BR112014009983A2

BR112014009983A2 - chip micro estruturado, dispositivo de análise por spr, processo de medida por spr e utilização do dispositivo

Info

Publication number: BR112014009983A2
Application number: BR112014009983A
Authority: BR
Inventors: Mercey Thibaut
Original assignee: Mercey Thibaut
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2019-10-01
Also published as: KR102103610B1; FR2982028B1; EP2780693A1; FR2982028A1; CN104081187B; CA2853388A1; WO2013060989A1; US20140293284A1; KR20140114335A; EP2780693B1; CN104081187A; US9739713B2

Abstract

chip micro estruturado, dispositivo de análise por spr, processo de medida por spr e utilização do dispositivo a presente invenção se refere a um chip micro estruturado (3; 33; 43; 53; 63) para análise por ressonância dos plasmons de superfície (spr) se apresentando sob a forma de um sólido constituído por uma base (5; 77), por uma face superior (4; 44) em que pelo menos uma parte está coberta por uma camada de metal (2; 22; 42; 52; 62), e pelo menos uma face lateral, (55; 66), caracterizada por: a referida face superior ser dotada de zonas de tamanho micrométrico destinadas a receber espécies para analisar escolhidas entre n protuberâncias e m cavidades; e por quando n+m maior igual a 2 as referidas zonas estarem separadas umas das outras por superfícies planas, com n indo de 1 a j, m indo de 0 a i; j e i sendo inteiros.

Description

CHIP MICRO ESTRUTURADO, DISPOSITIVO DE ANÁLISE POR SPR, PROCESSO DE MEDIDA POR SPR E UTILIZAÇÃO DO DISPOSITIVO

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um chip micro estruturado compreendendo superficies convexas para análise por Ressonância de Plasmons de Superfície, um dispositivo de análise compreendendo o referido chip micro estruturado, um processo de análise e as utilizações do referido dispositivo.

A Ressonância de Plasmons de superfície (ou SPR) para «Surface Plasmon Resonance» em inglês) é uma técnica óptica que permite detectar variações detalhadas de propriedades físicas na proximidade imediata de uma superfície. Essa técnica é sobretudo conhecida para permitir o acompanhamento em tempo real, e sem marcador (de tipo fluorescente ou radioativo por exemplo), das interações biomoleculares. Permite especialmente qualificar e quantificar interações entre ligantes imobilizados sobre uma superfície e analitos de solução em uma amostra.

A SPR é um fenômeno físico de excitação coletiva de elétrons de um metal sobre uma interface de metal meio dielétrico (sendo o referido meio dielétrico tipicamente um meio líquido ou um gás) . Para uma polarização particular da luz (polarização Transversal Magnética, ou «TM») incidente sobre essa interface (também denominada «superfície» no seguimento do texto) e para um ângulo chamado «ângulo de ressonância de plasmon», se produz um fenômeno de ressonância que se traduz pelo acoplamento da energia de luz incidente de uma onda de superfície (denominada «plasmon de superfície») que se se propaga paralelamente à interface. Esse fenômeno físico se traduz por uma queda da intensidade da luz

2/39 refletida pela superfície. Essa excitação só ocorre para os ângulos de incidência sobre a superfície para além do ângulo crítico de reflexão total (que só pode existir quando uma radiação passa de um meio mais refringente de índice óptico nl para um meio menos refringente de índice óptico n2, com nl>n2). Nesse caso, o plasmon de superfície virá «sondar» a espessura óptica na superfície do metal, do lado do meio dielétrico, sendo a espessura óptica definida como o produto do índice de refração pela espessura. Quando essas condições estão reunidas, se pode então dizer que a superfície é sensível ao efeito de plasmon.

Tipicamente uma radiação incidente acontece de acordo com um ângulo de incidência dado sobre uma das faces laterais de um chip (geralmente um prisma no estado da técnica, porque se trata do método de acoplamento da luz sobre a superfície sensível mais simples de utilizar) em que uma das faces está coberta por uma camada de metal, a referida radiação incidente é refratada quando entra no prisma (devido à diferença de índice óptico entre o meio que constitui o prisma e o meio óptico precedente, geralmente ar) e vem se refletir sobre a referida superfície de metal. Essa configuração é bem conhecida do perito na técnica com o nome de configuração de Kretschmann (E. Kretschmann, The determination of the Optical Constants of Metals by Excitation of Surface Plasmons, Z. Physik 241:313-324 (1971)). Existem também configurações equivalentes substituindo o prisma por uma rede de difração para acoplar a luz (configuração de Raether: H. Raether in Surface Polaritons, Eds. Agranovich and Mills, North Holland Pubi. Comp., Amesterdam, 1982).

3/39 fenômeno de SPR pode permitir além disso o estudo das interações biomoleculares. Nesse caso, ligantes são previamente imobilizados sobre a superfície de metal do prisma em zonas definidas. Assim, qualquer adesão posterior de outras moléculas com esses ligantes vai modificar localmente a espessura óptica ao nível das referidas zonas definidas e portanto vai provocar variações das condições de ressonância e portanto um movimento do ângulo de ressonância. Esse movimento é na primeira aproximação, proporcional à quantidade de matéria biológica que veio interagir com os ligantes. Assim, pequenas moléculas vão provocar um fraco movimento do ângulo de incidência enquanto moléculas maiores vão induzir um deslocamento angular bem mais relevante. É o estudo das variações de reflectividade óptica ligadas ao fenômeno de ressonância que vai permitir detectar e medir interações biomoleculares e a sua evolução temporal ao nível das zonas definidas.

Além disso, outros métodos ópticos permitem também realizar tais fenômenos físicos sem marcador (espelho ressonante, interferometria, ondas acústicas de superfície, microbalança de quartzo), mas essas técnicas requerem aparelhagens dispendiosas e inadaptadas às aplicações industriais concretas.

PROBLEMA TÉCNICO

Os sistemas atuais de SPR são volumosos, dispendiosos e difíceis de aplicar e não permitem portanto realizar análises a baixos custos. Com efeito, a maior parte dos sistemas atualmente comercializados requerem estratégias de medição complicadas e só permitem medições sobre uma zona bem exata (quase pontual) da superfície. Os dispositivos que

4/39 permitem análises de várias zonas em paralelo são muito complexos e apresentam peças mecânicas em movimento, tornando assim o sistema volumoso e difícil de utilizar.

É por isso que, a partir de alguns anos, numerosas pesquisas científicas são dedicadas ao desenvolvimento de dispositivos ópticos SPR eficientes, econômicos e fáceis de aplicar.

documento US5313264 (Ivarsson et ai) descreve um dispositivo SPR que utiliza uma interrogação chamada «angular» em que a superfície para estudar é excitada com um feixe convergente e a intensidade do feixe refletido é observada em um detector. Essa técnica não permite no entanto realizar o estudo de várias zonas em paralelo, pelo menos justapor vários detectores (se fala de análise essencialmente «mono ponto»).

documento Designing a curved surface SPR device, J Rooney et E. A. H. Hall, Sensors and Actuators B 114 (2006) 804-811 descreve um dispositivo que permite detectar uma interação biomolecular sobre um substrato esférico curvo côncavo. Embora esse documento sugira a justaposição 8 vezes do referido dispositivo, os elementos de detecção do dispositivo são também multiplicados 8 vezes, o que torna o dispositivo final oneroso e volumoso.

Os documentos US6862094 (Johansen et al) e US 7576863 (Weibel et ai) descrevem um dispositivo SPR que utiliza não uma interrogação angular mas uma interrogação de comprimento de onda com a ajuda de um monocromador ou de uma fonte de luz branca. Esses dispositivos permitem estudar várias interações biomoleculares em paralelo mas compreendem peças em movimento, o que aumenta as operações de manutenção

5/39 sobre o sistema, e portanto o custo global para o usuário.

Há também dispositivos SPR que permitem realizar imagiologia e seguir no ângulo de incidência e comprimento de onda fixados, a evolução das interações biomoleculares em zonas definidas sobre um chip. Os documentos US 7678584 (Guédon et al), US 7576863 (Weibel et al), US 7551286 (Tani et ai) apresentam tais dispositivos SPR. Embora esses dispositivos permitam uma análise de várias interações em paralelo, apresentam peças em movimento ou não permitem uma análise detalhada da interação quando nenhuma peça se mexe.

Para além disso, todos os dispositivos descritos precedentemente utilizam chips que são onerosos devido ao seu processo de fabricação. Por outro lado, como a maioria dos dispositivos são dispositivos «mono ponto», o preço por ponto de análise é importante.

Por outro lado, se pode também mencionar no estado da técnica o documento W02009/021964A2 (Maccraith and ai) que descreve uma plataforma óptica destinada a detectar analitos por fluorescência. Nesse documento, a superfície plana superior de uma rede de protuberâncias de forma paraboloide é metalizada depois funcionalizada por espécies biológicas. Depois, um sinal de fluorescência é excitado através de um efeito plasmônico gerado pela geometria paraboloide das protuberâncias, que permite obter um feixe incidente sobre a referida superfície plana metalizada para além do ângulo crítico.

No entanto, nesse documento, nenhuma informação pode ser deduzida diretamente das características da própria onda de plasmon porque ela só serve para a emissão indireta de luz por luminescência. Para além disso, a superfície útil

6/39 de detecção é uma superfície plana metalizada, e só permite realizar uma análise a um angulo θ exato.

Finalmente, há também no estado da técnica numerosos documentos descrevendo chips que têm nanoestruturas na sua superfície, que para alguns de entre eles, usam o fenômeno físico dos plasmons de superfície localizados (LSPR). A título de exemplo, o documento Grating coupler integrated photodiodes for plasmon resonance based sensing, B. Turker and al., Conference on lasers and Electro-Optics 2011 descreve biochips dispondo na sua superfície nanoestruturas ajustadas de acordo com uma rede periódica. Essa rede de nanoestruturas é usada para acoplar uma luz incidente na onda de plasmon da interface metal/dielétrica da rede. 0 documento Localised plasmons in gold photonic nanocavities, S. Coyle and al., Quantum Electronics and Laser Science Conference 2002 apresenta quanto a isso uma superfície nanoestruturada com nanocavidades de ouro. Essas nanocavidades de ouro colocam em jogo o fenômeno físico dos plasmons de superfície localizados (LSPR) que difere do fenômeno SPR e que conduz a uma amplificação dos sinais plasmônicos.

Assim, nos dois documentos supracitados, não só a realização de redes e de cavidades a uma escala nanométrica é difícil, mas também é necessário recorrer a peças móveis para avaliar a variação de reflectividade da camada de metal em função do ângulo de incidência do feixe de luz.

Finalmente, os dispositivos mais compactos usam chips cuja superfície é côncava. Ora, a realização de peça de forma côncava é difícil de aplicar e dispendiosa.

Há portanto uma necessidade real de um dispositivo

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SPR compacto, que não apresenta peça em movimento, econômico, e compreendendo um chip simples de realizar permitindo assim efetuar análises SPR a baixos custos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO presente inventor considerou que um dispositivo de análise por SPR compreendendo um chip micro estruturado apresentando uma arquitetura particular permitia responder a essas exigências.

Será utilizado indiferentemente o termo, «chip» ou «chip micro estruturado» no seguimento do texto.

Será utilizado indiferentemente o termo, «radiação» ou «feixe» no seguimento do texto.

A figura 1 representa em corte protuberâncias de acordo com diferentes modalidades de realização da invenção.

A figura 2 representa em corte cavidades de acordo com diferentes modalidades de realização da invenção.

A figura 3 representa um chip micro estruturado de acordo com a invenção dotado de protuberâncias dispostas em forma de matriz.

A figura 4 representa a face superior de um chip micro estruturado de acordo com a invenção dotado de protuberâncias dispostas em forma de calhas ao longo do eixo X.

A figura 5 representa em corte uma protuberância sem tilt irradiada por uma radiação incidente monocromática colimada e polarizada.

A figura 6 representa em corte uma protuberância apresentando um tilt de um ângulo β, irradiada por uma radiação incidente monocromática colimada e polarizada.

A figura 7 representa um chip de acordo com uma

8/39 modalidade de realização da invenção apresentando distâncias entre as superficies planas que separam as protuberâncias e a base diferentes.

A figura 8 representa um dispositivo compreendendo um chip micro estruturado apresentando distâncias entre as superficies planas que separam as protuberâncias e a base idênticas.

A figura 9 representa um dispositivo compreendendo um chip micro estruturado apresentando distâncias entre as superficies planas que separam as protuberâncias e a base diferentes.

A figura 10 mostra uma curva de plasmon representativa de diferentes faixas angulares estudadas (sem tilt) .

A figura 11 mostra uma curva de plasmon representativa de diferentes faixas angulares estudadas (com tilt) .

A figura 12 representa um exemplo de imagem em uma câmera de 3 protuberâncias de um chip micro estruturado de acordo com a invenção.

A figura 13 representa um chip de acordo com a invenção compreendendo 16 protuberâncias das quais pelo menos uma é diferente das outras.

A figura 14 representa a percentagem de reflectividade em função do ângulo de incidência Θ.

A figura 15 representa as curvas de plasmons antes e após adesão da bactéria Escherichia coli sobre as protuberâncias funcionalizadas com ligantes específicos da bactéria.

A figura 16 representa as curvas de plasmons antes

9/39 e após adesão das toxinas shiga sobre as protuberâncias funcionalizadas com ligantes específicos das toxinas shiga.

CHIP MICRO ESTRUTURADO

Um primeiro objetivo da invenção é um chip micro estruturado para análise por ressonância dos plasmons de superfície (SPR) se apresentando na forma de um sólido constituído por uma base, por uma face superior em que pelo menos uma parte está coberta por uma camada de metal, e por pelo menos uma face lateral, caracterizada por a referida face superior ser dotada de zonas de tamanho micrométrico destinadas a receber espécies para analisar escolhidas entre

n protuberâncias	e m cavidades; e	por	quando	n+m>2	, as
referidas zonas	estarem separadas	umas	das	outras	por
superfícies planas	, com n indo de 1 a	j e	m indo	de 0 a	i< j
e i sendo números	inteiros.

De acordo com uma modalidade de realização particular, o chip não compreende cavidade (m=0). Em outras palavras, a face superior do chip é dotada de zonas de tamanho micrométrico destinadas a receber espécies para analisar escolhidas unicamente entre pelo menos uma protuberância.

De acordo com uma outra modalidade de realização, m é diferente de 0 (m>0). Em outras palavras, a face superior do chip é dotada de zonas de tamanho micrométrico destinadas a receber espécies para analisar escolhidas entre pelo menos uma protuberância e pelo menos uma cavidade.

Por «chip micro estruturado», se entende um chip que apresenta zonas de tamanho micrométrico destinadas a receber espécies para analisar. Assim, o chip não é necessariamente de tamanho micrométrico mas compreende zonas

10/39 que são de tamanho micrométrico.

Por «zonas de tamanho micrométrico», se entendem zonas que apresentam pelo menos duas dimensões sobre três de tamanho micrométrico, as referidas dimensões micrométricas indo de Ipm a lOOOpm, e preferencialmente de 10pm a 500pm.

A terceira dimensão da zona não é, portanto necessariamente micrométrica e pode apresentar distâncias compreendidas entre Imm e 20mm, de preferência entre Imm e lOmm.

As zonas de acordo com a invenção apresentam geometrias particulares na forma de protuberâncias e eventualmente cavidades que serão descritas em seguida. É ao nível dessas zonas cobertas por uma camada de metal que o efeito de plasmon será observado.

De acordo com a invenção, o chip compreende um número de zonas (isto é n protuberâncias e m cavidades) compreendido entre 1 (quando m=0 e n=l) e 500000, de preferência entre 10 e 10000 e mais preferencialmente entre 25 e 400.

De acordo com a invenção pelo menos uma parte da face superior é revestida pela camada de metal. Representa a superfície útil de detecção (também chamada superfície sensível a seguir). De acordo com a invenção, pelo menos uma zona de tamanho micrométrico escolhida entre n protuberâncias e m cavidades é revestida pela camada de metal.

De acordo	com	uma modalidade	de	realização
particular, a face camada de metal.	super	ior é inteiramente	coberta pela
Assim, de	acordo	com uma modalidade	de	realização
particular combinada	com	a anterior, não só	as	zonas mas

11/39 também as superfícies planas que separam as referidas zonas estão destinadas a receber espécies para analisar.

Para facilitar a descrição que segue, o referencial ortonormal direto (XYZ) é usado onde as superficies planas que separam as zonas são paralelas ao plano (XY) e onde o eixo Z é orientado para baixo.

Por «superfícies planas», se entendem superfícies planas ou sensivelmente planas que podem apresentar algumas falhas.

A superfície plana que separa duas zonas destinadas a receber espécies para analisar é chamada superfície interzonas. Assim, serão usados indiferentemente os seguintes termos: superfícies planas ou superfícies inter-zonas ou ainda superfícies planas inter-zonas. Mais especificamente:

- quando a superfície plana separa duas zonas que são cavidades, se fala de superfície inter-cavidade;

- quando a superfície plana separa duas zonas que são protuberâncias, se fala de superfície interpret uberânci a;

e

- quando a superfície plana separa uma zona que é uma cavidade e uma outra zona que é uma protuberância, se fala de superfície inter-cavidade -protuberância.

De acordo com uma modalidade de realização, as zonas são dispostas na forma de uma matriz sobre a face superior do chip. Assim, as superfícies planas separam as zonas ao mesmo tempo conforme o eixo X e o eixo Y.

De acordo com uma outra modalidade de realização, as zonas são dispostas em forma de calhas contínuas ao longo da face superior do chip. Assim, de acordo com essa

12/39 modalidade de realização, as superfícies planas separam as zonas conforme o eixo X ou conforme o eixo Y.

De acordo com uma modalidade de realização, quando n+m>2; as zonas são separadas por uma distância D conforme o eixo Y e por uma distância D' conforme o eixo X pelas superfícies planas (ou superfícies inter-zonas); D e D' estando compreendidos entre Opm (no caso de uma calha contínua conforme um dos eixos X ou Y) e 5mm, de preferência entre 50pm e 5mm, de preferência entre 200 e 1000 pm e de maneira particularmente preferida entre 300 e 700pm.

De acordo com uma modalidade de realização, quando n+m>2, as zonas são separadas por uma distância centro com centro CTC compreendida entre lOpm e 25000pm, de preferência entre 50pm e 5000pm e mais preferencialmente entre lOOpm e lOOOpm.

De acordo com uma modalidade de realização, as superfícies planas pertencem a planos paralelos ao plano (XY) ; a face superior apresenta então a forma de degraus de escada.

De acordo com uma outra modalidade de realização, as superfícies planas pertencem a um mesmo plano (XY) (isto é Z é constante).

Por «protuberância», se entende uma saliência sobre a face superior do chip, a referida saliência se encontrando entre duas superfícies planas (também chamadas superfície inter-zona).

A protuberância pode ser definida ou em 3 dimensões (referência XYZ) ou em 2 dimensões (corte em um plano).

Assim, se chama protuberância, a um volume em que todas as coordenadas se encontram na parte de cima de um

13/39 plano imaginário ligando as duas superfícies planas interzonas adjacentes à referida protuberância.

Em seguida, a protuberância de acordo com a invenção, descrita no plano (YZ).

Assim uma protuberância de acordo com a invenção, descrita no plano (YZ) , é definida por pelo menos uma curva de raio de curvatura R médio e/ou pelo menos uma linha reta.

Quando a protuberância é unicamente definida por uma curva, então a curva é necessariamente convexa (isto é raio de curvatura conforme o eixo +Z).

Quando a protuberância é definida por pelo menos uma curva e pelo menos uma linha reta, então a curva pode ser ou côncava (isto é raio de curvatura conforme o eixo -Z), ou convexa.

De acordo com uma modalidade de realização particular, a protuberância é definida por duas linhas retas separadas por uma curva.

De acordo com uma modalidade de realização particular combinada com a anterior, as duas linhas retas são paralelas.

De acordo com uma outra modalidade de realização que pode ser combinada com a anterior, as duas linhas retas apresentam dimensões diferentes.

Por «cavidade», se entende uma concavidade na face superior do chip, a referida concavidade se encontrando entre duas superfícies planas (também chamadas superfície interzonas)

A cavidade pode ser definida ou entre 3 dimensões (referência XYZ) ou em 2 dimensões (corte em um plano).

Assim, se chama cavidade, a um volume em que todas

14/39 as coordenadas se encontram sob um plano imaginário ligando as duas superfícies planas inter-zona adjacentes à referida cavidade.

Em seguida, a cavidade será descrita no plano (YZ) .

Assim, uma cavidade de acordo com a invenção é descrita no plano (YZ) e é definida por pelo menos uma curva de raio de curvatura R médio e/ou pelo menos uma linha reta.

Quando a cavidade é unicamente definida por uma curva, então a curva é necessariamente côncava (isto é raio de curvatura conforme o eixo -Z).

Quando a cavidade é definida por pelo menos uma curva e pelo menos uma linha reta, então a curva pode ser ou

côncava,	ou convexa (isto é	raio de curvatura	conforme o eixo
+ Z) .	De acordo com	uma modalidade	de realização

particular, a cavidade é definida por duas linhas retas separadas por uma curva.

De	acordo	com uma modalidade	de	realização
particular combinada paralelas.	com a anterior, as duas	linhas	retas são
De	acordo	com uma outra modalidade de	realização

que pode ser combinada com a anterior, as duas linhas retas apresentam dimensões diferentes.

Assim, de acordo com uma modalidade de realização particularmente preferida, as zonas do chip (n protuberâncias e m cavidades), descritas no plano (YZ), são definidas unicamente por uma curva de raio de curvatura médio R (côncavo para uma cavidade e convexo para uma protuberância); o raio de curvatura R estando compreendido entre 0,lmm e 600mm, de preferência entre 0,3mm e 300mm.

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A título de exemplo, se podem mencionar n protuberâncias e m cavidades de forma semiesférica, semieliptica ou semicilindrica (referência (XYZ)).

De acordo com uma modalidade de realização preferida da invenção, as n protuberâncias e m cavidades apresentam uma forma semicilindrica na referência (XYZ).

De acordo com uma modalidade de realização particular, o raio de curvatura das zonas (i. é. das n protuberâncias e das m cavidades) é perpendicular ao plano (XY) , isto é conforme o eixo Z.

De acordo com uma outra modalidade de realização, o raio de curvatura das zonas não é perpendicular ao plano (XY) (isto é, as n protuberâncias e as m cavidades apresentam uma oscilação ou tilt).

De acordo com uma modalidade de realização particular, as zonas destinadas a receber espécies para analisar (as n protuberâncias e as m cavidades) apresentam um raio de curvatura R idêntico.

De acordo com a invenção, a base do chip pode ser uma superfície plana ou curva, ou uma aresta, ou um ponto.

De acordo com uma modalidade de realização preferida, a base do chip é uma superfície plana que, de modo preferido, é paralela às superfícies planas (também chamadas superfícies inter-zonas).

De acordo com uma outra modalidade de realização que pode ser combinada com a anterior, as superfícies planas pertencem ao mesmo plano (XY). Em outras palavras, se a base é paralela às referidas superfícies planas, as distâncias entre as superfícies planas e a base do chip são idênticas. Nesse caso se diz que a face superior é paralela à base.

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De acordo com uma outra modalidade de realização, as superficies planas pertencem a múltiplos planos paralelos ao plano (XY) . Em outras palavras, se a base é paralela às referidas superficies planas, as distâncias entre as superficies planas e a base do chip são diferentes (face superior em forma de degrau de escada).

Por «distâncias entre as superficies planas (ou superficies inter-zonas) e a base», é feita referência às alturas do chip, quer dizer ao comprimento da perpendicular que liga as superficies e a base ou um prolongamento de base.

De acordo com a invenção, a (ou as) face(s) lateral(laterais) do chip pode(podem) ser plana(s) perpendicular(es) ou não à base e/ou à face superior do chip) ou curva(s).

De acordo com uma modalidade de realização preferida, a (ou as) face(s) lateral(laterais) do chip é(são) plana (s) .

De acordo com uma outra modalidade de realização preferida, pelo menos uma face lateral do chip é perpendicular à base e/ou à face superior.

De acordo com uma outra modalidade de realização, a face superior é paralela à base do chip.

De acordo com uma modalidade de realização particular da invenção, o chip é unido a um prisma bem conhecido do estado da técnica.

Assim, de acordo com uma modalidade de realização particular, o chip apresenta a forma de um paralelepipedo (isto é um chip mostrando superficies planas que pertencem a um mesmo plano (XY) e uma base paralela às referidas superficies planas). De acordo com essa modalidade de

17/39 realização, as alturas das superfícies laterais são de pequenas dimensões da ordem de 0,lmm a 20mm, de preferência de Imm a lOmm).

Por espécies para analisar, se entendem por exemplo materiais, gases ou espécies biológicas tais como o DNA simples ou de cadeia dupla, proteínas, bactérias, toxinas, vírus, micoplasmas, agentes químicos ou qualquer outra espécie biológica ou química suscetível de interagir com outras espécies biológicas ou químicas.

De acordo com uma outra modalidade de realização preferida, as espécies para analisar são espécies biológicas, tais como bactérias patogênicas como Salmonella spp., Listeria monocytogenes Clostridium difficile ou ainda Campylobacter spp.

presente inventor demonstrou que era possível utilizando o chip de acordo com a invenção estudar vantajosamente estirpes de Escherchia coli produtoras de toxinas shiga (STEC), porque permite a análise simultânea de moléculas grandes (elas mesmas bactérias), mas também toxinas pequenas que elas produzem.

De acordo com uma outra modalidade preferida da invenção, as n protuberâncias e m cavidades serão funcionalizadas com diferentes anticorpos monoclonais específicos de biomarcadores.

A figura 1 representa um corte de acordo com o plano (ZY) de uma protuberância de acordo com diferentes modalidades de realização. Em cada uma dessas figuras, a protuberância é representada por uma superfície no plano (XY) (ou por um volume na referência XYZ) em que todos os pontos se situam na parte de cima (Z negativo) de uma linha reta

18/39 imaginária a pontilhado (ou plano imaginário na referência

XYZ para um volume) ligando as duas superfícies planas adjacentes à protuberância:

no caso a) : a protuberância é definida unicamente por uma curva de forma convexa de raio de curvatura R (isto é apresentando um raio de curvatura conforme o eixo +Z);

no caso b) :

a protuberância é definida por duas linhas retas paralelas separadas por uma curva de raio de curvatura R de forma convexa;

no caso c) : a protuberância é definida por duas linhas retas paralelas separadas por uma curva de raio de curvatura R de forma côncava (isto é apresentando um raio de curvatura conforme o eixo -Z) .

figura 2 representa um corte de acordo com plano (ZY) de uma cavidade de acordo com diferentes modalidades de realização. Em cada uma dessas figuras, a cavidade é representada por uma superfície no plano (XY) (ou por um volume na referência XYZ) em que todos os pontos se situam abaixo (Z positivo) de uma linha reta imaginária representada a pontilhado (ou plano imaginário na referência XYZ para um volume) ligando as duas superfícies planas adjacentes à cavidade no caso a): a cavidade é definida unicamente por uma curva de forma côncava de raio de curvatura R; (isto é apresentando um raio de curvatura conforme o eixo -Z);

no caso b): a cavidade é definida por duas linhas retas paralelas separadas por uma curva de forma côncava de raio de curvatura R;

- no caso c): a cavidade é definida por duas linhas retas paralelas separadas por uma curva de raio de curvatura

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R de forma convexa (isto é apresentando um raio de curvatura conforme +Z).

A figura 3 representa um chip micro estruturado 3 no qual a face superior 4 que compreende superfícies planas inter-protuberâncias é paralela à base 5 do chip 3. A face superior 4 está coberta por uma camada de metal 2 e é dotada de protuberâncias 1 sensíveis ao efeito de plasmon, destinadas a receber espécies para analisar.

Na figura 3, as protuberâncias 1 são separadas umas das outras por uma distância D conforme o eixo Y e por uma distância D' conforme o eixo X por superfícies planas (também chamadas superfícies inter-protuberâncias).

chip micro estruturado 3 pode ser feito de qualquer tipo de materiais que permitem a propagação da luz. Se podem mencionar por exemplo, o vidro, um cristal ou matérias plásticas.

De acordo com uma modalidade de realização preferida, por razões de custos, o chip 3 é feito de matéria(s) plástica (s) como por exemplo o PMMA (polimetilmetacrilato), o PC (Policarbonato), o PS (Poliestireno), o Su-8 (resina fotossensível negativa à base de epóxi) ou o PDMS (Polidimetilsiloxano).

De acordo com uma modalidade de realização particular, quando o chip está unido a um prisma, pode ser feito de um material diferente do do prisma.

A camada de metal 2 que cobre a camada superior 4 do chip 3 (e em particular as protuberâncias 1) pode ser feita com diversos metais tais como o ouro, a prata, a platina ou o alumínio.

De acordo com uma modalidade de realização

20/39 preferida, devido às suas excelentes propriedades anticorrosivas, a camada de metal 2 é de ouro.

A espessura da camada de metal 2 está compreendida entre lOnm e 200nm, de preferência entre 30nm e lOOnm e mais preferencialmente ainda entre 40nm e 50nm.

De acordo com uma outra modalidade de realização combinada com as anteriores, uma camada fina de cromo é usada como camada de pré-fixação do ouro sobre a face superior 4 do chip 3.

A figura 4 representa a face superior de um chip micro estruturado de acordo com a invenção inteiramente coberto por uma camada de metal 2, o referido chip micro estruturado é dotado de protuberâncias que são dispostas em forma de calhas ao longo do eixo X formando assim 4 colunas C₄-C₄. Na figura 4, d representa o diâmetro da calha e CTC representa a distância centro com centro entre duas calhas sucessivas.

O chip de acordo com a invenção permite adaptar a sensibilidade de cada zona (isto é das n protuberâncias e m cavidades) a fim de estudar espécies biológicas muito diferentes.

De acordo com uma modalidade de realização, pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades apresenta um raio de curvatura diferente dos outros.

A figura 5 representa um aumento em corte da figura 3 da protuberância de superfície curva convexa 1 do chip 3 (coberto com a camada de metal 2) que é irradiada por um feixe colimado monocromático de ângulo de incidência θ e polarizado linearmente seguindo a polarização TM.

A protuberância, de forma semicilíndrica (na

21/39 referência XYZ) apresentando uma superfície definida por uma única curva (no plano ZY) nas figuras 3 e 5, é caracterizado pelo seu raio de curvatura R e pelos dois semiângulos α (definindo assim um ângulo total de 2a).

raio de curvatura R e o semiângulo α vão assim definir o comprimento da linha d, ou ainda o diâmetro da referida cavidade.

Devido à reflexão sobre a superfície sensível (ou protuberância 1), o ângulo de incidência sobre as duas extremidades A e C vão ser respectivamente, para um ângulo de incidência médio do feixe colimado de Θ, de θ!=θ-2α e de θ₃=θ+2α. Assim, o feixe refletido (θι para o ponto A, θ₂ para o ponto B, θ₃ para o ponto C) pela referida protuberância 1 apresenta uma largura angular ΔΘ (/\Q=Q₃-Q₁) igual a 4a,

centrada <	em	torno do ângulo 0_médlo (correspondente	ao	ângulo	θ2
na figura	5)	. Nesse caso, temos 0_médlo =θ2=θ ·
	É	importante notar que a escolha	do	raio	de
curvatura	R	das n protuberâncias e m cavidade	do	chip	de

acordo com a invenção é muito importante porque vai determinar, em função dos parâmetros físicos essenciais (índice óptico do chip n_p, índice óptico do meio dielétrico externo n_e, ângulo de incidência médio do feixe colimado θ e o tamanho das espécies biológicas que se desejam analisar), a sensibilidade e a dinâmica angular da medida para cada uma das n protuberâncias e m cavidades.

Por «dinâmica angular da medição» se entende a faixa angular que vai poder ser visualizada no momento das análises.

Por «sensibilidade», se entende a variação mais pequena de espessura óptica que se vai poder medir sobre a

22/39 superfície sensível.

Com efeito, se o raio de curvatura é muito grande, se vai aproximar de um plano, portanto os ângulos θι e 63 estarão muito próximos (logo a faixa angular de análise ΔΘ será muito pequena) tornando essa configuração particularmente adaptada para a análise de pequenas moléculas (isto é uma boa sensibilidade) . Pelo contrário, um raio de curvatura muito pequeno permitirá observar a curva de plasmon no seu conjunto, certamente com uma sensibilidade de medição mais baixa mas mais adaptada para a análise de moléculas grandes.

É assim possível de acordo com a invenção, adaptar a sensibilidade de medição para diferentes espécies estudadas.

De acordo com uma outra modalidade de realização que pode ser combinada com a anterior, pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades apresenta um tilt (ou oscilação) de um ângulo β.

De acordo com essa modalidade de realização, o raio de curvatura R é desviado em relação ao eixo Z.

A figura 6 representa um aumento em corte de uma protuberância de superfície curva convexa 41 de um chip 43 (cuja face superior está coberta por uma camada de metal 42) que apresenta um tilt de um ângulo β e que é irradiada por um feixe monocromático colimado com um ângulo de incidência médio θ e polarizado linearmente seguindo a direção transversal magnética TM.

No caso de um tilt β da superfície sensível (aqui da protuberância) em relação à perpendicular ao plano médio da superfície sensível, sendo o plano médio definido como o

23/39 plano paralelo às superfícies planas inter-protuberâncias, o feixe refletido apresentará ainda uma largura angular ΔΘ igual a 4a mas dessa vez centrada em torno do ângulo médio Y' médio (representado por θ₂ na figura 3) tal como Y'_médio =θ + 2β para uma superfície convexa.

De acordo com uma modalidade de realização, o ângulo β é definido do seguinte modo: 0^Ω<β·^80^Ω, de preferência 15²«d β<·45^Ω.

É assim possível de acordo com a invenção ajustar, para cada uma das n protuberâncias e m cavidades ao mesmo tempo a largura angular estudada, mas também o ângulo médio (isto é θ₂ ou θ'₂ representado na figuras 5 e 6 de acordo com a protuberância seja inclinada ou não) dessa faixa angular, permitindo assim adaptar a sensibilidade de medições para diferentes espécies dentro de um mesmo chip no momento da mesma experiência.

Assim, de acordo com uma modalidade de realização particular, pelo menos uma das zonas (isto é pelo menos uma das n protuberâncias e das m cavidades) apresenta ao mesmo tempo um raio de curvatura diferente e uma orientação diferente em relação às outras zonas do chip.

De acordo com uma outra modalidade de realização, que pode ser combinada com as anteriores, pelo menos uma distância entra a base e as superfícies planas (também chamada superfície inter-zona) é diferente das outras.

A figura 7 representa um chip 33 cuja face superior 44 que está coberta por uma camada de metal 22 é dotada de protuberâncias de forma curva 11. As faces laterais (55, 66) do chip 33 são perpendiculares à base 77 e às superfícies planas.

24/39

As distâncias que separam as superfícies planas entre as protuberâncias 11 (ou superfícies interprotuberâncias) e a base 77 são todas diferentes umas das outras com d4<d3<d2<dl. Na figura 7, as superfícies interzonas pertencem a múltiplos planos paralelos ao plano (XY) (5 planos representados).

chip de acordo coma invenção pode ser realizado por diferentes métodos que compreendem necessariamente uma etapa de fabricação do chip seguida de uma etapa de depósito de pelo menos uma camada fina de metal.

Entre os métodos de fabricação, se podem mencionar a injeção de alta pressão, a usinagem mecânica direta, a estampagem a quente, a gravação com plasma, a fotolitografia ou a ablação por laser.

	De	acordo com	uma	modalidade	de	realização
preferida,	o	chip é fabricado por	injeção de	alta	pressão.
	A	realização do	chip	de acordo	com	a invenção
necessita	da	utilização de	um molde de forma	côncava a fim de
efetuar uma	protuberância	de forma convexs	1 o	que permite

assim diminuir o custo de produção. Com efeito, um perito na técnica sabe que a etapa mais dispendiosa no momento do desenvolvimento de uma produção de componentes pelo método de injeção de alta pressão é a realização do molde (ou «master») . 0 fato de ter uma superfície final da peça a ser realizada com protuberâncias convexas vai permitir fazer um molde com formas côncavas, o que equivale à remoção de matéria no «master», o que é muito simples de realizar com métodos de usinagem mecânica convencional.

Entre os métodos de depósito de camadas finas de metal, se podem mencionar a pulverização catódica, evaporação

25/39 no vácuo, ou técnicas de depósito a frio.

As técnicas de depósito a frio são especialmente úteis no caso de um suporte de plástico porque o plástico não aguenta subidas de temperatura significativas.

DISPOSITIVO DE ANÁLISE

As figuras 8 e 9 representam diferentes modalidades de realização de dispositivos de medição compreendendo o chip micro estruturado descrito precedentemente.

Assim, um outro objetivo da presente invenção é um dispositivo de análise por SPR compreendendo:

- uma fonte de luz 7 destinada a gerar um feixe incidente;

- eventualmente um sistema óptico de colimação 8;

- um sistema de polarização 6;

- um chip micro estruturado (3; 33; 43; 53; 63) tal como descrito precedentemente disposto no trajeto óptico do referido feixe incidente;

- eventualmente um sistema óptico de imagiologia (9; 6 9)

- um detector (10; 70).

De acordo com uma modalidade de realização, o acoplamento entre a energia do feixe incidente e a onda de superfície da superfície de metal do chip é efetuada pelo próprio chip.

De acordo com uma outra modalidade de realização, o meio de acoplamento é um prisma, um guia de onda ou uma rede de difração.

Assim, de acordo com uma modalidade de realização particular, quando o acoplamento é efetuado por um prisma, o chip de acordo com a invenção é unido ao referido prisma de

26/39 tal modo que a base do chip é colocada em contato com a face superior do prisma que não apresenta superfície de metal com a ajuda de um óleo de acoplamento de índice que é um método bem conhecido do perito na técnica.

De acordo com um outra modalidade de realização, o chip é unido a um guia de onda.

De acordo ainda com outra modalidade de realização particular, o chip é unido a uma rede de difração.

De acordo com a invenção, a fonte 7 pode ser por exemplo uma lâmpada de vapor de mercúrio, uma lâmpada de incandescência, um diodo de laser, um laser, um diodo eletroluminescente (LED) ou um diodo eletroluminescente orgânico (OLED).

De acordo com uma modalidade de realização preferida, a fonte 7 é um LED monocromático. Por monocromático, se entende um LED cuja largura espectral de meia altura não excede 40nm.

De acordo com a invenção, podem ser utilizadas diferentes gamas de comprimento de onda tais como o visível ou infravermelho próximo (IR) .

De acordo com uma modalidade de realização preferida, um comprimento de onda compreendido entre 790 e 825 nm (IR próximo) é utilizado.

De acordo com a invenção o feixe pode ser colimado. Para isso, diferentes técnicas bem conhecidas do perito na técnica poderão ser usadas.

A título de exemplo, se pode utilizar como sistema óptico de colimação 8 uma primeira lente convergente que permite focalizar a luz emitida pela fonte 7 sobre um furo de diâmetro Φ, estando o referido furo no plano focal de uma

27/39 lente convergente o que permite gerar o feixe colimado.

De acordo com uma modalidade de realização, o sistema óptico de colimação 8 está integrado na fonte 7.

De acordo com a invenção, o sistema de polarização 6 permite trabalhar de modo Transversal Magnético (ou TM, ou polarização -p).

A titulo de exemplo, se pode mencionar um polarizador linear ou um cubo separador de polarização.

De acordo com uma modalidade de realização preferida, o sistema de polarização 6 permite oscilar facilmente de uma polarização TM para uma polarização TE (Transversal Elétrica), e inversamente. A fim de evitar qualquer movimento de peça, isso pode ser realizado com a ajuda de uma lâmina de cristais líquidos, conduzida por correntes e tensões elétricas.

De acordo com a invenção, o detector (10; 70) pode ser por exemplo uma câmera CCD, CMOS ou ser uma matriz de detectores ópticos.

De acordo com uma modalidade de realização preferida, as câmeras funcionam em 8, 10, 12 ou 16 bits e de preferência em 10 ou 12 bits.

De acordo com uma modalidade de realização, o dispositivo compreende além disso um sistema óptico de imagiologia (9; 69) que permite realizar a imagem do chip micro estruturado (3; 33; 43; 53; 63) no detector (10; 70).

O sistema óptico de imagiologia (9; 69) deve ser suficientemente aberto para aceitar todas as radiações provenientes do chip micro estruturado. A geometria convexa das n protuberâncias de que é dotado o chip de acordo com a invenção permite especialmente fazer convergir os feixes após

28/39 reflexão da radiação incidente sobre essas últimas, tornando assim o sistema óptico de imagiologia (9; 69) muito mais simples de realizar.

Para além disso, o sistema óptico de imagiologia (9; 69) é escolhido para que a imagem de 2 protuberâncias ou de 1 protuberância e de 1 cavidade do chip micro estruturado correspondam a 2 posições diferentes no mesmo detector (10; 70) .

Finalmente de maneira vantajosa, o sistema óptico apresenta um aumento que maximiza o número de pixels úteis no detector (10; 70).

A titulo de exemplo como sistema óptico de imagiologia (9; 69), se podem mencionar 2 lentes planoconvexas montadas em afocal.

De acordo com a invenção, se chama face de entrada à face pela qual entra uma radiação incidente no chip e face de saida à face pela qual sai a radiação refletida pela superfície sensível.

Na figura 8, a fonte 7 emite uma radiação incidente, que é colimada com a ajuda do sistema de colimação 8 e polarizada com a ajuda do polarizador 6 antes de chegar à face de entrada 54 do chip 53 (coberto por uma camada de metal 52) sob uma incidência dada. A radiação é desviada para a sua entrada no chip 53 e vem se refletir sobre as protuberâncias 51.

O sistema de imagiologia 9, situado depois da face de saída 57 do referido chip 53, permite coletar a intensidade das radiações refletidas e realizar a imagem das protuberâncias irradiadas 51 no detector 10.

O dispositivo representado na figura 9 compreende

29/39 um chip 61 (coberto por uma camada de metal 62) cujas faces laterais são perpendiculares à base e cujas distâncias entre as superficies que separam as protuberâncias 61 da base são diferentes umas das outras.

A figura 9 representa uma modalidade de realização na qual a radiação incidente emitida pela fonte (não representada na figura 9) que chega perpendicularmente sobre a face de entrada 64 (correspondente à face lateral) , não é desviada quando atravessa o chip 63, e irradia o conjunto das diferentes protuberâncias 61.

sistema de imagiologia 69 e o detector 70 estão situados depois da face de saida 67, que nessa modalidade de realização corresponde à base do referido chip 63, permitindo assim coletar a intensidade das radiações refletidas e efetuar a imagem das protuberâncias 61.

De acordo com uma modalidade de realização, o sistema óptico de imagiologia (9; 69) pode ser integrado diretamente na face de saida (57; 67) do chip (53; 63) na forma de uma matriz de microlentes.

De acordo com uma modalidade de realização preferida, o sistema de colimação 8 e eventualmente o polarizador 6 se tornaram integrantes da face de entrada (54; 64) e/ou o sistema óptico de imagiologia (9; 69) e o detector (10; 70) se tornaram integrantes da face de saida (57; 67).

PROCESSO DE MEDIÇÃO

Um outro objetivo da invenção se refere a um processo de medição por SPR que compreende as etapas seguintes:

detectar um estado inicial (i) irradiando a superfície sensível em pelo menos uma das n protuberâncias e

30/39 m cavidades pela superfície de entrada do chip micro estruturado com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado e eventualmente colimado e (ii) detectando simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos um das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída;

pôr em contato pelo menos um fluido com a superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades;

- irradiar a superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades contendo o referido fluido pela face de entrada do chip micro estruturado com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado, e eventualmente colimado; e detectar simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades que saem pela face de saída para seguir em tempo real e sem interrupção modificações de espessura óptica em pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades; com n>0 e m>0.

- imobilizar ligantes sobre a face superior coberta por uma camada de metal de um chip micro estruturado tal como definido precedentemente;

detectar um estado inicial (i) irradiando a superfície sensível de pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades pela face de entrada do chip micro estruturado

31/39 com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado e eventualmente colimado; e (ii) detectando simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída;

pôr em contato pelo menos um fluido com a superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades do referido chip micro estruturado;

- irradiar a superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades contendo o referido fluido pela face de entrada do chip micro estruturado com a ajuda de feixe incidente monocromático previamente polarizado, e eventualmente colimado; e detectar simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída para seguir em tempo real e sem interrupção modificações de espessura óptica em pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades;

com n>0 e m>o.

De acordo com a invenção, a imobilização dos ligantes sobre a superfície superior pode ser realizada com diversas técnicas bem conhecidas do perito na técnica como por exemplo a imobilização por ligação química covalente ou por eletro copolimerização de pirrole sobre a superfície de metal.

Por fluido se entende um gás ou um líquido.

De acordo com uma modalidade de realização preferida da invenção, o fluido compreende pelo menos uma

32/39 espécie biológica.

Esses processos de medição estão adaptados para medir, de maneira não limitativa, variações de conformação de moléculas imobilizadas sobre uma superfície, interações biomoleculares, índices ópticos de fluidos (gás ou líquidos), a qualidade de uma superfície (paralelismo, rugosidade microscópica, qualidade de um depósito de camadas finas) ou ainda a presença de nanoconchas de metal próximo da superfície.

Esses processos de medição permitem também medir parâmetros externos tais como o índice óptico do meio exterior que permite tornar a subir para o valor do ângulo limite de refração.

De acordo com uma modalidade de realização, o feixe incidente entra perpendicularmente pela face de entrada 64 do chip 63.

A detecção da intensidade das radiações refletidas na faixa angular ΔΘ (ou ΔΘ') pelo detector (10; 70) permite gerar toda ou uma parte da curva de plasmon cujas principais zonas de interesse são as seguintes:

- o mínimo de sensibilidade de plasmon;

- a faixa angular na qual a sensibilidade é a mais intensa (isto é lá onde a derivada do plasmon é a mais relevante) também chamada «flanco do plasmon»;

-a zona nas imediações do angulo de refração limite (onde se passa de um regime de refração para um regime de reflexão total).

As figuras 10 e 11 representam uma curva de plasmon de 3 zonas escolhidas entre n protuberâncias e m cavidades com n+m=3 apresentando faixas angulares de estudos diferentes

33/39 (I^a protuberância tendo uma faixa angular Δθ2 para a figura 10 e ΔΘ/ para a figura 11, 2^a cavidade e/ou protuberância tendo uma faixa angular Δθ2 para a figura 10 e t\Q₂' para a figura 11 e 3^a cavidade e/ou protuberância tendo uma faixa angular Δθ₃ para a figura 10 e l\Q₃' para a figura 11) .

A figura 10 representa as faixas angulares de 3 zonas escolhidas entre n protuberâncias e m cavidades com n+m=3 quando β = 0 (sem tilt) enquanto a figura 11 representa as faixas angulares de 3 escolhidas entre n protuberâncias e m cavidades com n+m=3 quando β/O (com tilt).

Na figura 10, isto é quando β = 0 (sem tilt), as 3 faixas estudadas estão centradas sobre o ângulo θ. A largura de cada uma das zonas é definida pelo ângulo no vértice 2a e o raio de curvatura R de cada uma das protuberâncias ou protuberância e cavidades. A escolha do ângulo θ é portanto primordial para observar o melhor possível todas as zonas de interesse. É assim possível, em função do raio de curvatura da zona estudada, explorar uma faixa angular da curva de plasmon maior ou menor. Se as zonas não apresentam tilt β (é o caso para a figura 10) essa faixa angular estará sempre centrada no mesmo valor Θ.

Na figura 11, isto é quando β/O (com tilt), as três faixas angulares Δθ'₂, ΔΘ' ₂ e ΔΘ' ₃ estão centradas respectivamente sobre os ângulos γ'ι, γ'₂, θ γ'₃, os referidos ângulos γ'ι, γ'₂ e γ'₃ sendo definidos cada um por ângulos β diferentes. Nesse caso de figura (com tilt), as faixas angulares não estão centradas no mesmo valor. Assim, é possível explorar uma faixa angular variável da curva de plasmon tendo um feixe incidente de um único ângulo, permitindo assim não ter necessidade das peças móveis

34/39 habitualmente usadas para efetuar uma rotação angular do feixe incidente.

De acordo com uma outra modalidade de realização, o processo de medição compreende além disso uma etapa em que uma imagem das n protuberâncias e m cavidade é efetuada.

A figura 12 representa a imagem de 3 zonas escolhidas entre n protuberâncias e m cavidades com n+m=3 (curva de plasmon da figura 11) em um detector de matriz no qual a tira negra entre as tiras de luz (em variações de cinzento) representa as superfícies inter-cavidades e/ou inter-protuberâncias que têm uma reflectividade constante porque são superfícies planas.

De acordo com a invenção, se pode assim, conhecendo o ângulo incidente θ constante e fixado pela arquitetura do sistema óptico (já que nenhuma peça mecânica está em movimento), escolher a faixa angular ΔΘ que será eventualmente representada por imagem no detector (escolhendo o raio de curvatura R e o ângulo a, ou o raio de curvatura R e o diâmetro d, porque α e d se deduzem um do outro através do raio de curvatura R) e o ângulo γ' _méd_lo (com a escolha do tilt β) da micro estrutura em função das diferentes espécies para analisar com γ' _médlo =θ + 2β. Essa escolha pode ser feita por cada uma das n protuberâncias e m cavidades, o que permite a adaptação a vários tipos de espécies imobilizadas sobre o mesmo chip.

Do mesmo modo, a escolha pode ser feita em função do tipo de espécies que virão interagir com as espécies previamente imobilizadas no chip: se pode assim «adaptar» cada uma das protuberâncias ou protuberâncias e cavidades à espécie pesquisada.

35/39

Assim, um outro objetivo da invenção se refere à utilização do dispositivo de acordo com a invenção para a medição de interações moleculares.

A invenção é ilustrada com a ajuda dos exemplos que são dados unicamente a titulo de ilustração e não são limitativos.

EXEMPLO 1: CHIP DE PROTEÍNAS - ACOMPANHAMENTO E CORREÇÃO DO ÍNDICE DO MEIO EXTERIOR EM TEMPO REAL EM CINÉTICA DE INTERAÇÕES

Um chip micro estruturado feito de policarbonato (PC) compreendendo 16 protuberâncias está representado na figura 13.

Uma camada de ouro com uma espessura de 48nm foi depositada por pulverização catódica sobre a face superior do referido chip a fim de obter um efeito de plasmon.

Em polarização TM, o mínimo de reflectividade é obtido perto do ângulo θ =28^Ω.

As 16 protuberâncias são repartidas seguindo uma matriz regular de 4x4 superfícies semicilíndricas de diâmetro d=500pm e de comprimento L=500pm cada uma espaçada por uma distância centro a centro (CTC) de Imm.

Quatro espécies diferentes foram imobilizadas de modo covalente através de uma eletropolimerização de uma película de polipirrol funcionalizada com ligantes de interesse.

Assim, as espécies seguintes nas protuberâncias são:

- na linha Li: anticorpos monoclonais anti-ratos na linha L₂: anticorpos monoclonais dirigidos contra a hormona gonadotrofina coriônica humana (hCG,

36/39 incluída como biomarcador em várias patologias cancerosas)

- na linha L₃ : anticorpos monoclonais dirigidos contra a bactéria Listeria monocytogenes

- na linha L₄: da BSA (« albumina de soro bovino»).

chip é irradiado com uma radiação incidente polarizada, colimada e monocromática e a intensidade das radiações refletidas pelas protuberâncias é detectada por um detector de tipo CMOS.

raio de curvatura das superfícies semicilíndricas das protuberâncias das colunas C₄, C₂, e C₃, é de 9,5mm (equivalente a uma zona angular de estudo A0_a sobre a curva de plasmon de cerca de 3^Ω) e as protuberâncias da coluna C4 apresentam um raio de curvatura de l,9mm (equivalente a uma zona angular de estudo A0b de cerca de 15^Ω) . As faixas angulares A0a e A0_b correspondem respectivamente às faixas angulares Δθ₄ e Δθ₃ na figura 10.

Um líquido de um índice óptico desconhecido contendo proteínas hCG é posto em contato com o chip nas protuberâncias. Uma variação característica do sinal é observada em função do tempo sobre as protuberâncias da linha L₂ mas não sobre as outras porque uma interação específica ocorre sobre os anticorpos monoclonais anti-hCG e não sobre as outras proteínas imobilizadas.

Para além disso, visto que a protuberância situada em (L_2f C₄) apresenta um raio de curvatura tal que qualquer curva de plasmon pode ser visualizado no detector, o valor angular do ângulo de refração limite pode ser facilmente determinado e assim é possível deduzir o índice do meio líquido desconhecido.

Assim conhecendo esse índice é possível

37/39 determinar com precisão a variação do sinal sobre as protuberâncias situadas em (L₂,Ci), (L₂, C₂) e (L₂,C₃), não correlacionando a variação de sinal ligado ao meio exterior da variação de sinal ligada à adesão de proteínas hCG sobre os anticorpos monoclonais anti-hCG.

EXEMPLO 2: CHIP PARA 0 ESTUDO DE BACTÉRIAS ESCHERCHIA COLI EMISSORAS DE TOXINAS SHIGA

Nesse exemplo, foi estudada a presença de bactérias Escherchia coli emissoras de toxinas shiga (STEC) em uma amostra proveniente da indústria agroalimentar.

Exemplos de bactérias dessa categoria são as estirpes 0157:H7, O26:H11 ou ainda 0103:H2. As bactérias desse tipo e as toxinas shiga que elas produzem estão na origem de perturbações intestinais graves, para as quais o prognóstico vital pode ser envolvido. 0 tamanho e o peso molecular dessas toxinas shiga (alguns nanômetros de diâmetro e um peso molecular de cerca de 68kDA) são muito diferentes do de uma bactéria Escherichia coli (cerca de 10 milhões de vezes mais pesada). Por conseguinte, os sinais de plasmon para a adesão desses 2 tipos de famílias são muito diferentes. Com aparelhos SPR convencionais, não se pode portanto estudar ao mesmo tempo essas bactérias e essas toxinas no momento de uma mesma experiência e em tempo real. Com efeito, no caso de adesão de bactérias, a curva vai se desviar angularmente perto de 0,1^Ω ao passo que só vai mexer menos de 0,01^Ω no caso de toxinas (o que não é facilmente detectável por métodos SPR convencionais).

Esse exemplo demonstra que utilizando um chip micro estruturado de acordo com a invenção que apresenta uma arquitetura particular, é possível estudar essas 2 espécies

38/39 biológicas de tamanhos diferentes durante uma única experiência.

Um chip feito de policarbonato compreendendo duas protuberâncias semicilíndricas, de diâmetro 600pm e de comprimento 800pm é realizado.

A face superior do referido chip está coberta por uma camada de cromo com uma espessura de 2nm e por uma camada de ouro com uma espessura de 48nm ambas depositadas por pulverização catódica a fim de obter um efeito de plasmon.

A primeira protuberância apresenta um til nulo (β = 0) e a segunda protuberância apresenta um tilt de valor β = 0,5^Ω.

chip é irradiado com uma radiação incidente incidente polarizada, colimada e monocromática e a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível das protuberâncias é detectada por um detector de tipo CCD.

ângulo médio de incidência do sistema óptico é fixado mecanicamente pela arquitetura do sistema e é igual a 26,5^Ω.

raio de curvatura das duas protuberâncias é também diferente: ll,5mm para a primeira protuberância (correspondente a uma faixa angular de estudo ΔΘ de 3²) e 100mm para a segunda (o que corresponde a uma faixa angular de análise ΔΘ' de 0,3^Ω) (figura 14).

Anticorpos monoclonais dirigidos contra a bactéria 0157:H7 são imobilizados de modo covalente e de modo uniforme sobre a primeira protuberância e dos anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contra as toxinas shiga que a bactéria segrega são imobilizadas sobre a segunda protuberância.

39/39

As duas curvas de plasmon geradas a partir dessas 2 protuberâncias da reação apresentam o mesmo ângulo de ressonância de plasmon (cerca de 26,Ί-) antes da reação.

Quando uma mistura contendo uma grande quantidade de bactérias 0157:H7 é colocada em contato com a superfície sensível do chip (em outras palavras sobre as protuberâncias), algumas de entre elas interagem especificamente com os anticorpos da primeira protuberância. Como as bactérias são moléculas bem detectadas pelo SPR (devido ao seu peso significativo), a curva de plasmon se desvia suficientemente para que esse deslocamento seja bem captado pelo detector representando a imagem da primeira protuberância. Por outro lado, essa bactéria segrega também toxinas shiga durante a mesma experiência.

A segunda protuberância apresenta um ligeiro tilt (β=0,5-) e uma largura angular estudada muito mais baixa (Δθ'=0,3^Ω). Assim, a sensibilidade de medição da segunda protuberância é mais relevante e é possível detectar toxinas shiga que vêm se fixar sobre os anticorpos da segunda protuberância. As figuras 15 e 16 representam os sinais obtidos no detector para as duas protuberâncias antes e após interação dos anticorpos imobilizados sobre cada uma das protuberâncias respectivamente com as bactérias e as toxinas.

Assim, esse exemplo demonstra que o chip de acordo com a invenção permite adaptar a dinâmica e a sensibilidade de medição das espécies para medir durante uma única experiência.

Claims

1. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) para análise por ressonância dos plasmons de superfície (SPR) se apresentando sob a forma de um sólido constituído por uma base (5; 77), uma face superior (4; 44) em que pelo menos uma parte está coberta por uma camada de metal (2; 22; 42; 52; 62), e pelo menos uma face lateral (55; 66), caracterizada pela referida face superior (4; 44) ser dotada de zonas de tamanho micrométrico destinadas a receber espécies para analisar escolhidas entre n protuberâncias e m cavidades; e por quando n+m> 2, as referidas zonas estão separadas umas das outras por superfícies planas com n indo de 1 a j, m indo de 0 a i; j e i sendo inteiros.

2. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos uma zona escolhida entre as n protuberâncias e as m cavidades estar coberta pela camada de metal.

3. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por m=0.

4. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por m>0.

5 . CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 1 63) , de acordo com qualquer uma das reivindicações a 4, caracterizado pela base (5; 77) ser uma superfície plana. 6. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado (5; 77) . pela face superior (4; 44) ser paralela à base 7 . CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,

2/5 caracterizado por pelo menos uma face lateral (55; 66) ser plana.

8. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por pelo menos uma face lateral (55; 66) ser plana.

9. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos uma face lateral (55; 66) ser perpendicular à base (5; 77) ou à face superior (4;44) .

10. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por pelo menos uma face lateral (55; 66) ser perpendicular à base (5; 77) e à face superior (4;44) .

11. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelas n protuberâncias e m cavidades (1; 11; 41; 51; 61) apresentarem uma superfície curva de raio de curvatura R, de preferência compreendido entre 0,1 e 600 mm.

12. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelas n protuberâncias e m cavidades (1; 11; 41; 51; 61) apresentarem um raio de curvatura idêntico.

13. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades (1; 11; 41; 51; 61) apresentar um raio de curvatura diferente das outras.

14. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades (1; 11; 41; 51; 61) ter uma oscilação de um ângulo

3/5 β, de preferência tal como O² < β <80² .

15. CHIP MICRO ESTRUTURADO (3; 33; 43; 53; 63), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por pelo menos uma das distâncias separando as superfícies planas entre as n protuberâncias e m cavidades (1; 11; 41; 51; 61) da base (5; 77) ser diferente das outras.

16. DISPOSITIVO DE ANÁLISE POR SPR, caracterizado por compreender:

- uma fonte luminosa (7) destinada a produzir um feixe incidente;

- eventualmente um sistema óptico de colimação (8);

- um sistema de polarização (6);

- um chip micro estruturado (3, 33; 43; 53; 63), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 disposto no trajeto óptico do referido feixe incidente;

- eventualmente um sistema óptico de imagiologia (9, 69);

- um detector (10; 70).

17. DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo sistema de colimação (8) e eventualmente o polarizador (6) se tornarem solidários da face de entrada (54; 64) e/ou o sistema óptico de imagiologia (9; 69) e o detector (10, 70) se tornarem solidários da face de saída (57; 67) .

18. PROCESSO DE MEDIDA POR SPR, caracterizado por compreender as etapas seguintes:

detectar um estado inicial (i) irradiando a superfície sensível de pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades pela face de entrada do chip micro estruturado tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15

4/5 com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado e eventualmente colimado e (ii) detectando simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída;

- irradiar a superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades contendo o fluido pela face de entrada do chip micro estruturado com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado e eventualmente colimado e detectar simultaneamente a intensidade dos radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída para seguir em tempo real e continuamente modificações de espessura óptica em pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades;

com n>0 e m>0.

19. PROCESSO DE MEDIDA POR SPR, caracterizado por compreender as etapas seguintes:

- imobilizar ligantes sobre a face coberta por uma camada de metal de um chip micro estruturado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15;

detectar um estado inicial (i) irradiando a superfície sensível de pelo menos uma das n protuberâncias e m cavidades pela superfície de entrada do chip micro estruturado com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado e eventualmente colimado e (ii)

5/5 detectando simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída;

- irradiar a superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades contendo o referido fluido pela face de entrada do chip micro estruturado com a ajuda de um feixe incidente monocromático previamente polarizado e eventualmente colimado e detectar simultaneamente a intensidade das radiações refletidas pela superfície sensível de pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades, que saem pela face de saída para seguir em tempo real e continuamente modificações de espessura óptica em pelo menos uma das referidas n protuberâncias e m cavidades;

com n>0 e m>0.

20. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizado por compreender, além disso, uma etapa final na qual uma imagem das n protuberâncias e m cavidades (1, 11, 41, 51, 61) é realizada.

21. UTILIZAÇÃO DO DISPOSITIVO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 ou 17, caracterizado por medir interações biomoleculares.