BR112015011363B1 - Anticorpo anti-epo, e usos do mesmo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-EPO, E USOS DO MESMO. A presente invenção refere-se a composições e métodos para a inibição de EPO. A invenção fornece anticorpos e fragmentos ligação de antígeno dos mesmos que ligam-se a EPO e são capazes e inibir proliferação celular dependente de EPO e/ou sinalizando celular dependente de EPO.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] Retinopatia diabética (DR) é a complicação mais comum em pacientes com diabetes. Edema de macular diabético (DME) pode ocorrer em qualquer estágio de DR e é a causa principal de perda de visão em pacientes com DR. A incidência de DME depois de 10 anos de seguimento foi relatada ser 20,1% em diabetes Tipo 1, 25,4% em diabetes insulino dependentes Tipo 2, e 13,9% em diabetes não insuli- no dependente Tipo 2 (Klein e outro (1995) Ophthalmology 102, 7-16). A tentativa de ETDRS ((1985) Photocoagulation for Diabetic Macular Edema - Early Treatment Diabetic - Retinopathy Study Report .1. Archives of Ophtalmology 103, 1796-1806), um estudo pioneiro em DR, demonstrou que embora terapia de fotocoagulação a laser reduz o risco de perda visual moderada em olhos com DME em ~50% em 3 anos, apenas alguns olhos ganham visão, e alguns olhos continuam experimentando perda de visão até mesmo depois de tratamento intensivo. Em recentes anos, avanços em farmacoterapia e liberação de fármaco ocular mostrou promessa no tratamento de DME. O estudo de RESTABELECIMENTO, uma de duas tentativas de Fase III pivotal em DME (Mitchell e outro (2011) Ophtalmology 118, 615-625) demonstrou que Lucentis® foi superior a monoterapia a laser. A mudança média em acuidade visual melhor corrigida (BCVA), que foi o ponto final clínico primário, foi significativamente melhorada no grupo Lucentis ® (+6,1 letras para o grupo Lucentis ® versus +0,8 letras para o grupo a laser; p < 0,0001). Efeitos benéficos similares foram demonstrados com VEGF Trap-Eye (Regeneron Inc. NY, USA) e Ozurdex® (implante in- travítreo de dexametasona; Allergan Inc., CA, USA) (Do e outro (2011) Ophthalmology 118, 1819-1826; Haller e outro (2010) Archives Ophthalmology 128, 289-296). Entretanto, 16% de olhos tratados por Ozurdex desenvolveram pressão intra-ocular aumentada, um risco para glaucoma.

[002] Apesar destas novas opções de tratamento para DME, permanece uma necessidade médica imprópria substancial. ~25% de olhos nas tentativas de Lucentis ® pivotal não ganharam qualquer acuidade visual depois de 12 meses de tratamento e ~50% de olhos são deixados com acuidade visual de 20/40 ou pior. Estudos de associação de amplo genoma indicaram que diabéticos que são homozigo- tos para um polimorfismo de promotor de eritropoietina (Epo) (T) têm um risco 2,17-vezes mais alto de desenvolver DR proliferativo (Tong e outro (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Uns 105, 6998-7003). Interessantemente, pessoas com o alelo de promotor T para Epo têm concentração vítrea aproximadamente 7,5 vezes mais alta de Epo comparada a pessoas com o alelo G (Tong e outro (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 6998-7003).

[003] Permanece uma necessidade de desenvolver um tratamento eficaz para retinopatia diabética, particularmente DME para substituir ou suplementar tratamentos atuais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] A invenção refere-se a anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, como descrito aqui qual liga Epo e/ou Darbepoietina.

[005] Os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antí-geno, descritos aqui ligam Epo e/ou Darbepoietina, com um KD menor do que ou igual a 100 pM. Por exemplo, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ligar-se a Epo humano e/ou Darbepoietina com um KD menor do que ou igual a 50 pM, menor do que ou igual a 40 pM, menor do que ou igual a 35 pM, menor do que ou igual a 30 pM, menor do que ou igual a 25 pM, menor do que ou igual a 20 pM, menor do que ou igual a 15 pM, menor do que ou igual a 14 pM, menor do que ou igual a 13 pM, menor do que ou igual a 12 pM, menor do que ou igual a 11 pM, menor do que ou igual a 10 pM. Mais especificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem da mesma forma ligar Epo humano com um KD menor do que ou igual a 35pM, como medido por Biacore, ou menor do que ou igual a 6pM, como medido por Solution Equilibrium Titration (SET). Mais especificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem da mesma forma ligar Darbepoietina com um KD menor do que ou igual a 24pM, como medido por Biacore, ou menor do que ou igual a 4pM, como medido por SET.

[006] A presente invenção refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a EPO humano, cinomolgo, camundongo e/ou rato. A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga um epítopo conformacional compreendendo ami- noácidos selecionados a partir de Epo humana Helix D e Loop A-B. A invenção também refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga um epítopo conformacional compreendendo aminoácidos selecionados a partir de Epo humano Helix D, Loop A-B e Hélice A. Em aspectos particulares da invenção, os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, podem ligar-se ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88). Em outros aspectos, os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ligar-se ao domínio de Loop A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89). Em outros aspectos os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ligar-se ao domínio Loop A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89) e Helix A (aminoácidos 4-26 de Epo Humano; SEQ ID NO: 86). Em outros aspectos da invenção, os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ligar-se ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88), e ao domínio Loop A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89). Em ainda outros aspectos da invenção, os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ligar-se ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88), e Helix A (aminoácidos 4-26 de Epo Humano; SEQ ID NO: 86). Em ainda outros aspectos da invenção, os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ligar-se ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88), ao domínio Loop A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89) e Helix A (aminoácidos 4-26 de Epo Humano; SEQ ID NO: 86).

[007] A presente invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a um epítopo conformacional em Epo compreendendo resíduos de aminoácido Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, e Arg162 de Epo Humano (SEQ ID NO.81). A presente invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a um epítopo conformacional em Epo compreendendo resíduos de aminoácidos Ser9, Gln13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159, e Arg162, de Epo Humano (SEQ ID NO.81). A presente invenção ainda também refere- se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a um epítopo conformacional em Epo compreendendo resíduos de aminoácido Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, e Arg162 de Epo Humano (SEQ ID NO.81).

[008] A presente invenção da mesma forma refere-se a um anti corpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a Epo e também compete para ligação com um anticorpo como descrito na Tabela 1. A presente invenção da mesma forma também refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga o mesmo epítopo como um anticorpo como descrito na Tabela 1.

[009] A presente invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a Epo e tem um ponto isoelétrico (pi) maior do que 8,2, maior do que 8,3, maior do que 8,4, maior do que 8,5 ou maior do que 9,0.

[0010] Os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antíge-no descritos aqui podem da mesma forma ligar Epo cinomolgos, Epo de camundongo e/ou Epo de rato com um KD menor do que ou igual a 100 pM, menor do que ou igual a 80 pM, menor do que ou igual a 70 pM, menor do que ou igual a 60 pM, menor do que ou igual a 50 pM, menor do que ou igual a 40 pM, menor do que ou igual a 35 pM, menor do que ou igual a 30 pM, menor do que ou igual a 25 pM, menor do que ou igual a 20 pM, menor do que ou igual a 15 pM, menor do que ou igual a 10 pM, menor do que ou igual a 5 pM, menor do que ou igual a 4 pM, menor do que ou igual a 3 pM, menor do que ou igual a 2 pM, menor do que ou igual a 1 pM. Mais especificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem da mesma forma ligar Epo cinomolgo, Epo de camundongo e/ou Epo de rato com um KD menor do que ou igual a 80pM, como medido por Biacore, ou menor do que ou igual a 40pM, como medido por SET. Mais especificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem da mesma forma ligar Epo Cinomol- go com um KD menor do que ou igual a 80pM, como medido por Biaco- re, ou menor do que ou igual a 8pM, como medido por SET. Mais es-pecificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de an- tígeno descritos aqui podem da mesma forma ligar Epo de camundongo com um KD menor do que ou igual a 45pM, como medido por Biaco- re, ou menor do que ou igual a 37pM, como medido por SET. Mais especificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de an- tígeno descritos aqui podem da mesma forma ligar Epo de rato com um KD menor do que ou igual a 57pM, como medido por Biacore, ou menor do que ou igual a 13pM, como medido por SET.

[0011] A afinidade de ligação de anticorpos isolados e fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ser determinada por SET. Métodos para SET são conhecidos na técnica e são descritos em outros detalhes abaixo. Alternativamente, afinidade de ligação dos anticorpos isolados, ou fragmentos, descritos aqui pode ser determinada por ensaio de Biacore. Métodos para ensaios cinéticos de Biacore são conhecidos na técnica e são descritos em outros detalhes abaixo.

[0012] Os anticorpos isolados e fragmentos de ligação de antigen descritos aqui podem ser usados para inibir proliferação celular dependente de Epo com um IC50 menor do que ou igual a 350 pM, menor do que ou igual a 300 pM, menor do que ou igual a 250 pM, menor do que ou igual a 200 pM, menor do que ou igual a 190 pM, menor do que ou igual a 180 pM, menor do que ou igual a 175 pM, menor do que ou igual a 170 pM, menor do que ou igual a 160 pM, menor do que ou igual a 150 pM, menor do que ou igual a 125 pM, menor do que ou igual a 115 pM, menor do que ou igual a 110 pM, menor do que ou igual a 100 pM, menor do que ou igual a 90 pM, ou menor do que ou igual a 80 pM. Mais especificamente, um anticorpo isolado ou frag- mento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui pode inibir proliferação celular dependente de Epo como medido por um ensaio proliferação celular Ba/F3-EpoR in vitro com um IC50 menor do que ou igual a 338 pM, menor do que ou igual a 183 pM, menor do que ou igual a 175 pM, menor do que ou igual a 174 pM, menor do que ou igual a 145 pM, menor do que ou igual a 112 pM, menor do que ou igual a 89 pM, ou menor do que ou igual a 74 pM.

[0013] Os anticorpos isolados e fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ser usados para inibir proliferação celular dependente de Epo em células B. Mais especificamente, os anticorpos isolados e fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ser usados para inibir proliferação celular dependente de Epo em célu- las B de camundongo. Por exemplo, um anticorpo isolado ou fragmen- to de ligação de antígeno do mesmo pode inibir proliferação celular dependente de Epo como medido por um ensaio proliferação celular Ba/F3-EpoR in vitro com um IC50 menor do que ou igual a 350 pM, menor do que ou igual a 300 pM, menor do que ou igual a 250 pM, menor do que ou igual a 200 pM, menor do que ou igual a 175 pM, menor do que ou igual a 150 pM, menor do que ou igual a 125 pM, menor do que ou igual a 115 pM, menor do que ou igual a 110 pM, menor do que ou igual a 100 pM, menor do que ou igual a 90 pM, ou menor do que ou igual a 80 pM. Mais especificamente, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui pode inibir proliferação celular dependente de Epo como medido por um ensaio proliferação celular Ba/F3-EpoR in vitro com um IC50 menor do que ou igual a 338 pM, menor do que ou igual a 174 pM, menor do que ou igual a 112 pM, ou menor do que ou igual a 74 pM.

[0014] Os anticorpos isolados e fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui podem ser usados para inibir proliferação celular dependente de Epo de células B humanas. Por exemplo, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno pode inibir proliferação celular dependente de Epo do mesmo, como medido por um ensaio proliferação celular F36E in vitro, com um IC50 menor do que ou igual a 200 pM, menor do que ou igual a 190 pM, menor do que ou igual a 180 pM, menor do que ou igual a 170 pM, menor do que ou igual a 160 pM, menor do que ou igual a 150 pM, menor do que ou igual a 125 pM, menor do que ou igual a 100 pM, ou menor do que ou igual a 90 pM. Mais especificamente, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui pode inibir proliferação celular dependente de Epo como medido por um ensaio proliferação celular F36E in vitro com um IC50 menor do que ou igual a 183 pM, menor do que ou igual a 175 pM, menor do que ou igual a 145 pM, ou menor do que ou igual a 89 pM.

[0015] Os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antí- geno dos mesmos, pode da mesma forma bloquear ligação de Epo ao receptor de Epo e/ou previnir ligação de Epo a uma superfície de célula.

[0016] Outro aspecto da invenção inclui um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que especificamente liga-se a Epo de humano, cinomolgo, camundongo e/ou rato. Em um outro aspecto, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antíge- no, compete para ligação com um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, descrito na Tabela 1.

[0017] Os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antí-geno dos mesmos, como descrito aqui podem ser anticorpos mono- clonais, anticorpos de humano ou humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de Fab, fragmentos de Fv, fragmentos de F(ab’)2, ou fragmentos de ScFv, e/ou isótipos de IgG.

[0018] Os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antí-geno dos mesmos, como descrito aqui podem da mesma forma incluir uma estrutura em que um aminoácido foi substituído na estrutura de anticorpo das respectivas sequências de linha germinativa de VH ou VL humano.

[0019] Outro aspecto da invenção inclui um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo tendo as sequências de cadeia pesada e leve total de Fabs descritas na Tabela 1. Mais especificamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ter as sequências de cadeia pesada e leve de Fab NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4.

[0020] Um outro aspecto da invenção inclui um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo tendo as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve de Fabs descritas na Tabela 1. Mais especificamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ter a sequência de domínio variável de cadeia pesada e leve de Fab NVS1 (SEQ ID NOs 13 e 14, respectivamente), NVS2 (SEQ ID NOs 33 e 34, respectivamente), NVS3 (SEQ ID NOs 53 e 54, respectivamente), ou NVS4 (SEQ ID NOs 73 e 74, respectivamente).

[0021] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo iso lado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui um CDR1 de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 1, 21, 41, e 61; um CDR2 de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 22, 42, e 62; e um CDR3 de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 23, 43, e 63, em que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo liga-se a Epo humano. Em outro aspecto, tal anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo também inclui um CDR1 de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 24, 44, e 64; um CDR2 de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 5, 25, 45, e 65; e um CDR3 de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 6, 26, 46, e 66.

[0022] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui um CDR1 de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 24, 44, e 64; um CDR2 de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 5, 25, 45, e 65; e um CDR3 de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 6, 26, 46, e 66, em que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo liga-se a Epo humano.

[0023] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que liga-se a Epo tendo HCDR1, HCDR2, HCDR3 e LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que HCDR1, HCDR2, HCDR3 compreende SEQ ID NOs: 1, 2, 3, e LCDR1, LCDR2, LCDR3 compreende SEQ ID NOs: 4, 5, 6; ou HCDR1, HCDR2, HCDR3 compreende SEQ ID NOs: 21, 22, 23, e LCDR1, LCDR2, LCDR3 compreende SEQ ID NOs: 24, 25, 26; ou HCDR1, HCDR2, HCDR3 compreende SEQ ID NOs: 41, 42, 43, e LCDR1, LCDR2, LCDR3 compreende SEQ ID NOs: 44, 45, 46; ou HCDR1, HCDR2, HCDR3 compreende SEQ ID NOs: 61, 62, 63, e LCDR1, LCDR2, LCDR3 compreende SEQ ID NOs: 64, 65, 66.

[0024] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno tendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3 da cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13, 33, 53 ou 73, e o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve variável de SEQ ID NO: 14, 34, 54 ou 74, como definido por Chothia. Em outro aspecto da invenção o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno pode ter o HCDR1, HCDR2, e HCDR3 da sequência de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 13, 33, 53 ou 73, e o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da sequência de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 14, 34, 54 ou 74, como definido por Kabat.

[0025] Em um aspecto da invenção o anticorpo isolado ou frag- mento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 33, 53 e 73. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno também pode compreender uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL) em que o domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve combinam para formar um sítio de ligação de antígeno para Epo. Em particular a sequência de domínio variável de cadeia leve pode ser selecionada a partir de SEQ ID NOs: 14, 34, 54 e 74 em que o referido anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo liga Epo.

[0026] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui uma sequência de domínio variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 34, 54 e 74, em que o referido anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ligase a Epo humano. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação de an- tígeno também pode compreender uma sequência de domínio variável de cadeia pesada em que o domínio variável de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada combinam para formar e sítio de ligação de antígeno para Epo.

[0027] Em particular, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que liga-se a Epo, pode ter domínios variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo as sequências de SEQ ID NOs: 13 e 14; 33 e 34; 53 e 54; ou 73 e 74, respectivamente.

[0028] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que inclui um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 33, 53, e 73, em que o referido anticorpo liga-se a Epo. Em um as- pecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo também inclui um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 34, 54, e 74. Em um outro aspecto da invenção, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno tem um HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como definido por Kabat e como descrito na Tabela 1. É da mesma forma contemplado que o HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 pode ser definido por Chothia e como descrito na Tabela 1.

[0029] A invenção da mesma forma refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, tendo um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 34, 54, e 74, em que o referido anticorpo liga-se a Epo.

[0030] Em outro aspecto da invenção, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga-se a Epo pode ter uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 15, 35, 55, ou 75. O anticorpo isolado pode da mesma forma incluir uma cadeia leve que pode combinar com a cadeia pesada para formar um sítio de ligação de antígeno para Epo humano. Em particular, a cadeia leve pode ter uma sequência compreendendo SEQ ID NO: 16, 36, 56, ou 76. Em particular, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que liga-se a Epo, pode ter uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo as sequências de SEQ ID NOs: 15 e 16; 35 e 36; 55 e 56; ou 75 e 76, respectivamente.

[0031] A invenção ainda também refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui uma cadeia pesada tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 15, 35, 55, e 75, em que o referido anticorpo liga-se a Epo. Em um aspecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo também inclui uma cadeia leve tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 16, 36, 56, e 76.

[0032] A invenção ainda também refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui uma cadeia leve tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs 16, 36, 56, e 76, em que o referido anticorpo liga-se a Epo.

[0033] A invenção da mesma forma refere-se a composições com preendendo o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, como descrito aqui. Bem como, composições de anticorpo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Especificamente, a invenção também inclui composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da Tabela 1, tal como, por exemplo anticorpo NVS1, NVS2, NVS3 ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a composições farmacêuticas compreendendo uma combinação de dois ou mais dos anticorpos isolados ou fragmentos ligação de antígeno dos mesmos da Tabela 1.

[0034] A invenção da mesma forma refere-se a uma sequência de ácido nucleico isolada codificando a cadeia pesada variável tendo uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 13, 33, 53 e 73. Em particular o ácido nucleico tem uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 17, 37, 57, e 77. Em um outro aspecto da invenção a sequência é SEQ ID NOs: 17, 37, 57, ou 77.

[0035] A invenção da mesma forma refere-se a uma sequência de ácido nucleico isolada codificando a cadeia leve variável tendo uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14, 34, 54 e 74. Em particular o ácido nucleico tem uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 38, 58, e 78. Em um outro aspecto da invenção a sequência é SEQ ID NOs: 18, 38, 58, ou 78.

[0036] A invenção da mesma forma refere-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência codificando um polipeptídeo que inclui um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 38, 58, e 78.

[0037] A invenção da mesma forma refere-se a um vetor que inclui uma ou mais das moléculas de ácido nucleico descritas aqui.

[0038] A invenção da mesma forma refere-se a uma célula hospedeira isolada que inclui uma ou mais das moléculas de ácido nucleico ou vetores descritos aqui. A invenção da mesma forma refere-se a uma célula hospedeira isolada que inclui uma sequência de DNA re- combinante codificando uma cadeia pesada do anticorpo descrita acima, e uma segunda sequência de DNA recombinante codificando uma cadeia leve do anticorpo descrito acima, em que as referidas sequências de DNA são operavelmente ligadas a um promotor e são capazes de ser expressas na célula hospedeira. É contemplado que o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal humano. É da mesma forma contemplado que a célula hospedeira é uma célula de mamífero não humano, por exemplo uma célula de CHO.

[0039] A invenção da mesma forma refere-se a um método de inibir proliferação celular dependente de Epo em que o método inclui a etapa de contatar Epo (por exemplo, contatar Epo em um indivíduo) com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descritos aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. Em um aspecto, o método compreende contatar uma célula (por exemplo, uma célula compreendendo Epo) com uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir proliferação celular dependente de Epo em um indivíduo. É contemplado que a célula seja uma célula humana. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano.

[0040] A invenção da mesma forma refere-se a um método de inibir sinalização celular dependente de Epo em que o método inclui que a etapa de contatar Epo com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de an- tígeno do mesmo descrito aqui para impedir para Epo de interagir com um receptor em uma superfície de célula. Em um aspecto, o método compreende contatar uma célula compreendendo Epo do mesmo com uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno como descrito aqui. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir sinalização celular dependente de Epo em um indivíduo. É contemplado que a célula seja uma célula humana. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano.

[0041] A invenção da mesma forma refere-se a um método de inibir proliferação celular dependente de Epo ou sinalização em que o método inclui a etapa de contatar Epo com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui para impedir para Epo de interagir com um receptor em uma superfície de célula. É contemplado que a célula seja uma célula B. É contemplado que a célula seja uma célula humana.

[0042] A invenção da mesma forma refere-se a um método de ini bir ligação de Epo ao receptor de Epo em que o método inclui a etapa de contatar Epo (por exemplo, contatar Epo em um indivíduo) com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir ligação de Epo ao receptor de Epo em uma célula de um indivíduo; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. É contemplado que a célula seja uma célula humana. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano.

[0043] A invenção ainda também refere-se a um método de inibir ligação de Epo a uma célula em que o método inclui a etapa de contatar Epo (por exemplo, em um indivíduo) com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. Em um aspecto, o método compreende contatar uma célula (por exemplo, uma célula compreendendo Epo) com uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui. A invenção ainda também refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir ligação de Epo a uma célula em um indivíduo. Em um aspecto, é contemplado que a célula seja uma célula humana. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano.

[0044] A invenção da mesma forma refere-se a um método de tra tar edema macular em um indivíduo, em que o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para tratar edema macular em um indivíduo. Em um aspecto, edema macular é associado com doença vascular retinal. É contemplado que a doença vascular retinal associada com o edema macular pode incluir reti- nopatia diabética, edema macular diabético, retinopatia diabética proli- ferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada a idade, oclusão da veia retinal, coroidite multifocal, neo- vascularização coróide míope, ou retinopatia de prematuridade. É da mesma forma contemplado que o indivíduo seja humano.

[0045] A invenção da mesma forma refere-se a um método de tra- tar uma condição ou distúrbio associado com doença vascular retinal em um indivíduo, em que o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para tratar uma condição ou distúrbio associado com doença vascular retinal em um indivíduo. Em um aspecto, é contemplado que a condição ou distúrbio associado com doença vascular retinal seja retinopatia diabética. Em outro aspecto, é contemplado que a condição ou distúrbio seja degene-ração macular relacionada a idade. É ainda também contemplado que a condição ou distúrbio associado com doença vascular retinal pode ser oclusão da veia retinal, coroidite multifocal, neovascularização co- róide míope, ou retinopatia de prematuridade. É da mesma forma contemplado que o indivíduo seja humano.

[0046] A invenção da mesma forma refere-se a um método de tratar uma condição ou distúrbio associado com retinopatia diabética em um indivíduo, em que o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito para tratar uma condição ou distúrbio associado com retinopatia diabética em um indivíduo. É contemplado que o indivíduo seja humano.

[0047] A invenção da mesma forma refere-se a um método de tratar uma condição ou distúrbio associado com edema macular em um indivíduo, em que o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito para tratar uma condição ou distúrbio associado com edema macular em um indivíduo. É também contemplado que a condição ou distúrbio associado com edema macular seja edema macular diabético. É também contemplado que o indivíduo seja humano.

[0048] A invenção da mesma forma refere-se a um método de tratar retinopatia diabética proliferativa em um indivíduo, em que o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para tratar retinopatia diabética proliferativa em um indivíduo. É também contemplado que a composição seja administrada ao olho do indivíduo em que a composição diminui que dilatação da veia retinal, diminui vazamento vascular e/ou aumenta fluxo de sangue no olho. É também contemplado que o indivíduo seja humano.

[0049] Quaisquer dos anticorpos isolados anteriores ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo podem ser um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

DEFINIÇÕES

[0050] A menos que de outra maneira definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como ge- ralmente entendido por aqueles de experiência ordinária na técnica a qual esta invenção pertence.

[0051] O termo "anticorpo" quando aqui usado significa um anti corpo inteiro e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, “porção de ligação de antígeno”) ou cadeia simples do mesmo. Um anticorpo inteiro é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões de VH e VL podem ser também subdivididas em regiões de hipervari- abilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs dispostos de terminal amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0052] O termo "porção de ligação de antígeno" ou “fragmento de ligação de antígeno” de um anticorpo, quando aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retém a capacidade de especificamente ligar-se a um determinado antígeno (por exem- plo, Eritropoietina: Epo). Funções de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo porção de ligação de antígeno ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo incluem um fragmento de Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios de VL, VH, CL e CH1; um fragmento de F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; um fragmento de Fd consistindo nos domínios de VH e CH1; um fragmento de Fv consistindo nos domínios de VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio simples (dAb) (Ward e outro, 1989 Nature 341:544-546), que consiste em um domínio de VH ou um domínio de VL; e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR).

[0053] Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante de peptídeo artificial que o permite ser feito como uma cadeia de proteína simples em que as regiões de VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); veja, por exemplo, Bird e outro, 1988 Science 242:423-426; e Huston e outro, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples incluem uma ou mais porções de ligação de antígeno ou fragmentos de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas aqueles de experiência na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto a utilidade da mesma maneira como são anticorpos intactos.

[0054] Fragmentos de ligação de antígeno podem da mesma for ma ser incorporados em anticorpos de domínio simples, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (veja, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005, Nature Biote- chology, 23, 9, 1126-1136). Porções de ligação de antígeno de anticorpos podem ser enxertadas em sustentações com base em polipep- tídeos tais como Fibronectina tipo III (Fn3) (veja Patente U.S. No. 6,703,199, que descreve monocorpos de polipeptídeo de fibronectina).

[0055] Fragmentos de ligação de antígeno podem ser incorpora dos em moléculas de cadeia simples compreendendo um par de segmentos de Fv tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com poli- peptídeos de cadeia de leve complementar, formam um par de regiões de ligação de antígeno (Zapata e outro, 1995 Protein Eng. 8(10):1057- 1062; e Patente U.S. No. 5,641,870).

[0056] Quando aqui usado, o termo "afinidade" refere-se à resis tência de interação entre anticorpo e antígeno em sítios antigênicos simples. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável do anticorpo “braço” interage através de forças não covalentes fracas com antígeno em numerosos sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade. Quando aqui usado, o termo "afinidade alta" para um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo (por exemplo: um fragmento de Fab) geralmente refere-se a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, tendo um KD de 10-9M ou menos.

[0057] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácido e miméti- cos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos amino- ácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoá- cidos que são modificados depois, por exemplo, hidroxiprolina, y- carboxiglutamato, e O-fosfosserina. Análogos de aminoácido referem- se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono alfa que é ligado a um hidrogênio, um grupo de carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfônio de metionina. Tais análogos modificaram grupos R (por exemplo, norleucina) ou modificaram cadeias principais de peptídeo, porém retém a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido referem-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, porém que funciona de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.

[0058] O termo “especificidade de ligação” quando aqui usado re fere-se à capacidade de um anticorpo individual combinar sítio para reagir com apenas um determinante antigênico.

[0059] A frase “especificamente (ou seletivamente) liga-se” a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de ligação de Epo) refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença de um antí- geno cognato (por exemplo, um Epo humano ou Epo cinomolgo) em uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. As frases “um anticorpo reconhecendo um antígeno” e “um anticorpo específico para um antígeno” são usadas alternadamente aqui com o termo “um anticorpo que especificamente liga-se a um antígeno”.

[0060] O termo “condição ou distúrbio associado com doença vas cular retinal” refere-se a condições, distúrbios ou doenças em que a retina degenera-se ou torna-se disfuncional. Isto inclui retinopatia diabética (DR), edema macular diabético (DME), retinopatia diabética pro- liferativa (PDR), retinopatia diabética não proliferativa (NPDR), degeneração macular relacionada a idade (AMD), oclusão da veia retinal (RVO), coroidite multifocal, neovascularização coróide míope, ou reti- nopatia de prematuridade. Características anatômicas de doença vascular retinal que podem ser tratadas por inibição de Epo incluem edema macular, dilatação venosa, tortuosidade recipiente, vazamento vascular como medido por angiografia de fluoresceína, hemorragia re tinal, e anomalias microvasculares (por exemplo microaneurisma, manchas algodonosas, IRMA), deleção capilar, adesão de leucócito, isquemia retinal, neovascularização do disco óptico, neovasculariza- ção do pólo posterior, neovascularização de íris, hemorragia intrarreti- nal, hemorragia vítrea, cicatriz macular, fibrose subretinal, e fibrose retinal.

[0061] O termo "condição ou distúrbio associado com retinopatia diabética" refere-se a condições em que a retina degenera-se ou torna-se disfuncional, como uma consequência de efeitos de diabetes melito (Tipo 1 ou Tipo 2) em vasculatura retinal, metabolismo retinal, epitélio de pigmento retinal, a barreira hemato retinal, ou níveis oculares de produtos finais de glicação avançada (AGEs), atividade de aldose reductase, hemoglobina glicosilada, e proteína cinase C. Perda Visual em pacientes com retinopatia diabética pode ser um resultado de isquemia retinal, edema macular, vazamento vascular, hemorragia vítrea, ou efeitos diretos de níveis de glicose elevados em neurônios retinais. Características anatômicas de retinopatia diabética que podem ser tratadas por inibição de Epo incluem microaneurisma, manchas algodonosas, dilatação venosa, edema macular, anormalidades microvasculares intra-retinais (IRMA), hemorragia intra-retinal, proliferação vascular, neovascularização do disco, rubeose, e isquemia retinal. “Edema de macular diabético” ocorre em um indivíduo com retino- patia diabética e pode ocorrer em qualquer fase da doença.

[0062] O termo “condição ou distúrbio associado com edema macular”, refere-se a condições ou distúrbios em que inchaço ou espes- samento da mácula ocorre como um resultado de vasos sanguíneos retinais vazando fluido, “edema macular.” Edema macular ocorre dentro, e é frequentemente uma complicação de, doença vascular retinal. Condições específicas ou distúrbios associados com edema macular incluem, retinopatia diabética, edema macular diabético, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada a idade, oclusão da veia retinal, coroidite multifocal, neovascularização coróide míope, ou retinopatia de prematuridade. Tratamento de edema macular pela inibição de Epo pode ser determinado por exame de fundo de olho, tomografia de coerência óptica, e acuidade visual melhorada.

[0063] O termo “anticorpo quimérico” é uma molécula de anticorpo em que (a) a região constante, ou uma porção do mesmo, é alterada, substituída ou trocada de forma que o sítio de ligação de antígeno (região variável) é ligada a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, função efetora e/ou espécies, ou uma molécula completamente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção do mesmo, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável tendo uma especificidade de antígeno diferente ou alterada. Por exemplo, um anticorpo de camundongo pode ser modificado substituindo-se sua região constante com a região constante de uma imunoglobulina humano. Devido à substituição com uma região constante humana, o anticorpo quimérico pode reter sua especificidade reconhecendo o antígeno enquanto tendo antigenicidade reduzida em humano quando comparado ao anticorpo de camundongo original.

[0064] Os termos “proteína de Epo” ou “antígeno de Epo” ou “EPO” ou “Epo” são alternadamente usados, e referem-se à proteína de eritropoietina em espécies diferentes. Por exemplo, Epo humano tem a sequência como mencionada na Tabela 1: SEQ ID NO: 81. Exemplos de proteínas de Epo de outras espécies são fornecidos na Tabela 1, SEQ ID NOs: 82, 83, 84 ou 85. As sequências de proteína para Epo de humano, cinomolgo, camundongo, rato, e coelho estão publicamente disponíveis e descritas na Tabela 1. Epo humano pode da mesma forma ser hiperglicosilado. Epo hiperglicosilado é da mesma forma conhecido na técnica como “darbepoietina” e pode ser obtido a partir de várias fontes incluindo, LEK Pharmacueticals.

[0065] O termo "variante conservadoramente modificada" aplica-se igualmente às sequências de aminoácido e ácido nucleico. Com respeito às sequências de ácido nucleico particulares, variantes conservadoramente modificadas referem-se aqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, para sequências essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um número grande de ácidos nuclei- cos funcionalmente idênticos codifica qualquer determinada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam a alanina de aminoácido. Desse modo, em cada posição onde uma ala- nina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado em quaisquer códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptí- deo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas," que são uma espécie de variações conservadoramente modificadas. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um poli- peptídeo da mesma forma descreve cada possível variação silenciosa do ácido nucleico. Alguém de experiência reconhecerá que cada có- don em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina e TGG que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Desta maneira, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[0066] Para sequências de polipeptídeo, “variantes conservadoramente modificadas” incluem substituições individuais, deleções ou adições em uma sequência de polipeptídeo que resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservadoras fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservadoramente modificadas são além de e não excluem variantes polimórfi- cas, homólogos interespécies, e alelos da invenção. Os seguintes oito grupos contêm aminoácidos que são substituições conservadoras para um outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glu- tâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenila- lanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). Em algumas modalidades, o termo "modificações de sequência conservadoras" é usado para se referir a modificações de aminoá- cido que não significativamente afetam ou alteram as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido.

[0067] O termo “epítopo” significa uma proteína determinante ca paz de ligação específica a um anticorpo. Epítopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tal como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distintos naquela ligação ao anterior, porém não ao posterior é perdida na presença de solventes de desnaturação.

[0068] O termo "anticorpo humano", quando aqui usado, é pretendido incluir anticorpos tendo regiões variáveis em que ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante da mesma forma é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linha germinativa humana, ou versões mutadas de sequências de linha germinativa humana. Os anti- corpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo).

[0069] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anti corpos exibindo uma única especificidade de ligação que tem regiões variáveis em que as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências humanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por hibridomas que inclui (i) uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve (ii) fundido em uma célula imortalizada.

[0070] Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo que retém a reatividade de um anticorpo não humano enquanto sendo menos imu- nogênico em humanos. Isto pode ser obtido, por exemplo retendo-se as regiões de CDR não humanas e substituindo-se as partes restantes do anticorpo com suas contrapartes humanas (isto é, a região constante bem como as porções de estrutura da região variável). Veja, por exemplo, Morrison e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen e outro, Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489498, 1991; e Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Outros exemplos de tecnologia de engenharia humana incluem, porém não são li-mitados a tecnologia de Xoma descrita em US 5,766,886.

[0071] Os termos “idênticos” ou “100% por cento de identidade”,no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de poli- peptídeo, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. Duas sequências são "substancialmente idênticas" se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade em uma região especificada, ou, quando não especificada, sobre a sequência inteira), quando comparado e alinhado para correspondência máxima em uma janela de comparação, ou região designada como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe em uma região que é pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) em comprimento, ou mais preferivelmente em uma região que é 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) em comprimento.

[0072] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequên cia age como uma sequência de referência a qual sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e referência são entradas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrão, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência em seguida calcula as identidades de sequência percentuais para as sequências de teste relativo à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[0073] Uma “janela de comparação”, quando aqui usado, inclui referência a um segmento de qualquer um dos números de posições contíguas selecionadas a partir do grupo consistindo em de 20 a 600, normalmente cerca de 50 a cerca de 200, mais normalmente cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências estejam otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequência para comparação são bem conhecidos na técnica. Alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, pela procura para método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (veja, por exemplo, Brent e outro, Current Protocolos em Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., (Ed de Ringbou., 2003)).

[0074] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar identidade de sequência percentual e similaridade de sequência são os algoritimos de BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outro, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; e Altschul e outro, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. Software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível pelo National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequência de contagem altos (HSPs) identificando- se palavras curtas de comprimento W na sequência em questão, que emparelha ou satisfaz algumas contagens de limiar de valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar de contagem de palavra vizinho (Altschul e outro, supra). Estes acertos de palavras vizinhas agem como sementes por iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos que os contém. Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para até onde a contagem de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. Conta- gens cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleo- tídeo, os parâmetros M (contagem de recompensa para um par de resíduos de emparelhamento; sempre > 0) e N (contagem de penalidade para resíduos de desiquilíbrio; sempre < 0). Para sequências de ami- noácido, uma matriz de contagem é usada para calcular a contagem cumulativa. Extensão dos acertos de palavra em cada direção é parado quando: a contagem de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo obtido; a contagem cumulativa vai zerar ou baixar, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou ao fim de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para se-quências de nucleotídeo) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de contagem BLOSUM62 (veja Heni- koff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos.

[0075] O algoritmo de BLAST da mesma forma realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreria por casualidade. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucleico de teste ao ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e pre-ferivelmente menor do que cerca de 0,001.

[0076] A identidade percentual entre duas sequências de aminoá- cidos pode, da mesma forma, ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que foi incorporada no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de abertura de 12 e uma penalidade de abertura de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritimo de Needleman e Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444453, 1970) que foi incorporado no programa de GAP no pacote de software GCG (disponível no world wide web at gcg.com), ou usando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de abertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[0077] Diferente de porcentagem de identidade de sequência notada acima, outra indicação que duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídios são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reativo cruzado com os anticorpos elevados contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Desse modo, um poli- peptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo poli- peptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem-se apenas por substituições conservadoras. Outra indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas que é que as duas moléculas ou seus complementos hibridizam um ao outro sob condições estritas, como descrito abaixo. Ainda outra indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas que é que os mesmos iniciadores podem ser usados para ampliar a sequência.

[0078] O termo “inibir (ou inibe) proliferação celular dependente de Epo” refere-se à capacidade de um anticorpo anti-Epo interferir com ativação de célula (por exemplo, sinalização de célula), replicação e/ou proliferação proliferação estimulada e/ou induzida por Epo. Especificamente, “inibir” refere-se a uma diminuição estatisticamente signifi- cante (isto é, p < 0,05) em proliferação celular dependente de Epo, ou outro parâmetro (por exemplo, Sinalização de célula dependente de Epo, angiogênese), em um indivíduo seguindo contato com um anticorpo anti-Epo ou fragmento do mesmo como descrito aqui relativo a um controle. Quando aqui usado, “inibir (ou inibe) proliferação celular dependente de Epo” pode da mesma forma se referir a uma melhoria clinicamente relevante em função visual ou anatomia retinal seguindo tratamento com um anticorpo anti-Epo descrito aqui em um paciente diagnosticado com uma condição ou distúrbio associado com doença vascular retinal como descrito abaixo.

[0079] Quando aqui usado, “inibir (ou inibe) Sinalização cellular dependente de Epo” refere-se à capacidade de um anticorpo anti-Epo descrito aqui para produzir uma diminuição estatisticamente (isto é, p < 0,05) na ativação das séries de reação de sinalização intracelulares estimulada ou induzida por Epo.

[0080] O termo "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente liga-se a Epo está substancialmente livre de anticorpos que especificamente ligam-se a antígenos diferente de Epo). Um anticorpo isolado que especificamente liga-se a Epo pode, entretanto, ter reativi- dade cruzada a outros antígenos. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outros materiais e/ou químicas celulares.

[0081] O termo "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgG1 ou IgG4) que é fornecido pelos genes de região constante de cadeia pesada. Isótipo da mesma forma inclui versões modificadas de uma destas classes, onde modificações foram feitas para alterar a função de Fc, por exemplo, para realçar ou reduzir funções efetoras ou ligação a receptores de Fc. Isótipo da mesma forma refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, kappa, lambda) que é fornecida pelas regiões constantes de cadeia leve.

[0082] O termo "Kassoc" ou "Ka", quando aqui usado, é pretendido se referir à taxa de associação de uma interação de anticorpo- antígeno particular, visto que o termo "Kdis" ou "Kd," quando aqui usado, é pretendido se referir à taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. O termo "KD", quando aqui usado, é pretendido se referir à constante de dissociação, que é obtida a partir da relação de Kd a Ka (isto é Kd/Ka) e é expressado como uma concentração molar (M). Valores de KD para anticorpos pode ser determinado usando métodos bem estabelecidos na técnica. Métodos para determinar o KD de um anticorpo incluem medir ressonância de plásmon superficial usando um sistema biossensor tal como um sistema de Bi- acore®, ou medir afinidade em solução por titulação de equilíbrio de solução (SET).

[0083] Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anti corpo monoclonal” quando aqui usados referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de única composição molecular. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade por um epítopo particular.

[0084] O termo "ácido nucleico" é usado aqui alternadamente com o termo “polinucleotídeo” e refere-se a desoxiribonucleotídeos ou ribo- nucleotídeos e polímeros do mesmo na forma de filamento único ou duplo. O termo abrange ácidos nucleico conteúdo análogos de nucleo- tídeo conhecidos ou resíduos de cadeia principal modificados ou ligações, que são sintéticas, de ocorrência natural, e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação similares como o ácido nu- cleico de referência, e que são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fos- fonatos de quiral-metila, ribonucleotídeos de 2-O-metila, ácidos peptí- deo-nucleicos (PNAs).

[0085] A menos que de outra maneira indicado, uma sequência de ácido nucleico particular da mesma forma implicitamente abrange variantes conservadoramente modificadas do mesmo (por exemplo, substituições de códon degeneradas) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, como detalhado abaixo, substituições de códon degeneradas podem ser obtidas gerando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou tudos) é substituída com resíduos de base misturada e/ou desoxiinosina (Batzer e outro, Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka e outro, J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; e Rossolini e outro, Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

[0086] O termo "operavelmente ligado" refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeos (por exemplo, DNA). Tipicamente, o termo refere-se à relação funcional de uma sequência reguladora transcricional para uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou realçadora é operavel- mente ligada a uma sequência de codificação se estimula ou modula a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, sequências reguladoras transcricionais promotoras que são operavelmente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, elas são de ação cis. Entretanto, algumas sequências reguladoras transcricionais, tais como realçadoras, não necessitam ser fisicamente contíguas ou localizadas em proximidade íntima às se- quências de codificação cuja transcrição elas realçam.

[0087] Quando aqui usado, o termo, "otimizado" significa que uma sequência de nucleotídeo foi alterada para codificar uma sequência de aminoácido usando códons que são preferidos na célula de produção ou organismo, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia, uma célula de Ovário de Hamster chines (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeo otimizada é criada para reter completamente ou tanto quanto possível a sequência de aminoácido originalmente codificada pela sequência de nucleotídeo de partida, que é da mesma forma conhecida como a "sequência parental." As sequência otimizadas foram criadas para ter códons que são preferidos em células de mamífero. Entretanto, expressão otimizada destas sequências em outras células eucariótica ou células procarióti- cas é da mesma forma prevista aqui. As sequências de aminoácido codificadas por sequência de nucleotídeo otimizada são da mesma forma chamadas otimizadas.

[0088] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoáci- do. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural. A menos que de outra maneira indicado, uma sequência de polipeptídeo particular da mesma forma implicitamente abrange variantes conservadoramente modificadas do mesmo.

[0089] O termo "anticorpo humano recombinante", quando aqui usado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tal como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina hu- manos ou um hibridoma preparados disto, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo recombinante, combinatorial humano, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolve entrançando de todo ou uma porção de um gene de imunoglobulina humano, sequência para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis em que a regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certas moda-lidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequência de Ig humanos é usado, mutagênese somática in vivo) e desse modo as sequências de aminoácido das regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas de e relacionadas às sequências de VH e VL de linha germinativa humana, pode não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinativa de anticorpo humano in vivo.

[0090] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”) refere-se a uma célula em que um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deveria ser entendido que tais termos são pretendidos se referir não apenas à célula objeto particular, porém, a progênie de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula origem, porém ainda estão incluídas dentro do escopo do termo “célula hospedeira” quando aqui usado.

[0091] O termo “indivíduo” inclui animais humanos e não humanos.Animais não humanos incluem todos os vertebrados (por exemplo: mamíferos e não mamíferos) tais como, primatas não humanos (por exemplo: macaco cinomolgo), ovelha, cachorro, vaca, galinhas, anfíbios, e répteis. Exceto quando notado, os termos “paciente” ou “indivíduo” são usados aqui alternadamente. Quando aqui usados, os termos “cino” ou “cinomolgos” referem-se ao macaco cinomolgo (Macaca fas- cicularis).

[0092] Quando aqui usado, o termo “tratar" ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio (por exemplo, doença vascular retinal, retinopatia diabética, edema macular) refere-se em uma modalidade, a melhorar a doença ou distúrbio (isto é, atrasar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma). Em outra modalidade "tratar" ou "tratamento" refere- se a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo paciente. Em ainda outra modalidade, "tratar" ou "tratamento" refere-se a modular a doença ou distúrbio, fisicamente, (por exemplo, estabilização de um sintoma dis- cernível), fisiologicamente, (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. Em ainda outra modalidade, "tratar" ou "trata-mento" refere-se a prevenir ou atrasar o início ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio. “Prevenção” como refere-se a indicações descritas aqui, incluindo, condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal, condições ou distúrbios associados com retinopatia diabética, e/ou condições ou distúrbios associados com edema macular, significa qualquer ação que previne ou reduz uma agravação na função visual, anatomia de retinal, parâmetro de doença vascular retinal, parâmetro de doença de retinopatia diabética, e/ou parâmetro de doença de edema macular, como descrito abaixo, em um paciente em risco para a referida agravação. Mais especificamente, “tratamento” de condições ou distúrbios associadas com doença vascular retinal, condições ou distúrbios associados com retinopatia diabética, e/ou condições ou distúrbios associados com edema macu lar significa qualquer ação que resulta, ou é contemplado resultar, na melhoria ou preservação de função visual e/ou anatomia retinal. Métodos para avaliar tratamento e/ou prevenção de doença são conhecidos na técnica e descritos aqui abaixo.

[0093] O termo “vetor” é pretendido se referir a uma molécula de polinucleotídeo capaz de transportar outro polinucleotídeo ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo” que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, tal como um vetor viral adeno-associado (AAV, ou AAV2), em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de vetores mamíferos de replicação e episo- mais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não episomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira em introdução na célula hospedeira, e desse modo são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como “vetores de expressão re- combinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados alternadamente quando o plasmídeo está na forma mais geralmente usada de vetor. Entretanto, invenção é pretendida incluir tais outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenoviruses e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0094] Figura 1. Mostra que EPO induz dilatação de recipiente na retina central.

[0095] Figura 2. Mostra que um Fab anti-EPO neutraliza EPO em olhos de coelho.

[0096] Figura 3. Mostra que um Fab anti-EPO neutraliza EPO em olhos de coelho.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0097] A presente invenção está com base, em parte, na descoberta de moléculas de anticorpo que especificamente ligam-se a Epo. A invenção refere-se igualmente a anticorpos de formato de IgG total bem como fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, tal como fragmentos de Fab (por exemplo, veja anticorpos NVS1, NVS2, NVS3 e NVS4).

[0098] Desta maneira, a presente invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a Epo (por exemplo, Epo humano, Epo ci- nomolgo, Epo de rato, e Epo de camundongo), composições farma-cêuticas, métodos de produção, e métodos de uso de tais anticorpos e composições.

Anticorpos de Epo & Fragmentos de Ligação de Antígeno

[0099] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a Epo. Em algumas modalidades, a presente invenção for-nece anticorpos que especificamente ligam-se a Epo humano, cinomo- lgo, rato e/ou camundongo, bem como Epo humano-hiperglicosilado (darbepoietina). Anticorpos da invenção incluem, porém não são limi-tados, aos anticorpos monoclonais humanos e Fabs, isolados como descrito nos Exemplos.

[00100] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo (por exemplo, Epo de humano, ci- nomolgo, rato e/ou camundongo), em que os anticorpos compreendem um domínio de VH tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, 33, 53 ou 73. A presente invenção da mesma forma fornece anticorpos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo, em que os anticorpos compreendem um CDR de VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer um dos CDRs de VH listados na Tabela 1, infra. Em particular, a invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo (por exemplo, Epo de humano, ci- nomolgo, rato e/ou camundongo), em que os anticorpos compreendem (ou alternativamente, consistem em) um, dois, três, ou mais CDRs de VH tendo uma sequência de aminoácido de quaisquer dos CDRs de VH listados na Tabela 1, infra.

[00101] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo, os referidos anticorpos compreendendo um domínio de VL tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14, 34, 54 ou 74. A presente invenção da mesma forma fornece anticorpos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo (por exemplo, Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo), os refe-ridos anticorpos compreendendo um CDR de VL tendo uma sequência de aminoácido de quaisquer um dos CDRs de VL listados na Tabela 1, infra. Em particular, a invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo (por exemplo, Epo de humano, ci- nomolgo, rato e/ou camundongo), os referidos anticorpos compreendendo (ou alternativamente, consistindo em) um, dois, três ou mais CDRs de VL tendo uma sequência de aminoácido de quaisquer dos CDRs de VL listados na Tabela 1, infra.

[00102] Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, ainda têm pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99 por cento de identidade nas regiões de CDR com as regiões de CDR descritas nas sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modali-dades, inclui sequências de aminoácido mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões de CDR quando comparado com as regiões de CDR descritas nas sequências descritas na Tabela 1.

[00103] A presente invenção da mesma forma fornece sequências de ácido nucleico que codificam VH, VL, a cadeia pesada de tamanho natural, e a cadeia leve de tamanho natural dos anticorpos que especi-ficamente ligam-se a uma proteína de Epo (por exemplo, Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo). Tais sequência de ácido nucleico podem ser otimizadas para expressão em células de mamífero (por exemplo, Tabela 1 mostra as sequências de ácido nucleico otimizadas para a cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos da invenção).Tabela 1 Exemplos de Anticorpos de Epo, Fabs e Proteínas de Epo

[00104] Outros anticorpos da invenção incluem aqueles onde os aminoácidos ou ácidos nucleicos codificando os aminoácidos foram mutados, ainda têm pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou 95 por cento de identidade às sequências descritas na Tabela 1. Algumas modalidades incluem sequências de aminoácido mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis quando comparado com as regiões variáveis descritas nas sequências descritas na Tabela 1, enquanto retendo substancialmente a mesma atividade de ligação de antígeno.

[00105] Visto que cada um destes anticorpos pode ligar-se a Epo, VH, VL, sequências de cadeia leve de tamanho natural e cadeia pesada de tamanho natural (sequências de aminoácido e as sequências de nucleotídeo codificando as sequências de aminoácido) pode ser “mis-turada e emparelhada” para criar outros anticorpos de ligação de Epo da invenção. Tais anticorpos de ligação de Epo “misturados e empare-lhados” podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, ELISAs, e outros ensaios descritos na seção de Exemplo). Quando estas cadeias são misturadas e emparelhadas, uma sequência de VH de um pareamento de VH/VL particular deveria ser substituída com uma sequência de VH estruturalmente similar. Igualmente uma sequência de cadeia pesada de tamanho natural de um pareamento de cadeia pesada de tamanho natural particu- lar/cadeia leve de tamanho natural deveria ser substituído com uma sequência de cadeia pesada de tamanho natural estruturalmente similar. Igualmente, uma sequência de VL de um pareamento de VH/VL particular deveria ser substituído com uma sequência de VL estruturalmente similar. Igualmente uma sequência de cadeia leve de tamanho natural de um pareamento de cadeia pesada de tamanho natural particular/cadeia leve de tamanho natural deveria ser substituído com uma sequência de cadeia leve de tamanho natural estruturalmente similar. Desta maneira, em um aspecto, a invenção fornece um anticor- po isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 33, 53, e 73, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 34, 54 e 74 em que o anticorpo especificamente liga-se a Epo (por exemplo, Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo). Mais especificamente, em certos aspectos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente. Em outros aspectos específicos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 33 e 34, respectivamente. Em ainda outros aspectos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 53 e 54, respectivamente. Em ainda outros aspectos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 73 e 74, respectivamente.

[00106] Em outro aspecto, fornece a invenção (i) um anticorpo isolado tendo: uma cadeia pesada de tamanho natural compreendendo uma sequência de aminoácido que foi otimizada para expressão em uma célula de mamífero selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 15, 35, 55 e 75, e uma cadeia leve de tamanho natural compreendendo uma sequência de aminoácido que foi otimizada para expressão em uma célula de mamífero selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 36, 56, e 76; ou (ii) uma proteína fun-cional compreendendo uma porção de ligação de antígeno do mesmo. Mais especificamente, em certos aspectos, a invenção fornece um an-ticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequência de ami- noácido selecionada a partir SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente. Em outros aspectos específicos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente. Em ainda outros aspectos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir SEQ ID NOs: 55 e 56, respectivamente. Em ainda outros aspectos, a invenção fornece um anticorpo isolado ou região de ligação de antígeno do mesmo tendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequência de aminoácido selecionada a partir SEQ ID NOs: 75 e 76, respectivamente.

[00107] Os termos “região de determinação de complementaridade”, e “CDR”, quando aqui usados referem-se às sequências de ami- noácidos dentro de regiões variáveis de anticorpo que conferem especificidade de antígeno e afinidade de ligação. Em geral, há três CDRs em cada região variável de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três CDRs em cada região variável de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

[00108] Os limites de sequência de aminoácido precisos de um de-terminado CDR podem ser facilmente determinados usando quaisquer de vários esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat e outro (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5° Ed. Public Health Service, National Instituties of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração “Kabat”), Al-Lazikani e outro, (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeração “Chothia”).

[00109] Por exemplo, sob Kabat, os resíduos de aminoácido de CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) são numerados 3135 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), e 95-102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácido de CDR no domínio variável de cadeia leve (VL) são numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), e 89-97 (LCDR3). Sob Chothia os aminoácidos de CDR no VH são numerados 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), e 95-102 (HCDR3); e os resíduos de ami- noácido em VL são numerados 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2), e 9196 (LCDR3). Combinando-se as definições de CDR de Kabat e Chothia, os CDRs consistem em resíduos de aminoácido 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), e 95-102 (HCDR3) em VH humano e resíduos de aminoácido 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), e 89-97 (LCDR3) em VL humano.

[00110] Em outro aspecto, a presente invenção fornece anticorpos de ligação de Epo compreendendo a cadeia pesada e cadeia leve CDR1s, CDR2s, e CDR3s como descrito na Tabela 1, ou combinações dos mesmos. As sequências de aminoácido dos CDR1s de VH dos anticorpos são mostrados em SEQ ID NOs: 1, 21, 41 ou 61. As se-quências de aminoácido dos CDR2s de dos anticorpos e são mostradas em SEQ ID NOs: 2, 22, 42 ou 62. As sequências de aminoácido dos CDR3s de VH dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 3, 23, 43, ou 63. As sequência de aminoácido dos CDR1s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 4, 24, 44, ou 64. As sequências de aminoácido dos CDR2s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 5, 25, 45, ou 65. As sequência de aminoácido dos CDR3s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 6, 26, 46, ou 66. Estas regiões de CDR são delineadas usando o sistema de Kabat.

[00111] Alternativamente, como definido usando o sistema de Chothia (Al-Lazikani e outro, (1997) JMB 273,927-948) as sequência de aminoácido dos CDR1s de VH dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 7, 27, 47, ou 67. As sequência de aminoácido dos CDR2s de VH dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 8, 28, 48, ou 68. As sequência de aminoácido dos CDR3s de VH dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 9, 29, 49, ou 69. As sequências de aminoácido dos CDR1s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 10, 30, 50, ou 70. As sequências de aminoácido dos CDR2s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 11, 31, 51, ou 71. As sequências de aminoácido dos CDR3s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 12, 32, 52, ou 72.

[00112] Dado que cada um destes anticorpos podem ligar-se a Epo e que especificidade de ligação de antígeno é fornecida principalmente pelas regiões de CDR1, 2 e 3, as sequências de CDR1, 2 e 3 de VH e sequências de CDR1, 2 e 3 de VL, podem ser “misturadas e empare-lhadas” (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturados e emparelhados, embora cada anticorpo preferivelmente contém um CDR1, 2 e 3 de VH e um CDR 1, 2 e 3 de VL para criar outras moléculas de ligação de Epo da invenção. Tais anticorpos de ligação de Epo "misturados e emparelhados" podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica e aqueles descritos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs, FIXE, Biacore). Quando sequências de CDR de VH são misturadas e emparelhadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VH particular deveria ser substituída com uma sequência(s) de CDR similar. Igualmente, quando sequência de CDR de VL são misturadas e emparelhadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VL particular deveria ser substituída com uma sequência(s) de CDR similar. Será facilmente aparente ao técnico normalmente versado que novas sequências de VH e VL podem ser criadas substituindo-se uma ou mais sequências de regiões de CDR de VH e/ou VL com sequências estruturalmente similares das sequência de CDR mostradas aqui para anticorpos mo- noclonais da presente invenção. Além do anterior, em uma modalidade, os fragmentos de ligação de antígeno dos anticorpos descritos aqui pode compreender um CDR1, 2, e 3 de VH ou um CDR 1, 2, e 3 de VL em que o fragmento liga-se a Epo como um único domínio variável.

[00113] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos ou fra-gmentos de ligação de antígeno do mesmo podem ter as sequências de cadeia pesada e leve dos Fabs descritos na Tabela 1. Mais especi-ficamente, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ter a sequência pesada e leve de Fab NVS1, NVS2, NVS3 ou NVS4.

[00114] Em outras modalidades da invenção o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga-se a Epo compreende uma região variável de cadeia pesada CDR1, uma região variável de cadeia pesada CDR2, uma região variável de cadeia pesada CDR3, uma região variável de cadeia leve CDR1, uma região variável de cadeia leve CDR2, e uma região variável de cadeia leve CDR3 como definido por Kabat e descrito na Tabela 1. Em ainda outras modalidades da invenção o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno em que especificamente liga-se a Epo compreende uma região variável de cadeia pesada CDR1, uma região variável de cadeia pesada CDR2, uma região variável de cadeia pesada CDR3, uma região variável de cadeia leve CDR1, uma região variável de cadeia leve CDR2, e uma região variável de cadeia leve CDR3 como definido por Chothia e descrito na Tabela 1.

[00115] Em uma modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO:1; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 2; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 22; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 23; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 25; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 26. Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 41; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 42; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 43; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 44; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 45; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 46. Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 62; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 66.

[00116] Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 7; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 8; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 9; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 10; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 27; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 28; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 29; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 30; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 31; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 32. Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 47; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 48; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 49; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 50; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 51; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 52. Em outra modalidade específica, a invenção inclui um anticorpo que especificamente liga-se a Epo compreendendo uma região variável de cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 67; uma região variável de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 68; uma região variável de cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 69; uma região variável de cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 70; uma região variável de cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 71; e uma região variável de cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 72.

[00117] Em certas modalidades, a invenção inclui anticorpos ou fra- gmentos de ligação de antígeno que especificamente ligam-se a Epo como descrito na Tabela 1. Em uma modalidade preferida, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, que liga-se a Epo é Fab NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4.

[00118] Quando aqui usado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de tamanho natural que são "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de linha germinativa particular se as regiões variáveis ou cadeias de tamanho natural do anticorpo são obtidas a partir de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linha germinativa humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico transportando genes de imunoglobulina humanos com o antígeno de interesse ou avaliar uma biblioteca de gene de imunoglobulina humano exibido em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana pode ser identificada como tal comparando- se a sequência de aminoácido do anticorpo humano às sequências de aminoácido de imunoglobulinas de linha germinativa humana e selecionando-se a sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana que é íntima em sequência (isto é, maior % de identidade) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linha ger- minativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido quando comparado à sequência de linha germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutações sítio-dirigidas. Entretanto, nas regiões de estrutura de VH ou VL, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácidos para uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que iden- tificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado às sequências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequência de linha germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico em sequência de aminoácido à sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germi- nativa. Tipicamente, um anticorpo humano recombinante exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa humana nas regiões de estrutura de VH ou VL. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5, ou ainda não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa. Exemplos de genes de imunoglobulina de linha germinativa humana incluem, porém não são limitados aos fragmentos de linha germinativa de domínio variável descritos abaixo, bem como DP47 e DPK9.

Anticorpos homólogos

[00119] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo sequências de aminoácido que são homólogas às se-quências descritas na Tabela 1, e o anticorpo liga-se a uma proteína de Epo (por exemplo, Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo), e retém as propriedades funcionais desejadas daqueles anticorpos descritos na Tabela 1.

[00120] Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno funcional do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ami- noácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 33, 53, e 73; o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 34, 54, e 74; e o anticorpo especificamente liga-se a Epo (por exemplo, Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo). Em certos aspectos da invenção as sequências de cadeia pesada e leve também compreendem sequências de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, e LCDR3 como definido por Kabat, por exemplo SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, e 6, respectivamente; SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25, e 26, respectivamente; SEQ ID NOs: 41, 42, 43, 44, 45, e 46, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 64, 65, e 66, respectivamente. Em certos outros aspectos da invenção as sequências de cadeia pesada e leve também comprendem sequências de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, e LCDR3 como definido por Chothia, por exemplo SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, e 12, respectivamente; SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31, e 32, respectivamente; SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 50, 51, e 52, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 67, 68, 69, 70, 71, e 72, respectivamente.

[00121] Em outras modalidades, as sequências de aminoácido de VH e/ou VL podem ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências mencionadas na Tabela 1. Em outras modali-dades, as sequências de aminoácido de VH e/ou VL podem ser idênticas com exceto para uma substituição de aminoácido em não mais do que 1,2,3,4 ou 5 posições de aminoácido. Um anticorpo tendo regiões de VH e VL tendo identidade alta (isto é, 80% ou maior) às regiões de VH e VL daquelas descritas na Tabela 1 pode ser obtida por mutagê- nese (por exemplo, sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando SEQ ID NOs: 13, 33, 53 ou 73 e SEQ ID NOs: 14, 34, 54, ou 74, respectivamente, seguido por teste do anticorpo alterado codificado para função retida usando os ensaios funcionais descritos aqui.

[00122] Em outras modalidades, sequências de aminoácido de cadeia pesada de tamanho natural e/ou cadeia leve de tamanho natural podem ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências mencionadas na Tabela 1. Um anticorpo tendo uma cadeia pesada de tamanho natural e cadeia leve de tamanho natural tendo identidade alta (isto é, 80% ou maior) às cadeias pesadas de tamanho natural de qualquer de SEQ ID NOs: 15, 35, 55, ou 75, e cadeias leves de tamanho natural de qualquer de SEQ ID NOs: 16, 36, 56, ou 76, podem ser obtidas por mutagênese (por exemplo, mutagênse sítio- dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando tais polipeptídios, seguido por teste do anticorpo alterado codificado para função retida usando os ensaios funcionais descritos aqui.

[00123] Em outras modalidades, as sequências de nucleotídeo de cadeia pesada de tamanho natural e/ou cadeia leve de tamanho natural podem ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências mencionadas na Tabela 1.

[00124] Em outras modalidades, as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou as regiões variáveis de sequências de nucleotídeo de cadeia leve podem ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências mencionadas na Tabela 1.

[00125] Quando aqui usado, a identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas comparti-lhadas pelas sequências (isto é, % de identidade iguala número de po-sições idênticas/número total de posições x 100), levando em conta o número de aberturas, e o comprimento de cada abertura, que necessita ser introduzido para alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de identidade percentual entre duas sequências podem ser realizada usando um algoritmo ma-temático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.

[00126] Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de proteína da presente invenção podem ser também usadas como uma “sequência em questão” para realizar uma procura contra bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Por exemplo, tal procura pode ser realizada usando o programa de BLAST (versão 2.0) de Altschul, e outro, 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10.

Anticorpos com Modificações Conservadoras

[00127] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção tem uma região variável de cadeia pesada sequências de compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destas sequências de CDR tem sequências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos descritos aqui ou modificações conservadoras dos mesmos, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de ligação de Epo da invenção. Desta maneira, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo de uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que: as sequência de aminoácido de CDR1 de região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 21, 41, e 61, e modificações conservadoras do mesmo; as sequências de ami- noácido de CDR2 de região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 22, 42 e 62, e modificações conservadoras do mesmo; as sequências de aminoácido de CDR3 de região variável de cadeia pesada são selecionadas a par- tir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 23, 43, e 63, e modificações conservadoras do mesmo; as sequência de aminoácido de CDR1 de regiões variáveis de cadeia leve são selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 24, 44 e 64, e modificações conserva-doras do mesmo; as sequências de aminoácido de CDR2 de regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 25, 45 e 65, e modificações conservadoras do mesmo; as sequências de aminoácido de CDR3 de regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas de a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 26, 46, e 66, e modificações conservadoras do mesmo; e o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo es-pecificamente liga-se a Epo.

[00128] Em outras modalidades, o anticorpo da invenção é otimizado para expressão em uma célula de mamífero e tem uma sequência de cadeia pesada de tamanho natural e uma sequência de cadeia leve de tamanho natural, em que uma ou mais destas sequências tem sequências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos descritos aqui ou modificações conservadoras do mesmo, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de ligação de Epo da invenção. Desta maneira, a invenção fornece um anticorpo isolado otimizado para expressão em uma célula de mamífero que consiste em uma cadeia pesada de tamanho natural e uma cadeia leve de tamanho natural em que a cadeia pesada de tamanho natural tem sequências de aminoácido selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NOs: 15, 35, 55 e 75, e modificações conservadoras do mesmo; e a cadeia leve de tamanho natural tem sequências de aminoáci- do selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NOs: 16, 36, 56, e 76, e modificações conservadoras do mesmo; e o anticorpo especificamente liga-se a Epo (por exemplo, Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo).

Anticorpos Que Ligam-se ao Mesmo Epítopo

[00129] A presente invenção fornece anticorpos que ligam-se ao mesmo epítopo como o anticorpos de ligação de Epo descritos na Tabela 1. Anticorpos adicionais podem, portanto, ser identificados com base em sua capacidade competir (por exemplo, para competitivamente inibie a ligação de, de uma maneira estatisticamente significante) com outros anticorpos da invenção em ensaios de ligação de Epo (tal como aqueles descritos nos Exemplos). A capacidade de um anticorpo de teste inibir a ligação de anticorpos da presente invenção em uma proteína de Epo demonstra que o anticorpo de teste pode competir com aquele anticorpo para ligar-se a Epo; um tal anticorpo pode, de acordo com teoria não limitante, ligar o mesmo ou um epítopo relacionado (por exemplo, um estruturalmente similar ou espcialmente proximal) na proteína de Epo como o anticorpo com que compete. Em uma certa modalidade, o anticorpo que liga-se ao mesmo epítopo em Epo como os anticorpos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como descrito aqui. Quando aqui usado, um anticorpo “compete” para ligação quando o anticorpo de competição inibe ligação de Epo de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção por mais do que 50%, na presença de uma concentração equimolar de anticorpo de competição.

[00130] Em outras modalidades os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da invenção ligam-se a domínio de Helix D de Epo (aminoácidos 138-162 da proteína de Epo; SEQ ID NO: 88). Em outras modalidades os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da invenção ligam a Helix A (aminoácidos 4-26 da proteína de Epo; SEQ ID NO: 86) e Alça A-B de Epo (aminoácidos 27-55 da proteína de Epo; SEQ ID NO: 89).

[00131] Em outras modalidades os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno da invenção ligam ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88). Em outras modalidades, os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de an- tígeno ligam-se a domínio de Alça A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89). Em outras modalidades os anticorpos iso-lados, ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se a domínio de Alça A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89) e Helix A (aminoácidos 4-26 de Epo Humano; SEQ ID NO: 86). Em ainda outras modalidades os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88), e ao domínio de Alça A-B (aminoá- cidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89). Em outras modalidades os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se ao domínio D Helix de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo Humano; SEQ ID NO: 88), a domínio de Alça A-B (aminoácidos 27-55 de Epo Humano; SEQ ID NO: 89) e Helix A (aminoácidos 4-26 de Epo Humano; SEQ ID NO: 86).

[00132] Em outros aspectos da invenção os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se a um epítopo compreen-dendo aminoácidos nas posições, 44-50, 52, 53, 147, 150, 151, 154, 155, 159, e 162 de Epo Humano (SEQ ID NO.81). Em outros aspectos da invenção os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antí- geno ligam-se a um epítopo compreendendo aminoácidos nas posições 9, 13, 44-53, 147, 150, 151, 154, 155, 158, 159, e 162 de Epo Humano (SEQ ID NO.81). Em outros aspectos da invenção os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se a um epí- topo compreendendo aminoácidos nas posições 23, 43-50, 52, 53, 131, 143, 147, 150, 151, 154, 155, 159, e 162 de Epo Humano (SEQ ID NO.81). Em aspectos particulares da invenção os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se a um epítopo com- preendendo aminoácidos Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (nas posições 44-50), Lys-Arg (nas posições 52-53), Asn (na posição 147), Arg-Gly (nas posições 150-151), Lys-Leu (nas posições 154-155), Glu (na posição 159), e Arg (na posição 162) de Epo Humano (SEQ ID NO.81). Em outros aspectos particulares da invenção os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se a um epítopo compreendendo aminoácidos Ser (na posição 9), Glu (na posição 13), Thr-Lys- Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (nas posições 44-50), Lys-Arg (nas posições 5253), Asn (na posição 147), Arg-Gly (nas posições 150-151), Lys-Leu (nas posições 154-155), Gly (na posição 158), Glu (na posição 159), e Arg (na posição 162) de Epo Humano (SEQ ID NO.81). Em ainda outros aspectos da invenção os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno ligam-se a um epítopo compreendendo aminoáci- dos Glu (nas posições 23), Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (nas posições 43-50), Lys-Arg (nas posições 52-53), Arg (na posição 131), Arg (na posição 143), Asn (na posição 147), Arg-Gly (nas posições 150151), Lys-Leu (nas posições 154-155), Glu (na posição 159), e Arg (na posição 162) de Epo Humano (SEQ ID NO.81).

[00133] A invenção da mesma forma inclui um epítopo conformaci- onal em Epo humano, o epítopo compreendendo resíduos de aminoá- cido Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, e Arg162, em que um anticorpo que liga-se ao epítopo inibirá ligação de Epo ao receptor de Epo. É da mesma forma contemplado que um anticorpo que liga-se ao epítopo da invenção também inibirá proliferação celular dependente de Epo.

[00134] A invenção também inclui um epítopo conformacional em Epo humano, o epítopo compreendendo resíduos de aminoácido Ser9, Glu13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159, e Arg162, em que um anticorpo que liga-se ao epítopo inibirá ligação de Epo ao receptor de Epo. É da mesma forma contemplado que um anti-corpo que liga-se ao epítopo da invenção também inibirá proliferação celular dependente de Epo.

[00135] A presente invenção ainda também inclui um epítopo con- formacional em Epo humano, o epítopo compreendendo resíduos de aminoácido Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151,Lys154, Leu155, Glu159, e Arg162, em que um anticorpo que liga-se ao epítopo inibirá ligação de Epo ao receptor de Epo. É da mesma forma contemplado que um anticorpo que liga-se ao epítopo da invenção também inibirá proliferação celular dependente de Epo.

Anticorpos Criados e Modificados

[00136] Um anticorpo da invenção também pode ser preparado usando um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de VH e/ou VL mostradas aqui como material de partida para criar um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser criado modificando-se um ou mais resíduos com uma ou ambas regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser criado modificando-se resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo para alterar a fun- ção(ões) efetora(s) do anticorpo.

[00137] Um tipo de região variável criando aquela que pode ser realizada é enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos alvos predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão lo-calizados nas seis regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de ami- noácido dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individu- ais do que sequências fora de CDRs. Porque sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as proprie-dades de anticorpos de ocorrência natural específicos construindo ve-tores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado nas sequências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja, por exemplo, Riechmann, L., e outro, 1998 Nature 332:323-327; Jones, P., e outro, 1986 Nature 321:522-525; Queen, C., e outro, 1989 Proc. Natl. Acad., USA 86:10029-10033; Patente U.S. No. 5,225,539 para Winter, e Patente U.S. No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 para Queen e outro)

[00138] Desta maneira, outra modalidade da invenção pertence a um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoáci- do selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 21, 41, e 61; sequência de CDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 22, 42, e 62; sequência de CDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 23, 43 e 63, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve tendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 24, 44 e 64; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 25, 45, e 65; e sequências de CDR3 consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 26, 46, e 66, respectivamente. Desse modo, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL de anticorpos monoclonais, ainda pode conter sequências de estrutura diferentes destes anticorpos.

[00139] Alternativamente, outra modalidade da invenção pertence a um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoáci- do selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7, 27, 47, e 67; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 28, 48, e 68; sequências de CDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 29, 49, e 69, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve tendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 30, 50, e 70; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 11, 31, 51, e 71; e sequências de CDR3 consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 32, 52, e 72, respectivamente. Desse modo, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL de anticorpos monoclonais, ainda pode conter sequências de estrutura diferentes destes anticorpos.

[00140] Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de gene de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linha germinativa para genes de região variável de cadeia pesada e leve humanos podem ser encontrados no banco de dados de sequência de linha germinativa humana "VBa- se" (disponível na word wide web at mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., e outro, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., e outro, 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J., P. L. e outro, 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836; os teores dos quais são expressamente incorpo-rados aqui por referência.

[00141] Um exemplo de sequências de estrutura para uso nos anticorpos da invenção é aquele que são estruturalmente similares às sequências de estrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, sequências de consenso e/ou sequências de estrutura usadas por anticorpos monoclonais da invenção. As sequências de CDR1, 2 e 3 de VH, e as sequências de CDR1, 2 e 3 de VL, podem ser enxertadas sobre regiões de estrutura que têm a sequência idêntica como aquelas encontradas no gene de imunoglobulina de linha germinativa do qual a sequência de estrutura deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas sobre regiões de estrutura que contêm uma ou mais mutações quando comparadas às sequências de linha germinativa. Por exemplo, foi constatado que em certos exemplos é benéfico para mutar resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ou realçar a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo (veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 para Queen e outro). Estruturas que podem ser utilizadas como sustentações em que para construir os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui incluem, porém não são limitados a VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2, e Vk2. Estruturas adicionais são conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados de vBase no world wide web at vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/index.php? & MMN_position=1:1.

[00142] Desta maneira, uma modalidade da invenção refere-se a anticorpos de ligação de Epo isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 33, 53, e 73, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco subs-tituições de aminoácido, deleções ou adições na região de estrutura de tais sequências, e também compreendendo uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 34, 54, e 74, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições na região de estrutura de tais sequências.

[00143] Outro tipo de modificação de região variável é mutar resíduos de aminoácido dentro das regiões de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para desse modo melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido como “maturação de afinidade”. Mutagênese sítio-dirigido ou mu- tagênse mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mu- tação(ões) e o efeito em ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo como descrito aqui e fornecido nos Exemplos. Modificações conservadoras (como discutido acima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições de aminoácido, adições ou deleções. Além disso, tipicamente não mais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região de CDR são alterados.

[00144] Desta maneira, em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos de ligação de Epo isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, consistindo em uma região variável de cadeia pe-sada tendo uma região de CDR1 de VH consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo tendo SEQ ID NOs: 1, 21, 41, e 61 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 1, 21, 41, ou 61; uma região de CDR2 de VH tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 22, 42, e 62 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 2, 22, 42, ou 62; uma região de CDR3 de VH tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 23, 43, e 63, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 3, 23, 43, ou 63; uma região de CDR1 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 24, 44, e 64, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 4, 24, 44, ou 64; uma região de CDR2 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 25, 45, e 65, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, dele- ções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 5, 25, 45, ou 65; e uma região de CDR3 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 26, 46, e 66, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 6, 26, 46, ou 66.

[00145] Desta maneira, em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos de ligação de Epo isolados, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, consistindo em uma região variável de cadeia pe-sada tendo uma região de CDR1 de VH consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo tendo SEQ ID NOs: 7, 27, 47, e 67 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs:7, 27, 47, ou 67; uma região de CDR2 de VH tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 28, 48, e 68 ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 8, 28, 48, ou 68; uma região de CDR3 de VH tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 29, 49, e 69, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 9, 29, 49, ou 69; uma região de CDR1 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 30, 50, e 70, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 10, 30 50, ou 70; uma região de CDR2 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 11, 31, 51, e 71, ou uma sequência de aminoáci- do tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 11, 31, 51, ou 71; e uma região de CDR3 de VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 32, 52, e 72, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, deleções ou adições quando comparado a SEQ ID NOs: 12, 32, 52, ou 72.

Enxertar Domínios de ligação de Antígeno Em Estruturas Alterna-tivas ou Sustentações

[00146] Uma ampla variedade de estruturas de anticor- po/imunoglobulina ou sustentações podem ser empregadas contanto que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que especificamente liga-se a Epo. Tais estruturas ou sustentações incluem os 5 idiótipos principal de imunoglobulinas humanas, ou frag- mentos do mesmo, e inclui imunoglobulinas de outras espécies animais, depois de ter humanizado aspectos. Anticorpos de cadeia pesada simples tal como aqueles identificados em camelídeos são de interesse particular nesta consideração. Novas estruturas, sustentações e fragmentos continuam a ser descritas e desenvolvidas por aqueles versados na técnica.

[00147] Em um aspecto, a invenção pertence a gerar anticorpos com base em não imunoglobulina usando sustentações de não imuno- globulina em que CDRs da invenção podem ser enxertados. Estruturas e sustentações de não imunoglobulina conhecidas e futuras podem ser empregadas, contanto que elas compreendam uma região de ligação específica para a proteína de Epo alvo. Estruturas ou sustentações de não imunoglobulina conhecidas incluem, porém não são limitadas a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurique, Switzerland), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, e Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), imuno- farmacêuticos modulares pequenos (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Sweden), e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany).

[00148] As sustentações de fibronectina estão com base em domínio de fibronectina tipo III (por exemplo, o décimo módulo do fibronec- tina tipo III (domínio de 10 Fn3)). O domínio de fibronectina tipo III tem 7 ou 8 filamentos betas que são distribuídos entre duas folhas betas, que se empacotam um contra o outro para formar o núcleo da proteína, e também contendo alças (análogos a CDRs) que conectam os filamentos beta um ao outro e são expostos a solvente. Há pelo menos três tais alças em cada extremidade do sanduíche de folha beta, onde a extremidade é o limite da proteína perpendicular para a direção dos filamentos beta (veja US 6,818,418). Estas sustentações com base em fibronectina não são uma imunoglobulina, embora a dobra total esteja intimamente relacionada aquela do fragmento de anticorpo funcional menor, a região variável da cadeia pesada, que compreende a unidade de reconhecimento de antígeno inteira em IgG de camelo e lhama. Por causa desta estrutura, o anticorpo de não imunoglobulina imita propriedades de ligação de antígeno que são similares em natureza e afinidade para aqueles de anticorpos. Estas sustentações podem ser usadas em um aleatorização de alça e estratégia de embaralhamento in vitro que é similar ao processo de maturação de afinidade de anticorpos in vivo. Estas moléculas com base em fibronectina podem ser usadas como sustentações onde as regiões de alça da molécula podem ser substituídas com CDRs da invenção usando técnicas de clonagem padrões.

[00149] A tecnologia de anquirina está com base em usar proteínas com módulos repetidos derivados de anquirina como sustentações para sustentar regiões variáveis que podem ser usadas para ligação a alvos diferentes. O módulo repetido de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos consistindo em duas α-helices anti-paralelo e um β- volta. Ligação das regiões variáveis é principalmente otimizada usando-se exibição de ribossoma.

[00150] Avímeros são derivados de proteína contendo domínio A natural tal como LRP-1. Estes domínios são usados por natureza para interações de proteína-proteína e em humano mais de 250 proteínas estão estruturalmente com base em domínios A. Avímeros consistem em vários monômeros de “domínio A” diferentes (2-10) ligados por meio de ligantes de aminoácido. Avímeros podem ser criados que podem ligar-se ao antígeno alvo usando a metodologia descrita em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. Nos. 20040175756; 20050053973; 20050048512; e 20060008844.

[00151] Ligantes de afinidade de aficorpo são proteínas pequenas, simples compostas de um pacote de três hélices com base na susten-tação de um dos domínios de ligação de IgG da Proteína A. Proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio de sustentação consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são aleatorizados para gerar bibliotecas de aficorpos com um número grande de variantes de ligante (Veja, por exemplo, US 5,831,012). Moléculas de aficorpo imitam anticorpos, eles têm um peso molecular de 6 kDa, comparado ao peso molecular de anticorpos, que é 150 kDa. Apesar de seu tamanho pequeno, o sítio de ligação de moléculas de aficorpo é similar aquele de um anticorpo.

[00152] Anticalinas são produtos desenvolvidos pela companhia Pieris ProteoLab AG. Eles são derivados de lipocalinas, um grupo difundido de proteínas pequenas e robustas que estão normalmente envolvidas no transporte fisiológico ou armazenamento de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líquidos corporais. A arquitetura de proteína é rememorativo de imunoglobulinas, com alças hipervariáveis no topo de uma estrutura rígida. Entretanto, em contraste com anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, lipocalinas são compostas de uma cadeia de polipeptídeo simples com 160 a 180 resíduos de aminoáci- do, sendo apenas marginalmente maior do que um único domínio de imunoglobulina. O grupo de quatro alças, que compõem a cavidade de ligação, mostra plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias laterais. O sítio de ligação pode desse modo ser reformado em um processo proprietário para reconhecer moléculas alvo prescritas de forma diferente com alta afinidade e especificidade. Uma proteína da família de lipocalina, a proteína de ligação de bilina (BBP) de Pieris brassicae foi usada para desenvolver anticalinas mutageni- zando-se o grupo de quatro alças. Um exemplo de um pedido de pa- tente descrevendo anticalinas está em Publicação PCT No. WO 1999/16873.

[00153] Moléculas de afilina são proteínas de não imunoglobulina pequenas que são designadas para afinidades específicas para proteínas e moléculas pequenas. Novas moléculas de afilina podem ser muito rapidamente selecionadas a partir de duas bibliotecas, cada qual está com base em uma proteína de sustentação derivada de humano diferente. Moléculas de afilina não mostram homologia estrutural a pro-teínas de imunoglobulina. Atualmente, duas sustentações de afilina são empregadas, uma da qual é gama cristalina, uma proteína de lente de olho estrutural humana e a outra é proteínas de superfamília de "ubiquitina". Ambas as sustentações humanos são muito pequenas, mostram estabilidade de temperatura alta e são quase resistentes a mudanças de pH e agentes de desnaturação. Esta estabilidade alta é principalmente devido à estrutura de folha beta expandida das proteínas. Exemplos de proteínas gama cristalinas derivadas são descritos em WO 2001/04144 e exemplos de proteínas "semelhantes a ubiquiti- na" em WO 2004/106368.

[00154] Miméticos de epítopo de proteína (PEM) são moléculas de tamanho médio, cíclicas, semelhantes a peptídeo (MW 1-2kDa) imitando estruturas secundárias de grampo de cabelo beta de proteínas, a estrutura secundária principal envolvida em interações de proteína- proteína.

[00155] A presente invenção fornece anticorpos completamente humanos que especificamente ligam-se a uma proteína de Epo. Comparado aos anticorpos quiméricos ou humanizados, os anticorpos de ligação de Epo humanos da invenção têm antigenicidade também reduzida quando administrados a indivíduos humanos.

Anticorpos de Camelídeo

[00156] Proteínas de anticorpo obtidas de membros da família de camelo e dromedário (Camelus bactrianus e Camelus dromaderius) incluindo novos membros mundiais tal como espécies de lhama (Lama pacos, Lama glama e Lama vicugna) foram caracterizadas com respeito a tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos de IgG desta família de mamíferos como encontrados na natureza necessita de cadeias leves, e são desse modo estruturalmente distintas da estrutura quaternária de quatro cadeias típicas tendo duas cadeias pesadas e duas leves, para anticorpos de outros animais. Veja PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicado em 3 de março de 1994).

[00157] Uma região do anticorpo de camelídeo que é o domínio variável pequeno simples identificado como VHH pode ser obtida por engenharia genética para produzir uma proteína pequena tendo afinidade alta para um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de baixo peso molecular conhecida como um “nanocorpo de camelídeo.” Veja patente U.S. número 5,759,808 depositada em 2 de junho de 1998; veja da mesma forma Stijlemans, B., e outro, 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M., e outro, 2003 Nature 424: 783788; Pleschberger, M., e outro 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V., e outro 2002 Int J Cancer 89: 456-62; e Lauwe- reys, M., e outro 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Bibliotecas criadas de anticorpos de camelídeo e fragmentos de anticorpo estão comercialmente disponíveis, por exemplo, de Ablynx, Ghent, Belgium. Como com outros anticorpos de origem não humano, uma sequência de ami- noácido de um anticorpo de camelídeo pode ser alterada recombinan- temente para obter uma sequência que mais intimamente se assemelha a uma sequência humana, isto é, o nanocorpo pode ser “humanizado.” Desse modo a antigenicidade baixa natural de anticorpos de camelídeo para humanos pode ser também reduzida.

[00158] O nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular aproxi- madamente um-décimo daquele de uma molécula de IgG humana, e a proteína tem um diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma consequência do tamanho pequeno é a capacidade de nanocorpos de camelídeo ligar-se a sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis a proteínas de anticorpo maiores, isto é, nanocorpos de camelídeo são úteis como antígenos de detecção de reagentes que são de outra maneira ocultas usando técnicas imunológicas clássicas, e quando possível agentes terapêuticos. Desse modo ainda outra consequência de tamanho pequeno é que um nanocorpo de camelídeo podem inibir como um resultado de ligação a um sítio específico em uma fenda de ranhura ou estreita de uma proteína alvo, e consequentemente pode servir em uma capacidade que mais intimamente se assemelha à função de um fármaco de peso molecular baixo clássico do que o de um anticorpo clássico.

[00159] O baixo peso molecular e tamanho compacto também resulta em nanocorpos de camelídeo sendo extremamente termoestável, estável em pH extremo e para digestão proteolítica, e pobremente an- tigênico. Outra consequência é que nanocorpos de camelídeo facilmente passam do sistema circulatório para tecidos, e ainda cruzam a barreira hematoencefálica e pode tratar distúrbios que afetam tecido nervoso. Nanocorpos podem também facilitar transporte de fármaco através da barreira hematoencefálica. Veja pedido de patente U.S. 20040161738 depositada em 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas com a baixa antigenicidade a humanos indicam grande potencial terapêutico. Além disso, estas moléculas podem ser completamente expressadas em células procarióticas tal como E. coli e são expressados como proteínas de fusão com bacteriófago e são funcionais.

[00160] Desta maneira, uma característica da presente invenção é um anticorpo de camelídeo ou nanocorpo tendo afinidade alta por Epo. Em certas modalidades aqui, o anticorpo de camelídeo ou nanocorpo é naturalmente produzido no animal de camelídeo, isto é, é produzido pelo camelídeo seguindo imunização com Epo ou um fragmento de peptídeo do mesmo, usando técnicas descritas aqui para outros anticorpos. Alternativamente, o nanocorpo de camelídeo de ligação de Epo é criado, isto é, produzido por seleção, por exemplo a partir de uma biblioteca de fago exibindo proteínas de nanocorpo de camelídeo adequadamente mutagenizadas usando procedimentos de panicula- ção com Epo como um alvo como descrito nos exemplos aqui. Nano- corpos criados podem também ser personalizados por engenharia genética para ter uma meia-vida em um indivíduo de recipiente de 45 minutos a duas semanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo de camelídeo ou nanocorpo é obtido enxertando-se as sequências de CDRs da cadeia pesada ou leve dos anticorpos humanos da invenção em nanocorpo ou sequências de estrutura de anticorpo de domínio simples, como descrito, por exemplo em WO 1994/004678.

Moléculas Biespecíficas e Anticorpos Multivalentes

[00161] Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas e multiespecíficas compreendendo um anticorpo de ligação de Epo, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou regiões de ligação de antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que liga-se a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. O anticorpo da invenção pode de fato ser derivatizado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multi-específicas que ligam-se a mais do que dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas multi-específicas são da mesma forma pretendidas ser abrangidas pelo termo “molécula biespecífica” quando aqui usado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um an-ticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação noncovalente ou de outra maneira) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, tal que resulta em uma molécula biespecífica.

[00162] Desta maneira, a presente invenção inclui moléculas bies- pecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação a Epo e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Por exemplo, o segundo epítopo alvo é outro epí- topo de Epo diferente do primeiro epítopo alvo.

[00163] Adicionalmente, para a invenção em que a molécula bies- pecífica é multiespecífica, a molécula pode também incluir uma terceira especificidade de ligação, além do primeiro e segundo epítopo alvo.

[00164] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab, F(ab’)2, Fv, ou uma cadeia simples Fv. O anti-corpo pode da mesma forma ser uma cadeia leve ou dímero de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo tal como um Fv ou um construtor de cadeia simples como descrito em Ladner e outro Patente U.S. No. 4,946,778.

[00165] Diacorpos são moléculas bivalentes, biespecífica em que domínios de VH e VL são expressados em uma cadeia de polipeptídeo simples, conectadas por um ligante que é muito curto para permitir para emparelhar entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios de VH e VL emparelham com domínios complementares de outra cadeia, desse modo criando dois sítios de ligação de antígeno (veja por exemplo, Holliger e outro, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448; Poljak e outro, 1994 Structure 2:1121-1123). Diacorpos podem ser produzidos expressando-se duas cadeias de polipeptídeo com a estrutura VHA-VLB e VHB-VLA (configuração de VH-VL), ou VLA-VHB e VLB-VHA (configuração de VL-VH) dentro da mesma célula. A maioria deles pode ser expressado na forma solúvel em bactérias. Diacor- pos de cadeia simples (scDb) são produzidos conectando-se as duas cadeias de polipeptídeo de formação de diacorpo com ligante de apro-ximadamente 15 resíduos de aminoácido (veja Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu e outro, 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). scDb pode ser expressado em bactérias na dorma monomérica solúvel, ativa (veja Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu e outro, 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun e Pack, 1997 Immuno-technology, 3(2): 83-105; Ridgway e outro, 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Um diacorpo pode ser fundido a Fc para gerar um “di- diacorpo” (veja Lu e outro, 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).

[00166] Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecífica da invenção são anticorpos de murino, quiméricos e humanizados.

[00167] Moléculas biespecíficas podem ser preparadas conjugando- se as especificidades de ligação constituintes, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e em seguida conjugada uma a outra. Quando as especificidades de ligação forem proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação pode ser usada por conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-sucinimidil- S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-sucinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e 4-(N-maleimidometil)cicloaxano-l-carboxilato de sulfossuci- nimidila (sulfo-SMCC) (veja por exemplo, Karpovsky e outro, 1984 J.Exp. Med. 160:1686; Liu, MA e outro, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan e outro, 1985 Science 229:81-83), e Glennie e outro, 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de acoplamento são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis a partir de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[00168] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados por ligação de sulfidrila das regiões de articulação de C-terminal das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo um, antes da conjugação.

[00169] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e reunidas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab )2 ou ligante x Fab proteína de fusão. Uma molécula biespecífica da inven- ção pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo em Patente U.S. Número 5,260,203; Patente U.S. Número 5,455,030; Patente U.S. Número 4,881,175; Patente U.S. Número 5,132,405; Patente U.S. Número 5,091,513; Patente U.S. Número 5,476,786; Patente U.S. Número 5,013,653; Patente U.S. Número 5,258,498; e Patente U.S. Número 5,482,858.

[00170] Ligação das moléculas biespecíficas em seus alvos específicos podem ser confirmados por, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (ERA), análise de FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio de Mancha do Oeste. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular empregando-se um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

[00171] Em outro aspecto, a presente invenção fornece compostos multivalentes compreendendo pelo menos duas porções de ligação de antígeno idênticas ou diferentes dos anticorpos da invenção que ligam- se a Epo. As porções de ligação de antígeno podem ser ligadas juntas por fusão de proteína ou ligação covalente ou não covalente. Alternativamente, métodos de ligação foram descritos para as moléculas bies- pecíficas. Compostos tetravalentes podem ser obtidos por exemplo reticulando-se anticorpos dos anticorpos da invenção com um anticorpo que liga-se às regiões constantes dos anticorpos da invenção, por exemplo a região de Fc ou articulação.

[00172] Domínio de trimerização é descrito por exemplo em Borean patente EP 1 012 280B1. Módulos de pentamerização são descritos, por exemplo em WO 1998/018943.

Anticorpos com Meia Vida Estendida

[00173] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente ligam-se a proteína de Epo tendo uma meia-vida estendida in vivo.

[00174] Muitos fatores podem afetar a meia-vida de uma proteína in vivo, por exemplo, filtração renal, metabolismo no fígado, degradação por enzimas proteolíticas (protease), e respostas imunogênicas (por exemplo, neutralização de proteína por anticorpos e captação por ma- crófagos e células dendríticas). Uma variedade de estratégias pode ser usada para estender a meia-vida dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, por ligação química a polietilenoglicol (PEG), reCODE PEG, sustentação de anticorpo, ácido polissiálico (PSA), amido de hidroxietila (HES), ligantes de ligação de albumina, e prote- ções de carboidrato; por fusão genética a ligação de proteínas a proteínas de soro, tal como albumina, IgG, FcRn, e transferindo; acoplando- se (geneticamente ou quimicamente) a outras porções de ligação que ligam-se a proteínas de soro, tal como nanocorpos, Fabs, DARPins, avímeros, aficorpos, e anticalinas; por fusão genética a rPEG, albumina, domínio de albumina, proteínas de ligação de albumina, e Fc; ou por incorporação em nano transportadores, formulações de liberação lenta, ou dispositivos médicos.

[00175] Para prolongar a circulação de soro de anticorpos in vivo, moléculas de polímero inertes tal como polietileno glicol de peso molecular alto (PEG) podem ser ligadas aos anticorpos ou um fragmento do mesmo com ou sem um ligante multifuncional através da conjugação sítio-específica do PEG ao N- ou C-terminal dos anticorpos ou por meio de grupos epsilo-amino presentes em resíduos de lisina. Para pegilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmenta do mesmo, é tipicamente reagido com PEG, tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG tornam-se ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A pegilação podem ser realizada por uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Quando aqui usado, os termos “polietileno glicol” e “PEG” são pretendidos abranger quaisquer das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcóxi - ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol- maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser pegilado é um anticorpo aglicosilado. Derivatização de polímero linear ou ramificado que resulta em perda mínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação pode ser intimamente monitorado por SDS-PAGE e espectrometria de massa para garantir a própria conjugação de moléculas de PEG aos anticorpos. PEG não reagido pode ser separado dos conjugados de anticorpo-PEG por exclusão de tamanho ou por cromatografia de troca iônica. Anticorpos derivatizados por PEG podem ser testados por atividade de ligação bem como para eficácia in vivo usando métodos bem conhecidos aqueles de experiência na técnica, por exemplo, por imunoensaios descritos aqui. Métodos para pe- gilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Veja por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura e outro e EP 0 401 384 por Ishikawa e outros.

[00176] Outras tecnologias de pegilação modificadas incluem reconstituir quimicamente tecnologia de engenharia dirigida ortogonal (ReCODE PEG), que incorpora cadeias laterais quimicamente especificadas em proteínas biossintéticas por um sistema reconstituído que inclui tRNA sintetase e tRNA. Esta tecnologia permite incorporação de mais do que 30 novos aminoácidos em proteínas biossintéticas em E. coli, levedura, e células de mamífero. O tRNA incorpora um aminoáci- do não nativo qualquer lugar que um códon ambarino é posicionado, convertendo o âmbar de um códon de parada a um que incorporação de sinais do aminoácido quimicamente especificado.

[00177] Tecnologia de pegilação recombinante (rPEG) pode da mesma forma ser usada para extensão de meia-vida de soro. Esta tecnologia envolve geneticamente fundir uma cauda de proteína não estruturada de 300 a 600 aminoácidos em uma proteína farmacêutica existente. Porque o peso molecular aparente de uma tal cadeia de proteína não estruturada é cerca de 15 vezes maior do que seu peso molecular atual, a meia-vida de soro da proteína é grandemente aumentada. Em contraste com PEGilação tradicional, que requer conjugação química e repurificação, o processo de fabricação é grandemente simplificado e o produto é homogêneo.

[00178] Polisialização é outra tecnologia, que usa o ácido polissiáli- co de polímero natural (PSA) para prolongar a vida ativa e melhorar a estabilidade de peptídeos terapêuticos e proteínas. PSA é um polímero de ácido siálico (um açúcar). Quando usado para proteína e liberação de fármaco de peptídeo terapêutica, ácido polissiálico fornece um microambiente protetor em conjugação. Isto aumenta a vida ativa da proteína terapêutica na circulação e previne de ser reconhecida pelo sistema imune. O polímero de PSA é naturalmente encontrado no corpo humano. Foi adotado por certas bactérias que evoluíram sobre milhões de anos para revestir suas paredes com isto. Estas bactérias naturalmente polissialiladas foram em seguida capazes, em virtude de imitação molecular, de anular o sistema de defesa do corpo. PSA, a última tecnologia de cautela da natureza, pode ser facilmente produzida a partir de tais bactérias em quantidades grandes e com características físicas predeterminadas. PSA bacteriano é completamente não imunogênico, ainda quando acoplado a proteínas, como é quimicamente idêntico a PSA no corpo humano.

[00179] Outra tecnologia inclui o uso de derivados de amido de hi- droxietila (“HES”) ligados a anticorpos. HES é um polímero natural modificado derivado de amido de milho encerado e pode ser metaboli- zado pelas enzimas do corpo. Soluções de HES são normalmente administradas para substituir volume de sangue deficiente e melhorar as propriedades reológicas do sangue. Hesilação de um anticorpo permite a prolongação da meia-vida de circulação aumentando-se a estabilidade da molécula, bem como reduzindo-se liberação renal, resultando em uma atividade biológica aumentada. Variando-se parâmetros diferentes, tal como o peso molecular de HES, uma ampla faixa de conjugados de anticorpo de HES pode ser personalizada.

[00180] Anticorpos tendo uma meia-vida aumentada in vivo podem da mesma forma ser gerados introduzindo-se uma ou mais modificações de aminoácido (isto é, substituições, inserções ou deleções) em um domínio constante de IgG, ou fragmento de ligação de FcRn do mesmo (preferivelmente um fragmento de domínio de Fc ou articulação Fc). Veja, por exemplo, Publicação internacional No. WO 98/23289; Publicação Internacional No. WO 97/34631; e Patente U.S. No. 6,277,375.

[00181] Além disso, anticorpos podem ser conjugados a albumina (por exemplo, albumina de soro humana; HSA) para tornar o anticorpo ou fragmento de anticorpo mais estável in vivo ou ter uma meia-vida mais longa in vivo. As técnicas são bem conhecidas na técnica, veja, por exemplo, Publicação internacional Nos. WO 93/15199, WO 93/15200, e WO 01/77137; e Patente Europeia No. EP0 413622. Além disso, no contexto de um anticorpo biespecífico como descrito acima, as especificidades do anticorpo podem ser designadas tal que um domínio de ligação do anticorpo liga-se a Epo enquanto um segundo domínio de ligação do anticorpo liga-se a albumina de soro, preferivelmente HSA.

[00182] As estratégias para meia-vida crescente são especialmente úteis em nanocorpos, aglutinantes com base em fibronectina, e outros anticorpos ou proteínas aos quais meia-vida in vivo aumentada é desejado.

Conjugados de Anticorpo

[00183] A presente invenção fornece anticorpos ou fragmentos dos mesmos que especificamente ligam-se a uma proteína de recombinan- temente fundida ou quimicamente conjugada (incluindo ambas as con-jugações covalentes e não covalentes) para uma proteína heteróloga ou polipeptídeo (ou fragmentos dos mesmos, preferivelmente a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, a invenção fornece proteínas de fusão compreendendo um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo descrito aqui (por exemplo, um fragmento de Fab, fragmento de Fd, fragmento de Fv, fragmento de F(ab)2, um domínio de VH, um CDR de VH, um domínio de VL ou um CDR de VL) e uma proteína heteróloga, polipeptídeo, ou peptídeo. Métodos para fundir ou conjugar proteínas, polipeptídeos, ou peptídeos em um anticorpo ou um fragmento de anticorpo são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, e 5,112,946; o Patente Europeia Nos. EP 0307434 e EP 0367166; Publicação Internacional Nos. WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi e outro, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng e outro, 1995, J., Immunol. 154:5590-5600; e Vil e outro, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337 - 11341.

[00184] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas pelas técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento motif, embaralhamento de exon, e/ou embaralhamento de códon (coletivamente referido como “embaralhamento de DNA”). Embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos com taxas de afinidades mais altas e dissociação mais baixa). Veja, geralmente, Patente U.S. Nos. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, e 5,837,458; Patten e outro, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotech- nol. 16(2):76-82; Hansson, e outro, 1999, J., Mol. Biol. 287:265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308 - 313 (cada uma destas patentes e publicações estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ou os anti-corpos codificados ou fragmentos dos mesmos, podem ser alterados sendo submetido a mutagênse aleatória por PCR propensa a erro, inserção de nucleotídeo aleatória ou outros métodos antes da recombi- nação. Um polinucleotídeo codificando um anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente liga-se a uma proteína de Epo pode ser recombinado com um ou mais componentes, motifs, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

[00185] Além disso, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser fundidos a sequência marcadora, tal como um peptídeo para facilitar purificação. Em modalidades preferidas, a sequência de ami- noácido marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida em um vetor de pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz e outro, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por exemplo, hexa-histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de pep- tídeo úteis para purificação incluem, porém não são limitadas a, etiqueta de hemaglutinina (“HA”), que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina influenza (Wilson e outro, 1984, Cell 37:767), e a etiqueta “bandeira”.

[00186] Em outras modalidades, anticorpos da presente invenção ou fragmentos dos mesmos conjugados a um agente diagnóstico ou detectável. Tais anticorpos podem ser úteis para monitorar ou prognosticar o início, desenvolvimento, progressão e/ou severidade de uma doença ou distúrbio como parte de um procedimento de teste clínico, tal como determinar a eficácia de uma terapia particular. Tal diagnóstico e detecção podem ser realizados acoplando-se o anticorpo para detectar substâncias incluindo, porém não limitado a, várias enzimas, tais como, porém não limitado a, rábano picante peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos protéticos, tal como, porém não limitados a, estreptavidina/biotina e avidi- na/biotina; materiais fluorescentes, tais como, porém não limitados a, umbeliferona, fluoresceina, isotiocinato de fluoresceina, rodamina, di- clorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; mate- riais luminescentes, tais como, porém não limitados a, luminol; materiais bioluminescentes, tais como porém não limitados a, luciferase, luci- ferina, e aequorina; materiais radioativos, tais como, porém não limitados a, iodo (131I, 125I, 123I, e 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, e 111In,), tecnétio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xe- nônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La,175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; e pósitron emitindo metais usando várias tomografias de emissão de pósitron, e íons de metal paramagnéticos não radioativos.

[00187] A presente invenção também abrange usos de anticorpos ou fragmentos conjugados dos mesmos conjugados a uma porção terapêutica. Um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser conjugado a uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, por exemplo, agente citoestático ou citocida, agente terapêutico ou um íon de metal radioativo, por exemplo, alfa-emissores. Uma citotoxina ou o agente cito- tóxico inclui qualquer agente que é prejudicial a células.

[00188] Além disso, um anticorpo ou fragmento do mesmo podem ser conjugado a uma porção terapêutica ou porção de fármaco que modificam uma determinada resposta biológica. Porções terapêuticas ou porções de fármaco não serão interpretadas como limitantes para agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo, ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Por exemplo, tais proteínas podem incluir uma toxina tal como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, toxina de cólera, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor, α-interferon, β-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasmi- nogênio de tecido, um agente apoptótico, agente anti-angiogênico; ou, um modificador de resposta biológica tal como, por exemplo, uma lin- focina.

[00189] Além disso, um anticorpo pode ser conjugado a porções terapêuticas tal como um íon de metal radioativo, tal como alfa- emissores tal como 213Bi ou queladores macrocíclicos úteis para conjugar íons de radiometal, incluindo porém não limitados a, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipeptídios. Em certas modalidades, o quelador macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- N,N',N'',N'''-tetraacético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo por meio de uma molécula de ligante. Tais moléculas de ligante são geralmente conhecidas na técnica e descritas em Denardo e outro, 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson e outro, 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; e Zimmerman e outro, 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, cada qual incorporado por referência em sua totalidade.

[00190] Técnicas para conjugar porções terapêuticas a anticorpos são bem conhecidas, veja, por exemplo, Arnon e outro, “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld e outro (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom e outro, “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson e outro (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera e outro (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin e outro (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe e outro, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

[00191] Anticorpos podem da mesma forma ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purifica- ção do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, porém não são limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.

Métodos de Produzir Anticorpos da Invenção Ácidos Nucléicos Codificando os Anticorpos

[00192] A invenção fornece moléculas de ácido nucleico substancialmente purificadas que codificam polipeptídios compreendendo segmentos ou domínios das cadeias de anticorpo de ligação de Epo descritas acima. Alguns dos ácidos nucleico da invenção compreendem a sequência de nucleotídeo codificando a região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 13, 33, 53, ou 73, e/ou a sequência de nucleotídeo codificando a região variável de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 14, 34, 54, ou 74. Em uma modalidade específica, as moléculas de ácido nucleico são aquelas identificadas na Tabela 1. Algumas outras moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem sequência de nucleotídeo que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos 65, 80%, 95%, ou 99%) para as sequências de nucleotídeo daquelas identificadas na Tabela 1. Quando expresso a partir de vetores de expressão apropriados, polipeptídeos codificados por este polinucleotídeos são capazes de exibir capacidade de ligação de antígeno de Epo.

[00193] Da mesma forma fornecido na invenção são polinucleotí- deos que codificam pelo menos uma região de CDR e normalmente todas as três regiões de CDR da cadeia pesada ou leve do anticorpo de ligação de Epo mencionado acima. Alguns outros polinucleotídeos codificam toda ou substancialmente toda a sequência de região variável de cadeia pesada e/ou a cadeia leve do anticorpo de ligação de Epo mencionado acima. Por causa da degeneração do código, uma variedade de sequências de ácido nucleico codificará cada das sequências de aminoácido de imunoglobulina.

[00194] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem codificar igualmente uma região variável e uma região constante do anticorpo. Algumas das sequências de ácido nucleico da invenção compreendem nucleotídeos codificando uma sequência de cadeia pesada maduro que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) a sequência de cadeia pesada maduro mencionada em SEQ ID NO: 15, 35, 55, ou 75. Algumas outras sequências de ácido nucleico compreendendo nucleotídeo codificando uma sequência de cadeia leve madura que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) a sequência de cadeia leve madura mencionada em SEQ ID NO: 16, 36, 56, ou 76.

[00195] As sequências de polinucleotídeo podem ser produzidas por síntese de DNA de fase sólida novamente ou por mutagênse de PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências como descrito nos Exemplos abaixo) codificando um anticorpo de ligação de Epo ou seu fragmento de ligação. Síntese química direta de ácidos nucleico pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, tal como o método de fosfotriéster de Narang e outro, 1979, Meth. Enzymol. 68:90; o método de fosfodiéster de Brown e outro. Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage e outro, Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido de Patente U.S. No. 4,458,066. Mutações de introdução a uma sequência de polinucleotídeo por PCR podem ser realizada como descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis e outro (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila e outro, Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; and Eckert e outro, PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

[00196] Da mesma forma fornecido na invenção são vetores de expressão e células hospedeiras para produzir os anticorpos de ligação de Epo descritos acima. Vários vetores de expressão podem ser empregados para expressar os polinucleotídeos codificando as cadeias de anticorpo de ligação de Epo ou fragmentos de ligação. Igualmente vetores de expressão com base viral e não viral podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospedeira de mamífero. Vetores não virais e sistemas incluem plasmídeos, vetores episomais, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (veja, por exemplo, Harrington e outro, Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão do polinucleotídeos de ligação de Epo e polipeptídeos em mamífero (por exemplo, humano) células incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, a CA), vetores de MPSV, e numerosos outros vetores conhecidos na técnica para expressar outras proteínas. Vetores virais úteis incluem vetores com base em retrovírus, adenovírus, vírus adenoas- sociados, vírus do herpes, vetores com base em SV40, papiloma vírus, vpirus de Epstein Barr HBP, vetores de vírus de vacinia e vírus Semliki Forest (SFV). Veja, Brent e outro, supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld e outro, Cell 68:143, 1992.

[00197] A escolha de vetor de expressão depende das células hospedeiras pretendidas em que o vetor será expressado. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, realçadores) que são operativamente ligados aos polinucleotídeos codificando uma cadeia de anticorpo de ligação de Epo ou fragmento. Em algumas modalidades, um promotor de in- duzível é empregado para prevenir expressão de sequências inseridas exceto sob condições de inclusão. Promotores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, promotor de metalotioneina ou um promotor de choque de calor. Culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indizíveis sem influenciar a população para sequências de codificação cujos produtos de expressão são melhor tolerados pelas células hospedeiras. Além de promotores, outros elementos reguladores podem da mesma forma ser requeridos ou desejados para expressão eficiente de uma cadeia de anticorpo de ligação de Epo ou fragmento. Estes elementos tipicamente incluem um códon de iniciação de ATG e sítio de ligação e sítio de ligação ou outras sequências. Além disso, a eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de realçadores apropriados ao sistema de célula em uso (veja, por exemplo, Scharf e outro, Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittner e outro, Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o realçador de SV40 ou realçador de CMV pode ser usado para aumentar expressão em células hospedeiras de mamífero.

[00198] Os vetores de expressão podem da mesma forma fornecer uma posição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por sequência de anticorpo de ligação de Epo inseridos. Mais frequentemente, as sequências de anticorpo de ligação de Epo inseridas são ligadas a sequências de sinal antes da inclusão no vetor. Vetores a ser usados para receber sequências codificando domínios variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo de ligação de Epo algumas vezes da mesma forma codificam regiões constantes ou partes do mesmo. Tais vetores permitem expressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes desse modo levando a produção de anticorpos intactos ou fragmentos dos mesmos. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

[00199] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de anticorpo de ligação de Epo podem ser procarióticas ou eucarióti- cas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tal como Bacillus subtilis, e outra enterobacteriaceae, tal como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, alguém pode da mesma forma fazer vetores de expressão, que tipicamente contêm sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema de promotor de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de betalactamase, ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores tipicamente controlam expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências de sítio de ligação de ribossoma e similar, para iniciar e completar transcrição e translação. Outros micróbios, tal como levedura, podem da mesma forma ser empregados para ex-pressar polipeptídeos de ligação de Epo da invenção. Células de inseto em combinação com vetores de baculovírus podem da mesma forma ser usadas.

[00200] Em algumas modalidades preferidas, células hospedeiras de mamífero são usadas expressar e produzir os polipeptídeos de ligação de Epo da presente invenção. Por exemplo, eles podem ser uma linhagem celular de hibridoma expressando genes de imunoglo- bulina endógenos (por exemplo, o clone de hibridoma de mieloma 1D6.C9 como descrito nos Exemplos) ou uma linhagem celular de mamífero abrigando um vetor de expressão exógeno (por exemplo, as células de mieloma SP2/0 exemplificadas abaixo). Estes incluem qualquer célula de animal ou humano mortal normal ou normal ou anormal imortal. Por exemplo, várias linhagens de célula hospedeira adequadas capazes de segregar imunoglobulinas intactas foram desenvolvidas incluindo a linhagem celular de CHO, várias linhagens celulares de Cos, células de HeLa, linhagem celular de mieloma, células B trans-formadas e hibridomas. O uso de cultura de célula de tecido de mamífero para expressar polipeptídios é geralmente discutido em, por exemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir sequências de controle de expressão, tal como uma origem de replicação, um promotor, e um realçador (veja, por exemplo, Queen, e outro, Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), e sítios de informação de processamento necessários, tal como sítios de ligação de ribossoma, sítios de junção de RNA, sítios de poliadenilação, e sequências terminadoras transcricionais. Estes vetores de expressão normalmente contêm promotores derivados de genes de mamífero ou de vírus de mamífero. Promotores adequados podem ser constitutivos, célula tipo-específica, estágio-específica, moduláveis e/ou reguláveis. Promotores úteis incluem, porém não são limitados, ao promotor de metalotioneina, o último promotor principal de adenovírus constitutivo, o promotor de MMTV induzível de dexametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRP polIII, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível de tetraciclina (tal como o promotor de CMV precoce imediato humano), o promotor de CMV constitutivo, e combinações de promotor-realçador conhecidas na técnica.

[00201] Métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeo de interesse variam, dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção de cloreto de cálcio é geralmente utilizada para células procarióticas, visto que tratamento de fosfato de cálcio ou eletroporação podem ser usados para outros hospedeiros celulares. (veja geralmente Sambrook, e outro, supra). Outros métodos incluem, por exemplo, electroporação, tratamento de fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomos, imunolipossomos, conjugados de policátion: ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, fusão para a proteína estrutural do vírus do herpes VP22 (Elliot e O'Hare, Cell 88:223, 1997), captação realçada por de DNA, e transdu- ção ex vivo. Para produção a longo prazo, de alto-rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável será frequentemente desejada. Por exemplo, linhagem celular que estavelmente expressam cadeias de anticorpo de ligação de Epo ou fragmentos de ligação podem ser preparadas usando vetores de expressão da invenção que contém origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Seguindo a introdução do vetor, células podem ser permitidas crescer durante 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de eles fossem trocados para meios seletivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência a seleção, e sua presença permite crescimento de células que bem sucedidamente expressam as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes, estavelmente transfectadas podem ser proliferadas usando técnicas de cultura de tecido apropriadas ao tipo de célula.

Geração de anticorpos monoclonais da invenção

[00202] Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional por exemplo, a técnica de hibridação de célula somática padrão de Kohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Muitas técnicas para produzir anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

[00203] Sistemas animais para preparar hibridomas incluem os sistemas de murino, rato e coelho. Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Padrões de fusão (por exemplo, células de mi- eloma de murino) e procedimentos de fusão são da mesma forma co-nhecidos.

[00204] Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murino preparado como descrito acima. DNA codificando as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir do hibridoma de murino de interesse e criado para conter sequências de imunoglobulina de não murino (por exemplo. humano) usando técnicas de biologia molecular padrões. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando métodos conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4,816,567 para Cabilly e outro). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR de murine podem ser inseridas em uma estrutura de humano usando métodos conhecido na técnica. Veja por exemplo, Patente U.S. No. 5225539 para Winter, e Patente U.S. No. 5530101; 5585089; 5693762 e6180370 para Wueen e outro.

[00205] Em uma certa modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra Epo podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos transportando partes do sistema imune humano em lugar do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos ou transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como "camundongos de Ig humano."

[00206] O HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contém miniloci de gene de imunoglobulina humano que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada humana não rearranjada (μ e y) e K cadeia leve, juntamente com mutações alvejadas que inativam o local de cadeia μ e K endógeno (veja por exemplo, Lonberg, e outro, 1994 Nature 368(6474): 856-859). Desta maneira, os camundongos exibiram expressão reduzida de IgM de camundongo ou K, e com respeito a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar IgGk humano monoclonal de afinidade alta (Lonberg, N., e outro, 1994 supra; revisado em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N., e Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, e Harding, F., e Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci.764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMAb, e as mo-dificações genômicas transportadas por tais camundongos, é também descrita em Taylor, L., e outro, 1992 Nucleic Acids Research 20:62876295; Chen, J., e outro, 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon e outro, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi e outro, 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. e outro, 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon e outro, 1994 J. Immunol. 152:29122920; Taylor, L. e outro, 1994 International Immunology 579-591; and Fishwild, D. e outro, 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, os teores de todos dos quais estão aqui especificamente incorporados por referência em sua. Veja também Patente U.S. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; e 5,770,429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. No. 5,545,807 para Surani e outro; Publicação PCT Nos. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO 01/14424 para Korman e outro.

[00207] Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podem ser elevados usando um camundongo que transporta sequências de imunoglobulina humanas em transgenes e transcromossomos tal como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Tais camun- dongos, referidos aqui como "camundongos KM", são descritos em detalhes em Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida e outro.

[00208] Ainda também, sistemas animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar anticorpos de ligação de Epo da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 e 6,162,963 para Kucherlapati e outro.

[00209] Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar anticorpos de ligação de Epo da invenção. Por exemplo, camundongos transportando igualmente um transcromossomo de cadeia pesada humano e um trans- cromossomo de cadeia leve humano, referido como “camundongos TC” pode ser usado; tais camundongos são descritos em Tomizuka e outro, 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Além disso, vacas transportando transcromossomos de cadeia pesada e leve humano foram descritos na técnica (Kuroiwa e outro, 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) e pode ser usado para elevar anticorpos de ligação de Epo da invenção.

[00210] Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem da mesma forma ser preparados usando métodos de exibição de fago para avaliar bibliotecas de genes de imunoglobulina humanos. Tais métodos de exibição de fago para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Veja por exemplo: Patente U.S. No. 5,223,409; 5,403,484; e 5,571,698 para Ladner e outro; Patente U.S. Nos. 5,427,908 e 5,580,717 para Dower e outro; Patente U.S. Nos. 5,969,108 e 6,172,197 para McCafferty e outro; e Patente U.S. No. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 e 6,593,081 para Griffiths e outro.

[00211] Anticorpos de monoclonal humanos da invenção podem da mesma forma ser preparados usando camundongos SCID em que células imunes humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpo humano pode ser gerada em imunização. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5,476,996 e 5,698,767 para Wilson e outro.

Estrutura ou engenharia de Fc

[00212] Anticorpos criados da invenção incluem aqueles em que modificações foram feitas a resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VL, por exemplo para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imuno- genicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é para "novamente mutar" um ou mais resíduos de estrutura à sequência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem-se da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências de estrutura de anticorpo às sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências de região de estrutura à sua configuração de linha germinativa, as mutações somáticas podem ser "novamente mutadas" às sequências de linha germinativa por, por exemplo, mutagênse sítio-dirigida. Tais anticorpos "novamente mutado" são da mesma forma pretendidos ser abrangidos pela invenção.

[00213] Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutar um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou ainda dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epítopos de célula T para desse modo reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abro- dagem é da mesma forma referida como "desimunização" e é descrita em outros detalhes em Publicação de Patente U.S. No. 20030153043 por Carr e outro.

[00214] Além disso, ou alternativamente para modificações feitas dentro da estrutura ou regiões de CDR, anticorpos da invenção podem ser criados para incluir modificações dentro da região de Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida de soro, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificada para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em outros detalhes abaixo. A numeração de resíduos na região de Fc é aquela do índice de EU de Ka- bat.

[00215] Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 é modificada tal que o número de resíduos de cisteína na região de articulação é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuido. Esta abroda- gem é também descrita em Patente U.S. No. 5,677,425 por Bodmer e outro. O número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar reunião das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00216] Em outra modalidade, a região de articulação de Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio de CH2-CH3 do fragmento de articulação de Fc tal que o anticorpo prejudicou a ligação de proteína Staphylococcyl A (SpA) relativo a ligação de SpA de domínio de articulação de Fc. Esta abrodagem é descrita em outros detalhes em Patente U.S. No. 6,165,745 por Ward e outro.

[00217] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações pode ser introduzida: T252L, T254S, T256F, como descrito em Patente U.S. No. 6,277,375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região de CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação de receptor de salvamento empregado a partir de duas alças de um domínio de CH2 de uma região de Fc de um IgG, como descrito em Patente U.S. Nos. 5,869,046 e 6,121,022 por Presta e outro

[00218] Em ainda outras modalidades, a região de Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem uma afinidade alterada por um ligante efetor, porém retém a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo origem. O ligante efetor o qual afinidade é alterada podem ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente de C1 de complemento. Esta abordagem é descrita em outros detalhes em Patente U.S. Nos. 5,624,821 e 5,648,260, igualmente por Winter e outro.

[00219] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo alterou ligação de C1q e/ou reduziu ou aboliu citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esta abordagem é descrita em outros detalhes em Patente U.S. Nos. 6,194,551 por Idusogie e outro.

[00220] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para desse modo alterar a capacidade do anticorpo fixar complemento. Esta abordagem é descrita também em Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer e outro.

[00221] Em ainda outra modalidade, a região de Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor de Fcy modificando-se um ou mais aminoáci- dos. Esta abordagem é também descrita em Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios ligação em IgG1 humano para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (veja Shields, R.L. e outro, 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

[00222] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo necessita de glicosilação). Glicosilação pode ser alterada para aumentar a afinidade do anticorpo por "antígeno'. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas resultando em eliminação de um ou mais sítios de gli- cosilação de estrutura de região variável para desse modo eliminar glicosilação naquele sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Uma tal abordagem é descrita em outros detalhes em Patente U.S. Nos. 5,714,350 e 6,350,861 por Co e outro.

[00223] Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas de GlcNac biossectoras aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas por, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras em que para expressar anticorpos recombinantes da invenção para desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1,176,195 por Hang e outro descreve uma linhagem celular com um gene de FUT8 funcionalmente rompido, que codifica uma fucosil transferase, tal que anticorpos expressaram em uma tal linhagem celular exibe hipofucosilação. Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem celular de CHO variante, células de Lecl3, com capacidade reduzida de ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), da mesma forma resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (veja da mesma forma Shields, R.L. e outro, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Publicação PCT WO 99/54342 por Umana e outro descreve linhagens celulares criadas para expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglicosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que anticorpos expressos na linhagem celular criada exibem estruturas de GlcNac biossectoras aumentadas que resulta em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (veja da mesma forma Umana e outro, 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Métodos de Criar Anticorpos Alterados

[00224] Como discutido acima, os anticorpos de ligação de Epo tendo sequências de VH e VL ou sequências de cadeia pesada e leve de tamanho natural mostradas aqui para criar novos anticorpos de ligação de Epo modificando-se sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve de tamanho natural, sequências de VH e/ou VL, ou a regi- ão(ões) constante(s) ligadas a isso. Desse modo, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo de ligação de Epo da invenção são usadas para criar anticorpos de ligação de Epo estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação a Epo humano e da mesma forma inibindo uma ou mais propriedades funcionais de Epo (por exemplo, inibindo ligação de Epo ao receptor de Epo, inibir proliferação celular dependente de Epo).

[00225] Por exemplo, uma ou mais regiões de CDR dos anticorpos da presente invenção, ou mutações dos mesmos, podem ser combinadas recombinantemente com de regiões de estrutura conhecidas e/ou outros CDRs para criar anticorpos de ligação de Epo adicionais, recombinantemente criados da invenção, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aqueles descritos na seção prévia. O material de partida para o método de criação é uma ou mais das se-quências de VH e/ou VL fornecidas aqui, ou uma ou mais regiões de CDR do mesmo. Para criar o anticorpo criado, não é necessário para atualmente preparar (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas aqui, ou uma ou mais regiões de CDR do mesmo. Em vez disso, as informações contidas na(s) sequência(s) são usadas como o material de partida para criar uma "segunda geração" de sequência(s) deriva- da(s) da(s) sequência(s) original(is) e em seguida a "segunda geração" de sequência(s) é preparada e expressa como uma proteína.

[00226] Desta maneira, em outra modalidade, a invenção fornece um método para preparar um anticorpo de ligação de Epo modificado compreendendo as etapas de: a) produzir e anticorpo de ligação de Epo compreendendo uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 21, 41, e 61, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 22, 42, e 62, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 23, 43, e 63; e uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve tendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 24, 44, e 64, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 25, 45, e 65, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 26, 46, e 66; b) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada e/ou sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e c) expressar a sequência de anticorpo alterada como uma proteína.

[00227] Desta maneira, em outra modalidade, a invenção fornece um método para preparar um anticorpo de ligação de Epo consistindo em uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7, 27, 47, e 67, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 28, 48, e 68, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 29, 49, e 69; e uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve tendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 30, 50, e 70, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 11, 31, 51, e 71, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 32, 52, e 72; alterando pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada e/ou sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressando a sequência de anticorpo alterada como uma proteína.

[00228] Desta maneira, em outra modalidade, a invenção fornece um método para preparar um anticorpo de ligação de Epo otimizado para expressão em uma célula de mamífero consistindo em: uma se-quência de anticorpo de cadeia pesada de tamanho natural tendo uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 15, 35, 55 e 75; e uma sequência de anticorpo de cadeia leve de tamanho natural tendo uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 16, 36, 56, e 76; alterando-se pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de cadeia pesada de tamanho natural e/ou sequência de anticorpo de cadeia leve de tamanho natural para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressando a sequência de anticorpo alterada como uma proteína. Em uma modalidade, a alteração da cadeia pesada ou leve está na região de estrutura da cadeia pesada ou leve.

[00229] A sequência de anticorpo alterada pode da mesma forma ser preparada avaliando-se bibliotecas de anticorpo tendo sequências de CDR3 fixas ou determinantes de ligação essenciais mínimos como descrito em US20050255552 e diversidade em sequências de CDR1 e CDR2. A avaliação pode ser realizada de acordo com qualquer tecnologia de avaliação apropriada para avaliar anticorpos a partir de bibliotecas de anticorpo, tal como tecnologia de exibição de fago.

[00230] Técnicas de biologia molecular padrões podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterado. O anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é uma que retém um, alguns ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos de ligação de Epo descritos aqui, cujas propriedades funcionais incluem, porém não são limitadas a, especificamente ligar-se a Epo de humano, cinomolgo, rato e/ou camundongo; e o anticorpo inibe proliferação celular dependente de Epo em um ensaio de proliferação de célula F36E e/ou Ba/F3-EpoR.

[00231] Em certas modalidades dos métodos de criar anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ou seleti- vamente ao longo de todo ou parte de um anticorpo de ligação de Epo codificando sequência e os anticorpos de ligação de Epo modificados resultantes podem ser avaliados para atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais como descrito aqui. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos por criar e avaliar mutações de anticorpo usando mutagênse de saturação, reunião de ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, Publicação PCT WO 03/074679 por Lazar e outro descreve métodos de usar métodos de avaliação computacionais para otimizar propriedades físico- químicas de anticorpos.

[00232] Em certas modalidades dos anticorpos de invenção foram criados para remover sítios de desamidação. Desamidação é conhecida por causar mudanças estruturais e funcionais em um peptídeo ou proteína. Desamidação pode resultar em bioatividade diminuída, bem como alterações em farmacocinéticos e antigenicidade da proteína farmacêutica. (Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5):1432-9).

[00233] Em certas modalidades da invenção os anticorpos foram criados para aumentar pl e melhorar suas propriedades semelhantes a fármaco. O pl de uma proteína é um determinante principal das propriedades biofísicas totais de uma molécula. Anticorpos que têm pls baixos foram conhecidos ser menos solúveis, menos estáveis, e propensos a agregação. Além disso, a purificação de anticorpos com pl baixo está desafiando e pode ser problemática especialmente durante graduação para uso clínico. Aumentando-se o pl dos anticorpos anti-Epo, ou Fabs, da invenção melhorou sua solubilidade, permitindo os anticorpos ser formulados em concentrações mais altas (>100 mg/ml). Formulação dos anticorpos em concentrações altas (por exemplo >100mg/ml) oferece a vantagem de ser capaz de administrar doses mais altas dos anticorpos nos olhos de pacientes por meio de injeções intravítreas, que sucessivamente pode permitir frequência de dosagem reduzida uma vantagem significante por tratamento de doenças crônicas incluindo doenças vasculares retinais. Pis mais altos podem da mesma forma aumentar a reciclagem mediada por FcRn da versão de IgG do anticorpo desse modo permitindo o fármaco persistir no corpo durante uma duração mais longa, requerendo menos injeções. Finalmente, a estabilidade total dos anticorpos é significativamente melhorada devido ao pl mais alto resultando em vida de prateleira mais longa e bioatividade in vivo. Preferivelmente, o pl é maior do que ou igual a 8.2.

[00234] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando ensaios padrões disponíveis na técnica e/ou descritos aqui, tal como aqueles mencionados nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

Usos Profilácticos e Terapêuticos

[00235] Anticorpos que ligam-se a Epo como descrito aqui, podem ser usados em uma concentração terapeuticamente útil para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado com níveis de Epo aumentados e/ou atividade administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da invenção. A presente invenção fornece um método de tratar condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. A presente invenção fornece um método de tratar condições ou distúrbios associados com retinopatia diabética (DR) administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. A presente invenção fornece um método de tratar condições ou distúrbios associados com edema macular administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anti-corpos da invenção. A invenção da mesma forma fornece um método de tratar edema macular diabético (DME) administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. A presente invenção também fornece um método de tratar retinopatia diabética proliferativa (PDR) administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. Ainda também, a presente invenção fornece métodos para tratar edema macular relacionado a idade (AMD), oclusão da veia retinal (RVO), angioedema, coroidite multifocal, neovasculari- zação coróide míope e/ou retinopatia de prematuridade, administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. A invenção da mesma forma fornece métodos de tratar beta telassemia e/ou câncer.

[00236] A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de an- tígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio associado com níveis de Epo aumentados e/ou atividade. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de an- tígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de condições ou distúrbios associados com retinopatia diabética (DR). A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de condições ou distúrbios associados com edema macular, edema macular diabético (DME), e/ou retinopatia diabética proliferativa (PDR). A invenção ainda também refere-se a uma compo- sição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso em edema macular relacionado a idade (AMD), oclusão da veia retinal (RVO), angioe- dema, coroidite multifocal, neovascularização coróide míope, e/ou reti- nopatia de prematuridade. A invenção também refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de beta telassemia e/ou câncer. Mais especificamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio associado com níveis de Epo aumentados e/ou atividade, pode ser qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui, além daqueles descritos na Tabela 1. Ainda também, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso no tratamento de condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal, pode ser qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui, além daqueles descritos na Tabela 1. Os anticorpos da invenção podem ser usados, entre outros, para prevenir progressão de condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal (por exemplo, DR, DME, NPDR, PDR, degeneração macular relacionada a idade (AMD), oclusão da veia retinal (RVO), angioedema, coroidite multifocal, neovascularização coróide míope, e/ou retinopatia de prematuridade), para tratar ou prevenir edema macular associado com doença vascular retinal, para reduzir a frequência de injeção de Lucentis® (RTM), e para melhorar perda de visão devido a progressão de doença vascular retinal. Os anticorpos da invenção podem da mesma forma ser usados em combinação com terapias anti-VEGF para o tratamento de pacientes com doença vascular retinal.

[00237] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de inibir proliferação celular dependente de Epo em que o método inclui a etapa de contatar Epo (por exemplo, contatar Epo em um indivíduo) com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descritos aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. Em um aspecto, o método compreende contatar uma célula (por exemplo, uma célula compreendendo Epo) com uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir proliferação celular dependente de Epo em um indivíduo. É contemplado que a célula seja uma célula humana. A célula poderia ser uma célula B. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano.

[00238] Proliferação de célula pode ser medida por, por exemplo, bio-microscopia de lâmpada de fenda, tomografia de coerência óptica, retinografia colorida, e angiografia de fluoresceína (Heng e outro Diabet. Med. 2013 Jun;30(6):640-50). Além disso, a capacidade de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno descrito aqui para inibir proliferação celular dependente de Epo pode ser medida usando um ensaio tal como o ensaio de proliferação celular F36E, ou Ba/F3-EpoR descrito abaixo.

[00239] A invenção da mesma forma refere-se a um método de inibir sinalização celular dependente de Epo em que o método inclui a etapa de contatar Epo com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito para impedir Epo de interagir com um receptor em uma superfície de célula. Em um aspecto, o método compreende contatar uma célula compreendendo Epo com uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir sinalização celular dependente de Epo em um indivíduo. É contemplado que a célula seja uma célula humana. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano.

[00240] Ligando de Epo ao EpoR induz sinalização por JAK2 cina- ses que leva a ativação de séries de reação de sinalização a jusante que inclui fosfatidil-inositol 3-cinase (Pi-3K)/Akt, de MAP cinase, STAT5 e proteína cinase C (Jelkmann, 2007; Jelkmann, 2004). Epo ou o receptor de Epo (EpoR) foi relatado ser produzido endogenamente por tipos de célula diferentes tal como células endoteliais, células de músculo liso, e células do CNS (Ogunshola e Bogdanova, 2013). Ativação de EpoR sob ligação de Epo pode ativar séries de reação de sinalização a jusante levando a atividades diferentes tal como transporte de cálcio (Korbel e outro, 2004), sobrevivência de célula (Velly e outro, 2010), neuroproteção (Grimm e outro, 2002), e angiogênese (Ribatti, 2010; Ribatti e outro, 2003). Desta maneira, inibição de sinalização de célula dependente de Epo pode ser determinada medindo-se a atividade de uma ou mais destas séries de reação de sinalização. Por exemplo, inibição de sinalização de célula dependente de Epo pode ser determinada medindo-se cinase de JAK2 cinase, Pi-3K/Akt, MAP cinase, STAT5 ou proteína cinase C. Métodos para medir estas séries de reação de sinalização são conhecidas na técnica e kits para medir tal atividade de série de reação estão comercialmente disponí- veis. Além disso, inibição de sinalização de célula dependente de Epo pode ser determinada medindo-se proliferação celular como descrito acima. Proliferação celular pode estar em um indivíduo (por exemplo, angiogênese), ou pode ser medida usando um ensaio tal como o ensaio de proliferação celular de F36E, ou Ba/F3-EpoR descrito abaixo. Em um aspecto, sinalização de célula dependente de Epo é estatisticamente significativamente (p < 0,05) diminuída na presença de um anticorpo descrito aqui, relativo a controle.

[00241] A invenção da mesma forma refere-se a um método de inibir proliferação celular dependente de Epo ou sinalização em que o método inclui a etapa de contatar Epo com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui para impedir Epo de interagir com um receptor em uma superfície de célula. É contemplado que a célula seja uma célula B. É contemplado que a célula seja uma célula humana.

[00242] A invenção da mesma forma refere-se a um método de inibir ligação de Epo ao receptor de Epo em que o método inclui a etapa de contatar Epo (por exemplo, contatar Epo em um indivíduo) com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos ligação de antígeno do mesmo descrito aqui; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. A invenção da mesma forma refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito aqui para uso para inibir ligação de Epo ao receptor de Epo em uma célula de um indivíduo; em particular, a composição pode compreender o anticorpo NVS1, NVS2, NVS3, ou NVS4. É contemplado que a célula seja uma célula humana. É também contemplado que a célula esteja em um indivíduo. É da mesma forma contemplado que a célula esteja no olho do indivíduo. É ainda também contemplado que o indivíduo seja humano. Inibição de ligação de Epo ao receptor de Epo pode ser medida como descrito por Khankin e outro PLoS ONE, 2010 5:e9246.

[00243] Tratamento e/ou prevenção de doença vascular retinal e edema macular associado com doença vascular retinal pode ser determinado por um oftalmologista ou profissional de saúde usando medidas clinicamente relevantes de função visual e/ou anatomia retinal. Tratamento de condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal significa qualquer ação (por exemplo, administração de um anticorpo anti-Epo descrito aqui) que resulta em, ou é contemplado resultar, na melhoria ou preservação de função visual e/ou anatomia retinal. Além disso, prevenção quando refere-se a condições ou distúrbios associados com doença vascular retinal significa qualquer ação (por exemplo, administração de um anticorpo anti-Epo descrito aqui) que previne ou reduz uma agravação na função visual, anatomia retinal, e/ou um parâmetro de doença vascular retinal, como definido aqui, em um paciente em risco ao referido agravamento.

[00244] Função visual pode incluir, por exemplo, acuidade visual, acuidade visual com baixa iluminação, campo visual, campo visual central, visão periférica, sensibilidade de contraste, adaptação escura, recuperação de fotoestresse, distinção das cores, velocidade de leitura, dependência de dispositivos de assistência (por exemplo, fonte grande, dispositivos de aumento, telescópios), reconhecimento facial, proficiência a operar um automóvel, capacidade de realizar uma ou mais atividades de vida diária, e/ou satisfação relatada do paciente relacionada a função visual.

[00245] Medidas exemplares de função visual incluem acuidade visual de Snellen, acuidade visual de ETDRS, acuidade visual de baixa luminância, tela de Amsler, campo visual de Goldmann, campo visual de Humphrey, microperimetria, gráficos de Pelli-Robson, cartão de SKILL, placas de cor Ishihara, teste de cor Farnsworth D15 ou D100, eletroretinografia padrão, electroretinografia multifocal, testes validados para velocidade de leitura, reconhecimento facial, simulações de condução, e satisfação relatada pelo paciente. Desse modo, tratamento de doença vascular e/ou edema macular pode ser referido ser obtido em um ganho de ou fracasso para perder 2 ou mais linhas (ou 10 letras) de visão em uma escala de ETDRS. Além disso, tratamento de doença vascular e/ou edema macular pode ser referido ocorrer onde um indivíduo exibe pelo menos um aumento de 10% ou necessita de diminuição de 10% em velocidade de leitura (palavras por minuto). Além disso, tratamento de doença vascular e/ou edema macular pode ser referido ocorrer onde um indivíduo exibe pelo menos um aumento de 20% ou necessita de uma diminuição de 20% na proporção de placas corretamente identificadas em um teste de Ishihara ou discos corretamente sequenciados em um teste de Farnsworth. Além disso, tratamento de doença vascular retinal e/ou edema macular, pode ser referido ocorrer se um indivíduo tem, por exemplo, pelo menos diminuição de 10% ou necessita de 10% ou mais de aumento em tempo para um grau pré-especificado de adaptação ao escuro. Além disso, tratamento de doença vascular retinal e/ou edema macular pode ser referido ocorrer onde um indivíduo exibe, por exemplo, pelo menos uma redução de 10% ou necessita de 10% ou mais de aumento na área total de scotoma visual expressado como um ângulo visual determinado por um profissional da saúde qualificado (isto é, oftalmologista).

[00246] Aspectos indesejáveis de anatomia retinal que podem ser tratados ou prevenidos incluem, por exemplo, microaneurisma, edema macular, manchas algodonosas, anormalidade microvascular intrarre- tinal (IRMA), deleção capilar, adesão de leucócito, isquemia retinal, neovascularização do disco ótico, neovascularização do polo posterior, neovascularização da íris, hemorragia intrarretinal, hemorragia vítrea, cicatriz macular, fibrose subretinal, e fibrose retinal, dilatação venosa, tortuosidade vascular, vazamento vascular. Desse modo, tratamento de, por exemplo, edema macular pode ser determinado por uma redução de 20% ou mais em espessuras do sub-campo retinal central como medido por tomografia de coerência óptica.

[00247] Meios exemplares de avaliar anatomia retinal incluem fun- doscopia, retinografia, angiografia de fluoresceína, angiografia verde de indocianina, tomografia de coerência óptica (OCT), tomografia de coerência óptica de domínio espectral, oftalmoscopia de escaneameto a laser, microscopia confocal, óticos adaptáveis, autofluorescência, biópsia, necropsia, e imuno-histoquímica. Desse modo, doença vascular e/ou edema macular pode ser referida ser tratada em um indivíduo em uma redução de 10% em área de vazamento como determinado por angiografia de fluoresceína.

[00248] Indivíduos a ser tratados com agentes terapêuticos da presente invenção podem da mesma forma ser administrados outros agentes terapêuticos com métodos conhecidos de tratar condições associadas com diabetes melito, tal como todas as formas de insulina e medicamentos anti-hipertensivos.

[00249] Tratamento e/ou prevenção de doença ocular tal como de-generação macular relacionada a idade (AMD), oclusão da veia retinal (RVO), angioedema, coroidite multifocal, neovascularização coróide míope, e/ou retinopatia de prematuridade pode ser determinado por um oftalmologista ou profissional de saúde usando medidas clinicamente relevantes de função visual e/ou anatomia retinal por quaisquer das medidas descritas acima. Embora as medidas descritas aqui não aplica-se a cada e toda doença ocular aqui, alguém de experiência na técnica reconheceria a medida clinicamente relevante de função visual e/ou anatomia retinal que poderia ser usada para tratar a determinada doença ocular.

[00250] Quando os agentes terapêuticos da presente invenção são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser admi-nistrados sequencialmente em ordem ou simultaneamente. Em alguns aspectos, um anticorpo da presente invenção é administrado a um in-divíduo que está da mesma forma recebendo terapia com um segundo agente (por exemplo, Lucentis®). Em outros aspectos, a molécula de ligação é administrada juntamente com tratamentos cirúrgicos.

[00251] Agentes adequados para tratamento de combinação com anticorpos de ligação de Epo incluem agentes conhecidos na técnica que são capazes de modular as atividades de VEGF, receptores de VEGF, outros inibidores tirosina cinase receptora, ou outras entidades que modulam séries de reação mediadas por HIF-1. Outros agentes foram relatados inibir estas séries de reação incluem ranibizumabe, bevicizumabe, pegaptanibe, aflibercept, pazopanibe, sorafinibe, suniti- nibe, e rapamicina. Tratamentos de combinação com agentes anti- inflamatórios tal como corticosteróides, NSAIDS, e inibidores de TNF-α poderiam da mesma forma ser benéficos no tratamento de doença vascular retinal e edema macular, por exemplo, retinopatia diabética e DME.

[00252] Um regime de terapia de combinação pode ser aditivo, ou pode produzir resultados sinergísticos (por exemplo, reduções em severidade de retinopatia mais do que esperado para o uso combinado dos dois agentes). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma terapia de combinação para prevenir e/ou tratar retinal doenças vasculares e edema macular, especificamente, retinopatia diabética, incluindo DME e/ou PDR como descrito acima com um anticorpo de ligação de Epo da invenção e um anti-angiogênico, tal como agente anti-VEGF.

Composições Farmacêuticas

[00253] A invenção fornece composições farmacêuticas compreen- dendo os anticorpos de ligação de Epo (intactos ou fragmentos de ligação) formulados juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições podem adicionalmente conter um ou mais outros agentes terapêuticos que são adequados para tratar ou prevenir, por exemplo, retinopatia diabética. Veículos farmaceuticamente aceitáveis realçam ou estabilizam a composição, ou podem ser usados para facilitar preparação da composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de atraso de absorção, e similar que são fisiologicamente compatíveis.

[00254] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A rotina e/ou modo de administração variam, dependendo dos resultados desejados. É preferido que administração seja intravítrea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, ou administrada proximal ao sítio do alvo. O veículo farmaceuticamente aceitável deveria ser adequado para administração intravítrea, intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rotina de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, biespecífica e multiespecífi- ca, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[00255] A composição deveria ser estéril e fluida. A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, por uso de revestimento tal como lecitina, por manutenção de tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e por uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir os agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção a longo prazo das composições injetáveis pode ser provocada incluin- do-se na composição um agente que atrasa absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[00256] Composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos e habitualmente praticados na técnica. Veja, por exemplo, Remington: The Sciences and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a ed., 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Composições farmacêuticas são preferivelmente fabricadas sob condições de GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz do anticorpo de ligação de Epo é empregada nas composições farmacêuticas da invenção. Os anticorpos de ligação de Epo são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos aqueles de experiência na técnica. Regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou pode aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso para formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem quando aqui usada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias aos indivíduos a ser tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.

[00257] Níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas com-posições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmaco- cinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a rotina de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes.

[00258] Médico ou veterinário pode começar doses dos anticorpos da invenção empregados na composição farmacêutica em níveis mais baixos do que aqueles requeridos para obeter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que o efeito desejado seja obtido. Em geral, doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de uma doença vascular retinal descrita aqui varia dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente for humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se tratamento é profiláctico ou terapêutico. Dosagens de tratamento necessitam ser titulados para otimizar segurança e eficácia. Para administração sistêmica com um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais normalmente 0,01 a 15 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Para administração intravítrea com um anticorpo, a dosagem pode variar de 0,1 mg/olho a 10 mg/olho. Mais especificamente, a dose pode variar de 1 mg/olho a 9 mg/olho, 2 mg/olho a 8 mg/olho, 3 mg/olho a 7 mg/olho, 4 mg/olho a 6 mg/olho, ou 4,5 mg/olho a 5,5 mg/olho, Em certos exemplos a dose pode ser 0,1 mg/olho, 0,2 mg/olho, 0,3 mg/olho, 0,4 mg/olho, 0,5 mg/olho, 0,6 mg/olho, 0,7 mg/olho, 0,8 mg/olho, 0,9 mg/olho, 1 mg/olho, 2 mg/olho, 3 mg/olho, 4 mg/olho, 5 mg/olho, 6 mg/olho, 7 mg/olho, 8 mg/olho, 9 mg/olho, ou 10 mg/olho, Um regime de tratamento exemplar requer administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Um regime de tratamento exemplar requer administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses, ou quando necessário (PRN).

[00259] Anticorpo é normalmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre únicas dosagens podem ser semanais, mensais ou anuais. Intervalos podem, da mesma forma, ser irregulares como indicado medindo-se níveis de sangue de anticorpo de ligação de Epo no paciente. Além disso, intervalos de dosagem alternativos podem ser determinados por um médico e administrados mensalmente ou quando necessário para ser eficaz. Eficácia está com base em crescimento de lesão, taxa de resgaste de Lucentis®, espessuras retinais como determinado por Tomografia de Coerência Óptica (OCT), e acuidade visual. Em alguns métodos de administração sistêmica, dosagem é ajustada para obter uma concentração de anticorpo de plasma de 11000 μg/ml e em alguns métodos 25 a 500 μg/ml. Alternativamente, anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação prolongada caso no qual administração menos frequente é requerida. Dosagem e frequência variam, dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanizados mostram meia-vida mais longa do que de anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração pode variar, dependendo de se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um período longo de tem-po. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é requerida até que progressão da doença seja reduzida ou terminado, e preferivelmente até que o paciente mostra melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Depois disso, o paciente pode ser administrado um regime profiláctico.

EXEMPLOS

[00260] Os seguintes exemplos são fornecidos para também ilustrar a invenção, porém não para limitar seu escopo. Outras variantes da invenção serão facilmente aparentes a alguém de experiência ordinária na técnica e serão abrangidas pelas reivindicações anexas.

Exemplo 1: Geração de Anticorpos de Epo Amadurecidos por Afi-nidade

[00261] Uma biblioteca de exibição de fago completamente humana foi usada para gerar os anticorpos de ligação de Epo descritos aqui.

[00262] Epo biotinilados e não biotinilado de humano e cinomolgo foram usados em solução e paniculação de fase sólida. Paniculação padrão foi realizada bem como abordagens de RapMAT (Prassler e outro, (2009) Immunotherapy 1(4):571-583). Seguindo avaliação secundária e paniculação de RapMAT, clones foram selecionados para análise de sequência e um grupo de 8 anticorpos foram selecionados para conversão em um formato de FabCys, linhas germinativas, otimização de pl e remoção de sítios de desamidação. Geração de FabCys foi realizada com um método de RapCLONE® proprietário. RapCLONE® foi realizada como um método de duas etapas para conversão conveniente e eficiente de uma quantidade grande de clones de Fab no formato de IgG e FabCys. Em uma primeira etapa de clonagem, um cassete de expressão eucariótico foi introduzido nos vetores de expressão pMORPH®x11 (para HuCAL PLATINUM®) por meio de Bsi- WI/MfeI (para misturas de K) ou HpaI/MfeI (misturas de K e X) digestão e ligação subsequente. Isto foi seguido por uma segunda etapa de clonagem, em que as misturas de Fab contendo o cassete de expressão foram digeridas usando EcoRV/BlpI (misturas de K e X) e subse-quentemente clonadas no vetor aceptor pMorph®4_IgG1f ou pMorph®4_h_FabCys para expressão em células de mamífero. Para este projeto, RapCLONE® foi aplicado apenas em Fab únicos, se- quenciados e caracterizados. Portanto todos os clones foram recuperados depois de RapCLONE®.

[00263] pls baixos (< 8,2) são geralmente associados com propriedades biofísicas pobres incluindo estabilidade e agregação. 8 candidatos finais (HCDR3 clones únicos) foram selecionados para linhagem germinativa, otimização de pl e remoção de sítios de desamidação levando a um total de 12 variantes de linha germinativa. 12 genes de VL foram sintetizados (dois para 11317, 11324, 11331 e 11345) e um VH (11324). Possivelmente devido a de-seleção precoce de candidatos com PTMs, apenas 11317 (VL), 11332 (VL) e 11380 (VH) conteve sítios de desamidação que foram removidos com a linhagem germinati- va. Linhagem germinativa foi em geral feita à linha germinativa mais próxima. Para aumentar o pl, a linha germinativa lambda 3h foi escolhida para 6 dos candidatos em vez de ou além da linha germinativa 3r mais próxima. Adicionalmente variantes lambda 3j foram construídas para três candidatos para minimizar risco (11317, 11331 e 11345).

NA, Não aplicável * Toda modificação de PTM ocorreu em VL, ** modificações de pl ocorreram em VH

[00264] Como mencionado acima, o pl de uma proteína é um determinante principal das propriedades biofísicas totais de uma molécula. Os Fabs anti-Epo identificados a partir da biblioteca de exibição de fago tiveram pl mais baixo do que 8,2. Para melhorar as propriedades de fabricação, os anticorpos foram especificamente criados para aumentar seu pl e melhorar suas propriedades semelhantes a fármaco. Aumentando o pl dos Fabs anti-Epo melhorou sua solubilidade, permitindo os Fabs ser formulados em concentrações mais altas (>100 mg/ml). Formulação dos Fabs em concentrações altas (por exemplo, >100mg/ml) oferece a vantagem de ser capaz de administrar doses mais altas dos Fabs nos olhos do paciente por meio de injeções intra- vítreas que sucessivamente pode permitir frequência de dosagem reduzida, uma vantagem significante para tratamento de doenças oculares crônicas incluindo, porém não limitadas a AMD úmido e retinopatia diabética.

[00265] Os Fabs resultantes são mostrados na Tabela 1 (NVS1, NVS2, NVS3, e NVS4).

Exemplo 2: Caracterização de Anticorpos Otimizados

[00266] O seguinte exemplo descreve métodos que podem ser usados para medir afinidade de anticorpo. Estes e outros métodos de medir afinidade de ligação são conhecidos na técnica.

Determinação de Afinidade

[00267] Afinidade de anticorpo para Epo foi medida por ressonância de plásmon superficial (SPR) usando um Biacore® T200 (Biacore) e titulação de equilíbrio de solução (SET). Explicações de cada tecnologia e resultados médios correspondentes para ligação de Epo são descritas abaixo. Suposições de modelagem levam em conta concentrações de Epo no sistema, cinética de biogênese de Epo e meia-vida, bem como o horário de dosagem desejado, e sugere que um Fab com uma afinidade menor do que 50pM para Epo é suficiente para diminuir níveis de Epo livre.

Determinação de Biacore

[00268] A cinética de uma interação, isto é as taxas de formação complexa (ka) e dissociação (kd), podem ser determinadas a partir da informação em um sensorgrama. Se ligação ocorre como passagens de amostra sobre uma superfície de sensor preparada, a resposta no sensorgrama aumenta. Se equilíbrio é alcançado um sinal constante foi visto. Amostra de substituição com tampão faz as moléculas ligadas dissociar e a resposta diminui. Avaliação de software Biacore gera os valores de ka e kd ajustando-se os dados em modelos de interação.

[00269] Três células de fluxo foram utilizadas para o ciclo do método. Célula de fluxo 1 (fc1) serviu como a referência, onde nenhum Fab de Epo foi capturado, para avaliar quanto a ligação não específica do Epo ao superfície de fragmento revestido por anticorpo. Ambas as etapas de captura e ligação foram realizadas em células de fluxo 2-4.

[00270] Etapa de captura: para alcançar um Rmax de 20, o nível de captura de Fab anti-hu em fc2-4 foi aproximadamente 50RL. Fab antihu em uma concentração de 1ug/ul, fluiu em Fc2-4 em uma taxa de fluxo de 10 μl/min.

[00271] Os cálculos para o Rmax relativo são como segue:Fabs: Rmax = RL*(MWanalisado/MWligante)*estequiometria 20=RL*(21.4/50)*1 = 50 RL

[00272] O analisado começou em concentrações de 20nM e incluíram 8 1:2 diluições com uma duplicata a 2.5nM para a dissociação longa e curta. O analisado foi conduzido em uma taxa de fluxo de 60μl/min durante 240 segundos. Tempos de dissociação foram fixos em 4000 segundos e 600 segundos. Tempo de dissociação foi fixo em 4000 segundos a 10nM, 2,5nM e 0,3125nM de concentrações de analisado para NVS2 e NVS4. Depois da injeção de amostra, houve uma etapa de lavagem com o tampão de regeneração.

[00273] Regeneração foi realizada ao término de cada ciclo em todas as células de fluxo. Condição de regeneração para este método foi 1% de ácido fosfórico com 10% de Hidróxido de sódio a 60ul/min durante 100 segundos.

[00274] Todas as outras condições de ciclo foram realizadas a 25°C entre 1x tampão de HBS-EP+ (Biacore cat #BR-1006-69). Os sinais resultantes foram ajustados por referenciamento duplo, desse modo subtraindo os valores de índice de refração da célula de fluxo de referência e a etapa de ligação sem analisado. Dados foram coletados em 10 Hz e analisados usando o Software Biacore® T100 Evaluation Versão 1.1 (GE Healthcare). Este programa usa um método de análise de ajuste total para a determinação de taxa e constantes de afinidade para cada interação.

[00275] Os resultados da determinação de cinéticas de ligação de Biacore são mostrados na Tabela 2. Como mostrado os anticorpos descritos aqui exibiram ligação de afinidade alta a Epo humano, com valores de KD tipicamente menores do que ou iguais a 40 pM.Tabela 2: Afinidade de Ligação de Anticorpos de Epo (Biacore)

ND: não determinado * Dados mostrado para NVS1 é ponto de dados simples.

Determinação de SET

[00276] Em contraste com ensaios cinéticos usando superfícies de sensor, tal como SPR, SET é um método que determina afinidades em solução. É uma medida de equilíbrio que não libera dados cinéticos.

[00277] Em SET, uma quantidade constante de anticorpo é incuba- da com concentrações diferentes de antígeno até que equilíbrio seja alcançado. A concentração de anticorpo livre na solução equilibrada é determinada aplicando-se a solução em uma placa de MSD™ revestida por antígeno (Meso Scale Discovery™) seguido por incubação com um anticorpo secundário rotulado por ECL e medida de intensidade de sinal. Em concentrações de antígeno baixas, um sinal forte é obtido (concentração alta de anticorpo livre que liga-se ao antígeno na placa) visto que para concentração de antígeno alta, o anticorpo é antígeno completamente capturado, resultando em um sinal baixo. Se um número suficiente de concentrações de antígeno em uma faixa de empa- relhamento estiver disponível, a curva de titulação permite uma deter-minação razoável da afinidade, usando o modelo de ajuste apropriado. Para uma titulação completa, concentrações de antígeno pelo menos 10 vezes mais alta do que o KD antecipado têm que ser aplicadas. A concentração constante de anticorpo aplicada no ensaio deveria estar na faixa de, ou abaixo, do KD (Tabela 3).

[00278] Para determinação de KD por SET, frações de monômero de proteína de anticorpo foram usadas (pelo menos 90% de teor de monômero, analisado por SEC analítico; Superdex75 (Amersham Pharmacia) para Fab, ou Tosoh G3000SWXL (TOSOH BIOSCIENCE) para IgG, respectivamente).

[00279] Determinação de afinidade em solução foi basicamente realizada como descrito na literatura (Friguet e outro 305-19). Para melhorar a sensibilidade e precisão do método de SET, foi transferido de ELISA clássico para tecnologia com base em ECL (Haenel e outro, 2005).

[00280] Anticorpos de Epo foram diluídos em uma concentração fixa em tampão de incubação (PBS com 2% de BSA (cat#A4503 de Sigma) e 1% de Tween20 e 1% de Triton-X (cat#234729 de Sigma)), e adicionado a uma diluição serial (1:5) de Epo em tampão de incuba- ção. Concentração mais alta final de Epo: Humano, Hu-darbapoetina, cinomolgo, camundongo, rato = 10nM Coelho = 100nM Concentrações finais de Fabs: NVS2: 2pM, exceto Coelho = 30pM NVS3: 2pM, exceto Coelho = 5pM NVS4: 2pM, exceto Coelho = 10nM NVS1: 2pM

[00281] Amostras foram permitidas alcançar equilíbrio por incubação em RT durante a noite.

[00282] Placas de MSD padrões revestidas por etreptavidina (Me- so-Scale Discovery, 384-cavidades: MSD cat#L11SA) foram bloqueadas com 25μl de tampão de incubação em RT durante 1 hora. Placas foram lavadas 3x em tampão de TBST (25mM de TBS com 0,05% de Tween20), e 0,1μg/ml de Epo biotinilado foi adicionado em 25μl de tampão de incubação e incubado em RT durante 1 hora. Placas foram lavadas 3x em tampão de TBST. Amostras contendo Fabs e titulação de Epo foram adicionadas à placa (25μl), e incubadas em RT durante 15 minutos. Placas foram lavadas 3x em tampão de TBST. 25μl de anticorpo de detecção foi adicionado (o Anti-humano (Cabra) Sulfo-TAG, 1:1000 em tampão de incubação, cat#R32AJ-1 de MSD), e incubado em RT durante 60 minutos. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem, e 50μl de 1x MSD Read tampão T foi adicionado (com ten- soativo, MSD cat#R92TC-1). Placas foram lidas em um MSD Spector Imager 6000.

[00283] Três experiências foram realizadas em dias separados, cada ponto de dados em triplicata.

[00284] Dados foram analisados usando software GraphPad Prism v4, com antecedente (uma média de cavidades não contendo Fab) subtraido de cada valor. Valores de eixo X (concentração de Epo em solução) foram transformados em log10x.

[00285] Valores de KD (KD) foram ajustados a partir seguinte modelo: Y=(Top-((Top/(2xFab))x((((i0Ax)+Fab)+KD)- ((((((10Ax)+Fab)+KD)x(((10Ax)+Fab)+KD))-((4x(10Ax)) xFab))A0.5)))) Top = sinal em concentração de antígeno = 0 x = concentração de Epo em solução Fab = restrição para concentração de Fab foi fixa em 1pM

[00286] Afinidades de Epo Fabs foram determinadas usando o ensaio de SET e valores de KD resultantes ([pM] concentrações) são resumidos na Tabela 3. NVS2 ligado humano, darbepeotina humana e Epo cinomolgo com um KD menor do que 10pM. NVS2 da mesma forma Epo de camundongo ligado com um KD menor do que 50pM e Epo de rato com um KD menor do que 20pM. NVS3 ligado humano, dar- bepeotina humana, Epo cinomolgo, de camundongo e rato com um KD menor do 5pM. NVS4 ligado humano, darbepoetina humano, Epo ci- nomolgo, de camundongo e rato com um KD menor do que 10pM.Tabela 3: Afinidade de Ligação de Anticorpos de Epo (SET)

ND: não determinado *Dados mostrados para NVS1 é ponto de dados simples.

Exemplo 3: Inibição de Proliferação Celular Induzida por Epo

[00287] Células que são dependentes em eritropoietina para crescimento e sobrevivência podem ser utilizadas para medir a potência de terapêuticos anti-Epo por meios de inibição de proliferação dependente de Epo (Chiba e outro, 1991).

Exemplo 3a: Ensaio de Proliferação Celular Ba/F3-EpoR

[00288] Este ensaio demonstra a capacidade de anticorpos de Epo inibir proliferação celular induzida por Epo em células de Ba/F3 de camundongo expressando o receptor de Epo (células de Ba/F3-EpoR). Células de Ba/F3 são dependentes de IL-3 para crescimento e sobrevivência e foi mostrada crescer de uma maneira independente de IL-3 em transformação com várias tirosina cinases oncogênicas. Em trans- fecção estável com EpoR, células de Ba/F3-EpoR tornam-se independentes de IL-3. O plasmídeo de expressão de mamífero pcDNA3.1 transportando EpoR humano foi transfectado em células de Ba/F3 usando o sistema de nucleofecção Amaxa (número de catálogo VCA- 1003, Amaxa GmbH) de acordo com as instruções do fabricante usando o dispositivo Nucleofector (Amaxa, Nucleofactor™ II).Materiais

Manutenção de célula Médio de Crescimento: RPMI1640/10% de FBS/1% de Pen- Strep/100μg/ml de Higromicina B/1U/ml de Epo Médio de Ensaio: RPMI1640/10% de FBS/1% de Pen- Strep/100μg/ml de Higromicina B

[00289] Células de Ba/F3-EpoR foram mantidas em meio de crescimento (RPMI1640/10% de FBS/1% de Pen-Strep/100μg/ml de Hi- gromicina B/1U/ml de Epo). Células foram divididas em ~1e6células/ml (a cada 3-4 dias) até 0,4-0,6e5 células/ml. Ensaio de Proliferação Celular Induzido por Epo 1. Um dia antes da experiência, células de Ba/F3-EpoR foram preparadas por centrifugação para remover médio de crescimento, seguindo que as células foram ressuspensas em meio de ensaio (RPMI1640/10% de FBS/1% de Pen-Strep/100μg/mL de Higromicina B) que não contém Epo. 2. No dia da experiência, células foram lavadas 2-3 vezes em meio de ensaio (centrífuga 1000rpm, 5min) e ressuspensas em meio de ensaio a 1,25x 105 células/ml. 3. 2500 células foram adicionadas a cada cavidade de ensaio em uma placa preta de 384 cavidades (base clara, tratada por TC). 4. Epo foi serialmente diluído em um microplaca de 384 ca-vidades com meio de ensaio tal que a concentração final de Epo foi duas vezes mais alta do que concentração final desejada. 5. 20μl de Epo serialmente diluído (em triplicata) foi adicionado em triplicata a cavidades de amostra contendo células de Ba/F3- EpoR de placa preta de 384 cavidades. 6. A placa foi girada em uma centrífuga a 1000rpm durante 30-60 segundos e incubada durante 48 horas a 37°C, 5% de CO2. 7. Quatro horas antes do ponto final, 8μl de Célula Titer Blue foi adicionado a todas as cavidades e re-incubado a 37°C, 5% de CO2. 8. Quatro horas depois, a placa foi lida em um Beckman Coulter Paradigm com Paradigm Multimode SW, ou escâner comparável. 9. Epo estimulou proliferação de células de Ba/F3-EpoR 4 vezes em linha de referência. Epo estimulou Ba/F3-EpoR com um EC50 médio de 11,2 pM e faixa de 10pM e 26pM. 10. Anticorpos Anti-Epo foram serialmente diluídos em tri- plicata em uma microplaca de 384 cavidades contendo 4ng/ml Epo em meio de ensaio e incubado durante 30 minutos em temperatura de ambiente. 11. 20μl/cavidade da mistura de anticorpo de Epo/anti-Epo anterior foi adicionado a placa de parede preta de 384 cavidades semeada com 2500 células de BaF3/EpoR por cavidade. 12. Placas pós-incubação foram processadas como esboçado nas etapas 7-9 acima Resultados

[00290] Anticorpos de Epo inibiram proliferação de células de Ba/F3-EpoR na presença de 1ng/ml de Epo depois de 48 horas. Anticorpos inibiram proliferação de célula de Ba/F3-EpoR com um IC50 menor do que ou igual a 350pM.Tabela 4:

Exemplo 3b: Ensaio de Proliferação de Célula de F36E

[00291] Células de F36E são altamente dependentes em Epo para proliferação. Estímulo com Epo usando os métodos descritos acima tipicamente resulta em um maior em seguida sinal de 6 vezes em linha de referência. O EC50 desta curva é 7 pM.

Protocolo para Neutralização de Ensaio de Proliferação de Célula F36E Induzido por Epo

[00292] Um ensaio de proliferação usando a linhagem celular de F36E, uma linhagem celular imortalizada semelhante a linfócito dependente de Epo derivada de uma linhagem celular de medula óssea parental, foi usada para avaliar anticorpos terapêuticos anti-Epo e selecionar os candidatos para desenvolvimento.Materiais

Manutenção de célula

[00293] Darbepoietina, um Epo humano hiperglicosilado recombi- nante, foi usada para manutenção de célula e ensaios de proliferação descritos aqui. Darbepoietina estimula proliferação em células de F36E com um EC50 comparável para Epo humano recombinante (63,2 pg/ml de darbepoietina e 81,25 pg/ml de eritropoietina; veja LU-15432, pg. 44). Células de F36E foram mantidas em meio de crescimento (RPMI1640/5% de FBS/1% de Pen-Strep/5,2U/ml de dEpo) em células de 0.25e6 de densidade mínima por ml para células de 1.0e6 de densidade de máximo por ml até 10 passagens. Protocolo de Ensaio de Proliferação Induzido por Epo 1. Epo foi diluído em meio de ensaio (RPMI1640/5% de FBS/1% de Pen-Strep) a 4ng/ml, 4x-vezes concentração final desejada. 2. Anticorpo Anti-Epo foi diluído em meio de ensaio em 200nM, 4x concentração final, e esta concentração foi serialmente diluída em meio de ensaio para seis pontos. Diluição foi repetida para um anticorpo de referência positivo (por exemplo: Epo26) e um anticorpo de referência negativo (por exemplo: anticorpo monoclonal de lisozima anti-galinha). 3. 7,5ul dEpo diluído e 7,5ul de diluições seriais de anticorpo anti-Epo foram misturados em microplaca de polipropileno de 384 cavidades, em triplicata, e incubados em temperatura de ambiente durante 30 minutos. 4. Células de F36E (2e6 por placa de 384 cavidades) foram peletizadas, meio de crescimento foi aspirado e células foram lavadas uma vez em meio de ensaio (centrífuga 1200rpm, 5min), em seguida ressuspensas em meio de ensaio em 3.33e5 células/ml. 5. 15μl/cavidade de células (5,000 células/cavidade) foi adi-cionado a todas as cavidades em placas de cultura de célula de polies-tireno de 384 cavidades. 6. 15ul de mistura de anticorpo-Epo foi adicionada a células. 7. Incubado 68 horas a 37°C, 5% de CO2. 8. 8μl de Célula Titer Blue foi adicionado por cavidade e in-cubado a 37°C, 5% de CO2 durante 4 horas. 9. Fluorescência foi medida a 560(20)Ex/590(10)Em em um Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer ou escâner comparável. 10. O RFU +/- desvio-padrão médio versus anticorpo de nM foi plotado e IC50 determinado por ajuste de curva de regressão não linear em software Graph Pad Prizm Prizm. Resultados Anticorpos Anti-Epo inibiram proliferação de célula F36E com um IC50 menor do que ou igual a 200pM. Tabela 5:

Exemplo 4: Ligação de Epítopo Peptídeo sintético & Estudos de Truncação de Peptídeo

[00294] Peptídeos sintéticos correspondendo a domínios estruturais de Epo humano (hEpo), truncações de domínio de hEpo, ou moléculas quiméricas contendo porções de hEpo e trombopoietina humana (TPO) foram sintetizados ou expressos recombinantemente. Ligação positiva aos peptídeos sintéticos indicou que resíduos contidos naquele domínio de Epo foram envolvidos em ligação ao anticorpo anti-Epo. Para as proteínas truncadas, perda de ligação indicou o envolvimento da porção truncada em ligação ao anticorpo anti-Epo. Entretanto, a perda de ligação não impediu a possibilidade que a truncação alterou a estrutura da proteína restante significativamente para afetar ligação aos anticorpos anti-Epo. As quimeras de TPO de Epo-humano humanas permitiram manutenção da estrutura enquanto ainda permitindo mapeamento de epítopo. Perda de ligação em uma variante que conteve uma porção de hTPO indicou que a região homóloga em hEpo era importante para ligação ao anticorpo anti-Epo.

Mapeamento de Epítopo de Peptídeo de Anticorpos Anti- Eritropoietina

[00295] Os seguintes seis peptídeos (Tabela 6), correspondendo as hélices de eritropoietina foram sintetizados.Tabela 6:

Configuração do Ensaio 1. 25ul de peptídeo em PBS (5ug/ml) foi revestido em placa padrão de MSD de 384 cavidades (Mesoscale Discovery, Cat. No.L21XA-4) durante a noite. 2. A placa foi bloqueada com 90ul de PBS+5% de BSA/0.1% de Tween-20/0.1% de TritonX-100 durante 4 horas. 3. 500nM Morphosys Epo Fab em diluentes de PBS+2% de BSA/0.1% de Tween-20/0.1% de TritonX-100 foi adicionado a placa e incubado durante 1 hora. 4. A placa foi lavada e incubada com IgG anti-humano de Sulfo-tag (Meso Scale Discovery, Cat. No. R32AJ-1) para Fabs de Epo ou espécies apropriadas para proteínas de referência/anticorpos (1 hr). 5. Placa foi lavada e Solução de MSD Read (Meso Scale Discovery, Cat. R92TC-1) foi adicionada. 6. Placa de leitura. Mapeamento de Epítopo de Anticorpos Anti-Eritropoietina com Variantes Truncadas de Eritropoietina Variante de Epo 1: Hélice A Variante de Epo 2: Hélice A, Alça A-B Variante de Epo 3: Hélice A, Alça A-B, Hélice B Variante de Epo 4: Hélice A, Alça A-B, Hélice B, Alça B-C, Hélice C Variante de Epo 5: eritropoietina de tamanho natural Configuração do Ensaio 1. Placa foi revestida com variantes de Epo expressas por HEK293 biotinilado em placa de 384 cavidades de estreptavidina padrão (Mesoscale Discovery, Cat. No.L21SA-1) durante a noite a 4°C. 2. A placa foi bloqueada com 90ul de PBS+5% de BSA/0.1% de Tween-20/0.1% de TritonX-100 durante 4 horas. 3. O lugar foi lavado e 500nM de Morphosys Epo Fab foi adicionado à placa e incubado durante 1 hora. 4. A placa foi lavada e incubada com IgG anti-humano de Sulfo-tag (Meso Scale Discovery, Cat. No. R32AJ-1) para Fabs de Epo ou espécies apropriadas para proteínas/anticorpos de referência (1 hr) 5. A placa foi lavada e Solução de MSD Read (Meso Scale Discovery, Cat. R92TC-1) foi adicionada. 6. Placa de leitura. Mapeamento de Epítopo de Anticorpos Anti-Eritropoietina com Epo/Trombopoietina (Tpo) e Quiméricos de Epo de Coe- lho/Humano Quiméricos de Epo/Tpo Variante de Epo/Tpo 1: Epo Humano com Hélice de Tpo A Variante de Epo/Tpo 2: Epo Humano com Alça de Tpo A-B Variante de Epo/Tpo 3: Epo Humano com Hélice de Tpo B Variante de Epo/Tpo 4: Epo Humano com Hélice de Tpo C Variante de Epo/Tpo 5: Epo Humano com Hélice de Tpo D Quiméricos de Epo de Coelho/Humano Variante de de Epo Rb/Hu 1: Epo de Coelho com Hélice Humana A Variante de de Epo Rb/Hu 2: Epo de Coelho com Alça Humana A-B Variante de de Epo Rb/Hu 3: Epo de Coelho com Hélice Humana B Variante de de Epo Rb/Hu 4: Epo de Coelho com Alça Humana B-C e Hélice C Variante de de Epo Rb/Hu 5: Epo de Coelho com Alça Humana C-D Variante de de Epo Rb/Hu 6: Epo de Coelho com Hélice Humana D Configuração do Ensaio 1. 25ul quiméricos de Epo em PBS (2ug/ml) foram revestidos em uma placa padrão de MSD de 384 cavidades (Mesoscale Discovery, Cat. No.L21XA-4) durante a noite a 4°C. 2. A placa foi bloqueada com 90ul de PBS+5% de BSA/0.1% de Tween-20/0.1% de TritonX-100 durante 4 horas. 3. 500nM de Morphosys Epo Fab em diluente de PBS+2% de BSA/0.1% de Tween-20/0.1% de TritonX-100 foi adicionado a placa e incubado durante 1 hora. 4. A placa foi lavada e incubada com IgG anti-humano de Sulfo-tag (Meso Scale Discovery, Cat. No. R32AJ-1) para Fabs de Epo ou espécies apropriadas para proteínas/anticorpos de referência (1 hr) 5. A placa foi lavada e Solução de MSD Read (Meso Scale Discovery, Cat. R92TC-1) foi adicionada. 6. Placa de leitura Protocolo geral

[00296] Placas de MSD de 384 cavidades de captura padrão (Meso Scale Discovery) foram revestidas com peptídeo (5ug/ml em PBS, New England Peptide LLC) ou quiméricos de Epo (2ug/ml em PBS) e incubadas durante a noite a 4°C. Variantes de Epo truncadas biotiniladas (2ug/ml em PBS) foram revestidas em placas de MSD de 384 cavidades de captura de estreptavidina durante a noite. Depois de lavar as placas 1X com TBST (Thermo Scientific, Cat. No. Cat. No. 28360), as placas foram bloqueadas em diluente (PBS, 5% de BSA, 0.1% de Tween-20, 0.1% de TritonX-100) durante 4 horas em temperatura ambiente. Placas foram lavadas 3X em TBST. Quinhentos nanomolar de fabs anti-eritropoietina foram adicionados às placas de MSD de pré- revestidas por variantes de peptídeo/Epo durante 1 hora. Placas foram lavadas 3X em TBST e IgG-Sulfotag anti-humano (1ug/ml, Meso Scale Discovery, Cat. No.R32AJ-1) foi adicionado e incubado durante 60 minutos. Placas foram lavadas 3X em TBST e 1X Tampão de Leitura T (Meso Scale Discovery, Cat. No.R92TC-1) foi adicionado. As placas foram lidas em um MSD Spector Imager 6000 e dados foram analisados usando software GraphPad Prism v4.

Resultados:

[00297] Resultados indicaram que os anticorpos minimamente ligados aos seguintes domínios (Tabela 7). Nenhum anticorpo ligado a Hélice C.Tabela 7:

(++) Epítopo dominante; (+) ligação observada

Estrutura Cristalina de Anticorpos em Complexo com Epo

[00298] Eritropoeitina humana glicosilada, recombinante (Epo) foi recebida a partir de LEK Pharmaceuticals, Inc.,

[00299] Epo foi desglicosilado usando Mistura de Desglicosilação de Proteína (New England Biolabs, cat #P6039S). 30 mg de hEpo foi combinado com 1 ml de Mistura de Deglicosilação de Proteína e incubado a 37°C durante 1 hora em que ponto de desglicosilação estava incompleto como determinado por SDS-PAGE. Um adicional de 0,5 ml de Mistura de Deglicosilação de Proteína foi em seguida adicionado a Epo e incubado durante mais uma 1 hora a 37°C. Análise de gel mostrou desglicosilação quase completa de Epo. Esta proteína foi em seguida também purificada usando uma coluna de 120 ml Superdex75 (GE Healthcare, cat #28-9893-33) equilibrada em 25 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl. Frações de eluição contendo o nível mais alto de desglicosilação de hEpo foram agrupadas. Complexos de proteína foram formados combinando-se 5mg de Epo desglicosilado com 7 mg de NVS3, seguido por incubação em gelo durante 1 hora. A mistura de complexo de proteína foi em seguida concentrada e aplicada a 120 ml Superdex 75, equilibrada em 25mM de HEPES pH 7,5, 150mM de NaCl. Frações contendo relações esteiquiométricas avaliadas por SDS-gel de Epo:NVS3 foram agrupadas e concentradas a 19 mg/ml (concentração calculada por LCUV) (PRONOVA #27SN). Peneiras de cristalização foram fixas usando este complexo de Epo:NVS3 concentrado. Cristais foram cultivados pela técnica de difusão a vapor de gota assentada, com as gotas contendo volumes iguais de proteína e solução de reservatório. Cristais formados a 4°C com a seguinte condição de reservatório: 0.1M de Hepes pH7.0, 12% de PEG3350, 50mM de acetato de zinco desidrato. Cristais foram congelados usando a seguinte solução de crioproteção: 0.1M de Hepes pH7.0, 15% de PEG3350, 50mM de acetato de zinco desidratdo, 22% de glicerol.

[00300] Dados de difração cristalinos de complexo de Epo:NVS3 foram coletados em linha de feixe 17-ID no Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA). Dados foram processados e es- calados em 2.6Â usando autoPROC (Global Phasing, LTD) em grupo de espaço C2 com dimensões de célula a=125.57Â, b=150.15 Â,c=163.84Â, alpha=90o, beta=110.81o, gamma=90o,. A estrutura de Epo:NVS3 foi resolvida por substituição molecular usando Phaser (McCoy e outro, (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674). O Fab de estrutura 3H0T no banco de dados de PDB (Berman 2000) foi dividido em domínios variáveis e constantes, e a estrutura de eritropoietina humana Syed e outro, Nature. 1998 Oct 1;395(6701):511-6, código de PDB 1EER, foram usados como modelos de pesquisa.

[00301] O modelo final, contendo 3 moléculas do complexo de Epo:NVS3 por unidade assimétrica foi construído em COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) e refinado em valores de R e Rlivre de 23.0% e 26.7%, respectivamente, com um rmsd de 0.010 Â e 1.34° para comprimentos de ligação e ângulos de ligação, respectivamente, usando PHENIX (Adams e outro, Acta Cryst. D66, 213-221 (2010)).

[00302] A estrutura cristalina de Epo:NVS3 foi resolvida e refinada a 2.6Â. Revelou uma unidade assimétrica composta de três complexos de proteína de Epo:NVS2, cada composto de um Fab ligado a uma proteína de Epo. Dois destes complexos formam um dímero mediado por zinco e o terceiro exibe b-fatores mais altos e densidade mais fraca. Interações do Fab para Epo foram mediadas pelas alças de região de determinação de complementaridade (CDR) de ambas as cadeias pesadas e leves de NVS3. Mudanças conformacionais de Epo quando comparado a 1EER foram limitadas a alças distais do epítopo de ligação de Fab, com um RMSD de 0.5Â para todos os 144 aminoácidos alinhados. As cadeias pesadas e leves de Fab NVS3 mostram dobras semelhantes a imunoglobulina típicas para os domínios.

[00303] A estrutura cristalina de Epo:NVS3 foi usada para identificar o epítopo de Epo do fragmento de ligação de antígeno de NVS3. A su- perfície de interação em Epo foi formada principalmente por resíduos compreendendo resíduo Ser9, Glu13, resíduos Thr44 por Arg53 e resíduos Asn147 por Arg162. Estes correspondem aos elementos de estrutura secundários de Epo denotado como a-hélice A, alça βA-αB e α- hélice D. Estes resíduos formaram a superfície tridimensional que é reconhecida por NVS3. Interações incluíram interações de cadeia principal, interações mediadas por solvente, e interações de cadeia de lado direto.Tabela 8: Resíduos de interação de Epo em NVS3

[00304] Resíduos de Epo que contêm átomos em contato com NVS3 são listados na Tabela 9. Contato é definido estar dentro de 5 Â de NVS3 para responder por interações mediadas por água potencial.Tabela 9:

*Posição de sequência relativo a SEQ ID NO: 81

[00305] Resíduos de Epo que contêm átomos em contato com NVS2 são listados. Contato é definido estar dentro de 5 Â de padrão de proteína para responder por interações mediadas por água potencial.Tabela 10:

*Posição de sequência relativo a SEQ ID NO: 81

Exemplo 5: Modelo in vivo Exemplo 5a: Modelo de camundongo de edema ocular

[00306] Camundongos de C57/Bl6 (Taconic) foram injetados sub- retinalmente com ssAAV2-EPO-eGFP (DR005) e ssAAV2-EGFP (TM003) (controle). Camundongos foram sacrificados três semanas (21 dias) pós-injeção. As retinas foram montadas planas e o calibre do recipiente foi medido.

Métodos: Injeção subretinal de ssAAV2-EPO-eGFP e ssAAV2-eGFP

[00307] Camundongos C57/Bl6 com 8-semanas de idade foram divididos em dois grupos (10 camundongos cada, 20 olhos/grupo) e sub- retinalmente injetado com 1 μl ssAAV2 a 2x109 DRP/μl. O primeiro grupo (controle) recebeu ssAAV2-EPO sub-retinal (TM003), e o segundo (experimental) ssAAV2 - eGFP (DR005). O efeito de Epo de camundongo nas mudanças vasculares retinais foi examinado em montagens planas retinais em 21 dias pós-injeção.

[00308] O AAV (vírus adeno-associado) testado foi: ssAAV2-EPO- eGFP [(AAV2-CMV-mEPO-IRES-eGFP) de Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina at Chapel Hill, Lot# AV3782] and ssAAV2-GFP [(AAV2-eGFP) from Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina at Chapel Hill: Lot# AV3725].

Procedimento:

[00309] Vetores de AAV foram liberados por meio de injeção sub- retinal em ambos os olhos dos camundongos testados. Todos os procedimentos descritos foram realizados sob condições assépticas, usando reagentes estéreis, seringas e PPE apropriado. 1. Os camundongos foram imobilizados, e suas pupilas di-latadas com uma gota de ciclopentolato (1%), seguido por uma gota de 2,5% de fenilefrina. 2. Logo, o animal foi anestesiado com Avertina (250 mg/kg) i.p. A córnea foi topicamente anestesiada com uma gota de 0,5% de proparacaína. 3. Depois de colocar o animal sob um microscópio cirúrgico, um micro-bisturi foi usado para fazer uma incisão nasal de 0,5 mm, posterior ao limbo. 4. Uma agulha cega ligada a um 10 μl de seringa de Hamilton foi tangencialmente inserida pela incisão escleral para a retina temporal. A agulha foi avançada até que resistência foi sentida. 5. 1 μl de vetor de ssAAV2 (ssAAV2-EPO-eGFP ou ssA- AV2-GFP, igualmente contendo fluoresceína diluída 1:50 para visualizar liberação) foi lentamente injetada no espaço sub-retinal. 6. O olho foi examinado sob microscópio cirúrgico. Uma in-jeção sub-retinal bem sucedida foi confirmada visualizando-se uma fluoresceína contendo deslocamento de retina. 7. A injeção foi marcado dependendo do grau de dano retinal (visualizado por tamanho de hemorragia) e danifica à lente. 8. O animal foi virado ao outro lado e o procedimento foi repetido. 9. Unguento antibiótico foi aplicado a ambos os olhos depois da injeção. Dissecação Retinal, Imageamento e Quantificação em Montagem plana Retinal: 1. 0,1 ml de Concavalin-A (Con-A) foi injetado (i.v., veia da cauda) 1 a 5 miutos antes da eutanásia (CO2) 2. Os olhos foram enucleados e fixados em paraformalde- ído (4% em PBS) durante duas horas. Eles foram subsequentemente mantidos a 4°C em tampão de PBS durante 1 a 3 dias até a dissecação 3. A córnea e lente foram removidas, e a retina foi dissecada do ocular posterior (epitélio pigmentado retinal/coróide) 4. Quatro incisões radiais foram feitas à retina e montadas plana em meio de montagem de Vectashield com a camada fotorecep- tora virada para baixo. 5. Uma vez montada, as montagens planas foram centrados na retina central (usando a cabeça do nervo ótica como uma referência) e os recipientes retinais rotulados por Con-A foram capturados em 20X usando Sistema de Imageamento de Zeiss (AxioVision) 6. O software de AxioVision foi usado para medir o diâmetro de recipientes retinais centrais que são 200 μm longe da cabeça do nervo óptico. 7. Dados obtidos foram analisados com GraphPad Prism.

Resultados e Conclusão:

[00310] Quantificação de diâmetro de recipiente revelou que ssA- AV2-EPO induziu dilatação de recipiente significante (*p <0,001) na retina central comparada a ssAAV2-GFP e olhos ingênuos (6 olhos) (Figura 1). Nenhuma diferença significante foi constatada comparando ssAAV2-GFP versus grupo ingênuo. Amostras foram analisadas usando ANOVA de único sentido com Dunnet pós teste (C) Montagens planas representativas para cada grupo. Liberação a longo prazo de Epo por AAV2-Epo-eGFP resultou em um aumento estatisticamente signifi- cante em calibre venoso (Figura 1), um carimbo principal de edema macular diabético em humanos. Desta maneira, em um aspecto, a invenção refere-se a um método de diminuir calibre venoso no olho administrando-se um anticorpo anti-EPO descrito aqui em um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Exemplo 5b: Eficácia in vivo de anticorpos de anti-Epo

[00311] A atividade in vivo, e eficácia terapêutica, dos anticorpos anti-Epo descritos aqui pode ser avaliada no modelo de camundongo de edema ocular descrito acima.

Desafio in vivo no Modelo de camundongo

[00312] Camundongos C57B6 com 8 semanas de idade são injetados subretinalmente com um do seguinte. Grupos: Grupo 1: AAV2-eGFP @ titer 2 x 109 DRP @ titer, 1ul/olho, n = 20 olhos de 10 camundongos Grupo 2: AAV2-Epo-eGFP @ titer 2 x 109 DRP, 1ul/olho, n = 20 olhos de 10 camundongos Grupo 3: AAV2-Epo-eGFP @ titer 2 x 109, 1ul/olho, + anti- Epo Fab, 100ug/olho, 1 semanalmente, n = 20 olhos de 10 camundongos

[00313] O efeito de anticorpos anti-Epo dosado adequadamente é examinado no modelo de camundongo medindo-se diâmetro de recipiente 2 semanas pós injeção.

[00314] AAV-GFP (AAV2-eGFP) e AAV2-Epo-eGFP (AAV2-CMV- mEpo-raiva-eGFP) de Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina at Chapel Hill.

[00315] Injeção intra-ocular dos anticorpos anti-Epo inibirá anticorpos anti-Epo de dilatação de vaso retinal para melhorar os efeitos de Epo em diminuir fluxo de sangue e condições de hipóxicas na retina. Desse modo, os anticorpos anti-Epo são esperado reduzir a patologia retinal que é da mesma forma vista em pacientes com doenças retinais vasculares tal como AMD úmido e retinopatia diabética.

Exemplo 6: Neutralização in vivo de EPO livre Exemplo 6a: Neutralização in vivo de EPO livre usando um Fab anti- Epo

[00316] A atividade in vivo e eficácia terapêutica de anticorpos anti- EPO foi avaliada em olhos de coelho como segue. Coelhos foram dosados intravitreamente com um Fab anti-EPO, NVS2 (1mg/olho) e desafiado com uma dose intravítrea de EPO (3 ug/olho) quatro dias depois. Animais foram sacrificados e tecidos oculares incluindo vítreos foram extraídos. A quantidade de EPO livre e EPO total no vítreo foi determinada como descrito abaixo.

Total/Níveis de EPO livre:

[00317] Ensaios foram realizados usando placas de MSD de ligação padrão (Meso-Scale Discovery, 384-cavidades: MSD cat#L21XA), usando tampão de revestimento (PBS) e tampão de incubação (PBS com 2% de BSA (cat#A4503 de Sigma) e 0,1% de Tween20 e 0,1% de Triton-X).

[00318] Anticorpos de captura foram revestidos a 1μg/ml em PBS (25μl), e incubados durante a noite a 4°C. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem (PBS com 0,05% de Tween20), e bloqueados com 25μl de tampão de incubação em RT durante 2 horas. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem. Diluições vítreas em tampão de incubação foram adicionadas à placa (25μl), e incubadas durante 60 minutos em RT. Darbepoietina recombinante humana foi usada como um padrão (A000123, começando a 2μg/ml). Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem. 25μl de anticorpo primário foi adicionado (1μg/ml em tampão de incubação), e incubado em RT durante 60 minutos. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem. 25μl de anticorpos Sulfo-TAG secundários anti-espécie foi adicionado (1:1000 em tampão de incubação), e incubada em RT durante 60 minutos. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem, e 25μl de 1x tampão de MSD Read T foi adicionado (com tensoativo, MSD cat#R92TC-1). Placas foram lidas em um MSD Spector Imager 6000.

Resultados e Conclusão:

[00319] Os níveis de EPO totais medidos no vítreo de animais inje- tados com anti-EPO ou veículo foram similares como esperado (Figura 2). Em contraste, nenhum EPO livre foi medido no vítreo de coelhos injetados com Fab anti-EPO, porém média ~ 100ng/ml EPO livre foi medida no vítreo de coelhos injetados com veículo. Fab Anti-EPO administrado intravitreamente completamente neutralizou níveis de EPO livre como esperado.

Exemplo 6b: Neutralização in vivo de EPO livre usando um Fab anti- Epo

[00320] A atividade in vivo e eficácia terapêutica de anticorpos anti- EPO foram avaliadas nos olhos de coelho como segue. Coelhos foram dosados intravitreamente com uma solução pré-misturada de um Fab anti-EPO, NVS2 (1mg/olho) e EPO (3ug/olho). Animais foram sacrificados e tecidos oculares incluindo vítreo foram extraídos. A quantidade de EPO livre e EPO total no vítreo foi determinada como descrito abaixo. Nota: Alguns olhos receberam uma solução pré-mistura de um Fab anti-EPO, EPO, e VEGF.

Total/Níveis de EPO livres:

[00321] Ensaios foram realizados usando placas de MSD de ligação padrão (Meso-Scale Discovery, 384-cavidades: MSD cat#L21XA), usando tampão de revestimento (PBS) e tampão de incubação (PBS com 2% de BSA (cat#A4503 de Sigma) e 0,1% de Tween20 e 0,1% de Triton-X).

[00322] Anticorpos de captura foram revestidos a 1μg/ml em PBS (25μl), e incubados durante a noite a 4°C. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem (PBS com 0,05% de Tween20), e bloqueadas com 25μl de tampão de incubação em RT durante 2 horas. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem. Diluições vítreas em tampão de incubação foram adicionadas à placa (25μl), e incubadas durante 60 minutos em RT. Darbepoietina recombinante humana foi usada como um padrão (A000123, começando a 2μg/ml). Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem. 25μl de anticorpo primário foi adicionado (1μg/ml em tampão de incubação), e incubado em RT durante 60 minutos. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem. 25μl de anticorpos Sulfo-TAG secundários anti-espécies foram adicionados (1:1000 em tampão de incubação), e incubados em RT durante 60 minutos. Placas foram lavadas 3x em tampão de lavagem, e 25μl de tampão 1x MSD Read T foi adicionado (com tensoativo, MSD cat#R92TC-1). Placas foram lidas em um MSD Spector Imager 6000.

Resultados e Conclusão:

[00323] Os níveis de EPO totais medidos no vítreo de animais injetados com anti-EPO ou veículo foram similares como esperado (Figura 3). Em contraste, nenhum EPO livre foi medido no vítreo de coelhos injetados com um Fab anti-EPO, enquanto em uma média ~ 200ng/ml EPO livre foi medida no vítreo de coelhos injetados com veículo (Figura 3). Presença de VEGF não pareceu ter qualquer efeito em níveis de EPO livre ou totais. Fab Anti-EPO administrado intravitreamente com-pletamente neutralizou níveis de EPO livre como esperado.

Claims (12)

1. Anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga à eritropoietina (EPO) e compreende: (a) região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente; (b) região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, respectivamente; (c) região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 41, 42 e 43, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 44, 45 e 46, respectivamente; ou (d) região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66, respectivamente.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente, e pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, respectivamente, e pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 33 e 34, respectivamente.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 41, 42 e 43, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 44, 45 e 46, respectivamente, e pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 53 e 54, respectivamente.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 55 e 56, respectivamente.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a região variável da cadeia pesada contendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente, e região variável da cadeia leve contendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66, respectivamente, e pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 73 e 74, respectivamente.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 75 e 76, respectivamente.

10. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracteriza- do pelo fato de que é na preparação de uma composição para o tratamento de edema macular em um indivíduo.

11. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para o tratamento de edema macular diabético em um indivíduo.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende ainda administrar ao indivíduo um anticorpo anti-fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou outros agentes selecionados dentre o grupo que consiste em ranibizumabe, bevicizumabe, aflibercept, pegaptanibe, pazopanibe, sorafinibe, sunitinibe, rapamicina, corticosteroides, AINEs e inibidores de TNF-α.

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