BR102022006871A2 - Processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, uso dos extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, meio de cultura de organismos heterotróficos, uso dos organismos heterotróficos - Google Patents

Abstract

processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, uso dos extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, meio de cultura de organismos heterotróficos, uso dos organismos heterotróficos. a presente invenção refere-se a um processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, sendo eles, microalgas e/ou cianobactérias, bem como seu uso como fonte de nitrogênio em substituição à da fonte de proteína animal de meios de cultura de bactérias, leveduras, fungos e/ou célulasanimais, denominados organismos heterotróficos. adicionalmente, a presente invenção propõe a utilização dos organismos heterotróficos produzidos, bem como dos metabólitos produzidos por eles para aplicações industriais, como na produção de vacinas, soros, fármacos e biofármacos, antibióticos de uso humano e/ou animal, antitumorais, biomassa, ácidos orgânicos, solventes, ácidos nucleicos, biossurfactantes, aminoácidos, cosméticos, biofertilizantes, inoculantes agrícolas, fitohormônios, alimentos, ração animal, entre outros.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da Biologia, mais precisamente na área da Biotecnologia, e descreve um processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, sendo eles, microalgas e/ou cianobactérias, bem como seu uso como fonte de nitrogênio em substituição à fonte de proteína animal de meios de cultura de bactérias, leveduras, fungos e/ou células animais, denominados organismos heterotróficos. Adicionalmente, a presente invenção propõe a utilização dos organismos heterotróficos produzidos, bem como dos metabólitos produzidos por eles para aplicações industriais, como na produção de vacinas, soros, fármacos e biofármacos, antibióticos de uso humano e/ou animal, antitumorais, biomassa, ácidos orgânicos, solventes, ácidos nucleicos, biossurfactantes, aminoácidos, cosméticos, biofertilizantes, inoculantes agrícolas, fitohormônios, alimentos, ração animal, entre outros.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Com o crescimento da população mundial, a demanda por alimentos também se eleva. Na alimentação humana, a fração proteica mais especificamente, de proteína animal é uma das mais relevantes. Atualmente, proporcionar produtos com alto teor de proteínas renováveis e sustentáveis é o grande desafio da indústria de alimentos (JONES, S. W., KARPOL, A., FRIEDMAN, S., MARU, B. T., TRACY, B. P. Recent advances in single cell protein use as a feed ingredient in aquaculture. Current Opinion in Biotechnology, v. 61, pp. 189-197, 2020).

[003] Existe a tendência de substituição da proteína de origem animal por outras fontes. Desde 1950, as microalgas são estudadas por conter em sua biomassa elevada concentração de proteínas. Por serem capazes de consumir CO2, estudos sobre a otimização das condições de crescimento com o objetivo de aumento do rendimento de produção de biomassa são realizados, bem como avaliação de contribuição de redução dos gases do efeito estufa (BUI, H. H.; TRAN, K. Q.; CHEN, W. H. Pyrolysis of microalgae residues - a kinetic study. Bioresource Technology, v. 199, pp. 362-366, 2016). Além disso, o interesse pelas microalgas é crescente, pois, a otimização das condições de cultivo pode induzir à síntese e ao acúmulo de altos teores de proteínas (de 40% a 60% da biomassa), carboidratos, e lipídios. (BARKA, A., BLECKER, C. Focus on: microalgae as a potential source of single-cell proteins. A review. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., v. 20, pp. 427-436, 2016).

[004] Globalmente, a produção de biomassa seca de microalgas é de cerca de 20.000 toneladas.ano-1. O valor de vendas bruta de Spirulina e Chlorella variam de US $ 10.000 a US $ 30.000 por tonelada (BENEMANN, J. R., WOERTZ, I., LUNDQUIST, T. Autotrophic microalgae biomass production: from niche markets to commodities. Industrial Biotechnology, v. 14, pp. 3-10, 2018). O mercado específico de proteínas de algas, movimentou cerca de 700 milhões de dólares no ano de  2019 e estima-se que cresça 6% até 2026 (https://www.gminsights.com/methodology/detail/algae- protein-market, acesso em 20/05/2020, LARENS, L. M. L., MARKHAM, J., TEMPLETON, D. W., CHRISTENSEN, E. D., VAN WYCHEN, S., VADELIUS, E. W., PIENKOS, P. T. Development of algae biorefinery concepts for biofuels and bioproducts; a perspective on process-compatible products and their impact on cost-reduction. Energy & Environmental Science, v.10, pp.1716-1738, 2017).

[005] Muitas espécies de microalgas crescem mais rapidamente do que plantas terrestres, possibilitando obter maior quantidade de biomassa, bem como carboidratos e lipídeos. Além disso, sua natureza unicelular assegura uma biomassa com a mesma composição bioquímica, o que não ocorre com plantas terrestres onde diferentes compostos são produzidos em partes específicas como, frutos, folhas, sementes ou raízes, por exemplo. (BAICHA, Z., SALAR-GARCIA, M. J., ORTIZ-MARTINEZ., HERNANDEZ- FERNANDEZ, F. J., LOS RIOS, A. P.; LABJAR, N., LOTFI, E., ELMAHI, M. A critical review on microalgae as an alternative source for bioenergy production: A promising low cost substrate for microbial fuel cells. Fuel Processing Technology, v.154, pp.104-106, 2016; RICHMOND, A. (Ed). CRC Handbook of microalgal mass culture. Florida: CRC, pp. 528, 1990).

ESTADO DA TÉCNICA

[006] Alguns estudos presentes na literatura propõem a utilização de extrato de microrganismos fotossintetizantes, bem como métodos de obtenção dos mesmos, como por exemplo:

[007] O documento SINGH, R.N.; SHARMA, S.  Development of suitable photobioreactor for algae production - A review. Renewable And Sustainable Energy Reviews, v. 16, n. 4, p. 2347-2353, 2012 comenta sobre os tipos de fotobiorreatores empregados para cultivos de microalgas, como fotobiorreatores abertos e fechados, apresentando vantagens e desvantagens de cada um deles. No tocante a fotobiorreatores fechados, apresentam diferentes formas, como de placas planas e tubulares. Estes fotobiorreatores podem ser movimentados por “air lift” ou por meio de bombas. Os reatores tubulares podem ser dispostos verticalmente ou horizontalmente. Há ainda a possibilidade de se trabalhar com fotobiorreatores do tipo de mistura, comumente empregado em cultivos de microrganismos heterotróficos. Apresentam como promissores fotobiorreatores híbridos, onde diferentes tipos de fotobiorreatores possam ser combinados, de forma a se obter as melhores condições de produção de microalgas. Embora este artigo de revisão seja importante no campo das microalgas, os ensinamentos fornecidos neste artigo não revelam a presente invenção, que trata particularmente de extratos de microrganismos fotossintetizantes como fonte de nitrogênio em cultivo de organismos heterotróficos.

[008] Os documentos BECKER, E. W., Microalgae as source of protein, Biotechnology Advances, 25, p. 2017-210, 2007; BARKA, A., BLECKER, C. Focus on: Microalgae as a potential source of single-cell proteins. A review. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., v. 20, pp. 427-436, 2016; KOYANDE, A. K., CHEW, K. W., RAMBABU, K., DINH-TOICHU, Y. T., SHOW. P.-L. Microalgae: A potential alternative to health supplementation for humans, Human Science and Human Wellness, 8, p.16-24, 2019; BHATTACHARYA, M., GOSWAMI, S.,  Microalgae - A green multi - product biorefinery for future industrial prospects, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 25, 101580, 2020, descrevem que a produção de proteínas por microalgas, varia quantitativamente e qualitativamente, dependendo da espécie cultivada, sendo consideradas ótimas fontes de proteínas e aminoácidos.

[009] Os produtos “Single Cell Protein” podem ser preparados a partir de diferentes fontes microbianas, incluindo microalgas, leveduras, fungos e bactérias (JONES, S. W., KARPOL, A., FRIEDMAN, S., MARU, B. T., TRACY, B. P. Recent advances in single cell protein use as a feed ingredient in aquaculture. Current Opinion in Biotechnology, v. 61, pp. 189-197, 2020).

[010] Produtos de proveniência vegetal estão disponíveis para o preparo de meios de cultura ricos em nutrientes que são eficientes em culturas in vitro e na produção de biomassa bacteriana de maneira sustentável (MOURAD, E. F., SARHAN, M. S., DAANAA, H. S A., ABDOU, M., MORSI, A. T., ABDELFADEEL, M. R., ELSAWEY, H., NEMR, R., EL-TAHAN, M., HAMZA, M. A., ABBAS, M., YOUSSEF, H. H., ABDELHADI, A. A., AMER, W. A., FAYEZ, M., RUPPEL, S., HEGAZI, N. A. Plant materials are sustainable substrates supporting new technologies of plant- only-based culture media for in vitro culturing of the plant. Microbes. Environ., v.33, pp. 40-49, 2018).

[011] Há desafios e perspectivas ao cultivar microalgas para a produção de nutracêuticos e suplementos alimentares, bem como a produção de extratos e/ou biomassa, com interesse nas moléculas bioativas de alto valor agregado. Particularmente, o artigo de revisão de Chaco-Lee &González- Marino (2010) (CHACON-LEE, T.; GONZÁLEZ-MARINO, G.  Microalgae for “Healthy” Foods — Possabilities and Challenges. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v.9, pp. 655-675, 2010) procura evidenciar os componentes presentes em biomassas de microalgas, como ácidos graxos, proteínas e correspondentes perfis de aminoácidos, polissacarídeos, carotenoides e vitaminas, de modo a justificar a proposta de que a indústria de alimentos avalie as microalgas como uma nova fonte de produtos que promovem a saúde.

[012] O artigo também apresenta processos clássicos de produção de microrganismos fotossintetizantes, bem como a forma de separação deles. No entanto, em nenhuma parte do referido artigo de revisão foi encontrada menção à obtenção de extrato proteico de microrganismos fotossintetizantes, diferenciando e, assim, não revela a presente invenção, que tem como proposta a obtenção de extratos de microrganismos fotossintetizantes e seu uso como fonte de nitrogênio em cultivo de organismos heterotróficos.

[013] No tocante à alimentação animal, a microalga Chlorella vulgarisé uma alternativa potencial para substituir as rações de peixe na aquicultura devido à sua composição proteica semelhante. Para a obtenção da biomassa microalgal foi utilizado um fotobiorreator no qual foi possível atingir uma produtividade máxima de biomassa de 699 mg.L-1.dia-1e 365 mg.L-1.dia-1de proteína. Além disso, analisou-se a composição de aminoácidos da proteína microalgal, no qual a Chlorella vulgaris mostrou que até 70% das proteínas consistem em aminoácidos essenciais (CHEN, C.Y.; LEE, P. J.; TAN, C. H.; LO, Y. C.; HUANG, C. C.; SHOW, P. L.; LIN, C. H.; CHANG, J. S. Improving protein production of indigenous microalga Chlorella vulgaris FSP-E by photobioreactor design and cultivation strategies. Biotechnology Journal, v. 10, n. 6, pp. 905-914, 2015). É importante destacar que o trabalho de Chen et al. (2015) não cita em qualquer parte do texto a possibilidade de se trabalhar com extratos das microalgas, diferenciando-se da presente invenção.

[014] Microrganismos fotossintetizantes podem apresentar parede celular difícil de digerir, acarretando a diminuição da biodisponibilidade de seus nutrientes. Assim, visando melhorar a liberação do conteúdo proteico para a alimentação de peixes e crustáceos, os documentos patentários WO2019171293 e US2021/0000140A1 propõem o rompimento celular em moinhos de bola vibratório em sistema úmido, ou outros processos físicos de rompimento celular, preferencialmente úmidos, seguido de hidrólise enzimática com mistura de pelo menos duas enzimas, como lipase, pectinase, celulase, hemicelulase, endo e exo-arabanase, amilase ou misturas dos mesmos, sendo que pelo menos uma das enzimas seja lipase, pectinase ou amilase.

[015] Assim, a presente invenção diferencia-se dos documentos WO2019171293 e US2021/0000140A1 pois prevê o rompimento físico simultaneamente com hidrólise enzimática e/ou química, o que aumenta a eficiência de rompimento pela sinergia do uso dos dois processos simultaneamente. Além disso, a presente invenção prevê a possível remoção de lipídios das células, o que além de permitir a obtenção desta fração para outros usos, desestrutura a membrana celular, permitindo uma maior eficiência no rompimento celular e atuação das hidrolases utilizadas no processo de rompimento celular. Outra melhoria no processo proposto na presente invenção é o tratamento com proteases, que aumenta a biodisponibilidade da fonte proteica para os organismos heterotróficos, além de propor possível tratamento com nucleases e/ou precipitações dos peptídeos/proteínas ou material genético para obtenção de extratos proteicos com baixa quantidade de material genético. Ao extrato proteico, purificado ou não, ainda é proposta uma concentração para remoção de água e armazenamento, havendo diferença ainda quanto à finalidade de uso do extrato da presente invenção, que é a aplicação em cultivo de bactérias, leveduras, fungos e/ou células animais.

[016] O documento US2020/0095176A1 descreve um método de obtenção de fertilizante e bioestimulantes para uso na agricultura a partir de biomassa de microalga e/ou cianobactérias. Para tanto, os autores citam que a biomassa desses microrganismos passa por um rompimento celular seguido de tratamento com proteases, com pré-tratamento com celulase, até a obtenção de um extrato rico em aminoácidos livres, peptídeos e fitormônios. Em seguida, esse extrato é adicionado de nitrogênio, fósforo e/ou potássio para que possa ser utilizado como fertilizante. Os meios de cultivos utilizados para a finalidade do documento US2020/0095176A1 tratam-se de meios residuais ou de meios com água limpa, porém com adição de fertilizantes como nutrientes, diferenciando da presente invenção, que não usa meios residuais, utilizando sais de pelo menos grau técnico, preferencialmente P.A, a fim de evitar contaminantes nos extratos que possam interferir na qualidade dos produtos produzidos pelos organismos heterotróficos que venham a crescer nos extratos proteicos.

[017] De fato, considerando que importantes aplicações destes extratos seriam a produção de vacinas e biofármacos, é imprescindível ter segurança da origem dos insumos, com a rastreabilidade garantida. Outra diferença entre os processos da presente invenção, é que o documento US2020/0095176A1, por trabalhar com águas residuárias, considera cepas em mistura, expressando ao longo do texto como “microalgas, incluindo cianobactérias”. Ou seja, não apresenta qualquer tipo de restrição quanto à quantidade e diversidade dos microrganismos fotossintetizantes, o que é aceitável para a aplicação como biofertilizante. No caso da presente invenção, prefere-se cultivos sem presença de mais de um microrganismo fotossintetizante, com limitação de presença de outras espécies, havendo necessidade de garantia de não haver presença de microrganismos fotossintetizantes produtores de toxinas, pois os extratos proteicos obtidos a partir dessas células, como comentado acima, serão destinados a cultivos de organismos heterotróficos que produzem compostos em que há necessidade de garantir a segurança de não haver contaminantes.

[018] Outra diferença entre os processos do documento US2020/0095176A1 e da presente invenção é que esta propõe o cultivo dos microrganismos isoladamente e prepara os extratos proteicos isoladamente, considerando a mistura dos extratos já processados para a constituição de bases para a elaboração de meios de cultivo de organismos heterotróficos. Também na presente invenção considera-se a obtenção de extratos de proteínas e de peptídeos, pois são mais fáceis de purificar e grande parte dos organismos heterotróficos (bactérias, leveduras, fungos) são produtores de proteases. Os casos específicos em que se deseja a obtenção de aminoácidos livres, particularmente importantes no caso de cultivo de células animais, as proteases são aplicadas em extratos contendo proteínas e peptídeos purificados ou parcialmente purificados, diferindo do documento US2020/0095176A1, onde as proteases são aplicadas em extratos brutos. Por fim, o que justifica as diferenças das operações unitárias aplicadas na presente invenção e o documento US2020/0095176A1, é que as finalidades de uso são diferentes, como evidenciado acima.

[019] O documento US8486675B2 descreve um processo para remoção de fibras de microalgas e macroalgas para produção de alimento/refeição pobre em fibras, ou seja, para obtenção de concentrados proteicos proveniente de algas, removendo também fatores antinutricionais, usando centrifugação de baixa força g, gerando um conteúdo proteico entre 30 e 70%. São citados métodos envolvendo solventes orgânicos, água e mistura de solventes para a precipitação diferenciada das frações de fibras e de proteínas. Além da aplicação de operações de centrifugação, a tamisação também é prevista para a separação de fases. Podem ser aplicadas enzimas normalmente utilizadas tanto para liberação de fósforo (fitase) como para hidrolisar fibras (celulase) antes da separação das fases de fibras e proteínas. A partir da separação de fases proteica e de fibras, podem ser utilizadas enzimas específicas para obtenção dos hidrolisados das fases. Esses tratamentos podem ser aplicados tanto em microalgas como em macroalgas in natura, como rompidas e/ou desengorduradas.

[020] A presente invenção difere do documento US8486675B2 por não procurar separar as frações proteicas das frações de fibras, uma vez que as microalgas, microrganismos preferencialmente utilizados na elaboração dos extratos proteicos, bem como as cianobactérias, crescendo em meio com suprimento adequado de nitrogênio, apresentam baixos valores de concentração de fibras, além destas não prejudicarem a elaboração dos meios de cultivo. O tratamento com hidrolases, embora possa ocorrer tanto na presente invenção como no documento US8486675B2, diferenciam-se, pois na presente invenção estas enzimas são adicionadas preferencialmente quando da operação unitária de rompimento celular, o que leva a uma simplificação e diminuição de tempo de processo, e a presença de fibras residuais e seus hidrolisados, por apresentarem em sua composição compostos normalmente presente em parede celular, é vantajosa à finalidade que se destina o hidrolisado proteico, que é servir de meio de cultivo para organismos heterotróficos, que seriam os casos dos cultivos de bactérias, leveduras e fungos.

[021] Na presente invenção, diferentemente da patente US8486675B2, há a previsão de adição de nucleases ao extrato proteico para remoção de ácidos nucleicos e/ou solubilização deles. Na presente invenção, os extratos proteicos são sempre obtidos separadamente e a possível mistura de extratos proteicos ocorre posteriormente, com eles já preparados, concentrados ou secos, de forma que se complementem para proporcionar um crescimento celular adequado e/ou formação do produto desejado do organismo heterotrófico. Adicionalmente, o extrato proteico ainda não é o produto final, pois é apenas um dos componentes (fonte de nitrogênio) dos meios de cultivo a serem preparados para o crescimento dos organismos heterotróficos, embora os compostos contaminantes do extrato proteico possam contribuir com muitos nutrientes para o cultivo dos organismos heterotróficos.

[022] O documento PT115535A descreve uma solução para a extração de peptídeos bioativos de origem microalgal, a partir das espécies Nannochloropsis oceanica e Chlorella vulgaris, com ação antioxidante e anti-hipertensiva. Foi utilizado o método de ruptura da parede celular desses microrganismos através da adição de ácido, e por hidrólise enzimática mediante a mistura de celulase e protease. A presente invenção difere do documento PT115535A por utilizar rompimento celular físico, associado ao tratamento simultâneo com enzimas, que podem ser hidrolases (celulases, hemicelulases, pectinases, lipases, glucanases, manases, quitinases, lisozima, zimolase, isoladas ou na forma de mistura, entre outras), com possibilidade do uso também de nucleases, enquanto a patente citada utiliza um processo em que se usa apenas ácido fraco e, que após essa operação, é utilizada uma mistura de celulase e protease para obtenção de extrato proteico. Mesmo em caso de tratamento químico para acelerar o processo de rompimento celular, este é feito simultaneamente ao processo físico. Dessa forma, a eficiência de liberação da fração proteica e facilidade de separação é grandemente aumentada na presente invenção.

[023] O uso do extrato proteico do documento PT115535A é para atividade anti-hipertensiva e antioxidante, estando pronto para uso nesta condição, enquanto na presente  invenção, são previstas etapas de purificação do extrato proteico, concentração, combinação de extratos concentrados/secos, bem como sua incorporação em meios de cultivo de organismos heterotróficos, sendo, como comentado anteriormente, apenas um dos componentes destes.

[024] O desenvolvimento de meios livres de proteínas animais é importante para aumentar a segurança dos produtos biológicos produzidos, e assim, serem utilizados em terapias farmacológicas e vacinas. A principal desvantagem do uso dessas substâncias derivadas de animais é a introdução potencial de contaminantes, no processo e, potencialmente no produto final (MERTEN, O.W. Safety issues of animal products used in serum-free media. Dev. Biol. Stand., v. 99, pp. 16780, 1999). Outro risco associado ao uso de soro animal, inclui a possibilidade de variabilidade entre lotes e, em menor grau, variabilidade intra-lote. Cada um desses riscos pode ser reduzido através do uso de alternativas séricas, principalmente o uso de meio quimicamente definido (NIMS, R. W, HARBELL, J. W. Best practices for the use and evaluation of animal serum as a component of cell culture médium. In Vitro Cell.Dev.Biol., v.53, pp. 682-690, 2017).

[025] O documento WO2017216818 apresenta um método de cultura de bactéria anaeróbica obrigatória ou facultativa (Lactobacillus sp.) que compreende a inoculação da bactéria anaeróbica em um extrato de microalgas ricas em ácidos graxos ômega-3, em que se propõe seu uso como único componente de meio de cultivo, alternativamente com adição somente de açúcar, em condições anaeróbicas. Cita que uma concentração da microalga Nannochloropsis gaditana menor que 10 g/L foi suficiente para suportar o crescimento de Lactobacillus sp, mas indicou em sua reivindicação que a concentração da microalga a ser utilizada seja suficiente para suportar o crescimento da bactéria anaeróbica.

[026] O meio resultante desse crescimento, incluindo células e fração líquida seria usada sem qualquer tratamento para fins nutricionais, como suplemento alimentar e usos terapêutico e cosmético. Tendo em vista que a maioria dos processos industriais é aeróbico, e, nessa condição, a quantidade de biomassa formada é muito maior, um meio de cultivo constituído somente de extrato de microalgas não seria adequado, pois haveria necessidade de usar altas concentrações de extrato visando dar suporte ao crescimento celular, o que encareceria muito o processo. Adicionalmente, poderia haver carência de elementos essenciais para o crescimento celular de bactérias aeróbicas, como fontes de minerais, incluindo fósforo, potássio, magnésio, manganês, cálcio, entre outros.

[027] O documento PI 1107211-3 B1 utiliza a microalga de água doce Scenedesmus sp, cujo cultivo é realizado em câmara com sistema tipo biorreatores fechados, em meio apropriado. Para a extração das substâncias de interesse, a biomassa é separada do meio de cultivo, através da centrifugação, seguido de congelamento e liofilização. Dessa forma, a biomassa liofilizada é empregada na preparação dos extratos, através de extração sequencial com solventes em ordem de polaridade, ou utilizando a biomassa na preparação de suspensões. Através dos bioensaios realizados foi identificado o efeito bioestimulante vegetal, ou seja, evidenciou-se o efeito promotor do crescimento das plantas, a partir da utilização de extratos e/ou suspensões obtidos da microalga de água doce Scenedesmus sp.

[028] O documento EP0049632B1 prevê o uso do extrato de microalgas no cultivo de células animais, no qual o extrato aquoso é usado na concentração máxima de 0,05%. Para a obtenção do extrato, a suspensão de microalgas em meio aquoso, com ou sem adição de álcali ou ácido, é mantida em temperatura ambiente ou, preferencialmente, há um aquecimento em temperaturas elevadas, sendo a temperatura preferencial de 100 °C de acordo com esse documento. A fração líquida é separada e, opcionalmente, purificada por técnicas adequadas, como gel filtração ou diálise. O uso de temperatura ambiente em contato com as microalgas não é eficiente para seu rompimento e liberação de metabólitos. Se forem adicionados ácido ou base para fazer esse procedimento, há a dificuldade futura de neutralização e consequente salinização do extrato, o que leva à necessidade de diálise para remoção dos sais. O aumento de temperatura envolve aumento de custo e, per se, e sem o emprego de um agente físico de rompimento por abrasão celular associado, não se constitui um método eficiente de rompimento celular, diminuindo a eficiência de remoção de nutrientes orgânicos.

[029] O documento EP0067697B1 propõe um método de cultura de células humanas (fibroblastos) mediante um meio de cultura contendo extrato de microalgas, como Chlorella, Scenedesmus ou Spirulina, de modo que não houvesse qualquer alteração morfológica ou genética ao longo das gerações posteriores. Nesse processo, utiliza-se uma fração (fração A1) da patente EP0049632B1, que é um extrato de microalgas, com a adição de soro fetal bovino. Os inventores citam que o efeito do estímulo do metabolismo dos fibroblastos por esses extratos não é claro, apresentando a hipótese de que possam ser compostos de alta massa molar, como glicoproteína e polissacarídeo. Na presente invenção, para cada litro de meio, se utiliza um extrato aquoso de microalga de 0,3 a 400 mg.

[030] A patente EP0067697B1, de forma diferente da presente invenção, utiliza na composição do meio de cultivo material de origem animal (soro fetal bovino), de modo que, ao usar o extrato de microalgas, a intenção foi de prover os fibroblastos com moléculas que estimulassem o metabolismo celular. A concentração utilizada de extrato de microalgas (máximo de 0,04%) evidencia esse efeito de estímulo de metabolismo celular e não uso como fonte de nitrogênio, visto que foi utilizado um meio de cultivo constituído de aminoácidos livres como fonte de nitrogênio, o que é comum em cultivo de células animais, por apresentarem deficiência em produção de proteases extracelulares.

[031] Na mesma linha das patentes EP0067697B1 e EP0049632B1, foi sugerida a utilização de extratos de microalgas, como exemplo a Chlorella vulgaris, enriquecido com um fator de crescimento, como substituto de soro em cultivo de linhagens de células de mamíferos de importância biomédica em cultura de células 2D e 3D in vitro, com o subsequente aumento no rendimento da produção de proteína e manutenção do fenótipo de células-tronco (NG et al., 2020). No caso de substituição de soro em cultivo de células animais não se está pensando em fonte de nitrogênio, mas sim em compostos diversos que contribuam para a homeostase celular. Assim, a presente invenção se diferencia deste artigo também, pois o que se almeja é utilizar o extrato de microalgas como fonte de nitrogênio no cultivo de organismos heterotróficos.

[032] Em cultivo de células animais para obtenção de carne sintetizada por cultivo (cultured meat), OKAMOTO e colaboradores (2019) aplicaram nutrientes extraídos de microalgas no meio de cultura para o cultivo de células de mamíferos. A glicose era extraída com eficiência da Chlorococcum littorale ou Arthrospira platensis usando ácido sulfúrico, enquanto 18 dos 20 aminoácidos foram extraídos eficientemente de Chlorella vulgaris usando ácido clorídrico. Os melhores resultados de hidrólise foram em temperaturas maiores ou iguais a 100°C. No caso dos açúcares, um excesso de hidrólise em condições extremas pode levar à degradação de açúcares, além de ter sido observado baixa quantidade de glutamina e triptofano no caso da hidrólise ácida. Aplicando hidrólise alcalina para obtenção dos aminoácidos, ficaram ausentes nos extratos os aminoácidos arginina, cistina e histidina.

[033] Esse trabalho, que teve como foco a liberação tanto de glicose como de aminoácidos livres por meio de tratamento ácido, ou alcalino, uma vez que células animais não são produtoras eficientes de proteases, havendo necessidade de uso de aminoácidos livres em formulações, que não é o caso da presente invenção, onde não se visa liberação de glicose livre, nem se tem como objetivo a liberação de aminoácidos livres, embora na obtenção dos extratos proteicos, com formação de peptonas, possa, eventualmente haver a liberação de aminoácidos nos extratos.

[034] No artigo de Okamoto e colaboradores (2019), não se utilizou o processo de rompimento físico, o que também limita bastante o processo de liberação das proteínas para que possam sofrer o processo de hidrólise. De forma diferente, na presente invenção, propõe-se o uso de rompimento físico em presença de hidrolases, podendo haver adição de nucleases, de forma que as proteínas possam ser facilmente separadas do extrato, por precipitação, por exemplo, e em seguida sofrer tratamento com proteases para obtenção de peptonas.

[035] Adicionalmente, a hidrólise ácida isolada, que no caso desse artigo por ser mais demorada, embora seja eficiente para obtenção de açúcares e aminoácidos, leva a dificuldades operacionais na purificação dos monômeros para que possa ser usado no processo.

[036] O documento WO2011013707 descreve método para produção de L-aminoácidos que compreende a preparação de produtos processados de microalgas para uso como fontes de carbono para bactérias produtoras destes, como ácidos graxos, amido, glicose e glicerol, com obtenção destes por tratamentos químicos e/ou com lipases e amilases. No entanto, não há previsão do conteúdo proteico das biomassas das microalgas como fonte de nitrogênio.

[037] O documento US 7955833 refere-se a um meio de cultura livre de células de proteína animal compondo combinação peptídeos derivados de hidrolisados de soja e de levedura. A invenção também fornece um processo de cultura livre de proteína animal, em que as células são cultivadas e propagadas sem componentes de origem animal. Esse processo é útil para cultivar células, recombinantes ou infectadas com um vírus e para a produção de produtos biológicos por cultura de células em condições desprovidas de componentes proteicos de origem animal. Tendo em vista que os grãos de soja apresentam essencialmente, a mesma composição proteica, somente com algumas variações em função da variedade utilizada no plantio e das condições de produção, seu uso seria de certa forma limitada se comparado com microrganismos fotossintetizantes, que por serem de vários gêneros e espécies diferentes, apresentam distintas composições proteicas.

[038] Nesse sentido, diferente dos ensinamentos do estado da técnica, a presente invenção propõe um extrato proveniente de cianobactérias e/ou microalgas para substituir a proteína animal dos meios de cultura, podendo fazer misturas dos diferentes extratos provenientes de diferentes espécies, para atender a necessidade nutricional do(s) microrganismo(s) a ser(em) cultivado(s).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[039] A presente invenção tem por objetivo propor um processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, sendo eles, microalgas e/ou cianobactérias, bem como seu uso como fonte de nitrogênio em substituição à fonte de proteína animal de meios de cultura de organismos heterotróficos, podendo ser bactérias, leveduras, fungos ou células animais. Adicionalmente, a presente invenção tem por objetivo propor a utilização dos organismos heterotróficos produzidos, bem como dos metabólitos produzidos por eles para aplicações industriais, como na produção de vacinas, soros, fármacos e biofármacos, antibióticos de uso humano e/ou animal, antitumorais, biomassa, ácidos orgânicos, solventes, ácidos nucleicos, biossurfactantes, aminoácidos, cosméticos, biofertilizantes, inoculantes agrícolas, fitohormônios, alimentos, ração animal, entre outros.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[040] Para obter uma total e completa visualização do objetivo desta invenção, são apresentadas figuras, às quais se faz referência, conforme a seguir.

[041] A Figura 1 apresenta um fluxograma mostrando todas as modalidades abordadas na presente invenção.

[042] A Figura 2 apresenta um gráfico da concentração celular de C. vulgaris em função do tempo em cultivo em fotobiorreator tubular por processo semi- contínuo, com fração de corte de 80%. Foram realizados cortes nos instantes 7, 14 e 18 dias.

[043] A Figura 3 apresenta um gráfico do crescimento de B. atrophaeus ATCC 9372 em meio TSB com inóculo crescido previamente em meio líquido TSB (TSB1), inóculo crescido previamente em meio sólido, em garrafa de Roux, com meio PCA (TSB2) e em meio TSB modificado, com utilização de extrato proteico de microalga como fonte de nitrogênio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[044] A presente invenção refere-se a um processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes, principalmente de microalgas e/ou cianobactérias, bem como seu uso como fonte de nitrogênio em substituição à fonte de proteína animal de meios de cultura de organismos heterotróficos, podendo ser bactérias, leveduras, fungos ou células animais, conforme representado na Figura 1.

[045] De maneira geral, o referido processo da presente invenção compreende as seguintes etapas: (a) Cultivo dos microrganismos fotossintetizantes; (b) Separação das células coletadas; (c) Rompimento Celular; (d) Purificação do Extrato proteico, opcionalmente; e (e) Secagem/liofilização, opcionalmente.

[046] O cultivo dos microrganismos fotossintetizantes, modificados geneticamente ou não, pode ser em fotobiorreatores fechados, como tubulares ou de placa plana, ou abertos, como tanques, por exemplo, mas não se limitando a esses tipos de fotobiorreatores, com diferentes sistemas de circulação de células, em condições de esterilidade e/ou assépticas, podendo o cultivo não ser axênico, porém, preferencialmente sem presença de outros microrganismos fotossintetizantes ou com quantidades que não excedam 10% das células totais destes, não admitindo a presença de microrganismos produtores de toxinas.

[047] Os fotobiorreatores são iluminados com luz natural ou artificial, preferencialmente natural, e conduzidos em condições fotoautotróficas, mixotróficas ou heterotróficas, preferencialmente fotoautotróficas. As temperaturas podem ser de 20°C a 45°C, preferencialmente de 25°C a 35°C, por diferentes tipos de processo, como descontínuo, descontínuo alimentado e suas variações, processo semi-contínuo e/ou processo contínuo em condições não limitadas de nitrogênio, preferencialmente com meios com concentração de nitrogênio maiores que 0,5 mM, mais preferencialmente ainda, maiores que 2 mM. O valor de pH é preferencialmente controlado em faixa ótima de crescimento do microrganismo fotossintetizante a ser cultivado, que dependendo da espécie, podendo ter valor de pH de crescimento entre 4,0 e 11,0.

[048] No caso das microalgas, como Chlorella vulgaris, por exemplo, o valor de pH ótimo está ente 6,5 e 8,0, e no caso de cianobactérias, como Arthrospira platensis, por exemplo, o valor de pH ótimo está entre 9,0 e 10,0, embora faixas mais estreitas de valor de pH possam ser utilizadas para otimização das condições de crescimento celular. Assim, dependendo da espécie, haverá uma faixa de valor de pH ótimo a ser mantido no meio de cultivo, ou o valor de pH pode ser mantido em um valor fixo para o crescimento ocorrer em condições ótimas.

[049] O controle de pH pode ser feito com álcalis, ou com ácidos, orgânicos ou inorgânicos, preferencialmente com uso de gás carbônico, proveniente de diferentes fontes industriais, incluindo usinas, termoelétricas, indústrias de cimento, não se limitando a estas, preferencialmente através de dispositivo que permita o controle automático de pH. O meio de cultivo pode ser constituído de meios minerais, com diferentes salinidades e valores de pH, com ou sem presença de compostos orgânicos e/ou adição destes, com presença de nutrientes para o crescimento celular, incluindo vitaminas e microelementos. Os sais utilizados na preparação dos meios de cultivo devem ser pelo menos de grau técnico, preferencialmente de grau P.A.

[050] Uma vez o cultivo dos microrganismos fotossintetizantes ter sido realizado, as células coletadas do cultivo, preferencialmente de sua fase final, podem ser separadas por processos físicos e/ou químicos, dentre os quais filtração, com ou sem uso de vácuo, filtração tangencial, centrifugação, floculação, sedimentação, podendo haver combinação destas técnicas, com possibilidade de lavagem das células. As células recuperadas ainda úmidas, preferencialmente, ou que passaram por processo de secagem, são ressuspensas em água, por exemplo, deionizada, destilada, potável, não se limitando a esses tipos de água, ou em meios salinos, preferencialmente tamponados, para serem tratadas por processos de rompimento celular, que poderão ser mecânicos, como rompimento em moinhos de bolas ou reatores, com uso de esferas de vidro, cerâmica, aço inoxidável, ou de outros materiais, rompimento em homogeneizador de alta pressão, rompimento por ultrassom, operados de forma contínua ou descontínua.

[051] Alternativamente, podem ser utilizados outros métodos físicos, como emprego de temperatura elevada, preferencialmente acima de 40°C, congelamento e descongelamento, métodos químicos, incluindo a utilização de compostos alcalinos, ácidos, ou detergentes, e/ou enzimáticos para rompimento celular. Esses processos de rompimento celular podem ser usados em conjunto, preferencialmente, isoladamente, ou em sequência, em diferentes ordens. Ainda podem ser usados solventes para extração de lipídios previamente ao processo de rompimento celular.

[052] A sinergia do tratamento físico das células e o tratamento químico ou enzimático advém da diminuição do tamanho das partículas (“debris celulares”), aumentando a superfície de ação para atuação das enzimas ou ácidos/bases usados na hidrólise de polissacarídeos e/ou ácidos nucleicos, facilitando a separação da fração proteica. Para isso, em casos de rompimentos físicos associados a tratamentos químicos, equipamentos de rompimento físico das células e seus componentes que entrarão em contato com o meio reacional deverão ser construídos com materiais resistentes a ácidos e bases, como ácido inox 316, adicionado preferencialmente de outros metais na liga metálica, como titânio e nióbio, ligas de titânio, silício, zircônio, por exemplo, cerâmicas, não se limitando a esses materiais.

[053] No caso de tratamentos enzimáticos associados ao rompimento físico, devem ser usadas enzimas termoestáveis, preferencialmente resistentes a temperaturas superiores a 40°C, mais preferencialmente resistentes a temperaturas superiores a 50°C, com possibilidade de uso de equipamentos com controle de temperatura. Embora o uso de biomassa úmida, que pode ser recém coletada do processo de cultivo, ou proveniente de biomassa mantida sob refrigeração, congelada ou não, seja a forma preferencial de obtenção do extrato de microrganismos fotossintetizantes, alternativamente pode ser utilizada biomassa seca, desengordurada ou não, que pode passar pelos mesmos processos utilizados para a obtenção do extrato de biomassa úmida.

[054] O uso de enzimas de degradação (hidrolases) como celulases, hemicelulases, pectinases, lipases, glucanases, manases, quitinases, lisozima, zimolase, isoladas ou na forma de mistura, entre outras, podem ser realizados para aumentar a liberação de proteínas livres no meio de cultivo. Alternativamente, para obtenção de suspensões proteicas mais puras, no processo de rompimento celular, além da adição das hidrolases, podem ser adicionadas nucleases, facilitando a separação das proteínas por precipitação por meio da adição de sais ou por ajuste do pH para diferentes pontos isoelétricos.

[055] As hidrolases e nucleases devem, preferencialmente, ser adicionadas quando do processo de rompimento físico. Podem ser adicionados surfactantes, de origem sintética ou biológica, preferencialmente de origem biológica, ao processo de rompimento celular físico, bem como tratamento de rompimento celular físico simultaneamente ao tratamento químico ou enzimático para essa finalidade. As proteínas liberadas no meio de cultivo provenientes da etapa de rompimento celular podem ser utilizadas com ou sem purificação, e, alternativamente, pode haver a adição de proteases, preferencialmente de origem microbiana e/ou vegetal, que atuem em valor de pH de 1,0 a 11, para liberação de peptídeos e aminoácidos.

[056] A purificação pode ser realizada por meio de precipitação com auxílio de adição de sais, como por exemplo, sulfato de amônio ou cloreto de sódio, ou por correção de pH para o ponto isoelétrico das proteínas, peptídeos e/ou aminoácidos, não se limitando a estes métodos de precipitação de materiais proteicos.

[057] No caso da obtenção de extratos ricos em aminoácidos livres, a ação das proteases deve ser preferencialmente em extratos proteicos previamente purificados. Posteriormente, as proteínas, peptídeos e/ou aminoácidos podem opcionalmente sofrer diálise para remoção de sais e serem purificados por diferentes métodos, incluindo filtração tangencial, sistema de duas fases aquosas, cromatografia de troca iônica, cromatografia em gel e/ou cromatografia de afinidade.

[058] Além disso, uma etapa de precipitação de material genético dos microrganismos fotossintetizantes pode ainda ser incluída usando, por exemplo, processos de precipitação com solventes, como etanol, ou outras substâncias que promovam sua precipitação, ou o material genético pode sofrer tratamento com enzimas (nucleases) ou outros compostos, como álcalis, por exemplo, que levem à sua hidrólise, de modo que fique facilitada a separação do material genético hidrolisado e as proteínas por processos de separação por filtração tangencial. Estes procedimentos podem ocorrer antes ou depois do processo de purificação da fração proteica propriamente dita. Os ácidos nucleicos, após purificação, podem ser utilizados em formulações alimentícias, incluindo aplicações como realçadores de sabor em alimentos.

[059] Os extratos proteicos obtidos apresentam preferencialmente baixa quantidade de ácidos nucleicos, preferencialmente menores que 3%, mais preferencialmente menores que 1%, mais preferencialmente ainda menores que 0,5%, isentos de toxinas, com teores proteicos superiores a 30%, mais preferencialmente acima de 40%, mais preferencialmente ainda acima de 50% em relação aos sólidos totais. No entanto, dependendo do microrganismo heterotrófico que venha a ser cultivado e a finalidade do produto a ser produzido, podem ser usados extratos brutos, sem purificação das proteínas e de seus extratos ou com purificação parcial desses compostos.

[060] Também se prevê que possam ser misturados os extratos proteicos de mais de uma espécie de microrganismo fotossintetizante, com ou sem modificação genética, de modo que a mistura dos extratos destes microrganismos possa ser igual ou similar a composição de aminoácidos, bem como a sequência de aminoácidos de proteínas e seus derivados de origem animal ou vegetal, visando suprir os aminoácidos e suas proporções, na forma de peptídeos/proteínas, com ou sem presença de aminoácidos, bem como com ou sem adição de aminoácidos, que atendam a demandas específicas de organismos heterotróficos.

[061] A proporção entre os extratos dos microrganismos fotossintetizantes, com ou sem modificação genética, podem variar de 1% a 99%, com adição de no máximo 50% de aminoácidos livres na mistura, obtidos de outras fontes, preferencialmente não sendo de origem animal. Aos extratos proteicos, provenientes de um microrganismo fotossintetizante ou de mais de um microrganismo fotossintetizantes, podem ser adicionados extratos proteicos de origem vegetal, com proporções que podem variar de 1 a 99%, de forma que a mistura possa atender a demandas específicas de organismos heterotróficos.

[062] No caso do uso de microrganismos com modificação genética, podem ser construídas sequências de nucleotídeos, incorporadas no DNA da célula ou de organelas, como cloroplasto, por exemplo, ou em plasmídeos, que produzam proteínas, bem como peptídeos, com composição de aminoácidos que atendam a demandas específicas de organismos heterotróficos, com enriquecimento de aminoácidos nessas moléculas, bem como com composição igual ou semelhante a proteínas de origem animal e seus derivados.

[063] Particularmente, espera-se que os compostos produzidos por estes microrganismos tenham composições similares às peptonas de origem das proteínas de leite, podendo ser produzidas diferentes peptonas por diferentes microrganismos fotossintetizantes geneticamente modificados ou por apenas um.

[064] Em qualquer condição que seja obtido o material proteico proveniente dos microrganismos fotossintetizantes, denominado extrato proteico, ele pode passar por processos para aumentar sua concentração ou não, podendo ser aplicados processos posteriores de secagem, natural e/ou artificial, em tambores, túneis de secagem, bandejas, com ou sem pressão reduzida, com ou sem circulação de ar, gases inertes e/ou vapor aquecido.

[065] Adicionalmente, o extrato proteico pode ser seco por liofilização ou secagem por atomização (spray drying), preferencialmente, podendo ser utilizados outros processos de secagem. O extrato proteico pode passar por processo de moagem e tamisação para uniformização da granulometria.

[066] Na purificação do extrato proteico, há a possibilidade de realizar a separação dos ácidos nucleicos proveniente da biomassa. A separação da fração de ácidos nucleicos da fração proteica pode ser feita por precipitação da fração proteica ou da fração de ácidos nucleicos, preferencialmente da fração proteica, ou pela adição de nucleases para liberação de ácidos nucleicos e nucleotídeos provenientes da hidrólise de DNA e RNA dos microrganismos fotossintetizantes, que podem ser separados facilmente da fração proteica por precipitação desta ou por meio de tratamento com membranas filtrantes. Estes ácidos nucleicos, após purificação, podem ser utilizados em formulações alimentícias, incluindo aplicações como realçadores de sabor em alimentos.

[067] Uma vez obtido, o extrato proteico é utilizado como fonte de nitrogênio em cultivo de organismos heterotróficos, modificados geneticamente ou não, podendo ser a única fonte de nitrogênio no meio de cultivo, sendo de um único microrganismo fotossintetizante ou da mistura de mais de um microrganismo fotossintetizante, em diferentes proporções.

[068] O cultivo de organismos heterotróficos poderá ter a adição de outras fontes de nitrogênio visando suprir um ou mais aminoácidos, ácidos nucleicos, que podem, alternativamente, serprovenientes de fontes de nitrogênio complexas, como extrato de bactérias, extrato de levedura, água de maceração de milho, purificadas ou não. Ureia e/ou fontes de nitrogênio inorgânicas podem complementar o extrato proteico no crescimento dos organismos heterotróficos. Particularmente, no caso de cultivo de células para obtenção de vacinas e biofármacos, preferencialmente, as fontes de nitrogênio complexas complementares não são de origem animal.

[069] Os extratos podem ser adicionados em teores, considerando sua base seca, em valores de 0,01% a 30%, mais preferencialmente, na faixa de 0,1% a 15%, mais preferencialmente ainda na faixa de 1% a 10%.

[070] Outros nutrientes, como fontes de carbono orgânicas, preferencialmente monossacarídeos e dissacarídeos, mais preferencialmente monossacarídeos, vitaminas e sais minerais, como fontes de fósforo, na forma de ácido fosfórico ou sais de fósforo, cálcio, potássio, entre outros, e micronutrientes podem ser constituintes do meio de cultivo, independentemente do tipo de processo de cultivo empregado (descontínuo, descontínuo alimentado, semi-contínuo, contínuo e suas variações).

[071] O meio de cultivo contendo o extrato proteico pode ser esterilizado já com este em sua composição, ou pode haver uma esterilização em separado da fonte de nitrogênio e outros constituintes do meio de cultivo, particularmente fonte de carbono orgânica, para evitar reação de Maillard.

[072] Os processos de cultivo podem ser preferencialmente sob condições assépticas ou de esterilidade, embora possa haver a possibilidade de cultivo com presença de outros organismos, ser aeróbios ou anaeróbios, com ou sem adição de antiespumantes, com pressão positiva ou negativa nos biorreatores, com ou sem borbulhamento de gases, como nitrogênio, ar, oxigênio, misturas de oxigênio e ar, com valores de pH de 2,5 a 11,0, preferencialmente entre 4,0 a 9,0, mais preferencialmente ainda entre 5,5 e 8,0. O crescimento será em temperaturas de 20°C a 65°C, mais preferencialmente entre 25°C e 45°C, mais preferencialmente ainda entre 28°C e 37°C. Esses valores de pH e temperatura devem atender a condições que permitam o crescimento ótimo dos organismos heterotróficos.

[073] Durante o cultivo, preferencialmente no final deste, o organismo heterotrófico será preferencialmente separado do meio de cultivo residual, e as células produzidas e/ou meio de cultivo serão utilizados para a recuperação do produto de interesse, podendo ser utilizados diferentes processos para esta finalidade, incluindo processos físicos, químicos e/ou enzimáticos, em diferentes combinações e etapas. As moléculas de interesse poderão ser purificadas e/ou modificadas, dependendo da finalidade de uso.

[074] Por fim, a presente invenção propõe a utilização dos organismos heterotróficos produzidos, bem como dos metabólitos produzidos por eles para aplicações industriais, como na produção de vacinas, soros, fármacos e biofármacos, antibióticos de uso humano e/ou animal, antitumorais, biomassa, ácidos orgânicos, solventes, ácidos nucleicos, biossurfactantes, aminoácidos, cosméticos, biofertilizantes, inoculantes agrícolas, fitohormônios, alimentos, ração animal, entre outros.

[075] Os exemplos a seguir têm o intuito apenas de ilustrar, sem limitar o escopo da presente invenção. Quaisquer variações passíveis de serem realizadas por um técnico no assunto devem ser consideradas como dentro do escopo da presente invenção.

EXEMPLOS DA INVENÇÃO Manutenção das cepas

[076] A microalga Chlorella vulgaris, utilizada como exemplo de microrganismo fotossintetizante, foi mantida em meio líquido de cultivo padrão Bold.

[077] O Bacillus atrophaeus ATCC 9372, utilizado como exemplo de organismo heterotrófico, foi mantido em solução de acetato de cálcio 0,2 M, em forma de suspensão matriz.

Meio Padrão de Cultivo

[078] O Meio padrão (Bold) (BISCHOFF, Harry William, BOLD, Harold C. Some Soil Algae from Enchanted Rock and Related Algal Species. Austin, Tex: University of Texas, Phycological Studies, n. IV, 1963) foi utilizado para o crescimento de Chlorella vulgaris.

[079] O Meio padrão Tryptic Soy Broth (TSB) foi utilizado para o cultivo do Bacillus atrophaeus ATCC 9372. O meio TSB contém peptonas de origem animal.

Meio Modificado para o cultivo de Bacillus atrophaeus ATCC 9372

[080] O Meio TSB modificado, com extrato proteico de microalga, ao invés das peptonas do meio TSB padrão (peptonas de caseína e de soja), para o cultivo de Bacillus atrophaeus ATCC 9372.

Obtenção de biomassa de C. vulgaris Preparo do inóculo

[081] O preparo de inóculo de Chlorella vulgaris foi realizado em frascos Erlenmeyer com capacidade de 500 mL, adicionando-se 20mL do inóculo fixado em 4000mg.L-1da microalga em 180 mL de meio Bold, incubando-se a 25 °C a 110 rpm por até 10 dias, com intensidade luminosa de 80 (± 10) μmol fótons.m-2.s-1.

Cultivo em fotobiorreator tubular

[082] O cultivo de Chlorella vulgaris foi realizado em um fotobiorreator tubular com capacidade 35 L a 25° C, sendo o inóculo obtido nas condições indicadas no preparo do inóculo. A cultura foi movimentada por um sistema de air lift, o pH foi mantido em 7,5 ± 0,5 e intensidade luminosa de 40 (± 10) μmol fótons m-2.s-1, por até 50 dias em processo semi-contínuo, utilizando meio Bold.

Preparo do extrato microalgal

[083] Após o cultivo da microalga, a biomassa foi centrifugada a 4000 rpm por 30 minutos e lavou-se a biomassa com água deionizada para a remoção dos sais. Adicionou-se água deionizada novamente, e as células dessa suspensão foram rompidas com pérolas de vidro de 1 mm e agitação vigorosa por 50 minutos. As pérolas foram removidas e a suspensão foi seca em estufa de circulação forçada a 60 °C, e, por fim, a biomassa foi triturada com o auxílio de almofariz e pistilo.

Experimentos realizados em meio padrão de Bacillus atrophaeusATCC9372 (meio TSB) e em meio TSB modificado, com uso de extrato proteico de microalga

[084] Foram realizados dois cultivos em meio padrão de Bacillus atrophaeus, a 37 °C, a 150 rpm, por 24 horas, sendo que no primeiro cultivo as bactérias cresceram previamente também em meio líquido TSB e no segundo cultivo as bactérias cresceram previamente em meio sólido PCA, com a suspensão de esporos obtida pela remoção das células com pérola de vidro e ressuspensão em solução fisiológica. Os cultivos, em triplicata, foram realizados em frascos Erlenmeyer com capacidade de 250 mL. No caso do meio modificado, prepararam-se 100 mL de meio de cultura teste com a composição semelhante ao do TSB, porém com a fonte de proteína substituída pelo extrato de Chlorella vulgaris, em quantidade equivalente de nitrogênio orgânico, incubando-se a 37 °C, a 150 rpm, por 24 horas, e comparados aos cultivos padrão (meio TSB).

[085] As contagens bacterianas foram realizadas por diluições seriadas em solução de cloreto de sódio 0,9 % em que alíquotas de 1 mL, foram transferidas para placas de Petri e, em seguida, foram adicionados 20 mL de PCA, sendo que as placas foram incubadas em estufas a 37 °C por 48 horas, após solidificação do meio. Após as 48 horas, realizou-se a contagem considerando as placas que apresentaram até 300 UFC.mL-1. RESULTADOS OBTIDOS

[086] Os cultivos de Chlorella vulgaris foram conduzidos por processo semi-contínuo em fotobiorreator de 35 L, com fração de corte de 80%. Os valores de concentração celular durante os ciclos do processo semi-contínuo variaram entre 0,22 g.L-1e 1,46 g.L-1(Figura 2), e o processo se mostrou estável, sem tendência de queda de concentração celular entre um ciclo e outro.

[087] Após a etapa de crescimento celular, as células foram recuperadas para a obtenção dos extratos proteicos de microalgas, conforme relatado anteriormente (item “Preparo do extrato microalgal”). O teor proteico do extrato proteico microalgal seco foi de 14,03 % ± 0,16 % e do meio TSB seco foi de 49,10 % ± 2,61 %, de modo que no meio TSB modificado foi incluída a concentração de extrato de 104,8 g.L-1para suprir a mesma concentração proteica do meio TSB.

[088] Testou-se o crescimento Bacillus atrophaeus ATCC 9372 em meio de cultivo com extrato de Chlorella vulgaris (extrato proteico microalgal), tendo como parâmetro de comparação o crescimento desta bactéria em meio TSB, seja proveniente de inóculo crescido previamente em meio líquido TSB (TSB1) ou inóculo crescido previamente em meio sólido, em garrafa de Roux, com meio PCA (TSB2) (Figura 3).

[089] Em TSB1, meio padrão no qual o Bacillus atrophaeus ATCC 9372 foi pré-adaptado ao meio TSB, ao inocular uma população 102UFC.mL-1, a bactéria imediatamente cresceu exponencialmente até 8 h de cultivo, atingindo população máxima de 3,7 x 108UFC.mL-1em 24 horas, obtendo- se velocidade específica de crescimento máxima (μm) de 1,57 h-1. Entretanto, na substituição das peptonas por extrato de Chlorella vulgaris, a bactéria precisou de 6 horas para se adaptar, no qual cresceu exponencialmente até 12 h de cultivo, e atingiu uma população máxima de 1,9 x 107UFC.mL- 1em 24 horas. Seu valor de μm foi de 1,25 h-1.

[090] Por outro lado, os experimentos realizados indicam que a substituição das peptonas do meio TSB por proteínas microalgais é uma boa alternativa, pois os crescimentos com as células não adaptadas previamente em meio TSB (experimento TSB2) e os crescimentos com extrato de Chlorella vulgaris levaram a crescimentos celulares equivalentes (Figura 3) (p = 0,513). Em ambos os casos, houve fase lag, sendo mais pronunciada no meio com extrato da microalga, o que poderia ser evitado com o crescimento prévio das células nesse meio.

[091] Quando se cultivou previamente o inóculo de Bacillus atrophaeus em meio TSB (experimento TSB1), não houve fase lag de crescimento, o que se deve provavelmente ao fato de as células estarem previamente adaptadas ao meio antes de seu crescimento, o que pode ter proporcionado a obtenção de maior crescimento celular em comparação com o crescimento do cultivo com extrato microalgal (p = 0,000).

[092] No entanto, em comparação das concentrações celulares finais obtidas com o extrato proteico microalgal e nos meios TSB, não houve diferença estatística (p = 0,121), reforçando a ideia de que o extrato proteico microalgal poderia ser usado como fonte de proteínas, o que seria particularmente importante em produção de vacinas e biofármacos, onde é conveniente a substituição de proteínas animais por outras fontes proteicas.

[093] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims (24)

1. Processo para obtenção de extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes caracterizadopelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) Cultivo dos microrganismos fotossintetizantes; (b) Separação das células coletadas; (c) Rompimento celular; (d) Purificação do extrato proteico, opcionalmente; e (e) Secagem/liofilização, opcionalmente.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que os microrganismos fotossintetizantes são selecionados do grupo consistindo principalmente em microalgas e cianobactérias, preferencialmente Chlorella vulgaris e Arthrospira platensis, respectivamente.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) o cultivo é realizado em fotobiorreatores preferencialmente em condições de esterilidade e assépticas, preferencialmente sem presença de outros microrganismos fotossintetizantes ou com quantidades que não excedam 10% das células totais destes.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que os fotobiorreatores são iluminados com luz natural ou artificial, preferencialmente natural, conduzidos em condições fotoautotróficas, mixotróficas ou heterotróficas, preferencialmente fotoautotróficas, em temperaturas variando de 20°C a 45°C, preferencialmente de 25°C a 35°C, conduzidos por diferentes tipos de processo, preferencialmente descontínuo, descontínuo alimentado e suas variações, processo semi- contínuo e processo contínuo em condições não limitadas de nitrogênio, preferencialmente com meios com concentração de nitrogênio maiores que 0,5 mM, mais preferencialmente ainda, maiores que 2 mM.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o valor de pH de crescimento do microrganismo fotossintetizante varia entre 4,0 e 11,0, em que para as microalgas, o valor de pH ótimo está preferencialmente na faixa entre 6,5 e 8,0, e para as cianobactérias, o valor de pH ótimo está preferencialmente na faixa entre 9,0 e 10,0.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (b) as células coletadas são separadas por processos físicos e/ou químicos selecionados do grupo consistindo principalmente em filtração tangencial, centrifugação, floculação, sedimentação, e suas combinações, em que posteriormente, as células secas ou úmidas, preferencialmente úmidas, são ressuspensas em água, principalmente água deionizada, destilada e potável ou meios salinos, preferencialmente em meios salinos tamponados.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (c) o rompimento celular é realizado preferencialmente por processos mecânicos, físicos, químicos, enzimáticos, e suas combinações.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que os processos mecânicos são selecionados do grupo consistindo principalmente em moinhos de bolas ou reatores, esferas de vidro, cerâmica, aço inoxidável, homogeneizador de alta pressão e ultrassom.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que os processos físicos são selecionados do grupo consistindo principalmente no emprego de temperatura elevada, preferencialmente acima de 40°C, congelamento e descongelamento.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que os processos químicos são selecionados do grupo consistindo principalmente em compostos alcalinos, ácidos e detergentes.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que os processos enzimáticos são selecionados do grupo consistindo principalmente de enzimas de degradação selecionadas do grupo consistindo preferencialmente em hidrolases e nucleases, principalmente celulases, hemicelulases, pectinases, lipases, glucanases, manases, quitinases, lisozima, zimolase, isoladas ou na forma de mistura.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que nos processos físicos associados a processos químicos, os componentes dos equipamentos de rompimento físico das células compreendem materiais resistentes a ácidos e bases, principalmente aço inox 316, adicionado de outros metais na liga metálica, preferencialmente titânio e nióbio, ligas de titânio, silício, zircônio e cerâmicas.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que nos processos enzimáticos associados a processos físicos, as enzimas são termoestáveis, preferencialmente resistentes a temperaturas superiores a 40°C, mais preferencialmente resistentes a temperaturas superiores a 50°C, em que opcionalmente são utilizados equipamentos com controle de temperatura.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de na etapa (d) a purificação ser realizada preferencialmente por meio de precipitação com auxílio de adição de sais, principalmente sulfato de amônio ou cloreto de sódio, e por correção de pH para o ponto isoelétrico das proteínas, peptídeos e/ou aminoácidos.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que opcionalmente as proteínas, peptídeos e/ou aminoácidos são submetidos à diálise e são purificados por métodos selecionados do grupo consistindo principalmente em filtração tangencial, sistema de duas fases aquosas, cromatografia de troca iônica, cromatografia em gel e cromatografia de afinidade.

16. Extratos proteicos de microrganismo fotossintetizantes obtidos conforme o processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizadopelo fato de que apresentam baixa quantidade de ácidos nucleicos, preferencialmente menores que 3%, mais preferencialmente menores que 1%, mais preferencialmente ainda menores que 0,5%; são isentos de toxinas; e apresentam teores proteicos superiores a 30%, mais preferencialmente acima de 40%, mais preferencialmente ainda acima de 50% em relação aos sólidos totais.

17. Extratos proteicos, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a proporção entre os extratos dos microrganismos fotossintetizantes varia entre 1% e 99%.

18. Extratos proteicos, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizadopelo fato de que é opcionalmente adicionado ao extrato no máximo 50% de aminoácidos livres obtidos de outras fontes, preferencialmente não sendo de origem animal.

19. Extratos proteicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizadopelo fato de que opcionalmente é adicionado extratos proteicos de origem vegetal, com proporções que podem variar de 1 a 99%.

20. Uso dos extratos proteicos de microrganismo fotossintetizantes, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizadopelo fato de ser como fonte de nitrogênio em cultivo de organismos heterotróficos.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato que os extratos são adicionados em teores, considerando sua base seca, de 0,01% a 30%, mais preferencialmente, na faixa de 0,1% a 15%, mais preferencialmente ainda na faixa de 1% a 10%.

22. Meio de cultura de organismos heterotróficos, caracterizadopelo fato de que compreende os extratos proteicos de microrganismos fotossintetizantes conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 16 a 19, outras fontes de nitrogênio selecionadas do grupo consistindo principalmente em extrato de bactérias, extrato de levedura, água de maceração de milho, ureia e fontes de nitrogênio inorgânicas, fontes de carbono orgânicas, preferencialmente monossacarídeos e dissacarídeos, mais preferencialmente monossacarídeos, vitaminas e sais minerais, fontes de fósforo, principalmente na forma de ácido fosfórico ou sais de fósforo, cálcio e potássio.

23. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que apresenta valores de pH de 2,5 a 11,0, preferencialmente entre 4,0 e 9,0, mais preferencialmente ainda entre 5,5 e 8,0, e temperaturas de 20°C a 65°C, mais preferencialmente entre 25°C e 45°C, mais preferencialmente ainda entre 28°C e 37°C.

24. Uso dos organismos heterotróficos e seus metabólitos produzidos no meio de cultura, conforme definido na reivindicação 22 ou 23, caracterizadopelo fato de ser principalmente na produção de vacinas, soros, fármacos e biofármacos, antibióticos de uso humano e/ou animal, antitumorais, biomassa, ácidos orgânicos, solventes, ácidos nucleicos, biossurfactantes, aminoácidos, cosméticos, biofertilizantes, inoculantes agrícolas, fitohormônios, alimentos e ração animal.