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BR102019007044A2 - Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de interleucina-10, composição farmacêutica e uso dos mesmos como imunomuduladores no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou alérgicas - Google Patents

Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de interleucina-10, composição farmacêutica e uso dos mesmos como imunomuduladores no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou alérgicas Download PDF

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BR102019007044A2
BR102019007044A2 BR102019007044-7A BR102019007044A BR102019007044A2 BR 102019007044 A2 BR102019007044 A2 BR 102019007044A2 BR 102019007044 A BR102019007044 A BR 102019007044A BR 102019007044 A2 BR102019007044 A2 BR 102019007044A2
Authority
BR
Brazil
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treatment
pep
peptides
seq
cells
Prior art date
Application number
BR102019007044-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Luiz Ricardo Goulart Filho
Fatima D. Ferreira-Briza
Emília Rezende Vaz
Galber Rodrigues Araujo
Carlos Ueira Vieira
Lorenz Aglas
Original Assignee
Universidade Federal de Uberlândia
Cirino Alberto Goulart Eireli Epp (Biogenetics)
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Publication date
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Priority to PCT/BR2020/050116 priority patent/WO2020198831A1/pt
Priority to US17/601,658 priority patent/US20220204577A1/en
Priority to EP20784232.9A priority patent/EP3992202A4/en
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    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • C07K14/5428IL-10
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Abstract

peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de interleucina-10, composição farmacêutica e uso dos mesmos como imunomuduladores no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou alérgicas. a presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptídeos sintéticos, que possuem afinidade por receptores presentes em células do sistema imunológico, mais particularmente com afinidade ao receptor de interleucina-10 (il-10), bem como composições farmacêuticas e uso destes peptídeos para preparar medicamentos ou composições imunogências. estes peptídeos sintéticos podem se ligar a receptores celulares e promover um perfil regulatório importante para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.

Description

PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COM AFINIDADE AO RECEPTOR DE INTERLEUCINA-10, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS COMO IMUNOMUDULADORES NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES, INFLAMATÓRIAS OU ALÉRGICAS Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptídeos sintéticos, que possuem afinidade por receptores presentes em células do sistema imunológico, mais particularmente com afinidade ao receptor de Interleucina-10 (IL-10). Esses receptores são conhecidos por apresentarem papel importante na modulação da reposta imológica, inflamatória e alérgica. Além disso a presente inveção também descreve composições farmacêuticas compreendendo ao menos um destes peptídeos sintéticos e o uso destes peptídeos para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
Fundamentos da Invenção
[002] A IL-10 é uma citocina pleiotrópica reguladora produzida por diferentes tipos de células: monócitos, células T, macrófagos, células dendríticas (CD), células natural killer (NK) e células B. Por influenciar diferentes tipos celulares, a IL-10 tem se mostrado uma molécula importante associada a uma ampla gama de doenças, distúrbios e condições, incluindo condições inflamatórias e alérgicas, distúrbios relacionados a imunidade e câncer, devido à sua capacidade de regular a resposta imune humoral e celular. Assim, o entendimento de como a IL-10 regula diferentes tipos celulares, é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias de intervenção para o tratamento de várias patologias.
[003] Por exemplo, o pedido de patente WO 2008/054585 descreve o uso de IL-10 peguiladas para tratar câncer. Os pedidos de patente WO 2014/172392 e WO 2015/070060 também descrevem o uso de IL-10 modificadas, mas particularmente peguiladas, para tratar câncer.
[004] Já foi demonstrado que a IL-10 liga-se ao receptor da IL-10 (IL10R), ativando assim as proteínas Jak1 / Tyk2. A STAT3 é a principal proteína expressa para regular negativamente a resposta inflamatória, levando a uma regulação negativa de algumas citocinas, como o TNF-α e a IL-6. Esse processo regulatório mediado pela IL-10 é essencial para entender como essa citocina controla a resposta inflamatória, ativando uma das principais vias moleculares para a resolução da inflamação e resposta alérgica. Com isso, novas estratégias utilizando como base a molécula de IL-10 para modular a produção de citocinas têm sido utilizadas em humanos para controle de respostas inflamatórias.
[005] A IL-10 recombinante, por exemplo, já demonstrou ser segura, bem tolerada e eficaz em pacientes com doença de Crohn (Fedorak, R. N. et al. Gastroenterology 2000 Dec;119(6):1473-82). O pedido de patente BR 102017010787-6 descreve 101 Peptídeos sintéticos, selecionados por Phage Display, que possuem afinidade pelo receptor da IL-10. O referido pedido de patente descreve então o uso dessas sequências peptídicas sintetizadas no tratamento e acompanhamento de um processo inflamatório, doenças alérgicas e doenças auto-imunes.
[006] Para desenvolver novas moléculas com abordagens farmacêuticas, a metodologia de Phage Display (PD) pode ser uma boa opção, uma vez que nos permite selecionar moléculas pequenas que podem imitar aminoácidos específicos de proteínas grandes e induzir a mesma ou melhor resposta conforme esperado com a molécula natural ou em comparação com outras moléculas recombinantes já descritas. Peptídeos selecionados pela PD apresentam baixa toxicidade e alta afinidade receptor/proteína. Essa abordagem é utilizada a fim de se obter uma resposta imune específica aonde a produção da IL-10 é essencial para a regulação da resposta imune inflamatória. Além disso, esse tipo de modulação imunológica célula específica não promove uma imuno supressão severa como é observada nas drogas antiinflamatórias comercialmente utilizadas.
Objetivo da invenção
[007] O presente pedido de patente teve como objetivo selecionar novos peptídeos miméticos à IL-10, pela tecnologia PD, que tivessem capacidade melhorada de modular a resposta imunológica, mais particularmente, controlar respostas inflamatórias e alérgicas. Dos peptídeos estudados, quatro (4) peptídeos foram selecionados e suas estruturas tridimentsionais foram preditas. Os dados obtidos mostraram a capacidade destes peptídeos sintetizados em dimunir a resposta alérgica e inibir as vias inflamatórias nos ensaios realizados, bem como seu potencial farmacêutico no controle de doenças alérgicas inflamatórias ou autoimunes.
Breve descrição da invenção
[008] O presente pedido de patente descreve peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de Interleucina-10. Estes peptídeos foram sintetizados e suas estruturas tridimensionais foram preditas. Todos eles foram sintetizados de modo a apresentar a Histidina como primeiro resíduo de aminoácido e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou autoimunes.
[009] Uma modalidade do presente pedido são os métodos de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes, compreendendo administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos sintéticos descritos
[010] Outra modalidade do presente pedido são composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um dos peptídeos sintéticos aqui descritos, mais, pelo menos, um veículo, carreador e/ou composto farmacêuticamente aceitável. A Composição farmacêutica é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[011] Outra modalidade do presente pedido é o uso dos peptídeos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou autoimunes.
Breve descrição das figuras
[012] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:
[013] A FIGURA 1A mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 1.
[014] A FIGURA 1B mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 2.
[015] A FIGURA 1C mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 3.
[016] A FIGURA 1D mostra a estrutura tridimensional predita do Pep 4.
[017] A FIGURA 1E mostra o comportamento de agregação dos peptídeos Pep 1, Pep 2, Pep 3 e Pep 4 em solução.
[018] A FIGURA 2A mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 12 horas.
[019] A FIGURA 2B mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 24 horas.
[020] A FIGURA 2C mostra uma análise de expressão de NFkB após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 48 horas.
[021] A FIGURA 3A mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-α, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados por 12 horas.
[022] A FIGURA 3B mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-α, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados por 24 horas.
[023] A FIGURA 3C mostra uma análise de expressão de NFkB, usando uma molécula de ativação, o TNF-α, não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados por 48 horas.
[024] A FIGURA 4A mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-α e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 12 horas.
[025] A FIGURA 4B mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-α e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 24 horas.
[026] A FIGURA 4C mostra uma análise de expressão de NFkB, quando as células foram pré-tratadas com TNF-α e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 48 horas.
[027] A FIGURA 5A mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 12 horas.
[028] A FIGURA 5B mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 24 horas.
[029] A FIGURA 5C mostra uma análise da via de sinalizao de IFN após tratamento com os peptídeos sintetizados aqui descritos por 48 horas.
[030] A FIGURA 6A mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 12 horas.
[031] A FIGURA 6B mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 24 horas.
[032] A FIGURA 6C mostra uma análise da via de sinalizao de IFN, quando as células foram pré-tratadas com IFN e os peptídeos foram adicionados posteriormente, após tratamento das células por 48 horas.
[033] A FIGURA 7A mostra a capacidade dos peptídeos em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas de tratamento com os peptídeos sintetizados.
[034] A FIGURA 7B mostra a capacidade dos peptídeos em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4, quando as células foram pré-tratadas com lipopolissacarídeos (LPS) e os peptídeos sintetizados foram adicionados posteriormente, após 12 horas de tratamento com os peptídeos.
[035] A FIGURA 8A mostra o efeito do tratamento com os peptídeos sintetizados na redução da ativação celular nas células CD11c+ CD86, após 24 horas de tratamento.
[036] A FIGURA 8B mostra o efeito do tratamento com os peptídeos sintetizados na redução da ativação celular nas células CD11c+ CD40+, após 24 horas de tratamento.
[037] A FIGURA 9 mostra a capacidade do peptídeo sintetizado Pep 1 em diminuir a ativaçãoo de células dendríticas, após 24 horas de tratamento.
[038] A FIGURA 10A mostra o efeito do peptídeo sintetizado Pep 1 na liberação de IgE mediada.
[039] A FIGURA 10B mostra o efeito do rIL10 na liberação de IgE mediada.
[040] A FIGURA 11A mostra a redução nos níveis de IL6, quando as células foram tratadas com Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas.
[041] A FIGURA 11B mostra a redução nos níveis de MCP1, quando as células foram tratadas com Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas.
[042] A FIGURA 11C mostra a redução nos níveis de TNF-α, quando as células foram tratadas com Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas.
Descrição detalhada da invenção
[043] O presente pedido de patente descreve 4 peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de Interleucina-10 que compreendem ou consistem das sequências de aminoácidos: peptídeo 1 (Pep 1): SEQ ID No 01; peptídeo 2 (Pep 2): SEQ ID No 02; peptídeo 3 (Pep 3) SEQ ID No 03; peptídeo 4 (Pep 4) SEQ ID No 04. Tais peptídeos apresentaram atividade importante sobre vias moduladoras e regulatórias imunológicas. Potanto, podem ser usados no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[044] Os peptídeos descritos no presente pedido de patente foram selecionados utilizando a metodologia Phage Display (PD). Eles foram obtidos aleatoriamente após três ciclos de seleção utilizando uma biblioteca de peptídeos randômicos PhD-7mer e PhD12. A seleção foi realizada utilizando a linhagem celular J774; para isso, uma eluição competitiva com a rIL-10 (Il-10 recombinante) foi adotada para selecionar peptídeos com afinidade ao receptor de IL10.
[045] Uma pré-triagem foi realizada em Células Mononucleares de Sangue Periférico (do inglês PBMC – Peripheral Blood Mononuclear Cell) utilizando sobrenadante de fago para selecionar fagos das bibliotecas de PhD-7mer e PhD12.
[046] Os fagos mais reativos foram purificados e testados contra PBMC para confirmar a capacidade dos fagos selecionados em se ligar a receptores de células.
[047] Os peptídeos com alta afinidade com os receptores celulares foram então quimicamente sintetizados seguindo o manual de seleção de fagos (Barbas, C. F. et al. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)) e suas estruturas tridimensionais foram preditas. Todos eles foram sintetizados de modo a apresentarem a Histidina como primeiro resíduo de aminoácido e uma sequência de três Glicinas e uma Serina como os últimos quatro resíduos de aminoácidos.
[048] O peptídeo 1 (Pep 1), SEQ ID No 01, tem sua estrutura tridimensional, com pontes dissulfeto, predita na Figura 1A.
[049] O peptídeo 2 (Pep 2), SEQ ID No 02, tem sua estrutura tridimensional, sem ponte dissulfufeto, predita na Figura 1B.
[050] O peptídeo 3 (Pep 3), SEQ ID No 03, tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1C.
[051] O peptídeo 4 (Pep 4), SEQ ID No 04, tem sua estrutura tridimensional predita na Figura 1D.
[052] Os Pep 1 e Pep 2 foram sintetizados com uma identidade ou similaridade de cerca de pelo menos 85% entre eles. Os resíduos de aminoácido nas posições três (3) e onze (11) foram substituídos de Serina no Pep 2 para Cisteina no Pep 1. Portanto, o Pep 1 é o único peptídeo que foi sintetizado com ponte dissulfufeto, sendo sua estrutura tridimensional destinta da estrutura do Pep 2 e mais compacta em comparação com Pep 3 e Pep 4. Nas Figuras 1A a 1D, a esfera preta é representativa do átomo C-alfa do primeiro resíduo, apenas para orientação, enquanto os resíduos hidrofílicos estão em azul e os hidrofóbicos em vermelho.
[053] O comportamento de agregação dos peptídeos Pep 1, Pep 2, Pep 3 e Pep 4 em solução foi determinado por Dispersão de Luz Dinâmica (DLS), como pode ser visto na Figura 1E. Todos os peptídeos sintéticos se mostraram aproximadamente 100% monoméricos em solução. O rádio hidrodinâmico medido dos peptídeos foi similar entre Pep 1 (0,82nm), Pep 2 (0,74m), Pep 3 (0,79nm) e Pep 4 (0,86nm).
[054] Uma vez que os peptídeos selecionados foram sintetizados, vários ensaios foram realizados a fim de determinar a atividade desses peptídeos. Vale aqui ressaltar que nos exemplos que demonstraremos abaixo e nas figuras aqui anexadas, todos os peptídeos de um modo geral e em diferentes concentrações mostraram resultados surpreendetes e positivos na modulação da resposta imunológica, inflamatória e alérgica. No entanto, iremos ressaltar aqui ao longo da descrição, apenas a título de exemplo, aqueles resultados que foram estatisticamente mais significativos. Isso não exclui quaisquer outros resultados que não tenham sido expressamente citados nos exemplos ao longo do relatório descritivo, mas que podem ser verificados diretamente nas figuras.
Exemplo 1 - Tratamento de células repórter.
[055] A fim de investigar a capacidade dos peptídeos em interferirem nas vias NFkB, IFN e TLR4, foram utilizadas linhagens celulares repórter. Para analisar se os peptídeos isolados (sem moléculas de ativação) poderiam induzir qualquer tipo de ativação, os peptídeos isolados foram testados nas linhagens celulares durante 12, 24 e 48 horas de tratamento. Em todas as células repórter e em todos os momentos testados, os peptídeos não induziram nenhum tipo de ativação quando estavam sozinhos, sem nenhum ambiente inflamatório para induzir a ativação das vias NFκB, IFN ou TLR4. Como exemplo, as Figura 2A, Figura 2B e Figura 2C mostram uma análise de expressão de NFkB após estímulo com os peptídeos sintetizados aqui descritos. As células foram tratadas durante 12, 24 e 48 horas com os peptídeos sintetizados Pep 1, Pep 2, Pep 3 e Pep 4, em diferentes concentrações, sem moléculas de ativação. A luciferase foi então medida após 12 horas de tratamento (Figura 2A), 24 horas de tratamento (Figura 2B) e 48 horas de tratamento (Figura 2C). Todas as concentrações de peptídeos testadas não foram capazes de induzir qualquer resposta. O TNF-α (200 ng/mL) foi usado como controle positivo.
[056] O ensaio foi então realizado utilizando agora como molécula de ativação o TNF-α não somente no controle, mas após um pré-tratamento com os peptídios sintetizados Pep 1, Pep 2, Pep 3 e Pep 4, em diferentes concentrações. O prétratamento com Pep 1 em todas as concentrações testadas foi capaz de diminuir a ativação de NFκB após 12, 24 e 48 horas (P <0,0005) de estímulo com o TNF-α (Figura 3A, B e C). O pré-tratamento com Pep 2 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 100 µM, 10 µM, 5 µM, 1 µM, 0,5 µM e 0,1 µM, também diminuindo a ativação de NFκB (P <0,0005) após 12, 24 e 48 horas (Figura 3A, B e C). O pré-tratamento com Pep 3 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 0,05 µM (P <0,05) reduzindo a ativação da via após 12 horas de tratamento (Figura 3A) e a 0,01 µM (P <0,05) após 48 horas (Figura 3C). Já o pré-tratamento com Pep 4 teve os resultados estatisticamente mais significativos a 0,05 µM, 0,01 µM e 0,005 µM, reduzindo a ativação da via após 48 horas de tratamento (Figura 3 C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 3 A, B e C, a análise da expressão de NFkB foi realizada em células repórter JurkartDual. As células foram tratadas durante 1 hora com peptídeos e adicionado TNF-α (200 ng/mL). A luciferase foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 3 A) 24 horas de tratamento (Figura 3 B) e 48 horas de tratamento (Figura 3 C).
[057] Outro ensaio foi então realizado em que as células foram pré-tratadas com TNF-α e os peptídeos foram adicionados posteriormente. Por exemplo, os resultados com maior significância estatistica foram: o Pep 1 nas concetrações de 10 µM, 5 µM, 1 µM, 0,5 µM, 0,1 µM (P <0,05), 0,05 µM e 0,001 µM (P < 0,0005) diminui a ativação da via analisada após 12 horas de tratamento (Figura 4A); O Pep 2 nas concetrações de 100 µM (P <0,0005), 10 µM (P <0,005), 5 µM (P <0,05) e 1 µM (P <0,005); o Pep 3 na concetração de 0,005 µM (P <0,005) e o Pep 4 na concetração de 0,5 µM (P <0,05) também foram capazes de diminuir a sinalização de NFκB após 12 horas de tratamento (Figura 4A). Já após 24 horas de tratamento com os peptídeos, os resultados com maior significância estatistica foram: o Pep 1 a 100 µM (P <0,0005), 10 µM (P <0,005), 1 µM (P <0,0005), 0,1 µM (P <0,05), 0,005 µM (P <0,0005), 0,001 µM (P <0,005) e 0,0001 µM (P <0,0005); Pep 2 a 100 µM (P <0,0005), 5 µM (P <0,005), 1 µM (0,0005) e 0,5 µM (P <0,05); Pep 3 a 10 µM (P <0,05), 0,005 µM (P <0,05) e 0,001 µM (P <0,05), onde a via de sinalização analisada obteve menor ativação (Figura 4B). Após 48 horas de tratamento, o Pep 1 na concentração de 0,001 µM (P <0,05) foi o que obteve resultado com maior significância estatística na diminuição da sinalização de NFκB (Figura 4C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 4 A, B e C, a análise da expressão de NFkB foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. As células foram tratadas durante 1 hora com TNF-α (200 ng/mL) e os peptídeos foram adicionados. A luciferase foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 4A) 24 horas de tratamento (Figura 4B) e 48 horas de tratamento (Figura 4C). Utilizou-se TNF-α (200ng/mL) como controle positivo e rIL-10 (Interleuciona-10 recombinante) (0,4ng/mL) como controle negativo. * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
[058] A análise da via de sinalização de IFN demonstrou que a ativação da via foi diminuída quando as células Jurkat foram pré-tratadas com Pep 1 a 10 µM (P <0,005) durante 12 horas (Figura 5A); Pep 3 a 100 µM (0,005) durante 48 horas (Figura 5C); e Pep 4 a 100 µM (P <0,005) e 0,05 µM (P <0,05) durante 48 horas (Figura 5C). Quando as células foram prétratadas com IFN, embora os peptídeos, em algumas concentrações, tenham indicado resultado, os mesmos não tiveram suficiência estatística. Por tanto, não podemos confirmar se os mesmos foram capazes de interferir na ativação da via (Figura 6A, B e C) de forma igual ou melhor do que o controle negativo (rIL-10). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 5 (A, B e C) e Figuras 6 (A, B e C), a análise da expressão de IFN foi realizada em células repórter Jurkart-Dual. Nos ensaios mostrados pelas Figuras 5 A, B e C, as células foram tratadas durante 1 hora com peptídeos com posterior adição de IFN-α (104 EU/mL). A produção de fosfatase alcalina embrionária secretada (do inglês – Secreted Embryonic Alcaline Phosphatase - SEAP) foi medida após 12 horas de tratamento (Figura 5A) 24 horas de tratamento (Figura 5B) e 48 horas de tratamento (Figura 5C). Nos ensaios mostrados pelas Figuras 6 A, B e C, as células foram tratadas durante 1 hora com IFN-α (104 EU/mL) com posterior adição dos peptídeos. A produção de SEAP foi medida após (D) 12 horas de tratamento (E) 24 horas de tratamento e (F) 48 horas de tratamento. Utilizou-se IFN-α (104 EU/mL) como controle positivo e rIL-10 (0,4 ng/mL) como controle negativo. * P <0,05.
[059] As células HEK foram utilizadas para investigar a capacidade dos peptídeos em reduzir a ativação da via de sinalização do TLR4 após 12 horas de tratamento. O prétratamento com os peptídeos demonstrou que Pep 1 a 0,005 µM (P <0,05); Pep 2 a 100 µM (P <0,05), 0,1 µM (P <0,0005); Pep 3 a 100 µM (P <0,05) e Pep 4 a 100 µM (P <0,05), 10 µM (P <0,005), 5 µM (p <0,05) e 1 µM (P <0,05) reduziram mais significativamente a ativação da via (Figura 7A). Por outro lado, quando as células foram pré-tratadas com lipopolissacarídeos (LPS) e os peptídeos foram adicionados, a ativação da via de TLR4 foi reduzida mais significativamente quando adicionado Pep 1 a 0,1 µM (P <0,05), 0,05 µM (P <0,05), 0,01 µM (P <0,005), 0,005 µM (P <0,005) e 0,001 µM (P <0,005); Pep2 a 100 µM (P <0,05), 1 µM (P <0,005), 0,5 µM (P <0,05), 0,1 µM (P <0,05), 0,05 µM (P <0,05) e 0,01 µM (P <0,005); Pep 3 a 100 µM (P <0,0005), 10 µM (P <0,005), 0,5 µM (P <0,05) e 0,1 µM (P <0,05); Pep 4 a 100 µM (P <0,0005), 10 µM (P <0,05), 5 µM (P <0,005), 1 µM (P <0,05) e 0,5 µM (P <0,005) (Figura 7B).
[060] No ensaio mostrado pela Figuras 7A as células foram tratadas 1 hora com peptídeos e LPS (100ng/mL) foi adicionado. A produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento. No ensaio mostrado pela Figuras 7B as células foram tratadas com LPS (100ng/mL) por 1 hora e os peptídeos foram adicionados. A produção de SEAP foi medida após 12 horas de tratamento. LPS (100 ng/mL) foi usado como controle positivo e IL-10 (0,4ng/mL) como controle negativo. * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
Exemplo 2 - Efeito dos peptídeos sobre células dendríticas e T em ambiente inflamatório e alérgico
[061] Células dendríticas murinas da medula óssea foram isoladas de camundongos para analisar o efeito dos peptídeos sintetizados Pep 1, Pep 2, Pep 3 e Pep 4, em duas concentrações, 1 µM e 10 µM, na redução da ativação celular. Após 24 horas de tratamento com composição compreendendo ao menos um dos peptídeos na concentração desejada, a análise celular mostrou que todos os quatro peptídeos sintetizados apresentaram respostas em diferentes níveis e foram capazes de interferir nas moléculas co-estimulatórias presentes na superfície das células dendríticas, sendo os peptídeos Pep 1 e 2 os que apresentaram melhor resposta. Por exemplo, o Pep 1 a 1 µM diminuiu a expressação de CD86+ (P<0.005), e a 10 µM também diminuiu a expressação de CD86+ (P<0.05). O Pep 2 a 1 µM reduziu a expressão de CD86+ e de CD40+ na superfície celular (P <0,005; P <0,05, respectivamente) (Figura 8 A e B).
[062] Nos ensaios foram usadas células CD11c+ CD86 (Figuras 8A) e células CD11c+ CD40+ (Figuras 8B) após 24 horas de tratamento. LPS (100ng/mL) foi usado como controle positivo. * P <0,05; ** P <0,005.
[063] A fim de confirmar a capacidade dos peptídeos sintetizados em diminuir a ativação de células dendríticas, uma composição compreendendo o Pep 1 a 10 µM de concentração foi escolhida e a proliferação de células T, de pacientes alérgicos, foi mensurado após 24 horas de tratamento. O Pep 1 nesta concentração diminuiu a proliferação de células T (P <0,005) (Figura 9). As células foram tratadas com Bet v 1, como controle positivo e um peptídeo irrelevante (IR) foi usado como um controle negativo.
[064] Todos os quatro peptídeos sintetizados apresentaram efeito sob células imunológicas em ambientes inflamatório e alérgico, confirmando a capacidade dos mesmos em modular a reposta imológica. Mais ainda, os resultados aqui apresentados demonstram o potencial de associação desses peptídeos, uma vez que eles apresentaram respostas distintas e em vários casos complementares no que diz respeito a concentração e tempo de exposição com melhor resposta. Portanto, fica claro que os mesmos podem ser usados sozinhos ou em quaisquer combinação ente eles, em composições para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de doenças aonde haja uma desordem imunológica, mais particularmente em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou autoimunes.
[065] Uma vez que todos os peptídeos apresentaram resposta, selecionamos o Pep 1 para aprofundar ainda mais com os estudos. Tais resultados podem ser extrapolados para os demais peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de IL-10 sintetizados e demonstrados no presente pedido de patente.
Exemplo 3 - Ação do Pep 1 na degranulação de basófilos
[066] O efeito do Pep 1 na liberação de IgE mediada foi examinado utilizando células de leucemia basofílica de rato transfectadas com o receptor FcεRI IgE humano (hRBL). As células hRBL foram sensibilizadas com soro de sete pacientes alérgicos ao pólen de bétula. As células foram estimuladas com o antígeno e a sua interação com IgEs imobilizadas causou uma liberação de β-hexosaminidase.
[067] Quando as células foram tratadas com uma composição compreendendo o Pep 1 a 1 µM (Figura 10A) ou rIL10 (Figura 10B), a quantidade de Bet v 1 necessária para induzir a mesma quantidade de degranulação foi superior quando comparada com as células tratadas apenas com Bet v1 ( P <0,05). Quantidade de rBet v 1 (ng/mL) necessária para induzir metade da liberação de β-hexosaminidase usando soro de sete doadores alérgicos a pólen de bétula após o tratamento com Pep 1 (A) (P <0,05) e rIL10 (B) * P <0,05.
Exemplo 4 - Produção de citocinas após o tratamento da linhagem celular J774 com Pep 1
[068] Após 24 horas de tratamento, os níveis de IL-6, MCP-1 e TNF-α produzidos foram mensurados. Não foi observada interferência na produção de IL-10, IFN-γ ou IL12p70 (dados não mostrados). As células tratadas apenas com o peptídeo sintético Pep 1, sem estímulo de LPS para induzir uma resposta inflamatória, foi incapazes de induzir qualquer resposta (dados não mostrados). Por outro lado, quando as células foram tratadas com um composição compreendendo o Pep 1 seguido de incubação com LPS (1 mg/mL) durante 24 horas para induzir uma resposta inflamatória, o peptídeo foi capaz de diminuir a produção de IL-6, MCP-1 e TNF-α.
[069] O Pep1 (1 µM, 10 µM e 100 µM, 1 µM P <0,05 e 10 µM e 100 µM P < 0,0005) reduziu significativamente os níveis de IL-6 (1 µM e 10 µM, P <0,05) (Figura 11A); MCP-1 (Figura 11B) e TNF-α (1 µM, 10 µM e 100 µM, P <0,005) (Figura 11C). Cada diminuição foi significativa em comparação com células tratadas apenas com LPS (controle positivo). * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005
Análise dos resultados apresentados nos exemplos e modalidades da invenção
[070] Para analisar se a estrutura é determinante para a ativação da ligação e uma resposta celular ou se apenas a seqüência é suficiente para induzir este efeito, como explicamos acima, decidimos sintetizar um único peptídeo conformacional, o Pep 1, com ponte dissulfeto e uma identidade ou similaridade de pelo menos 85% com o Pep 2, e os demais com cadeia linear (sem ponte dissulfeto). As estruturas de todos os 4 peptídeos foram preditas para investigar suas diferenças de conformação. O Pep 1 apresentou estrutura mais compacta em comparação aos peptídeos 2, 3 e 4 (Figura 1 A, B, C e D). Todos os peptídeos sintéticos apresentaram resposta, sendo que os compactos mostraram-se melhores para induzir uma resposta, uma vez que a conformação é muito importante para a ativação de receptores. Todos os peptídeos sintéticos se apresentam como monómero conforme mostrado nos resultados de DLS (Figura 1E).
[071] A citocina IL-10 se liga ao IL-10R, ativando assim a sinalização JAK/STAT20; essa via possui um mecanismo principal para a produção de citocinas capaz de controlar uma resposta inflamatória. Entretanto, diferentes citocinas podem ativar essa via, então, a sua ativação é dependente de qual família JAK e STAT é ativada e, portanto, responsável por induzir o efeito anti-inflamatório ou não. A produção de SOCS 3 é mediada por IL-10R e pode interferir na liberação de IκB do complexo NFκB em células intactas e/ou bloqueia a ligação de DNA de NF-κB já presente no núcleo e como conseqüência bloqueia a expressão de NFκB. A produção de SOCS 3 também pode inibir a via de sinalização do LPS, ativando a via de TLR4, embora esse mecanismo seja complexo e não totalmente elucidado. Para investigar a capacidade dos peptídeos bloquearem a ativação de vias inflamatórias, as células repórter foram tratadas com os peptídeos antes ou após a adição de moléculas de ativação (TNF-α, IFN-α e LPS), a fim de explorar novas estratégias de tratamento.
[072] Após o pré-tratamento com os peptídeos sintéticos, o Pep 1 apresentou melhor capacidade de interferir nas vias analisadas, comparado com Pep 2, Pep 3 e Pep 4. Em todas as concentrações testadas e em todos os momentos, Pep 1 foi capaz de reduzir a expressão de NFκB; esta resposta foi mantida ao longo de 48 horas de tratamento. O Pep 2 também interferiu nestas vias mesmo após 48 horas, mas com uma significância maior apenas em algumas concentrações testadas (100 µM, 10 µM, 5 µM, 1 µM, 0,5 µM e 0,1 µM). A mesma ação não ocorreu de forma tão significativa quando as células foram tratadas com Pep 3 ou Pep 4, então, concluímos que esses dois peptídeos muito embora tenham produzido resposta e, portanto, apresentam potencial de uso, essa resposta não foi tão estável como observado no tratamento com o Pep 1 e 2. Ao mesmo tempo, quando as células foram pré-tratadas com TNF-α (para ativar a via de NFκB), confirmamos a melhor ação de Pep 1 mesmo quando as células já haviam sido ativadas; todas as concentrações testadas diminuíram a ativação do NFκB após 12 e 24 horas. Ação semelhante foi encontrada na via do TLR4 onde Pep 1 apresentou estabilidade (em diferentes concentrações) quando a via foi ativada antes do tratamento com o peptídeo. Essa melhor ação observada após o tratamento com Pep 1 pode ser explicada pela ponte dissulfeto presente no peptídeo levando a uma melhor conformação necessária para ativar o receptor e induzir a diminuição das vias investigadas. Por outro lado, essa diferença de ação dos peptídeos sintetizados indica a possibilidade de usá-los em combinação, seja ela qualquer combinação de dois ou mais dentre eles, a fim de se obter um resultado sinérgico, melhorado e/ou por tempo prolongado, dependendo do objetivo, uma vez que os mesmos demonstraram ação diferente dependendo da concentração e do tempo de exposição.
[073] Quando as células Jurkat foram utilizadas para investigar a capacidade dos peptídeos inibirem a via do IFNα, os peptídeos produziram uma diminuição estatística em concentrações específicas, esta resposta pode não ser estável porque, embora o IFN-αβ também induza a sinalização JAK-STAT, a ativação é desencadeada, preferencialmente, por STAT4, 1 e 2 em vez de STAT3, como ocorre após a ligação de IL-10 ao IL-10R. Além disso, o rIL-10 também pode induzir a produção de IFN, sugerindo que a citocina é capaz de interagir com ambas as vias de sinalização.
[074] Em estudos do mecanismo de tolerância imune aos alérgenos, a investigação tem demonstrado o papel da IL-10 na redução da expressão de moléculas co-estimuladoras em células apresentadoras de antígenos (do inglês: Antígen Presenting Celles – APCs) e, consequentemente, as células T não serão ativadas e não proliferaram, suprimindo assim a exacerbação da inflamação, considerada a via crítica para prevenir uma resposta inflamatória alérgica grave. Corroborando com essa ideia, os peptídeos sintetizados reduziram as moléculas co-estimulatórias nas células dendríticas (Figura 8 A e B), demonstrando capacidade e ação estáveis. Embora todos os peptídeos sintetizados tenham apresentado resultados com potencial de uso, principalente os Pep 1 e 2, escolhemos o Pep 1 para utilização em alguns experimentos para investigar a sua ação regulatória, um efeito confirmado pela diminuição da proliferação de células T em pacientes alérgicos (Figura 9). No entanto, TLR4 foi mostrado presente em células dendríticas, uma vez que o Pep 1 e 2 diminuíram estatisticamente esta via de ativação, em células repórter, e também as moléculas co-estimulatórias em células dendríticas. Podemos aceitar a hipótese de que os peptídeos aqui sintetizados podem então atuar em ambos os casos: diretamente na via TLR4 para diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias e também reduzir a apresentação do antígeno às células T e conseqüentemente diminuir a sua proliferação.
[075] Outra ação da IL-10 na resposta alérgica é a inibição do receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI) em mastócitos humanos e murinos, reduzindo assim a liberação de β-hexosaminidase. Além disso, a citocina interfere nas moléculas reguladoras (Fyn, Syk, Akt e STAT5) encontradas em mastócitos ativados. Como os mastócitos e basófilos apresentam crosstalk semelhante entre o FcεRI e IgE31, podemos supor que a IL-10 tenha o mesmo efeito em diminuir a expressão de FcεRI no basófilo como nos mastócitos, o que pode explicar como Pep1 pode diminuir a degranulação de basófilos observada no ensaio RBL (Figura 10).
[076] Os macrófagos são células importantes encontradas nas respostas inflamatórias. O tratamento com LPS induz a transcrição de NF-κB e MAPK32 e, posteriormente, a produção de IL-6, MCP-1 e TNF-α33. Entretanto, o tratamento de macrófagos com a molécula IL-10, em ambiente inflamatório, é capaz de regular negativamente a produção de TNF-α, MCP-1 e IL-634. Este achado sugere que os peptídeos aqui sintetizados apresentam uma atividade similar à da molécula nativa, uma vez que o tratamento com Pep 1 diminuiu essas citocinas após o tratamento da linhagem celular J447 com o LPS (Figura 11). A produção de MPC-1 e IL-6 em ambiente inflamatório possibilita a ativação de monócitos, linfócitos T de memória, células natural killer (NK) e macrófagos. Por isso, uma nova estratégia para bloquear ou diminuir essas citocinas deve constituir um tratamento interessante contra um alvo específico. Portanto, os peptídeos aqui sintetizados, Pep 1, 2, 3 e 4, podem ser usados sozinhos ou em qualquer combinação entre eles, no tratamento de doenças relacionadas a desordem imunológica, como por exemplo: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes, dada a capacidade destes peptídeos de modular a sinalização de NFκB e TLR4, ativação de célelas dendríticas, proliferação de células T e degranulação de basófilos.
[077] Pep 1 apresentou melhor capacidade de interagir com receptores celulares em células repórter, BMDCs (Células dendríticas murinas da medula óssea), basófilos, células T e linhagem celular J774, e se mostrou capaz de regular uma resposta inflamatória alérgica melhor do que quando comparado a Pep 2, Pep 3 e Pep 4. No entanto, todos estes peptídeos sintéticos demonstraram capacidade de modular uma resposta inflamatória alérgica em níveis diferentes e estes podem ser usados no desenvolvimento de composições farmacêuticas, sozinhos ou em qualquer combinação com outros peptídeos ou compostos, para desenvolver novos tratamentos ou na prevenção de doenças inflamatórias e/ou alérgicas.
[078] Portanto, o presente pedido de patente descreve Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de Interleucina-10 compreendendo ou consistindo uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que compreende: SEQ ID No 01, SEQ ID No 02, SEQ ID No 03 e SEQ ID No 04, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com umas das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID No 01, SEQ ID No 02, SEQ ID No 03 e SEQ ID No 04. O Peptídeo compreendendo ou consistindo da sequência SEQ ID No 01 apresenta conformação tridimensional com pontes dissulfeto. O peptídeo compreendendo ou consistindo da sequência SEQ ID No 02, SEQ ID No 03 ou SEQ ID No 04 apresenta conformação tridimensional isenta de pontes dissulfeto. Os Peptídeos sintéticos são para serem utilizados em composições farmacêuticas para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[079] O presente pedido também descreve métodos de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica em que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos sintéticos descritos, ou administrar uma composição farmacêutica ou imunogênica compreendo pelo menos um dos peptídeos sintéticos descritos.
[080] O presente pedido também descreve composições farmacêuticas ou imunogênicas que compreendem pelo menos um dos peptídeos sintéticos aqui descritos, mais, pelo menos, um veículo ou composto farmacêuticamente aceito. A Composição farmacêutica ou imunogênica é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica, em que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
[081] Adicionalmente, o presente pedido também descreve o uso dos peptídeos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
[082] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a título de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.
[083] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente ivenção, equivalentes aos peptídeos sintéticos, composições ou usos aqui descritos, sem se distanciar do escopo da presente invenção.

Claims (11)

  1. Peptídeo sintético com afinidade ao receptor de Interleucina-10 caracterizado pelo fato de que compreende uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID No 01, SEQ ID No 02, SEQ ID No 03 e SEQ ID No 04, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID No 01, SEQ ID No 02, SEQ ID No 03 e SEQ ID No 04 .
  2. Peptídeo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreendendo a SEQ ID No 01 apresenta comformação tridimensional com pontes dissulfeto.
  3. Peptídeo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreendendo a SEQ ID No 02, SEQ ID No 03 ou SEQ ID No 04, apresenta conformação tridimensional isenta de pontes dissulfeto.
  4. Peptídeo sintético de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para ser utilizado em composições farmacêuticas para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
  5. Peptídeo sintético de acordo areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
  6. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos peptídeos sintéticos tal como descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e pelo menos um veículo, carreador ou composto farmacêuticamente aceitável.
  7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
  8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou autoimunes.
  9. Uso de ao menos um peptídeo sintético tal como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou da composição farmacêutica tal como descrito na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia de doenças relacionadas a desordem imunológica.
  10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a desordem imunológica são: doenças inflamatórias crônicas ou agudas, alérgicas e/ou auto-imunes.
  11. Método de tratamento e/ou profilático de doenças relacionadas a desordem imunológica, caracterizada pelo fato de que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos recombinantes tal como descritos em qualquer um das reivindicações 1 a 5 ou uma composição farmacêutica tal como descrita na reivindicação 6.
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