula que é transfectada com um gene codificando a pelo menos uma proteína estrutural de flavivírus contida na partícula tipo vírus; e recuperando a partícula tipo vírus da cultura de célula. Este aspecto pode ainda compreender a etapa de preparar um gene compreendendo uma sequência de nucleotídeos, codificando a pelo menos uma proteína estrutural de flavivírus contida na partícula tipo vírus.[0016] In a sixth aspect, the present application provides a method of producing the virus-like particle provided in the first aspect of the present application, comprising: culturing a cell that is transfected with a gene encoding at least one flavivirus structural protein contained in the virus-like particle; and recovering the virus-like particle from the cell culture. This aspect may further comprise the step of preparing a gene comprising a nucleotide sequence, encoding at least one flavivirus structural protein contained in the virus-like particle.
[0017] Em um sétimo aspecto, o presente pedido provê uma partícula tipo vírus para uso em um método, ou kit, de diagnosticar infecção por flavivírus em um mamífero.[0017] In a seventh aspect, the present application provides a virus-like particle for use in a method, or kit, of diagnosing flavivirus infection in a mammal.
[0018] A Figura 1 mostra a construção do genoma de vírus de dengue, e um exemplo de construção de VLP de dengue.[0018] Figure 1 shows the construction of the dengue virus genome, and an example of dengue VLP construction.
[0019] A Figura 2 mostra proteínas de envoltório nas sobrenadantes medidas por Western Blotting. O vetor de expressão, para a proteína de estrutura viral compreendendo vírus de dengue prM tipo 2 e proteína de envoltório, ou para uma proteína de estrutura viral compreendendo vírus de dengue prM tipo 2 e uma quimera de Dengue tipo 2 e Dengue tipo 1, caracterizado pelo fato de que a região do terminal C da proteína de envoltório do vírus de dengue tipo 2, foi substituída por vírus de dengue do tipo 1, correspondente da região do terminal C (199aa-676aa da SEQ ID NO: 8), ou uma proteína estrutural viral contendo a região de envoltório quimérico, caracterizada pelo fato de que uma alteração de aminoácido na região de envoltório quimérico (F108K, em 289aa da SEQ ID NO: 10) foi introduzida, e um vetor de expressão para proteína capsídeo de vírus de dengue tipo 1 foi transfectada para células 293F. Western blotting usando anticorpo contra a proteína de envoltório de dengue, foi conduzido contra a sobrenadante da cultura.[0019] Figure 2 shows envelope proteins in supernatants measured by Western Blotting. The expression vector, for the viral scaffold protein comprising dengue virus prM type 2 and envelope protein, or for a viral scaffold protein comprising dengue virus prM type 2 and a chimera of Dengue type 2 and Dengue type 1, characterized by the fact that the C-terminal region of the envelope protein of dengue virus type 2 was replaced by dengue virus type 1, corresponding to the C-terminal region (199aa-676aa of SEQ ID NO: 8), or a viral structural protein containing the chimeric envelope region, characterized by the fact that an amino acid change in the chimeric envelope region (F108K, at 289aa of SEQ ID NO: 10) was introduced, and an expression vector for virus capsid protein dengue type 1 was transfected into 293F cells. Western blotting using antibody against dengue envelope protein was conducted against the culture supernatant.
[0020] A Figura 3 mostra resultados de Western Blotting. Um vetor de expressão para proteína estrutural viral compreendendo vírus prM tipo 1 de dengue, e envoltório com ou sem alteração (tipo selvagem, F108A, K203M, K246M F108A +K246M ou F108+K203N) junto com o vetor de expressão para proteína de Capsídeo de dengue tipo 1, foi transfectado para células 293F. Western blotting usando anticorpo contra proteína de Envoltório de dengue, foi conduzido contra a cultura sobrenadante.[0020] Figure 3 shows Western Blotting results. An expression vector for viral structural protein comprising dengue type 1 prM virus, and envelope with or without alteration (wild type, F108A, K203M, K246M F108A +K246M or F108+K203N) together with the expression vector for dengue Capsid protein dengue type 1, was transfected into 293F cells. Western blotting using antibody against dengue Envelope protein was conducted against the culture supernatant.
[0021] A Figura 4 mostra resultados de Western Blotting. Um vetor de expressão para proteína estrutural viral, compreendendo vírus prM de dengue tipo 1, e envoltório com ou sem alteração (tipo selvagem, F108A, K203M ou F108+K203N) foi transfectado para células 293F. Western blotting usando proteína de envoltório contra Dengue, foi conduzido contra a cultura sobrenadante.[0021] Figure 4 shows Western Blotting results. An expression vector for viral structural protein, comprising dengue type 1 prM virus, and envelope with or without alteration (wild type, F108A, K203M or F108+K203N) was transfected into 293F cells. Western blotting using Dengue envelope protein was conducted against the culture supernatant.
[0022] A Figura 5 mostra a visualização microscópica de Elétron (EM) de VLPs negativamente manchada (F108+K203N).[0022] Figure 5 shows the Electron Microscopic (EM) visualization of negatively stained VLPs (F108+K203N).
[0023] No primeiro aspecto, o presente pedido provê uma partícula tipo vírus, compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de flavivírus, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido na região do envoltório é alterado a partir de sua estrutura de ocorrência natural.[0023] In the first aspect, the present application provides a virus-like particle, comprising one or more flavivirus structural proteins, characterized by the fact that at least one amino acid in the envelope region is altered from its naturally occurring structure.
[0024] Flavivírus pode ser vírus do Nilo Ocidental, vírus da Dengue, vírus de encefalite originada de carrapato, vírus da febre amarela, encefalite japonesa, e vírus da hepatite C (HCV). Flavivírus preferido é o vírus de dengue. O vírus de dengue pode ser vírus 1 de dengue, incluindo subtipos I a IV, vírus 2 de dengue, incluindo subtipos Asiático I, Asiático II, Cosmopolitano, Americano e Americano/Asiático, Vírus 3 de dengue, incluindo subtipos I a IV e vírus 4 de dengue, incluindo subtipos I a III. No relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "proteína estrutural de flavivírus ou fragmento da mesma", se refere a qualquer sequência baseada em peptídeo derivada de flavivírus, que pode ser reconhecida pelo sistema imune em um sujeito, e/ou que estimula uma resposta imune mediada por célula em um sujeito, e/ou estimula a geração de anticorpos em um sujeito.[0024] Flaviviruses can be West Nile virus, Dengue virus, tick-borne encephalitis virus, yellow fever virus, Japanese encephalitis, and hepatitis C virus (HCV). Preferred flavivirus is dengue virus. Dengue virus may be dengue virus 1, including subtypes I to IV, dengue virus 2, including subtypes Asian I, Asian II, Cosmopolitan, American and American/Asian, dengue virus 3, including subtypes I to IV and 4 of dengue, including subtypes I to III. In the specification and claims, the term "flavivirus structural protein or fragment thereof" refers to any peptide-based sequence derived from flaviviruses, which can be recognized by the immune system in a subject, and/or which stimulates a response. cell-mediated immune response in a subject, and/or stimulates the generation of antibodies in a subject.
[0025] Como mostrado na Figura 1, a proteína estrutural do vírus de dengue consiste em proteína capsida, proteína da membrana precursora e proteína de envoltório. Nesta modalidade, a VLP compreende pelo menos uma daquelas proteínas estruturais e, preferivelmente, uma proteína de membrana precursora (prM) e uma proteína de envoltório. A proteína estrutural do vírus de dengue pode ainda compreender um aminoácido correspondendo ao códon de iniciação, e uma sequência de sinal para terminal amino da sequência de prM.[0025] As shown in Figure 1, the structural protein of the dengue virus consists of capsid protein, precursor membrane protein and envelope protein. In this embodiment, the VLP comprises at least one of those structural proteins and, preferably, a precursor membrane protein (prM) and an envelope protein. The dengue virus structural protein may further comprise an amino acid corresponding to the initiation codon, and a signal sequence to the amino terminus of the prM sequence.
[0026] A região compreendendo pelo menos uma alternação de aminoácidos pode ser, preferivelmente, entre a posição 182 de aminoácido e a posição 676 de aminoácido, mais preferivelmente entre a posição 271 de aminoácido e a posição 302 de aminoácido, especialmente entre a posição 280 de aminoácido e posição 291 de aminoácido, particularmente 289 de um proteína da SEQ ID NO: 21, que compreende códon de iniciação M e peptídeo de sinal da SEQ ID NO: 17, seguidos por prM e região de envoltório de vírus 1 de dengue (cepa WestPac, Acesso GenBank No: U88535), ou entre as posições determinadas como as posições identificadas acima, quando a sequência de aminoácidos de uma proteína compreendendo códon de iniciação M, peptídeo de sinal seguido por prM, e região de envoltório de um flavivírus, ou um fragmento do mesmo, é alinhada com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 21.[0026] The region comprising at least one amino acid alternation may preferably be between amino acid position 182 and amino acid position 676, more preferably between amino acid position 271 and amino acid position 302, especially between position 280 of amino acid and amino acid position 291, particularly 289 of a protein of SEQ ID NO: 21, which comprises initiation codon M and signal peptide of SEQ ID NO: 17, followed by prM and dengue virus 1 envelope region ( strain WestPac, GenBank Accession No: U88535), or between the positions determined as the positions identified above, when the amino acid sequence of a protein comprising initiation codon M, signal peptide followed by prM, and envelope region of a flavivirus, or a fragment thereof, is aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
[0027] A região de envoltório da sequência de aminoácidos do vírus de dengue tipo 1, é representada pela SEQ ID NO: 20. Desta maneira, a região compreendendo pelo menos uma alternação de aminoácido pode ser nessa sequência, preferivelmente entre a posição 90 de aminoácido e a posição 121 de aminoácido, especialmente entre a posição 99 de aminoácido e a posição 110 de aminoácido, particularmente 108 de uma proteína da SEQ ID NO: 20, ou entre as posições determinadas como as posições identificadas acima, quando a sequência de aminoácidos de um envoltório de um flavivírus, ou um fragmento da mesma, é alinhada com a SEQ ID NO: 20.[0027] The envelope region of the amino acid sequence of dengue virus type 1 is represented by SEQ ID NO: 20. In this way, the region comprising at least one amino acid alternation can be in this sequence, preferably between position 90 of amino acid and amino acid position 121, especially between amino acid position 99 and amino acid position 110, particularly 108 of a protein of SEQ ID NO: 20, or between positions determined as the positions identified above, when the amino acid sequence of a flavivirus envelope, or a fragment thereof, is aligned with SEQ ID NO: 20.
[0028] Como usado aqui no presente, "uma posição correspondendo à" ou detalhamento de que os nucleotídeos ou posições de aminoácidos "corresponde à" posições de nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência descrita, tal como descrito na Listagem de Sequência, se refere às posições de nucleotídeos ou aminoácidos identificadas mediante alinhamento com a sequência descrita, para maximizar a identidade usando um algoritmo de alinhamento padrão. Pelo alinhamento das sequências, a pessoa versada na técnica pode identificar resíduos correspondentes.[0028] As used herein, "a position corresponding to" or detailing which nucleotide or amino acid positions "correspond to" nucleotide or amino acid positions in a described sequence, as described in the Sequence Listing, refers to the nucleotide or amino acid positions identified by aligning with the described sequence, to maximize identity using a standard alignment algorithm. By aligning the sequences, the person skilled in the art can identify corresponding residues.
[0029] Proteínas estruturais virais de vários flavivírus, tais como vírus de dengue tipos 1-4, têm sido identificadas e disponíveis em vários bancos de dados públicos, tais como o banco de dados GenBank. Por exemplo, o vírus de dengue tipo 1 (cepa WestPac): Acesso No. U88535, vírus de dengue tipo 2 (cepa da vacina S1): Acesso No. M19197, Vírus de dengue tipo 3 (cepa Singapore 8120/95): Acesso No. AY766104 e vírus de dengue tipo 4 (cepa ThD4_0476_97): Acesso No. Y618988. De acordo com este pedido, a proteína de envoltório de um flavivírus, tal como vírus de dengue, pode ser obtida de um banco de dados e alinhada com a SEQ ID NO: 20, para identificar uma posição entre as posições correspondendo à posição 90 do aminoácido, e a posição 121 de aminoácido da SEQ ID NO: 20, tal como uma posição correspondendo à posição do aminoácido 108 da SEQ ID NO: 20.[0029] Viral structural proteins from various flaviviruses, such as dengue viruses types 1-4, have been identified and available in several public databases, such as the GenBank database. For example, dengue virus type 1 (WestPac strain): Accession No. U88535, dengue virus type 2 (vaccine strain S1): Accession No. M19197, Dengue virus type 3 (Singapore strain 8120/95): Accession No. AY766104 and dengue virus type 4 (strain ThD4_0476_97): Accession No. Y618988. According to this application, the envelope protein of a flavivirus, such as dengue virus, can be obtained from a database and aligned with SEQ ID NO: 20, to identify a position among the positions corresponding to position 90 of the amino acid, and amino acid position 121 of SEQ ID NO: 20, such as a position corresponding to amino acid position 108 of SEQ ID NO: 20.
[0030] Com a exceção de compreender pelo menos uma alteração de aminoácido, na região de envoltório, uma proteína estrutural de flavivírus contida na partícula tipo vírus, pode ser uma proteína estrutural viral de ocorrência natural, ou uma proteína modificada da mesma. Em uma modalidade, a proteína modificada tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácido para uma proteína estrutural viral de ocorrência natural, incluindo prM e proteína de envoltório. Em uma modalidade, a proteína modificada é um mutante caracterizado pelo fato de que no máximo 10% dos aminoácidos são deletados, substituídos, e/ou adicionados a uma proteína estrutural viral de ocorrência natural, incluindo prM e regiões de envoltório. A identidade de sequência pode ser determinada pelos métodos convencionais.[0030] With the exception of comprising at least one amino acid change, in the envelope region, a flavivirus structural protein contained in the virus-like particle, may be a naturally occurring viral structural protein, or a modified protein thereof. In one embodiment, the modified protein has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% amino acid sequence identity to a naturally occurring viral structural protein, including prM and wrap. In one embodiment, the modified protein is a mutant characterized by the fact that at most 10% of the amino acids are deleted, replaced, and/or added to a naturally occurring viral structural protein, including prM and envelope regions. Sequence identity can be determined by conventional methods.
[0031] De acordo com o presente pedido, uma ou mais proteínas estruturais de flavivírus, ou fragmentos das mesmas discutidas acima, podem ser usadas desde que elas espontaneamente sejam montadas em uma estrutura de particulado. Por exemplo, quando células eucarióticas, expressando um gene codificando prM e proteínas de envoltório de vírus de dengue são culturadas, as proteínas são geradas pelas células e a montagem para dar VLPs, e os VLPs podem ser coletados da sobrenadante de cultura de célula.[0031] According to the present application, one or more flavivirus structural proteins, or fragments thereof discussed above, can be used as long as they are spontaneously assembled into a particulate structure. For example, when eukaryotic cells expressing a gene encoding prM and dengue virus envelope proteins are cultured, the proteins are generated by the cells and assembled to give VLPs, and the VLPs can be collected from the cell culture supernatant.
[0032] O presente pedido trata de uma ou mais das necessidades acima provendo VLPs, vetores codificando os VLPs, e anticorpos (e moléculas como anticorpos, incluindo aptâmeros e peptídeos) que especificamente ligam para o antígeno, junto com os usos dos mesmos (sós ou em combinação) na prevenção ou tratamento de infecção por flavivírus.[0032] The present application addresses one or more of the above needs by providing VLPs, vectors encoding the VLPs, and antibodies (and molecules such as antibodies, including aptamers and peptides) that specifically bind to the antigen, along with the uses thereof (only or in combination) in the prevention or treatment of flavivirus infection.
[0033] Como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "anticorpo" se refere à uma molécula que é capaz de ligação para um epítopo ou determinante antigênica. O termo cobre um anticorpo todo e um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, incluindo um anticorpo de cadeia única. Tais anticorpos podem incluir fragmentos de ligação de antígeno de ser humano e incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfetos (sdFv) e fragmentos compreendendo um VL ou domínio de VH. Os anticorpos podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são mamíferos, por exemplo, ser humano, murino, coelho, cabra, porquinho da Índia, camelo, cavalo e similares, ou outros animais apropriados, por exemplo, galinha. Como usados aqui no presente, anticorpos de "ser humano" incluem anticorpos que têm a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina de ser humano, e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina de ser humano, ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulina de ser humano, e que não expressa imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exemplo, na Patente Norte-americana No. 5.939.598, cuja descrição é incorporada aqui no presente por referência em sua inteireza.[0033] As used in the specification and claims, the term "antibody" refers to a molecule that is capable of binding to an epitope or antigenic determinant. The term covers a whole antibody and an antigen-binding fragment thereof, including a single-chain antibody. Such antibodies may include human antigen binding fragments and include, but are not limited to, Fab, Fab' and F(ab')2, Fd, single chain Fvs (scFv), single chain antibodies, linked Fvs to disulfides (sdFv) and fragments comprising a VL or VH domain. Antibodies can be of any animal origin, including birds and mammals. Preferably, the antibodies are mammals, for example, human, murine, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse and the like, or other suitable animals, for example chicken. As used herein, "human" antibodies include antibodies that have the amino acid sequence of a human immunoglobulin, and include antibodies isolated from human immunoglobulin libraries, or from animals transgenic for one or more human immunoglobulins. human, and which does not express endogenous immunoglobulins, as described, for example, in United States Patent No. 5,939,598, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0034] Uma proteína estrutural de flavivírus pode ser uma proteína de ocorrência natural, ou proteína modificada da proteína de ocorrência natural, ou um fragmento da proteína de ocorrência natural, ou o peptídeo modificado. A proteína modificada pode ser um fragmento da proteína estrutural de vírus de ocorrência natural.[0034] A flavivirus structural protein can be a naturally occurring protein, or a modified protein of the naturally occurring protein, or a fragment of the naturally occurring protein, or the modified peptide. The modified protein may be a structural protein fragment of naturally occurring viruses.
[0035] Em uma modalidade, a proteína modificada derivada de uma proteína estrutural de flavivírus, tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos para a proteína de ocorrência natural. Em uma modalidade, a proteína modificada derivada de um flavivírus é uma alteração, caracterizada pelo fato de que no máximo 10% dos aminoácidos são deletados, substituídos, e/ou adicionados, com base na proteína estrutural viral de ocorrência natural derivada do flavivírus.[0035] In one embodiment, the modified protein derived from a flavivirus structural protein has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% amino acid sequence identity to the protein naturally occurring. In one embodiment, the modified protein derived from a flavivirus is an alteration, characterized by the fact that at most 10% of the amino acids are deleted, replaced, and/or added, based on the naturally occurring viral structural protein derived from the flavivirus.
[0036] Em uma modalidade, o presente pedido provê uma partícula tipo vírus, compreendendo uma proteína estrutural de flavivírus, tendo uma sequência de aminoácidos representada por uma das SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 e 16.[0036] In one embodiment, the present application provides a virus-like particle, comprising a flavivirus structural protein, having an amino acid sequence represented by one of SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 and 16.
[0037] Cada uma daquelas sequências representa uma proteína contendo as seguintes regiões: códon de iniciação: M (1aa), sequência de sinais (2-15aa), sequência pr (16-106aa), sequência M (107- 181aa), e região de Envoltório (182-676aa). Em uma modalidade, uma partícula tipo vírus, compreendendo uma proteína estrutural viral, que tem as regiões de prM e região de envoltório de SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 e 16, isto é, compreendendo a sequência de aminoácidos da posição 16 para a posição 676 daquelas proteínas, pode ser provido.[0037] Each of those sequences represents a protein containing the following regions: initiation codon: M (1aa), signal sequence (2-15aa), pr sequence (16-106aa), M sequence (107-181aa), and Enveloping region (182-676aa). In one embodiment, a virus-like particle, comprising a viral structural protein, having the prM regions and envelope region of SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 and 16, i.e., comprising the amino acid sequence from position 16 to position 676 of those proteins, can be provided.
[0038] A proteína estrutural de flavivírus modificada pode ser pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos para uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 e 16, ou uma sequência de aminoácidos da posição 16 para a posição 676 de uma daquelas sequências. Além disso, a proteína estrutural de flavivírus modificada pode ser um mutante, caracterizado pelo fato de que no máximo 10% dos aminoácidos são deletados, substituídos, e/ou adicionados, com base na proteína estrutural de flavivírus que tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos. SEQ ID Nos. 2, 4, 8, 10, 14 e 16, ou uma sequência de aminoácidos da posição 16 para a posição 676 de qualquer uma dessas sequências.[0038] The modified flavivirus structural protein may have at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% amino acid sequence identity to an amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 and 16, or an amino acid sequence from position 16 to position 676 of one of those sequences. Furthermore, the modified flavivirus structural protein may be a mutant, characterized by the fact that at most 10% of the amino acids are deleted, replaced, and/or added, based on the flavivirus structural protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos. SEQ ID Nos. 2, 4, 8, 10, 14 and 16, or an amino acid sequence from position 16 to position 676 of any of these sequences.
[0039] No segundo aspecto, o presente pedido provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência de nucleotídeos codificando a partícula tipo vírus, como provido no primeiro aspecto da presente invenção.[0039] In the second aspect, the present application provides a nucleic acid molecule comprising, or consisting of, a nucleotide sequence encoding the virus-like particle, as provided in the first aspect of the present invention.
[0040] Em uma modalidade, o presente pedido provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína estrutural de flavivírus, que provê a partícula tipo vírus, como descrito acima.[0040] In one embodiment, the present application provides a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a flavivirus structural protein, which provides the virus-like particle, as described above.
[0041] Em uma modalidade, o presente pedido provê um vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico, como descrito acima, caracterizado pelo fato de que o vetor opcionalmente compreendes uma sequência de controle de expressão operavelmente ligada à molécula de ácido nucleico.[0041] In one embodiment, the present application provides an expression vector comprising the nucleic acid molecule, as described above, characterized by the fact that the vector optionally comprises an expression control sequence operably linked to the nucleic acid molecule.
[0042] Exemplos de sequências de controle de expressão incluem, mas não são limitados a, promotor tal como promotor de CMV, promotor de fago PL de lambda, os promotores E. coli lac, phoA e tac, os promotores SV40 iniciais e tardios, e promoters de LTRs retrovirais.[0042] Examples of expression control sequences include, but are not limited to, promoter such as CMV promoter, lambda phage PL promoter, the E. coli lac, phoA and tac promoters, the early and late SV40 promoters, and promoters of retroviral LTRs.
[0043] Em uma modalidade, o presente pedido provê um vetor de expressão para uma proteína estrutural de flavivírus, que consiste em uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 e 15.[0043] In one embodiment, the present application provides an expression vector for a flavivirus structural protein, which consists of a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID Nos. 1, 3, 7, 9, 13 and 15.
[0044] Em uma modalidade, o presente pedido provê uma molécula de ácido nucleico, que é modificada da molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos, representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 e 15. A molécula de ácido nucleico modificada pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de nucleotídeo para a molécula de ácido nucleico, que tem uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 e 15. Além disso, a molécula de ácido nucleico modificada pode ser uma alteração, caracterizada pelo fato de que no máximo 10% dos aminoácidos são deletados, substituídos, e/ou adicionados com base na molécula de ácido nucleico, que tem uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 e 15.[0044] In one embodiment, the present application provides a nucleic acid molecule, which is modified from the nucleic acid molecule having a nucleotide sequence, represented by any of SEQ ID Nos. 1, 3, 7, 9, 13 and 15. The modified nucleic acid molecule may have at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% nucleotide sequence identity to the nucleic acid molecule, which has a sequence of nucleotides represented by any of SEQ ID Nos. 1, 3, 7, 9, 13 and 15. Furthermore, the modified nucleic acid molecule may be an alteration, characterized by the fact that at most 10% of the amino acids are deleted, substituted, and/or added based on the nucleic acid molecule, which has a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID Nos. 1, 3, 7, 9, 13 and 15.
[0045] No terceiro aspecto, o presente pedido provê uma composição ou vacina, compreendendo a partícula tipo vírus provido no primeiro aspecto do presente pedido, e/ou a molécula de ácido nucleico provida no segundo aspecto da presente invenção.[0045] In the third aspect, the present application provides a composition or vaccine, comprising the virus-like particle provided in the first aspect of the present application, and/or the nucleic acid molecule provided in the second aspect of the present invention.
[0046] Em uma modalidade, o presente pedido provê uma composição compreendendo a partícula tipo flavivírus, como descrito acima, ou a molécula de ácido nucleico como descrita acima.[0046] In one embodiment, the present application provides a composition comprising the flavivirus-like particle, as described above, or the nucleic acid molecule as described above.
[0047] A composição pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, e/ou adjuvante. Exemplos de adjuvantes incluem, mas não são limitados à solução de Ribi (sistema Adjuvante Sigma, Sigma-Aldrich).[0047] The composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and/or adjuvant. Examples of adjuvants include, but are not limited to, Ribi solution (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich).
[0048] A composição farmacêutica do presente pedido pode conter um único ingrediente ativo, ou uma combinação de dois ou mais ingredientes ativos, desde que eles não sejam contrários aos objetivos da presente invenção. Por exemplo, citocinas incluindo quimiocinas, anticorpos contra uma citocina, tal como anticorpo anti-TNF (por exemplo, infliximab, adalimumab), anticorpo anti-VEGF (por exemplo, bevacizumab e ranibizumab), antagonista receptor de citocina, tal como anticorpo anti HER2 (por exemplo, Trastuzumab), anticorpo receptor anti EGF (por exemplo Cetuximab), apatâmero anti VEGF (por exemplo, Pegaptanib) e imunomoduladores tais como ciclosporina, tacrolimus e ubenimex podem ser usados para a terapia de combinação.[0048] The pharmaceutical composition of the present application may contain a single active ingredient, or a combination of two or more active ingredients, as long as they are not contrary to the objectives of the present invention. For example, cytokines including chemokines, antibodies against a cytokine, such as anti-TNF antibody (e.g., infliximab, adalimumab), anti-VEGF antibody (e.g., bevacizumab and ranibizumab), cytokine receptor antagonist, such as anti-HER2 antibody (e.g. Trastuzumab), anti EGF receptor antibody (e.g. Cetuximab), anti VEGF apatamer (e.g. Pegaptanib) and immunomodulators such as cyclosporine, tacrolimus and ubenimex can be used for combination therapy.
[0049] Em uma combinação de ingredientes ativos plurais, os conteúdos dos respectivos ingredientes podem ser apropriadamente aumentados ou diminuídos, em consideração aos seus efeitos e segurança terapêuticos.[0049] In a combination of plural active ingredients, the contents of the respective ingredients can be appropriately increased or decreased, in consideration of their therapeutic effects and safety.
[0050] O termo "combinação", usado aqui no presente, significa que dois ou mais ingredientes ativos são administrados para um paciente simultaneamente, na forma de uma única entidade ou dosagem, ou aqueles ingredientes ativos são administrados para um paciente como entidades separadas, simultaneamente ou sequencialmente, sem nenhum limite de tempo específico, caracterizado pelo fato de que tal administração provê níveis terapeuticamente eficazes dos dois componentes no corpo, preferivelmente ao mesmo tempo.[0050] The term "combination", used herein, means that two or more active ingredients are administered to a patient simultaneously, in the form of a single entity or dosage, or those active ingredients are administered to a patient as separate entities, simultaneously or sequentially, without any specific time limit, characterized by the fact that such administration provides therapeutically effective levels of the two components in the body, preferably at the same time.
[0051] Em uma modalidade, a composição é uma composição de vacina incluindo uma vacina de DNA. Em uma modalidade, a vacina de DNA provida pela presente invenção compreende CpG contendo oligonucleotídeo.[0051] In one embodiment, the composition is a vaccine composition including a DNA vaccine. In one embodiment, the DNA vaccine provided by the present invention comprises CpG containing oligonucleotide.
[0052] No quarto aspecto, o presente pedido provê um método de produzir um anticorpo contra um flavivírus, ou um antissoro contendo um anticorpo neutralizando contra um flavivírus, compreendendo contatar a partícula tipo vírus, provido no primeiro aspecto do presente pedido, e/ou a molécula de ácido nucleico, provida no segundo aspecto da presente invenção para um mamífero.[0052] In the fourth aspect, the present application provides a method of producing an antibody against a flavivirus, or an antiserum containing a neutralizing antibody against a flavivirus, comprising contacting the virus-like particle, provided in the first aspect of the present application, and/or the nucleic acid molecule provided in the second aspect of the present invention for a mammal.
[0053] O anticorpo produzido neste aspecto pode ser usado para imunização passiva de um patógeno causando flavivírus em um mamífero, administrando o mesmo para o mamífero, e desse modo prevenindo o mamífero de infecção por flavivírus, ou tratar uma doença ou condição causada pela infecção por flavivírus no mamífero.[0053] The antibody produced in this aspect can be used for passive immunization of a pathogen causing flavivirus in a mammal, administering the same to the mammal, and thereby preventing the mammal from flavivirus infection, or treating a disease or condition caused by the infection. by flaviviruses in mammals.
[0054] O anticorpo produzido no quarto aspecto do presente pedido pode ser humanizado, usando uma técnica convencional. Dessa maneira, em uma modalidade, o método provido no quarto aspecto da invenção, ainda compreende uma etapa de humanização de um anticorpo produzido por um mamífero não humano. O anticorpo ou anticorpo humanizado provido por esse aspecto pode ser usado para prevenir um sujeito humano da infecção por flavivírus, ou para tratar uma doença ou condição causada pela infecção de flavivírus no sujeito.[0054] The antibody produced in the fourth aspect of the present application can be humanized using a conventional technique. Thus, in one embodiment, the method provided in the fourth aspect of the invention further comprises a step of humanizing an antibody produced by a non-human mammal. The antibody or humanized antibody provided by this aspect can be used to prevent a human subject from flavivirus infection, or to treat a disease or condition caused by flavivirus infection in the subject.
[0055] O anticorpo produzido de acordo com esse aspecto, pode ser usado in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes, tais como célula B e célula T, derivadas do paciente, que são depois readministradas para o paciente.[0055] The antibody produced in accordance with this aspect can be used in vitro to select a subpopulation of immune cells, such as B cells and T cells, derived from the patient, which are then readministered to the patient.
[0056] Antissoro pode ser obtido pela maneira convencional. Amostras de sangue são tiradas do animal não humano imunizado, e o sangue é processado de maneira a obter o antissoro, isto é, o anticorpo-contendo o componente líquido do sangue. O mamífero não humano é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em rato, camundongo, hamster, porco, coelho, cavalo, burro, cabra, carneiro, porquinho da Índia, lama, e primata não humano (por exemplo, chipanzé).[0056] Antiserum can be obtained in the conventional way. Blood samples are taken from the immunized non-human animal, and the blood is processed in order to obtain the antiserum, that is, the antibody-containing liquid component of the blood. The non-human mammal is preferably selected from the group consisting of rat, mouse, hamster, pig, rabbit, horse, donkey, goat, sheep, guinea pig, llama, and non-human primate (e.g., chimpanzee).
[0057] No quinto aspecto, um método de tratar uma doença ou condição causada pela infecção por flavivírus, tal como febre de dengue em um sujeito, caracterizado pelo fato de que a partícula tipo vírus, provido no primeiro aspecto, a molécula de nucleotídeo provida no segundo aspecto, ou a composição provida no terceiro aspecto, é administrada para o sujeito. Pela administração do VLP listado acima, molécula de nucleotídeo ou composição para o sujeito, a resposta imune contra um flavivírus pode ser intensificada e, desse modo, a doença ou condição causada pela infecção por flavivírus pode ser eficazmente tratada. Neste aspecto, o VLP, a molécula ou composição de nucleotídeo pode ser administrada para o paciente, localmente para o órgão afetado ou sistemicamente.[0057] In the fifth aspect, a method of treating a disease or condition caused by flavivirus infection, such as dengue fever in a subject, characterized by the fact that the virus-like particle, provided in the first aspect, the nucleotide molecule provided in the second aspect, or the composition provided in the third aspect, is administered to the subject. By administering the above-listed VLP, nucleotide molecule or composition to the subject, the immune response against a flavivirus can be enhanced and, thereby, the disease or condition caused by the flavivirus infection can be effectively treated. In this aspect, the VLP, molecule or nucleotide composition can be administered to the patient, locally to the affected organ or systemically.
[0058] Um método de prevenir um sujeito de uma infecção por flavivírus, ou de uma doença causada por uma infecção por flavivírus, compreendendo administrar a partícula tipo vírus do primeiro aspecto, a molécula de nucleotídeo provida no segundo aspecto, ou a composição do terceiro aspecto para o sujeito. A doença causada por um flavivírus pode ser uma febre de dengue.[0058] A method of preventing a subject from a flavivirus infection, or a disease caused by a flavivirus infection, comprising administering the virus-like particle of the first aspect, the nucleotide molecule provided in the second aspect, or the composition of the third aspect to the subject. The disease caused by a flavivirus may be dengue fever.
[0059] De acordo com o presente pedido, a partícula tipo vírus pode também ser aplicado para terapia imune. O VLP pode ser aplicado ex vivo para células derivadas do paciente, ou uma linha de células de ser humano, que são subsequentemente administradas para o paciente.[0059] According to the present application, the virus-like particle can also be applied for immune therapy. The VLP can be applied ex vivo to patient-derived cells, or a human cell line, which are subsequently administered to the patient.
[0060] No sexto aspecto, o presente pedido provê um método de produzir a partícula tipo vírus, provido no primeiro aspecto da presente invenção, compreendendo fazer a cultura de uma célula, que está expressando um gene codificando para a proteína estrutural viral; e recuperando a partícula tipo vírus da cultura de célula.[0060] In the sixth aspect, the present application provides a method of producing the virus-like particle, provided in the first aspect of the present invention, comprising culturing a cell, which is expressing a gene encoding the viral structural protein; and recovering the virus-like particle from the cell culture.
[0061] Vários sistemas de vetor hospedeiro podem ser usados para expressão da partícula tipo vírus. Células eucarióticas podem ser usadas para o método provido pelo quarto aspecto do presente pedido. Exemplos de células eucarióticas incluem, mas não são limitados a células de insetos (por exemplo, células de sf9, células de H5), células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae) e células de mamífero (por exemplo, células de CHO, células de rim embriônico de ser humano (células HEK) 293F). Vetor usado para o método provido pelo segundo aspecto do presente pedido, compreende uma molécula de ácido nucleico, codificando a partícula tipo vírus para ser expresso. Células podem ser transfectadas com o vetor, usando métodos convencionais (por exemplo, lipofecção, eletroporação). Uma pessoa versada pode selecionar o meio de cultura, ou com inibidores de transferase de metila de DNA e inibidores de deacetilase de histona, tais como butirato de sódio, dependendo das células empregadas. Depois da transfecção, o partícula tipo vírus pode ser produzido nas células e/ou sobrenadante de cultura. A partícula tipo vírus pode ser recuperado da sobrenadante de cultura e purificado usando ultracentrifugação.[0061] Various host vector systems can be used for expression of the virus-like particle. Eukaryotic cells can be used for the method provided by the fourth aspect of the present application. Examples of eukaryotic cells include, but are not limited to, insect cells (e.g., sf9 cells, H5 cells), yeast cells (e.g., S. cerevisiae), and mammalian cells (e.g., CHO cells, human embryonic kidney cells (HEK cells) 293F). Vector used for the method provided by the second aspect of the present application, comprises a nucleic acid molecule, encoding the virus-like particle to be expressed. Cells can be transfected with the vector using conventional methods (e.g., lipofection, electroporation). A skilled person can select the culture medium, either with DNA methyl transferase inhibitors and histone deacetylase inhibitors, such as sodium butyrate, depending on the cells employed. After transfection, the virus-like particle can be produced in the cells and/or culture supernatant. The virus-like particle can be recovered from the culture supernatant and purified using ultracentrifugation.
[0062] As partícula tipo vírus do presente pedido não replicam e, dessa maneira, têm perfis altamente seguros.[0062] The virus-like particles of the present application do not replicate and, therefore, have highly safe profiles.
[0063] No sétimo aspecto, o presente pedido provê um vírus como partícula para uso, e um método ou kit de diagnosticar infecção por flavivírus em um mamífero. Por usar o vírus como partículas, um kit de diagnóstico de ensaio de sorvente imune ligado à enzima (ELISA) capaz de detectar um anticorpo específico para o flavivírus, poderá ser produzido.[0063] In the seventh aspect, the present application provides a virus as a particle for use, and a method or kit of diagnosing flavivirus infection in a mammal. By using the virus as particles, an enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) diagnostic kit capable of detecting an antibody specific to the flavivirus could be produced.
[0064] O presente pedido será descrito em detalhes com referência ao exemplo a seguir, que, no entanto, não é destinado a limitar o escopo da presente invenção.[0064] The present application will be described in detail with reference to the following example, which, however, is not intended to limit the scope of the present invention.
[0065] Proteínas estruturais virais do vírus de dengue tipos 1 e 2 foram usadas como as proteínas estruturais virais do tipo selvagem. Na região de envoltório das proteínas estruturais virais, pelo menos uma alternativa foi introduzida. A saber, o aminoácido Phe na posição 108 da proteína de envoltório de vírus de dengue tipo 1 (SEQ ID NO: 20) foi alterado para Ala (F108A), o aminoácido Lys na posição 203 da proteína de envoltório de vírus de dengue tipo 1 foi alterado para Asn (K203N) (Região do envoltório: 172-676aa da SEQ ID NO: 4), o aminoácido Asn na posição 246 foi alterado para Met (K246M). Neste exemplo, a região de envoltório corresponde a 172-676aa da SEQ ID NO: 2, posição 108 da SEQ ID NO: 20 corresponde à posição 289 da SEQ ID NO: 2, a posição 203 da SEQ ID NO: 20 corresponde à posição 384 da SEQ ID NO: 2, e a posição 246 da SEQ ID NO: 20 corresponde à posição 427 da SEQ ID NO: 2. Nos exemplos, a alteração na região do envoltório é expressa usando o número de partida da região do envoltório.[0065] Viral structural proteins from dengue virus types 1 and 2 were used as the wild-type viral structural proteins. In the envelope region of viral structural proteins, at least one alternative has been introduced. Namely, the amino acid Phe at position 108 of the dengue virus type 1 envelope protein (SEQ ID NO: 20) was changed to Ala (F108A), the amino acid Lys at position 203 of the dengue virus type 1 envelope protein was changed to Asn (K203N) (Shell region: 172-676aa of SEQ ID NO: 4), the amino acid Asn at position 246 was changed to Met (K246M). In this example, the envelope region corresponds to 172-676aa of SEQ ID NO: 2, position 108 of SEQ ID NO: 20 corresponds to position 289 of SEQ ID NO: 2, position 203 of SEQ ID NO: 20 corresponds to position 384 of SEQ ID NO: 2, and position 246 of SEQ ID NO: 20 corresponds to position 427 of SEQ ID NO: 2. In the examples, the change in the envelope region is expressed using the starting number of the envelope region.
[0066] Para expressar a proteína estrutural viral em células de mamífero, o vetor de expressão DENV2 prM E e o vetor de expressão de DENV2 Capsídeo 20ug, cada um, foi misturado e transfectado para células 293F. O vetor Capsídeo foi R85A e K86A alterados para expressar melhor rendimento (SEQ ID NO: 11 e 12). Para expressar melhor o DENV2 prM E, a região DENV2 Env do terminal C (199aa- 676aa) foi substituída para a região DENV1 Env correspondente para dar proteínas quiméricas (SEQ ID NOs. 7 e 8). Para estabilizar os VLPs, a região de peptídeo de fusão Env (F108A) foi alterada (SEQ ID NOs. 9 e 10).[0066] To express the viral structural protein in mammalian cells, the DENV2 prM E expression vector and the DENV2 Capsid 20ug expression vector each were mixed and transfected into 293F cells. The Capsid vector was R85A and K86A altered to express better yield (SEQ ID NO: 11 and 12). To better express DENV2 prM E, the C-terminal DENV2 Env region (199aa-676aa) was replaced with the corresponding DENV1 Env region to give chimeric proteins (SEQ ID NOs. 7 and 8). To stabilize the VLPs, the Env fusion peptide region (F108A) was altered (SEQ ID NOs. 9 and 10).
[0067] 4 dias depois da transfecção, a sobrenadante da cultura da célula transfectada foi colhida e a expressão de Env foi examinada por Western blotting, usando o anticorpo monoclonal do vírus de dengue (9.F.10), que especificamente liga para a proteína do envoltório (sc- 70959, Santa Cruz Biotecnologia) como um 1° anticorpo, e IgG-HRP de coelho anticamundongo (sc-358920, Santa Cruz Biotecnologia) com um 2° anticorpo. O resultado é mostrado na Fig. 2.[0067] 4 days after transfection, the culture supernatant of the transfected cell was harvested and Env expression was examined by Western blotting, using the dengue virus monoclonal antibody (9.F.10), which specifically binds to the envelope protein (sc-70959, Santa Cruz Biotechnology) as a 1st antibody, and rabbit anti-mouse IgG-HRP (sc-358920, Santa Cruz Biotechnology) with a 2nd antibody. The result is shown in Fig. 2.
[0068] Como mostrado na Figura 2, células transfectadas com DENV2 prM e a quimera de proteína de envoltório de vírus de dengue tipo 2 e tipo 1, com uma alteração (F108A) gerada por maior quantidade de proteína. Aquelas proteínas no sobrenadante espontaneamente montadas para dar partículas.[0068] As shown in Figure 2, cells transfected with DENV2 prM and the type 2 and type 1 dengue virus envelope protein chimera, with one change (F108A) generated by a greater amount of protein. Those proteins in the supernatant spontaneously assemble to give particles.
[0069] Para expressar o vetor de expressão VLP, DENV1 prM E e o vetor de expressão DENV1 Capsídeo 20ug, cada um foram misturados e transfectados para as células 293F. O vetor Capsídeo foi K85A e K86A alterado para expressar melhor rendimento (SEQ ID NOs. 5 e 6). Para estabilizar os VLPs, a região do pepetídeo de fusão Env (F108A) (SEQ ID NOs. 1 e 2) ou aminoácido básico (K203N) (SEQ ID NOs. 3 e 4) ou (K246M) foram alterados. Além disso, dois aminoácidos (F108A+K246M, SEQ ID NOs: 13 e 14) e (F108A+K203N, SEQ ID NOs. 15 e 16) foram também alterados. 4 dias depois da transfecção, a sobrenadante das células transfectadas foi colhida e a expressão de Env foi examinada por Western blotting, usando anticorpo monoclonal de vírus de dengue (9.F.10) (sc-70959, Santa Cruz Biotecnologia) como um 1° anticorpo, e coelho anti- camundongo IgG-HRP (sc-358920, Santa Cruz Biotecnologia) como um 2a anticorpo. Os resultados são mostrados na Fig. 3.[0069] To express the VLP expression vector, DENV1 prM E and the DENV1 Capsid 20ug expression vector, each were mixed and transfected into 293F cells. The Capsid vector was K85A and K86A altered to express better yield (SEQ ID NOs. 5 and 6). To stabilize the VLPs, the Env fusion peptide region (F108A) (SEQ ID NOs. 1 and 2) or basic amino acid (K203N) (SEQ ID NOs. 3 and 4) or (K246M) were changed. Furthermore, two amino acids (F108A+K246M, SEQ ID NOs: 13 and 14) and (F108A+K203N, SEQ ID NOs. 15 and 16) were also changed. 4 days after transfection, supernatant from transfected cells was harvested and Env expression was examined by Western blotting, using dengue virus (9.F.10) monoclonal antibody (sc-70959, Santa Cruz Biotechnology) as a 1 ° antibody, and rabbit anti-mouse IgG-HRP (sc-358920, Santa Cruz Biotechnology) as a 2nd antibody. The results are shown in Fig. 3.
[0070] Como mostrado pela Figura 3, as células transfectadas com DENV prM e a proteína de envoltório, com pelo menos uma alteração, geraram quantidades maiores de proteína de envoltório. Essas proteínas na sobrenadante foram espontaneamente montadas para dar partículas.[0070] As shown in Figure 3, cells transfected with DENV prM and the envelope protein, with at least one change, generated greater amounts of envelope protein. These proteins in the supernatant were spontaneously assembled to give particles.
[0071] O vetor de expressão para as proteínas estruturais de vírus de dengue, contendo prM e proteína de Envoltório modificada F108A, K203N, ou K203N+F108A (SEQ ID NOs 1, 3, 15 respectivamente) usadas no Exemplo 1 foram usadas. Da mesma maneira como no Exemplo 1, 20ug do vector foi transfectada para células 293F e culturadas. Sobrenadantes das células transfectadas foram colhidas no 4° dia, depois da transfecção. Western Blot foi realizada para detectar DENV VLP, usando um anticorpo monoclonal (9.F. 10, Santa Cruz Biotec) como um anticorpo primário, e anticamundongo de coelho IgG-HRP conjugaram anticorpos como um anticorpo secundário. Os resultados são mostrados na Figura 4. Como mostrado pela Figura 4, células transfectadas com DENV1-prM e a proteína de envoltório, com pelo menos uma alteração, geraram maior quantidade de proteína de envoltório.[0071] The expression vector for the structural proteins of dengue viruses, containing prM and modified Envelope protein F108A, K203N, or K203N+F108A (SEQ ID NOs 1, 3, 15 respectively) used in Example 1 were used. In the same manner as in Example 1, 20ug of the vector was transfected into 293F cells and cultured. Supernatants from transfected cells were harvested on the 4th day, after transfection. Western blot was performed to detect DENV VLP, using a monoclonal antibody (9.F. 10, Santa Cruz Biotec) as a primary antibody, and rabbit anti-mouse IgG-HRP conjugated antibodies as a secondary antibody. The results are shown in Figure 4. As shown in Figure 4, cells transfected with DENV1-prM and the envelope protein, with at least one change, generated greater amounts of envelope protein.
[0072] A sobrenadante foi filtrada usando filtro de 0,45 μm para obter partículas tipo vírus. As partícula tipo vírus foram concentrados usando coluna de TFF, e purificados usando coluna de QXL (GE Healthcare) para obter vírus como partículas purificadas. O VLP purificado foi arquivado em 4% de formaldeído em PBS. Visualização microscópica de elétron (EM) de VLPs negativamente manchadas foi realizada. Resumidamente, 1,0 μl da amostra foi colocado sobre uma grade de cobre de Formvar-filmado revestido de carbono, e deixados os VLPs para acoplar. Depois, 2 μl 1% de solução de PTA foram adicionadas para a grade e a grade foi examinada pelo microscópio de elétron. O resultado é mostrado na Figura 5. No sobrenadante, vírus como partículas foram observados.[0072] The supernatant was filtered using a 0.45 μm filter to obtain virus-like particles. Virus-like particles were concentrated using TFF column, and purified using QXL column (GE Healthcare) to obtain viruses as purified particles. The purified VLP was archived in 4% formaldehyde in PBS. Electron microscopic (EM) visualization of negatively stained VLPs was performed. Briefly, 1.0 μl of the sample was placed on a carbon-coated Formvar-filmed copper grid, and the VLPs were allowed to couple. Then, 2 μl 1% PTA solution was added to the grid and the grid was examined by electron microscope. The result is shown in Figure 5. In the supernatant, virus like particles were observed.
[0073] VLP purificado obtido no Exemplo 2 (K203N+F108A) foi denominado como DEN1 VLP e usado neste exemplo. As partícula tipo vírus purificadas foram ainda concentradas usando coluna de rotação (corte de Peso Molecular: 100kDa) para preparar as partícula tipo vírus para a imunização. Depois disso, quatro (4) camundongos foram imunizados com DEN1 VLP 30 μg em PBS, contendo adjuvante de alumínio (2% de alidrogel, Adjuvantes Sergeant) por injeção intramuscular duas vezes nas semanas 0 e 4.[0073] Purified VLP obtained in Example 2 (K203N+F108A) was named DEN1 VLP and used in this example. The purified virus-like particles were further concentrated using spin column (Molecular Weight cutoff: 100kDa) to prepare the virus-like particles for immunization. Thereafter, four (4) mice were immunized with DEN1 VLP 30 μg in PBS containing aluminum adjuvant (2% alidrogel, Sergeant Adjuvants) by intramuscular injection twice at weeks 0 and 4.
[0074] Títulos de IgG específicos do vírus de dengue, do soro derivado dos camundongos imunizados, foram determinados pelo sistema ELISA. O soro foi ensaiado por anticorpo de neutralização para cada um dos vírus DENV-1, DENV-2, DENV-3, e DENV-4. Os tipos de soro de Dengue 1-4 foram usados: DENV-1, cepa Philippine-99St12A DENV-2, cepa Philippine-00St22A DENV-3, cepa Philipine-SLMC50 DENV-4, cepa Philippine-SLMC318 JEV- JaOAr S-982 cepa[0074] Dengue virus-specific IgG titers from serum derived from immunized mice were determined by the ELISA system. Serum was assayed for neutralizing antibody to each of the DENV-1, DENV-2, DENV-3, and DENV-4 viruses. Dengue serum types 1-4 were used: DENV-1, strain Philippine-99St12A DENV-2, strain Philippine-00St22A DENV-3, strain Philipine-SLMC50 DENV-4, strain Philippine-SLMC318 JEV- JaOAr S-982 strain
[0075] Anticorpos de neutralização de Anti-DENV, nos soros de camundongos imunizados, foram detectados por um teste de neutralização de redução de foco anteriormente descrito (FRNT), em células Vero, usando 1,25 x 108 FFU de Vero-adaptado DVs tipo 1-4. O título do ponto final foi calculado como a mais alta diluição de soro testada, que reduziu o número de FFU por pelo menos 50% (FRNT50). Células vero em 100 % de confluência em placas de 96 poços foram usadas.[0075] Anti-DENV neutralizing antibodies, in the sera of immunized mice, were detected by a previously described focus reduction neutralization test (FRNT), in Vero cells, using 1.25 x 108 FFU of Vero-adapted DVs type 1-4. The endpoint titer was calculated as the highest serum dilution tested that reduced the number of FFU by at least 50% (FRNT50). Vero cells at 100% confluency in 96-well plates were used.
[0076] IgG de coelho anti-Dengue alojado foi usado como o anticorpo principal, e conjugado IgG-HRPO anticoelho (102-PD) foi usado como o anticorpo secundário. Os resultados estão resumidos na tabela abaixo. Tabela 1 [0076] Housed anti-Dengue rabbit IgG was used as the main antibody, and anti-rabbit IgG-HRPO conjugate (102-PD) was used as the secondary antibody. The results are summarized in the table below. Table 1
[0077] Como mostrado na tabela 1, o DENV1 VLP exibiu efeito de neutralização superior sobre os vírus de dengue tipos 1, 2, 3 e 4. Em vista do fato de que o valor de FRNT 50 de anticorpos de neutralização, obtidos com a vacina de Dengue atenuada ao vivo, é em torno de 1000 (Tsai et al., Jornal de Virologia, 2015 89: 73487362.), a imunogenicidade de DENV1 VLP foi muito forte e forneceu neutralização de anticorpo cerca de 10 vezes mais alta contra vírus de Dengue do que a vacina atenuada ao vivo.[0077] As shown in table 1, the DENV1 VLP exhibited superior neutralization effect on dengue viruses types 1, 2, 3 and 4. In view of the fact that the FRNT 50 value of neutralization antibodies, obtained with the live attenuated Dengue vaccine, is around 1000 (Tsai et al., Journal of Virology, 2015 89: 73487362.), the immunogenicity of DENV1 VLP was very strong and provided about 10 times higher antibody neutralization against viruses of Dengue than the live attenuated vaccine.
[0078] Vírus de dengue como partículas foram preparados de acordo com o Exemplo 1. Para preparar uma composição farmacêutica que é uma composição de vacina, 80 μg de cada uma das partículas preparadas foram misturados com 1 ml de Solução de Fosfato de Sacarose, pH 7,2, Endotoxina Livre (tampão Teknova, SP).[0078] Dengue virus like particles were prepared according to Example 1. To prepare a pharmaceutical composition which is a vaccine composition, 80 μg of each of the prepared particles were mixed with 1 ml of Sucrose Phosphate Solution, pH 7.2, Free Endotoxin (Teknova buffer, SP).
[0079] Vetores de expressão para prM e proteínas de Envoltório de vírus de dengue tipo 2-4, caracterizado pelo fato de que a posição do aminoácido 108 da região de envoltório (correspondente a 289aa de SEQ ID NOs. 22-24) é substituída de F para A, e a região do terminal C da proteína de Envoltório (478-676aa ou 476-674aa) é substituída com aquela correspondente à proteína de envoltório do vírus de dengue tipo 1 (478-676aa da SEQ ID NO. 22) são preparados. Proteínas a ser expressas pelos vetores são aquelas representadas pela SEQ ID NOs. 22-24. As partícula tipo vírus são obtidas da mesma maneira como no Exemplo 1.[0079] Expression vectors for prM and Envelope proteins of dengue virus type 2-4, characterized by the fact that the position of amino acid 108 of the envelope region (corresponding to 289aa of SEQ ID NOs. 22-24) is substituted from F to A, and the C-terminal region of the Envelope protein (478-676aa or 476-674aa) is replaced with that corresponding to the envelope protein of dengue virus type 1 (478-676aa of SEQ ID NO. 22) are prepared. Proteins to be expressed by the vectors are those represented by SEQ ID NOs. 22-24. Virus-like particles are obtained in the same way as in Example 1.
Claims (16)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462048897P | 2014-09-11 | 2014-09-11 | |
| US62/048,897 | 2014-09-11 | ||
| PCT/JP2015/004623 WO2016038895A1 (en) | 2014-09-11 | 2015-09-10 | Flavivirus virus like particle |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112017004770A2 BR112017004770A2 (en) | 2017-12-12 |
| BR112017004770A8 BR112017004770A8 (en) | 2023-04-11 |
| BR112017004770B1 true BR112017004770B1 (en) | 2024-04-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2960102C (en) | Flavivirus virus like particle | |
| Mezhenskaya et al. | M2e-based universal influenza vaccines: a historical overview and new approaches to development | |
| AU2011217903B2 (en) | Vaccines for use in the prophylaxis and treatment of influenza virus disease | |
| ES2858315T3 (en) | Stabilized soluble RSV prefusion protein F for use in the prophylaxis of RSV infection | |
| WO2017150683A1 (en) | Zika virus virus like particle | |
| CA2849434A1 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| ES2640961T3 (en) | Vesicular stomatitis virus for sensitization and reinforcement vaccines | |
| CA2974699A1 (en) | Influenza virus vaccination regimens | |
| Jiang et al. | Hantavirus Gc induces long-term immune protection via LAMP-targeting DNA vaccine strategy | |
| KR20010022452A (en) | Recombinant dimeric envelope vaccine against flaviviral infection | |
| JP2023524990A (en) | Recombinant Newcastle disease virus expressing SARS-CoV-2 spike protein and uses thereof | |
| CN105555958B (en) | Modified matrix proteins of vesicular stomatitis virus | |
| WO2021206638A1 (en) | Vaccine and/or antibody for viral infection | |
| CN105085672B (en) | 3D protein specific monoclonal immunoglobulin A antibodies and compositions thereof | |
| BR112021008217A2 (en) | human antibodies that target zika virus ns1, polypeptides ns1 and their uses | |
| WO2016130786A2 (en) | Flaviviridae proteins and virions and methods of use thereof | |
| BR112016029201B1 (en) | NUCLEIC ACID CHIMERA, IMMUNOGENIC COMPOSITION, USE AND METHOD FOR INACTIVATING A VIRUS | |
| BR112017004770B1 (en) | VIRUS-LIKE PARTICLE COMPRISES A FLAVIVIRUS ENVELOPE PROTEIN, ITS PRODUCTION METHOD, COMPOSITION THAT COMPRISES IT AND METHOD OF PRODUCING AN ANTIBODY | |
| US11111275B2 (en) | Compositions and methods for making and using virus-like particles (VLPs) | |
| CN105085671B (en) | Monoclonal immunoglobulin G antibodies against enterovirus 3D proteins and immunogenic compositions thereof | |
| WO2016115664A1 (en) | 3d protein-specific monoclonal immunoglobulin a antibodies | |
| WO2016115665A1 (en) | Immunoglobulin g monoclonal antibodies against 3d proteins of enteroviruses | |
| Willis | The Effect of Maternal Antibodies on Anti-viral Immunity in Infant Mice |