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BR112016013482B1 - Conjugado de anticorpo anti-her2-fármaco, fármacos antitumor e/ou anticâncer e composição farmacêutica - Google Patents

Conjugado de anticorpo anti-her2-fármaco, fármacos antitumor e/ou anticâncer e composição farmacêutica Download PDF

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BR112016013482B1
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BR
Brazil
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antibody
cancer
ch2ch2
drug
compound
Prior art date
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BR112016013482-6A
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English (en)
Other versions
BR112016013482A2 (pt
Inventor
Hiroyuki Naito
Yusuke OGITANI
Takeshi Masuda
Takashi Nakada
Masao Yoshida
Shinji Ashida
Koji Morita
Hideki Miyazaki
Yuji Kasuya
Ichiro Hayakawa
Yuki Abe
Original Assignee
Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53756672&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112016013482(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Company, Limited filed Critical Daiichi Sankyo Company, Limited
Publication of BR112016013482A2 publication Critical patent/BR112016013482A2/pt
Publication of BR112016013482B1 publication Critical patent/BR112016013482B1/pt

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Abstract

conjugado de anticorpo-fármaco anti-her2. (i) como um fármaco antitumor tendo um excelente efeito antitumor e e segurança e também tendo um excelente efeito terapêutico, um conjugado de anticorpo-fármaco é fornecido, que é caracterizado pelo fato de que um composto antitumor representado pela fórmula (i) é ligado a um anticorpo anti-her2 através de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula: -l1-l2-lp-nh-(ch2)n1-la-(ch2)n2-c(=o)- (em que o anticorpo anti-her2 é ligado no terminal de l1, e o composto antitumor é ligado a um grupo carbonila em uma porção -(ch2)n2-c(=o)- em que um átomo de nitrogênio em um grupo amino localizado na posição -1 no composto antitumor serve como uma parte de ligação).

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente invenção refere-se a um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um fármaco antitumor conjugado a um anticorpo anti-HER2 por meio de uma porção de estrutura de ligante, o conjugado sendo útil como um fármaco antitumor.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[0002] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) tendo um fármaco com citotoxicidade conjugada para um anticorpo cujo antígeno é expresso da mesma forma na superfície das células cancerosas e qual liga-se a um antígeno capaz de internalização celular, e portanto pode liberar o fármaco seletivamente às células cancerosas, é esperado desse modo causar o acúmulo do fármaco dentro das células cancerosas e matar as células cancerosas (veja, Literaturas de Não Patente 1 a 3). Como um ADC, Mylotarg (marca registrada; Gentuzumabe ozogamicina) em que a calicamicina é conjugada a um anticorpo anti-CD33 é aprovado como um agente terapêutico para leucemia mieloide aguda. Além disso, Adcetris (marca registrada; Brentuximabe vedotina) em que auristatina E é conjugado a um anticorpo anti-CD30, foi recentemente aprovado como um agente terapêutico para o linfoma Hodgkin e linfoma anaplásico de células grandes (veja, Literatura de Não Patente 4). Os fármacos contidos em ADCs que foram aprovados até agora alvejam o DNA ou tubulina.
[0003] Com respeito a um agente antitumor, derivados de camptotecina, compostos de baixo peso molecular que inibem a topoisomerase I de exibir um efeito antitumor, são conhecidos. Entre estes, um composto antitumor representado pela fórmula abaixo Fórmula 1
Figure img0001
[0004] (exatecana, nome químico: (1S, 9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro- 2, 3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-10, 13(9H, 15H)- diona) é um derivado solúvel em água de camptotecina (Literaturas de Patentes 1 e 2). Ao contrário da irinotecan atualmente usada em aplicações clínicas, este composto não requer a ativação por uma enzima para exibir seu efeito antitumor. Além disso, sua atividade inibidora sobre a topoisomerase I foi observado ser mais alta do que SN-38 que é a substância farmaceuticamente ativa principal de irinotecana e topotecana usadas em aplicações clínicas, e a atividade de citocida in vitro mais alta foi confirmada contra várias células cancerosas. Em particular, foi confirmado ter o efeito contra células cancerosas tendo resistência a SN-38 ou similares devido à expressão de P-glicoproteína. Além disso, em um modelo de camundongo subcutaneamente transplantado de tumor humano, foi confirmado ter um efeito antitumor potente, e desse modo tem passado por estudos clínicos, porém, ainda não foi colocado no mercado (veja, Literaturas de Não Patente 5 a 10). Permanece obscuro se ou não a exatecana age efetivamente como um ADC.
[0005] DE-310 é um complexo no qual a exatecana é conjugada a um polímero de poliálcool de carboximetildextrana biodegradável por meio de um espaçador de peptídeo de GGFG (Literatura de Patente 3). Convertendo-se a exatecana na forma de um pró-fármaco de polímero, uma propriedade de retenção de sangue alta pode ser mantida e da mesma forma uma propriedade de alvejamento alta para as áreas de tumor é aumentada passivamente utilizando-se a permeabilidade aumentada de vasos sanguíneos recentemente formados dentro de tumores e propriedade de retenção em tecidos de tumor. Com DE-310, por clivagem do espaçador de peptídeo por enzima, exatecana e exatecana com glicina conectada a um grupo amino são liberadas continuamente como substância ativa principal, e como resultado, as farmacocinéticas são melhoradas. DE-310 foi constatada ter efetividade mais alta do que a exatecana administrada sozinha apesar da dosagem total de exatecana contida em D310 ser mais baixa do que no caso da administração da exatecana sozinha de acordo com vários modelos de avaliação de tumor em estudos não clínicos. Um estudo clínico foi conduzido para DE-310, e casos efetivos foram da mesma forma confirmados, incluindo um relato que sugere que a substância ativa principal acumule-se em tumores maiores do que em tecidos normais. Entretanto, há da mesma forma um relato que indica que o acúmulo de DE-310 e a substância ativa principal em tumores não é muito diferente do acúmulo em tecidos normais em humanos, e desse modo nenhum alvejamento passivo é observado em humanos (veja, Literaturas de Não Patente 11 a 14). Como resultado, DE-310 não foi da mesma forma comercializado, e permanece obscuro se ou não exatecana efetivamente age como um fármaco direcionado a tal alvejamento.
[0006] Como um composto relativo a DE-310, um complexo no qual uma porção de estrutura representada por -NH-(CH2)4-C(=O)- é inserida entre o espaçador de -GGFG- e exatecana para formar - GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- usado como uma estrutura espaçadora é da mesma forma conhecido (Literatura de Patente 4). Entretanto, o efeito antitumor do referido complexo não é conhecido em todos.
[0007] HER2 é um dos produtos de um oncogene tipo receptor do fator de crescimento típico identificado como oncogene relacionado ao receptor do fator de crescimento celular epidérico humano 2, e é uma proteína do receptor de transmembrana tendo um peso molecular de 185 kDa e tendo um domínio de tirosina cinase (Literatura de Não Patente 15). A sequência de DNA e sequência de aminoácido de HER2 são descritas em um banco de dados público, e pode referir-se a, por exemplo, sob No. de Acesso M11730 (GenBank), NP_004439.2 (NCBI), ou similares.
[0008] HER2 (neu, ErbB-2) é um dos membros da família do EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico) e é ativado por autofosforilação em resíduos de tirosina intracelulares por sua formação de homodímero ou formação de heterodímero com outro receptor de EGFR, HER1 (EGFR, ErbB-1), HER3 (ErbB-3), ou HER4 (ErbB-4) (Literaturas de Não Patente 16 a 18), desse modo desempenhando um papel importante no crescimento de célula, diferenciação, e sobrevivência em células normais e células cancerosas (Literaturas de Não Patente 19 e 20). HER2 é superexpresso em vários tipos de câncer tais como câncer de mama, câncer gástrico, e câncer ovariano (Literaturas de Não Patente 21 a 26) e foi relatado ser um fator de prognóstico negativo para câncer de mama (Literaturas de Não Patente 27 e 28).
[0009] Trastuzumabe é um anticorpo humanizado de um anticorpo anti-HER2 de camundongo 4D5 (Literatura de Não Patente 29 e Literatura de Patente 5), nomeado como anticorpo monoclonal anti- HER2 humanizado recombinante (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Herceptin(R)) (Literatura de Patente 6). Trastuzumabe especificamente liga-se ao domínio extracelular IV de HER2 e induz citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou mostra um efeito anticâncer por meio da inibição de transdução de sinal a partir de HER2 (Literaturas de Não Patente 30 e 31). Trastuzumabe é altamente efetivo para tumores superexpressandor HER2 (Literatura de Não Patente 32) e como tal, foi lançado em 1999 nos USA e em 2001 no Japão como agente terapêutico para pacientes com câncer de mama metastático superexpressando HER2.
[00010] Embora o efeito terapêutico de trastuzumabe no câncer de mama tenha sido adequadamente comprovado (Literatura de Não Patente 33), supostamente cerca de 15% de pacientes com câncer de mama superexpressando HER2 que receberam uma ampla faixa de terapias anticâncer convencionais são respondedores ao trastuzumabe. Cerca de 85% de pacientes desta população não têm ou respostem meramente fraco ao tratamento com trastuzumabe.
[00011] Desse modo, a necessidade quanto a um agente terapêutico alvejando doenças relacionadas à expressão de HER2 foi reconhecida por pacientes afetados por tumores superexpressando HER2 sem ou resposta fraca ao trastuzumabe ou distúrbios relacionados ao HER2. T-DM1 (trastuzumabe entansina, Kadcyla (R); Literatura de Não Patente 34) tendo um fármaco antitumor conjugado para trastuzumabe por meio de uma estrutura de ligante, e pertuzumabe (Perjeta(R); Literatura de Não Patente 35 e Literatura de Patente 7) projetado para alvejar o domínio extracelular II de HER2 e inibir a formação de heterodímero foi desenvolvido. Entretanto, sua responsabilidade, intensidade de atividade, e indicações aceitas ainda são insuficientes, e há necessidades insatisfeitas para alvejar o HER2. LISTA DE CITAÇÃO
LITERATURAS DE PATENTE
[00012] [Literatura de Patente 1] Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 5-59061
[00013] [Literatura de Patente 2] Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 8-337584
[00014] [Literatura de Patente 3] Publicação Internacional No. WO 1997/46260
[00015] [Literatura de Patente 4] Publicação Internacional No. WO 2000/25825
[00016] [Literatura de Patente 5] Patente U.S. No. 5677171
[00017] [Literatura de Patente 6] Patente U.S. No. 5821337
[00018] [Literatura de Patente 7] Publicação Internacional No. WO 01/00244
LITERATURAS DE NÃO PATENTE
[00019] [Literatura de Não Patente 1] Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
[00020] [Literatura de Não Patente 2] Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
[00021] [Literatura de Não Patente 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
[00022] [Literatura de Não Patente 4] Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
[00023] [Literatura de Não Patente 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
[00024] [Literatura de Não Patente 6] Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782.
[00025] [Literatura de Não Patente 7] Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.
[00026] [Literatura de Não Patente 8] Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
[00027] [Literatura de Não Patente 9] Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. (1998) 42, 210-220.
[00028] [Literatura de Não Patente 10] De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
[00029] [Literatura de Não Patente 11] Inoue, K. et al., Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003) 145-153.
[00030] [Literatura de Não Patente 12] Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175.
[00031] [Literatura de Não Patente 13] Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
[00032] [Literatura de Não Patente 14] Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
[00033] [Literatura de Não Patente 15] Coussens L, et al., Science. 1985; 230(4730):1132-1139.
[00034] [Literatura de Não Patente 16] Graus-Porta G, et al., EMBO J. 1997;16;1647-1655.
[00035] [Literatura de Não Patente 17] Karnagaran D, et al., EMBO J. 1996;15:254-264.
[00036] [Literatura de Não Patente 18] Sliwkowski MX, et al.,J. Biol. Chem. 1994; 269:14661-14665.
[00037] [Literatura de Não Patente 19]Di Fore PP, et al., Science. 1987; 237:178-182.
[00038] [Literatura de Não Patente 20] Hudziak RM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84:7159-7163.
[00039] [Literatura de Não Patente 21] Hardwick R, et al., Eur. J Surg Oncol. 1997 (23): 30-35.
[00040] [Literatura de Não Patente 22] Korkaya H, et al., Oncogene. 2008; 27(47): 6120-6130.
[00041] [Literatura de Não Patente 23] Yano T, et al., Oncol Rep. 2006; 15(1):65-71.
[00042] [Literatura de Não Patente 24] Slamon DJ, et al., Science. 1987;235:177-182.
[00043] [Literatura de Não Patente 25] Gravalos C, et al., Ann Oncol 19: 1523-1529, 2008.
[00044] [Literatura de Não Patente 26] Fukushige S, et al., Mol Cell Biol 6: 955-958, 1986.
[00045] [Literatura de Não Patente 27] Slamon DJ, et al. Science. 1989; 244:707-712.
[00046] [Literatura de Não Patente 28] Kaptain S et al., Diagn Mol Pathol 10:139-152, 2001.
[00047] [Literatura de Não Patente 29] Fendly. et al., Cancer Research1990(50):1550-1558.
[00048] [Literatura de Não Patente 30] Sliwkowski MX, et al., Semin Oncol. 1999; 26(4, Suppl 12):60-70.
[00049] [Literatura de Não Patente 31] Hudis CA, et al., N Engl J Med. 357: 39-51, 2007.
[00050] [Literatura de Não Patente 32] Vogel CL, et al., J Clin Oncol. 2002; 20(3):719-726.
[00051] [Literatura de Não Patente 33] Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996).
[00052] [Literatura de Não Patente 34] Howard A. et al., J Clin Oncol 2011; 29:398-405.
[00053] [Literatura de Não Patente 35] Adams CW, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 6:717-727.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[00054] Com respeito ao tratamento de tumores por anticorpos, um efeito antitumor insuficiente pode ser observado até mesmo quando o anticorpo reconhece um antígeno para ligar-se a células de tumor, e há casos em que um anticorpo antitumor mais efetivo é necessário. Além disso, muitos compostos de baixo peso molecular antitumor têm problemas de segurança como efeitos colaterais e toxicidade até mesmo se os compostos tiverem um efeito antitumor excelente. Permaneceu um objetivo alcançar um efeito terapêutico superior realçando-se também a segurança. Desse modo, um objetivo da presente invenção é fornecer um fármaco antitumor tendo um efeito terapêutico excelente que é excelente em termos de efeito antitumor e segurança.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA
[00055] Os inventores consideraram que um anticorpo anti-HER2 é um anticorpo que é capaz de alvejar células de tumor, isto é, tendo uma propriedade de reconhecer células de tumor, uma propriedade de ligar a células de tumor, uma propriedade de interiorizar dentro das células de tumor, uma atividade citotóxica contra células de tumor, uma atividade citocida contra células de tumor, ou similares; desse modo, quando o composto antitumor exatecana é convertido em um conjugado de anticorpo-fármaco, por meio de uma porção de estrutura de ligante, por conjugação a este anticorpo, o composto antitumor pode ser mais seguramente liberado a células de tumor para especificamente exibir o efeito antitumor do composto em células de tumor, e desse modo o efeito antitumor pode ser seguramente exibido e da mesma forma um efeito citocida realçado do anticorpo anti-HER2 pode ser esperado, e a dose do composto antitumor pode ser reduzida em comparação ao caso de administrar o composto sozinho, e desse modo influências do composto antitumor sobre células normais podem ser aliviado de forma que uma segurança mais alta possa ser obtida.
[00056] A este respeito, os inventores criaram um ligante com uma estrutura específica e tiveram sucesso na obtenção de um conjugado de anticorpo-fármaco em que o anticorpo anti-HER2 e exatecana são conjugados um ao outro por meio do ligante, e confirmaram um efeito antitumor excelente exibido pelo conjugado para desse modo completar a presente invenção.
[00057] Especificamente, a presente invenção refere-se aos seguintes.
[00058] [1] um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela seguinte fórmula: Fórmula 2
Figure img0002
[00059] é conjugado a um anticorpo anti-HER2 por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela seguinte fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
[00060] por meio de uma ligação de tioéter que é formada em uma porção de ligação de dissulfeto presente na parte da articulação do anticorpo anti-HER2.
[00061] Aqui, o anticorpo anti-HER2 é conectado ao terminal L1,
[00062] o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção -(CH2)n2-C(=O)- com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como a posição de conexão,
[00063] em que
[00064] n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[00065] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[00066] L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-,
[00067] em que n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[00068] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[00069] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[00070] LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos,
[00071] La representa -O- ou uma ligação simples, e
[00072] -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 3
Figure img0003
[00073] que é conectada ao anticorpo anti-HER2 na posição 3 do mesmo e é conectada ao grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1.
[00074] A presente invenção refere-se também a cada dos seguintes.
[00075] [2] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que o resíduo de peptídeo LP é um resíduo de peptídeo compreendendo um aminoácido selecionado a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico.
[00076] [3] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que LP é um resíduo de peptídeo selecionado a partir do seguinte grupo: -GGF-, -DGGF-, -(D-)D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, e -GGFGGGF-; em que "(D-)D" representa ácido D-aspártico.
[00077] [4] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos.
[00078] [5] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que LP é o resíduo de tetrapeptídeo - GGFG-.
[00079] [6] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, e L2 é uma ligação simples.
[00080] [7] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, e n4 é 2 ou 4.
[00081] [8] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [7], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos.
[00082] [9] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [7], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.
[00083] [10] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é - NH-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, ou - NH-CH2CH2-O-C(=O)-.
[00084] [11] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[00085] [12] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que a porção da estrutura de fármaco- ligante tendo o fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00086] em que -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 4
Figure img0004
[00087] que é conectada ao anticorpo anti-HER2 na posição 3 do mesmo e é conectada ao grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(NH-DX) representa um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 5
Figure img0005
[00088] em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão, e -GGFG- representa o resíduo de tetrapeptídeo -Gly-Gly- Phe-Gly -.
[00089] [13] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que a porção da estrutura de fármaco- ligante tendo o fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00090] Aqui, -(Succinimid-3-il-N)-, -(NH-DX), e -GGFG- é como definido acima.
[00091] [14] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela seguinte fórmula: Fórmula 6
Figure img0006
[00092] é conjugado a um anticorpo anti-HER2 por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela seguinte fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
[00093] por meio de uma ligação de tioéter que é formada em uma porção de ligação de dissulfeto presente na parte da articulação do anticorpo anti-HER2,
[00094] em que
[00095] o anticorpo anti-HER2 é conectado ao terminal L1, o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção - (CH2)n2-C(=O)-,
[00096] em que
[00097] n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[00098] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[00099] L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-,
[000100] em que n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[000101] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[000102] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[000103] LP representa o resíduo de tetrapeptídeo -GGFG-,
[000104] La representa -O- ou uma ligação simples, e
[000105] -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 7
Figure img0007
[000106] que é conectada ao anticorpo anti-HER2 na posição 3 do mesmo e é conectada ao grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1.
[000107] [15] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14], em que
[000108] n1 é 3, n2 é 0, n3 é 2, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2- C(=O)-, n4 é 2, e La é uma ligação simples,
[000109] n1 é 1, n2 é 1, n3 é 5, L2 é uma ligação simples, e La é -O-, ou
[000110] n1 é 2, n2 é 1, n3 é 5, L2 é uma ligação simples, e La é -O-.
[000111] [16] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14] ou [15], em que n3 é 2 ou 5, e L2 é uma ligação simples.
[000112] [17] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14] ou [15], em que n3 é 2 ou 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, e n4 é 2 ou 4.
[000113] [18] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [14] a [17], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[000114] [19] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [14] a [18], em que a porção da estrutura de fármaco- ligante tendo o fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do grupo consistindo no seguinte: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[000115] em que, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 8
Figure img0008
[000116] que é conectada ao anticorpo anti-HER2 na posição 3 do mesmo e é conectada ao grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(NH-DX) representa um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 9
Figure img0009
[000117] em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a porção de conexão, e -GGFG- representa o resíduo de tetrapeptídeo -Gly-Gly- Phe-Gly -.
[000118] [20] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [14] a [18], em que a porção da estrutura de fármaco- ligante tendo o fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[000119] Aqui, -(Succinimid-3-il-N)-, -(NH-DX), e -GGFG- são como definido acima.
[000120] [21] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [20], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 1 a 10.
[000121] [22] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [20], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 2 a 8.
[000122] [23] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [20], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 3 a 8.
[000123] [24] Um fármaco contendo o conjugado de anticorpo- fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[000124] [25] Um fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer contendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[000125] [26] O fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer de acordo com [25], que é para uso contra câncer de pulmão, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, câncer de cerviz uterino, câncer esofágico, carcinoma de célula escamosa, câncer peritoneal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer uterino, câncer da glândula salival, câncer renal, câncer vulvar, câncer da tireoide, câncer de pênis, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma, ou sarcoma.
[000126] [27] Uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo como um componente ativo, e um componente de formulação farmaceuticamente aceitável.
[000127] [28] A composição farmacêutica de acordo com [27] que é para uso contra câncer de pulmão, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, câncer de cerviz uterino, câncer esofágico, carcinoma de célula escamosa, câncer peritoneal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer uterino, câncer da glândula salival, câncer renal, câncer vulvar, câncer da tireoide, câncer de pênis, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma, ou sarcoma.
[000128] [29] Um método para tratar tumor e/ou câncer compreendendo administrar o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[000129] [30] Um método para produzir um conjugado de anticorpo- fármaco compreendendo reagir um composto representado pela seguinte fórmula: (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)-(NH-DX)
[000130] com um anticorpo anti-HER2 ou um derivado reativo do mesmo e conjugando uma porção de fármaco-ligante para o anticorpo por um método para formar uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de dissulfeto presente na parte da articulação do anticorpo.
[000131] Na fórmula, n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[000132] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[000133] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[000134] LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos selecionados a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico,
[000135] n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[000136] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[000137] La representa -O- ou uma ligação simples,
[000138] (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 10
Figure img0010
[000139] em que o átomo de nitrogênio é a porção de conexão, e
[000140] -(NH-DX) é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 11
Figure img0011
[000141] em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão.
[000142] [31] O método de produção de acordo com [30], em que o método para conjugar uma porção de fármaco-ligante a um anticorpo anti-HER2 é um método de reduzir o anticorpo para converter o anticorpo a um derivado reativo.
[000143] [32] O método de produção de acordo com [30] ou [31], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 1 a 10.
[000144] [33] O método de produção de acordo com [30] ou [31], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 2 a 8.
[000145] [34] O método de produção de acordo com [30] ou [31], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 3 a 8.
[000146] [35] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido pelo método de produção de acordo com qualquer de [30] a [34].
[000147] [36] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido formando- se uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de sulfeto na parte da articulação do anticorpo em que o anticorpo anti-HER2 é tratado em uma condição de redução e depois disso reagido com um composto selecionado a partir do grupo mostrado abaixo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX).
[000148] No anterior, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 12
Figure img0012
[000149] em que o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e
[000150] -(NH-DX) é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 13
Figure img0013
[000151] em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão, e
[000152] -GGFG- representa o resíduo de tetrapeptídeo -Gly-Gly- Phe-Gly -.
[000153] [37] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido formando- se uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de sulfeto presente na parte da articulação do anticorpo em que o anticorpo anti-HER2 é tratado em uma condição de redução e depois disso reagido com um composto selecionado a partir do grupo mostrado abaixo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[000154] Aqui, (maleimid-N-il)-, -(NH-DX), e -GGFG- é como definido acima.
[000155] [38] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [36] ou [37], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 1 a 10.
[000156] [39] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [36] ou [37], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 2 a 8.
[000157] [40] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [36] ou [37], em que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por molécula de anticorpo está na faixa de 3 a 8.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[000158] Com um conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 tendo o composto antitumor exatecana conjugado por meio de um ligante com uma estrutura específica, um excelente efeito antitumor e segurança podem ser obtidos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[000159] Figura 1 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada de um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado (SEQ ID NO: 1).
[000160] Figura 2 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado (SEQ ID NO: 2).
[000161] Figura 3 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (27) ou trastuzumabe em um camundongo nu com células KPL-4 de linhagem de câncer de mama humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume de tumor.
[000162] Figura 4 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (8), (28) ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células NCI-N87de linhagem de câncer gástrico humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000163] Figura 5 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (8), (29), (30), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células JIMT-1de linhagem de câncer de mama humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000164] Figura 6 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (31), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células Capan-1 de linhagem de câncer pancreático humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000165] Figura 7 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50) em um camundongo nu com células NCI-N87 de linhagem de câncer gástrico humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000166] Figura 8 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células ST225 de câncer de mama humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000167] Figura 9 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células ST910 de câncer de mama humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000168] Figura 10 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células CTG-0401de linhagem de câncer colorretal humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000169] Figura 11 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células CTG-0860 de câncer de pulmão de células não pequenas humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000170] Figura 12 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células CTG-0927 de linhagem de câncer do ducto de bílis humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000171] Figura 13 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células CTG-0137 de linhagem de câncer esofágico humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
[000172] Figura 14 é um diagrama exibindo o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina em um camundongo nu com células SK-OV-3 de linhagem de câncer ovariano humano subcutaneamente transplantadas. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES
[000173] Em seguida, modos preferidos para realizar a presente invenção são descritos com referência aos desenhos. As modalidades descritas abaixo são dadas somente para ilustrar um exemplo de uma modalidade típica da presente invenção e não são destinadas a limitar o escopo da presente invenção.
[000174] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção é um fármaco antitumor no qual um anticorpo anti-HER2 é conjugado a um composto antitumor por meio de uma porção de estrutura de ligante e é explicado a seguir em detalhes.
ANTICORPO
[000175] O anticorpo anti-HER2 usado no conjugado de anticorpo- fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser derivado a partir de qualquer espécie, e exemplos preferidos das espécies podem incluir os seres humanos, ratos, camundongos, e coelhos. No caso de quando o anticorpo é derivado de diferentes espécies humanas, é preferivelmente quimerizado ou humanizado usando uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal e é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[000176] O anticorpo anti-HER2 é o anticorpo que é capaz de alvejar células de tumor, isto é, possui uma propriedade de reconhecer uma célula de tumor, uma propriedade de ligar a uma célula de tumor, uma propriedade de internalizar em uma célula de tumor, atividade citocida contra células de tumor, ou similares, e pode ser conjugado com um fármaco tendo atividade antitumor por meio de um ligante para formar um conjugado de anticorpo-fármaco.
[000177] A atividade de ligação do anticorpo contra células de tumor pode ser confirmada usando citometria de fluxo. A internalização do anticorpo em células de tumor pode ser confirmada usando (1) um ensaio de visualização de um anticorpo incorporado em células sob um microscópio de fluorescência usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando-se ao anticorpo terapêutico (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) um ensaio de medição da intensidade de fluorescência incorporada em células usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando- se ao anticorpo terapêutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004), ou (3) um ensaio de Mab-ZAP usando uma imunotoxina ligando-se ao anticorpo terapêutico onde na toxina é liberado na incorporação em células para inibir o crescimento da célula (Bio Techniques 28:162-165, January 2000). Como a imunotoxina, uma proteína complexa recombinante de um domínio catalítico de toxina de difteria e proteína G pode ser usada.
[000178] A atividade antitumor do anticorpo pode ser confirmada in vitro determinando-se a atividade inibidora contra o crescimento da célula. Por exemplo, uma linhagem de célula cancerosa superexpressando uma proteína alvo para o anticorpo é cultivada, e o anticorpo é adicionado em concentrações variadas no sistema de cultura para determinar uma atividade inibidora contra a formação de foco, formação de colônia, e crescimento esferoide. A atividade antitumor pode ser confirmada in vivo, por exemplo, administrando-se o anticorpo a um camundongo nu com uma linhagem de célula de tumor transplantada altamente expressando a proteína alvo, e determinando a alteração na célula cancerosa.
[000179] Visto que o composto conjugado no conjugado de anticorpo-fármaco mostra um efeito antitumor, é preferido, porém, não essencial que o próprio anticorpo deveria ter um efeito antitumor. Com a finalidade de especificamente e seletivamente mostrar a atividade citotóxica do composto antitumor contra células de tumor, é importante e da mesma forma preferido que o anticorpo deva ter a propriedade de internalização para migrar em células de tumor.
[000180] O anticorpo anti-HER2 pode ser obtido por um procedimento conhecido na técnica. Por exemplo, o anticorpo da presente invenção pode ser obtido usando um método normalmente realizado na técnica, que envolve imunizar os animais com um polipeptídeo antigênico e coletar e purificar anticorpos produzidos in vivo. A origem do antígeno não está limitada a humanos, e os animais podem ser imunizados com um antígeno derivado de um animal não humano tal como um camundongo, um rato e similares. Neste caso, a reatividade cruzada de anticorpos ligando-se ao antígeno heterólogo obtido com antígenos seres humanos pode ser testada para avaliar um anticorpo aplicável a uma doença humana.
[000181] Alternativamente, células produtoras de anticorpo que produzem anticorpos contra o antígeno são fundidas com células de mieloma de acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; e Kennet, R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) para estabelecer hibridomas, dos quais os anticorpos monoclonais podem por sua vez ser obtidos.
[000182] O antígeno pode ser obtido criando geneticamente as células hospedeiras para produzir um gene codificando a proteína antigênica. Especificamente, vetores que permitem a expressão do gene de antígeno são preparados e transferidos às células hospedeiras de forma que o gene seja expresso. O antígeno desse modo expresso pode ser purificado. O anticorpo pode da mesma forma ser obtido por um método de imunizar animais com as células de expressão de antígeno geneticamente criadas acima descrito ou uma linhagem celular expressando o antígeno.
[000183] Os anticorpos anti-HER2 que podem ser usados na presente invenção não estão particularmente limitados e são preferivelmente, por exemplo, aqueles tendo propriedades como descrito abaixo.
[000184] (1) Um anticorpo anti-HER2 tendo as seguintes propriedades: (a) especificamente ligar-se ao HER2, e (b) ter uma atividade de internalização em células de expressão de HER2 ligando-se ao HER2.
[000185] (2) O anticorpo de acordo com (1) acima, onde o anticorpo liga-se ao domínio extracelular de HER2.
[000186] (3) O anticorpo de acordo com (1) ou (2) acima, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[000187] (4) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (3) acima, em que o anticorpo tem uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). e/ou uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[000188] (5) O anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (4) acima, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo monoclonal quimérico, ou um anticorpo monoclonal humanizado.
[000189] (6) O anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (5) acima, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado compreendendo uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2.
[000190] (7) O anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (6) acima, onde o anticorpo necessita de um resíduo de lisina no terminal carboxila da cadeia pesada.
[000191] (8) O anticorpo de acordo com (7) acima, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 449 de SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 214 de SEQ ID NO: 2.
[000192] (9) Um anticorpo obtido por um método para produzir o anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (8) acima, o método compreendendo as etapas de: cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo; e coletar o anticorpo de interesse a partir das culturas obtidas na etapa precedente.
[000193] Em seguida, o anticorpo anti-HER2 usado na invenção é descrito.
[000194] Os termos "câncer" e "tumor" quando aqui usado são usados com o mesmo significado.
[000195] O termo "gene" quando aqui usado não só inclui o DNA, porém da mesma forma o mRNA do mesmo, cDNA do mesmo e cRNA do mesmo.
[000196] O termo "polinucleotídeo" quando aqui usado é usado com o mesmo significado como um ácido nucleico e da mesma forma inclui o DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos, e iniciadores.
[000197] Os termos "polipeptídeo", "proteína" e "proteína" quando aqui usados são usado sem distinção.
[000198] O termo "célula" quando aqui usado da mesma forma inclui células em um indivíduo animal e células cultivadas.
[000199] O termo "HER2" quando aqui usado é usado com o mesmo significado como proteína de HER2.
[000200] Exemplos do anticorpo anti-HER2 quando aqui usado pode incluir, porém, não particularmente limitados a, pertuzumabe (Publicação de Patente Internacional No. WO 01/00245) e trastuzumabe (Patente U.S. No. 5821337). Trastuzumabe é preferido. Entretanto, o anticorpo anti-HER2 da presente invenção não está limitado a isto contanto que seja um anticorpo anti-HER2 que especificamente ligando HER2, e tendo mais preferivelmente uma atividade de internalização em células de expressão de HER2 ligando- se a HER2.
[000201] O termo "trastuzumab" quando aqui usado é da mesma forma chamado HERCEPTIN®), huMAb4D5-8, ou rhuMAb4D5-8 e é um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 449 de SEQ ID NO: 1 (Figura 1) e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 214 de SEQ ID NO: 2 (Figura 2).
[000202] O termo "especificamente ligando" quando aqui usado significa a ligação que não é adsorção não específica. Exemplos do critério para determinar se a ligação é específica ou não podem incluir a constante de dissociação (em seguida referida como "KD"). O valor de KD do anticorpo para a proteína de HER2 é preferivelmente 1 x 10-5 M ou menor, 5 x 10-6 M ou menor, 2 x 10-6 M ou menor, ou 1 x 10-6 M ou menor, mais preferivelmente 5 x 10-7 M ou menor, 2 x 10-7 M ou menor, ou 1 x 10-7 M ou menor, também preferivelmente 5 x 10-8 M ou menor, 2 x 10-8 M ou menor, ou 1 x 10-8 M ou menor, e ainda mais preferivelmente 5 x 10-9 M ou menor, 2 x 10-9 M ou menor, ou 1 x 10-9 M ou menor. A ligação entre a proteína de HER2 e o anticorpo pode ser medida usando um método conhecido na técnica, tal como ressonância de plásmon superficial, ELISA, ou RIA.
[000203] O termo "CDR" quando aqui usado refere-se a uma região de determinação de complementaridade (CDR). Sabe-se que cada cadeia pesada e leve de uma molécula de anticorpo tem três regiões de determinação de complementaridade (CDRs). A CDR é da mesma forma chamada de domínio hipervariável, e está presente em uma região variável de cada cadeia pesada e leve de um anticorpo. É um sítio que tem variabilidade extraordinariamente alta em sua estrutura primária, e há três CDRs separadas na estrutura primária de cada cadeia de polipeptídeo pesada e leve. Nesta especificação, de acordo com as CDRs de um anticorpo, as CDRs da cadeia pesada são representadas por CDRH1, CDRH2, e CDRH3 do lado amino-terminal da sequência de aminoácido da cadeia pesada, e as CDRs da cadeia leve são representadas por CDRL1, CDRL2, e CDRL3 a partir do lado amino-terminal da sequência de aminoácido da cadeia leve. Estes sítios são próximos entre si na estrutura terciária e determinam a especificidade para um antígeno ao qual o anticorpo liga-se.
[000204] A frase "hibridização é realizada sob condições estritas" quando aqui usado refere-se a um processo em que a hibridização é realizada sob condições sob as quais a identificação pode ser obtido realizando-se a hibridização a 68oC em uma solução de hibridização comercialmente disponível ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) ou realizando-se a hibridização a 68oC na presença de 0,7 a 1,0 M de NaCl usando um filtro tendo DNA imobilizado nisto, seguido realizando-se a lavagem a 68oC usando solução de 0,1 a 2 x de SSC (solução de 1 x de SSC é composta de 150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio) ou sob condições equivalente a isto.
1. HER2
[000205] HER2 é um dos produtos de oncogene de um oncogene do receptor do fator de crescimento típico como oncogene relacionado ao receptor do fator de crescimento celular epidérico humano 2, e é uma proteína do receptor de transmembrana tendo um peso molecular de 185 kDa e tendo um domínio de tirosina cinase. HER2 é um membro da família de EGFR consistindo em HER1 (EGFR, ErbB-1), HER2 (neu, ErbB-2), HER3 (ErbB-3), e HER4 (ErbB-4) e é conhecido ser autofosforilado em resíduos de tirosina intracelulares por sua formação de homodímero ou formação de heterodímero com outro receptor de EGFR HER1, HER3, ou HER4 e é por si mesmo ativado daquela maneira, desse modo desempenhando um papel importante no crescimento de célula, diferenciação, e sobrevivência em células normais e células de tumor.
[000206] Quanto à proteína de HER2 a ser usada na presente invenção, a proteína de HER2 pode ser purificada diretamente a partir de células de expressão de HER2 de um mamífero humano ou um não humano (tal como um rato ou um camundongo) e usada, ou uma fração de membrana celular das células acima descrita pode ser preparada e usada. Além disso, HER2 pode ser obtido por síntese in vitro do mesmo ou produção do mesmo em uma célula hospedeira por engenharia genética. Na engenharia genética, especificamente, depois que cDNA de HER2 é integrado em um vetor capaz de expressar cDNA de HER2, a proteína de HER2 pode ser obtida sintetizando-se em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para transcrição e translação, ou expressando-se HER2 em outra célula hospedeira transformada procariótica ou eucariótica. Alternativamente, as células de expressão de HER2 geneticamente criadas acima descrito, ou uma linhagem celular expressando HER2 podem ser usadas como a proteína de HER2.
[000207] A sequência de DNA e sequência de aminoácido de HER2 são descritas em uma base de dados público, e pode se referir, por exemplo, sob No. de Acesso M11730 (GenBank), NP_004439.2 (NCBI), ou similares.
[000208] Além disso, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido em que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados e/ou adicionados em quaisquer das sequências de aminoácido acima descritas de HER2 e da mesma forma têm uma atividade biológica equivalente àquela da proteína é da mesma forma incluída em HER2.
[000209] Proteína de HER2 humana é composta de uma sequência de sinal consistindo em 22 resíduos de aminoácido N-terminais, um domínio extracelular consistindo em 630 resíduos de aminoácido, um domínio de transmembrana consistindo em 23 resíduos de aminoácido, e um domínio intracelular consistindo em 580 resíduos de aminoácido.
2. Produção de anticorpo anti-HER2
[000210] O anticorpo contra HER2 da presente invenção pode ser obtido de acordo com, por exemplo, um método normalmente realizado na técnica, que envolve imunizar animais com HER2 ou um polipeptídeo arbitrário selecionado a partir da sequência de aminoácido de HER2 e coletar e purificar anticorpos produzidos in vivo. As espécies biológicas de HER2 a ser usadas como um antígeno não estão limitadas a ser humano, e um animal pode ser imunizado com HER2 derivado de um animal diferente de humanos tal como um camundongo ou um rato ou com p185neu de rato. Neste caso, examinando-se a reatividade cruzada entre um anticorpo que liga-se ao HER2 heterólogo obtido e HER2 humano, um anticorpo aplicável a uma doença humana pode ser selecionado.
[000211] Além disso, um anticorpo monoclonal pode ser obtido a partir de um hibridoma estabelecido fundindo-se as células produtoras de anticorpo que produzem um anticorpo contra HER2 com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y.(1980)).
[000212] HER2 a ser usado como um antígeno pode ser obtido expressando-se o gene de HER2 em uma célula hospedeira usando a engenharia genética.
[000213] Especificamente, um vetor capaz de expressar o gene de HER2 é produzido, e o vetor resultante é transfectado em uma célula hospedeira para expressar o gene, e em seguida, o HER2 expresso é purificado.
[000214] Alternativamente, as células de experssão de HER2 geneticamente criadas acima descritas, ou uma linhagem celular expressando HER2 pode ser usada como a proteína de HER2. O anticorpo anti-HER2 pode ser obtido por um procedimento conhecido na técnica. A seguir, um método de obter um anticorpo contra HER2 é especificamente descrito. (1) Preparação de antígeno
[000215] Exemplos do antígeno a ser usado para produzir o anticorpo anti-HER2 incluem HER2, ou um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido parcial compreendendo pelo menos 6 aminoácidos sucessivos de HER2, ou um derivado obtido adicionando-se uma determinada sequência de aminoácido ou veículo a isto.
[000216] HER2 pode ser purificado diretamente a partir de tecidos de tumor humanos ou células de tumor e usado. Além disso, HER2 pode ser obtido sintetizando-o in vitro ou produzindo-o em uma célula hospedeira por engenharia genética.
[000217] Com respeito à engenharia genética, especificamente, depois que o cDNA de HER2 é integrado em um vetor capaz de expressar o cDNA de HER2, HER2 pode ser obtido sintetizando-o em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para transcrição e translação, ou expressando-se HER2 em outra célula hospedeira transformada procariótica ou eucariótica.
[000218] Além disso, o antígeno pode da mesma forma ser obtido como uma proteína secretora expressando-se uma proteína de fusão obtida ligando-se o domínio extracelular de HER2 que é uma proteína de membrana, à região constante de um anticorpo em um sistema de hospedeiro-vetor apropriado.
[000219] cDNA de HER2 pode ser obtido, por exemplo, por um assim chamado método de PCR no qual uma reação de cadeia de polimerase é realizado usando-se uma biblioteca de cDNA expressando o cDNA de HER2 como um padrão e iniciadores que especificamente amplificam o cDNA de HER2 (PCR; Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).
[000220] Como a síntese in vitro do polipeptídeo, por exemplo, Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc. pode ser exemplificado, porém não está limitado a isto.
[000221] Exemplos das células hospedeiras procarióticas incluem Escherichia coli e Bacillus subtilis. Para transformar as células hospedeiras com um gene alvo, as células hospedeiras são transformadas por um vetor de plasmídeo compreendendo um réplicon, isto é, uma origem de replicação derivada de uma espécie compatível com o hospedeiro, e uma sequência reguladora. Além disso, o vetor tem preferivelmente uma sequência capaz de impor a seletividade fenotípica na célula transformada.
[000222] Exemplos das células hospedeiras eucarióticas incluem células vertebradas, células de inseto, e células de levedura. Como as células vertebradas, por exemplo, células COS de símio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCCCRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC No. CRL- 1658), e cepas deficientes de di-hidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células ovarianas de hamster chinês (células CHO; ATCC: CCL-61); e similares são frequentemente usadas, entretanto, as células não estão limitadas a isto.
[000223] O transformante desse modo obtido pode ser cultivado de acordo com um método normalmente realizado na técnica, e pelo cultivo do transformante, um polipeptídeo alvo é produzido intracelularmente ou extracelularmente.
[000224] Um meio adequado a ser usado para o cultivo pode ser selecionado a partir de várias meios de cultura geralmente usados dependendo das células hospedeiras empregadas. Se Escherichia coli é empregado, por exemplo, um meio de LB suplementado com um antibiótico tal como ampicilina ou IPMG quando necessário pode ser usado.
[000225] Uma proteína recombinante produzida intracelularmente ou extracelularmente pelo transformante por tal cultivo pode ser separada e purificada por quaisquer dos vários métodos de separação conhecidos utilizando a propriedade física ou química da proteína.
[000226] Exemplos específicos dos métodos incluem o tratamento com um precipitante de proteína comum, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia líquida tal como cromatografia de peneira molecular (filtração de gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca de íons, e cromatografia de afinidade, diálise, e uma combinação dos mesmos.
[000227] Além disso, unindo-se um rótulo de seis resíduos de histidina a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser purificada efetivamente com uma coluna de afinidade de níquel. Alternativamente, unindo-se a região de Fc de IgG a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser purificada efetivamente com uma coluna de proteína A.
[000228] Combinando-se os métodos acima descritos, uma quantidade grande de um polipeptídeo alvo pode ser produzida facilmente em um rendimento alto e pureza alta.
[000229] O próprio transformante acima descrito pode ser usado como o antígeno. Uma linhagem celular expressando HER2 pode da mesma forma ser usada como o antígeno. Exemplos de uma tal linhagem celular podem incluir linhagnes de câncer de mama humano SK-BR-3, BT-474, KPL-4, e JIMT-1, uma linhagem de câncer gástrico humano NCI-N87, e uma linhagem de câncer ovariano humano SK- OV-3. A linhagem celular da presente invenção não está limitada a estas linhagens celulares contanto que expresse HER2. (2) Produção de anticorpo monoclonal anti-HER2
[000230] Exemplos do anticorpo que especificamente liga-se ao HER2 incluem um anticorpo monoclonal que especificamente liga-se ao HER2, e um método de obter tal anticorpo é como descrito abaixo.
[000231] A produção de um anticorpo monoclonal geralmente requer as seguintes etapas operacionais de: (a) purificar um biopolímero a ser usado como um antígeno, ou preparar as células de expressão de antígeno; (b) preparar as células produtoras de anticorpo imunizando- se um animal por injeção do antígeno, coletar o sangue, analisar seu título de anticorpo para determinar quando o baço é cortado; (c) preparar as células de mieloma (em seguida referidas como "mieloma"); (d) fundir as células produtoras de anticorpo com o mieloma; (e) avaliar um grupo de hibridomas produzindo um anticorpo desejado; (f) dividir os hibridomas em clones de célula isolada (clonagem); (g) opcionalmente, cultivar o hibridoma ou criar um animal implantado com o hibridoma para produzir uma quantidade grande de anticorpo monoclonal; (h) examinar o anticorpo monoclonal desse modo produzido para atividade biológica e especificidade de ligação, ou analisar o mesmo quanto a propriedades como um reagente rotulado; e similares.
[000232] Em seguida, o método de produzir um anticorpo monoclonal será descrito em detalhes seguindo as etapas anteriores, entretanto, o método não está limitado a estas, e, por exemplo, as células produtoras de anticorpo diferentes das células de baço e mieloma podem ser usadas. (i) Purificação de antígeno
[000233] Como o antígeno, HER2 preparado pelo método como descrito acima ou um peptídeo parcial do mesmo pode ser usado.
[000234] Além disso, uma fração de membrana preparada a partir de células recombinantes expressando HER2 ou as células recombinantes expressando HER2 por si próprias, e da mesma forma um peptídeo parcial da proteína da invenção quimicamente sintetizado por um método conhecido por aqueles versados na técnica pode da mesma forma ser usado como o antígeno.
[000235] Além disso, uma linhagem celular de expressão de HER2 pode da mesma forma ser usada como o antígeno. (j) Preparação de células produtoras de anticorpo
[000236] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante tal como o adjuvante completo ou incompleto de Freund ou agente auxiliar tal como sulfato de potássio de alumínio e a mistura resultante é usada como um imunógeno para imunizar um animal experimental. Outro método envolve imunizar um animal experimental com as células de expressão de antígeno como um imunógeno. Como o animal experimental, qualquer animal usado em um método de produção de hibridoma conhecido pode ser usado sem impedimento. Especificamente, por exemplo, um camundongo, um rato, uma cabra, ovelha, gado, um cavalo, ou similares podem ser usados. Entretanto, a partir do ponto de vista da facilidade de disponibilidade de células de mieloma a ser fundidas com as células produtoras de anticorpo, um camundongo ou um rato é preferivelmente usado como o animal a ser imunizado.
[000237] Além disso, a cepa de um camundongo ou um rato a ser usado não está limitada particularmente, e no caso de um camundongo, por exemplo, várias cepas tais como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, e 129 e similares podem ser usadas, e no caso de um rato, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer e similares podem ser usados.
[000238] Estes camundongos e ratos estão comercialmente disponíveis a partir de criadores/distribuidores de animais experimentais, por exemplo, CLEA Japan, Inc. e Charles River Laboratories Japan, Inc.
[000239] Como o animal a ser imunizado, em atenção à compatibilidade da fusão com células de mieloma descritas abaixo, no caso de um camundongo, a cepa de BALB/c, e no caso de um rato, cepas de Wistar e Low são particularmente preferidas.
[000240] Além disso, em atenção à homologia antigênica entre os seres humanos e camundongos, é da mesma forma preferido usar um camundongo tendo a função biológica diminuída para remover autoanticorpos, isto é, um camundongo com uma doença autoimune.
[000241] A idade de tal camundongo ou rato no momento da imunização é preferivelmente 5 a 12 semanas de idade, mais preferivelmente 6 a 8 semanas de idade.
[000242] Para imunizar um animal com HER2 ou um recombinante do mesmo, por exemplo, um método conhecido descrito em detalhes em, por exemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ou similares pode ser usado.
[000243] Entre estes métodos de imunização, um método específico preferido na presente invenção é, por exemplo, como segue.
[000244] Isto é, primeiro, uma fração de proteína de membrana que serve como o antígeno ou células causadas para expressar o antígeno é/são intradermicamente ou intraperitonealmente administrada(s) a um animal. Entretanto, a combinação de ambas as rotinas de administração é preferida para aumentar a eficiência de imunização, e quando a administração intradérmica é realizada na última metade ou apenas na última dosagem, a eficiência de imunização pode ser particularmente aumentada.
[000245] O horário de administração do antígeno varia, dependendo do tipo de animal a ser imunizado, diferença individual ou similares. Entretanto, em geral, um horário de administração no qual a frequência de administração do antígeno é 3 a 6 vezes e o intervalo de dosagem é 2 a 6 semanas é preferido, e um horário de administração em que a frequência de administração do antígeno é 3 a 4 vezes e o intervalo de dosagem é 2 a 4 semanas é mais preferido.
[000246] Além disso, a dose do antígeno varia, dependendo do tipo de animal, diferenças individuais ou similares, entretanto, a dose geralmente é fixada em 0,05 a 5 mg, preferivelmente cerca de 0,1 a 0,5 mg.
[000247] Uma imunização de reforço é realizada 1 a 6 semanas, preferivelmente 1 a 4 semanas, mais preferivelmente 1 a 3 semanas depois da administração do antígeno como descrito acima. Quando o imunógeno é as células, 1 x 106 a 1 x 107 células são usadas.
[000248] A dose do antígeno no momento de realizar a imunização de reforço varia dependendo do tipo ou tamanho de animal ou similares, entretanto, no caso de, por exemplo, um camundongo, a dose geralmente é fixada em 0,05 a 5 mg, preferivelmente 0,1 a 0,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a 0,2 mg. Quando o imunógeno é as células, 1 x 106 a 1 x 107 células são usadas.
[000249] Células de baço ou linfócitos incluindo as células produtoras de anticorpo são assepticamente removidas do animal imunizado depois de 1 a 10 dias, preferivelmente 2 a 5 dias, mais preferivelmente 2 a 3 dias da imunização de reforço. Neste momento, o título de anticorpo é medido, e se um animal tendo um título de anticorpo suficientemente aumentado é usado como uma fonte de fornecimento das células produtoras de anticorpo, o procedimento subsequente pode ser realizado mais efetivamente.
[000250] Exemplos do método de medir o título de anticorpo a ser usado aqui incluem um método de RIA e um método de ELISA, porém, o método não está limitado a isto. Por exemplo, se um método de ELISA é empregado, a medida do título de anticorpo na invenção pode ser realizada de acordo com os procedimentos como descrito abaixo.
[000251] Primeiro, um antígeno purificado ou parcialmente purificado é absorvido à superfície de uma fase sólida tal como uma placa de 96 cavidades para ELISA, e a superfície da fase sólida que não tem nenhum antígeno absorvido a isto é revestida com uma proteína não relacionada ao antígeno tal como albumina de soro bovina (BSA). Depois de lavar a superfície, a superfície é trazida em contato com uma amostra serialmente diluída (por exemplo, soro de camundongo) como um anticorpo primário para permitir o anticorpo na amostra ligar- se ao antígeno.
[000252] Além disso, como um anticorpo secundário, um anticorpo rotulado com uma enzima contra um anticorpo de camundongo é adicionado e é permitido ligar-se ao anticorpo de camundongo. Depois de lavar, um substrato para a enzima é adicionado e uma alteração na absorvência que ocorre devido ao desenvolvimento da cor induzido por degradação do substrato ou similares é medida e o título de anticorpo é calculado com base na medida.
[000253] A separação das células produtoras de anticorpo a partir das células de baço ou linfócitos do animal imunizado pode ser realizada de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por exemplo, no caso das células de baço, um método geral em que as células produtoras de anticorpo são separadas homogeneizando-se baço para obter as células por filtração com uma malha de aço inoxidável e suspendendo-se as células em Médio Essencial Mínimo de Eagle (MEM) pode ser empregado. (k) Preparação de células de mieloma (em seguida referidas como "mieloma")
[000254] As células de mieloma a serem usadas para fusão da célula não são limitadas particularmente e as células adequadas podem ser selecionadas a partir de linhagens celulares conhecidas. Entretanto, em atenção à conveniência quando um hibridoma é selecionado a partir de células fundidas, foi preferido usar uma cepa deficiente de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase) cujo procedimento de seleção foi estabelecido.
[000255] Mais especificamente, exemplos da cepa deficiente de HGPRT incluem X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63- Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11- 45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, derivadas de camundongos; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivada de ratos; e U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) e 8226AR/NIP4-1(NP41) derivadas de humanos. Estas cepas deficientes de HGPRT estão disponíveis de, por exemplo, ATCC ou similares.
[000256] Estas cepas de célula são subcultivadas em um meio apropriado tal como um meio de 8-azaguanina [um meio obtido adicionando-se 8-azaguanina a um meio de RPMI1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, e soro de bezerro fetal (em seguida referido como "FCS")], Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (em seguida referido como "IMDM"), ou Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (em seguida referido como "DMEM"). Neste caso, 3 a 4 dias antes de realizar a fusão da célula, as células são subcultivadas em um meio normal (por exemplo, um meio de ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) contendo 10% de FCS) para garantir não menos de 2 x 107 células no dia da fusão celular. (l) Fusão celular
[000257] A fusão entre as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma pode ser realizada adequadamente de acordo com um método conhecido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), sob condições tal que a taxa de sobrevivência das células não é reduzida excessivamente.
[000258] Como um tal método, por exemplo, um método químico no qual as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma são misturadas em uma solução contendo um polímero tal como polietileno glicol em uma concentração alta, um método físico usando a estimulação elétrica, ou similares pode ser usado. Entre estes métodos, um exemplo específico do método químico é como descrito abaixo.
[000259] Isto é, no caso onde o polietileno glicol é usado na solução contendo um polímero em uma concentração alta, as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma são misturadas em uma solução de polietileno glicol tendo um peso molecular de 1500 a 6000, mais preferivelmente 2000 a 4000 a uma temperatura de 30 a 40oC, preferivelmente de 35 a 38oC durante 1 a 10 minutos, preferivelmente 5 a 8 minutos. (m) Seleção de um grupo de hibridomas
[000260] O método de selecionar hibridomas obtidos pela fusão celular acima descrita não está particularmente limitado. Normalmente, um método de seleção de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) é usado.
[000261] Este método é efetivo quando os hibridomas são obtidos usando as células de mieloma de uma cepa deficiente de HGPRT que não pode sobreviver na presença da aminopterina. Isto é, cultivando- se células não fundidas e hibridomas em um meio de HAT, apenas hibridomas resistentes à aminopterina é seletivamente permitido sobreviver e proliferar. (n) Divisão no clone de célula isolada (clonagem)
[000262] Como um método de clonagem para hibridomas, um método conhecido tal como um método de metilcelulose, um método de agarose macia, ou um método de diluição limitante pode ser usado (veja, por exemplo, Barbara, B.M. and Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estes métodos, particularmente, um método de cultura tridimensional tal como um método de metilcelulose é preferido. Por exemplo, o grupo de hibridomas produzidos por fusão celular é suspenso em um meio de metilcelulose tal como Meio de Seleção ClonaCell-HY D (fabricado por StemCell Technologies, Inc., #03804) e cultivado. Em seguida, as colônias de hibridoma formadas são coletadas, por meio das quais hibridomas monoclonais podem ser obtidos. As colônias de hibridoma respectivas coletadas são cultivadas, e um hibridoma que foi confirmado ter um título de anticorpo estável em um sobrenadante de cultura de hibridoma obtido é selecionado como uma cepa de hibridoma de produção de anticorpo monoclonal de HER2. (o) Preparação de anticorpo monoclonal cultivando-se hibridoma
[000263] Cultivando-se o hibridoma desse modo selecionado, um anticorpo monoclonal pode ser obtido efetivamente. Entretanto, antes de cultivar, é preferido realizar a avaliação de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal alvo.
[000264] Em tal avaliação, um método conhecido pode ser empregado.
[000265] A medida do título de anticorpo na invenção pode ser realizada, por exemplo, por um método de ELISA explicado no item (b) descrito acima.
[000266] O hibridoma obtido pelo método descrito acima pode ser armazenado em um estado congelado em nitrogênio líquido ou em um congelador a -80oC ou abaixo.
[000267] Depois da conclusão da clonagem, o meio é mudado de um meio de HT a um meio normal, e o hibridoma é cultivado.
[000268] A cultura em grande escala é realizada por cultura de rotação usando um frasco de cultura grande ou por cultura de centrifugação. A partir do sobrenadante obtido pela ampla cultura, um anticorpo monoclonal que especificamente liga-se à proteína da invenção pode ser obtido por purificação usando um método conhecido por aqueles versados na técnica tal como filtração de gel.
[000269] Além disso, o hibridoma é injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma cepa como o hibridoma (por exemplo, o BALB/c acima descrito) ou um camundongo Nu/Nu para proliferar o hibridoma, onde pelo menos o ascite contendo uma quantidade grande do anticorpo monoclonal da invenção pode ser obtido.
[000270] No caso onde o hibridoma é administrado na cavidade abdominal, se um óleo mineral tal como 2, 6, 10, 14-tetrametil pentadecano (pristano) é administrado 3 a 7 dias antes disso, uma quantidade maior do ascite pode ser obtida.
[000271] Por exemplo, um imunossupressor é previamente injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma cepa como o hibridoma para inativar as células T. 20 Dias depois disso, 106 a 107 de células de clone de hibridoma são suspensas em um meio livre de soro (0,5 ml), e a suspensão é administrada na cavidade abdominal do camundongo. Em geral, quando o abdômen é ampliado e preenchido com o ascite, o ascite é coletado do camundongo. Por este método, o anticorpo monoclonal pode ser obtido em uma concentração que é cerca de 100 vezes ou mais alta que aquela na solução de cultura.
[000272] O anticorpo monoclonal obtido pelo método acima descrito pode ser purificado por um método descrito em, por exemplo, Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
[000273] O anticorpo monoclonal desse modo obtido tem especificidade de antígeno elevada para HER2. Exemplos do anticorpo monoclonal da presente invenção podem incluir, porém não estão limitados particularmente a, um anticorpo monoclonal de camundongo 4D5 (ATCC CRL 10463). (p) Ensaio de anticorpo monoclonal
[000274] O isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal desse modo obtido podem ser determinadas como segue.
[000275] Primeiro, exemplos do método de identificação incluem um método de Ouchterlony, um método de ELISA, e um método de RIA.
[000276] Um método de Ouchterlony é simples, porém quando a concentração do anticorpo monoclonal é baixa, uma operação de condensação é requerida.
[000277] Por outro lado, quando um método de ELISA ou um método de RIA é usado, reagindo-se diretamente o sobrenadante de cultura com uma fase sólida absorvida por antígeno e usando anticorpos que correspondem a vários tipos de isótipos de imunoglobulina e subclasse como anticorpos secundários, o isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal podem ser identificados.
[000278] Além disso, como um método mais simples, um kit de identificação comercialmente disponível (por exemplo, Mouse Typer Kit fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) ou similares pode da mesma forma ser usado.
[000279] Além disso, a determinação quantitativa de uma proteína pode ser realizada pelo método de Folin Lowry e um método de cálculo com base na absorvência em 280 nm (1.4 (OD280) = Imunoglobulina 1 mg/ml).
[000280] Além disso, até mesmo quando o anticorpo monoclonal é separadamente e independentemente obtido realizando-se novamente as etapas de (a) a (h) em (2), é possível obter um anticorpo tendo uma atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo de HER2 obtido na etapa de (g). Como um exemplo de um tal anticorpo, um anticorpo que liga-se ao mesmo epitopo como o anticorpo de HER2 obtido na etapa de (g) pode ser exemplificado. Se um anticorpo monoclonal recentemente produzido liga-se a um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial a qual o anticorpo anti-HER2 liga-se, pode ser determinado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epitopo como o anticorpo anti-HER2. Além disso, confirmando-se que o anticorpo monoclonal compete com o anticorpo anti-HER2 para a ligação ao HER2 (isto é, o anticorpo monoclonal inibe a ligação entre o anticorpo anti-HER2 e HER2), pode ser determinado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epitopo como o anticorpo anti-HER2 ainda que a sequência de epitopo específica ou estrutura não tenha sido determinada. Quando é confirmado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epitopo como o anticorpo anti-HER2, esperada-se fortemente que o anticorpo monoclonal tenha uma afinidade de ligação de antígeno ou atividade biológica equivalente àquela do anticorpo anti-HER2. (3) Outros anticorpos
[000281] O anticorpo da invenção não só inclui o anticorpo monoclonal acima descrito contra HER2, porém, da mesma forma um anticorpo recombinante obtido por modificação artificial com a finalidade de diminuir a antigenicidade heteróloga aos seres humanos tal como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Estes anticorpos podem ser produzidos usando um método conhecido.
[000282] Como o anticorpo quimérico, um anticorpo no qual a variável de anticorpo e regiões constantes são derivadas a partir de espécies diferentes, por exemplo, um anticorpo quimérico em que uma região variável de anticorpo derivada de camundongo ou rato é conectada a uma região constante de anticorpo derivada de humano pode ser exemplificada (veja Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 68516855, (1984)). Exemplos do anticorpo quimérico da presente invenção podem incluir, porém não são limitados particularmente a, anticorpo quimérico 4D5 compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2 humano.
[000283] Como o anticorpo humanizado, um anticorpo obtido integrando-se apenas uma região de determinação de complementaridade (CDR) em um anticorpo derivado de humano (veja Nature (1986) 321, pp. 522-525), e um anticorpo obtido enxertando-se uma parte dos resíduos de aminoácido da estrutura bem como a sequência de CDR a um anticorpo humano por um método de enxerto de CDR (WO90/07861), e um anticorpo humanizado usando estratégia de mutagênese de conversão de gene (Patente U.S. No. 5821337) pode ser exemplificado.
[000284] O termo "vários" quando aqui usado refere-se a 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, ou 1 ou 2.
[000285] Como a substituição de aminoácido nesta especificação, uma substituição de aminoácido conservadora é preferida. A substituição de aminoácido conservadora refere-se a uma substituição que ocorre dentro de um grupo de aminoácidos relacionados a cadeias laterais de aminoácido. Grupos aminoácido preferidos são como segue: um grupo ácido (ácido aspártico e ácido glutâmico); um grupo básico (lisina, arginina e histidina); um grupo não polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano); e uma família polar não carregada (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina). Grupos aminoácido mais preferidos são como segue: um grupo hidróxi alifático (serina e treonina); um grupo contendo amida (asparagina e glutamina); um grupo alifático (alanina, valina, leucina e isoleucina); e um grupo aromático (fenilalanina, triptofano e tirosina). Uma tal substituição de aminoácido é realizada preferivelmente dentro de uma faixa que não prejudica as propriedades de uma substância que tem a sequência de aminoácido original.
[000286] Combinando-se uma sequência que tem uma alta homologia com a sequência de aminoácido de cadeia pesada descrita acima com uma sequência que tem uma alta homologia com a sequência de aminoácido de cadeia leve descrita acima, é possível selecionar um anticorpo que tem uma atividade biológica equivalente àquela de cada um dos anticorpos descritos acima. Uma tal homologia geralmente é uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente uma homologia de 90% ou mais, mais preferivelmente uma homologia de 95% ou mais, ainda mais preferivelmente uma homologia de 99% ou mais. Além disso, combinando-se uma sequência de aminoácido, em que um a vários resíduos de aminoácido é(são) substituído(s), deletado(s) ou adicionado(s) na sequência de aminoácido de cadeia pesada ou cadeia leve, é da mesma forma possível selecionar um anticorpo que tem uma atividade biológica equivalente àquela de cada um dos anticorpos acima descritos. O termo "homologia" quando aqui usado, é usado com o mesmo significado como "identidade".
[000287] A homologia entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando parâmetros básicos de algoritmo de Blast versão 2.2.2 (Altschul, Stefen F., Thomas L.Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402). O algoritmo de Blast pode ser usado da mesma forma pela Internet acessando o site www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[000288] Além disso, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo humano que liga-se a HER2. Um anticorpo humano anti-HER2 refere- se a um anticorpo humano que tem apenas uma sequência de um anticorpo derivado de um cromossomo humano. O anticorpo humano anti-HER2 pode ser obtido por um método usando um camundongo produtor de anticorpo humano que tem um fragmento de cromossomo humano que compreende genes de cadeia pesada e leve de um anticorpo humano (veja, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).
[000289] Um tal camundongo produtor de anticorpo humano pode ser criado especificamente como segue. Um animal geneticamente modificado cujos locais de gene de cadeia pesada e leve de imunoglobulina endógena foram rompidos, e ao contrário, locais de gene de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana foram introduzidos por meio de um vetor de cromossomo artificial de levedura (YAC) ou similares é criado produzindo um animal de nocaute e um animal transgênico e acasalando estes animais.
[000290] Além disso, de acordo com um técnica de DNA recombinante, usando cDNAs que codificam cada uma dentre uma tal cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano, e preferivelmente um vetor que compreende tais cDNAs, células eucarióticas são transformadas, e uma célula transformante que produz um anticorpo monoclonal humano recombinante é cultivada, por meio do qual o anticorpo pode ser obtido da mesma forma a partir do sobrenadante de cultura.
[000291] Aqui, como o hospedeiro, por exemplo, células eucarióticas, preferivelmente células de mamífero tais como células de CHO, linfócitos ou células de mieloma podem ser usadas.
[000292] Além disso, um método de obter um anticorpo humano derivado de exibição de fago selecionado a partir de uma biblioteca de anticorpo humana (veja Wormstone, I.M. et al., Investigative Ofthalmology & Visual Science. (2002) 43(7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), pp,189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109(3), pp. 427-431, etc.) é da mesma forma conhecido.
[000293] Por exemplo, um método de exibição de fago no qual uma região variável de um anticorpo humano é expressa na superfície de um fago como um anticorpo de cadeia simples (scFv), e um fago que liga-se a um antígeno é selecionado (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) pode ser usado.
[000294] Analisando-se o gene do fago selecionado com base na ligação a um antígeno, uma sequência de DNA que codifica a região variável de um anticorpo humano que se liga a um antígeno, pode ser determinada.
[000295] Se a sequência de DNA de scFv que liga-se a um antígeno for determinada, um anticorpo humano pode ser obtido preparando-se um vetor de expressão que compreende a sequência e introduz o vetor em um hospedeiro apropriado para expressá-lo (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
[000296] Como um exemplo de outro índice para uso na comparação das propriedades de anticorpos, a estabilidade de anticorpos pode ser exemplificada. A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é um dispositivo capaz de rapidamente e com precisão medir uma temperatura de ponto central de desnaturação térmica (Tm) a ser usada como um índice favorável da estabilidade conformacional relativa de proteínas. Medindo-se os valores de Tm usando DSC e comparando-se os valores, uma diferença na estabilidade térmica pode ser comparada. Sabe-se que a estabilidade de armazenamento de anticorpos mostra alguma correlação com a estabilidade térmica de anticorpos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), e um anticorpo preferido pode ser selecionado usando estabilidade térmica como um índice. Exemplos de outros índices para selecionar anticorpos incluem os seguintes aspectos: o rendimento em uma célula hospedeira apropriada é alto; e a agregabilidade em uma solução aquosa é baixa. Por exemplo, um anticorpo que mostra o rendimento mais alto não mostra sempre a estabilidade térmica mais alta, e, portanto, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para a administração a humanos fazendo avaliação compreensiva com base nos índices descritos acima.
[000297] Na presente invenção, uma variante modificada do anticorpo é da mesma forma incluída. A variante modificada refere-se a uma variante obtida submetendo-se o anticorpo da presente invenção à modificação química ou biológica. Exemplos da variante quimicamente modificada incluem variantes quimicamente modificadas ligando uma porção química a um esqueleto de aminoácido, variantes quimicamente modificadas com uma cadeia de carboidrato ligada a N ou ligada a O, etc. Exemplos da variante biologicamente modificada incluem variantes obtidas por modificação pós-translacional (tal como, glicosilação ligada a N ou ligada a O, processo N ou C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, ou oxidação de metionina), e variantes nas quais um resíduo de metionina foi adicionado ao N terminal sendo expresso em um hospedeiro de célula procariótica. Além disso, um anticorpo rotulado para permitir a detecção ou isolamento do anticorpo ou um antígeno da invenção, por exemplo, um anticorpo rotulado por enzima, um anticorpo rotulado por fluorescência e um anticorpo rotulado por afinidade estão da mesma forma incluídos no significado da variante modificada. Uma tal variante modificada do anticorpo da invenção é útil para melhorar a estabilidade e retenção de sangue do anticorpo, reduzindo o antigenicidade do mesmo, detectando ou isolando um anticorpo ou um antígeno, e assim por diante.
[000298] Além disso, regulando a modificação de um glicano que é ligado ao anticorpo da invenção (glicosilação, desfucosilação, etc.), é possível realçar uma atividade citotóxica celular dependente de anticorpo. Como a técnica para regular a modificação de um glicano de anticorpos, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. são conhecidos. Entretanto, a técnica não está limitada a isto. No anticorpo da presente invenção, um anticorpo cuja modificação de um glicano é regulada, está da mesma forma incluído.
[000299] No caso onde um anticorpo é produzido primeiro isolando um gene de anticorpo e em seguida introduzindo o gene em um hospedeiro apropriado, uma combinação de um hospedeiro apropriado e um vetor de expressão apropriado pode ser usada. Exemplos específicos do gene de anticorpo incluem uma combinação de um gene que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo descrito nesta especificação e um gene que codifica uma sequência de cadeia leve do mesmo. Quando uma célula hospedeira é transformada, é possível inserir o gene de sequência de cadeia pesada e o gene de sequência de cadeia leve no mesmo vetor de expressão, e da mesma forma em vetores de expressão diferentes separadamente.
[000300] No caso onde células eucarióticas são usadas como o hospedeiro, células de animal, células de planta e micro-organismos eucarióticos podem ser usados. Como as células de animal, as células de mamífero, por exemplo, células COS de símio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCCCRL-1650), fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e cepas deficientes de di-hidrofolato reductase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células ovarianas de hamster Chinês (células de CHO; ATCC: CCL-61) podem ser exemplificadas. No caso onde as células procarióticas são usadas, por exemplo, Escherichia coli e Bacillus subtilis podem ser exemplificadas.
[000301] Introduzindo-se um gene de anticorpo desejado nestas células por transformação, e cultivando-se as células desse modo transformadas in vitro, o anticorpo pode ser obtido. No método de cultura acima descrito, o rendimento pode às vezes variar dependendo da sequência do anticorpo, e portanto, é possível selecionar um anticorpo que é facilmente produzido como um farmacêutico usando- se o rendimento como um índice entre os anticorpos tendo uma atividade de ligação equivalente. Portanto, no anticorpo da presente invenção, um anticorpo obtido por um método de produção de um anticorpo, caracterizado por incluir uma etapa de cultivar a célula hospedeira transformada e uma etapa de coletar um anticorpo desejado a partir de um produto cultivado obtido na etapa de cultivo é da mesma forma incluído.
[000302] Sabe-se que um resíduo de lisina no terminal carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula de mamífero cultivada é deletado (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), e sabe-se da mesma forma que dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) no terminal carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula de mamífero cultivada são deletados e um resíduo de prolina recentemente localizado no terminal carboxila é amidadp (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Entretanto, tal deleção e modificação da sequência de cadeia pesada não afetam a afinidade de ligação de antígeno e a função efetora (a ativação de um complemento, a citotoxicidade celular dependente de anticorpo, etc.) do anticorpo. Portanto, no anticorpo de acordo com a presente invenção, um anticorpo submetido a tal modificação e um fragmento funcional do anticorpo é da mesma forma incluído, e uma variante de deleção em que um ou dois aminoácidos foram deletados no terminal carboxila da cadeia pesada, uma variante obtida por amidação da variante de deleção (por exemplo, uma cadeia pesada em que o resíduo de prolina terminal carboxila foi amidada), e similares são da mesma forma incluídas. O tipo de variante de deleção tendo uma deleção no terminal de carboxila da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a invenção não está limitado às variantes anteriores contanto que a afinidade de ligação de antígeno e a função efetora sejam conservadas. As duas cadeias pesadas que constituem o anticorpo de acordo com a invenção podem ser de um tipo selecionado a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada de tamanho natural e a variante de deleção acima descrita, ou podem ser de dois tipos em combinação selecionada dos mesmos. A relação da quantidade de cada variante de deleção pode ser afetada pelo tipo de células de mamífero cultivadas que produzem o anticorpo de acordo com a invenção e as condições de cultura, entretanto, um caso onde um resíduo de aminoácido no terminal carboxila foi deletado em ambas as duas cadeias pesadas contidas como componentes principais no anticorpo de acordo com a invenção pode ser exemplificado.
[000303] Como isótipo do anticorpo da invenção, por exemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) pode ser exemplificado, e IgG1 ou IgG2 podem ser preferivelmente exemplificados.
[000304] Como a atividade biológica do anticorpo, geralmente uma atividade de ligação de antígeno, uma atividade de internalização em células expressando um antígeno ligando-se ao antígeno, uma atividade de neutralização da atividade de um antígeno, uma atividade de realce da atividade de um antígeno, uma atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) atividade, uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e uma fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) podem ser exemplificadas. A atividade biológica do anticorpo da presente invenção é uma atividade de ligação ao HER2, e preferivelmente uma atividade de internalização em células de expressão de HER2 ligando- se ao HER2. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ter uma atividade de ADCC, uma atividade de CDC, e/ou uma atividade de ADCP além de uma atividade de internalização em células.
[000305] O anticorpo obtido pode ser purificado para homogeneidade. A separação e purificação do anticorpo podem ser realizadas empregando-se um método de purificação e separação de proteína convencional. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado adequadamente selecionando-se e combinando-se cromatografia de coluna, filtração por filtro, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese de focalização isoelétrica, e similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), porém o método não está limitado a isto.
[000306] Exemplos de tal cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração de gel, cromatografia de fase inversa, e cromatografia de absorção.
[000307] Tal cromatografia pode ser realizada empregando-se a cromatografia líquida tal como HPLC ou FPLC.
[000308] Como uma coluna a ser usada em cromatografia de afinidade, uma coluna de Proteína A e uma coluna de Proteína G podem ser exemplificadas. Por exemplo, como uma coluna usando uma coluna de Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF(Pharmacia Corporation) e similares podem ser exemplificadas.
[000309] Além disso, usando um veículo tendo um antígeno imobilizado neste, o anticorpo pode ser purificado utilizando a propriedade de ligação do anticorpo ao antígeno.
COMPOSTO ANTITUMOR
[000310] O composto antitumor a ser conjugado ao conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção é explicado. O composto antitumor usado na presente invenção não está limitado particularmente contanto que seja um composto tendo um efeito antitumor e um grupo substituinte ou uma estrutura parcial que permitem a conexão a uma estrutura de ligante. Quando uma parte ou todo o ligante é clivado em células de tumor, a porção de composto antitumor é liberada para exibir o efeito antitumor do composto antitumor. Como o ligante é clivado em uma posição de conexão no fármaco, o composto antitumor é liberado em uma estrutura inalterada para exibir seu efeito antitumor intrínseco.
[000311] Como o composto antitumor usado na presente invenção, exatecana (((1S, 9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2, 3-di-hidro-9-hidróxi-4- metil-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolina-10, 13(9H, 15H)-diona; mostrada na seguinte fórmula), um dos derivados de camptotecina, pode ser usado preferivelmente. Fórmula 14
Figure img0014
[000312] Embora tendo um excelente efeito antitumor, exatecana não foi comercializada como um fármaco antitumor. O composto pode ser obtido facilmente por um método conhecido e o grupo amino na posição 1 pode ser usado preferivelmente como posição de conexão à estrutura de ligante. Além disso, embora a exatecana possa ser da mesma forma libertada em células de tumor enquanto parte do ligante ainda é ligada a este, é um composto excelente que exibe um excelente efeito antitumor mesmo em uma tal estrutura.
[000313] Porque a exatecana tem uma estrutura de camptotecina, sabe-se que as trocas de equilíbrio para uma estrutura com um anel de lactona fechado (anel fechado) em um meio ácido aquoso (por exemplo, pH 3 mais ou menos), porém, troca-se para uma estrutura com um anel de lactona aberto (anel aberto) em um meio básico aquoso (por exemplo, pH 10 mais ou menos). Um conjugado de fármaco a ser introduzido com um resíduo de exatecana que corresponde à estrutura de anel fechada e à estrutura de anel aberta é da mesma forma esperado ter o mesmo efeito antitumor e é desnecessário dizer que quaisquer destas estruturas estão dentro do escopo da presente invenção.
[000314] Outros exemplos do composto antitumor podem incluir doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vimblastina, metotrexato, agente antitumor com base em platina (cisplatina ou derivados da mesma), taxol ou derivados do mesmo, e outras camptotecinas ou derivados das mesmas (agente antitumor descrito na Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 6-87746).
[000315] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco, o número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo é um fator chave tendo uma influência na eficácia e segurança. A produção do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada definindo-se as condições de reação incluindo as quantidades de matérias-primas e reagentes usados para a reação ter um número constante de moléculas de fármaco conjugadas. Uma mistura contendo números diferentes de moléculas de fármaco conjugadas geralmente é obtida ao contrário da reação química de um composto de baixo peso molecular. O número de fármacos conjugados em uma molécula de anticorpo é expresso ou especificado pelo valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas. A menos que especificamente descrito de outra maneira como um princípio, o número de moléculas de fármaco conjugadas significa o valor médio exceto no caso em que representa um conjugado de anticorpo- fármaco tendo um número específico de moléculas de fármaco conjugadas que é incluído em um mistura de conjugado de anticorpo- fármaco tendo números diferentes de moléculas de fármaco conjugadas.
[000316] O número de moléculas de exatecana conjugadas em uma molécula de anticorpo é controlável, e como o número médio das moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo, cerca de 1 a 10 exatecanas podem ser conectadas. Preferivelmente, é 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8. Enquanto isso, uma pessoa versada na técnica pode projetar uma reação para conjugar um número exigido de moléculas de fármaco em uma molécula de anticorpo com base na descrição dos Exemplos do pedido presente e pode obter um conjugado de anticorpo-fármaco conjugado com um número controlado de moléculas de exatecana.
ESTRUTURA LIGANTE
[000317] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco anti- HER2 da presente invenção, a estrutura de ligante para conjugar um composto antitumor ao anticorpo anti-HER2 é explicada. O ligante tem uma estrutura da seguinte fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-.
[000318] O anticorpo é conectado ao terminal L1 (terminal oposto à conexão ao L2), e o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção - La-(CH2)n2-C(=O)-.
[000319] n1 representa um número inteiro de 0 a 6 e é preferivelmente um número inteiro de 1 a 5, e mais preferivelmente 1 a 3. 1.L1
[000320] L1 é representado pela seguinte estrutura: -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-.
[000321] No anterior, n3 é um número inteiro de 2 a 8, "-(Succinimid- 3-il-N)-" tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 15
Figure img0015
[000322] Posição 3 da estrutura parcial acima é a posição de conexão ao anticorpo anti-HER2. A ligação ao anticorpo na posição 3 é caracterizada ligando-se com a formação de tioéter. O átomo de nitrogênio na posição 1 da porção de estrutura é conectado ao átomo de carbono do metileno que está presente dentro do ligante incluindo a estrutura. Especificamente, -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2 - é uma estrutura representada pela seguinte fórmula (aqui, "anticorpo-S - " origina-se de um anticorpo). Fórmula 16
Figure img0016
[000323] Na fórmula, n3 é um número inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 2 a 5.
[000324] Exemplos específicos de L1 podem incluir -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. 2.L2
[000325] L2 é representado pela seguinte estrutura: -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-,
[000326] L2 pode não estar presente, e em um tal caso, L2 é uma ligação simples. n4 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 2 a 4. L2 é conectado a L1 ao seu grupo amino terminal e é conectado ao LP em seu grupo carbonila ao outro terminal.
[000327] Exemplos específicos de L2 podem incluir - NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-. 3.LP
[000328] LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos. Especificamente, consiste em um resíduo de oligopeptídeo em que 2 a 7 aminoácidos são ligados por ligação de peptídeo. LP é conectado ao L2 em seu terminal N e é conectado ao grupo amino da porção -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- do ligante em seu terminal C. Aqui, o termo "resíduo de peptídeo" ou "resíduo de oligopeptídeo" é um grupo derivado a partir de um peptídeo consistindo em dois ou mais resíduos de aminoácido e refere-se a um grupo divalente cujos N terminal e C terminal são posições de conexão.
[000329] O aminoácido constituindo LP no ligante não está limitado particularmente, entretanto, exemplos do mesmo incluem um L- ou um D-aminoácido, preferivelmente um L-aminoácido. E, pode ser um aminoácido tendo uma estrutura tal como β-alanina, ácido ε- aminocaproico, ou ácido y-aminobutírico além de um a-aminoácido, também, pode ser um aminoácido de tipo não natural tal como aminoácido N-metilado.
[000330] A sequência de aminoácido de LP não é limitada particularmente, porém, exemplos dos aminoácidos constituintes incluem fenilalanina (Phe; F), tirosina (Tyr; Y), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), alanina (Ala; A), valina (Val; V), lisina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), ácido glutâmico (Glu; E), e ácido aspártico (Asp; D). Entre eles, exemplos preferidos incluem fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico. A partir destes aminoácidos, LP tendo uma sequência de aminoácidos opcionalmente selecionados com ou sem sobreposições pode ser construído. Dependendo do tipo dos aminoácidos, o padrão de liberação de fármaco pode ser controlado. O número de aminoácidos pode ser entre 2 a 7.
[000331] Exemplos específicos de LP podem incluir -GGF-, -DGGF-, -(D-)D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, e -GGFGGGF-.
[000332] No anterior, "(D-)D" representa um ácido D-aspártico.
[000333] Exemplos particularmente preferidos de LP para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem incluir o resíduo de tetrapeptídeo -GGFG-. 4. La-(CH2)n2-C(=O)-
[000334] La em La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura de -O- ou uma ligação simples. n2 é um número inteiro de 0 a 5, preferivelmente 0 a 3, e mais preferivelmente 0 ou 1.
[000335] Exemplos de La-(CH2)n2-C(=O)- podem incluir as seguintes estruturas: - O-CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2-C(=O)-, - CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-C(=O)-.
[000336] Entre estas, - O-CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2-C(=O)-, - O-C(=O)-,
[000337] ou um caso no qual La é uma ligação simples, e n2 é 0 é preferido.
[000338] Exemplos específicos da estrutura representados por -NH- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- do ligante podem incluir - NH-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2-O-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-O-C(=O)-.
[000339] Entre estas, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
[000340] é mais preferido.
[000341] No ligante, o comprimento de cadeia de -NH-(CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)- é preferivelmente um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos, e mais preferivelmente um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.
[000342] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco anti- HER2 da presente invenção, quando é transferido para o interior das células de tumor, foi sugerido que a porção de ligante seja clivada e o derivado de fármaco tendo uma estrutura representada por NH2- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) seja liberado para expressar uma ação antitumor. Exemplos do derivado antitumor exibindo um efeito antitumor liberando-se do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção incluem um derivado antitumor tendo uma porção de estrutura na qual um terminal da estrutura representada por -NH- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- do ligante tem um grupo amino, e particularmente aqueles preferidos incluem os seguintes. NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[000343] Enquanto isso, no caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), foi confirmado que, quando a estrutura aminal na molécula é instável, sofre novamente uma autodegradação para liberar a seguinte HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Esses compostos podem ser usados da mesma forma preferivelmente como um intermediário de produção do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção.
[000344] Para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção em que exatecana é usada como o fármaco, é preferível que a porção da estrutura de fármaco-ligante [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] tendo a seguinte estrutura seja conectada a um anticorpo. O número conjugado médio das referidas porções de estrutura de fármaco-ligante por molécula de anticorpo pode ser 1 a 10. Preferivelmente, 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX).
[000345] Entre estes, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX).
[000346] Particularmente preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[000347] Com respeito à estrutura de ligante para conjugar o anticorpo anti-HER2 e o fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, o ligante preferido pode ser construído conectando-se as estruturas preferidas mostradas para cada parte do ligante explicada acima. Quanto à estrutura de ligante, aqueles com a seguinte estrutura podem ser preferivelmente usados. Enquanto isso, o terminal esquerdo destas estruturas está na posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito é a posição de conexão com o fármaco. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-.
[000348] Entre estes, mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-.
[000349] Particularmente preferidos incluem os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
MÉTODO DE PRODUÇÃO
[000350] Em seguida, as explicações são determinadas para o método representativo para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou um intermediário de produção do mesmo. Enquanto isso, os compostos são a seguir descritos com o número do composto mostrado em cada fórmula de reação. Especificamente, eles são referidos como um "composto da fórmula (1)", um "composto (1)", ou similares. Os compostos com números diferentes daqueles são descritos da mesma forma semelhantemente. 1. MÉTODO DE PRODUÇÃO 1
[000351] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é conectado à estrutura de fármaco- ligante por meio de tioéter pode ser produzido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 17
Figure img0017
[000352] [Na fórmula, AB representa um anticorpo tendo um grupo sulfidrila, e L1’ representa estrutura de ligante L1 em que o terminal do ligante é um grupo maleimidila (fórmula mostrada abaixo) Fórmula 18
Figure img0018
[000353] (na fórmula, o átomo de nitrogênio é a posição de conexão), e especificamente representa um grupo em que a porção - (Succinimid-3-il-N)- em -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)- de L1 é um grupo maleimidila. Além disso, o -(NH-DX) representa uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 19
Figure img0019
[000354] e representa um grupo que é derivado removendo-se um átomo de hidrogênio do grupo amino na posição 1 de exatecan.]
[000355] Além disso, o composto da fórmula (1) na fórmula de reação anterior pode ser interpretado como uma estrutura em que uma porção de estrutura correspondendo do fármaco ao terminal do ligante conecta-se a um anticorpo. Entretanto, é apenas uma descrição dada por causa da conveniência, e de fato há muitos casos nos quais uma pluralidade das porções de estrutura é conectada a uma molécula de anticorpo. O mesmo aplica-se à explicação do método de produção descrito abaixo.
[000356] O conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2) que é obtenível pelo método descreveu abaixo, com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila.
[000357] O anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila pode ser obtido por um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos incluem: o reagente de Traut é reagido com o grupo amino do anticorpo; N-succinimidil S-acetiltioalcanoatos são reagidos com o grupo amino do anticorpo seguido por reação com hidroxilamina; depois de reagir com N-succinimidil 3- (piridilditio)propionato, o anticorpo é reagido com um agente de redução; o anticorpo é reagido com um agente de redução tal como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, e cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reduzir a ligação de dissulfeto na parte da articulação no anticorpo para formar um grupo sulfidrila, porém, não está limitado a este.
[000358] Especificamente, usando 0,3 a 3 equivalentes molares de TCEP como um agente de redução por dissulfeto na parte da articulação no anticorpo e reagindo com o anticorpo em uma solução de tamponamento contendo um agente de quelação, o anticorpo com dissulfeto parcialmente ou completamente reduzido na parte da articulação no anticorpo pode ser obtido. Exemplos do agente de quelação incluem ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) e ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA). Pode ser usado na concentração de 1 mM a 20 mM. Exemplos da solução de tamponamento que pode ser usada incluem uma solução de fosfato de sódio, borato de sódio, ou acetato de sódio. Especificamente, reagindo-se o anticorpo com TCEP a 4oC a 37oC durante 1 a 4 horas, o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila parcialmente ou completamente reduzido pode ser obtido.
[000359] Enquanto isso, conduzindo-se a reação para adicionar um grupo sulfidrila a uma porção de fármaco-ligante, as porções de fármaco-ligante podem ser conjugadas por uma ligação de tioéter.
[000360] Usando-se 2 a 20 equivalentes molares do composto (2) por anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila, o conjugado de anticorpo- fármaco (1) em que 2 a 8 moléculas de fármaco são conjugadas por molécula de anticorpo pode ser produzido. Especificamente, é suficiente que a solução contendo o composto (2) dissolvido nisso seja adicionada a uma solução de tamponamento contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. Aqui, exemplos da solução de tamponamento que pode ser usada incluem solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, e borato de sódio. O pH para a reação é 5 a 9, e mais preferivelmente a reação é realizada próximo ao pH 7. Exemplos do solvente para dissolver o composto (2) incluem um solvente orgânico tal como dimetil sulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetil acetamida (DMA), e N-metil-2-piridona (NMP).
[000361] É suficiente que a solução de solvente orgânico contendo o composto (2) dissolvido nisso seja adicionado em 1 a 20% em v/v a uma solução de tamponamento contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. A temperatura de reação é 0 a 37oC, mais preferivelmente 10 a 25oC, e o tempo de reação é 0,5 a 2 horas. A reação pode ser terminada desativando-se a reatividade do composto não reagido (2) com um reagente contendo tiol. Exemplos do reagente contendo tiol incluem cisteína e N-acetil-L-cisteína (NAC). Mais especificamente, 1 a 2 equivalentes molares de NAC são adicionados ao composto (2) usado e, incubando-se em temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos, a reação pode ser terminada.
[000362] O conjugado de anticorpo-fármaco produzido (1) pode, depois da concentração, troca de tampão, purificação, e medida de concentração de anticorpo e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo de acordo com os procedimentos comuns descritos abaixo, ser submetido à identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1). Procedimento comum A: Concentração de solução aquosa de anticorpo ou conjugado de anticorpo-fármaco
[000363] Em um recipiente Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Co.), uma solução de anticorpo ou conjugado de anticorpo-fármaco foi adicionada e a solução do anticorpo ou conjugado de anticorpo- fármaco foi concentrada por centrifugação (centrifugar durante 5 a 20 minutos em 2000 G a 3800 G) usando-se uma centrífuga (Allegra X- 15R, Beckman Coulter, Inc.). Procedimento comum B: Medida de concentração de anticorpo
[000364] Usando-se um detector UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), a medida da concentração de anticorpo foi realizada de acordo com o método definido pelo fabricante. Naquele momento, um coeficiente de absorção de 280 nm diferente para cada anticorpo foi usado (1,3 mLmg-1cm-1 a 1,8 mLmg-1cm-1). Procedimento comum C-1: Troca de Tampão para anticorpo
[000365] Coluna NAP-25 (Cat. No.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (10 mM, pH 6,0; é referido como PBS6.0/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (137 mM) e ácido etileno diamina tetraacético (EDTA, 5 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. A solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL para coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6.0/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Depois de medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada em 10 mg/mL usando PBS6.0/EDTA. Procedimento comum C-2: Troca de Tampão para anticorpo
[000366] Coluna NAP-25 (Cat. No.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (50 mM, pH 6,5; é referido como PBS6.5/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (50 mM) e EDTA (2 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. Solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL à coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3.5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6.5/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Depois de medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada a 20 mg/mL usando PBS6.5/EDTA. Procedimento comum D: Purificação de conjugado de anticorpo- fármaco
[000367] Coluna NAP-25 foi equilibrada com qualquer tampão selecionado a partir do tampão de fosfato comercialmente disponível (PBS7.4, Cat.No.10010-023, Invitrogen), tampão de fosfato de sódio (10mM, pH 6,0; é referido como PBS6.0) contendo cloreto de sódio (137mM), e tampão de acetato contendo sorbitol (5%) (10 mM, pH 5,5; é referido como ABS na especificação). Solução aquosa da reação do conjugado de anticorpo-fármaco foi aplicada em uma quantidade de cerca de 1,5 mL à coluna NAP-25, e em seguida eluída com o tampão em uma quantidade definida pelo fabricante para coletar a fração de anticorpo. A fração coletada foi aplicada novamente à coluna NAP-25 e, repetindo-se 2 a 3 vezes no total o processo de purificação por filtração de gel para eluir com tampão, o conjugado de anticorpo- fármaco excluindo o ligante de fármaco não conjugado e um composto de baixo peso molecular (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L-cisteína (NAC), e dimetil sulfóxido) foi obtido.
[000368] Procedimento comum E: Medida de concentração de anticorpo em conjugado de anticorpo-fármaco e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo (1).
[000369] A concentração de fármaco conjugada no conjugado de anticorpo-fármaco pode ser calculada medindo-se a absorvência UV de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em dois comprimentos de onda de 280 nm e 370 nm, seguidos realizando-se o cálculo mostrado abaixo.
[000370] Porque a absorvência total em qualquer comprimento de onda é igual à soma da absorvência de todas as espécies químicas de absorção de luz que estão presentes no sistema (aditividade de absorvência), quando os coeficientes de absorção molares do anticorpo e o fármaco pemanece o mesmo antes e depois da conjugação entre o anticorpo e o fármaco, a concentração de anticorpo e a concentração de fármaco no conjugado de anticorpo- fármaco é expressa pelas seguintes equações. A280 = AD,280 + AA,280 = SD,28OCD + SA,28OCA Equação (I) A370 = AD,37O+AA,37O = SD,37OCD+SA,37OCA Equação (II)
[000371] No anterior, A280 representa a absorvência de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em 280 nm, A370 representa a absorvência de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em 370 nm, AA, 280 representa a absorvência de um anticorpo em 280 nm, AA,370 representa a absorvência de um anticorpo em 370 nm, AD,280 representam a absorvência de um precursor de conjugado em 280 nm, AD, 370 representa a absorvência de um precursor de conjugado em 370 nm, SA,280 representa o coeficiente de absorção molar de um anticorpo em 280 nm, SA,37Ü representa o coeficiente de absorção molar de um anticorpo em 370 nm, SD,28Ü representa o coeficiente de absorção molar de um precursor conjugado a 280 nm, SD,37Ü representa o coeficiente de absorção molar de um precursor de conjugado em 370 nm, a CA representa a concentração de anticorpo em um conjugado de anticorpo-fármaco, e CD representa a concentração de fármaco em um conjugado de anticorpo-fármaco.
[000372] Quanto a SA,28Ü, SA,37Ü, SD,28Ü, e SD,37Ü nos anteriores, valores previamente preparados (valores estimados com base no cálculo ou valores de medida obtidos por medida de UV dos compostos) são usados. Por exemplo, SA,28Ü, pode ser calculada a partir da sequência de aminoácido de um anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). SA,37Ü é geralmente zero. Nos Exemplos, quanto ao coeficiente de absorção molar de trastuzumabe, SA,28Ü = 215400 (valor estimado com base no cálculo) e SA,37Ü = 0 foram usados. SD,28Ü e SD,37Ü podem ser obtidos com base na lei de Lambert-Beer (Absorvência = concentração molar x coeficiente de absorção molar x comprimento da trilha da célula) medindo-se a absorvência de uma solução em que o precursor de conjugado a ser usado é dissolvido em uma certa concentração molar. Quanto ao coeficiente de absorção molar de um ligante de fármaco nos Exemplos, SD,28Ü = 5000 (valor médio medido) e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados, a menos que de outra maneira especificado. Medindo-se A280 e A370 de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco e resolvendo-se as equações simultâneas (I) e (II) usando os valores, CA e CD podem ser obtidos. Além disso, dividindo-se o CD por CA, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo pode ser obtido.
[000373] Procedimento comum F: Medida (2) do número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo em conjugado de anticorpo-fármaco.
[000374] O número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado de anticorpo-fármaco pode da mesma forma ser determinado por análise de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) usando o seguinte método além do Procedimento comum E acima mencionado. F-1. Preparação de amostra para análise de HPLC (redução de conjugado de anticorpo-fármaco)
[000375] Uma solução de conjugado de anticorpo-fármaco (cerca de 1 mg/mL, 60 μL) é misturada com uma solução aquosa de ditiotreitol (DTT) (100 mM, 15 μL). Uma amostra em que a ligação de dissulfeto entre a cadeia L e a cadeia H do conjugado de anticorpo-fármaco foi clivada incubando-se a mistura durante 30 minutos a 37oC é usada em análise de HPLC. F-2. Análise de HPLC
[000376] A análise de HPLC é realizada sob as seguintes de condições de medida: Sistema de HPLC: Sistema de HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.) Detector: Espectrômetro de absorção ultravioleta (comprimento de onda de medida: 280 nm) Coluna: PLRP-S (2,1 x 50 mm, 8 μm, 1000 angstroms; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802) Temperatura da coluna: 80oC Fase móvel A: solução aquosa contendo 0,04% de ácido trifluoroacético (TFA) Fase móvel B: solução de acetonitrila contendo 0,04% de TFA Programa de gradiente: 29%-36% (0-12,5 min), 36%-42% (12,5-15 min), 42%-29% (15-15,1 min), e 29%-29% (15,1-25 min) Volume de injeção da amostra: 15 μL F-3. Análise de dados
[000377] [F-3-1] Comparado com o anticorpo não conjugado, cadeias L (L0) e H (H0), cadeias L (cadeia L conectada a uma molécula de fármaco: L1) e H (cadeia H conectada a uma molécula de fármaco: H1, cadeia H conectada a duas moléculas de fármaco: H2, cadeia H conectada a três moléculas de fármaco: H3) conjugadas por fármaco exibem hidrofobicidade mais alta na proporção ao número de moléculas de fármaco conjugadas e desse modo têm um tempo de retenção maior. Estas cadeias são, portanto, eluídas na ordem de L0 e L1 ou H0, H1, H2, e H3. Picos de detecção podem ser nomeados em quaisquer dentre L0, L1, H0, H1, H2, e H3 pela comparação dos tempos de retenção com L0 e H0.
[000378] [F-3-2] Visto que o ligante de fármaco tem absorção UV, valores de área de pico são corrigidos com respeito ao número de moléculas de ligante de fármaco conjugadas de acordo com a seguinte expressão usando os coeficientes de absorção molares das cadeias L ou H e o ligante de fármaco. Expressão 1
Figure img0020
Expressão 2
Figure img0021
[000379] Aqui, quanto ao coeficiente de absorção molar (280 nm) da cadeia L ou H de cada anticorpo, um valor estimado da sequência de aminoácido da cadeia L ou H de cada anticorpo por um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) pode ser usado. No caso de trastuzumabe, um coeficiente de absorção molar de 26150 e um coeficiente de absorção molar de 81290 foram usados como valores estimados para as cadeias L e H, respectivamente, de acordo com sua sequência de aminoácido. Quanto ao coeficiente de absorção molar (280 nm) do ligante de fármaco, o coeficiente de absorção molar medido (280 nm) de um composto no qual o grupo maleimida foi convertido à succinimida tioéter pela reação de cada ligante de fármaco com mercaptoetanol ou N-acetilcisteína foi usado.
[000380] [F-3-3] A relação de área de pico (%) de cada cadeia é calculada para o total dos valores corrigidos das áreas de pico de acordo com a seguinte expressão. Expressão 3
Figure img0022
[000381] [F-3-4] O número médio das moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado de anticorpo- fármaco é calculado de acordo com a seguinte expressão.
[000382] Número médio das moléculas de fármaco conjugadas = (relação de área de pico de L0 x 0 + relação de área de pico de L0 x 1 + relação de área de pico de H0 x 0 + relação de área de pico de H1 x 1 + relação de área de pico de H2 x 2 + relação de área de pico de H3 x 3) / 100 x 2
[000383] O composto de intermediário de produção usado no Método de produção 1 é descrito abaixo. O composto representado pela fórmula (2) no Método de produção 1 é um composto representado pela seguinte fórmula: (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- (NH-DX).
[000384] Na fórmula,
[000385] n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[000386] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[000387] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[000388] LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos selecionados a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico,
[000389] n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[000390] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[000391] La representa -O- ou uma ligação simples,
[000392] (maleimid-N-il)- é um grupo maleimidila (grupo 2, 5-dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1-ila) representado pela seguinte fórmula: Fórmula 20
Figure img0023
[000393] em que o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e
[000394] -(NH-DX) é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 21
Figure img0024
[000395] em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão.
[000396] Quando L2 é uma ligação simples ou -NH-(CH2CH2-O)n4- CH2CH2-C(=O)-, é preferido como um intermediário de produção que n4 deve ser um número inteiro de 2 a 4.
[000397] Quanto ao resíduo de peptídeo de LP, um composto tendo um resíduo de peptídeo consistindo em um aminoácido selecionado a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico é preferido como um intermediário de produção. Entre esses resíduos de peptídeo, um composto no qual LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos é preferido como um intermediário de produção. Mais especificamente, um composto no qual LP é o resíduo de tetrapeptídeo -GGFG- é preferido como um intermediário de produção.
[000398] Além disso, quanto a -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2 -, um composto tendo -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2 -, ou - NH-CH2CH2-O-CH2 - é preferido como um intermediário de produção. Um composto tendo -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2 -, ou -NH- CH2CH2-O-CH2 é mais preferido.
[000399] Um composto representado pela fórmula (2) em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1- La-(CH2)n2 - é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2 -, ou -NH-CH2CH2-O-CH2 - é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2 - é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2- O-CH2 -, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido. Um composto no qual n3 é um número inteiro de 2 ou 5 é também preferido.
[000400] Um composto representado pela fórmula (2) em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 é um número inteiro de 2 a 4, e -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2 - é -NH- CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2 -, ou -NH-CH2CH2-O-CH2 - é preferido como um intermediário de produção. Um composto no qual n4 é um número inteiro de 2 ou 4 é mais preferido. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2 - é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2 -, ou -NH-CH2CH2-O-CH2 - é também preferido.
[000401] Exemplos preferidos de um intermediário útil na produção de um tal composto da presente invenção podem incluir os seguintes. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX).
[000402] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser produzido reagindo-se um composto de fármaco- ligante selecionado a partir do grupo de composto de intermediário de produção supracitado com um anticorpo anti-HER2 ou um derivado reativo do mesmo para desse modo formar uma ligação de tioéter a um sítio de ligação de dissulfeto presente na parte da articulação do anticorpo anti-HER2. Neste caso, o derivado reativo do anticorpo anti-HER2 é preferivelmente usado, e um derivado reativo obtido reduzindo-se o anticorpo anti-HER2 é particularmente preferido.
[000403] Os seguintes são compostos mais preferidos como um intermediário de produção. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX).
[000404] Entre o grupo de composto de intermediário supracitado, um composto representado pela seguinte fórmula: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ou (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[000405] é um outro composto preferido.
[000406] Para obter a quantidade do conjugado, uma pluralidade de conjugados obtidos sob condições de produção similares para ter um número equivalente de fármaco (por exemplo, cerca de ±1) pode ser misturada para preparar novos grupos. Neste caso, o número médio de fármacos cai entre os números médios de fármacos nos conjugados antes da misturação.
2. MÉTODO DE PRODUÇÃO 2
[000407] O composto representado pela fórmula (2) como um intermediário usado no método de produção anterior e um sal farmacologicamente aceitável do mesmo pode ser produzido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 22
Figure img0025
[000408] Na fórmula, L1’ representa um grupo maleimidila terminal, e P1, P2, e P3 cada qual representa um grupo protetor.
[000409] O composto (6) pode ser produzido por derivação do ácido carboxílico (5) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-o com NH2-DX(4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo. NH2-DX (4) indica exatecana (nome químico: (1S, 9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2, 3-di-hidro-9-hidróxi- 4-metil-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-10, 13(9H, 15H)-diona).
[000410] Reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser empregados para a reação. Há vários tipos de éster ativo. Por exemplo, pode ser produzido reagindo-se fenóis tais como p-nitrofenol, N-hidróxi benzotriazol, N-hidróxi succinimida, ou similares, com o ácido carboxílico (5) usando um agente de condensação tal como N, N'- diciclohexilcarbodiimida ou cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida. Além disso, o éster ativo pode ser produzido da mesma forma por uma reação do ácido carboxílico (5) com trifluoroacetato de pentafluorofenila ou similares; uma reação do ácido carboxílico (5) com 1- hexafluorofosfito de benzotriazolil oxitripirrolidinofosfônio; uma reação do ácido carboxílico (5) com cianofosfonato de dietila (método de dispersão); uma reação do ácido carboxílico (5) com trifenilfosfina e 2, 2'-dipiridil dissulfeto (método de Mukaiyama); uma reação do ácido carboxílico (5) com um derivado de triazina tal como cloreto de 4-(4, 6-dimetóxi-1, 3, 5-triazin-2-il)-4- metilmorfolínio (DMTMM); ou similares. Além disso, a reação pode ser realizada da mesma forma, por exemplo, por um método de haleto ácido pelo qual o ácido carboxílico (5) é tratado com um haleto ácido tal como cloreto de tionila e cloreto de oxalila na presença de uma base.
[000411] Reagindo-se o éster ativo, anidrido ácido misturado, ou haleto ácido do ácido carboxílico (5) obtido como acima com o composto (4) na presença de uma base adequada em um solvente inerte a -78oC a 150oC, o composto (6) pode ser produzido. (Enquanto isso, "solvente inerte" indica um solvente que não inibe uma reação para a qual o solvente é usado.)
[000412] Exemplos específicos da base usados para cada etapa descrita acima incluem um carbonato, alcóxido, hidróxido ou hidreto de um metal de álcali ou um metal alcalinoterroso tal como cabonato de sódio, carbonato de potássio, etóxido de sódio, butóxido de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidreto de sódio, e hidreto de potássio; uma base organometálica representada por um alquil lítio tal como n-butil lítio, ou dialquilamino lítio tal como di-isopropilamida de lítio; uma base organometálica de bissililamina tal como bis(trimetilsilil)amida de lítio; e uma base orgânica incluindo uma amina terciária ou um composto heterocíclico contendo nitrogênio tais como piridina, 2, 6-lutidina, colidina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N- metil morfolina, di-isopropiletilamina, e diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU).
[000413] Exemplos do solvente inerte que é usado para a reação da presente invenção incluem um solvente de hidrocarboneto halogenado tais como diclorometano, clorofórmio, e tetracloreto de carbono; um solvente de éter tal como tetra-hidrofurano, 1, 2-dimetoxietano, e dioxano; um solvente de hidrocarboneto aromático tal como benzeno e tolueno; e um solvente de amida tal como N, N-dimetilformamida, N, N-dimetilacetamida, e N-metilpirrolidin-2-ona. Além destes, um solvente de sulfóxido tal como dimetil sulfóxido e sulfolano; e um solvente de cetona tal como acetona e metil etil cetona e um solvente de álcool tais como metanol e etanol podem ser usados em alguns casos. Além disso, um solvente misturado do mesmo pode da mesma forma ser usado.
[000414] Quanto ao grupo protetor P1 para o grupo amino terminal do composto (6), um grupo protetor para um grupo amino que é geralmente usado para síntese de peptídeo, por exemplo, um grupo terc-butilóxi carbonila, um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, ou um grupo benzilóxi carbonila, pode ser usado. Exemplos de outros grupos protetores para um grupo amino incluem um grupo alcanoíla tal como um grupo acetila; um grupo alcoxicarbonila tal como um grupo metoxicarbonila e um grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetóxi carbonila tal como um grupo parametoxibenzilóxi carbonila, e um grupo para (ou orto)nitrobenzilóxi carbonila; um grupo arilmetila tal como um grupo benzila e um grupo trifenil metila; um grupo aroíla tal como um grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila tal como um grupo 2, 4-dinitrobenzeno sulfonila e um grupo ortonitrobenzeno sulfonila. O grupo protetor P1 pode ser selecionado dependendo, por exemplo, das propriedades do composto tendo o grupo amino a ser protegido.
[000415] Por desproteção do grupo protetor P1 para o grupo amino terminal do composto (6) obtido, o composto (7) pode ser produzido. Na desproteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.
[000416] O composto (9) pode ser produzido por derivação do ácido peptídeo carboxílico (8) tendo o N terminal protegido com P2 em um éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-o com o composto (7) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido peptídeo carboxílico (8) e o composto (7) podem ser selecionados adequadamente a partir daquelas descritas para a síntese do composto (6). O grupo protetor P2 pode ser selecionado adequadamente a partir daqueles descritos para o grupo protetor do composto (6), e a seleção pode ser feita com base, por exemplo, nas propriedades do composto tendo o grupo amino a ser protegido. Como é geralmente usado para a síntese de peptídeo, por repetição sequencial da reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo constituindo o ácido peptídeo carboxílico (8) para alongamento, o composto (9) pode da mesma forma ser produzido.
[000417] Por desproteção do grupo protetor P2 para o grupo amino do composto (9) obtido, o composto (10) pode ser produzido. Na desproteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.
[000418] É possível produzir o composto (2) por derivação do ácido carboxílico (11) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-o com o composto (10) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico (11) e o composto (10) podem adequadamente ser selecionadas a partir daquelas descritas para a síntese do composto (6).
[000419] O composto (9) pode ser produzido da mesma forma pelo seguinte método, por exemplo.
[000420] O composto (13) pode ser produzido por derivação do ácido peptídeo carboxílico (8) tendo o N terminal protegido com P2 em um éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-o na presença de uma base com o composto de amina (12) tendo o grupo carbóxi protegido com P3. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido peptídeo carboxílico (8) e o composto (12) podem ser selecionadas adequadamente a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo protetor P2 para o grupo amino do composto (13) não está particularmente limitado contanto que geralmente seja um grupo protetor usado.
[000421] Especificamente, exemplos do grupo protetor para um grupo hidroxila podem incluir um grupo alcoximetila tal como um grupo metoximetila; um grupo arilmetila tal como um grupo benzila, um grupo 4-metoxibenzila, e um grupo trifenilmetila; um grupo alcanoíla tal como um grupo acetila; um grupo aroíla tal como um grupo benzoíla; e um grupo silila tal como um grupo terc-butil difenilsilila. Grupo carbóxi pode ser protegido, por exemplo, como um ester com um grupo alquila tal como um grupo metila, um grupo etila, e um grupo terc-butila, um grupo alila, ou um grupo arilmetila tal como um grupo benzila. Exemplos do grupo protetor para um grupo amino podem incluir: um grupo alquilóxi carbonila tal como um grupo terc-butilóxi carbonila, um grupo metoxicarbonila, e um grupo etoxicarbonila; um grupo aliloxicarbonila, ou um grupo arilmetóxi carbonila tal como um grupo 9- fluorenilmetilóxi carbonila, um grupo benzilóxi carbonila, um grupo parametoxibenzilóxi carbonila, e um grupo para (ou orto)nitrobenzilóxi carbonila; um grupo alcanoíla tal como um grupo acetila; um grupo arilmetila tal como um grupo benzila e um grupo trifenil metila; um grupo aroíla tal como um grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila tal como um grupo 2, 4-dinitrobenzeno sulfonila ou um grupo ortonitrobenzeno sulfonila.
[000422] Quanto ao grupo protetor P3 para um grupo carbóxi, um grupo protetor geralmente usado como um grupo protetor para um grupo carbóxi na química sintética orgânica, em particular, síntese de peptídeo pode ser usado. Especificamente, pode ser selecionado adequadamente a partir dos grupos protetores descritos acima, por exemplo, ésteres com um grupo alquila tal como um grupo metila, um grupo etila, ou uma terc-butila, ésteres de alila, e ésteres de benzila.
[000423] Em tais casos, o grupo protetor para um grupo amino e o grupo protetor para um grupo carbóxi podem ser preferivelmente aqueles removidos por um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação em que P2 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P3 é um grupo benzila. Os grupos protetores podem ser selecionados a partir daqueles acima mencionados dependendo, por exemplo, das propriedades dos compostos tendo o grupo amino e o grupo carbóxi a ser protegido. Para remoção dos grupos protetores, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.
[000424] Por desproteção do grupo protetor P3 para o grupo carbóxi do composto (13) obtido, o composto (14) pode ser produzido. Na desproteção, reagentes e condições são selecionadas dependendo do grupo protetor.
[000425] O composto (9) pode ser produzido por derivação do composto (14) obtido em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser selecionados adequadamente a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[000426] O composto (2) pode ser produzido da mesma forma pelo seguinte método, por exemplo.
[000427] Por desproteção do grupo protetor P2 para o grupo amino do composto (13), o composto (15) pode ser produzido. Na desproteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.
[000428] O composto (16) pode ser produzido por derivação do derivado de ácido carboxílico (11) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-o na presença de uma base com o composto (15) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de amida entre o ácido peptídeo carboxílico (11) e o composto (15) podem ser selecionadas adequadamente a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[000429] Por desproteção do grupo protetor para o grupo carbóxi do composto (16) obtido, o composto (17) pode ser produzido. A desproteção pode ser realizada semelhantemente para o desproteção no grupo carbóxi para produzir o composto (14).
[000430] O composto (2) pode ser produzido por derivação do composto (17) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-o com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser selecionados adequadamente a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6).
3. MÉTODO DE PRODUÇÃO 3
[000431] O composto representado pela fórmula (2) de um intermediário pode ser produzido da mesma forma pelo seguinte método.
Figure img0026
[000432] Na fórmula, L1’ corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o terminal é convertido a um grupo maleimidila, e P4 representa um grupo protetor.
[000433] O composto (19) pode ser produzido por derivação do composto (11) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-o na presença de uma base com o ácido peptídeo carboxílico (18) tendo o C terminal protegido com P4. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido peptídeo carboxílico (18) e o composto (11) podem ser selecionados adequadamente a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo protetor P4 para o grupo carbóxi do composto (18) pode ser selecionado adequadamente a partir dos grupos protetores descritos acima.
[000434] Por desproteção do grupo protetor para o grupo carbóxi do composto (19) obtido, o composto (20) pode ser produzido. A desproteção pode ser realizada similarmente à desproteção do grupo carbóxi para produzir o composto (14).
[000435] O composto (2) pode ser produzido por derivação do composto (20) obtido em um éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-o com o composto (7). Para a reação, reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser selecionados adequadamente a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6).
4. MÉTODO DE PRODUÇÃO 4
[000436] A seguir, o método para produzir o composto (10b) tendo n1 = 1, La = O no intermediário de produção (10) descrito no Método de produção 2 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (10b), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 24
Figure img0027
[000437] Na fórmula, LP é como definido acima, L representa um grupo acila que é um grupo alcanoíla tal como um grupo acetila ou um grupo aroíla tal como grupo benzoíla, ou um átomo de hidrogênio, X e Y cada qual representa um oligopeptídeo consistindo em 1 a 3 aminoácidos, P5 e P7 cada qual representa um grupo protetor para um grupo amino, e P6 representa um grupo protetor para um grupo carbóxi.
[000438] Um composto representado pela fórmula (21) pode ser produzido usando ou aplicando o método descrito na Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 2002-60351 ou a literatura (J. Org. Chem., Vol. 51, página 3196, 1986), e conduzindo-se a remoção dos grupos protetores ou modificação dos grupos funcionais, se necessário. Além disso, pode ser da mesma forma obtido tratando-se um aminoácido com um grupo amino terminal protegido ou uma amida ácida de um oligopeptídeo com grupo amino protegido com um aldeído ou uma cetona.
[000439] Reagindo-se o composto (21) com o composto (22) tendo um grupo hidroxila em uma temperatura variando de sob condições de temperatura de resfriamento à temperatura ambiente em um solvente inerte na presença de um ácido ou uma base, o composto (23) pode ser produzido.
[000440] Aqui, exemplos do ácido que pode ser usado incluem um ácido inorgânico tais como ácido fluorídrico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e ácido bórico; um ácido orgânico tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido paratolueno sulfônico, e ácido metanossulfônico; e um ácido de Lewis tais como tetrafluoroborato, cloreto de zinco, cloreto de estanho, cloreto de alumínio, e cloreto de ferro. Entre estes, um ácido sulfônico, em particular, ácido paratolueno sulfônico é preferível. Quanto à base, qualquer uma das bases já mencionadas pode ser adequadamente selecionada e usada. Exemplos preferidos das mesmas incluem um alcóxido de metal de álcali tal como terc-butóxido de potássio, um hidróxido de metal de álcali tal como hidróxido de sódio e hidróxido de potássio; um hidreto de metal de álcali ou de metal alcalinoterroso tal como hidreto de sódio e hidreto de potássio; uma base organometálica representada por dialquilamino lítio tal como di-isopropilamida de lítio; e uma base organometálica de bissililamina tal como bis(trimetilsilil)amida de lítio.
[000441] Exemplos do solvente a ser usado para a reação incluem um solvente de éter tal como tetra-hidrofurano e 1,4-dioxano; e um solvente de hidrocarboneto aromático tais como benzeno e tolueno. Aqueles solventes podem ser preparados como uma mistura com água.
[000442] Além disso, o grupo protetor para um grupo amino como exemplificado por P5 não está limitado particularmente contanto que seja um grupo geralmente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos protetores para um grupo amino que são descritos no Método de produção 2. Entretanto, na reação presente, pode haver casos em que o grupo protetor para um grupo amino como exemplificado por P5 é clivado. Em tais casos, um grupo protetor pode ser introduzido novamente realizando-se adequadamente uma reação com um reagente adequado para proteger um grupo amino como pode ser requerido.
[000443] O composto (24) pode ser produzido removendo-se o grupo protetor P6 do composto (23). Aqui, exemplos representativos do grupo protetor para um grupo carbóxi como exemplificado por P6 são descritos no Método de produção 2, e podem ser selecionados adequadamente a partir destes. No composto (23), é desejável neste caso que o grupo protetor P5 para um grupo amino e grupo protetor P6 para um grupo carbóxi são os grupos protetores que podem ser removidos por um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P5 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi e P6 é um grupo benzila. Os grupos protetores podem ser selecionados dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo o grupo amino e o grupo carbóxi a serem protegidos. Para a remoção dos grupos protetores, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo protetor.
[000444] O composto (26) pode ser produzido por derivação do ácido carboxílico (24) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-o com o composto (4) ou um sal farmacologicamente aceitável dos mesmos produzir o composto (25) seguido por remoção do grupo protetor P5 do composto (25) obtido. Para a reação entre o composto (4) e o ácido carboxílico (24) e a reação para remover o grupo protetor P6, os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para o Método de produção 2 podem ser usados.
[000445] O composto (10b) pode ser produzido reagindo-se o composto (26) com um aminoácido com um grupo amino terminal protegido ou o oligopeptídeo (27) com um grupo amino protegido para produzir o composto (9b) e removendo-se o grupo protetor P7 do composto (9b) obtido. O grupo protetor para um grupo amino como representado por P7 não está limitado particularmente contanto que seja geralmente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos dos mesmos incluem os grupos protetores para um grupo amino que são descritos no Método de produção 2. Para remover o grupo protetor, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo protetor. Para a reação entre o composto (26) e o composto (27), reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser empregados. O composto (10b) produzido pelo método acima mencionado pode ser derivado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrito acima.
5. MÉTODO DE PRODUÇÃO 5
[000446] A seguir, o método para produzir o composto (2) tendo n1 = 1, n2 = 1, La = O no intermediário de produção (2) descrito no Método de produção 2 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (2), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 25
Figure img0028
[000447] Na fórmula, L1’, L2, LP é como definidos acima, Z representa um oligopeptídeo consistindo em 1 a 3 aminoácidos, P8 representa um grupo protetor para um grupo amino, e P9 representa um grupo para um grupo protetor carbóxi.
[000448] O composto (30) pode ser produzido removendo-se o grupo protetor P8 do aminoácido ou oligopeptídeo (28) com o grupo amino terminal protegido e grupo carbóxi para produzir o composto (29) e reagindo-se a forma de amina obtida (29) com o composto (11). O grupo protetor para um grupo amino como representado por P8 não está limitado particularmente contanto que seja um grupo geralmente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos protetores para um grupo amino que é descrito no Método de produção 2. Além disso, para remover o grupo protetor P8, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor. Para a reação entre o composto (29) e o ácido carboxílico (11), os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para o Método de produção 2 podem ser usados.
[000449] O intermediário de produção (2b) pode ser produzido removendo-se o grupo protetor P9 do composto (30) para produzir o composto (31) e reagindo o ácido carboxílico obtido (31) com o composto (26). Os exemplos representativos do grupo protetor para um grupo carbóxi como representado por P8 são descritos no Método de produção 2. Para a reação de desproteção dos mesmos, os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para o Método de produção 2 podem ser usados. Para a reação entre o composto (26) e o ácido carboxílico (31), reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados. O composto (2b) produzido pelo método acima mencionado pode ser derivado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrito acima.
6. MÉTODO DE PRODUÇÃO 6
[000450] A seguir, um método para produzir o composto (17b) tendo n1 = 1, n2 = 1, La = O no intermediário de produção (17) descrito no Método de produção 2 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (17b), um sal ou um solvato do mesmo pode ser da mesma forma produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 26
Figure img0029
[000451] Na fórmula, L1’, L2, LP, X, Y, P5, P6, e P7 são como definidos acima.
[000452] O composto (33) pode ser produzido por desproteção do grupo protetor P5 para o grupo amino do composto (23) tendo o grupo amino terminal protegido e grupo carbóxi para produzir o composto (32) e reagindo-se o derivado de amina obtido (32) com o oligopeptídeo (27) tendo um grupo amino terminal protegido ou um grupo amino protegido. O grupo protetor para um grupo amino como representado por P5 não está limitado particularmente contanto que seja um grupo geralmente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos protetores para um grupo amino que é descrito no Método de produção 2. Além disso, para remover o grupo protetor P5, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor. Aqui, contudo, exemplos representativos do grupo protetor para um grupo carbóxi como representado por P6 e o grupo protetor para um grupo amino como representado por P7 incluem os grupos protetores para um grupo carbóxi e um grupo amino que são descritos no Método de produção 2. É desejável que no composto (33), o grupo protetor P6 para um grupo carbóxi e grupo protetor P7 para um grupo amino sejam grupos protetores que podem ser removidos pelo mesmo método ou pelas mesmas condições. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P6 é um grupo benzil éster e P7 é um grupo benziloxicarbonila.
[000453] O composto (34) pode ser produzido removendo-se o grupo protetor P6 para o grupo carbóxi do composto (33) e do grupo protetor P7 para o grupo amino do composto (33). O composto (37) pode ser produzido da mesma forma removendo-se sequencialmente o grupo protetor P6 para o grupo carbóxi e o grupo protetor P7 para o grupo amino, e, além disso, o composto (34) pode ser produzido simplesmente removendo-se imediatamente ambos os grupos protetores P6 e P7 que podem ser removidos pelo mesmo método ou pelas mesmas condições.
[000454] O composto (17b) pode ser produzido reagindo-se o composto obtido (34) com o composto (11). Para a reação entre o composto (34) e o composto (11), os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para o Método de produção 2 podem ser usados.
[000455] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção, quando é deixado no ar ou recristalizado ou purificado, pode absorver umidade ou pode ter água de absorção ou transformar em um hidrato, e tais compostos ou sais contendo água são da mesma forma incluídos na presente invenção.
[000456] Compostos rotulados com vários isótopos radioativos ou não radioativos são da mesma forma incluídos na presente invenção. Um ou mais átomos que constituem o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem conter um isótopo atômico em uma relação não natural. Exemplos de isótopos atômicos incluem deutério (2H), trício (3H), iodo-125 (125I), e carbono-14 (14C). Além disso, o composto da presente invenção pode ser radioativo-rotulado com um isótopo radioativo tais como trício (3H), iodo-125 (125I), carbono-14 (14C), cobre-64 (64Cu), zircônio-89 (89Zr), iodo-124 (124I), flúor-18 (18F), índio-111 (111I), carbono-11 (11C) e iodo-131 (131I). O composto rotulado com um isótopo radioativo é útil como um agente terapêutico ou profilático, um reagente para pesquisa tal como um reagente de ensaio e um agente para diagnóstico tal como um agente de imageamento diagnóstico em vivo. Sem estar relacionado à radioatividade, qualquer tipo variante de isótopo do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção está dentro do escopo da presente invenção. FÁRMACOS
[000457] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção exibe atividade citotóxica contra células cancerosas, e desse modo, pode ser usado como um fármaco, particularmente como um agente terapêutico e/ou agente profilático para o câncer.
[000458] Isto é, o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser seletivamente usado como um fármaco para quimioterapia que é um método principal para tratar o câncer, e como um resultado, pode atrasar o desenvolvimento das células cancerosas, inibir o crescimento das mesmas, e também matar as células cancerosas. Isto pode permitir os pacientes com câncer ficarem livres de sintomas causados por câncer ou alcançar melhoria em QOL de pacientes com câncer e atingir um efeito terapêutico sustentando-se as vidas dos pacientes com câncer. Até mesmo se o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção não realize a morte das cancerosas, ele pode obter QOL mais alto de pacientes com câncer enquanto alcançando a sobrevivência a longo prazo, inibindo-se ou controlando-se o crescimento das células cancerosas.
[000459] Em tal terapia de fármaco, pode ser usado como um fármaco sozinho e além disso, pode ser usado como um fármaco em combinação com uma terapia adicional em terapia adjuvante e pode ser combinado com operação cirúrgica, radioterapia, terapia hormonal, ou similares. Além disso, pode ser usado da mesma forma como um fármaco para terapia de fármaco em terapia neoadjuvante.
[000460] Além do uso terapêutico como descrito acima, um efeito de suprimir o crescimento de células cancerosas metastáticas pequenas e também de matá-las pode da mesma forma ser esperado. Particularmente, quando a expressão de HER2 é confirmada em células cancerosas primárias, a inibição de metástase de câncer ou um efeito profilático pode ser esperada administrar o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção. Por exemplo, um efeito de inibir e matar as células em um fluido do corpo no curso de metástase ou um efeito, por exemplo, de inibir e matar células cancerosas pequenas imediatamente após o implante em qualquer tecido pode ser esperado. Consequentemente, a inibição da metástase de câncer ou um efeito profilático pode ser esperado, particularmente, depois da remoção cirúrgica do câncer.
[000461] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser esperado exercer o efeito terapêutico por administração como terapia sistêmica para pacientes, e adicionalmente, por administração local aos tecidos cancerosos.
[000462] Exemplos do tipo de câncer ao qual o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção é aplicado podem incluir câncer de pulmão, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, câncer de cerviz uterino, câncer esofágico, carcinoma de célula escamosa, câncer peritoneal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer uterino, câncer da glândula salival, câncer renal, câncer vulvar, câncer da tireoide, ou câncer de pênis. O objeto de tratamento do conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção é uma célula cancerosa expressando, em uma célula cancerosa como um indivíduo de tratamento, proteína de HER2 que o anticorpo dentro do conjugado de anticorpo-fármaco pode reconhecer. O termo "câncer expressando a proteína de HER2" quando usado na presente especificação é um câncer contendo células tendo a proteína de HER2 em sua superfície celular. A proteína de HER2 é superexpressa em vários tumores humanos e pode ser avaliada geralmente usando um método realizado na técnica, tal como método de manchamento imunoistoquímico (IHC) para avaliar a superexpressão da proteína de HER2, ou método de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para avaliar a amplificação do gene de HER2.
[000463] Além disso, o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção exibe um efeito antitumor reconhecendo-se, por seu anticorpo anti-HER2, a proteína de HER2 expressa na superfície das células cancerosas e interiorizando-se nas células cancerosas. Desse modo, o objeto de tratamento do conjugado de anticorpo- fármaco anti-HER2 da presente invenção não está limitado ao "câncer expressando a proteína de HER2" e pode da mesma forma ser, por exemplo, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma, ou sarcoma.
[000464] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser administrado preferivelmente a um mamífero, porém, é administrado mais preferivelmente a um humano.
[000465] Substâncias usadas em uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção podem ser selecionadas adequadamente e podem ser aplicadas a partir de aditivos de formulação ou similares que são geralmente usadas na técnica, devido à dosagem ou concentração de administração.
[000466] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica contendo PElo menos um ingrediente farmaceuticamente adequado. Por exemplo, a composição farmacêutica acima tipicamente contém pelo menos um veículo farmacêutico (por exemplo, líquido esterilizado). Aqui, o líquido inclui, por exemplo, água e óleo (óleo de petróleo e óleo de origem animal, origem de planta, ou de origem sintética. O óleo pode ser, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, ou óleo de gergelim. Água é um veículo mais típico quando a composição farmacêutica acima é intravenosamente administrada. Solução salina, uma solução de dextrose aquosa, e uma solução de glicerol aquosa podem da mesma forma ser usadas como veículo líquido, em particular, para uma solução de injeção. Um veículo farmacêutico adequado pode ser selecionado daqueles conhecidos na técnica. Se desejado, a composição acima pode da mesma forma conter uma quantidade de traço de um agente hidratante, agente de emulsificação, ou um agente de tamponamento de pH. Exemplos de veículo farmacêutico adequado são descritos em "Remington’s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. As formulações correspondem a um modo de administração.
[000467] Vários sistemas de liberação são conhecidos e eles podem ser usados para administrar o conjugado de anticorpo-fármaco anti- HER2 da presente invenção. Exemplos da rotina de administração podem incluir rotinas intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, e subcutâneas, porém, não limitadas a estes. A administração pode ser feita por injeção ou injeção de bolo, por exemplo. De acordo com uma modalidade preferida específica, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada pór injeção. A administração parenteral é uma rotina de administração preferida.
[000468] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita, como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a humano, de acordo com os procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em uma solução de tamponamento aquosa estéril e isotônica. Se necessário, o fármaco pode conter agente de solubilização e anestésicos locais para aliviar a dor no sítio de injeção (por exemplo, lignocaína). Geralmente, o ingrediente acima é fornecido individualmente como qualquer um dentre pó liofilizado ou um concentrado anidroso contido em um recipiente que é obtido selando-se em uma ampola ou um sachê tendo uma quantidade do agente ativo ou como uma mistura em uma forma de dosagem unitária. Quando o fármaco deve ser administrado por injeção, pode ser administrado a partir de um frasco de injeção contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Quando o fármaco é administrado por injeção, uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção pode ser fornecida tal que os ingredientes acima mencionados são misturados entre si antes da administração.
[000469] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica contendo apenas o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 e pelo menos um agente de tratamento de câncer diferente do conjugado. O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 da presente invenção pode ser administrado com outros agentes de tratamento de câncer. O efeito anticâncer pode ser realçado consequentemente. Outros agentes anticâncer usados para tal propósito podem ser administrados a um indivíduo simultaneamente com, separadamente de, ou subsequentemente ao conjugado de anticorpo-fármaco, e podem ser administrados enquanto variando o intervalo de administração para cada. Exemplos de agentes de tratamento de câncer incluem 5-FU, pertuzumabe, paclitaxel, carboplatina, cisplatina, gencitabina, capecitabina, irinotecana (CPT- 11), paclitaxel, docetaxel, pemetrexede, sorafenibe, vimblastina, vinorelbina, everolimus, tanespimicina, bevacizumabe, oxaliplatina, lapatinibe, ado-trastuzumabe entansina (T-DM1), ou fármacos descritos na Publicação Internacional No. WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorrelina, gosserrelina, ou similares), fosfato de estramustina, antagonistas de estrogênio (tamoxifeno, raloxifeno, ou similares), e inibidores de aromatase (anastrozol, letrozol, exemestano, ou similares), porém, não estão limitados contanto que eles sejam fármaco tendo uma atividade antitumor.
[000470] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma formulação de liofilização ou uma formulação líquida como uma formulação tendo a composição desejada e pureza exigida. Quando formulada como uma formulação de liofilização, pode ser uma formulação contendo aditivos de formulação adequados que são usados na técnica. Da mesma forma para uma formulação líquida, pode ser formulada como uma formulação líquida contendo vários aditivos de formulação que são usados na técnica.
[000471] A composição e a concentração da composição farmacêutica podem variar dependendo de método de administração. Entretanto, o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER2 contido na composição farmacêutica da presente invenção pode exibir um efeito farmacêutico mesmo em uma dosagem pequena quando o conjugado de anticorpo-fármaco tem uma afinidade mais alta por um antígeno, isto é, uma afinidade mais alta (= valor de Kd mais baixo) em termos da constante de dissociação (isto é, valor de Kd) para o antígeno. Desse modo, para determinar a dosagem do conjugado de anticorpo- fármaco, a dosagem pode ser determinada devido à situação relativa à afinidade entre o conjugado de anticorpo-fármaco e antígeno. Quando o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é administrado a um humano, por exemplo, cerca de 0,001 a 100 mg/kg podem ser administrados uma vez ou administrados várias vezes com um intervalo de, por 1 a 180 dias.
[000472] uma vez com um intervalo de 1 a 180 dias
EXEMPLOS
[000473] A presente invenção é especificamente descrita devido aos exemplos mostrados abaixo. Entretanto, a presente invenção não está limitada a estes. Além disso, não é por nenhum meio interpretada de um modo limitado. Além disso, a menos que especificamente descrito de outra maneira, o reagente, solvente, e material de partida descritos na especificação podem ser obtidos facilmente a partir de um fornecedor comercial. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 PREPARAÇÃO DE TRASTUZUMABE
[000474] Quatorze frasconetes de 440 mg/frasconete de Herceptina (Genentech, Inc.) foram dissolvidos em 2 L de tampão de cromatografia de permuta de cátion A (25 mM de tampão de citrato, 30 mM de NaCl, pH 5,0) e filtrados por um filtro de 0,2 μm (Millipore Corp.: Stericup 0,22 μm, Membrana de GVPVDF). As amostras foram aplicadas a uma coluna de cromatografia de permuta de cátion (SP Sepharose HP 240 ml, coluna XK50), seguido por eluição sob um gradiente linear de concentração de NaCl de 30 mM a 500 mM usando tampão de cromatografia de permuta de cátion B (25 mM de tampão de citrato, 500 mM de NaCl, pH 5,0) para separar as frações de monômero de IgG. Amostras de monômero tendo uma pureza mais alta acima de 98 % por análise de cromatografia de exclusão de tamanho foram combinadas e concentradas com UF30K (Millipore Corp.: PELLICON XL Filter, BIOMAX 30K, PXB030A50), e o tampão foi substituído com tampão de CBS (10 mM de citrate/140 mM de NaCl, pH 6,0). As amostras substituídas por tampão de CBS foram filtradas por um filtro de 0,2 μm (Sartorius AG: Minisart-Plus 0,2 μm, 17823K).
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 PRODUÇÃO DE TRASTUZUMABE ENTANSINA T-DM1
[000475] A derivação de SMCC do anticorpo: Usando-se o Procedimento comum C-2 (PBS6.5/EDTA foi usado como uma solução de tamponamento), Procedimento comum A, e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção em 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foram usados) descrito no Método de produção 1, a substituição de tampão com PBS6.5/EDTA foi conduzida no trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 para preparar uma solução contendo trastuzumabe (160,0 mg) dissolvida em PBS6.5/EDTA (7,60 mL) em um tubo de polipropileno de 15 mL. Subsequentemente, SMCC (1,84 mg) solução de DMSO (0,40 mL; que corresponde a cerca de 5,1 equivalentes por molécula de anticorpo) foram adicionados em temperatura ambiente. A mistura reacional foi ajustada para ter uma concentração de anticorpo de 20mg/mL, e a reação foi realizada em temperatura ambiente usando um rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) durante 2 horas. Esta solução de reação foi submetida à purificação de acordo com o Procedimento comum D-2 (PBS6.5/EDTA foi usado como uma solução de tamponamento) para produzir 12 mL de uma solução contendo 154,9 mg do anticorpo de derivado de SMCC. A conjugação entre o anticorpo e ligante de fármaco: Adicionar PBS6.5/EDTA (2,56 mL) e N2-desacetil-N2-(3- mercapto-1-oxopropil)-maitansina (4,67 mg; DM1, Journal of Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49, No. 14, pág. 4392) solução de DMA (dimetilacetamida) (0,93 mL; que corresponde a cerca de 5,8 equivalentes por molécula de anticorpo derivada de SMCC) à solução obtida acima no tubo de polipropileno de 50 mL em temperatura ambiente, a solução de reação foi ajustada em uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL, e a reação foi realizada em temperatura ambiente usando um rotador de tubo durante 16,5 horas.
[000476] Procedimento de purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 usando uma solução de tamponamento de fosfato de sódio (10 mM, pH 6.5) contendo cloreto de sódio (137 mM) para produzir 35 mL de uma solução contendo o composto do Exemplo de Referência alvo.
[000477] Caracterização físico-química: usando o Procedimento comum E usando a absorvência UV em dois comprimentos de onda de 252 nm e 280 nm, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000478] Concentração de anticorpo: 4,14 mg/mL, produção de anticorpo: 144,9 mg (91%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,0. Exemplo 1 Intermediário (1) Fórmula 27
Figure img0030
Processo 1: (4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)carbamato de terc-butila,
[000479] Ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL), N-hidroxissuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,216 g, 1,13 mmol) foram adicionados e agitados durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetilformamida (10 mL) carregada com sal de ácido metanossulfônico de exatecana (0,500 g, 0,94 mmol) e trietilamina (0,157 mL, 1,13 mmol), e agitada em temperatura ambiente durante 1 dia. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica- gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 8: 2 (v/v)] para produzir o composto titulado (0,595 g, quantitativo).
[000480] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J = 7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J = 7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,12-2,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000481] MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+ Processo 2: 4-Amino-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]butanamida
[000482] O composto (0,388 g, 0,61 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (9 mL). Ácido trifluoroacético (9 mL) foi adicionado e foi agitado durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir trifluoroacetato do composto titulado (0,343 g, quantitativo).
[000483] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,79-1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000484] MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+ Exemplo 2 Conjugado de anticorpo-fármaco (2) Fórmula 28
Figure img0031
Processo 1: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[000485] N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) foi dissolvido em diclorometano (3 mL), N- hidroxissuccinimida (0,021 g, 0,19 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,036 g, 0,19 mmol) foram adicionados, e em seguida agitados durante 3,5 horas. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N- dimetilformamida (1,5 mL) carregada com o composto (0,080 g, 0,15 mmol) obtido no Processo 2 do Exemplo 1, e agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado (0,106 g, 73%).
[000486] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J = 7,8 Hz), 2,15-2,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J = 12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,1, 4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,16-3,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J = 5,9 Hz), 3,57-3,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,2 Hz).
[000487] MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+ Processo 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida,
[000488] O composto (1,97 g, 2,10 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (7 mL). Depois de adicionar ácido trifluoroacético (7 mL), foi agitado durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos foram carregados com tolueno por destilação azeotrópica. Os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir trifluoroacetato do composto titulado (1,97 g, 99%).
[000489] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J = 13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J = 5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J = 5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J = 5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J = 16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78-7,81 (2H, m), 7,95-7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m).
[000490] MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida,
[000491] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (1,2 mL) do composto (337 mg, 0,353 mmol) obtido no Processo 2 acima, trietilamina (44,3 mL, 0,318 mmol) e hexanoato de N-succinimidil 6- maleimida (119,7 mg, 0,388 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 5 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (278,0 mg, 76%).
[000492] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,66-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,05-2,21 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J = 14,0, 9,8 Hz), 2,98-3,21 (5H, m), 3,55-3,77 (8H, m), 4,41-4,48 (1H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,40 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,44 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,207,27 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,70 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,08 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,14 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,25 (1H, t, J = 6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,5 Hz).
[000493] MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+ Processo 4: Conjugado de anticorpo-fármaco (2)
[000494] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de Produção 1. A solução (3,0 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de 10 mM de cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0934 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,150 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000495] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução acima a 22°C durante 10 minutos, uma solução de DMSO (0,187 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0374 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de N-acetilcisteína (NAC, Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000496] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS6.0 foi usada como solução de tamponamento) descrito no Método de Produção 1 para produzir 6 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado. Depois disso, a solução foi concentrada pelo procedimento Comum A.
[000497] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E descrito no Método de Produção 1, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000498] Concentração de anticorpo: 3,21 mg/mL, rendimento de anticorpo: 22,5 mg (75%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,6. Exemplo 3 Conjugado de anticorpo-fármaco (3) Fórmula 29
Figure img0032
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (3)
[000499] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,487 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,0625 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000500] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,072 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 3 do Exemplo 2 (0,078 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, foi agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0155 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000501] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) descrito no Método de Produção 1 para produzir 6 mL de uma solução que contém o composto de interesse. A solução também foi concentrada pelo procedimento Comum A. Depois disso, usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000502] Concentração de anticorpo: 9,85 mg/mL, rendimento de anticorpo: 6,9 mg (55%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,3. Exemplo 4 Conjugado de anticorpo-fármaco (4) Fórmula 30
Figure img0033
Processo 1: N-[3-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida,
[000503] O composto (80 mg, 0,084 mmol) do Exemplo 1 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando propioato de N-succinimidil 3-maleimida (24,6 mg, 0,0924 mmol) em vez de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (60,0 mg, 73%).
[000504] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,89 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,70-1,78 (2H, m), 1,81-1,94 (2H, m), 2,12-2,23 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,81 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,01-3,15 (3H, m), 3,16-3,23 (2H, m), 3,30-3,35 (1H, m), 3,58-3,71 (6H, m), 3,71-3,79 (1H, m), 4,44-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,0 Hz), 5,27 (1H, d, J = 19,0 Hz), 5,43 (1H, d, J = 17,6 Hz), 5,47 (1H, d, J = 17,6 Hz), 5,57-5,63 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,02 (2H, s), 7,17-7,22 (1H, m), 7,22-7,30 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,73 (1H, t, J = 5,6 Hz), 7,83 (1H, d, J = 10,7 Hz), 8,08 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,15 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,30 (2H, dt, J = 18,7, 5,7 Hz), 8,49 (1H, d, J = 8,8 Hz).
[000505] MS (APCI) m/z: 990 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (4)
[000506] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,0155 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,050 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000507] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,072 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 3 do Exemplo 2 (0,031 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, foi agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0078 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000508] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) para produzir 6 mL de uma solução que contém o composto de interesse. Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000509] Concentração de anticorpo: 1,32 mg/mL, rendimento de anticorpo: 7,9 mg (79%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,1. Exemplo 5 Conjugado de anticorpo-fármaco (5) Fórmula 31
Figure img0034
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (5)
[000510] A quantidade da solução aquosa de TCEP a 10 mM foi ajustada tal que a relação molar de TCEP para o anticorpo na redução de anticorpo foi 4,6. E a quantidade da solução de ligante de fármaco a 10 mM adicionada foi ajustada, tal que a relação molar do composto do Processo 1 do Exemplo 4 para o anticorpo à conjugação de ligante de fármaco foi 9,2. Em seguida, a quantidade da solução aquosa de NAC a 100 mM adicionada foi ajustada, tal que a relação molar de NAC para o anticorpo na terminação da reação foi 18,4. Pelos mesmos procedimentos como o Processo 2 do Exemplo 4, 6 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido, e os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000511] Concentração de anticorpo: 1,23 mg/mL, rendimento de anticorpo: 7,4 mg (74%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,1. Exemplo 6: Conjugado de anticorpo-fármaco (6) Fórmula 32
Figure img0035
Processo 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoil]amino}etóxi)etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N- (4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida,
[000512] O composto (100 mg, 0,119 mmol) obtido 2 do Exemplo no Processo 2 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando di-isopropiletilamina (20,8 μL, 0,119 mmol) em vez de trietilamina e N-succinimidil 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato (50,7 mg, 0,119 mmol) em vez de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (66,5 mg, 48%).
[000513] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,85 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,65-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,07-2,19 (4H, m), 2,30 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,33-2,36 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,18 (9H, m), 3,42-3,44 (4H, m), 3,53-3,76 (10H, m), 4,43 (1H, td, J = 8,6, 4,7 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,17 (1H, m), 7,18-7,25 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J = 11,3 Hz), 7,988,03 (2H, m), 8,11 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,44 (1H, d, J = 9,0 Hz).
[000514] MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (6)
[000515] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,019 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,0625 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000516] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 1 (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, foi agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,008 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000517] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) descrito no Método de Produção 1 para produzir 6 mL de uma solução que contém o composto de interesse.
[000518] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000519] Concentração de anticorpo: 1,76 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,6 mg (85%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,6. Exemplo 7 Conjugado de anticorpo-fármaco (7) Fórmula 33
Figure img0036
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (7)
[000520] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,0625 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000521] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,072 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 1 do Exemplo 6 (0,078 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, foi agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0155 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000522] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) para produzir 6 mL de uma solução que contém o composto de interesse.
[000523] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000524] Concentração de anticorpo: 1,93 mg/mL, rendimento de anticorpo: 11,6 mg (93%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,9. Exemplo 8 Conjugado de anticorpo-fármaco (8) Fórmula 34
Figure img0037
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (8)
[000525] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,0625 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000526] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,072 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 1 do Exemplo 6 (0,078 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, foi agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0155 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000527] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (ABS foi usada como solução de tamponamento) para produzir 5,7 mL de uma solução que contém o composto de interesse.
[000528] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000529] Concentração de anticorpo: 1,50 mg/mL, rendimento de anticorpo: 8,55 mg (86%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,2. Exemplo 9 Conjugado de anticorpo-fármaco (9) Fórmula 35
Figure img0038
Processo 1: N-[19-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4, 7, 10, 13-tetraoxo-16-azanonadecan-1-oil]glicilglicil-L-fenilalanil-N- (4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[000530] O composto (90 mg, 0,107 mmol) obtido 2 do Exemplo no Processo 2 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando di-isopropiletilamina (18,7 μL, 0,107 mmol) em vez de trietilamina e N-succinimidil 1-maleinimida-3-oxo-7, 10, 13, 16- tetraoxa-4-azanonadecan-19-oato (55,1 mg, 0,107 mmol) em vez de N-succinimidil 6-maleimidahexanoato para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (50 mg, 37%).
[000531] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,85 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,64-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,06-2,19 (4H, m), 2,27-2,32 (2H, m), 2,33-2,37 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,72-2,80 (3H, m), 2,96-3,19 (6H, m), 3,39-3,48 (10H, m), 3,52-3,75 (10H, m), 4,39-4,48 (1H, m), 5,14 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 17,0 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17,0 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (1H, s), 7,13-7,24 (5H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,10 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,44 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000532] MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (9)
[000533] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000534] Concentração de anticorpo: 1,75 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,5 mg (84%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 10 Conjugado de anticorpo-fármaco (10)
Figure img0039
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (10)
[000535] Usando o trastuzumabe produzido no Referência 1 e o composto obtido 1 do Exemplo 9 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000536] Concentração de anticorpo: 1,79 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,7 mg (86%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,0. Exemplo 11 Intermediário (11)
Figure img0040
Fórmula 37 1: [2-(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]carbamato de terc-butila,
[000537] Sal de ácido metanossulfônico de exatecana (3,10 g, 5,47 mol) foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 1 usando ácido {2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etóxi}acético (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 292; 1,55 g, 6,01 mmol) em vez de ácido 4- (terc-butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (2,56 g, 73%).
[000538] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,26 (9H, s), 1,81-1,91 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,083,26 (4H, m), 3,43-3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J = 15,1 Hz), 4,05 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,22 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,59-5,66 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,86 (1H, t, J = 5,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J = 9,1 Hz).
[000539] MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+ Processo 2: 2-(2-Aminoetóxi)-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]acetamida
[000540] O composto (1,50 g, 2,36 mol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 1 para produzir sal de ácido trifluoroacético do composto titulado como um sólido amarelo pálido (1,50 g, quantitativo).
[000541] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,15-2,23 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,05 (2H, t, J = 5,1 Hz), 3,15-3,23 (2H, m), 3,71 (2H, t, J = 5,1 Hz), 4,10 (2H, s), 5,19 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,66 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,73-7,84 (4H, m), 8,55 (1H, d, J = 9,1 Hz).
[000542] MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+ Exemplo 12 Conjugado de anticorpo-fármaco (12) Fórmula 38
Figure img0041
Processo 1: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2- {[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamida
[000543] O composto (554 mg, 0,85 mmol) do Processo 2 do Exemplo 11 foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado (775 mg, 95%).
[000544] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,85 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,36 (9H, s), 1,78-1,89 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J = 13,4, 9,8 Hz), 2,95 (1H, dd, J = 13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,23-3,32 (2H, m), 3,40-3,62 (8H, m), 3,73 (1H, dd, J = 16,5, 5,5 Hz), 4,03 (2H, s), 4,39-4,47 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J = 16,8 Hz), 5,45 (1H, d, J = 16,8 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (1H, t, J = 5,8 Hz), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,82 (2H, m), 7,90 (1H, t, J = 5,2 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,49 (1H, d, J = 8,5 Hz).
[000545] MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+ Processo 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5- fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1- il]amino}-2-oxoetóxi)etil]glicinamida
[000546] O composto (630 mg, 0,659 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 2 para produzir sal de ácido trifluoroacético do composto titulado (588 mg, 92%).
[000547] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J = 13,4, 10,1 Hz), 2,99 (1H, dd, J = 13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,243,32 (3H, m), 3,41-3,71 (7H, m), 3,86 (1H, dd, J = 16,8, 5,8 Hz), 4,04 (2H, s), 4,52 (1H, td, J = 9,0, 4,1 Hz), 5,17 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,45 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,87-8,01 (4H, m), 8,29-8,36 (2H, m), 8,468,55 (2H, m).
[000548] MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamida
[000549] O composto (240 mg, 0,247 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado (162 mg, 62%).
[000550] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,13-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,78-1,90 (2H, m), 2,09 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,14-2,21 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,74 (1H, dd, J = 13,6, 9,7 Hz), 2,96 (1H, dd, J = 13,6, 4,5 Hz), 3,08-3,24 (1H, m), 3,24-3,30 (1H, m), 3,33-3,40 (4H, m), 3,47-3,68 (7H, m), 3,72 (1H, dd, J = 16,6, 5,7 Hz), 4,03 (2H, s), 4,42 (1H, td, J = 8,6, 4,2 Hz), 5,17 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,81 (2H, m), 7,99 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,03-8,11 (2H, m), 8,22 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J = 9,1 Hz).
[000551] MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+ Processo 4: Conjugado de anticorpo-fármaco (12)
[000552] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 3 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6. A solução também foi concentrada pelo procedimento Comum A. Depois disso, usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000553] Concentração de anticorpo: 10,77 mg/mL, rendimento de anticorpo: 7,5 mg (60%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 13 Conjugado de anticorpo-fármaco (13) Fórmula 39
Figure img0042
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (13)
[000554] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 3 do Exemplo 12 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7. A solução também foi concentrada pelo procedimento Comum A. Depois disso, usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000555] Concentração de anticorpo: 10,69 mg/mL, rendimento de anticorpo: 7,5 mg (60%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,9. Exemplo 14 Intermediário (14)
Figure img0043
Processo 1: (3-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-3- oxopropil)carbamato de terc-butila,
[000556] Sal de ácido metanossulfônico de exatecana (500 mg, 0,941 mmol) foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-β-alanina em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto titulado como um sólido marrom amarelado (616 mg, quantitativo).
[000557] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,29 (9H, s), 1,86 (2H, dt, J = 15,1, 7,3 Hz), 2,04-2,22 (2H, m), 2,31 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,40 (3H, s), 3,10-3,26 (4H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,42 (2H, dd, J = 18,8, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J = 8,5, 4,2 Hz), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000558] MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+ Processo 2: N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-β- alaninamida,
[000559] O composto obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 1 para produzir sal de ácido trifluoroacético do composto titulado como um sólido amarelo (499 mg, 86%).
[000560] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,86 (2H, dquin, J = 14,6, 7,2, 7,2, 7,2, 7,2 Hz), 2,06-2,27 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,46-2,57 (2H, m), 3,08 (2H, t, J = 6,8 Hz), 3,14-3,24 (2H, m), 5,22 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,29 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, dt, J = 8,5, 4,5 Hz), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,74 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000561] MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+ Exemplo 15 Conjugado de anticorpo-fármaco (15) Fórmula 41
Figure img0044
Processo 1: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N- [(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-β- alaninamida,
[000562] O composto (484 mg, 0,780 mmol) obtido no Processo 2 do Exemplo 14 foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (626 mg, 87%).
[000563] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,27-1,42 (9H, m), 1,77-1,93 (2H, m), 2,06-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,40 (3H, d, J = 1,6 Hz), 2,44-2,54 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J = 14,5, 10,2 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,52 (6H, d, J = 6,3 Hz), 4,42-4,54 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,4 Hz), 5,42 (1H, dd, J = 18,4, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J = 8,7, 4,4 Hz), 6,53 (1H, s), 6,98 (1H, t, J = 5,9 Hz), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,77-7,84 (1H, m), 7,91 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,16 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,1 Hz), 8,52 (1H, d, J = 9,0 Hz). Processo 2: Trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2- b]quinolin-1-il]-β-alaninamida
[000564] O composto (624 mg, 0,675 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo (626 mg, 92%).
[000565] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,86 (2H, tt, J = 14,5, 7,2 Hz), 2,07-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,44-2,54 (2H, m), 2,75 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,04 (1H, dd, J = 13,7, 4,3 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,58 (2H, d, J = 4,7 Hz), 3,69 (3H, td, J = 11,2, 5,7 Hz), 3,87 (1H, dd, J = 17,0, 5,7 Hz), 4,54 (1H, m, J = 17,8, 4,5 Hz), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,51-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,88 (1H, t, J = 5,7 Hz), 7,97 (3H, brs), 8,29-8,38 (2H, m), 8,50 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,55 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000566] MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2, 5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-β- alaninamida,
[000567] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado como um sólido (14,0 mg, 21%).
[000568] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,39-1,51 (4H, m), 1,79-1,91 (2H, m), 2,02-2,20 (2H, m), 2,07 (2H, t, J = 7,4 Hz), 2,30-2,42 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,78 (1H, dd, J = 14,1, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,7, 4,9 Hz), 3,12-3,21 (2H, m), 3,26-3,42 (2H, m), 3,50-3,80 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,51-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,84 (2H, m), 8,01 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,06 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,25 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,53 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000569] MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+ Processo 4: Conjugado de anticorpo-fármaco (15)
[000570] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,0155 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,050 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000571] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução a 22°C durante 10 minutos, uma solução de DMSO (0,0311 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00622 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000572] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS6.0 foi usado como solução de tamponamento) para produzir 6 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000573] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000574] Concentração de anticorpo: 1,18 mg/mL, rendimento de anticorpo: 7,08 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,0. Exemplo 16 Conjugado de anticorpo-fármaco (16) Fórmula 42
Figure img0045
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (16)
[000575] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,0311 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,050 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000576] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução a 22°C durante 10 minutos, uma solução de DMSO (0,0622 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido 3 do Exemplo 15 no Processo foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0124 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000577] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS6.0 foi usado como solução de tamponamento) para produzir 6 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000578] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000579] Concentração de anticorpo: 1,03 mg/mL, rendimento de anticorpo: 6,18 mg (62%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 17 Conjugado de anticorpo-fármaco (17) Fórmula 43
Figure img0046
Processo 1: N-[3-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanoil] glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida,
[000580] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 do Exemplo 15 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando propionato de N-succinimidil 3-maleimida em vez de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimidato para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (36,0 mg, 57%).
[000581] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,85 (2H, dt, J = 14,4, 7,5 Hz), 2,05-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,302,44 (5H, m), 2,73-2,84 (1H, m), 3,02 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,17 (3H, d, J = 5,1 Hz), 3,26-3,40 (2H, m), 3,41-3,81 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,52-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (2H, d, J = 10,2 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,12 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,20-8,31 (2H, m), 8,52 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000582] MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (17)
[000583] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000584] Concentração de anticorpo: 1,74 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,4 mg (83%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 18 Conjugado de anticorpo-fármaco (18) Fórmula 44
Figure img0047
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (18)
[000585] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 do Exemplo 17 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000586] Concentração de anticorpo: 1,98 mg/mL, rendimento de anticorpo: 11,9 mg (95%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,6. Exemplo 19 Conjugado de anticorpo-fármaco (19) Fórmula 45
Figure img0048
Processo 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoil]amino}) etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N- [(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2- b]quinolin-1-il]-β-alaninamida,
[000587] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 do Exemplo 15 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando N-succinimidil 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato em vez de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimidato para produzir o composto titulado como um sólido (23,0 mg, 31%).
[000588] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,77-1,92 (2H, m), 2,07-2,21 (2H, m), 2,27-2,42 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,84 (1H, m), 2,97-3,06 (1H, m), 3,09-3,21 (4H, m), 3,25-3,39 (6H, m), 3,45 (4H, s), 3,50-3,80 (8H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 18,4 Hz), 5,26 (1H, m, J = 18,4 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,51-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,87 (2H, m), 7,93-8,07 (2H, m), 8,09-8,21 (2H, m), 8,26 (1H, brs), 8,54 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000589] MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (19)
[000590] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000591] Concentração de anticorpo: 1,60 mg/mL, rendimento de anticorpo: 9,6 mg (77%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,9. Exemplo 20 Conjugado de anticorpo-fármaco (20) Fórmula 46
Figure img0049
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (20)
[000592] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 do Exemplo 19 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000593] Concentração de anticorpo: 1,69 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,1 mg (81%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,0. Exemplo 21 Conjugado de anticorpo-fármaco (21) Fórmula 47
Figure img0050
Processo 1: N-[19-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4, 7, 10, 13-tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil]glicilglicil-L- fenilalanilglicil-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-β- alaninamida,
[000594] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 do Exemplo 15 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando N-succinimidil 1-maleinimida-3-oxo-7, 10, 13, 16- tetraoxa-4-azanonadecanoato em vez de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para produzir o composto titulado como um sólido (23,0 mg, 29%).
[000595] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,85 (2H, tt, J = 14,6, 7,1 Hz), 2,06-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,282,43 (6H, m), 2,78 (1H, dd, J = 13,7, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,1, 3,9 Hz), 3,09-3,22 (4H, m), 3,27-3,41 (4H, m), 3,47 (12H, d, J = 8,6 Hz), 3,53-3,81 (10H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,53-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,85 (2H, m), 8,03 (2H, d, J = 6,6 Hz), 8,11-8,21 (2H, m), 8,27 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000596] MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (21)
[000597] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000598] Concentração de anticorpo: 1,77 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,6 mg (85%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 22 Conjugado de anticorpo-fármaco (22) Fórmula 48
Figure img0051
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (22)
[000599] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 do Exemplo 21 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000600] Concentração de anticorpo: 1,89 mg/mL, rendimento de anticorpo: 11,3 mg (90%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,2. Exemplo 23 Intermediário (23) Fórmula 49
Figure img0052
Processo 1: (6-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)carbamato de terc-butila
[000601] Sal de ácido metanossulfônico de exatecana (0,500 g, 0,882 mmol) foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 1 usando ácido 6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoico em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto titulado (0,620 g, quantitativo).
[000602] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 0,83 (3H, t, J = 7,8 Hz), 1,14-1,28 (2H, m), 1,31 (9H, s), 1,47-1,61 (2H, m), 1,75-1,89 (2H, m), 2,04-2,17 (4H, m), 2,35 (3H, s), 2,81-2,88 (2H, m), 3,09-3,16 (2H, m), 5,10 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,16 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,39 (2H, s), 5,48-5,55 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,73-6,78 (1H, m), 7,26 (1H, s), 7,74 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,39 (1H, d, J = 9,0 Hz). Processo 2: 6-amino-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1- il]hexanamida
[000603] O composto (0,397 g, 0,611 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 1 para produzir sal de ácido trifluoroacético do composto titulado (0,342 g, 84%).
[000604] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 0,88 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,31-1,41 (2H, m), 1,52-1,70 (4H, m), 1,80-1,94 (2H, m), 2,05-2,18 (2H, m), 2,21 (2H, t, J = 7,4 Hz), 2,40 (3H, s), 2,81 (2H, t, J = 7,4 Hz), 3,10-3,25 (2H, m), 3,33 (2H, brs), 5,18 (1H, d, J = 19,8 Hz), 5,22 (1H, d, J = 19,8 Hz), 5,41 (2H, d, J = 16,6 Hz), 5,45 (2H, d, J = 16,6 Hz), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J = 9,2 Hz). Exemplo 24 Conjugado de anticorpo-fármaco (24) Fórmula 50
Figure img0053
Processo 1: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6- {[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)glicinamida
[000605] O composto (0,170 g, 0,516 mmol) obtido 2 do Exemplo 23 foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado no Processo (0,225 g, 91%).
[000606] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 0,88 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,43-1,70 (6H, m), 1,87 (2H, td, J = 15,0, 7,4 Hz), 2,10-2,22 (3H, m), 2,28-2,37 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,78-2,85 (1H, m), 3,01-3,10 (3H, m), 3,15-3,22 (2H, m), 3,54-3,61 (5H, m), 3,62-3,69 (1H, m), 4,44-4,53 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,45 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,02 (1H, t, J = 6,1 Hz), 7,11-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,63-7,69 (1H, m), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,90-7,96 (1H, m), 8,17 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,28 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 9,0 Hz). Processo 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)glicinamida
[000607] O composto (0,105 g, 0,108 mmol) obtido no Processo 1 anterior foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado (0,068 mg, 65%).
[000608] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,15-1,67 (6H, m), 1,79-1,97 (2H, m), 2,08-2,24 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,76-2,82 (1H, m), 3,00-3,10 (5H, m), 3,19 (1H, s), 3,50-3,63 (2H, m), 3,64-3,76 (3H, m), 3,84-3,92 (1H, m), 4,51-4,59 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,24 (1H, d, J = 19,4 Hz), 5,44 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, brs), 7,15-7,29 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,72-7,78 (1H, m), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,96-8,08 (2H, m), 8,30-8,38 (2H, m), 8,46-8,56 (2H, m). Processo 3: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)glicinamida,
[000609] O composto (58 mg, 0,060 mmol) obtido no Processo 2 anterior foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado (39 mg, 62%).
[000610] 1H-RMN (CD3OD) δ : 0,99 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,27 (2H, td, J = 11,6, 6,1 Hz), 1,38-1,44 (2H, m), 1,50-1,63 (6H, m), 1,65-1,80 (2H, m), 1,89-1,98 (2H, m), 2,17-2,25 (3H, m), 2,26-2,36 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,95 (1H, dd, J = 14,3, 9,2 Hz), 3,12 (1H, dd, J = 13,7, 5,7 Hz), 3,15-3,25 (4H, m), 3,44 (2H, t, J = 7,2 Hz), 3,65 (1H, d, J = 17,2 Hz), 3,76 (1H, d, J = 17,2 Hz), 3,79-3,86 (4H, m), 4,43 (1H, dd, J = 8,9, 6,0 Hz), 5,10 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,35 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,56 (1H, d, J = 16,0 Hz), 5,60-5,64 (1H, m), 6,76 (2H, s), 7,12-7,24 (6H, m), 7,58 (1H, s), 7,60 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,68 (1H, t, J = 5,7 Hz).
[000611] MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+ Processo 4: Conjugado de anticorpo-fármaco (24)
[000612] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (9,0 mL) foi coletado em um tubo de 50 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,140 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,450 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000613] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução a 22°C durante 10 minutos, uma solução de DMSO (0,280 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto no Processo 3 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0559 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000614] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tamponamento) para produzir uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000615] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000616] Concentração de anticorpo: 3,30 mg/mL, rendimento de anticorpo: 53,5 mg (59%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,7. Exemplo 25 Conjugado de anticorpo-fármaco (25) Fórmula 51
Figure img0054
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (25)
[000617] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (9,0 mL) foi coletada em um tubo de 50 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,280 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,450 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000618] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução a 22°C durante 10 minutos, uma solução de DMSO (0,559 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto no Processo 3 do Exemplo 24 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,112 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000619] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS6.0 foi usado como solução de tamponamento) para produzir uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000620] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000621] Concentração de anticorpo: 10,65 mg/mL, rendimento de anticorpo: 55,1 mg (61%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,5. Exemplo 26 Conjugado de anticorpo-fármaco (26)
Figure img0055
Processo 1: Acetato de ({N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil}amino)metila
[000622] Em uma mistura que contém N-9-fluorenilmetoxicarbonilglicilglicina (4,33 g, hidrofurano (THF; 120 ml), e tolueno (40,0 ml), piridina (1,16 ml, 14,7 mmol) e tetraacetato de chumbo (6,84 g, 14,7 mmol) foram adicionados e aquecidos sob refluxo durante 5 horas. Depois que a solução de reação foi resfriada em temperatura ambiente, os insolúveis foram removidos por filtração através de Celite e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em acetato de etila e lavados com água e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de magnésio anidroso. Depois que o solvente foi removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [hexano : acetato de etila = 9 : 1 (v/v) - acetato de etila] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (3,00 g, 67%).
[000623] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ : 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J = 5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J = 7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J = 6,6 Hz), 5,26 (2H, d, J = 7,0 Hz), 5,32 (1H, brs), 6,96 (1H, brs), 7,32 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 7,3 Hz), 7,77 (2H, d, J = 7,3 Hz). Processo 2: [({N-[(9H-Fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil}amino) metóxi]acetato de benzila
[000624] Em uma solução de THF (40,0 mL) do composto (3,68 g, 10,0 mmol) obtido no Processo 1 acima e glicolato de benzila (4,99 g, 30,0 mmol), terc-butóxido de potássio (2,24 g, 20,0 mmol) foi adicionado a 0°C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com acetato de etila e água a 0°C e extraída com acetato de etila e clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em dioxano (40,0 mL) e água (10,0 mL), carregados com hidrogenocarbonato de sódio (1,01 g, 12,0 mmol) e 9-fluorenilmetil cloroformiato (2,59 g, 10,0 mmol) e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregada com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto titulado como uma substância oleosa incolor (1,88 g, 40%).
[000625] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ : 3,84 (2H, d, J = 5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J = 6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J = 6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,15-5,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, brs), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J = 7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J = 7,4 Hz). Processo 3: Ácido [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil} amino)metóxi]acético
[000626] O composto (1,88 g, 3,96 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em etanol (40,0 mL) e acetato de etila (20,0 ml). Depois de adicionar catalisador de paládio carbono (376 mg), foi agitado sob atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas. Os insolúveis foram removidos por filtração através de Celite, e o solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto titulado como um sólido incolor (1,52 g, quantitativo).
[000627] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 3,62 (2H, d, J = 6,3 Hz), 3,97 (2H, s), 4,18-4,32 (3H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 7,29-7,46 (4H, m), 7,58 (1H, t, J = 5,9 Hz), 7,72 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,90 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,71 (1H, t, J = 6,5 Hz). Processo 4: (2-{[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]amino}-2- oxoetil)carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila
[000628] Sob resfriamento com gelo, a uma solução de N,N- dimetilformamida (10,0 mL) de sal de ácido metanossulfônico de exatecana (0,283 g, 0,533 mmol), N-hidroxissuccinimida (61,4 mg, 0,533 mmol), e o composto (0,205 g, 0,533 mmol) obtido no Processo 3 acima, N,N-di-isopropiletilamina (92,9 μL, 0,533 mmol) e N, N'- diciclo-hexilcarbodiimida (0,143 g, 0,693 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio: metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido marrom pálido (0,352 g, 82%).
[000629] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,81 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,73-1,87 (2H, m), 2,06-2,20 (2H, m), 2,34 (3H, s), 3,01-3,23 (2H, m), 3,58 (2H, d, J = 6,7 Hz), 3,98 (2H, s), 4,13-4,25 (3H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,09-5,22 (2H, m), 5,32-5,42 (2H, m), 5,50-5,59 (1H, m), 6,49 (1H, s), 7,24-7,30 (3H, m), 7,36 (2H, t, J = 7,4 Hz), 7,53 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,66 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,84 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,47 (1H, d, J = 8,6 Hz), 8,77 (1H, t, J = 6,7 Hz).
[000630] MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+ Processo 5 : N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida,
[000631] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (11,0 mL) do composto (0,881 g, 1,10 mmol) obtido no Processo 4 acima, piperidina (1,1 mL) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura que contém o composto titulado. A mistura foi usada para a próxima reação sem outra purificação. Processo 6: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L- fenilalanil-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida
[000632] Sob resfriamento com gelo, a uma solução de N,N- dimetilformamida (50,0 mL) da mistura (0,439 mmol) obtida no Processo 5 acima, N-hidroxissuccinimida (0,101 g, 0,878 mmol) e N- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (o composto descrito na Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 200260351; 0,440 g, 0,878 mmol), N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (0,181 g, 0,878 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 4 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido laranja pálido (0,269 g, 58%).
[000633] MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+ Processo 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[000634] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (4,00 mL) do composto (0,269 g, 0,253 mmol) obtido no Processo 6 acima, piperidina (0,251 mL, 2,53 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura que contém o composto titulado. A mistura foi usada para a próxima reação sem outra purificação. Processo 8 : N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[000635] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (10,0 mL) do composto (0,253 mmol) obtido no Processo 7 acima, hexanoato de N- succinimidil 6-maleimida (0,156 g, 0,506 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio- clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,100 g, 38%).
[000636] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,83 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,09-1,21 (2H, m), 1,33-1,47 (4H, m), 1,75-1,90 (2H, m), 2,00-2,23 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,69-2,81 (1H, m), 2,94-3,03 (1H, m), 3,06-3,22 (2H, m), 3,23-3,74 (6H, m), 3,98 (2H, s), 4,39-4,50 (1H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,39 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,96 (2H, s), 7,11-7,24 (5H, m), 7,28 (1H, s), 7,75 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,97 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,09 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J = 6,5 Hz), 8,48 (1H, d, J = 9,0 Hz), 8,60 (1H, t, J = 6,5 Hz).
[000637] MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+ Processo 9 : Conjugado de anticorpo-fármaco (26)
[000638] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 8 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000639] Concentração de anticorpo: 1,61 mg/mL, rendimento de anticorpo: 9,7 mg (77%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,9. Exemplo 27 Conjugado de anticorpo-fármaco (27) Fórmula 53
Figure img0056
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (27)
[000640] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 8 do Exemplo 26 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000641] Concentração de anticorpo: 1,58 mg/mL, rendimento de anticorpo: 9,5 mg (76%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,6. Exemplo 28 Conjugado de anticorpo-fármaco (28) Fórmula 54
Figure img0057
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (28)
[000642] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,25 mL) foi colocada em dois tubos de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,0625 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000643] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,072 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (0,078 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, foi agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa de NAC a 100 mM (0,0155 mL) foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000644] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (ABS foi usada como uma solução de tamponamento) para produzir 11,7 mL no total de uma solução que contém o composto de interesse.
[000645] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000646] Concentração de anticorpo: 1,60 mg/mL, rendimento de anticorpo: 18,7 mg (94%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,2. Exemplo 29 Conjugado de anticorpo-fármaco (29) Fórmula 55
Figure img0058
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (29)
[000647] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (6 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,108 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,091 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000648] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,146 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (0,193 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,029 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000649] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) para produzir 24 mL de uma solução que contém o composto de interesse.
[000650] Caracterização Físico-química: Usando os procedimentos Comuns E e F (SD,280 = 5178 (valor medido) e SD,3?O = 20217 (valor medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000651] Concentração de anticorpo: 1,77 mg/mL, rendimento de anticorpo: 42 mg (85%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum E: 3,0, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum F: 3,4. Exemplo 30 Conjugado de anticorpo-fármaco (30) Fórmula 56
Figure img0059
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (30)
[000652] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (6 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,215 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,094 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000653] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (0,370 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,056 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000654] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) para produzir 24 mL de uma solução que contém o composto de interesse.
[000655] Caracterização Físico-química: Usando os procedimentos Comuns E e F (SD,280 = 5178 (valor medido) e SD,3?O = 20217 (valor medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000656] Concentração de anticorpo: 1,92 mg/mL, rendimento de anticorpo: 46 mg (92%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum E: 6,2, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum F: 7,1. Exemplo 31 Conjugado de anticorpo-fármaco (31) Fórmula 57
Figure img0060
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (31)
[000657] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). Uma solução (50,00 mL) foi colocada em um recipiente de polipropileno e carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,745 mL) em temperatura ambiente com agitação, e em seguida com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (1,868 mL; 5,4 equivalentes por molécula de anticorpo). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,0 ± 0,1, a agitação foi terminada, e a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000658] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de resfriar a solução anterior a 15°C, uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (2,958 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) foi gradualmente adicionada gota a gota a isto com agitação. Ao mesmo tempo que a temperatura foi mantida a 15°C, a solução de reação foi agitada durante os primeiros 30 minutos e incubada sem agitação para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo durante a próxima 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,444 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto com agitação e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000659] Purificação: Adicionando-se solução de ácido acético aquosa a 20% gradualmente (cerca de 0,25 mL) e ABS (50 mL) à solução anterior com agitação, o pH da solução foi ajustado em 5,5 ± 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (Millipore Corp., filtro Millex-HV, 0,45 μm, membrana de PVDF) para remover a matéria esbranquiçada. Esta solução foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um mecanismo de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassete, Biomax 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionada gota a gota (um total de 800 mL) como uma solução de tamponamento para purificação à solução de reação, purificação por ultrafiltração foi realizada para remover ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular, da mesma forma substituindo a solução de tamponamento com ABS, e também concentrando a solução. A solução purificada obtida foi submetida à microfiltração (0,22 μm (Millipore Corp., filtro Millex-GV, membrana de PVDF) e 0,10 μm (Millipore Corp., filtro Millex-VV, membrana de PVDF)) para produzir uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000660] Caracterização Físico-química: Usando os procedimentos Comuns E e F (SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000661] Concentração de anticorpo: 11,28 mg/mL, rendimento de anticorpo: 451 mg (90%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum E: 6,6, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum F: 7,7. Exemplo 32 (Método alternativo para sintetizar o composto do Processo 8 do Exemplo 26) Fórmula 58
Figure img0061
Processo 1: N-[6-(2, 5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenil alaninato de terc-butila
[000662] Sob resfriamento com gelo, a uma solução de THF (12,0 ml) de terc-butil N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenil alaninato (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, pp. 393; 0,400 g, 0,717 mmol), 1, 8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno (0,400 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 dias, e em seguida hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (0,221 g, 0,717 mmol) também foi adicionado e agitado durante 3 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10%, uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio, e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de magnésio anidroso. Depois que o solvente foi removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,295 g, 78%).
[000663] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ : 1,28-1,36 (2H, m), 1,41 (9H, s), 1,57-1,71 (4H, m), 2,23 (2H, t, J = 7,6 Hz), 3,09 (2H, d, J = 6,0 Hz), 3,51 (2H, t, J = 7,6 Hz), 3,85-4,02 (4H, m), 4,69-4,78 (1H, m), 6,15 (1H, t, J = 4,6 Hz), 6,33 (1H, d, J = 7,3 Hz), 6,60 (1H, t, J = 5,0 Hz), 6,68 (2H, s), 7,10-7,16 (2H, m), 7,22-7,31 (3H, m).
[000664] MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+ Processo 2: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanina
[000665] Em uma solução de diclorometano (8,00 ml) do composto (0,295 g, 0,558 mmol) obtido no Processo 1 acima, ácido trifluoroacético (4,00 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 18 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,240 g, 91%).
[000666] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 1,15-1,23 (2H, m), 1,40 1,53 (4H, m), 2,10 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,88 (1H, dd, J = 13,7, 8,9 Hz), 3,04 (1H, dd, J = 13,7, 5,0 Hz), 3,35-3,43 (2H, m), 3,58-3,77 (4H, m), 4,41 (1H, td, J = 7,8, 5,0 Hz), 7,00 (2H, s), 7,16-7,31 (5H, m), 8,00 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,06 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz). Processo 3: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[000667] O composto (0,572 g, 1,21 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em diclorometano (12,0 mL), carregado com N- hidroxissuccinimida (0,152 g, 1,32 mmol) e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,253 g, 1,32 mmol), e agitado durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada a uma solução de N,N-dimetilformamida (22,0 mL) da mistura (1,10 mmol) obtida 5 do Exemplo 26 no Processo, e agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. A solução de reação foi carregada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10% e extraída com clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio- clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,351 g, 31%). Os dados instrumentais do composto foram iguais àqueles do composto do Processo 8 do Exemplo 26. Exemplo 33 (Método alternativo para sintetizar o composto do Processo 8 do Exemplo 26) Fórmula 59
Figure img0062
Processo 1: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil}amino) metóxi]acetato de benzila
[000668] Em uma solução de THF (200 ml) do composto (7,37 g, 20,0 mmol) obtido no Processo 1 do Exemplo 26, glicolato de benzila (6,65 g, 40,0 mmol) e monoidrato de ácido p-toluenossulfônico (0,381 g, 2,00 mmol) foram adicionados a 0°C e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas e 30 minutos. A solução de reação foi carregada com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (6,75 g, 71%). Os dados instrumentais do composto foram iguais àqueles do composto do Processo 2 do Exemplo 26. Processo 2: N-[(Benzilóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina-N-{[(2- (benzilóxi)-2-oxoetóxi]metil}glicinamida
[000669] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (140 mL) do composto (6,60 g, 13,9 mmol) obtido no Processo 1 acima, 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (2,22 g, 14,6 mmol) foi adicionado a 0°C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com uma solução de N,N-dimetilformamida (140 mL) de N-[(benzilóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6,33 g, 15,3 mmol), N-hidroxissuccinimida (1,92 g, 16,7 mmol) e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,20 g, 16,7 mmol) agitada com antecedência em temperatura ambiente durante 1 hora, e agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A solução de reação foi carregada com ácido clorídrico a 0,1 N e extraída com clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (7,10 g, 79%).
[000670] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 2,78 (1H, dd, J = 13,9, 9,6 Hz), 3,05 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,56-3,80 (6H, m), 4,15 (2H, s), 4,47-4,55 (1H, m), 4,63 (2H, d, J = 6,6 Hz), 5,03 (2H, s), 5,15 (2H, s), 7,16-7,38 (15H, m), 7,52 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,17 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,36 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,61 (1H, t, J = 6,6 Hz). Processo 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil] glicinamida
[000671] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (216 mL) do composto (7,00 g, 10,8 mmol) obtido no Processo 2 acima, catalisador de paládio carbono (7,00 g) foi adicionado e agitado sob uma atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 24 horas. Os insolúveis foram removidos por filtração através de Celite, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em água, o material insolúvel foi removido por filtração através de Celite, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Este procedimento foi repetido duas vezes para produzir o composto titulado como um sólido incolor (3,77 g, 82%).
[000672] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 2,84 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,08 (1H, dd, J = 13,7, 4,7 Hz), 3,50-3,72 (4H, m), 3,77-3,86 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,52-4,43 (1H, m), 4,61 (2H, d, J = 6,6 Hz), 7,12-7,30 (5H, m), 8,43 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,70 (1H, t, J = 6,3 Hz), 8,79 (1H, t, J = 5,5 Hz). Processo 4: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(carboximetóxi)metil]glicinamida
[000673] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (85,0 mL) do composto (3,59 g, 8,48 mmol) obtido no Processo 3 acima, hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (2,88 g, 9,33 mmol) e trietilamina (0,858 g, 8,48 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de reação foi carregada com ácido clorídrico a 0,1 N e extraída com clorofórmio e um solvente misto de clorofórmio e metanol [clorofórmio : metanol = 4: 1 (v/v)]. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (3,70 g, 71%).
[000674] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 1,13-1,24 (2H, m), 1,42-1,53 (4H, m), 2,11 (2H, t, J = 7,4 Hz), 2,80 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 3,06 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,37 (2H, t, J = 7,2 Hz), 3,56-3,78 (6H, m), 3,97 (2H, s), 4,46-4,53 (1H, m), 4,61 (2H, d, J = 6,3 Hz), 7,00 (2H, s), 7,157,29 (5H, m), 8,03-8,20 (3H, m), 8,32 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,60 (1H, t, J = 6,7 Hz). Processo 5 : N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[000675] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (40,0 mL) de sal de ácido metanossulfônico de exatecana (1,14 g, 2,00 mmol), trietilamina (0,202 g, 2,00 mmol), o composto (1,48 g, 2,40 mmol) obtido no Processo 4 acima, e cloreto de 4-(4, 6-dimetóxi-1, 3, 5- triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (0,993 g, 3,00 mmol) contendo 16,4% de água foram adicionados a 0°C e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (1,69 g, 82%). Os dados espectrais do composto foram iguais àqueles do composto do Processo 8 do Exemplo 26. Exemplo 34 Intermediário (34) Fórmula 60
Figure img0063
Processo 1: 2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetilacetato
[000676] Sob resfriamento com gelo, a uma suspensão de N,N- dimetilformamida (20,0 mL) de sal de ácido metanossulfônico de exatecana (0,500 g, 0,941 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (0,492 mL, 2,82 mmol) e cloreto de acetoxiacetila (0,121 ml, 1,13 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,505 g, quantitativo).
[000677] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,81 1,92 (2H, m), 2,08 (3H, s), 2,08-2,22 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,14-3,21 (2H, m), 4,51 (2H, dd, J = 19,4, 14,7 Hz), 5,22 (2H, dd, J = 40,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,56-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000678] MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+ Processo 2: N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamida
[000679] Em uma suspensão de metanol (50,0 mL) do composto (0,504 g, 0,941 mmol) obtido no Processo 1 acima, um THF (20,0 ml) e uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 1 N (4,00 ml, 4,00 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação foi terminada pela adição de ácido clorídrico a 1 N (5,00 ml, 5,00 mmol), e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,412 g, 89%). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (45) ou (46).
[000680] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,78 1,95 (2H, m), 2,09-2,28 (2H, m), 2,39 (3H, s), 3,07-3,27 (2H, m), 3,96 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,11-5,26 (2H, m), 5,42 (2H, s), 5,46-5,54 (1H, m), 5,55-5,63 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,41 (1H, d, J = 9,1 Hz). MS (ESI) m/z: 494 (M+H)+ Exemplo 35 (Método alternativo para sintetizar o composto do Exemplo 34) Fórmula 61
Figure img0064
Processo 1: N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamida
[000681] Ácido glicólico (0,0201 g, 0,27 mmol) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (1,0 mL), carregado com N-hidroxissuccinimida (0,0302 g, 0,27 mmol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,0508 g, 0,27 mmol), e agitados durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada a uma suspensão de N,N-dimetilformamida (1,0 mL) carregada com sal de ácido metanossulfônico de exatecana (0,1 g, 0,176 mmol) e trietilamina (0,025 mL, 0,18 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 10 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,080 g, 92%). Os dados espectrais do composto foram iguais àqueles do composto obtido 2 do Exemplo 34 no Processo. Exemplo 36 Conjugado de anticorpo-fármaco (36) Fórmula 62
Figure img0065
Processo 1: N-[4-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)butanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida
[000682] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 do Exemplo 15 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 usando butirato de N-succinimidil 4-maleimida em vez de hexanoato de N- succinimidil 6-maleimida para produzir o composto titulado como um sólido branco pálido (24,0 mg, 38%).
[000683] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,68 (2H, quin, J = 7,4 Hz), 1,78-1,92 (2H, m), 2,06-2,22 (2H, m), 2,10 (2H, t, J = 7,8 Hz), 2,31-2,43 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,78 (1H, dd, J = 13,7, 9,4 Hz), 3,01 (1H, dd, J = 13,7, 4,7 Hz), 3,17 (4H, d, J = 5,1 Hz), 3,29-3,40 (2H, m), 3,523,80 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J = 18,4 Hz), 5,26 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,52-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,127,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,84 (2H, m), 8,02 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,088,16 (2H, m), 8,25 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,52 (1H, d, J = 8,2 Hz).
[000684] MS (ESI) m/z: 990 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (33)
[000685] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo- fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000686] Concentração de anticorpo: 1,75 mg/mL, rendimento de anticorpo: 10,5 mg (84%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,7. Exemplo 37 Conjugado de anticorpo-fármaco (37) Fórmula 63
Figure img0066
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (37)
[000687] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 do Exemplo 36 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000688] Concentração de anticorpo: 1,89 mg/mL, rendimento de anticorpo: 11,3 mg (90%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 8,5. Exemplo 38 Intermediário (38) Fórmula 64
Figure img0067
Processo 1: (5-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7] indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil)carbamato de terc-butila
[000689] Sal de ácido metanossulfônico de exatecana (500 mg, 0,941 mmol) foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 1 usando ácido 5-(terc-butoxicarbonilamino)valérico em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto titulado como um sólido marrom amarelado (571 mg, 96%). O composto foi usado para a próxima reação sem realizar outra purificação.
[000690] MS(ESI)m/z:635(M+H)+ Processo 2: 5-Amino-N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]pentanamida
[000691] O composto (558 mg, 0,879 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 1 para produzir trifluoroacetato do composto titulado como um sólido amarelo (363 mg, 64%).
[000692] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,88 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,52-1,71 (4H, m), 1,87 (2H, tt, J = 14,4, 6,9 Hz), 2,07-2,18 (2H, m), 2,22 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,76-2,88 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 5,18 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,65 (3H, br.s.), 7,81 (1H, d, J = 11,3 Hz), 8,49 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000693] MS (ESI) m/z: 535 (M+H)+ Exemplo 39 Conjugado de anticorpo-fármaco (39) Fórmula 65
Figure img0068
Processo 1: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2- b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil)glicinamida
[000694] O composto (348 mg, 0,537 mmol) obtido 2 do Exemplo 38 no Processo foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (429 mg, 84%). O composto foi usado para a próxima reação sem realizar outra purificação. Processo 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de] pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil) glicinamida
[000695] O composto (427 mg, 0,448 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 2 para produzir trifluoroacetato do composto titulado como um sólido amarelo (430 mg, 99%).
[000696] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,38-1,49 (2H, m), 1,54-1,66 (2H, m), 1,86 (2H, tt, J = 14,5, 7,0 Hz), 2,08-2,16 (2H, m), 2,19 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J = 13,9, 10,0 Hz), 3,00-3,12 (3H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,57 (2H, d, J = 4,7 Hz), 3,60-3,75 (3H, m), 3,87 (1H, dd, J = 16,8, 5,9 Hz), 4,55 (1H, td, J = 9,0, 4,7 Hz), 5,16 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,4 Hz), 5,44 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,74 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,81 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,96 (3H, br.s.), 8,30-8,37 (1H, m), 8,44-8,53 (2H, m).
[000697] MS (ESI) m/z: 853 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de] pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil) glicinamida
[000698] O composto (60,0 mg, 0,0621 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado como um sólido (16,0 mg, 25%).
[000699] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,13-1,21 (2H, m), 1,36-1,52 (6H, m), 1,53-1,65 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,05-2,15 (4H, m), 2,19 (2H, s), 2,40 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J = 13,7, 10,2 Hz), 2,98-3,10 (3H, m), 3,12-3,21 (2H, m), 3,29-3,37 (2H, m), 3,53-3,79 (6H, m), 4,41-4,50 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,52-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,12-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,63 (1H, t, J = 5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J = 10,6 Hz), 8,02 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,08 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,12 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,24 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,45 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000700] MS (ESI) m/z: 1046 (M+H)+ Processo 4: Conjugado de anticorpo-fármaco (39)
[000701] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,0155 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,050 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000702] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução durante 10 minutos a 22°C, uma solução de DMSO (0,0311 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00622 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000703] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS6.0 foi usado como solução de tamponamento) para produzir 6 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000704] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000705] Concentração de anticorpo: 1,12 mg/mL, rendimento de anticorpo: 6,72 mg (67%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,8. Exemplo 40 Conjugado de anticorpo-fármaco (40) Fórmula 66
Figure img0069
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (40)
[000706] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,37 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,0311 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,050 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000707] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução a 22°C durante 10 minutos, uma solução de DMSO (0,0622 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido 3 do Exemplo 39 no Processo foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0124 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e incubada a 22°C para terminar a reação do ligante de fármaco durante outros 20 minutos.
[000708] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D-1 (PBS6.0 foi usado como solução de tamponamento) para produzir 6 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000709] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E, os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000710] Concentração de anticorpo: 0,98 mg/mL, rendimento de anticorpo: 5,88 mg (59%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 41 Conjugado de anticorpo-fármaco (41) Fórmula 67
Figure img0070
Processo 1: {2-[(2-hidroxietil)amino]-2-oxoetil}carbamato de terc- butila
[000711] N-(terc-Butoxicarbonil)glicina (4,2 g, 24 mmol) foi dissolvido em dimetilformamida (40 mL). Depois de adicionar aminoetanol (2,9 g, 48 mmol) e 1-hidroxibenzotriazol (3,7 g, 24 mmol) e adicionar cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (6,9 g, 36 mmol), isto foi agitado em temperatura ambiente durante 12 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi carregado com tolueno por destilação azeotrópica. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [acetato de etila - acetato de etila : metanol = 10 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como uma substância oleosa incolor (3,8 g, 72%).
[000712] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ : 1,44 (9H, s), 1,69 (1H, brs), 3,43 (2H, td, J = 5,9, 5,1 Hz), 3,71 (2H, t, J = 5,1 Hz), 3,79 (2H, d, J = 5,9 Hz), 5,22 (1H, brs), 6,62 (1H, brs). Processo 2: 2-{[N-(terc-Butoxicarbonil)glicil]amino}etil4- nitrofenilcarbonato
[000713] Em uma solução de THF (23 mL) do composto (1,0 g, 4,59 mmol) obtido no Processo 1 acima, di-isopropiletilamina (0,80 mL, 4,59 mmol) e bis(4-nitrofenil) carbonato (1,32 g, 6,88 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 12 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [hexano- hexano:acetato de etila = 1 : 3 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (1,13 g, 64%).
[000714] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ : 1,44 (1H, s), 3,66 (2H, td, J = 5,1, 5,9 Hz), 3,81 (2H, d, J = 5,9 Hz), 4,36 (2H, t, J = 5,1 Hz), 5,07 (1H, s), 6,48-6,53 (1H, m), 7,38 (2H, dt, J = 9,9, 2,7 Hz), 8,27 (2H, dt, J = 9,9, 2,7 Hz). Processo 3: [(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]carbamato de 2-({[(terc- Butoxicarbonil)amino]acetil}amino)etila
[000715] Em sal de ácido metanossulfônico de exatecana (0,70 g, 1,2 mmol), o composto (0,57 g, 1,5 mmol) obtido 2 no Processo, e 1- hidroxibenzotriazol (3,7 g, 24 mmol), dimetilformamida (23 mL) foram adicionados, e di-isopropiletilamina (0,43 mL, 2,5 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 12 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi carregado com tolueno por destilação azeotrópica. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio: metanol = 10 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado (0,86 g, quantitativo) como um sólido amarelo pálido.
[000716] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,35 (9H, s), 1,78-1,94 (1H, m), 2,07-2,17 (1H, m), 2,17-2,27 (1H, m), 2,37 (3H, s), 3,05-3,16 (1H, m), 3,19-3,26 (1H, m), 3,34-3,39 (2H, m), 3,50-3,56 (2H, m), 4,00-4,07 (1H, m), 4,13-4,21 (1H, m), 5,15-5,34 (3H, m), 5,44 (2H, s), 6,54 (1H, s), 6,90-6,96 (1H, m), 7,32 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,93-8,07 (2H, m). Processo 4: 2-(Glicilamino)etil[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]carbamato
[000717] O composto (0,86 g, 2,1 mmol) obtido no Processo 3 acima foi dissolvido em diclorometano (15 mL). Depois de adicionar ácido trifluoroacético (15 mL), foi agitado durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi carregado com tolueno por destilação azeotrópica. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,86 g, 99%).
[000718] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,79-1,95 (2H, m), 2,06-2,18 (1H, m), 2,18-2,29 (1H, m), 2,38 (3H, s), 3,07-3,17 (1H, m), 3,20-3,29 (1H, m), 3,36-3,50 (2H, m), 3,51-3,62 (2H, m), 3,99-4,08 (1H, m), 4,22-4,31 (1H, m), 5,16-5,35 (3H, m), 5,42 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,46 (1H, d, J = 18,8 Hz), 6,56 (1H, s), 7,34 (1H, s), 7,65 (2H, brs), 7,79 (1H, d, J = 10,6 Hz), 7,99-8,06 (1H, m), 8,51 (1H, t, J = 5,5 Hz).
[000719] MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+ Processo 5 : N-[(9H-Fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L- fenilalanil-N-[2-({[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]carbamoil}óxi)etil]glicinamida
[000720] N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 2002-60351; 0,21 g, 0,41 mmol) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (3 mL). Depois de adicionar N-hidroxissuccinimida (0,052 g, 0,45 mmol) e cloridrato de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,086 g, 0,45 mmol), isto foi agitado durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetilformamida (2 mL) carregada com o composto (0,24 g, 0,35 mmol) obtido no Processo 4 e trietilamina (0,078 mL, 0,45 mmol), e agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio- clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,24 g, 65%).
[000721] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,05-2,27 (2H, m), 2,36 (3H, s), 2,73-2,81 (1H, m), 2,98-3,12 (2H, m), 3,17-3,26 (1H, m), 3,35-3,42 (2H, m), 3,55-3,79 (6H, m), 4,00-4,10 (1H, m), 4,12-4,23 (2H, m), 4,23-4,29 (2H, m), 4,45-4,55 (1H, m), 5,13-5,33 (3H, m), 5,40 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J = 17,2 Hz), 6,53 (1H, s), 7,11-7,26 (5H, m), 7,26-7,33 (3H, m), 7,38 (2H, t, J = 7,6 Hz), 7,57 (1H, t, J = 5,9 Hz), 7,68 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,77 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,85 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,91-7,97 (1H, m), 7,988,05 (2H, m), 8,14 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,31-8,26 (1H, m).
[000722] MS (APCI) m/z: 1063 (M+H)+ Processo 6: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1- il]carbamoil}óxi)etil]glicinamida
[000723] O composto (0,24 g, 0,35 mmol) obtido no Processo 5 anterior foi reagido da mesma maneira como o Processo 7 do Exemplo 26 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,12 g, 65%).
[000724] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,78-1,94 (2H, m), 2,06-2,27 (2H, m), 2,37 (3H, s), 2,72-2,81 (1H, m), 2,98-3,07 (1H, m), 3,12-3,17 (2H, m), 3,57-3,81 (6H, m), 4,00-4,21 (3H, m), 4,45-4,54 (1H, m), 5,15-5,35 (3H, m), 5,41 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,45 (1H, d, J = 17,2 Hz), 6,54 (1H, s), 7,11-7,26 (6H, m), 7,32 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,93-8,00 (1H, m), 8,03 (1H, d, J = 9,4 Hz), 8,06-8,13 (1H, m), 8,21-8,27 (2H, m), 8,30-8,36 (1H, m).
[000725] MS (APCI) m/z: 841 (M+H)+ Processo 7: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1- il]carbamoil}óxi)etil]glicinamida
[000726] O composto (42,0 mg, 0,0499 mmol) obtido no Processo 6 foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 2 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (38,3 mg, 74%).
[000727] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,12-1,23 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,80-1,95 (2H, m), 2,05-2,27 (4H, m), 2,38 (3H, s), 3,43-2,40 (8H, m), 3,53-3,78 (6H, m), 4,00-4,21 (2H, m), 4,44-4,55 (1H, m), 5,17-5,36 (3H, m), 5,43 (2H, s), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,19 (5H, d, J = 23,9 Hz), 7,33 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 10,6 Hz), 7,91-8,16 (5H, m), 8,24-8,31 (1H, m).
[000728] MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+ Processo 8 : Conjugado de anticorpo-fármaco (41)
[000729] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 7 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 6.
[000730] Concentração de anticorpo: 1,54 mg/mL, rendimento de anticorpo: 9,2 mg (74%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 42 Conjugado de anticorpo-fármaco (42) Fórmula 68
Figure img0071
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (42)
[000731] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 7 do Exemplo 41 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000732] Concentração de anticorpo: 1,47 mg/mL, rendimento de anticorpo: 8,8 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,0. Exemplo 43 Conjugado de anticorpo-fármaco (43) Fórmula 69
Figure img0072
Processo 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoil]amino}etóxi)etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[000733] O composto (53,7 mg, 50,5 μmol) obtido no Processo 6 do Exemplo 26 foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (1,50 mL). Depois de adicionar 1,8-diazabiciclo(5,4,0)-7-undeceno (7,5 μL, 50,5 μmol), isto foi agitado em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de reação foi carregada com p-toluenossulfonato de piridínio (14,0 mg, 5,56 μmol), em seguida carregada com N-succinimidil 3-(2- (2-(3-maleinimidopropanamido)etóxi)etóxi)propanoato (32,3 mg, 75,8 μmol), e agitada em temperatura ambiente durante 2,25 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [[clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (27,1 mg, 47%).
[000734] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,79-1,91 (2H, m), 2,18 (2H, t, J = 15,1 Hz), 2,29-2,33 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J = 13,9, 9,2 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 13,7, 3,9 Hz), 3,13-3,15 (2H, m), 3,44-3,46 (6H, m), 3,57-3,59 (6H, m), 3,69-3,75 (6H, m), 4,01 (2H, s), 4,46-4,48 (1H, m), 4,63 (2H, d, J = 6,3 Hz), 5,21 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,60 (1H, dd, J = 13,5, 5,7 Hz), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,177,24 (6H, m), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,00-8,02 (2H, m), 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,17 (1H, t, J = 6,3 Hz), 8,52 (1H, d, J = 9,0 Hz), 8,65 (1H, t, J = 6,5 Hz).
[000735] MS (ESI) m/z = 1151 (M+H)+ Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (43)
[000736] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido 1 no Processo, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000737] Concentração de anticorpo: 1,96 mg/mL, rendimento de anticorpo: 17,6 mg (88%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,6. Exemplo 44 Conjugado de anticorpo-fármaco (44) Fórmula 70
Figure img0073
Processo 1: N-[(benzilóxi)carbonil]glicilglicil-D-fenilalaninato de terc-butila
[000738] N-[(Benzilóxi)carbonil]glicilglicina (3,00 g, 11,3 mmol) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (20,0 mL). Depois de adicionar N- hidroxissuccinimida (1,43 g, 12,4 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (2,37 g, 12,4 mmol), isto foi agitado durante 1 hora. Uma solução de N,N-dimetilformamida (10 mL) carregada com D-fenilalanina terc-butila (2,74 g, 12,38 mmol) e trietilamina (1,73 mL, 12,4 mmol) foi adicionada gota a gota à solução de reação e agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregada com diclorometano e lavada com água, ácido clorídrico a 1 N, e uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de sódio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (4,21 g, 80%).
[000739] 1H-RMN (CDCl3) δ : 1,41 (9H, s), 3,03-3,14 (2H, m), 3,86 3,97 (4H, m), 4,70-4,77 (1H, m), 5,13 (2H, s), 5,43 (1H, brs), 6,42 (1H, d, J = 10,0 Hz), 6,64-6,71 (1H, m), 7,11-7,15 (2H, m), 7,20-7,31 (4H, m), 7,31-7,38 (4H, m).
[000740] MS (APCI) m/z: 470 (M+H)+ Processo 2: N-[(Benzilóxi)carbonil]glicilglicil-D-fenilalanina
[000741] O composto (4,21 g, 8,97 mmol) obtido no Processo 1 foi dissolvido em acetato de etila (20 mL). Depois de adicionar uma solução de acetato de etila (20,0 mL) de cloreto de hidrogênio a 4 N, foi deixada durante a noite em temperatura ambiente. O solvente foi removido sob pressão reduzida, em seguida tolueno foi adicionado, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (1,66 g, 45%).
[000742] 1H-RMN (CDCl3) δ : 2,92-3,01 (1H, m), 3,10-3,18 (1H, m), 3,65-3,81 (3H, m), 3,88-3,98 (1H, m), 4,64-4,73 (1H, m), 5,06 (2H, s), 5,87 (1H, brs), 7,10-7,37 (13H, m).
[000743] MS (APCI) m/z: 412 (M+H) - Processo 3: N-[(Benzilóxi)carbonil]glicilglicil-D-fenilalanil-N-{[2- (benzilóxi)-2-oxoetóxi]metil}glicinamida
[000744] Em uma solução de dioxano (25,0 mL) do composto (1,25 g, 2,63 mmol) obtido no Processo 1 do Exemplo 32, piperidina (5,00 mL) e N,N-dimetilformamida (5,00 mL) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 30 minutos. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (20,0 mL). Depois de adicionar o composto (1,20 g, 2,90 mmol) do Processo 2 anterior e cloreto de 4-(4, 6-dimetóxi-1, 3, 5- triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (1,03 g, 3,16 mmol) contendo 16,4% de água, foi agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregada com clorofórmio e lavada com água, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de sódio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio- clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (270 mg, 16%).
[000745] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 2,78 (1H, dd, J = 13,6, 10,0 Hz), 3,05 (1H, dd, J = 13,9, 4,2 Hz), 3,56-3,79 (6H, m), 4,15 (2H, s), 4,474,54 (1H, m), 4,63 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,03 (2H, s), 5,15 (2H, s), 7,147,39 (15H, m), 7,50 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,02 (1H, t, J = 5,4 Hz), 8,16 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,34 (1H, t, J = 6,0 Hz), 8,60 (1H, t, J = 7,0 Hz).
[000746] MS (APCI) m/z: 648 (M+H)+ Processo 4: Glicilglicil-D-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil] glicinamida
[000747] O composto (200 mg, 0,31 mmol) obtido no Processo 3 anterior foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (5,0 mL). Depois de adicionar catalisador de paládio carbono a 5% (0,12 g), foi agitado sob uma atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 9 horas. A solução de reação foi filtrada através de Celite, e o resíduo foi lavado com um solvente misto de água e N,N-dimetilformamida. O filtrado e a lavagem foram combinados, e o solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto titulado como um sólido incolor (0,15 g, quantitativo).
[000748] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 2,85 (1H, dd, J = 13,3, 9,7 Hz), 3,08 (1H, dd, J = 13,9, 5,4 Hz), 3,43-3,52 (4H, m), 3,62-3,89 (7H, m), 4,364,44 (1H, m), 4,58-4,67 (2H, m), 7,12-7,29 (5H, m), 8,44 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,67 (1H, d, J = 7,3 Hz), 8,78 (1H, t, J = 5,4 Hz), 8,91 (1H, brs).
[000749] MS (APCI) m/z: 424 (M+H)+ Processo 5 : N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-D-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil] glicinamida,
[000750] O composto (0,15 g, 0,35 mmol) obtido no Processo 4 anterior foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (10 mL). Depois de adicionar hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (0,11 g, 0,35 mmol), isto foi agitado em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de reação foi carregada com clorofórmio e lavada com água, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de sódio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (41 mg, 26%).
[000751] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 1,13-1,24 (2H, m), 1,42-1,53 (4H, m), 2,12 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,82 (1H, dd, J = 13,9, 10,0 Hz), 3,09 (1H, dd, J = 13,9, 4,8 Hz), 3,17 (2H, d, J = 4,2 Hz), 3,47-3,89 (8H, m), 4,08-4,14 (1H, m), 4,41-4,49 (1H, m), 4,58-4,69 (2H, m), 7,00 (2H, s), 7,147,27 (5H, m), 8,31 (1H, t, J = 6,0 Hz), 8,39 (1H, brs), 8,55 (2H, brs), 8,93 (1H, brs).
[000752] MS (APCI) m/z: 615 (M-H) - Processo 6: N-[6-(2, 5-Dioxo-2, 5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-D-fenilalanil-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[000753] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (10 mL) de sal de ácido metanossulfônico de exatecana (22 mg, 0,388 mmol), trietilamina (5,42 μL, 0,388 mmol), o composto (29 mg, 0,466 mmol) obtido no Processo 5 acima, e cloreto de 4-(4, 6-dimetóxi-1, 3, 5- triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (19 mg, 0,686 mmol) contendo 16,4% de água foram adicionados a 0°C e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente na solução de reação foi removido sob pressão reduzida, e em seguida o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (26 mg, 65%).
[000754] 1H-RMN (DMSO-d6) δ : 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,13-2,23 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,78 (1H, dd, J = 13,6, 9,4 Hz), 2,983,05 (1H, m), 3,13-3,23 (2H, m), 3,54-3,78 (8H, m), 4,02 (2H, s), 4,414,50 (1H, m), 4,61-4,66 (2H, m), 5,21 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,56-5,64 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,01 (1H, t, J = 5,4 Hz), 8,07 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,14 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,31 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,53 (1H, d, J = 9,1 Hz), 8,63 (1H, t, J = 6,3 Hz).
[000755] MS (APCI) m/z: 1034 (M+H)+ Processo 7: Conjugado de anticorpo-fármaco (44)
[000756] Usando o trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 6 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco titulado foi obtido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 7.
[000757] Concentração de anticorpo: 1,87 mg/mL, rendimento de anticorpo: 16,8 mg (84%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,1. Exemplo 45 Intermediário (45) Fórmula 71
Figure img0074
Processo 1: (2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)carbamato de terc- butila
[000758] Em uma solução de diclorometano (3,00 mL) de N-(terc- butoxicarbonil)-glicina (0,395 g, 2,26 mmol), N-hidroxissuccinimida (0,260 g, 2,26 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,433 mg, 2,26 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. Esta solução foi adicionada a uma solução que consiste em sal de ácido metanossulfônico de exatecana (1,00 g, 1,88 mmol), trietilamina (0,315 mL, 2,26 mmol) e N,N-dimetilformamida (3,00 mL) e agitada em temperatura ambiente durante 16,5 horas. A solução de reação foi diluída com clorofórmio e lavada com solução de ácido cítrico a 10%, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de sódio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel [clorofórmio-clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo (1,16 g, 99%).
[000759] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ : 0,86 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,30 (9H, s), 1,81-1,89 (2H, m), 2,09-2,21 (2H, m), 2,38 (3H, s), 3,15-3,17 (2H, m), 3,55-3,56 (2H, m), 5,15 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,41 (2H, s), 5,55-5,56 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,95 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,28 (1H, s), 7,77 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,39 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[000760] MS (APCI) m/z: 593 (M+H)+ Processo 2: N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino[1, 2-b]quinolin-1-il]glicinamida
[000761] O composto (0,513 g, 1,01 mmol) obtido no Processo 1 anterior foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 1 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo (0,463 g, 93%).
[000762] 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) δ : 0,96 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,89 1,91 (2H, m), 2,14-2,16 (1H, m), 2,30 (3H, s), 2,40-2,42 (1H, m), 3,153,21 (2H, m), 3,79-3,86 (2H, m), 4,63-4,67 (1H, m), 5,00-5,05 (1H, m), 5,23 (1H, d, J = 16,0 Hz), 5,48 (1H, d, J = 16,0 Hz), 5,62-5,64 (1H, m), 7,40-7,45 (2H, m).
[000763] MS (APCI) m/z: 493 (M+H)+ Exemplo 46 Conjugado de anticorpo-fármaco (46) Fórmula 72
Figure img0075
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (46)
[000764] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (50 mL) foi colocada em um frasco de Erlenmeyer de policarbonato de 125 mL, carregado com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M em temperatura ambiente (0,750 mL) com agitação usando um agitador magnético, e em seguida carregado com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (1,857 mL; 5,4 equivalentes por molécula de anticorpo). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,0 ± 0,1, a agitação foi terminada, e a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.
[000765] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de resfriar a solução anterior a 15°C, uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (2,958 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada gradualmente a isto gota a gota com agitação. A 15°C, a solução de reação foi agitada durante os primeiros 30 minutos e incubada sem agitação para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo durante a próxima 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,444 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto com agitação e agitada em temperatura ambiente para terminar a reatividade de ligantes de fármaco não reagidos durante outros 20 minutos.
[000766] Purificação: Adicionando-se gradualmente solução de ácido acético aquosa a 20% (cerca de 0,25 mL) e ABS (50 mL) à solução anterior com agitação, o pH da solução foi ajustado em 5,5 ± 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (Millipore Corp., filtro Millex-HV, 0,45 μm, membrana de PVDF) para remover a matéria esbranquiçada. Esta solução foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um mecanismo de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassete, Biomax 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole- Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionada gota a gota (um total de 800 mL) como uma solução de tamponamento para purificação à solução de reação, purificação por ultrafiltração foi realizada para remover ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular, da mesma forma substituindo a solução de tamponamento com ABS, e concentrando a solução. A solução purificada obtida foi submetida à microfiltração (0,22 μm (Millipore Corp., filtro Millex-GV, membrana de PVDF) e 0,10 μm (Millipore Corp., filtro Millex-VV, membrana de PVDF)) para produzir 42,5 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000767] Caracterização Físico-química: Usando os procedimentos Comuns E e F e (SD,28O = 5178 (valor medido), e SD,3?O = 20217 (valor medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000768] Concentração de anticorpo: 10,4 mg/mL, rendimento de anticorpo: 442 mg (88,5%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum E: 6,0, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo procedimento Comum F: 7,5. Exemplo 47 Conjugado de anticorpo-fármaco (47) Fórmula 73
Figure img0076
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (47)
[000769] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (15 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,567 mL; 5,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (0,225 mL). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 2 horas.
[000770] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de adicionar DMSO (0,146 mL) e uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (0,928 mL; 9,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução anterior em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 15°C durante 30 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,133 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto e agitada em temperatura ambiente para terminar a reatividade de ligantes de fármaco não reagidos durante outros 20 minutos.
[000771] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o procedimento Comum D (ABS foi usada como solução de tamponamento) para produzir 49 mL de uma solução que contém o composto de interesse.
[000772] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E (SD,280 = 5178 e SD,3?O = 20217 foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000773] Concentração de anticorpo: 2,91 mg/mL, rendimento de anticorpo: 143 mg (95%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,2. Exemplo 48 Conjugado de anticorpo-fármaco (48) Fórmula 74
Figure img0077
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (48)
[000774] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (280 mL) foi colocada em um frasco de Erlenmeyer de policarbonato de 1000 mL, carregado com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M em temperatura ambiente (4,200 mL) com agitação usando um agitador magnético, e em seguida carregado com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (10,594 mL; 5,5 equivalentes por molécula de anticorpo). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,4 ± 0,1, a agitação foi terminada, e a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 2 horas.
[000775] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de resfriar a solução anterior a 15°C, uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (17,335 mL; 9,0 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionado gradualmente a isto gota a gota com agitação. A solução de reação foi agitada a 15°C para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo durante 30 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (2,485 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto com agitação e agitada em temperatura ambiente para terminar a reatividade de ligantes de fármaco não reagidos durante outros 20 minutos.
[000776] Purificação: Adicionando-se solução de ácido acético aquosa a 20% gradualmente (cerca de 1,4 mL) e ABS (280 mL) à solução anterior com agitação, o pH da solução foi ajustado em 5,5 ± 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (0,45 μm, membrana de PVDF) para remover a matéria esbranquiçada ao mesmo tempo que produzindo cerca de 600 mL de um filtrado. Esta solução foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um mecanismo de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassete, Biomax 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionada gota a gota (um total de 4800 mL) como uma solução de tamponamento para purificação à solução de reação, purificação por ultrafiltração foi realizada para remover ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular, da mesma forma substituindo a solução de tamponamento com ABS, e também concentrando a solução. A solução purificada obtida foi submetida à microfiltração (duas vezes com 0,22 μm e 0,10 μm, membrana de PVDF) para produzir 70 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000777] Caracterização Físico-química: Usando o procedimento Comum E e (SD,280 = 5178 e SD,370 = 20217 foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.
[000778] Concentração de anticorpo: 35,96 mg/mL, rendimento de anticorpo: 2517 mg (90%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,2. Exemplo 49 Conjugado de anticorpo-fármaco (49) Fórmula 75
Figure img0078
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (49)
[000779] Redução do anticorpo: O trastuzumabe produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6.0/EDTA usando os procedimento Comum C-1 e procedimento Comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,48 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (280 mL) foi colocada em um frasco de Erlenmeyer de policarbonato de 1000 mL, carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M em temperatura ambiente (4,200 mL) com agitação usando um agitador magnético, e em seguida carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (10,594 mL; 5,5 equivalentes por molécula de anticorpo). Depois de confirmar que a solução teve um pH de 7,0 ± 0,1, a agitação foi terminada, e a ligação de dissulfeto à parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 2 horas.
[000780] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de resfriar a solução anterior a 15°C, uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto do Processo 8 do Exemplo 26 (17,335 mL; 9,0 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada gradualmente a isto gota a gota com agitação. A solução de reação foi agitada a 15°C para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo durante 30 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (2,485 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isto com agitação e agitada em temperatura ambiente para terminar a reatividade de ligantes de fármaco não reagidos durante outros 20 minutos.
[000781] Purificação: Adicionando-se gradualmente solução de ácido acético aquosa a 20% (cerca de 1,4 mL) e ABS (280 mL) à solução anterior com agitação, o pH da solução foi ajustado em 5,5 ± 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (0,45 μm, membrana de PVDF) para remover a matéria esbranquiçada ao mesmo tempo que produzindo cerca de 600 mL de um filtrado. Esta solução foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um mecanismo de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassete, Ultracell 30 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionada gota a gota (um total de 4800 mL) como uma solução de tamponamento para purificação à solução de reação, purificação por ultrafiltração foi realizada para remover ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular, da mesma forma substituindo a solução de tamponamento com ABS, e também concentrando a solução. A solução purificada obtida foi submetida à microfiltração (duas vezes com 0,22 μm e 0,10 μm, membrana de PVDF) para produzir 130 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000782] Caracterização físico-química: Usando-se o Procedimento comum E (SD, 280 = 5178 e SD, 370 = 20217 foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[000783] Concentração de anticorpo: 21,00 mg/mL, produção de anticorpo: 2730 mg (97,5%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 50 Conjugado de anticorpo-fármaco (50) Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (50)
[000784] Os conjugados de anticorpo-fármaco (47), (48), e (49) produzidos nos Exemplos 47, 48, e 49 foram misturados (243 mL) e também carregados com ABS (39,75 mL) para produzir 283 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.
[000785] Caracterização físico-química: Usando-se os procedimentos Comuns E e F (sD, 280 = 5178, e sD, 370 = 20217 foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[000786] Concentração de anticorpo: 20,0 mg/mL, produção de anticorpo: 5655 mg, número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 6.3, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 7,8. Exemplo de Avaliação 1 Efeito inibidor do crescimento celular (1) de conjugado de anticorpo-fármaco
[000787] Linhagem de câncer de mama humana KPL-4 de células positivas de antígeno de HER2 (Dr. Junichi Kurebayashi, Kawasaki Medical School, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717) ou linhagem de câncer de mama humana MCF7 de células negativas de antígeno (European Collection of Cell Cultures; ECACC) foi cultivada em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (em seguida, referido como meio).A KPL-4 ou MCF7 foram preparadas para ter uma concentração de 2,5 (104 células/mL usando-se meio, adicionadas em uma concentração de 100 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular, e cultivadas durante a noite.
[000788] No dia seguinte, trastuzumabe ou o conjugado de anticorpo-fármaco diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando-se meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. O meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de anticorpo. As células foram cultivadas sob CO2 a 5% 37oC durante 5 a 7 dias. Depois da cultura, a microplaca foi retirada da incubadora e deixada em repouso em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Depois que a microplaca foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 10 minutos, a intensidade de luminescência de cada cavidade foi medida usando-se uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor da IC50 foi calculado de acordo com a seguinte equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOG10(b) - LOG10 (a)) / (d - c) + LOG10 (b)) a: Concentração da amostra a b: Concentração da amostra b c: Viabilidade de Célula da amostra a d: Viabilidade de Célula da amostra b
[000789] A viabilidade de célula em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte equação: Viabilidade de célula (%) = a / b x 100 a: Intensidade de luminescência média das cavidades de amostra (n = 2) b: Intensidade de luminescência média das cavidades não suplementadas de anticorpo (n = 10)
[000790] Os conjugados de anticorpo-fármaco (2), (3), (5), (7), (10), (12), (13), (16), (18), (40), e (42) exibiram um efeito inibidor de crescimento de célula de IC50 < 0,1 (nM) contra as células KPL-4.
[000791] Os conjugados de anticorpo-fármaco (4), (6), (9), (15), (17), (21), (22), (25), (36), (37), (39), (41), e (43) exibiram um efeito inibidor de crescimento de célula de 0,1 < IC50 < 1 (nM) contra as células.
[000792] Os conjugados de anticorpo-fármaco (20), (24), e (27) exibiram um efeito inibidor de crescimento de célula de 1 < IC50 < 100 (nM) contra as células. Nenhum dos conjugados de anticorpo-fármaco (19) ou (26) exibiu um efeito inibidor de crescimento de célula contra as células (> 100 (nM)).
[000793] Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (5), (13), e (43) exibiram um efeito inibidor de crescimento de célula de 1 < IC50 < 100 (nM) contra as células MCF7, considerando que nenhum dos conjugados de anticorpo-fármaco (2), (3), (4), (6), (7), (9), (10), (12), (15), (16), (17), (18), (25), (26), (27), (39), (40), (41), (42), e (44) exibiu um efeito inibidor de crescimento de célula contra as células (> 100 (nM)).
[000794] Trastuzumabe exibiu um efeito inibidor de crescimento de célula nem contra as células KPL-4 nem as células MCF7 (> 100 (nM)). Exemplo de Avaliação 2 Teste antitumor (1)
[000795] Camundongo: camundongos nus fêmeas de 5 a 6 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.) foram aclimados durante 4 a 7 dia sob condições de SPF antes do uso na experiência. Os camundongos foram alimentados com alimento sólido esterilizado (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) e dado água de torneira esterilizada (preparada pela adição de 5 a 15 ppm de solução de hipoclorito de sódio).
[000796] Ensaio e expressão de cálculo: Em todos os estudos, o eixo principal e eixo secundário de um tumor foram medidos duas vezes por semana usando um calibrador digital eletrônico (CD-15CX, Mitutoyo Corp.), e o volume de tumor (mm3) foi calculado. A expressão de cálculo é como mostrado abaixo. Volume de tumor (mm3)= ^ x Eixo principal (mm) x [Eixo secundário (mm)]2
[000797] Todos os conjugados de anticorpo-fármaco e o anticorpo foram diluídos com solução salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) e usados em um volume de 10mL/kg para administração intravenosa à veia do rabo de cada camundongo.
[000798] Células KPL-4 foram suspensas em solução salina fisiológica, e 1,5 x 107 células foram subcutaneamente transplantadas ao lado direiro do corpo de cada camundongo nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram randomizadamente agrupados no Dia 15. Os conjugados de anticorpo-fármaco (27) ou o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe (Exemplo de Referência 1) para um grupo controle foram intravenosamente administrados em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo nos Dias 15 e 22. Um grupo não tratado foi estabelecido como um grupo controle.
[000799] Os resultados são mostrados na Figura 3. A administração de trastuzumabe inibiu o crescimento de tumor, considerando que a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (27) produziu um efeito inibidor de crescimento de tumor mais significante. No desenho, a abscissa descreve dias depois da inoculação do tumor, e a ordenada descreve o volume do tumor. Além disso, os camundongos que receberam trastuzumabe ou o conjugado de anticorpo-fármaco (27) ficaram livres de sinais notáveis tal como perda de peso, sugerindo que o conjugado de anticorpo-fármaco (27) é altamente seguro. Nos Exemplos de Avaliação abaixo relativos ao teste antitumor, o teste foi conduzido pelo procedimento usado neste Exemplo de Avaliação, a menos que de outra maneira especificado. Exemplo de Avaliação 3 Teste antitumor (2)
[000800] Células NCI-N87 de linhagem de câncer gástrico humano adquiridas de ATCC (American Type Culture Collection) foram suspensas em solução salina fisiológica, e 1 x 107 células foram subcutaneamente transplantadas ao lado direiro do corpo de cada camundongo nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram radomizadamente agrupados no Dia 7. Os conjugados de anticorpo- fármaco (8) ou (28), ou trastuzumabe entansina (Exemplo de Referência 2) foram intravenosamente administrados em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 7. Um grupo não tratado foi estabelecido como um grupo controle.
[000801] Os resultados são mostrados na Figura 4. Os conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (28) foram confirmados ter um forte efeito antitumor com regressão de tumor equivalente àquela de trastuzumabe entansina. Além disso, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (8) ou (28), ou trastuzumabe entansina foi constatada estar livre da perda de peso dos camundongos. Exemplo de Avaliação 4 Teste antitumor (3)
[000802] Células JIMT-1 de linhagem de câncer de mama humana adquiridas de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) foram suspensas em solução salina fisiológica, e 3 x 106 células foram subcutaneamente transplantadas ao lado direiro do corpo de cada camundongo nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram randomizadamente agrupados no Dia 12. Os conjugados de anticorpo-fármaco (8), (29), ou (30), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo nos Dias 12 e 19. Um grupo de administração de solução salina fisiológica foi estabelecido como um grupo controle.
[000803] Os resultados são mostrados na Figura 5. A administração de trastuzumabe ou trastuzumabe entansina não inibiu o crescimento do tumor de JIMT-1. Por outro lado, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (8), (29), ou (30) inibiu o crescimento do tumor. Além disso, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (8), (29), ou (30), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi constatada estar livre da perda de peso dos camundongos. Exemplo de Avaliação 5 Efeito inibidor do crescimento celular (2) do conjugado de anticorpo-fármaco
[000804] Linhagem de câncer de pulmão de células não pequenas humano Calu-3 (ATCC) foi cultivada no Meio Essencial Mínimo de Eagle (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (em seguida, referido como meio MEM).
[000805] Linhagem de câncer gástrico humano NCI-N87 (ATCC) ou linhagem de câncer gástrico humano MKN-45 (Health Science Research Resources Bank) foi cultivada em Meio RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (em seguida, referido como meio RPMI).
[000806] Linhagem de câncer de mama humana MDA-MB-453 (ATCC) ou linhagem de câncer de mama humana MDA-MB-468 (ATCC) foi cultivada no Meio L-15 de Leibovitz (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (em seguida, referido como meio de Leibovitz).
[000807] Entre estes 5 tipos de linhagens celulares, Calu-3, NCI- N87, e MDA-MB-453 são células HER2 positivas, e MKN-45 e MDA- MB-468 são células HER2 negativas.
[000808] Calu-3, NCI-N87, ou MKN-45 foi preparada para ter uma concentração de 4 x 104 células/mL usando-se o meio MEM ou meio RPMI, adicionada em uma concentração de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular carregada com 65 μL/cavidade de um meio, e cultivadas durante a noite sob CO2 a 5% a 37oC. Da mesma forma, MDA-MB-453 ou MDA-MB-468 foi preparada para ter uma concentração de 4 x 104 células/mL usando-se o meio de Leibovitz, adicionada em uma concentração de 25 μL/cavidade em uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular carregada com 65 μL/cavidade de meio, e cultivada durante a noite a 37oC sem fixar a concentração de CO2.
[000809] No dia seguinte, uma substância teste diluída em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando-se meio RPMI ou meio de Leibovitz, ou meio RPMI ou meio de Leibovitz foi adicionada em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. As células foram cultivadas sob CO2 a 5% a 37oC ou a 37oC sem fixar a concentração de CO2 durante 6 dias.
[000810] Para Calu-3, NCI-N87, e MDA-MB-468, o conjugado de anticorpo-fármaco (46) foi adicionado como a substância teste. Para as outras células, o conjugado de anticorpo-fármaco (50) foi adicionado como a substância teste. Depois da cultura, a microplaca foi retirada da incubadora e deixada em repouso em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada com um misturador de placa para completamente lisar as células. Depois que a microplaca foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 10 minutos, intensidade de luminescência foi medida usando uma leitora de placa.
[000811] A viabilidade de célula foi calculada de acordo com a seguinte equação: Viabilidade de célula (%) = a / b x 100 a: Intensidade de luminescência média das cavidades suplementadas com substância teste b: Intensidade de luminescência média das cavidades suplementadas com meio
[000812] O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte equação: IC50 (nM) = antilog ((50 - d) x (LOG10 (b) - LOG10 (a)) / (d - c) + LOG10 (b)) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Viabilidade de célula suplementada com a substância teste tendo a concentração a d: Viabilidade de célula suplementada com a substância teste tendo a concentração b
[000813] As concentrações a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de viabilidade de célula.
[000814] O conjugado de anticorpo-fármaco (46) exibiu um efeito inibidor de crescimento de célula de IC50 < 1 (nM) contra as células HER2 positivas Calu-3 e NCI-N87. Por outro lado, o conjugado de anticorpo-fármaco (46) não exibiu nenhum efeito inibidor de crescimento celular contra as células HER2 negativas MDA-MB-468 (> 100 (nM)).
[000815] O conjugado de anticorpo-fármaco (50) exibiu um efeito inibidor de crescimento de célula de IC50 < 1 (nM) contra as células HER2 positivas MDA-MB-453. Por outro lado, o conjugado de anticorpo-fármaco (50) não exibiu efeito inibidor de crescimento celular contra as células HER2 negativas MKN-45 (> 100 (nM)). Exemplo de Avaliação 6 Teste antitumor (4)
[000816] Células Capan-1 de linhagem de câncer pancreático humano (ATCC) fracamente expressando HER2 foram suspensas em solução salina fisiológica, e 4 x 107 células foram subcutaneamente transplantadas ao lado direiro do corpo de cada camundongo nu fêmea para gerar o tumor sólido de Capan-1. Depois disso, este tumor sólido foi mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas e usado neste teste. Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado direiro do corpo de cada camundongo nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram randomizadamente agrupados no Dia 20.
[000817] Os conjugados de anticorpo-fármaco (31), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 20. Um grupo de administração de solução salina fisiológica foi estabelecido como um grupo controle.
[000818] Os resultados são mostrados na Figura 6. A administração de trastuzumabe ou trastuzumabe entansina não inibiu o crescimento do tumor de Capan-1. Através de comparação, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (31) inibiu o crescimento do tumor, demonstrando que o conjugado de anticorpo-fármaco (31) é efetivo mesmo para tumor com baixa expressão de HER2. Os conjugados de anticorpo-fármaco (31) não inibem o crescimento de HER2 não expressando o tumor de GCIY de linhagem de câncer gástrico.
[000819] Quanto à expressão de HER2 em tumor, com base nos resultados de medida do manchamento imunoistoquímico descrito na 3a edição das diretrizes para teste de HER2 (desenvolvido pela Japonese Pathology Board for Optimal Use of Trastuzumab, The Japonese Society Pathology), a classificação foi realizada tal que a contagem de 3+: expressão alta, 2+: expressão moderada, e 1+: baixa expressão. Embora a contagem tenha sido 0 neste método de medida, o tumor constatado HER2 positivo por outros métodos de medida tal como um método de medida usando um citômetro de fluxo foi classificado como fracamente expressando tumor. Exemplo de Avaliação 7 Teste antitumor (5)
[000820] Células de NCI-N87 de linhagem de câncer gástrico humano adquiridas de ATCC foram suspensas em solução salina fisiológica, e 1 x 107 células foram subcutaneamente transplantadas ao lado direiro do corpo de cada camundongo nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram randomizadamente agrupados no Dia 6. O conjugado de anticorpo-fármaco (50) foi intravenosamente administrado a cada dose de 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 6. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000821] Os resultados são mostrados na Figura 7. O conjugado de anticorpo-fármaco (50) exibiu um efeito antitumor dependente de dose. Além disso, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (50) foi constatada estar livre da perda de peso dos camundongos. Exemplo de Avaliação 8 Teste antitumor (6)
[000822] Este teste foi realizado pelo seguinte método.
[000823] Camundongo: camundongos nus fêmeas de 6 a 12 semana de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.) foram submetidos à experiência.
[000824] Ensaio e expressão de cálculo: O eixo principal e eixo secundário de tumor foram medidos duas vezes por semana usando um calibrador digital eletrônico, e o volume de tumor (mm3) foi calculado. A expressão de cálculo é como mostrado abaixo. Volume de tumor (mm3) = 0,52 (Eixo principal (mm) x [Eixo secundário (mm)]2
[000825] O conjugado de anticorpo-fármaco, trastuzumabe, e trastuzumabe entansina foi diluído com uma solução de tamponamento de acetato e usado em um volume de 10 mL/kg para administração intravenosa à veia do rabo de cada camundongo.
[000826] Tumor (ST225; South Texas Accelerated Research Therapeutics (START)) cortado de um paciente com câncer de mama e mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas foi usado neste teste. Este tumor expressou moderadamente HER2 (que recebeu uma contagem de 2+ em manchamento imunoistoquímico).
[000827] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000828] Os resultados são mostrados na Figura 8. A administração de trastuzumabe não inibiu o crescimento do tumor de ST225 de câncer de mama expressando moderadamente HER2. Através de comparação, a administração de trastuzumabe entansina ou do conjugado de anticorpo-fármaco (50) inibiu notavelmente o crescimento do tumor. Exemplo de Avaliação 9 Teste antitumor (7)
[000829] Tumor (ST910; START) cortado de um paciente com câncer de mama e mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas foi usado neste teste. Este tumor expressou fracamente HER2 (que recebeu uma contagem de 1+ em manchamento imunoistoquímico).
[000830] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000831] Os resultados são mostrados na Figura 9. A administração de trastuzumabe ou trastuzumabe entansina não inibiu o crescimento do tumor de ST910 de câncer de mama fracamente expressando HER2. Através de comparação, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (50) inibiu notavelmente o crescimento do tumor, demonstrando que o conjugado de anticorpo-fármaco (50) é efetivo para tumor de câncer de mama fracamente expressando HER2. Este Exemplo de Avaliação 9 foi realizado pelo mesmo procedimento como o Exemplo de Avaliação 8. Exemplo de Avaliação 10 Teste antitumor (8)
[000832] Este teste foi realizado pelo seguinte procedimento. Exemplos de avaliação 11 a 13 foram da mesma forma realizados por este procedimento.
[000833] Camundongo: camundongos nus fêmeas de 5 a 8-semanas de idade (Harlan Laboratories Ltd.) foram submetidos à experiência.
[000834] Ensaio e expressão de cálculo: O eixo principal e eixo secundário de tumor foram medidos duas vezes por semana usando um calibrador digital eletrônico, e o volume de tumor (mm3) foi calculado. A expressão de cálculo é como mostrado abaixo. Volume de tumor (mm3) = 0,52 x Eixo principal (mm) x [Eixo secundário (mm)]2
[000835] O conjugado de anticorpo-fármaco, trastuzumabe, e trastuzumabe entansina foram diluídos com uma solução de tamponamento de acetato e usado em um volume de 10 mL/kg para administração intravenosa à veia do rabo de cada camundongo.
[000836] Tumor (CTG-0401; Champions Oncology Inc.) cortado de um paciente com câncer colorretal e mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas foi usado neste teste. Este tumor expressou fracamente ou moderadamente HER2 (que recebeu uma contagem de 1+ ou 2+ em manchamento imunoistoquímico).
[000837] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado esquerdo do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo- fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000838] Os resultados são mostrados na Figura 10. A administração de trastuzumabe ou trastuzumabe entansina não inibiu o crescimento do tumor de CTG-0401 de câncer colorretal expressando fracamente ou moderadamente HER2. Através de comparação, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (50) inibiu notavelmente o crescimento do tumor. Exemplo de Avaliação 11 Teste antitumor (9)
[000839] Tumor (CTG-0860; Champions Oncology Inc.) cortado de um paciente com câncer de pulmão de células não pequenas e mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas foi usado neste teste. Este tumor expressou moderadamente HER2 (que recebeu uma contagem de 2+ em manchamento imunoistoquímico).
[000840] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado esquerdo do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo- fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000841] Os resultados são mostrados na Figura 11. A administração de trastuzumabe ou trastuzumabe entansina não inibiu o crescimento do tumor de CTG-0860 de câncer de pulmão de células não pequenas expressando moderadamente HER2. Através de comparação, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (50) inibiu notavelmente o crescimento do tumor. Exemplo de Avaliação 12 Teste antitumor (10)
[000842] Tumor (CTG-0927; Champions Oncology Inc.) cortado a partir de um paciente com câncer de ducto de bílis e mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas foi usado neste teste. Este tumor expressou HER2 altamente (que recebeu uma contagem de 3+ em manchamento imunoistoquímico).
[000843] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado esquerdo do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo- fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000844] Os resultados são mostrados na Figura 12. A administração de trastuzumabe não inibiu o crescimento do tumor de CTG-0927 de câncer de ducto de bílis altamente expressando HER2. Através de comparação, a administração de trastuzumabe entansina inibiu o crescimento do tumor. Além disso, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (50) induziu a regressão do tumor. Exemplo de Avaliação 13 Teste antitumor (11)
[000845] Tumor (CTG-0137; Champions Oncology Inc.) cortado de um paciente com câncer esofágico e mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas foi usado neste teste. Este tumor expressou HER2 altamente (que recebeu uma contagem de 3+ em manchamento imunoistoquímico).
[000846] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado esquerdo do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo- fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução de tamponamento de acetato foi estabelecido como um grupo controle.
[000847] Os resultados são mostrados na Figura 13. A administração de trastuzumabe não inibiu o crescimento do tumor de CTG-0137 de câncer esofágico altamente expressando HER2. Através de comparação, a administração de trastuzumabe entansina ou do conjugado de anticorpo-fármaco (50) inibiu notavelmente o crescimento do tumor. Exemplo de Avaliação 14 Teste antitumor (12)
[000848] Células SK-OV-3 de linhagem de câncer ovariano humanas altamente expressando HER2 adquiridas de ATCC foram suspensas em solução salina fisiológica, e 4 x 107 células foram subcutaneamente transplantadas ao lado direito do corpo de cada camundongo nu fêmea para preparar o tumor sólido para SK-OV-3. Depois disso, este tumor sólido foi mantido em várias passagens por transplante em camundongos nus fêmeas e usado neste teste.
[000849] Uma seção de tumor do tumor sólido foi subcutaneamente transplantada ao lado direito do corpo de cada camundongo nu fêmea, e os camundongos foram radomizadamente agrupados quando o volume de tumor alcançou 100 a 300 mm3. Os dados do agrupamento foram definidos como Dia 0. O conjugado de anticorpo-fármaco (50), trastuzumabe, ou trastuzumabe entansina foi intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à veia do rabo de cada camundongo no Dia 0. Um grupo de administração de solução salina fisiológica foi estabelecido como um grupo controle.
[000850] Os resultados são mostrados na Figura 14. A administração de trastuzumabe não inibiu o crescimento do tumor de SK-OV-3. Através de comparação, a administração de trastuzumabe entansina ou do conjugado de anticorpo-fármaco (50) inibiu notavelmente o crescimento do tumor.
TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[000851] SEQ ID NO: 1 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado
[000852] SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado.

Claims (10)

1. Conjugado de anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que um ligante e um fármaco representado pela fórmula seguinte e um anticorpo anti-HER2 são conectados: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), em que -(Succinimid-3-il-N)- possui uma estrutura representada pela seguinte fórmula:
Figure img0079
que é conectado ao anticorpo anti-HER2 na posição 3 da mesma pelo por meio de uma ligação de tioéter que é formada em uma porção de ligação de dissulfeto presente na parte da articulação do anticorpo anti-HER2, e está conectado a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(NH-DX) representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
Figure img0080
em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma posição de conexão, e o anticorpo anti-HER2 compreende uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 1 a 449 da SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 2, ou compreende uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.
2. Conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER2 compreende uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 1 a 449 da SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve consistindo em um aminoácido sequência de ácido consistindo nos resíduos de aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 2.
3. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER2 compreende uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.
4. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante conjugada por anticorpo está na faixa de 2 a 8.
5. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante conjugada por anticorpo está na faixa de 3 a 8.
6. Fármaco, caracterizado pelo fato de que contém o conjugado de anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um sal do mesmo, ou um hidrato do mesmo.
7. Fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer, caracterizado pelo fato de que contém o conjugado de anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um sal do mesmo, ou um hidrato do mesmo.
8. Fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso contra câncer de pulmão, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, câncer de cerviz uterino, câncer esofágico, carcinoma de célula escamosa, câncer peritoneal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer uterino, câncer da glândula salival, câncer renal, câncer vulvar, câncer da tireoide, câncer de pênis, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma, ou sarcoma.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que contém o conjugado de anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um sal do mesmo, ou um hidrato do mesmo, como um componente ativo, e um componente de formulação farmaceuticamente aceitável.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é para uso contra câncer de pulmão, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, câncer de cerviz uterino, câncer esofágico, carcinoma de célula escamosa, câncer peritoneal, câncer de fígado, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer uterino, câncer da glândula salival, câncer renal, câncer vulvar, câncer da tireoide, câncer de pênis, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma, ou sarcoma.
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