BR112016022011B1 - Antígeno de proteína estafilocócica a mutante, proteína de fusão, e,composição imunogênica - Google Patents

Abstract

ANTÍGENO DE PROTEÍNA ESTAFILOCÓCICA A MUTANTE, PROTEÍNA DE FUSÃO, E, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA. É provido SpA mutante com afinidade diminuída para a porção Fcy de IgG humana. A imunização com EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, Hla e o dito SpA mutante provê resultados surpreendentes em um modelo de abscesso renal de infecção pela S. aureus.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício dos pedidos de patente europeus 14161861.1 (depositado em 26 de março de 2014) e 14192913.3 (depositado em 12 de novembro de 2014), os conteúdos completos de ambos os quais são por meio deste incorporados por referência para todos os propósitos.

CAMPO TÉCNICO

[002] Esta invenção se refere à imunização contra infecção pelo S. aureus.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[003] Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica Gram-positiva. A mortalidade anual nos Estados Unidos excede aquela de qualquer outra doença infecciosa, incluindo HIV/AIDS, e S. aureus é a causa principal de infecções na corrente sanguínea, trato respiratório inferior, pele & tecido mole. Também é a causa predominante de infecções ósseas no mundo todo, e estas infecções são dolorosas, debilitantes e difíceis de tratar.

[004] O tratamento de S. aureus está se tornando crescentemente desafiador devido ao desenvolvimento de resistência a antibiótico por muitas cepas de S. aureus. O S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é encontrado em mais da metade de todas as infecções na comunidade e hospitalares. Nos anos recentes têm-se observado a emergência de cepas de MRSA que também são resistentes à vancomicina, o antibiótico de última instância, e que são essencialmente intratáveis.

[005] Não há correntemente nenhuma vacina autorizada. Uma vacina com base em uma mistura de polissacarídeo de superfície de tipos bacterianos 5 e 8, StaphVAX®, falhou na redução de infecções quando comparadas com o grupo do placebo em um teste clínico de fase III. Similarmente, a vacina V710 [1], com base no antígeno IsdB [2], falhou em reduzir a taxa de infecções por S. aureus no pós-operatório [3].

[006] A necessidade quanto a uma vacina é particularmente aguda devido aos problemas de resistência a antibiótico e ao fato de que a infecção pela S. aureus não provê imunidade para infecção futura graças às suas capacidades de evasão imune bem desenvolvidas. As propriedades de evasão imune de S. aureus por sua vez tornam o desenvolvimento de vacinas eficazes mais difícil. Os mecanismos de evasão imune não são totalmente entendidos, mas são pelo menos em parte devido à proteína estafilocócica A (SpA), uma molécula de superfície da S. aureus que se liga ao Fc da imunoglobulina (Ig) e à porção Fab de receptores de célula B do tipo VH3. A interação de SpA com receptores de célula B leva à expansão clonal e subsequente morte celular de populações de célula B, levando à ablação da resposta imune adaptativa. A ligação de SpA ao Fc de Ig interfere com a depuração opsonofagocítica de estafilocócicos pelos leucócitos polimorfonucleares.

[007] As formas mutantes de SpA com afinidade reduzida para imunoglobulinas foram desenvolvidas. A WO2011/005341 descreve uma SpA com mutações pontuais em cada um dos cinco domínios de ligação de Ig que reduzem a capacidade da proteína para se ligar à IgG.

[008] A referência 4 descreve vários métodos para prover vacinas contra S. aureus melhoradas, incluindo duas combinações de imunógeno preferidas aludidas como “Combo-1” e “Combo-2”. “Combo-1” incluiu cinco antígenos EsxA, EsxB, um Hla mutante, FhuD2, e Sta011, ao passo que “Combo-2” usou um fragmento de IsdA no lugar do Hla mutante. Ambas destas combinações foram testadas com adjuvantes de hidróxido de alumínio e elas aumentaram o tempo médio de sobrevivência em um modelo de camundongo de infecção quando comparadas ao tampão sozinho ou ao antígeno de IsdB. “Combo-1” também foi testado com um adjuvante de hidróxido de alumínio e um agonista de TLR7, e a adição do agonista de TLR7 melhorou as respostas [5].

[009] A despeito dos resultados positivos com “Combo-1” e “Combo-2”, permanece uma necessidade quanto a composições adicionais e melhoradas para a imunização contra S. aureus.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0010] A Proteína A (SpA) (SEQ ID NO: 43), uma proteína de superfície ancorada à parede celular de Staphylococcus aureus, provê a evasão bacteriana de respostas inatas e imunes adaptativas. A proteína A liga imunoglobulinas na sua porção Fc, interage com o domínio VH3 de receptores de célula B inadequadamente estimulando a proliferação de célula B e a apotose, se liga aos domínios do fator de von Willebrand A1 para ativar a coagulação intracelular, e também se liga ao Receptor 1 de TNF para contribuir para a patogênese da pneumonia pelos estafilocócicos. Devido ao fato de que a proteína A captura a imunoglobulina e demonstra atributos tóxicos, a possibilidade de que esta molécula de superfície possa funcionar como uma vacina nos seres humanos não foi rigorosamente perseguida. Aqui os inventores demonstram que as variantes da proteína A não são mais capazes de se ligar às imunoglobulinas, que são deste modo removidas do seu potencial toxigênico, isto é, são não toxigênicas, estimulam as respostas imunes humorais que protegem contra a doença estafilocócica.

[0011] A invenção, portanto, provê antígenos de SpA mutantes como descritos abaixo. Os ditos mutantes preferivelmente têm afinidade diminuída para a porção FCY da IgG humana em relação à SpA não modificada. Os mutantes também podem ter afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção Fab de receptores de célula B humanos contendo VH3.

[0012] Os inventores descobriram que a vacina “Combo-1” conhecida pode ser melhorada pela adição de uma proteína A de estafilocócicos (SpA) mutante que foi modificada para diminuir a sua afinidade para a porção FCY da IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B contendo VH3. Este antígeno extra aumenta a eficácia protetiva da combinação e provê resultados surpreendentes em um modelo de abscesso renal. Nenhuma das combinações de antígeno testada na referência 4 incluiu um antígeno de SpA.

[0013] A invenção, portanto, provê ainda uma composição imunogênica compreendendo os antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla, caracterizado em que a composição adicionalmente inclui um antígeno de SpA mutante, em que o mutante tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção FCY da IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3.

[0014] A invenção também provê uma composição imunogênica compreendendo: (i) pelo menos um antígeno selecionado do grupo consistindo em antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 e Hla; e (ii) um antígeno de SpA mutante que tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção FCY da IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3. Assim 1, 2, 3, 4 ou preferivelmente todos os 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla podem ser usados em combinação com a SpA mutante.

[0015] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa habilitada na técnica relevante.

[0016] Por conveniência, o significado de certos termos e frases utilizados no relatório descritivo, exemplos e reivindicações é provido.

Antígenos de S. aureus

[0017] A invenção se refere inter alia a um antígeno de SpA mutante. A SpA do tipo selvagem (proteína A estafilocócica) é uma proteína de superfície ancorada à parede celular que é um fator de virulência crucial para as infecções pulmonares, septicemia, e desenvolvimento abscesso e é expressa pela maioria dos isolados clínicos de S. aureus. A SpA do tipo selvagem se liga à porção Fc da IgG humana, aos receptores de célula B contendo VH3, ao fator de von Willebrand no seu domínio A1, e ao receptor 1 de TNF-α. A interação de SpA com receptores de célula B leva à expansão clonal e subsequente morte celular das populações de célula B com efeitos sobre as respostas imunes adaptativas e inatas, ao passo que a sua ligação ao FcY de IgG interfere com a depuração opsonofagocítica de estafilocócicos pelos leucócitos polimorfonucleares. A parte do terminal N de SpA madura é compreendida de quatro ou cinco domínios de ligação de Ig de 56 a 61 resíduos, que se dobram em feixes helicoidais triplos conectados pelos ligantes curtos, e são designados na ordem E, D, A, B, e C [6]. Estes domínios demonstram ~80 % de identidade ao nível de aminoácido, têm de 56 a 61 resíduos no comprimento, e são organizados como repetições em tandem [7]. A região de terminal C é compreendida de “Xr”, um octapeptídeo altamente repetitivo embora variável, e “Xc”, um domínio que está contíguo com a estrutura de âncora da parede celular de SpA.

[0018] Na cepa NCTC 8325 spa é SAOUHSC_00069 e tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 43 (GI:88193885). Na cepa Newman a mesma é nwmn_0055 (GI:151220267). Os antígenos de SpA usados com a invenção podem extrair um anticorpo (por exemplo, quando administrados a um humano) que reconhece a SEQ ID NO: 43 e/ou pode compreender uma sequência de aminoácidos: (a) tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 43; e/ou (b) compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 43, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Estes antígenos de SpA incluem variantes da SEQ ID NO: 43. Os fragmentos preferidos de (b) compreendem um epítopo da SEQ ID NO: 43. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal N da SEQ ID NO: 43 enquanto retêm pelo menos um epítopo da SEQ ID NO: 43. Os 35 aminoácidos finais do terminal C da SEQ ID NO: 43 podem ser utilmente omitidos. Os primeiros 36 aminoácidos do terminal N da SEQ ID NO: 43 podem ser utilmente omitidos. A referência 8 sugere que domínios de ligação de IgG individuais seriam imunógenos úteis, sozinhos ou em combinação.

[0019] Um fragmento útil da SEQ ID NO: 43 tem os aminoácidos de 37 a 325. Este fragmento contém todos os cinco domínios de ligação da Ig de SpA (que são naturalmente dispostos do terminal N para o C na ordem E, D, A, B, C) e inclui o domínio mais exposto de SpA. Ele também reduz a similaridade do antígeno com proteínas humanas. Outros fragmentos úteis podem omitir 1, 2, 3 ou 4 dos domínios A, B, C, D e/ou E naturais para prevenir a expansão excessiva de célula B e depois a apoptose que ocorreria se spa funcionasse como um superantígeno de célula B. Como relatado na referência 18, outros fragmentos úteis podem incluir apenas 1, 2, 3 ou 4 dos domínios A, B, C, D e/ou E naturais por exemplo, compreendem apenas o domínio SpA(A) mas não de B a E, ou compreendem apenas o domínio SpA(D) mas não A, B, C ou E, etc. Assim um antígeno de spa útil com a invenção pode incluir 1, 2, 3, 4 ou 5 domínios de ligação de IgG, mas idealmente tem 4 ou menos.

[0020] Assim, um outro fragmento de SpA útil compreende ou consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 em que o dubleto de aminoácido nas posições 60 e 61 não é Gln-Gln. O dito dubleto pode ser mutado como descrito abaixo, por exemplo, para Lys-Arg. Assim, o dito fragmento pode compreender ou consistir das SEQ ID NOs: 51 ou 52.

[0021] Se um antígeno inclui apenas um tipo de domínio spa (por exemplo, apenas o domínio Spa(A), SpA(D) ou Spa(E)), o mesmo pode incluir mais do que uma cópia deste domínio por exemplo, domínios SpA(E) múltiplos em uma única cadeia de polipeptídeo. O mesmo também pode incluir um tipo de domínio de SpA e uma outra proteína ou polipeptídeo. Assim, um antígeno da invenção pode ser uma proteína de fusão compreendendo apenas um tipo de domínio de SpA, tal como o domínio SpA(E), e um outro antígeno de proteína, tal como EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; e Hla.

[0022] Os antígenos de SpA da invenção são mutados em relação à SEQ ID NO: 43, tal que eles tenham afinidade diminuída para a porção de FCY de IgG humana. Por exemplo, o dipeptídeo QQ nos resíduos 60-61 da SEQ ID NO: 43 pode ser mutado para reduzir a afinidade para imunoglobulinas. As substituições de dipeptídeo úteis para um dipeptídeo QQ são debatidos abaixo, e uma substituição preferida é o dipeptídeo KR. Assim um antígeno SpA útil pode compreender a SEQ ID NO: 49, em que um ou mais (preferivelmente todos) dos 11 dipeptídeos XX diferem dos dipeptídeos correspondentes dentro da SEQ ID NO: 43. Por exemplo, o antígeno de SpA pode compreender a SEQ ID NO: 46, e um exemplo preferido da SEQ ID NO: 46 é a SEQ ID NO: 47. Quando expresso com uma metionina no terminal N, o antígeno de SpA compreendendo a SEQ ID NO: 47 pode consistir da SEQ ID NO: 48.

[0023] Os antígenos de SpA usados com a invenção podem ser mutados ainda em relação à SEQ ID NO: 43, tal que eles tenham afinidade diminuída para a porção Fcy da IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3. Isto pode ser obtido e avaliado, por exemplo, seguindo-se a orientação na referência 9. Assim pelo menos um dipeptídeo Gln-Gln na SpA do tipo selvagem pode ser mutado (por exemplo, para Lys-Lys; outras mutações possíveis incluem Arg-Arg, Arg-Lys, Lys- Arg, Ala-Ala, Ser-Ser, Ser-Thr, Thr-Thr, etc.) e/ou pelo menos um dipeptídeo de Asp-Asp na SpA do tipo selvagem pode ser mutado (por exemplo, para Ala-Ala; outras mutações possíveis incluem Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, His-His, Val-Val, etc.). Estas sequências alvo para mutação são sublinhadas abaixo, onde traços separam os cinco domínios de ligação de Ig: MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTP-AANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPN LNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK-ADAQQNNFNKDQQSAFYE ILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK-ADNNFNKEQQNA FYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK-ADNKFNKEQ QNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK-ADNKFN KEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK-EED NNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKED GNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTA DKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFG GLSLALGAALLAGRRREL (SEQ ID NO: 43)

[0024] Um domínio individual dentro do antígeno pode ser mutado em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 43 (por exemplo, ver acima em relação às sequências Gln-Gln e Asp-Asp, mas também ver a referência 22 que descreve mutações nos resíduos 3 e/ou 24 do domínio D, nos resíduos 46 e/ou 53 do domínio A, etc.). Tais mutações não devem remover a capacidade do antígeno para extrair um anticorpo que reconheça a SEQ ID NO: 43, mas removerá a ligação do antígeno à IgG e/ou outras proteínas humanas (tais como proteínas sanguíneas humanas) como mencionado acima. Particularmente, o antígeno de SpA mutante é da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 43 mutados em pelo menos 1, mais particularmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e ainda mais particularmente 20 aminoácidos na posição 43, 44, 70, 71, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 190, 191, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 e/ou 306 da SEQ ID NO: 43. As substituições úteis para estas posições são mencionadas acima.

[0025] Além disso, o terminal N nativo pode ser removido, e os primeiros 36 aminoácidos da SEQ ID NO: 43 podem ser utilmente omitidos. Similarmente, o terminal V nativo pode ser removido, e a sequência jusante do quinto domínio de ligação de Ig pode ser utilmente omitida (isto é, a jusante de Lys-327 na SEQ ID NO: 43). Assim um antígeno de SpA útil compreende a SEQ ID NO: 44: AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK ADAQQNNFNKDXXSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQSTNVLGEAKKLNE SQAPKADNNFNKEXXNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKL NESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLAEAK KLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKXXPSVSKEILAE AKKLNDAQAPK em que os 10 dipeptídeos XX sublinhados diferem dos dipeptídeos correspondentes dentro da SEQ ID NO: 43. Assim um QQ nestas posições na SEQ ID NO: 43 não serão QQ na SEQ ID NO: 44, e idealmente não incluem nenhum resíduo de glutamina por exemplo, é KK. Similarmente, um DD nestas posições na SEQ ID NO: 43 não será DD na SEQ ID NO: 44, e idealmente não inclui nenhum resíduo de aspartato por exemplo, é AA. A forma preferida de SpA para o uso com a invenção assim compreende a SEQ ID NO: 45.

[0026] Além das substituições nos dipeptídeos XX na SEQ ID NO: 44 é possível modificar a sequência de aminoácidos com até 5 mudanças de amino único contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que ainda se liguem a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 44. Assim, a SEQ ID NO: 45 pode ser modificada por 1, 2 ou 3 substituições nas posições fora dos dipeptídeos XX dentro da SEQ ID NO: 44. Por exemplo, o dipeptídeo QQ nos resíduos 60 a 61 da SEQ ID NO: 44 podem ser mutados para reduzir ainda mais a afinidade para imunoglobulinas. As substituições de dipeptídeo úteis para um dipeptídeo QQ são debatidas acima, e uma substituição preferida é o dipeptídeo KR. Assim um antígeno de SpA útil pode compreender a SEQ ID NO: 49, em que um ou mais (preferivelmente todos) dos 11 dipeptídeos XX diferem dos dipeptídeos correspondentes dentro da SEQ ID NO: 43. Por exemplo, o antígeno de SpA pode compreender a SEQ ID NO: 46, e um exemplo preferido da SEQ ID NO: 46 é a SEQ ID NO: 47. Quando expresso com uma metionina no terminal N, o antígeno de SpA compreendendo a SEQ ID NO: 47 pode consistir da SEQ ID NO: 48.

[0027] Como debatido acima, um fragmento de SpA útil pode incluir apenas 1, 2, 3 ou 4 dos domínios A, B, C, D e/ou E naturais por exemplo, compreendem apenas o domínio SpA(E) mas não D, A, B ou C. Assim um antígeno de SpA útil com a invenção pode compreender apenas o domínio SpA(E) mutado como descrito acima, isto é, a sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 54 mutada em pelo menos 1 aminoácido nas posições 60 e 61 da SEQ ID NO: 54 aminoácidos 1 a 67 da SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 49, ou aminoácidos 1 a 68 da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, o dito antígeno pode compreender a SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 53. O dito antígeno preferivelmente não incluirá outra sequência de SpA. O mesmo pode incluir mais do que uma cópia do domínio SpA(E), e/ou adicionalmente compreende um outro antígeno de proteína tal como um antígeno de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, ou Hla como aqui descrito.

[0028] As combinações de antígeno da invenção usam 1, 2, 3, 4, ou todos os 5 dos seguintes antígenos: EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; e Hla. Estes cinco antígenos já são conhecidos na técnica (por exemplo, ver as referências 4-514) e mais detalhes são dados abaixo. Uma composição particularmente útil inclui todos os cinco destes antígenos (preferivelmente onde o Hla é uma forma mutante não tóxica (isto é, destoxificada)).

[0029] O antígeno ‘EsxA’ na cepa NCTC 8325 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (GI:88194063). Os antígenos EsxA usados com a presente invenção podem extrair um anticorpo (por exemplo, quando administrados a um humano) que reconhece a SEQ ID NO: 1 e/ou pode compreender uma sequência de aminoácidos: (a) tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 1; e/ou (b) compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 1, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou mais). Estes polipeptídeos de EsxA incluem variantes da SEQ ID NO: 1. Os fragmentos preferidos de (b) compreendem um epítopo da SEQ ID NO: 1. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal N da SEQ ID NO: 1 enquanto retêm pelo menos um epítopo da SEQ ID NO: 1.

[0030] O antígeno ‘EsxB’ na cepa NCTC 8325 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 (GI:88194070). O EsxB usado com a presente invenção pode extrair um anticorpo (por exemplo, quando administrado a um humano) que reconhece a SEQ ID NO: 2 e/ou pode compreender uma sequência de aminoácidos: (a) tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 2; e/ou (b) compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 2, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais). Estes polipeptídeos de EsxB incluem variantes da SEQ ID NO: 2. Os fragmentos preferidos de (b) compreendem um epítopo da SEQ ID NO: 2. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal N da SEQ ID NO: 2 enquanto retêm pelo menos um epítopo da SEQ ID NO: 2. Um antígeno de EsxB útil carece do resíduo de cisteína interno da SEQ ID NO: 2 por exemplo, o mesmo compreende a SEQ ID NO: 35, em que o resíduo X na posição 30 está ausente ou é um resíduo de aminoácido sem um grupo tiol livre (sob condições redutoras) por exemplo, é qualquer aminoácido natural exceto cisteína.

[0031] O antígeno ‘FhuD2’ é anotado como ‘proteína de ligação de ferricromo’, e também foi estudado na literatura [15]. O mesmo também foi conhecido como ‘Sta006’ (por exemplo, nas referências 4-14). Na cepa NCTC 8325 FhuD2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (GI:88196199). FhuD2 usada com a presente invenção pode extrair um anticorpo (por exemplo, quando administrado a um humano) que reconhece a SEQ ID NO: 3 e/ou pode compreender uma sequência de aminoácidos: (a) tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 3; e/ou (b) compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 3, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Estes polipeptídeos de FhuD2 incluem variantes da SEQ ID NO: 3. Os fragmentos preferidos de (b) compreendem um epítopo da SEQ ID NO: 3. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal N da SEQ ID NO: 3 enquanto retêm pelo menos um epítopo da SEQ ID NO: 3. Os primeiros 17 aminoácidos do terminal N da SEQ ID NO: 3 podem ser utilmente omitidos (para prover a SEQ ID NO: 6). As formas mutantes de FhuD2 são relatadas na referência 16. Um antígeno de FhuD2 útil carece do resíduo de cisteína da SEQ ID NO: 3 por exemplo, o mesmo compreende a SEQ ID NO: 34 e não inclui nenhum resíduo de aminoácido com um grupo tiol livre (sob condições redutoras) por exemplo, o mesmo é livre de cisteína. Um antígeno de FhuD2 pode ser lipidado por exemplo, com uma cisteína de terminal N acilada. Uma sequência de FhuD2 útil é a SEQ ID NO: 7, que tem uma sequência Met-Ala-Ser- no terminal N; a SEQ ID NO: 37 é uma outra tal sequência, mas a mesma carece da cisteína presente na SEQ ID NO: 7.

[0032] O antígeno ‘Sta011’ tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4 (GI:88193872) na cepa NCTC 8325. Os antígenos de Sta011 usados com a invenção podem extrair um anticorpo (por exemplo, quando administrados a um humano) que reconhece a SEQ ID NO: 4 e/ou pode compreender uma sequência de aminoácidos: (a) tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 4; e/ou (b) compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 4, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Estes polipeptídeos de Sta011 incluem variantes da SEQ ID NO: 4. Os fragmentos preferidos de (b) compreendem um epítopo da SEQ ID NO: 4. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal N da SEQ ID NO: 4 enquanto retêm pelo menos um epítopo da SEQ ID NO: 4. Os primeiros 23 aminoácidos do terminal N da SEQ ID NO: 4 podem ser utilmente omitidos (para prover a SEQ ID NO: 33). Um antígeno de Sta011 útil carece do resíduo de cisteína da SEQ ID NO: 4 por exemplo, o mesmo compreende a SEQ ID NO: 36 e não inclui nenhum resíduo de aminoácido com um grupo tiol livre (sob condições redutoras) por exemplo, o mesmo é livre de cisteína. Um antígeno de Sta011 pode ser lipidado por exemplo, com uma cisteína de terminal N acilada. Uma sequência de Sta011 útil é a SEQ ID NO: 8, que tem uma metionina no terminal N; a SEQ ID NO: 39 é uma outra tal sequência, mas a mesma carece da cisteína presente na SEQ ID NO: 8. As formas variantes da SEQ ID NO: 4 que podem ser usadas como ou para preparar antígenos de Sta011 incluem, mas não são limitadas às SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 com várias substituições Ile/Val/Leu (e variantes livres de Cys destas sequências também podem ser usadas com a invenção). Sta011 pode existir como um monômero ou um oligômero, com íons Ca++ favorecendo a oligomerização. A invenção pode usar monômeros e/ou oligômeros de Sta011.

[0033] O antígeno ‘Hla’ é o ‘precursor de alfa-hemolisina’ também conhecido como ‘toxina alfa’ ou simplesmente ‘hemolisina’. Na cepa NCTC 8325 Hla tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 (GI:88194865). Hla é um determinante de virulência importante produzido pela maioria das cepas de S. aureus, tendo atividade de formação de poro e hemolítica. Os anticorpos anti-Hla podem neutraliza os efeitos nocivos da toxina em modelos de animal, e Hla é particularmente útil para proteger contra a pneumonia.

[0034] Os antígenos de Hla úteis podem extrair um anticorpo (por exemplo, quando administrados a um humano) que reconhece a SEQ ID NO: 5 e/ou pode compreender uma sequência de aminoácidos: (a) tendo 50 % ou mais identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 5; e/ou (b) compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 5, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Estes antígenos de Hla incluem variantes da SEQ ID NO: 5. Os fragmentos preferidos de (b) compreendem um epítopo da SEQ ID NO: 5. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal N da SEQ ID NO: 5 enquanto retêm pelo menos um epítopo da SEQ ID NO: 5. Os primeiros 26 aminoácidos do terminal N da SEQ ID NO: 5 podem ser utilmente omitidos (por exemplo, para dar a SEQ ID NO: 12). A truncagem no terminal C também pode ser usado por exemplo, deixando apenas 50 aminoácidos (resíduos 27 a 76 da SEQ ID NO: 5) [17].

[0035] Particularmente, o antígeno Hla é um antígeno Hla destoxificado, isto é, uma forma mutante de Hla, em que a toxicidade natural do Hla foi removida. A toxicidade do Hla pode ser evitada pela inativação química (por exemplo, usando formaldeído, glutaraldeído ou outros reagentes reticulados). Ao invés, entretanto, é preferido usar formas mutantes de Hla que removem a sua atividade tóxica enquanto retêm a sua imunogenicidade. Mais particularmente, o antígeno de Hla destoxificado é uma forma mutante de Hla, em que a toxicidade de Hla foi removida enquanto que a imunogenicidade de Hla foi retida. Tais mutantes destoxificados já são conhecidos na técnica. Um antígeno de Hla preferido é uma hemolisina de S. aureus mutante tendo uma mutação no resíduo 61 da SEQ ID NO: 5, que é o resíduo 35 do antígeno maduro (isto é, depois de omitir os primeiros 26 aminoácidos do terminal N = resíduo 35 da SEQ ID NO: 12). Assim o resíduo 61 pode não ser histidina, e ao invés pode ser por exemplo, Ile, Val ou preferivelmente Leu. Uma mutação His-Arg nesta posição também pode ser usada. Por exemplo, a SEQ ID NO: 13 é a sequência da forma mutante H35L madura de Hla (isto é, a SEQ ID NO: 12 com uma mutação H35L) e um antígeno de Hla destoxificado útil é da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 13. Uma outra mutação útil substitui uma alça longa com uma sequência curta por exemplo, para substituir o 39mer nos resíduos 136-174 da SEQ ID NO: 5 com um tetrâmero tal como PSGS (SEQ ID NO: 14), como na SEQ ID NO: 15 (que também inclui a mutação H35L) e SEQ ID NO: 16 (que não incluem a mutação H35L). Uma outra mutação útil substitui o resíduo Y101 por exemplo, com uma leucina (SEQ ID NO: 17). Uma outra mutação útil substitui o resíduo D152 por exemplo, com uma leucina (SEQ ID NO: 18). Um outro mutante útil substitui os resíduos H35 e Y101 por exemplo, com uma leucina (SEQ ID NO: 19). Um outro mutante útil substitui os resíduos H35 e D152 por exemplo, com uma leucina (SEQ ID NO: 20).

[0036] Outros antígenos de Hla úteis são descritos nas referências 18 e 19.

[0037] As SEQ ID NOs: 21, 22 & 23 são três fragmentos úteis da SEQ ID NO: 5 (‘Hla27-76’, ‘Hla27-89’ e ‘Hla27-79’, respectivamente). As SEQ ID NOs: 24, 25 & 26 são os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 13.

[0038] Uma sequência de Hla útil é a SEQ ID NO: 27. A mesma tem um Met no terminal N, depois um dipeptídeo Ala-Ser do vetor de expressão, depois a SEQ ID NO: 13 (da cepa NCTC8325) incluindo a mutação H35L.

[0039] Onde uma composição inclui tanto o antígeno de EsxA quanto o EsxB, estes podem estar presentes como um único polipeptídeo (isto é, como um polipeptídeo de fusão compreendendo ou consistindo tanto de EsxA quanto de EsxB). Assim um polipeptídeo único pode extrair anticorpos (por exemplo, quando administrado a um humano) que reconhece tanto a SEQ ID NO: 1 quanto a SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo único pode incluir: (i) uma primeira sequência de polipeptídeo tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 1 e/ou compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 1, como definido acima para EsxA; e (ii) uma segunda sequência de polipeptídeo tendo 50 % ou mais de identidade (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 2 e/ou compreendendo um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 2, como definido acima para EsxB. A primeira e segunda sequências de polipeptídeo podem estar em cada ordem, do terminal N para C. As SEQ ID NOs: 28 (‘EsxAB’) e 29 (‘EsxBA’) são exemplos de tais polipeptídeos, ambos tendo ligantes hexapeptídicos ASGGGS (SEQ ID NO: 30). Um outro híbrido ‘EsxAB’ compreende a SEQ ID NO: 31, que pode ser provida com uma metionina no terminal N (por exemplo, a SEQ ID NO: 32). Uma variante útil de EsxAB carece do resíduo de cisteína interno de EsxB por exemplo, a mesma compreende a SEQ ID NO: 40 em que o resíduo X na posição 132 é ausente ou é um resíduo de aminoácido sem um grupo tiol livre (sob condições redutoras) por exemplo, é qualquer aminoácido natural exceto cisteína. Assim um antígeno de EsxAB preferido para o uso com a invenção tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 38.

[0040] Assim um polipeptídeo útil compreende uma sequência de aminoácidos (a) tendo 80 % ou mais de identidade (por exemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com a SEQ ID NO: 31; e/ou (b) compreendendo tanto um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos dos aminoácidos 1 a 96 da SEQ ID NO: 31 quanto um fragmento de pelo menos ‘n’ aminoácidos consecutivos dos aminoácidos 103 a 205 da SEQ ID NO: 31, em que ‘n’ é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Estes polipeptídeos (por exemplo, SEQ ID NO: 32) podem extrair anticorpos (por exemplo, quando administrados a um humano) que reconhece tanto a proteína estafilocócica do tipo selvagem compreendendo a SEQ ID NO: 1 quanto à proteína estafilocócica do tipo selvagem compreendendo a SEQ ID NO: 2. Assim a resposta imune reconhecerá tanto o antígeno de EsxA quanto o EsxB. Os fragmentos preferidos de (b) proveem um epítopo da SEQ ID NO: 1 e um epítopo da SEQ ID NO: 2.

[0041] A invenção usa 1, 2, 3, 4, ou todos os 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 e Hla (preferivelmente um Hla mutante não tóxico). Como mencionado acima uma composição particularmente útil inclui todos os cinco destes antígenos, mas em algumas modalidades a invenção inclui apenas 1, 2, 3 ou 4 destes cinco antígenos, isto é, 1, 2, 3 ou 4 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla é ausente da composição.

[0042] Uma composição preferida inclui todos os quatro de: (i) um polipeptídeo único incluindo tanto um antígeno de EsxA quanto um antígeno de EsxB por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 31; (ii) um antígeno de FhuD2 por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 6; (iii) um antígeno de Sta011 por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 33; e (iv) uma forma mutante H35L de Hla por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 13.

[0043] Embora as SEQ ID NOs: 31, 6, 33 e 13 sejam sequências de aminoácido úteis em uma combinação, a invenção não é limitada a estas sequências precisas. Assim 1, 2, 3 ou todas as 4 destas sequências podem ser independentemente modificadas em até 5 mudanças de aminoácido únicas (isto é, 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido único) contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que ainda se liguem a um polipeptídeo consistindo em sequência não modificada.

[0044] Uma outra composição útil inclui todos os quatro de: (i) um primeiro polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 32; (ii) um segundo polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7; (iii) um terceiro polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; e (iv) um quarto polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 27.

[0045] Embora as SEQ ID NOs: 32, 7, 8 e 27 sejam sequências de aminoácido úteis em uma combinação, a invenção não é limitada a estas sequências exatas. Assim 1, 2, 3 ou todas as 4 destas quatro sequências podem ser independentemente modificadas por 1, 2, 3, 4 ou 5 mudanças de aminoácido únicas (isto é, 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido único) contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que ainda se liguem a um polipeptídeo consistindo em sequência não modificada. Em uma modalidade preferida, uma composição assim inclui estes quatro polipeptídeos especificados com 1, 2, 3 ou todos os 4 das SEQ ID NOs: 32, 7, 8 e 27 independentemente modificadas por 1 única substituição, deleção e/ou inserção de aminoácido.

[0046] Por exemplo, as sequências de polipeptídeo FhuD2, Sta011 e EsxAB do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NOs: 6, 31 e 33) cada uma inclui um único resíduo de cisteína que pode levar às pontes de dissulfeto inter-polipeptídeo, formando tanto homodímeros quanto heterodímeros. Tais polipeptídeos interligados são indesejáveis e assim as sequências de Sta006, Sta011 e EsxB podem ser modificados para remover seus resíduos de cisteína naturais, tal que eles não contenham grupos tiol livres (sob condições redutoras). A cisteína do tipo selvagem pode ser deletada ou pode ser substituída com um aminoácido diferente.

[0047] Assim: um antígeno de FhuD2 pode compreender a SEQ ID NO: 34; um antígeno de Sta011 pode compreender a SEQ ID NO: 36; e um antígeno de EsxB pode compreender a SEQ ID NO: 35 (por exemplo, como um híbrido de EsxAB compreendendo a SEQ ID NO: 40). Os exemplos de tais sequências incluem, mas não são limitadas às SEQ ID NOs: 37, 39, e 38. Estas sequências podem ser usadas isoladamente como substitutos para as sequências do tipo selvagem correspondentes, ou em combinação. Assim uma composição particularmente útil inclui todos os quatro de: (i) um primeiro polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 38; (ii) um segundo polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 37; (iii) um terceiro polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39; e (iv) um quarto polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 27.

[0048] Assim uma composição preferida da invenção compreende todos os cinco de: (i) um polipeptídeo único incluindo tanto um antígeno de EsxA quanto um antígeno de EsxB por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 31; (ii) um antígeno de FhuD2 por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 6; (iii) um antígeno de Sta011 por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 33; (iv) uma forma mutante H35L de Hla por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 13; e (v) um SpA mutante por exemplo, compreendendo as SEQ ID NOs: 45 ou 47, ou um antígeno compreendendo um domínio únicos dos mesmos por exemplo, SEQ ID NO: 50, 51, 52 ou 53. Assim, em particular a composição de acordo com a invenção compreende: (i) um polipeptídeo único incluindo tanto um antígeno de EsxA quanto um antígeno de EsxB, particularmente da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 31; (ii) um antígeno de FhuD2, particularmente da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 6; (iii) um antígeno de Sta011, particularmente da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 33; (iv) uma forma mutante H35L de Hla, particularmente da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 13; e (v) um antígeno de SpA mutante, particularmente da sequência compreendendo ou consistindo ems SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 52.

[0049] Uma outra composição preferida de acordo com a invenção compreende: (i) um primeiro polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 32, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 32; (ii) um segundo polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 7, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 7; (iii) um terceiro polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 8, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 8; (iv) um quarto polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 27, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 27; e (v) um quinto polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 52, mais particularmente compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 45 modificada em até 3 substituições de aminoácido (por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 47 ou consistindo em SEQ ID NO: 48).

[0050] Uma outra composição preferida de acordo com a invenção compreende: (i) um primeiro polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 38, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 38; (ii) um segundo polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 37, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 37; (iii) um terceiro polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 39, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 39; (iv) um quarto polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 27, mais particularmente consistindo em SEQ ID NO: 27; e (v) um quinto polipeptídeo da sequência compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 52, mais particularmente SEQ ID NO: 45 modificada em até 3 substituições de aminoácido (por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 47 ou consistindo em SEQ ID NO: 48).

[0051] As proteínas (i) a (v) nestas combinações podem, como explicado acima, ser independentemente modificada em até 5 mudanças de aminoácido únicas contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que ainda se liguem a um polipeptídeo consistindo em sequência não modificada. Em algumas modalidades, uma composição pode incluir um ou mais outros polipeptídeos; em outras modalidades os únicos polipeptídeos em uma composição são estes cinco polipeptídeos especificados, e estes polipeptídeos pode ser ainda o único componente imunogênico em uma composição.

[0052] Quando mais do que um polipeptídeo está presente, eles podem estar presentes em massas substancialmente iguais, isto é, a massa de cada um deles está dentro de ± 5 % da massa média de todos os polipeptídeos. Assim, quando cinco polipeptídeos estão presentes, eles podem estar presentes em uma razão em massa de a:b:c:d:e, onde cada um de a-e está entre 0,95 e 1,05.

[0053] Além de EsxA, EsxB, Hla, FhuD2, Sta011, e SpA, outros antígenos de S. aureus existem, e uma composição pode opcionalmente incluir um ou mais outros antígenos de S. aureus. Por exemplo, tanto antígeno de sacarídeo quanto de polipeptídeo são conhecido para S. aureus. Assim uma composição incluiria um antígeno de sacarídeo de S. aureus por exemplo, antígenos de sacarídeo conhecidos incluem o exopolissacarídeo de S. aureus, que é uma poli-N-acetilglicosamina (PNAG), e os sacarídeos capsulares de S. aureus, que podem ser por exemplo, do tipo 5, tipo 8 ou tipo 336. Uma composição também incluiria um antígeno de ClfA, um antígeno de IsdA, um antígeno de IsdB, um antígeno de IsdC, e/ou um antígeno de IsdH (cada um como definido nas páginas 15 a 17 da referência 5).

[0054] Em algumas modalidades, uma composição inclui um antígeno S. aureus como definido acima, e também um antígeno de um organismo diferente (por exemplo, de um vírus ou de uma outra bactéria). Composições e Medicamentos Imunogênicos

[0055] As composições imunogênicas de acordo com a invenção podem ser úteis como vacinas. As vacinas de acordo com a invenção podem ser profiláticas (isto é, para prevenir a infecção) ou terapêutica (isto é, para tratar a infecção), mas tipicamente será profilática.

[0056] As composições assim podem ser farmaceuticamente aceitáveis. Elas usualmente incluirão componentes além dos antígenos por exemplo, elas tipicamente incluirão um ou mais carregadores e/ou excipientes farmacêuticos. Um debate completo de tais componentes está disponível na referência 121.

[0057] As composições geralmente serão administradas a um mamífero na forma aquosa. Antes da administração, entretanto, a composição pode ter estado em uma forma não aquosa. Por exemplo, embora algumas vacinas sejam fabricadas na forma aquosa, depois enchidas e distribuídas e administradas também na forma aquosa, outras vacinas são liofilizadas durante a fabricação e são reconstituídas em uma forma aquosa no momento do uso. Assim uma composição pode ser secada, tal como uma formulação liofilizada. A referência Erro! Indicador não definido. descreve o uso da liofilização com composições imunogênicas de S. aureus.

[0058] Uma composição pode incluir conservantes tais como tiomersal ou 2-fenoxietanol. É preferido, entretanto, que a vacina deva ser substancialmente livre de (isto é, menos do que 5 μg/ml) de material mercúrico por exemplo, livre de tiomersal. As vacinas que não contenha nenhum mercúrio são mais preferidas. As vacinas livres de conservantes são particularmente preferidas.

[0059] Para melhorar a estabilidade térmica, uma composição pode incluir um agente protetivo de temperatura (ver abaixo).

[0060] Para controlar a tonicidade, é preferido incluir um sal fisiológico, tal como um sal de sódio. Cloreto de sódio (NaCl) é preferido, que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml por exemplo, cerca de 10 ± 2 mg/ml de NaCl. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di-idrogeno fosfato de potássio, fosfato de dissódio desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.

[0061] As composições geralmente terão uma osmolalidade dentre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240 e 360 mOsm/kg, e mais preferivelmente cairão dentro da faixa de 290 a 310 mOsm/kg.

[0062] As composições podem incluir um ou mais tampões. Tipicamente os tampões incluem: um tampão de fosfato; um tampão de Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina (particularmente com um adjuvante de hidróxido de alumínio); ou um tampão de citrato. Os tampões tipicamente serão incluídos na faixa de 5 a 20 mM.

[0063] As composições podem incluir um quelador de íon metálico, em particular um quelador de íon de metal bivalente tal como EDTA. A referência Erro! Indicador não definido. descreve que a inclusão de EDTA pode melhorar a estabilidade das composições aqui descritas. A concentração final de EDTA em uma composição imunogênica pode ser cerca de 1 a 50 mM, de cerca de 1 a 10 mM ou de cerca de 1 a 5 mM, preferivelmente de cerca de 2,5 mM.

[0064] O pH de uma composição geralmente estará entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0 por exemplo, 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8.

[0065] A composição é preferivelmente estéril. A composição é preferivelmente não pirogênica por exemplo, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferivelmente <0,1 EU por dose. A composição é preferivelmente isenta de glúten.

[0066] A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (isto é, um kit de ‘multidose’). A inclusão de um conservante é preferida nos arranjos de multidose. Como uma alternativa (ou além disso) para incluir um conservante nas composições de multidose, as composições podem estar contidas em um recipiente tendo um adaptador asséptico para a remoção de material.

[0067] As infecções pelo S. aureus podem afetar várias áreas do corpo e assim uma composição pode ser preparada em várias formas. Por exemplo, uma composição pode ser preparada como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. As formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada ou uma composição seca por pulverização-congelamento). Uma composição pode ser preparada para a administração tópica por exemplo, como um unguento, creme ou pó. Uma composição pode ser preparada para a administração oral por exemplo, como um tablete ou cápsula, como uma pulverização, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). Uma composição pode ser preparada para a administração pulmonar por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou uma pulverização. Uma composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. Uma composição pode ser preparada para a administração nasal, auricular ou ocular por exemplo, como gotas. Uma composição pode estar na forma de kit, planejada tal que uma composição combinada seja reconstituída exatamente antes da administração a um paciente. Tais kits podem compreender um ou mais antígenos na forma líquida e um ou mais antígenos liofilizados.

[0068] Onde uma composição deva ser preparada extemporaneamente antes do uso (por exemplo, onde um componente é apresentado na forma liofilizada) e é apresentada como um kit, o kit pode compreender dois frascos, ou pode compreender uma seringa pré-enchida e um frasco, com os conteúdos da seringa sendo usada para reativar os conteúdos do frasco antes da injeção.

[0069] As vacinas humanas são tipicamente administradas em um volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, embora metade do volume (isto é, cerca de 0,25 ml) também possa ser útil por exemplo, para crianças.

[0070] As composições imunogênicas administradas de acordo com a invenção também podem compreender um ou mais agentes imunorreguladores. Preferivelmente, um ou mais dos agentes imunorreguladores incluem um ou mais adjuvantes (ver abaixo).

[0071] As composições podem extrair tanto uma resposta imune mediada por célula assim como uma resposta imune humoral. Esta resposta imune preferivelmente induzirá anticorpos de longa duração (por exemplo, neutralização) e uma imunidade mediada por célula que pode responder rapidamente na exposição ao S. aureus.

[0072] As composições imunogênicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno(s), assim como qualquer outro dos componentes, como necessário. Por ‘quantidade imunologicamente eficaz’, é intencionado que a administração desta quantidade a um indivíduo, em uma dose única ou como parte de uma série, seja eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, o grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), da capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do doutor tratador da situação médica, e outros fatores relevantes. É esperado que a quantidade cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através dos testes de rotina. Onde mais do que um antígeno é incluído em uma composição então dois antígenos podem estar presentes na mesma dose um do outro ou em doses diferentes.

[0073] Como mencionado acima, uma composição pode incluir um agente protetivo da temperatura, e este componente pode ser particularmente útil em composições adjuvantadas (particularmente aqueles contendo um adjuvante mineral, tal como um sal de alumínio). Como descrito na referência 20, um agente protetivo de temperatura líquida pode ser adicionado a uma composição de vacina aquoso para diminuir o seu ponto de congelamento por exemplo, para reduzir o ponto de congelamento até abaixo de 0 °C. Assim a composição pode ser armazenada abaixo de 0 °C, mas acima do seu ponto de congelamento, para inibir a decomposição térmica. O agente protetivo de temperatura também permite o congelamento da composição enquanto adjuvantes de sal mineral protetor contra aglomeração ou sedimentação depois do congelamento e descongelamento, e também pode proteger a composição em temperaturas elevadas por exemplo, acima de 40 °C. Uma vacina aquosa de partida e o agente protetivo de temperatura de líquido podem ser misturados tal que o agente protetivo de temperatura de líquido forma de 1 a 80 % em volume da mistura final. Os agentes protetivos de temperatura adequados devem ser seguros para a administração humana, facilmente miscível/solúvel em água, e não devem danificar outros componentes (por exemplo, antígeno e adjuvante) na composição. Os exemplos incluem glicerina, propileno glicol, e/ou polietileno glicol (PEG). Os PEGs adequados podem ter um peso molecular médio variando de 200 a 20.000 Da. Em uma modalidade preferida, o polietileno glicol pode ter um peso molecular médio de cerca de 300 Da (‘PEG-300’). Métodos de tratamento, e administração de uma composição imunogênica

[0074] A invenção se refere à composição imunogênica de acordo com a invenção para o uso como um medicamento.

[0075] A invenção também se refere à composição imunogênica de acordo com a invenção para o uso como um medicamento na prevenção e/ou tratamento de uma infecção pelo S. aureus.

[0076] A invenção também provê um método para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção pelo S. aureus em um mamífero compreendendo a etapa de administrar a um mamífero em necessidade do mesmo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica de acordo com a invenção como definida acima. As modalidades vantajosas são como definidas acima.

[0077] A invenção também provê o uso de (i) pelo menos um antígeno selecionado do grupo consistindo em antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla, e (ii) um antígeno de SpA mutante que tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção FCY de IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3, na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar a infecção por S. aureus em um mamífero. As modalidades vantajosas são como definidas acima.

[0078] A invenção também provê (i) pelo menos um antígeno selecionado do grupo consistindo em antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla, e (ii) um antígeno de SpA mutante que tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção FCY de IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3, para o uso na imunização de um mamífero para prevenir ou tratar infecção por S. aureus. As modalidades vantajosas são como definidas acima.

[0079] A invenção também provê (i) pelo menos um antígeno selecionado do grupo consistindo em antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla, e (ii) um antígeno de SpA mutante que tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção Fcy de IgG humana e para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3, para o uso em um método de imunizar um mamífero para prevenir ou tratar infecção de S. aureus pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos antígenos ao mamífero. As modalidades vantajosas são como definidas acima.

[0080] Como mencionado acima, 1, 2, 3, 4 ou preferivelmente todos os 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, e Hla pode ser usado em combinação com a SpA mutante. Desta maneira os métodos, usos, composições e combinações de antígeno da invenção evocam uma resposta imune que é eficaz para prevenir ou tratar infecções por S. aureus. A resposta imune pode envolver anticorpos e/ou imunidade mediada por célula. Incitando-se uma resposta imune no mamífero por estes usos e métodos, o mamífero pode ser protegido contra infecção por S. aureus, incluindo uma infecção nosocomial. Mais particularmente, o mamífero pode ser protegido contra uma infecção de pele, pneumonia, meningite, osteomielite, endocardite, síndrome do choque tóxico, e/ou septicemia. A invenção também é útil para proteger contra infecção por S. aureus de um dos ossos e juntas de mamífero (e assim para prevenir distúrbios incluindo, mas não limitados a, osteomielite, artrite séptica, e infecção de junta protética). Em muitos casos estes distúrbios podem estar associados com a formação de uma biopelícula de S. aureus.

[0081] S. aureus infecta vários mamíferos (incluindo vacas, cães, cavalos e porcos), mas o mamífero preferido para o uso com a invenção é um humano. O humano pode ser uma criança (por exemplo, um bebê ou criança jovem), um adolescente, ou um adulto. Em algumas modalidades o humano pode ter um osso ou junta protéticos, ou pode ser um receptor pretendido de tais próteses (por exemplo, um paciente de cirurgia ortopédica pré- operatória). Uma vacina pretendida para crianças também pode ser administrada aos adultos por exemplo, para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade, etc. As vacinas não são adequadas unicamente para estes grupos, entretanto, e pode ser usado mais geralmente em uma população humana.

[0082] Um modo de checar a eficácia do tratamento terapêutico envolve monitorar infecção por S. aureus depois da administração das composições ou antígenos de acordo com a invenção. Um modo de checar a eficácia do tratamento profilático envolve monitorar respostas imunes, sistemicamente (tal como monitorar o nível de produção de IgG1 e IgG2a) e/ou mucosicamente (tal como monitorar o nível de produção de IgA), contra os antígenos na composição administrada depois da sua administração. Um outro modo de avaliar a imunogenicidade das composições é expressar os antígenos recombinantemente para triar soros ou secreções mucósicas de paciente pela imunomancha e/ou microarranjos. Uma reação positiva entre a proteína e a amostra do paciente indica que o paciente montou uma resposta imune para a proteína em questão.

[0083] A eficácia das composições de vacina também pode ser determinada in vivo pela inoculação de modelos de animal de infecção por S. aureus, por exemplo, porquinhos da Índia ou camundongos, com as composições de vacina. Existem três modelos de animal geralmente úteis para o estudo da doença infecciosa por S. aureus, a saber: (i) o modelo de abscesso de murino [21], (ii) o modelo da infecção letal de murino [21], e (iii) o modelo da pneumonia de murino [22]. O modelo de abscesso estuda abscessos nos rins de camundongo depois da inoculação intravenosa. O modelo da infecção letal estuda o número de camundongos que sobrevivem depois de serem infectados por uma dose normalmente letal de S. aureus pelas vias intravenosa ou intraperitoneal. O modelo da pneumonia também estuda a taxa de sobrevivência, mas usa a infecção intranasal. Outros modelos úteis são descritos na referência 23 para estudar tanto a doença por S. aureus em relação à infecção por implante mediado por biopelícula, infecção da pele e tecido mole (SSTI), e septicemia. Uma vacina útil pode ser eficaz em um ou mais destes modelos. Por exemplo, para algumas situações clínicas pode ser desejável proteger contra pneumonia, sem precisar prevenir a disseminação hemática ou promover a opsonização; em outras situações o desejo principal pode ser prevenir a disseminação hemática ou septicemia. Antígenos diferentes, e combinações diferentes de antígeno, podem contribuir para aspectos diferentes de uma vacina eficaz.

[0084] As composições geralmente serão administradas diretamente a um paciente. A liberação direta pode ser realizada pela injeção parenteral (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscularmente, ou ao espaço intersticial de um tecido), ou mucosicamente, tal como pela administração retal, oral (por exemplo, tablete, pulverização), vaginal, tópica, transdérmica ou transcutânea, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucósica. A injeção intramuscular é a via mais típica para administrar composições de acordo com a invenção.

[0085] A invenção pode ser usada para extrair imunidade sistêmica e/ou mucósica, preferivelmente para extrair uma imunidade sistêmica e/ou mucósica realçada. Preferivelmente a imunidade sistêmica e/ou mucósica realçada é refletida em uma resposta imune TH1 e/ou TH2 realçada. Preferivelmente, a resposta imune realçada inclui um aumento na produção de IgG1 e/ou IgG2a e/ou IgA.

[0086] A dosagem pode ser por um programa de dose única ou um programa de dose múltipla. As doses múltiplas podem ser usadas em um programa de imunização primária e/ou em um programa de imunização de reforço. Em um programa de dose múltipla as várias doses podem ser dadas pelas mesmas ou vias diferentes por exemplo, uma primeira dose parenteral e reforço mucósico, uma primeira dose mucósica e reforço parenteral, etc. as doses múltiplas tipicamente serão administradas pelo menos 1 semana separadamente (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.).

[0087] As composições imunogênicas podem ser administradas aos pacientes substancialmente ao mesmo tempo com (por exemplo, durante a mesma consulta ou visita médica a um profissional de cuidado de saúde ou centro de vacinação) outras vacinas.

[0088] As composições imunogênicas podem ser administradas aos pacientes em combinação com um antibiótico. Por exemplo, elas podem ser administradas substancialmente ao mesmo tempo com um antibiótico. Similarmente, elas podem ser administradas a um indivíduo que está recebendo terapia de antibiótico. Similarmente, elas podem ser administradas como parte de uma coterapia que envolve a administração tanto de uma composição como aqui debatida quanto de um antibiótico. O antibiótico será eficaz contra uma bactéria S. aureus, por exemplo uma beta-lactama.

Cepas e variantes

[0089] Os antígenos são debatidos acima por referência à nomenclatura existente (por exemplo, “EsxA”) e sequências exemplares dadas como números GI e também na listagem de sequência. A invenção não é limitada a estas sequências exatas. As sequências genômicas de várias cepas de S. aureus estão disponíveis, incluindo aquelas das cepas MRSA N315 e Mu50 [24], MW2, N315, COL, MRSA252, MSSA476, RF122, USA300 (muito virulento), JH1, JH9, NCTC 8325, e Newman. A pesquisa padrão e as técnicas de alinhamento podem ser usadas para identificar em qualquer uma destas (ou outras) sequências genômicas adicionais o homólogo de qualquer sequência particular aqui mencionada. Além disso, as sequências específicas aqui descritas podem ser usadas para planejar iniciadores para a amplificação de sequências homólogas de outras cepas. Assim a invenção abrange tais variantes e homólogos de qualquer cepa de S. aureus, assim como variantes não naturais. No geral, variantes adequadas de uma SEQ ID NO particular incluem as suas variantes alélicas, suas formas poliméricas, seus homólogos, seus ortólogos, seus parálogos, seus mutantes, etc.

[0090] Assim, por exemplo, os polipeptídeos usados com a invenção pode, comparado com a SEQ ID NO aqui, incluem uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) substituições de aminoácido, tais como substituições conservativas (isto é, substituições de um aminoácido com um outro que tem uma cadeia lateral relacionada). Os aminoácidos geneticamente codificados são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos isto é, aspartato, glutamato; (2) básicos isto é, lisina, arginina, histidina; (3) não polares isto é, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar não carregado isto é, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são algumas vezes classificados conjuntamente como aminoácidos aromáticos. No geral, a substituição de aminoácidos únicos dentro destas famílias não tem um efeito maior sobre a atividade biológica. Os polipeptídeos também podem incluir um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) deleções de aminoácido único em relação às sequências SEQ ID NO. Os polipeptídeos também podem incluir um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserções (por exemplo, cada um de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) em relação às sequências SEQ ID NO.

[0091] Similarmente, um polipeptídeo usado com a invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos que: (a) é idêntica (isto é, 100 % idêntica) a uma sequência descrita na listagem de sequência; (b) compartilha a identidade de sequência (por exemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) com uma sequência descrita na listagem de sequência (idealmente no comprimento inteiro da dita sequência); (c) tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 (ou mais) alterações de aminoácido único (deleções, inserções, substituições), que podem estar em locais separados ou podem ser contíguos, quando comparado com as sequências de (a) ou (b); ou (d) quando alinhado com uma sequência particular da listagem de sequência usando um algoritmo de alinhamento aos pares, cada janela móvel de x aminoácidos do terminal N para o terminal C (tal que para um alinhamento que se estende a p aminoácidos, onde p>x, existem, p-x+1 tais janelas) tem pelo menos x-y aminoácidos alinhados idênticos, onde: x é selecionado de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y é selecionado de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; e se x-y não é um número inteiro então o mesmo é arredondado até o número inteiro mais próximo. O algoritmo de alinhamento aos pares preferido é o algoritmo de alinhamento global de Needleman- Wunsch [25], usando parâmetros de default (por exemplo, com Penalidade de abertura de intervalo = 10,0, e com Penalidade de extensão de intervalo = 0,5, usando a matriz de contagem EBLOSUM62). Este algoritmo é convenientemente implementado na ferramenta needle no pacote EMBOSS [26].

[0092] Onde polipeptídeos híbridos são usados, os antígenos individuais dentro do híbrido (isto é, as porções -X- individuais) podem ser de uma ou mais cepas. Onde n = 2, por exemplo, X2 pode ser da mesma cepa como X1 ou de uma cepa diferente. Onde n = 3, as cepas seriam (i) X1=X2=X3 (ii) X1=X2/X3 (iii) X1/X2=X3 (iv) X1/X2/X3 ou (v) X1=X3/X2, etc.

[0093] Dentro do grupo (c), as deleções ou substituições podem ser no terminal N e/ou terminal C, ou podem ser entre os dois terminais. Assim uma truncagem é um exemplo de uma deleção. As truncagens podem envolver a deleção de até 40 (ou mais) aminoácidos no terminal N e/ou terminal C. A truncagem do terminal N pode remover peptídeos líder por exemplo, para facilitar a expressão recombinante em um hospedeiro heterólogo. A truncagem do terminal C pode remover sequências âncoras por exemplo, para facilitar a expressão recombinante em um hospedeiro heterólogo.

[0094] No geral, quando um antígeno compreende uma sequência que não é idêntica a uma sequência de S. aureus completa da listagem de sequência (por exemplo, quando a mesma compreende uma listagem de sequência com <100 % de identidade de sequência com ela, ou quando a mesma compreende um fragmento da mesma) é preferido em cada caso individual que o antígeno possa extrair um anticorpo que reconhece a respectiva sequência de S. aureus completa. Polipeptídeos usados com a invenção

[0095] Os polipeptídeos usados com a invenção podem tomar várias formas (por exemplo, nativa, fusões, glicosilada, não glicosilada, lipidada, não lipidada, fosforilada, não fosforilada, miristoilada, não miristoilada, monomérica, multimérica, etc.).

[0096] Os polipeptídeos usados com a invenção podem ser preparados por vários meios (por exemplo, expressão recombinante, purificação da cultura de célula, síntese química, etc.). As proteínas que expressam recombinantemente são preferidas, particularmente para polipeptídeos híbridos.

[0097] Os polipeptídeos usados com a invenção são preferivelmente providos na forma purificada ou substancialmente purificada isto é, substancialmente livre de outros polipeptídeos (por exemplo, livre de polipeptídeos que ocorrem naturalmente), particularmente de outros estafilocócicos ou polipeptídeos de célula hospedeira, e são geralmente pelo menos de cerca de 50 % puro (em peso), e usualmente pelo menos cerca de 90 % puro isto é, menos do que cerca de 50 %, e mais preferivelmente menos do que cerca de 10 % (por exemplo, 5 %) de uma composição é composta de outros polipeptídeos expressos. Assim os antígenos nas composições são separados do organismo inteiro com o qual a molécula é expressa.

[0098] O termo “polipeptídeo” se refere a polímeros de aminoácido de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, o mesmo pode compreender aminoácidos modificados, e o mesmo pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou pela intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotulação. Também são incluídos, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica. Os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.

[0099] Embora a expressão dos polipeptídeos da invenção possa ocorrer em um Staphylococcus, a invenção usualmente usará um hospedeiro heterólogo para a expressão (expressão recombinante). O hospedeiro heterólogo pode ser procariótico (por exemplo, uma bactéria) ou eucariótico. A mesma pode ser E. coli, mas outros hospedeiros adequados incluem Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por exemplo, M. tuberculosis), leveduras, etc. Comparados com os polipeptídeos que codificam os genes da S. aureus do tipo selvagem da invenção, é útil trocar códons para otimizar a eficiência de expressão em tais hospedeiros sem afetar os aminoácidos codificados.

Adjuvantes

[00100] Como mencionado acima, as composições imunogênicas usadas de acordo com a invenção podem incluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes que podem ser usados com a invenção incluem, mas não são limitados a:

A. Composições contendo mineral

[00101] As composições contendo mineral adequadas para o uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tais como sais de alumínio e sais de cálcio (ou misturas dos mesmos). Os sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas “CAP” descritas na ref. 27). Os sais de alumínio incluem hidróxidos e fosfatos etc., com os sais tomando qualquer forma adequada (por exemplo, de gel, cristalina, amorfa, etc.). A adsorção para estes sais é preferida (por exemplo, todos os antígenos podem ser adsorvidos). As composições contendo mineral também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico [28].

[00102] Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Estes nomes são convencionais, mas são usados apenas por conveniência, visto que nenhum é uma descrição precisa do composto químico real que está presente (por exemplo, ver o capítulo 9 da referência 29). A invenção pode usar qualquer um dos adjuvantes de “hidróxido” ou “fosfato” que são no geral usados como adjuvantes. Os adjuvantes conhecidos como “hidróxido de alumínio” são tipicamente sais de oxiidróxido de alumínio, que são usualmente pelo menos parcialmente cristalinos. Os adjuvantes conhecidos como “fosfato de alumínio” são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, frequentemente também contendo uma quantidade pequena de sulfato (isto é, hidroxifosfato sulfato de alumínio). Eles podem ser obtidos pela precipitação, e as condições de reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato para hidroxila no sal.

[00103] Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como observada nas micrografias eletrônicas de transmissão) é típica para os adjuvantes de hidróxido de alumínio. O pI dos adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente de cerca de 11 isto é, o próprio adjuvante tem uma carga de superfície positiva no pH fisiológico. As capacidades adsortivas dentre 1,8 e 2,6 mg de proteína por mg de Al+++ no pH 7,4 foram relatadas para os adjuvantes de hidróxido de alumínio.

[00104] Os adjuvantes de fosfato de alumínio geralmente têm uma razão molar PO4/Al entre 0,3 e 1,2, preferivelmente entre 0,8 e 1,2, e mais preferivelmente 0,95 ± 0,1. O fosfato de alumínio geralmente será amorfa, particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com razão molar PO4/Al entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6 mg de Al3+/ml. O fosfato de alumínio geralmente será particulado (por exemplo, morfologia como placa como observado nas micrografias eletrônicas de transmissão). Os diâmetros típicos das partículas estão na faixa de 0,5 a 20 μm (por exemplo, de cerca de 5 a 10 μm) depois de qualquer adsorção de antígeno. As capacidades adsortivas dentre 0,7 e 1,5 mg de proteína por mg de Al+++ no pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio.

[00105] O ponto de carga zero (PZC) de fosfato de alumínio está inversamente relacionado com o grau de substituição de fosfato no lugar da hidroxila, e este grau de substituição pode variar dependendo das condições de reação e concentração dos reagentes usados para preparar o sal pela precipitação. PZC também é alterado mudando-se a concentração de íons fosfato livres em solução (mais fosfato = mais PZC ácido) ou pela adição de um tampão tal como um tampão de histidina (torna PZC mais básico). Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção geralmente terão um PZC dentre 4,0 e 7,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 6,5 por exemplo, de cerca de 5,7.

[00106] As suspensões de sais de alumínio usados para preparar as composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um fosfato ou uma histidina ou um tampão de Tris), mas isto não é sempre necessário. As suspensões são preferivelmente estéreis e isentas de pirógeno. Uma suspensão pode incluir íons fosfato aquosos livres por exemplo, presentes em uma concentração entre 1,0 e 20 mM, preferivelmente entre 5 e 15 mM, e mais preferivelmente de cerca de 10 mM. As suspensões também podem compreender cloreto de sódio.

[00107] A invenção pode usar uma mistura tanto de um hidróxido de alumínio quanto de um fosfato de alumínio. Neste caso pode haver mais fosfato de alumínio do que hidróxido por exemplo, uma razão em peso de pelo menos 2:1 por exemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

[00108] A concentração de Al+++ em uma composição para a administração a um paciente é preferivelmente menor do que 10 mg/ml por exemplo, < 5 mg/ml, < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml, etc. Uma faixa preferida está entre 0,3 e 1 mg/ml. Um máximo de 0,85 mg/dose é preferido.

B. Emulsões de óleo em água

[00109] As composições de emulsão de óleo em água adequadas para o uso como adjuvantes na invenção incluem emulsões de esqualeno em água, tal como MF59 (ver o Capítulo 10 da ref. 29; ver também a ref. 30) e AS03 [31].

[00110] Vários adjuvantes de emulsão de óleo em água são conhecidos, e eles tipicamente incluem pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com o(s) óleo(s) e tensoativo(s) sendo biodegradável(is) (metabolizável(is)) e biocompatível(is). A emulsão incluirá gotículas oleosas submícron, e emulsões com gotículas tendo um diâmetro menor do que 220 nm são preferidas visto que elas podem ser submetidas à esterilização em filtro.

[00111] A emulsão compreende um ou mais óleos. O(s) óleo(s) adequado(s) incluem aqueles, por exemplo, de um animal (tal como peixe) ou uma fonte vegetal. O óleo é idealmente biodegradável (metabolizável) e biocompatível. As fontes para os óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e azeite de oliva, os mais habitualmente disponíveis, exemplificam os óleos de nozes. Óleo de jojoba pode ser usado por exemplo, obtido do feijão de jojoba. Os óleos de semente incluem óleo de açafroa, óleo da semente de algodão, óleo da semente de girassol, óleo de semente de gergelim e os semelhantes. No grupo dos grãos, óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos cereais tais como trigo, aveias, centeio, arroz, teff, triticale e os semelhantes também podem ser usados. Os ésteres de ácido graxo 6-10 carbonos de glicerol e 1,2-propanodiol, embora não ocorram naturalmente nos óleos de semente, podem ser preparados pela hidrólise, separação e esterificação dos materiais apropriados partindo dos óleos de nozes e sementes. As gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e assim podem ser usados. Os procedimentos para a separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para a obtenção de óleos puros de fontes animais são bem conhecidos na técnica.

[00112] A maioria dos peixes contêm óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia tal como espermacete exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser aqui usados. Vários óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são geralmente aludidos como terpenoides. As emulsões preferidas compreendem esqualeno, um óleo de fígado de tubarão que é um terpenoide ramificado, insaturado. Esqualano, o análogo saturado para esqualeno, também pode ser usado. Os óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, são facilmente disponíveis de fontes comerciais ou podem ser obtidos pelos métodos conhecidos na técnica.

[00113] Outros óleos úteis são os tocoferóis, particularmente em combinação com esqualeno. Onde a fase oleosa de uma emulsão inclui um tocoferol, qualquer um dos tocoferois α, β, y, δ, ε ou £ pode ser usado, mas os a-tocoferóis são preferidos. D-α-tocoferol e DL-α-tocoferol ambos podem ser usados. Um α-tocoferol preferido é o DL-α-tocoferol. Uma combinação oleosa compreendendo esqualeno e um tocoferol (por exemplo, DL-α- tocoferol) pode ser usada.

[00114] O óleo na emulsão pode compreender uma combinação de óleos por exemplo, esqualeno e pelo menos um outro óleo.

[00115] O componente aquoso da emulsão pode ser água comum (por exemplo, w.f.i.) ou pode incluir outros componentes por exemplo, solutos. Por exemplo, o mesmo pode incluir sais para formar um tampão por exemplo, sais de citrato ou fosfato, tais como sais de sódio. Os tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão de Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Uma fase aquosa tamponada é preferida, e tampões tipicamente serão incluídos na faixa de 5 a 20 mM.

[00116] Além do óleo e lipídeo catiônico, uma emulsão pode incluir um tensoativo não iônico e/ou um tensoativo zuiteriônico. Tais tensoativos incluem, mas não são limitados a: os tensoativos de éteres de polioxietileno sorbitano (habitualmente aludidos como os Tweens), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), e/ou óxido de butileno (BO), vendidos sob a marca DOWFAX®, tais como copolímeros de bloco EO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etóxi de repetição (oxi-1,2-etanodiíla), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de interesse particular; (octilfenóxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídeos tais como fosfatidilcolina (lecitina); éteres graxos de polioxietileno derivados de álcoois laurílicos, cetílicos, estearílicos e oleílicos (conhecidos como tensoativos Brij), tais como éter monolaurílico de trietileno glicol (Brij 30); éter polioxietileno-9-laurílico; e ésteres de sorbitano (habitualmente conhecidos como os Spans), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Os tensoativos preferidos para incluir na emulsão são polissorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.

[00117] As misturas de tensoativos podem ser usadas por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85, ou misturas de Tween 80/Triton-X100. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano tal como monooleato polioxietileno sorbitano (Tween 80) e um octoxinol tal como t-octilfenóxi- polietoxietanol (Triton X-100) também é adequada. Uma outra combinação útil compreende lauret 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol. As misturas úteis podem compreender um tensoativo com um valor HLB na faixa de 10 a 20 (por exemplo, polissorbato 80, com um HLB de 15,0) e um tensoativo com um valor de HLB na faixa de 1 a 10 (por exemplo, trioleato de sorbitano, com um HLB de 1,8).

[00118] As quantidades preferidas de óleo (% em volume) na emulsão final estão entre 2 e 20 % por exemplo, 5 a 15 %, 6 a 14 %, 7 a 13 %, 8 a 12 %. Um teor de esqualeno de cerca de 4 a 6 % ou cerca de 9 a 11 % é particularmente útil.

[00119] As quantidades preferidas de tensoativos (% em peso) na emulsão final estão entre 0,001 % e 8 %. Por exemplo: ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como polissorbato 80) de 0,2 a 4 %, em particular entre 0,4 e 0,6 %, entre 0,45 e 0,55 %, de cerca de 0,5 % ou entre 1,5 e 2 %, entre 1,8 e 2,2 %, entre 1,9 e 2,1 %, de cerca de 2 %, ou 0,85 a 0,95 %, ou de cerca de 1 %; ésteres de sorbitano (tais como trioleato de sorbitano) de 0,02 a 2 %, em particular de cerca de 0,5 % ou cerca de 1 %; octil- ou nonilfenóxi polioxietanóis (tais como Triton X-100) de 0,001 a 0,1 %, em particular de 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tais como lauret 9) de 0,1 a 8 %, preferivelmente de 0,1 a 10 % e em particular de 0,1 a 1 % ou de cerca de 0,5 %.

[00120] As quantidades absolutas de óleo e tensoativo, e sua razão, podem ser variadas dentro de limites amplos enquanto ainda formando uma emulsão. Uma pessoa habilitada pode facilmente variar as proporções relativas dos componentes para se obter uma emulsão desejada, mas uma razão em peso dentre 4:1 e 5:1 para óleo e tensoativo é típica (óleo em excesso).

[00121] Um parâmetro importante para garantir a atividade imunoestimulatória de uma emulsão, particularmente em animais grandes, é o tamanho (diâmetro) da gotícula do óleo. As emulsões mais eficazes têm um tamanho de gotícula na faixa do submícron. Adequadamente os tamanhos de gotícula estarão na faixa de 50 a 750 nm. Mais utilmente o tamanho médio da gotícula é menor do que 250 nm por exemplo, menor do que 200 nm, menor do que 150 nm. O tamanho médio da gotícula está utilmente na faixa de 80 a 180 nm. Idealmente, pelo menos 80 % (em número) das gotículas de óleo da emulsão são menores do que 250 nm no diâmetro, e preferivelmente pelo menos 90 %. Estes tamanhos de gotícula podem ser convenientemente obtidos pelas técnicas tais como microfluidização. Os aparelhos para determinar o tamanho médio da gotícula em uma emulsão, e a distribuição de tamanho, são comercialmente disponíveis. Estes tipicamente usam as técnicas da dispersão de luz dinâmica e/ou sensoriamento óptico de partícula única por exemplo, as séries Accusizer® e Nicomp® de instrumentos disponíveis dos Sistemas de Classificação da Partícula por Tamanho (Santa Barbara, USA), ou os instrumentos Zetasizer® da Malvern Instruments (UK), ou os instrumentos Analisadores da Distribuição do Tamanho da Partícula da Horiba (Kyoto, Japão).

[00122] Idealmente, a distribuição dos tamanhos de gotícula (em número) tem apenas um máximo, isto é, existe uma população única de gotículas distribuídas em torno de uma média (modo), ao invés de ter duas máximas. As emulsões preferidas têm uma polidispersividade de <0,4 por exemplo, 0,3, 0,2, ou menos.

[00123] Os adjuvantes de emulsão de óleo em água específicos úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a: • Uma emulsão submícron de esqualeno, Tween 80, e Span 85. A composição da emulsão em volume pode ser de cerca de 5 % de esqualeno, cerca de 0,5 % de polissorbato 80 e cerca de 0,5 % de Span 85. Em termos de peso, estas razões tornam-se 4,3 % de esqualeno, 0,5 % de polissorbato 80 e 0,48 % de Span 85. Este adjuvante é conhecido como ‘MF59’ [32-34], como descrito em mais detalhes no Capítulo 10 da ref. 35 e capítulo 12 da ref. 36. A emulsão MF59 vantajosamente inclui íons citrato por exemplo, tampão de citrato de sódio a 10 mM. • Uma emulsão compreendendo esqualeno, um tocoferol, e polissorbato 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato. Estas emulsões podem ter em volume de 2 a 10 % de esqualeno, de 2 a 10 % de tocoferol e de 0,3 a 3 % de polissorbato 80, e a razão em peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente <1 (por exemplo, 0,90) visto que isto pode prover uma emulsão mais estável. Esqualeno e polissorbato 80 pode estar presente na razão em volume de cerca de 5:2 ou em uma razão em peso de cerca de 11:5. Assim os três componentes (esqualeno, tocoferol, polissorbato 80) podem estar presentes em uma razão em peso de 1068:1186:485 ou em torno de 55:61:25. Uma tal emulsão (‘AS03’) pode ser fabricada dissolvendo-se Tween 80 em PBS para dar uma solução a 2 %, depois misturando 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL α tocoferol e 5 ml de esqualeno), depois microfluidizando a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo submícron por exemplo, com um diâmetro médio dentre 100 e 250 nm, preferivelmente de cerca de 180 nm. A emulsão também pode incluir um monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado (3d MPL). Uma outra emulsão útil deste tipo pode compreender, por dose humana, de 0,5 a 10 mg de esqualeno, de 0,5 a 11 mg de tocoferol, e de 0,1 a 4 mg de polissorbato 80 [37] por exemplo, nas razões debatidas acima. Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A emulsão pode conter um tampão de fosfato. Uma emulsão compreendendo um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente de Triton (por exemplo, Triton X100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de α-tocoferol). A emulsão pode incluir estes três componentes em uma razão em massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 μg/ml de polissorbato 80, 110 μg/ml de Triton X-100 e 100 μg/ml de succinato de α-tocoferol), e estas concentrações devem incluir qualquer contribuição destes componentes dos antígenos. A emulsão também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A fase aquosa pode conter um tampão de fosfato. Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e poloxâmero 401 (“Pluronic® L121”). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veículo de liberação útil para dipeptídeos de muramila, e foi usada com treonil-MDP no adjuvante “SAF-1” [38] (0,05 a 1 % de Thr-MDP, 5 % de esqualano, 2,5 % de Pluronic L121 e 0,2 % de polissorbato 80). A mesma também pode ser usada sem o Thr-MDP, como no adjuvante “AF” [39] (5 % de esqualano, 1,25 % de Pluronic L121 e 0,2 % de polissorbato 80). A microfluidização é preferida. Uma emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um tensoativo não iônico hidrofílico de éter de polioxietileno alquila (por exemplo, éter polioxietileno (12) cetoestearílico) e um tensoativo não iônico hidrofóbico (por exemplo, um éster de sorbitano ou éster de maneto, tal como monoleato de sorbitano ou ‘Span 80’). A emulsão é preferivelmente termorreversível e/ou tem pelo menos 90 % das gotículas de óleo (em volume) com um tamanho menor do que 200 nm [40]. A emulsão também pode incluir um ou mais de: alditol; um agente crioprotetivo (por exemplo, um açúcar, tal como dodecilmaltosídeo e/ou sacarose); e/ou um alquilpoliglicosídeo. A emulsão pode incluir um agonista de TLR4 [41]. Tais emulsões podem ser liofilizadas. Uma emulsão de esqualeno, poloxâmero 105 e Abil-Care [42]. A concentração final (peso) destes componentes nas vacinas adjuvantadas são 5 % de esqualeno, 4 % de poloxâmero 105 (pluronic poliol) e 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicerídeo caprílico/cáprico). Uma emulsão tendo de 0,5 a 50 % de um óleo, 0,1 a 10 % de um fosfolipídeo, e 0,05 a 5 % de um tensoativo não iônico. Como descrito na referência 43, os componentes de fosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Os tamanhos de gotícula submícrons são vantajosos. • Uma emulsão de óleo em água submícron de um óleo não metabolizável (tal como óleo mineral leve) e pelo menos um tensoativo (tal como lecitina, Tween 80 ou Span 80). Aditivos podem ser incluídos, tais como QuilA saponina, colesterol, um conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito na referência 44, produzido pela adição de amina alifática à desacilsaponina por intermédio do grupo carboxila do ácido glicurônico), brometo de dimetildioctadecilamônio e/ou N,N- dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina. • Uma emulsão em que uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados como micelas helicoidais [45]. • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool graxo etoxilado lipofílico não iônico, e um tensoativo hidrofílico não iônico (por exemplo, um álcool graxo etoxilado e/ou copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno) [46]. • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool graxo etoxilado hidrofílico não iônico, e um tensoativo lipofílico não iônico (por exemplo, um álcool graxo etoxilado e/ou copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno) [46].

[00124] Em algumas modalidades uma emulsão pode ser misturada com antígeno(s) extemporaneamente, no momento da liberação, e assim o adjuvante e antígeno(s) podem ser mantidos separadamente em uma vacina embalada ou distribuída, prontos para a formulação final no momento do uso. Em outras modalidades uma emulsão é misturada com antígeno durante a fabricação, e assim a composição é embalada em uma forma líquida adjuvantada. O antígeno geralmente estará em uma forma aquosa, tal que a vacina seja finalmente preparada pela mistura dos dois líquidos. A razão em volume dos dois líquidos para mistura pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5) mas é geralmente de cerca de 1:1. Onde as concentrações de componentes são dadas nas descrições acima de emulsões específicas, estas concentrações são tipicamente para uma composição não diluída, e a concentração depois da mistura com uma solução de antígeno assim diminuirá.

C. Formulações com Saponina [capítulo 22 da ref. Erro! Indicador não definido.]

[00125] As formulações de saponina também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. As saponinas são um grupo heterogêneo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenoide que são encontrados na casca, folhas, hastes, raízes e mesmo flores de uma ampla faixa de espécies vegetais. A saponina da casca da árvore Quillaia saponaria Molina foi amplamente estudada como adjuvante. A saponina também pode ser comercialmente obtida da Smilax ornata (salsaparrilha), Gypsophilla paniculata (véu de noiva), e Saponaria officianalis (raiz sabão). As formulações adjuvantes de saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, assim como formulações lipídicas, tais como ISCOMs. QS21 é comercializada como Stimulon®.

[00126] As composições de saponina foram purificadas usando HPLC e RP-HPLC. As frações específicas purificadas usando estas técnicas foram identificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é descrito na ref. 47. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, tal como colesterol [48].

[00127] Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas chamadas de ISCOMs (capítulo 23 da ref. 29). ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferivelmente, a ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA & QHC. ISCOMs são descritas ainda nas refs. 48-50. Opcionalmente, as ISCOMS podem ser destituídas de detergente adicional [51].

[00128] Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes com base em saponina pode ser encontrada nas refs. 52 & 53.

D. Derivados bacterianos ou microbianos

[00129] Adjuvantes adequados para o uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos tais como derivados não tóxicos de lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS), derivados de Lipídeo A, oligonucleotídeos imunoestimuladores e toxinas que ribozilam ADP e derivados destoxificados dos mesmos.

[00130] Os derivados não tóxicos de LPS incluem monofosforil lipídeo A (MPL) e MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma de “partícula pequena” preferida de monofosforil lipídeo A 3-Des-O- acilado é descrita na ref. 54. Tais “partículas pequenas” de 3dMPL são pequenas o bastante para serem filtradas estéreis através de uma membrana de 0,22 μm [54]. Outros derivados de LPS não tóxicos incluem imitações de monofosforil lipídeo A, tais como derivados de fosfato de aminoalquil glicosaminida por exemplo, RC-529 (ver abaixo).

[00131] Os derivados de Lipídeo A incluem derivados de lipídeo A de Escherichia coli tais como OM-174. OM-174 é descrito por exemplo, nas refs. 55 & 56.

[00132] Os oligonucleotídeos imunoestimuladores adequados para o uso como adjuvantes na invenção incluem sequências de nucleotídeo contendo um motivo CpG (uma sequência de dinucleotídeo contendo uma citosina não metilada ligada por uma ligação de fosfato a uma guanosina). Os RNAs de filamento duplo e oligonucleotídeos contendo sequências palindrômicas ou poli(dG) também foram mostradas ser imunoestimuladoras.

[00133] Os CpG’s podem incluir modificações/análogos de nucleotídeo tais como modificações de fosforotioato e podem ser de filamento duplo ou de filamento único. As referências 57, 58 e 59 descrevem substituições análogas possíveis por exemplo, a substituição de guanosina com 2’-desóxi-7-desazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG é debatido ainda nas refs. 60-65.

[00134] A sequência pode ser direcionada para TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [66]. A sequência de CpG pode ser específica para induzir uma resposta imune Th1, tal como um CpG-A ODN, ou pode ser mais específica para induzir uma resposta de célula B, tal como um CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são debatidos nas refs. 67-69. Preferivelmente, o CpG é um CpG-A ODN.

[00135] Preferivelmente, o oligonucleotídeo de CpG é construído de modo que a extremidade 5’ seja acessível para o reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleotídeo CpG podem ser ligadas nas suas extremidades 3’ para formar “imunômeros”. Ver, por exemplo, refs. 66 & 70-72.

[00136] Um adjuvante de CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune® (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Um outro é CpG1826. Como uma alternativa, ou além disso, ao uso de sequências CpG, sequências TpG podem ser usadas [73], e estes oligonucleotídeos podem ser livres de motivos CpG não metilados. O oligonucleotídeo imunoestimulador pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, o mesmo pode compreender mais do que um nucleotídeo de timidina consecutivo (por exemplo, TTTT, como descrito na ref. 73), e/ou o mesmo pode ter uma composição de nucleotídeo com >25 % de timidina (por exemplo, >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Por exemplo, o mesmo pode compreender mais do que um nucleotídeo de citosina consecutivo (por exemplo, CCCC, como descrito na ref. 73), e/ou o mesmo pode ter uma composição de nucleotídeo com >25 % de citosina (por exemplo, >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Estes oligonucleotídeos podem ser livres de motivos CpG não metilados. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores tipicamente compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Eles podem compreender menos do que 100 nucleotídeos.

[00137] Um adjuvante particularmente útil com base em oligonucleotídeos imunoestimuladores é conhecido como IC-31® [74]. Assim um adjuvante usado com a invenção pode compreender uma mistura de (i) um oligonucleotídeo (por exemplo, entre 15 a 40 nucleotídeos) incluindo pelo menos um (e preferivelmente múltiplos) motivos CpI (isto é, uma citosina ligada a uma inosina para formar um dinucleotídeo), e (ii) um polímero policatiônico, tal como um oligopeptídeo (por exemplo, entre 5 e 20 aminoácidos) incluindo pelo menos uma (e preferivelmente múltiplas) sequência de tripeptídeo Lys-Arg-Lys. O oligonucleotídeo pode ser um desoxinucleotídeo compreendendo sequência 26-mer 5’-(IC)13-3’ (SEQ ID NO: 41). O polímero policatiônico pode ser um peptídeo compreendendo sequência de aminoácidos 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 42). O oligonucleotídeo e polímero podem formar complexos por exemplo, como descritos nas referências 75 & 76.

[00138] As toxinas de Ribosilação de ADP bacterianas e derivados destoxificados das mesmas podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Preferivelmente, a proteína é derivada da E. coli (enterotoxina “LT” instável ao calor da E. coli), cólera (“CT”), ou coqueluche (“PT”). O uso de toxinas de Ribosilação de ADP destoxificadas como adjuvantes mucósicos está descrita na ref. 77 e como adjuvantes precursores na ref. 78. A toxina ou toxóide estão preferivelmente na forma de uma holotoxina, compreendendo tanto subunidades A quanto B. Preferivelmente, a subunidade A contém uma mutação de destoxificação; preferivelmente a subunidade B não é mutada. Preferivelmente, o adjuvante é um mutante LT destoxificado tal como LT- K63, LT-R72, e LT-G192. O uso de toxinas que ribosilam ADP e derivados destoxificados das mesmas, particularmente LT-K63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrado nas refs. 79-86. Um mutante CT útil é ou CT- E29H [87]. A referência numérica para as substituições de aminoácido é preferivelmente fundamentada nos alinhamentos das subunidades A e B de toxinas de ribosilação de ADP apresentadas na ref. 88, especificamente aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

E. Agonistas de TLR

[00139] As composições podem incluir um agonista de TLR isto é, um composto que pode agonizar um receptor semelhante a Toll. Mais preferivelmente, um agonista de TLR é um agonista de um TLR humano. O agonista de TLR pode ativar qualquer um de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 ou TLR11; preferivelmente o mesmo pode ativar TLR4 humano ou TLR7 humano.

[00140] A atividade agonista de um composto contra qualquer receptor semelhante a Toll particular pode ser determinada pelos ensaios padrão. Companhias tais como a Imgenex e Invivogen proveem linhagens de célula que são estavelmente cotransfectadas com genes de TLR humano e NFKB, mais genes repórter adequados, para medir os caminhos da ativação de TLR. Eles são planejados para sensibilidade, dinâmicas de faixa de trabalho amplas e podem ser usados para a triagem de alto rendimento. A expressão constitutiva de um ou dois TLRs específicos é típico em tais linhagens de célula. Ver também a referência 89. Muitos agonistas de TLR são conhecidos na técnica por exemplo, a referência 90 descreve certas moléculas de lipopeptídeo que são agonistas de TLR2, as referências 91 a 94 cada uma descreve classes de agonistas de molécula pequena de TLR7, e as referências 95 & 96 descrevem agonistas de TLR7 e TLR8 para o tratamento de doenças.

[00141] Um agonista de TLR usado com a invenção idealmente inclui pelo menos uma porção adsorptiva. A inclusão de tais porções nos agonistas de TLR permite que eles adsorvam sais de alumínio insolúveis (por exemplo, pela troca de ligando ou qualquer outro mecanismo adequado) e melhora o seu comportamento imunológico [97]. As porções adsorptivas contendo fósforo são particularmente úteis, e assim uma porção adsorptiva pode compreender um fosfato, um fosfonato, um fosfinato, um fosfonito, um fosfinito, etc. Preferivelmente o agonista de TLR inclui pelo menos um grupo fosfonato.

[00142] Assim, em modalidades preferidas, uma composição inclui um agonista de TLR (mais preferivelmente um agonista de TLR7) que inclui um grupo fosfonato. Este grupo fosfonato pode permitir a adsorção do agonista a um sal de alumínio insolúvel [97].

[00143] Agonistas de TLR úteis com a invenção podem incluir uma única porção adsorptiva, ou podem incluir mais do que um por exemplo, entre 2 e 15 porções adsorptivas. Tipicamente um composto incluirá 1, 2 ou 3 porções adsorptivas.

[00144] Os agonistas de TLR contendo fósforo útil podem ser representados pela fórmula (A1): em que: RX e RY são independentemente selecionados de H e alquila C1-C6; X é selecionado de uma ligação covalente, O e NH; Y é selecionado de uma ligação covalente, O, C(O), S e NH; L é um ligante por exemplo, selecionado de, alquileno C1-C6, alquenileno C1-C6, arileno, heteroarileno, alquileno C1-C6 óxi e - ((CH2)pO)q(CH2)p- cada um opcionalmente substituído com 1 a 4 substituintes independentemente selecionados de halo, OH, alquila C1-C4, -OP(O)(OH)2 e - P(O)(OH)2; cada p é independentemente selecionado de 1, 2, 3, 4, 5 e 6; q é selecionado de 1, 2, 3 e 4; n é selecionado de 1, 2 e 3; e A é uma porção agonista de TLR.

[00145] Em uma modalidade, o agonista de TLR de acordo com a fórmula (A1) é como segue: RX e RY são H; X é O; L é selecionado de alquileno C1-C6 e -((CH2)pO)q(CH2)p- cada um opcionalmente substituído com 1 a 2 átomos de halógeno; p é selecionado de 1, 2 e 3; q é selecionado de 1 e 2; e n é 1. Assim nestas modalidades a porção adsorptiva compreende um grupo fosfato.

[00146] Outros agonistas de TLR útil da fórmula (A1) são descritos nas páginas 6 a 13 da referência 98.

[00147] As composições podem incluir um composto de imidazo- quinolona, tal como Imiquimod (“R-837”) [99,100], Resiquimod (“R-848”) [101], e seus análogos; e sais dos mesmos (por exemplo, os sais de cloridreto). Outros detalhes a respeito das imidazoquinolinas imunoestimuladoras podem ser encontrados nas referências 102 a 106.

[00148] As composições podem incluir um agonista de TLR4, e mais preferivelmente um agonista de TLR4 humano. O TLR4 é expresso pelas células do sistema imune inato, incluindo células dendríticas convencionais e macrófagos [107]. A deflagração por intermédio de TLR4 induz uma cascata de sinalização que utiliza os caminhos dependentes tanto de MyD88 quanto de TRIF, levando à ativação de NF-KB e IRF3/7, respectivamente. A ativação de TLR4 tipicamente induz a produção de IL-12p70 robusta e fortemente realça respostas imunes tanto celulares quanto humorais.

[00149] Vários agonistas de TLR4 úteis são conhecidos na técnica, muitos dos quais são análogos de endotoxina ou lipopolissacarídeo (LPS). Por exemplo, o agonista de TLR4 pode ser: 3d-MPL (isto é, monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado; presente no adjuvante ‘AS04’ de GSK, com mais detalhes nas referências 108 a 111, glicopiranosil lipídeo A (GLA) [112] ou seu sal de amônio; um fosfato de aminoalquil glicosaminida, tal como RC-529 ou CRX- 524 [113-115]; E5564 [116,117]; ou um composto da fórmula I, II ou III como definido na referência 118, ou um sal dos mesmos, tais como compostos ‘ER 803058’, ‘ER 803732’, ‘ER 804053’, ‘ER 804058’, ‘ER 804059’, ‘ER 804442’, ‘ER 804680’, ‘ER 803022’, ‘ER 804764’ ou ‘ER 804057’ (também conhecido como E6020).

[00150] A invenção é particularmente útil quando do uso dos agonistas de TLR7 humano, tais como um composto da fórmula (K). Estes agonistas são debatidos em detalhes na referência 119: em que: R 1 5 15 16 25 26 é H, alquila C1-C6, -C(R )2OH, -L R , -L R , -L R , -L R , - OL2R5, ou -OL2R6; L1 é -C(O)- ou -O-; L2 é alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6, arileno, heteroarileno ou -((CR4R4)pO)q(CH2)p-, em que o alquileno C1-C6 e alquenileno C2-C6 de L2 são opcionalmente substituídos com 1 a 4 grupos flúor; cada L3 é independentemente selecionado de alquileno C1-C6 e -((CR4R4)pO)q(CH2)p-, em que o alquileno C1-C6 de L3 é opcionalmente substituído com 1 a 4 grupos flúor; L4 é arileno ou heteroarileno; R2 é H ou alquila C1-C6; R 3 35 15 37 é selecionado de aiquiia C1-C4, —L R , -L R , -L R , - 3437 345 3435 35 37 347 3437 L L L R , -L L R , -L L L R , -OL R , -OL R , -OL L R , -OL L L R , - 8 345 3435 5 OR , -OL L R , -OL L L R e -C(R )2OH; cada R4 é independentemente selecionado de H e flúor; R5 é -P(O)(OR9)2, R6 é —CF2P(O)(OR9)2 ou -C(O)OR10; R7 é —CF2P(O)(OR9)2 ou -C(O)OR10; R8 é H ou alquila C1-C4; cada R9 é independentemente selecionado de H e alquila C1 C6; R10 é H ou alquila C1-C4; cada p é independentemente selecionado de 1, 2, 3, 4, 5 e 6, e q é 1, 2, 3 ou 4.

[00151] O composto da fórmula (K) é preferivelmente da fórmula (K’): em que: P1 é selecionado de H, alquila C1-C6 opcionalmente substituído com COOH e -Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY); P2 é selecionado de H, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6 e -Y-L-X- P(O)(ORX)(ORY); com a condição de que pelo menos um de P1 e P2 seja -Y-L-X- P(O)(ORX)(ORY); RB é selecionado de H e alquila C1-C6; RX e RY são independentemente selecionados de H e alquila C1-C6; X é selecionado de uma ligação covalente, O e NH; Y é selecionado de uma ligação covalente, O, C(O), S e NH; L é selecionado de, uma ligação covalente, alquileno C1-C6, alquenileno C1-C6, arileno, heteroarileno, alquilenóxi C1-C6 e - ((CH2)pO)q(CH2)p- cada um opcionalmente substituído com 1 a 4 substituintes independentemente selecionados de halo, OH, alquila C1-C4, -OP(O)(OH)2 e -P(O)(OH)2; cada p é independentemente selecionado de 1, 2, 3, 4, 5 e 6; e q é selecionado de 1, 2, 3 e 4.

[00152] Em algumas modalidades da fórmula (K’): P1 é selecionado de alquila C1-C6 opcionalmente substituído com COOH e -Y-L-X- P(O)(ORX)(ORY); P2 é selecionado de alcóxi C1-C6 e -Y-L-X- P(O)(ORX)(ORY); RB é alquila C1-C6; X é uma ligação covalente; L é selecionado de alquileno C1-C6 e -((CH2)pO)q(CH2)p- cada um opcionalmente substituído com 1 a 4 substituintes independentemente selecionados de halo, OH, alquila C1-C4, -OP(O)(OH)2 e -P(O)(OH)i; cada p é independentemente selecionado de 1, 2 e 3; q é selecionado de 1 e 2.

[00153] Um composto preferido da fórmula (K) para o uso com a invenção é o ácido 3-(5-amino-2-(2-metil-4-(2-(2-(2-fosfonoetóxi)etóxi)- etóxi)fenetil)benzo[f][1,7]naftiridin-8-il)propanoico, ou o composto ‘K1’:

[00154] Este composto pode ser usado como base livre ou na forma de

F. Micropartículas

[00155] As micropartículas também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. As micropartículas (isto é, uma partícula de ~100 nm a ~150 μm no diâmetro, mais preferivelmente ~200 nm a ~30 μm no diâmetro, e mais preferivelmente de ~500 nm a ~10 μm no diâmetro) formado de materiais que sejam biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um poli(α- hidróxi ácido), um ácido poliidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli(lactídeo-co-glicolídeo) são preferidas, opcionalmente tratadas para ter uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, tal como CTAB).

Combinações adjuvantes

[00156] Os adjuvantes individuais listados acima também podem ser incluídos em combinações. Por exemplo, uma combinação de um adjuvante de hidróxido de alumínio e um de fosfato de alumínio pode ser usada. Similarmente, uma combinação de fosfato de alumínio e 3dMPL pode ser usada.

[00157] Uma combinação adjuvante particularmente preferida é um sal metálico insolúvel (por exemplo, um sal de alumínio, tal como um hidróxido de alumínio) e um agonista de TLR (por exemplo, um agonista de TLR7 humano, tal como o composto ‘K1’ identificado acima), como descrito nas referências Erro! Indicador não definido. e Erro! Indicador não definido.. Assim, em particular, o dito adjuvante é selecionado do grupo consistindo em: - sais de alumínio, particularmente hidróxidos de alumínio e fosfatos de alumínio; - agonistas de TLR humano, particularmente agonistas de TLR7; e - uma mistura dos mesmos.

[00158] O Agonista De Tlr É Preferivelmente Adsorvido Ao Sal Metálico, E O(S) Antígeno(S) S. Aureus Também Pode(M) Ser Adsorvido(S) Ao Sal Metálico.

[00159] Uma composição incluindo um agonista de TLR da invenção adsorvido a um sal metálico também pode incluir um tampão (por exemplo, um fosfato ou uma histidina ou um tampão de Tris). Quando uma tal composição inclui um tampão de fosfato, entretanto, é preferido que a concentração de íons fosfato no tampão deva ser menor do que 50 mM por exemplo, <40 mM, <30 mM, <20 mM, <10 mM, ou <5 mM, ou entre 1 e 15 mM. Um tampão de histidina é preferido por exemplo, entre 1 e 50 mM, entre 5 e 25 mM, ou cerca de 10 mM.

[00160] Uma composição pode incluir uma mistura tanto de um óxi- hidróxido de alumínio e um hidroxifosfato de alumínio, e um agonista de TLR pode ser adsorvido a um ou ambos destes sais.

[00161] Como mencionado acima, um máximo de 0,85 mg/dose de Al+++ é preferido. Porque a inclusão de um agonista de TLR pode melhorar o efeito adjuvante de sais de alumínio então a invenção vantajosamente permite quantidades mais baixas de Al+++ por dose, e assim uma composição pode utilmente incluir entre 10 e 250 μg de Al+++ por dose unitária. As vacinas pediátricas correntes tipicamente incluem pelo menos 300 μg de Al+++. Em termos de concentração, uma composição pode ter uma concentração de Al+++ entre 10 e 500 μg/ml por exemplo, entre 10 e 300 μg/ml, entre 10 e 200 μg/ml, ou entre 10 e 100 μg/ml.

[00162] No geral, quando uma composição inclui tanto um agonista de TLR quanto um sal de alumínio, a razão em peso de agonista para Al+++ será menor do que 5:1 por exemplo, menor do que 4:1, menor do que 3:1, menor do que 2:1, ou menor do que 1:1. Assim, por exemplo, com uma concentração de Al+++ de 0,5 mg/ml a concentração máxima de agonista de TLR seria de 1,5 mg/ml. Porém níveis mais altos ou mais baixos podem ser usados.

[00163] Onde uma composição inclui um agonista de TLR e um sal metálico insolúvel, é preferido que pelo menos 50 % (em massa) do agonista na composição sejam adsorvidos ao sal metálico por exemplo, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 85 %, > 90 %, > 92 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou mesmo 100 %.

[00164] Assim, em uma modalidade, a invenção usa uma composição imunogênica compreendendo: ■ um adjuvante de hidróxido de alumínio; ■ um agonista de TLR7 da fórmula (K), tal como o composto K1; ■ um primeiro polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de aminoácidos modificada que difira da SEQ ID NO: 6 em até 5 mudanças de aminoácido únicas contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que se ligam a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 6; ■ um segundo polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos modificada que difira da SEQ ID NO: 13 em até 5 mudanças de aminoácido únicas contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que se ligam a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 13; ■ um terceiro polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 31, ou uma sequência de aminoácidos modificada que difira da SEQ ID NO: 31 em até 5 mudanças de aminoácido únicas contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que se ligam a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 31; ■ um quarto polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 33, ou uma sequência de aminoácidos modificada que difira da SEQ ID NO: 33 em até 5 mudanças de aminoácido únicas contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que se ligam a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 33; e ■ um quinto polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 45, ou uma sequência de aminoácidos modificada que difira da SEQ ID NO: 45 em até 5 mudanças de aminoácido únicas contanto que a sequência modificada possa extrair anticorpos que se ligam a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 43; e, em que o agonista de TLR7 e/ou pelo menos um dos polipeptídeos é/são adsorvidos ao adjuvante de hidróxido de alumínio.

[00165] Por exemplo, como explicado em mais detalhes aqui em outro lugar: o primeiro polipeptídeo pode compreender a SEQ ID NO: 34; o segundo polipeptídeo pode compreender a SEQ ID NO: 13; o terceiro polipeptídeo pode compreender a SEQ ID NO: 40; o quarto polipeptídeo pode compreender a SEQ ID NO: 36; e o quinto polipeptídeo pode compreender a SEQ ID NO: 45, opcionalmente modificada em até 3 substituições de aminoácido (outras que não nas posições que são X na SEQ ID NO: 44). Assim a composição pode usar uma mistura de cinco polipeptídeos tendo as SEQ ID NOs: 37, 27, 38, 39, e 45 (exceto que a SEQ ID NO: 45 possa ser modificada em até 3 substituições de aminoácido como debatido acima). Grupos Químicos

[00166] A menos que especificamente definido em outro lugar, os grupos químicos aqui debatidos têm o seguinte significado quando usados no presente relatório descritivo:

[00167] O termo “alquila” inclui resíduos de hidrocarboneto saturado incluindo: - grupos lineares até 10 átomos (C1-C10), ou de até 6 átomos (C1-C6), ou de até 4 átomos (C1-C4). Os exemplos de tais grupos alquila incluem, mas não são limitados a C1 - metila, C2 - etila, C3 - propila e C4- n- butila. - grupos ramificados dentre 3 e 10 átomos (C3-C10), ou de até 7 átomos (C3-C7), ou de até 4 átomos (C3-C4). Os exemplos de tais grupos alquila incluem, mas não são limitadas a, C3 - iso-propila, C4 - sec-butila, C4 - iso-butila, C4 - terc-butila e C5 - neo-pentila.

[00168] O termo “alquileno” se refere ao radical hidrocarboneto bivalente derivado de um grupo alquila, e deve ser interpretado de acordo com a definição acima.

[00169] O termo “alquenila” inclui resíduos de hidrocarboneto monoinsaturado incluindo: - grupos lineares dentre 2 e 6 átomos (C2-C6). Os exemplos de tais grupos alquenila incluem, mas não são limitados a, C2 - vinila, C3 - 1- propenila, C3 - alila, C4 - 2-butenila. - grupos ramificados dentre 3 e 8 átomos (C3-C8). Os exemplos de tais grupos alquenila incluem, mas não são limitadas a, C4 - 2-metil-2- propenila e C6 - 2,3-dimetil-2-butenila.

[00170] O termo alquenileno se refere ao radical de hidrocarboneto bivalente derivado de um grupo alquenila, e deve ser interpretado de acordo com a definição acima.

[00171] O termo “alcóxi” inclui resíduos de hidrocarboneto ligados em O incluindo: - grupos lineares dentre 1 e 6 átomos (C1-C6), ou dentre 1 e 4 átomos (C1-C4). Os exemplos de tais grupos alcóxi incluem, mas não são limitados a, C1 - metóxi, C2 - etóxi, C3 - n-propóxi e C4 - n-butóxi. - grupos ramificados dentre 3 e 6 átomos (C3-C6) ou dentre 3 e 4 átomos (C3-C4). Os exemplos de tais grupos alcóxi incluem, mas não são limitados a, C3 - iso-propóxi, e C4 - sec-butóxi e terc-butóxi.

[00172] Halo é selecionado de Cl, F, Br e I. Halo é preferivelmente F.

[00173] O termo “arila” inclui um sistema de anel aromático único ou fundido contendo 6 ou 10 átomos de carbono; em que, a menos que de outro modo estabelecido, cada ocorrência de arila pode ser opcionalmente substituída com até 5 substituintes independentemente selecionados de alquila (C1-C6), alcóxi (C1-C6), OH, halo, CN, COOR14, CF3 e NR14R15; como definidos acima. Tipicamente, arila será opcionalmente substituído com 1, 2 ou 3 substituintes. Os substituintes opcionais são selecionados daqueles estabelecidos acima. Os exemplos de grupos arila adequados incluem fenila e naftila (cada um opcionalmente substituído como estabelecido acima). Arileno se refere a radical bivalente derivado de um grupo arila, e deve ser interpretado de acordo com a definição acima.

[00174] O termo “heteroarila” inclui um anel aromático mono- ou bi- cíclico de 5, 6, 9 ou 10 membros, contendo 1 ou 2 átomos N e, opcionalmente, um átomo NR14, ou um átomo NR14 e um átomo de S ou um O, ou um átomo de S, ou um átomo de O; em que, a menos que de outro modo estabelecido, o dito heteroarila pode ser opcionalmente substituído com 1, 2 ou 3 substituintes independentemente selecionados de alquila (C1-C6), alcóxi (C1-C6), OH, halo, CN, COOR14, CF3 e NR14R15; como definidos abaixo. Os exemplos de grupos heteroarila adequados incluem tienila, furanila, pirrolila, pirazolila, imidazoíla, oxazolila, isoxazolila, tiazolila, isotiazolila, triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, tetrazolila, piridinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, indolila, benzimidazolila, benzotriazolila, quinolinila e isoquinolinila (opcionalmente substituído como estabelecido acima). Heteroarileno se refere a radical bivalente derivado de heteroarila, e deve ser interpretado de acordo com a definição acima.

[00175] O termo “heterociclila” é um anel mono- ou bi-cíclico não aromático de 3 a 10 membros ligado em C ou ligado em N, em que o dito anel de heterocicloalquila contém, onde possível, 1, 2 ou 3 heteroátomos independentemente selecionados de N, NR14, S(O)q e O; e o dito anel heterocicloalquila opcionalmente contém, onde possível, 1 ou 2 ligações duplas, e é opcionalmente substituído no carbono com 1 ou 2 substituintes independentemente selecionados de alquila (C1-C6), alcóxi (C1-C6), OH, CN, CF3, halo, COOR14, NR14R15 e arila.

[00176] Nas definições acima R14 e R15 são independentemente selecionados de H e alquila (C1-C6).

[00177] Quando uma fórmula estrutural é definida com um substituinte ligado ao núcleo da molécula por uma ligação não especificada, ou “flutuante”, por exemplo, como para o grupo P3 no caso da fórmula (C), Esta definição abrange os casos onde o substituinte não especificado é ligado a qualquer um dos átomos no anel no qual a ligação flutuante está localizada, enquanto está de acordo com a valência permissível para este átomo.

[00178] No caso de compostos da invenção que podem existir nas formas tautoméricas (isto é, nas formas ceto ou enol), por exemplo, os compostos da fórmula (C) ou (H), referência a um composto particular opcionalmente inclui todas de tais formas tautoméricas. Geral

[00179] A prática da presente invenção utilizará, a menos que de outro modo indicado, métodos convencionais da química, bioquímica, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, as referências 121-128, etc.

[00180] A numeração “GI” é usada acima. Um número GI, ou “Identificador GenInfo”, é uma série de dígitos designados consecutivamente para cada registro de sequência processado pela NCBI quando as sequências são adicionadas às suas bases de dados. O número GI não exibe nenhuma semelhança com o número de acesso do registro de sequência. Quando uma sequência é atualizada (por exemplo, por correção, ou para adicionar mais anotação ou informação) então ela recebe um novo número GI. Assim a sequência associada com um dado número GI nunca é mudada.

[00181] Onde a invenção se refere a um “epítopo”, este epítopo pode ser um epítopo de célula B e/ou um epítopo de célula T. Tais epítopos podem ser identificados empiricamente (por exemplo, usando PEPSCAN [129,130] ou métodos similares), ou eles podem ser prognosticados (por exemplo, usando o índice antigênico de Jameson-Wolf [131], métodos com base em matriz [132], MAPITOPE [133], TEPITOPE [134,135], redes neurais [136], OptiMer & EpiMer [137, 138], ADEPT [139], Tsites [140], hidrofilicidade [141], índice antigênico [142] ou os métodos descritos nas referências 143147, etc.). Os epítopos são as partes de um antígeno que são reconhecidos pelos sítios de ligação de antígeno de anticorpos ou receptores de célula T e se ligam aos mesmos, e eles também podem ser aludidos como “determinantes antigênicos”.

[00182] Onde um “domínio” de antígeno é omitido, isto pode envolver a omissão de um peptídeo de sinal, de um domínio citoplasmático, de um domínio de transmembrana, de um domínio extracelular, etc.

[00183] O termo “compreendendo” abrange “incluindo” assim como “consistindo” por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir alguma coisa adicional por exemplo, X + Y.

[00184] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x ± 10 %.

[00185] Referências a uma identidade de sequência percentual entre duas sequências de aminoácido significa que, quando alinhado, esta porcentagem de aminoácidos são a mesma em comparação com as duas sequências. Este alinhamento e a homologia ou identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos na seção 7.7.18 da ref. 148. Um alinhamento preferido é determinado pelo algoritmo de pesquisa por homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisa de intervalo afim com uma penalidade de abertura de intervalo de 12 e uma penalidade de extensão de intervalo de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é descrito na ref. 149. A identidade percentual para qualquer sequência particular (por exemplo, para uma SEQ ID particular) é idealmente calculada no comprimento inteiro desta sequência.

[00186] A afinidade de ligação pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo a resistência plasmônica superficial, calorimetria de titulação isotérmica, ensaios de ligação competitiva, ensaio de mudança térmica, etc. Embora as figuras absolutas obtidas usando métodos diferentes possam variar, é considerado que a determinação da afinidade de ligação relativa de uma proteína comparada uma com a outra não deve depender do método usado.

[00187] Adjuvantes contendo fósforo usados com a invenção podem existir em várias formas protonadas e desprotonadas dependendo do pH do ambiente circundante, por exemplo, do pH do solvente no qual eles são dissolvidos. Portanto, embora uma forma particular possa ser ilustrada, é intencionado que estas ilustrações sejam meramente representativas e não limitantes a uma forma protonada ou desprotonada específica. Por exemplo, no caso de um grupo fosfato, este foi ilustrado como -OP(O)(OH)2 mas a definição inclui as formas protonadas [OP(O)(OH2)(OH)]+ e -[OP(O)(OH)2]2+ que podem existir nas condições ácidas e as formas desprotonadas - [OP(O)(OH)(O)]- e [OP(O)(O)2]2- que podem existir nas condições básicas.

[00188] Os compostos podem existir como sais farmaceuticamente aceitáveis. Assim, os compostos (por exemplo, adjuvantes) podem ser usados na forma de seus sais farmaceuticamente aceitáveis isto é, sal fisiológica ou toxicologicamente tolerável (que inclui, quando apropriado, sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis e sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis).

[00189] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente” por exemplo, uma composição que é “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra “substancialmente” pode ser omitida da definição da invenção.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO Mutante SpAkR

[00190] SpA é um fator de virulência crucial na S. aureus e o mesmo atua pela interferência com a depuração opsonofagocítica da bactéria e pela ablação das respostas imunes adaptativas. A sequência do tipo selvagem SEQ ID NO: 43 inclui cinco domínios de ligação de Ig (IgBD), como mostrado acima, e é conhecido mutar resíduos de aminoácido dentro destes domínios para abolir a atividade da ligação Fc/Fab enquanto retêm imunogenicidade por exemplo, ver a referência, que substitui dipeptídeos Gln-Gln com Lys-Lys e/ou substitui dipeptídeos Asp-Asp com Ala-Ala.

[00191] Um novo SpA mutante foi produzido em que um dipeptídeo Gln-Gln adicional é mutado para Lys-Arg. Este dipeptídeo foi identificado com base na análise de bioinformática e prognósticos de um sítio adicional envolvido na ligação de Ig. Em particular, levantou-se a hipótese de que os resíduos 96 & 97 da SEQ ID NO: 43 estivessem envolvidos na ligação de Ig. Este sítio foi negligenciado em trabalhos iniciais porque o mesmo está fora da IgBD conservada e não é parte das estruturas resolvidas. O novo mutante é aludido como ‘SpAkR’ e tem a seguinte sequência de aminoácidos, onde a substituição QQ/KR extra em relação ao mutante ‘SpAkkAA’ anterior está em caixa: MAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAP KADA|KRNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLN ESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKK LNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEA KKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILA EAKKLNDAQAPK SSEQ ID NO: 48)

[00192] O mutante SpAkR foi confirmado ter afinidade reduzida para imunoglobulinas em relação aos mutantes conhecidos, enquanto retêm imunogenicidade.

[00193] As análises de CD e DSC mostraram que a introdução do mutante KR não afetou materialmente a estrutura de SpA. Os espectros de CD de SpAkkAA e SpAKR foram idênticos. Tm1 e Tm2 da análise de DSC foram como segue. Tm1: SpAkkAA 48,9 °C; SpAKR 51,1 °C. Tm2: SpAkkAA 68,1 °C; SpAKR 68,0 °C.

[00194] A afinidade de SpA do tipo selvagem, e dos mutantes SpAkkAA e SpAkR, para IgG, IgA e IgM humanas foi testada usando a ressonância plasmônica superficial. As proteínas foram imobilizadas em um chip sensor e IgG, IgA e IgM humanas foram usadas como análitos. Ambos mutantes demonstraram uma capacidade de ligação enormemente reduzida comparada com a do tipo selvagem, mas enquanto SpAkkAA mostrou ligação residual à IgG e IgM, nenhuma interação detectável com nenhuma das imunoglobulinas foi observada com SpAkR. As atividades de ligação residual de SpAkkAA para IgG e IgM foram muito baixas (11 a 12 vezes mais baixa do que a do tipo selvagem), mas reprodutível e dependente da concentração.

[00195] A sobrevivência de S. aureus na presença de SpA (WT, SpAkkAA e SpAkR) foi avaliada através do ensaio de sobrevivência em sangue integral (WBA). 1 ml de sangue integral de doadores saudáveis, suplementado com 50 mg/l de anticoagulante lepirudina (10 μl/ml de sangue), foi incubado com 0,15 μM de SpA ou com PBS, por 15 min a 37 °C, antes de adicionar aproximadamente 2,5 x 105 CFU de S. aureus USA300 LAC (OD600, 0,4) diluído em BHI. As alíquotas desta cultura foram plaqueadas em BHI-ágar para determinar a CFU de entrada. Depois da incubação a 37 °C por 2 h com agitação (180 RPM), neutrófilos foram lisados a 0,5 % de saponina- PBS por 3 min em gelo. O número de bactérias viáveis foi determinado pelas diluições de dez vezes em série em BHI e plaqueando nas placas de ágar nutriente. As colônias foram contadas depois da incubação das placas a 37 °C por 18 h. O controle foi a amostra de sangue pré-incubada com PBS. A sobrevivência relativa foi calculada com base na CFU de entrada comparada com a CFU pós-incubação. Os experimentos foram realizados em triplicata; houve pouca variação entre os experimentos.

[00196] No WBA, a sobrevivência relativa de S aureus no sangue integral humano foi consideravelmente mais baixa quando incubada com SpAKR do que com SpA do tipo selvagem (p<0,001, Mann-Whitney) ou com SpAkkAA (p<0,05). A incubação com SpAwt resultou na sobrevivência de S aureus aumentada comparada ao controle (p<0,001), ao passo que a sobrevivência no WBA incubado com SpAkkAA foi comparável ao controle. A incubação com SpAkR reduziu a sobrevivência em torno da metade daquela do controle.

[00197] SpAkkAA ou SpAkR formulados com adjuvante de hidróxido de alumínio foram descobertos ser fracamente imunogênicos em camundongos por si só, mas a inclusão de agonista de TLR7 adsorvido ‘K1’ significantemente aumentou os títulos de anticorpo. Porque o mecanismo de ação associado com a imunização por SpA parece ser principalmente induzido pelos anticorpos, esta é uma melhora importante.

Vacinas de S. aureus

[00198] SpAkR, SpAkkAA, domínio SpAkR E sozinho e domínio SpAkR E fundido a HlaH35L foram testados no modelo de abscesso renal, adjuvantado com hidróxido de alumínio (Al-H) a 2 mg/ml (sal total). Os antígenos foram cada um presentes a 10 μg em uma dose de 100 μl para injeção intramuscular.

[00199] Camundongos com quatro ou cinco semanas de idade (CD1) foram imunizados intramuscularmente (IM) com injeções de preparação- reforço com um intervalo de 14 dias. Os camundongos de controle receberam quantidades iguais de adjuvantes sozinhos. O soro foi coletado de camundongos tanto na pré- quanto na pós-vacinação para documentar os títulos de anticorpo séricos para cada componente de proteína na vacina de combinação. Estes títulos foram medidos pela tecnologia Luminex usando os antígenos de vacina recombinante conjugada às microesferas. Modelo de abscesso renal: os animais imunizados foram inoculados no dia 24 pela injeção intravenosa de uma dose subletal da cepa Newman de S. aureus (~ 2 a 6 x 107 CFU). No dia 28, os camundongos foram eutanizados e os rins foram removidos e homogeneizados em 2 ml de PBS e plaqueados em meio de ágar em duplica para a determinação de unidades formadoras de colônia (CFU).

[00200] Uma redução comparável em log10 CFU/ml (redução em torno de 1 log) foi obtida na vacinação com SpAKR, SpAkkAA, domínio SpAkR E sozinho e domínio SpAkR E fundido a HlaH35L, comparados ao adjuvante sozinho.

Vacinas de Combinação de S. aureus

[00201] Uma vacina 5-valente e uma 6-valente foram preparadas. A vacina 5-valente incluiu antígenos consistindo ems SEQ ID NOs: 7, 8, 27 e 32 (FhuD2, Sta011, Hla-H35L, e EsxAB); a vacina 6-valente também incluiu o mutante SpAkR. As vacinas foram adjuvantadas com: (i) hidróxido de alumínio, Al-H; (ii) Al-H + agonista de TLR7 adsorvido K1; ou (iii) a emulsão de óleo em água de MF59. Al-H foi usado a 2 mg/ml (sal total), K1 foi presente a 50 μg por dose, e MF59 foi misturado com os antígenos a uma razão em volume de 1:1. Os antígenos foram cada um presentes a 10 μg em uma dose de 100 μL para a injeção intramuscular.

[00202] Camundongos de quatro ou cinco semanas de idade (CD1) foram imunizados com injeções de iniciador reforço com um intervalo de 14 dias. Os camundongos de controle receberam quantidades iguais de adjuvantes sozinhos. O soro foi coletado dos camundongos tanto pré- quanto pós-vacinação para documentar os títulos de anticorpo sérico para cada componente de proteína na vacina de combinação. Estes títulos foram medidos pela tecnologia Luminex usando os antígenos de vacina recombinantes conjugados às microesferas. Modelo de abscesso renal: os animais imunizados foram inoculados no dia 24 pela injeção intravenosa de uma dose subletal de S. aureus (~ 2 a 6 x 107 CFU, onde o inóculo específico variou dependendo da cepa inoculada). No dia 28, os camundongos foram eutanizados e os rins foram removidos e homogeneizados em 2 ml de PBS e plaqueados em meio ágar em duplicata para a determinação das unidades formadoras de colônia (CFU). Os rins também foram processados para histopatologia. Modelo de Peritonite: Separadamente, os animais imunizados foram inoculados no dia 24 pela injeção intraperitoneal de uma dose letal de S. aureus. (~ 2 a 5 x 108 CFU) e depois monitorados diariamente por 14 dias. Modelo de infecção de pele: Os camundongos imunizados foram inoculados pela injeção subcutânea no flanco direito raspado com 2 x 107 CFU da cepa LAC de S. aureus (clone USA300, que é um dos clones mais importantes no mundo todo e altamente associado com infecções cutâneas adquiridas na comunidade). A formação de massa e abscesso (tamanho e dermonecrose) foram monitorados em intervalos de 24 horas durante um curso de 7 dias. O tamanho de um abscesso e lesão dermonecrótica subjacente associada foi determinada usando o software de análise de imagem. A pele e abscessos de camundongo foram colhidos no dia 7 após a inoculação para a enumeração de CFU. Este modelo foi usado apenas com o adjuvante Al-H/K1.

[00203] Os resultados foram como segue:* p<0,05 comparado ao controle; ** p<0,01 comparado ao controle

[00204] Estes resultados demonstram que o mutante SpAkR melhora o produto Combo-1 5-valente em ambos os modelos. Além disso, os melhores resultados foram observados usando o adjuvante Al-H/K1. Surpreendentemente, os resultados no modelo de abscesso renal da vacina 6- valente com Al-H/K1 aproximou-se da esterilidade.

[00205] No modelo da peritonite, a vacina 6-valente com Al-H/K1 foi estatisticamente superior quando comparada com o controle negativo (ver a tabela acima), e também quando comparada com a vacina Al-H5-valente. No modelo do abscesso, a vacina 6-valente com Al-H/K1 foi estatisticamente superior quando comparada com o controle negativo (ver a tabela acima), com a vacina Al-H 5-valente, e com a vacina Al-H/K1 5-valente, mostrando assim que a contribuição do SpA mutante vai além do realce que foi devido unicamente ao agonista K1.

[00206] No modelo da infecção de pele, as vacinas 5-valente e 6- valente ambas significantemente reduziram a formação de abscesso e as contagens de CFU (ver a tabela acima). A dermonecrose foi ausente nos camundongos vacinados enquanto a mesma foi observada em todos os camundongos que receberam apenas adjuvante (‘N/A’ na tabela). Além disso, a redução de CFU foi significantemente melhorada pela inclusão de SpAkR na vacina, e menos camundongos foram observados com abscessos distinguíveis em um nível macroscópico (71 % vs. 88 %).

[00207] Os títulos anti-SpA também foram comparados para os três adjuvantes. Os títulos médios usando Al-H ou MF59 não foram significantemente diferentes, mas o título usando Al-H/K1 foi significantemente mais alto do que com Al-H sozinho (p = 0,0047, teste de Mann-Whitney) e do que com MF59 (p = 0,01). Assim a formulação que desempenhou melhor nos ensaios funcionais foi aquela que evocou os títulos de anticorpo anti-SpA mais altos, em linha com a hipótese de que a atividade da SpA como um antígeno de vacina depende dos anticorpos, que podem se ligar à mesma e inibir a sua atividade de imuno-evasão.

[00208] Será entendido que a invenção foi descrita apenas por via de exemplo e modificações podem ser feitas embora permanecendo dentro do escopo e espírito da invenção. REFERÊNCIAS [1] Sheridan (2009) Nature Biotechnology 27:499-501. [2] Kuklin et al. (2006) Infect Immun. 74(4):2215-23. [3] Fowler et al. (2013) JAMA 309(13):1368-78. [4] WO2010/119343. [5] WO2013/030378. [6] Sjodahl (1977) J. Biochem. 73:343-351. [7] Uhlen et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:1695-1702 & 13628 (Corr.). [8] WO2007/071692. [9] Kim et al. (2010) J Exp Med 207(9):1863-70. [10] WO2013/092985. [11] WO2014/033190. [12] WO2014/033191. [13] WO2014/033192. [14] WO2014/033193. [15] Sebulsky & Heinrichs (2001) J Bacteriol 183:4994-5000. [16] Sebulsky et al. (2003) J Biol Chem 278:49890-900. [17] Rable & Wardenburg (2009) Infect Immun 77:2712-8. [18] WO2007/145689. [19] WO2009/029831. [20] WO2006/110603. [21] Stranger-Jones et al. (2006) PNAS USA 103:16942-7. [22] Wardenburg et al. (2007) Infect Immun 75:1040-4. 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Claims (14)

1. Antígeno de SpA mutante, o antígeno caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 49, em que os dipeptídeos XX nas posições 7-8, 60-61, 68-69, 126-127, 184-185, e 242-243 de SEQ ID NO: 49 são KK, RR, RK ou KR, e os dipeptídeos nas posições 34-35, 95-96, 153-154, 211-212, e 269-270 de SEQ ID NO: 49 são AA.

2. Antígeno de SpA mutante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dipeptídeo nas posições 60 e 61 é KK ou KR.

3. Antígeno de SpA mutante de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita sequência de aminoácido é SEQ ID NO: 47.

4. Antígeno de SpA mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o antígeno elicita anticorpos em um mamífero que reconhece a SEQ ID NO: 43 e/ou SEQ ID NO: 54.

5. Antígeno de SpA mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção FCY da IgG humana.

6. Antígeno de SpA mutante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que tem afinidade diminuída, em relação à SpA não modificada, para a porção Fab de receptores de célula B humana contendo VH3.

7. Antígeno de SpA mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 48.

8. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de SpA mutante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de SpA mutante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 8.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um antígeno selecionado do grupo que consiste de antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 e Hla.

11. Composição de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende um adjuvante, em que o dito adjuvante é opcionalmente selecionado do grupo consistindo em: - sais de alumínio, particularmente hidróxidos de alumínio e fosfatos de alumínio; - agonistas de TLR humano, particularmente agonistas de TLR7; - uma emulsão de óleo em água; - uma formulação de saponina; - um derivado não-tóxico de LPS enterobacteriano, particularmente MPL (monofosforil lipídeo A (MPL) ou 3d-MPL (monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado)), - um derivado de lipídeo A, e - uma mistura dos mesmos, em que o dito agonista de TLR7 é opcionalmente u composto da seguinte fórmula (K): (K) em que: R 1 5 15 16 25 26 é H, alquila C1-C6, -C(R )2OH, -L R , -L R , -L R , -L R , - OL2R5, ou -OL2R6; L1 é -C(O)- ou -O-; L2 é alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6, arileno, heteroarileno ou -((CR4R4)pO)q(CH2)p-, em que o alquileno C1-C6 e o alquenileno C2-C6 de L2 são opcionalmente substituídos com 1 a 4 grupos flúor; cada L3 é independentemente selecionado de alquileno C1-C6 e -((CR4R4)pO)q(CH2)p-, em que o alquileno C1-C6 de L3 é opcionalmente substituído com 1 a 4 grupos flúor; L4 é arileno ou heteroarileno; R2 é H ou alquila C1-C6; R 3 35 15 37 é selecionado de aiquiia C1-C4, —L R , -L R , -L R , - 3437 345 3435 35 37 347 3437 L L L R , -L L R , -L L L R , -OL R , -OL R , -OL L R , -OL L L R , -

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende um agonista de TLR humano adsorvido a um sal de alumínio.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.

14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento na prevenção e/ou tratamento de uma infecção pela S. aureus, opcionalmente em um humano.