BG67257B1

BG67257B1 - Бактериален щам bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum bs89 като средство за повишаване на продуктивността на растенията и тяхната защита срещу болести

Info

Publication number: BG67257B1
Application number: BG112709A
Authority: BG
Inventors: Владимир Чеботарь; Кузьмич Чеботарь Владимир; Сергей Ерофеев; Викторович Ерофеев Сергей
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "БИСОЛБИ ПЛЮС"
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2016-09-01
Publication date: 2021-02-26
Also published as: PH12018550036A1; WO2017039491A1; RU2599416C1; RS20180250A1; CN110520519A; BG112709A; US20200029571A1; UA121062C2; TR201806559T1

Abstract

Изобретението се отнася към биотехнологиите и селското стопанство. Бактериалният щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 е средство за повишаване на продуктивността на растенията и тяхната защита срещу болести. Щамът е депозиран във Ведомствената колекция на Федералното държавно бюджетно научно учреждение "Руски научноизследователски институт по селскостопанска микробиология" под номер RCAM 03458. Щамът притежава високо фунгицидно действие срещу фитопатогенни гъби и бактерицидно действие срещу фитопатогенни бактерии, а също така високо ръстостимулиращо действие по отношение на различни селскостопански култури и по-специално пшеница, ечемик, картофи, зеле, захарно цвекло, лен, слънчоглед.

Description

(54) БАКТЕРИАЛЕН ЩАМ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM BS89 КАТО СРЕДСТВО ЗА ПОВИШАВАНЕ HA ПРОДУКТИВНОСТТА HA РАСТЕНИЯТА И ТЯХНАТА ЗАЩИТА СРЕЩУ БОЛЕСТИ

Област на техниката

Настоящото изобретение е от областта на биотехнологиите и селското стопанство и е свързано с новия щам ризосферни бактерии от рода Bacillus, като средство за повишаване на продуктивността на растенията и защитата им от фитопатогенни микроорганизми.

Предшестващо състояние на техниката

Модерното високоефективно селскостопанско производство е немислимо без използването на торове и препарати за растителна защита. Например широко разпространеното прилагане на минерални торове, и поспециално на азотни, през последните 50 години повиши с повече от 5 пъти добива на основните селскостопански култури в развитите страни. Процесът на получаване и използване на минерални азотни торове обаче е изключително енергийно интензивен - разходва от 30 до 50% от общата енергия, потребявана в селскостопанското производство.

Понастоящем има много микробиологични препарати за селското стопанство с различно предназначение: стимулиращи растежа, потискащи развитието на фитопатогенни бактерии и гъби.

Микроорганизмите могат да стимулират растежа им (Azospirillum), да се свързват с азотните атоми (Rhizobium), да предотвратяват болестите при растенията (Pseudomonas или Bacillus) или да унищожават вредните насекоми (Streptomyces).

Известният „Метод за третиране на семената“, описан в заявка от Великобритания с декларация за приоритет № GB 2170987 от 14.02.1985 г. МКИ 4 А 01 С 1/06, публикуван в ИСУ № 10 за 1987 г., предвижда третиране на семената с препарат, съдържащ микроорганизми, носител, като трици например и лепило от типа на гума гати. Най-добри резултати се получават при третиране на семена от пшеница.

Известен е патентът RU № 2140138 за група изобретения „Метод за предпосевно третиране на зеленчукови семена и метод за получаване на препарат за предпосевно третиране на зеленчуковите семена“ по заявка с декларация за приоритет № 98120341 от 13.11.1998 г. от фирма ЗАО ССПР „СОРТСЕМОВОЩ , МГЖ А01С1 /06, публикувано на 27.10.1999 г.

Описаните методи предвиждат използването на биофунгициден продукт, съдържащ бактериален щам Bacillus subtilis 4-13 (депозиран с per. № ВНИИСХМ Д-606 в групата на микроорганизмите епифити).

Методът за получаване на биофунгицидния продукт се състои в смесването на културална течност, съдържаща щама B.s. 4-13, предварително култивиран в течна стерилна хранителна среда, с поливинилацетатна емулсия, воден разредител и стерилна креда или доломит в определени пропорции. Изобретенията спомагат за повишаване ефективността на защитата на зеленчуковите култури срещу фитопатогенни гъби чрез предпосевно третиране на семената.

Известен е патентът RU № 2099947 за изобретението „Биопрепарат „Фитоспорин“ за защита на растенията срещу болести“ по заявка с декларация за приоритет № 96121980 от 15.11.1996 г. от Института по микробиология и вирусология към Националната академия на науките на Украйна (UA) и НПО „Башкирское (RU), МПК А01N63/00; С12N1 /20; С12R1:125, публикувано на 27.12.1997 г.

BG 67257 Bl

Биопрепаратът „Фитоспорин“ е създаден на базата на бактериален щам Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с клетъчна концентрация 10⁹ - 10¹⁰ на 1 ml физиологичен разтвор с обем 92-98 об. % и пълнител с обем 2-8 об. %.

Щамът Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 се отличава с висока антагонистична активност по отношение на фитопатогенните бактерии и гъби, което позволява използването му за защита на различни видове селскостопански (зърнени и бобови) и декоративни дървесни растения чрез предпосевно третиране на семената.

Известен е патентът RU № 2478290 за изобретението „Биопрепарат за стимулиране на растежа и защита на растенията срещу болести, за увеличаване на добива и почвеното плодородие към патент RU № 2478290 (заявка № 2011145665) с декларация за приоритет от 11.11.2011 г. от фирма ООО „Бациз“, МПК A01N63/02, А01С1/06. C12N1/20. С12R1/07, с дата на публикация на заявката 20.05.2012 г., а на патента - 10.04.2013 г. Биопрепаратът съдържа биомаса Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 и хумата в следното съотношение на съставките, в об. %: биомаса от вегетативни клетки и спори на бактерията Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 - 1,24 - 4,30 х 10¹⁰ KOE/ml културална течност и 94 % съдържание на спори от общото количество КОЕ - 99,0, хумати - 1.0. Биопрепаратът осигурява защита на растенията срещу гъбни и бактериални болести, подобрява фитосанитарното състояние на почвата, като повишава нейното плодородие, спомага за увеличаването на добива.

Недостатък е ограничената област на приложение (само при зърнените култури: пшеница и ечемик), както и необходимостта от завишен титър на клетки и спори на продуциращия щам в състава на препарата с цел ефикасното му прилагане.

Известен е патентът RU № 2528058 за изобретението „Бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens с фунгицидно и бактерицидно действие и базиран на него биологичен препарат за защита на зърнените култури срещу болести, причинени от фитопатогенни гъби по заявка с декларация за приоритет № 2013125726 от 04.06.2013 г., подадена от предприятието ФГУП „ГосНИИгенетика“, МПК A01N63/02, А01С1/06, C12N1/20, C12R1/07, с дата на публикацията 10.09.2014 г.

Описаният бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 има фунгицидно и бактерицидно действие. Също така се предлага биологичен препарат за защита на зърнените култури срещу болести, причинени от фитопатогенни гъби. Биологичният препарат се получава чрез смесване на активна съставка, която представлява културална течност на посочения щам при титър 2-3 х 10⁹ KOE/ml и носител под формата на фини гранули диатомична пръст в обемно съотношение 1:3, последвано от сушене.

Изобретенията дават възможност за увеличаване на зърнодобива и намаляване процента на инфектиране с фитопатогенни гъби.

Недостатък е ограничената област на приложение (само при зърнени култури) и липсата на бактерицидна активност при щама.

Известна е заявка за патент от Китай CN102703354 (А) от 03.10.2012 г. за бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B203 c проявен фунгициден ефект срещу антракноза по ягодите и някои други болести, причинени от гъби, МПК A01N63/00, -/02, А01РЗ/00, Cl2N1 /20, С12R1 /07 и заявка за патент от Китай CN 104195072 (А) от 10.12.2014 г. въз основа на национална заявка CN 20141385641 с декларация

BG 67257 Bl за приоритет от 06.08.2014 г. за бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B232 c проявен фунгициден ефект срещу некроза по кората на тополата и някои други гъбни болести, МПК A01N63/00. А01РЗ/00, С12N1/20, С12R1/07.

Недостатък на описаните щамове е ограничената област на приложение (ягоди, топола) и липсата на бактерицидна активност. Освен това в патентите не се уточняват стойностите на титрите на препарата, при които се отчита ефективен контрол върху гъбните болести по ягодите и тополата съответно.

Известна е заявка за патент от Румъния R 0127468 (А2) от 29.06.2012 г. въз основа на национална заявка RO 20100001379 с декларация за приоритет от 21.12.2010 г. за изобретението „Щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum В100 за растеж на селскостопанските култури“, МПК A01N63/00; Cl 2N1 /20. Щамът показва фунгициден (продуциране на липопептидни и поликетидни антибиотици) и бактерициден ефект срещу широк спектър фитопатогенни гъби в почвата и бактериални заболявания по плодните дървета, както и стимулиращ ефект, дължащ се на произвежданите от ендофитите растежни фактори. Може да продуцира редица ензими: протеаза, лактоназа, амилаза, фитаза и целулаза. Способен е да разтваря неорганични съединения на фосфора и селена. Може да се използва за заздравяване на зърнените култури (пшеница и царевица) в райони с недостиг на селен.

В тази публикация не се посочва титъра на Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum В100, необходим за приготвянето на препарата при използването на този бактериален щам, за да се контролират болестите по растенията. Друг недостатък е ограничената област на приложение (зърнени култури и плодни дървета).

Известна е още международна заявка WO 2012130221 (А2) от 24.03.2012 г„ основаваща се на националната заявка от Германия DE 20111015803 с декларация за приоритет от 01.04.2011 г. за изобретението „Препарат срещу фитопатогенни микроорганизми“, МПК A01N63/00, С07К14/32, C12N1/20, C12R1/07.

Описаният в нея нов щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum_AB101 е много ефективен срещу черното кореново гниене („струпясване“) по картофите, предизвикано от Rhizoctonia solani.

Разработен е противогьбичен препарат „Бактериоцин“ за лекуване на гъбни и други микробни и вирусни инфекции, получен на базата на бактериалните спори Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AB 101, които имат силен ефект срещу грам-положителните бактерии.

Щамът Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum продуцира 10 различни вещества: фунгицидни (антибиотични вещества от различни групи: дипептиди, липопептиди и сидерофори). бактерицидни (поликетиди и бактериоцини) и антивирусни срещу широк спектър болести по растенията и по-специално срещу черното кореново гниене по картофите, предизвикано от фитопатогенната гъба Rhizoctonia solani. Има приложение в селското стопанство за растителна защита и в биотехнологиите.

В публикацията не се посочва титъра на щама, необходим за приготвянето на препарата при използването на тези бактерии, за да се контролират болестите по растенията.

Друг недостатък е ограничената област на приложение - описва се предимно ефектът срещу черното кореново гниене по картофите, предизвикано от фитопатогенната гъба Rhizoctonia solani.

Известен е патент № RU 2495119 за изобретението „Бактериален щам Bacillus subtilis 8А като средство за повишаване на продуктивността на растенията и защитата им срещу фитопатогенни микроорганизми по

BG 67257 Bl заявка № 2012151104 c декларация за приоритет от 29.11.2012 г. от Държавното научно учреждение „Руски научноизследователски институт по селскостопанска микробиология“ (ГНУ ВНИИСХМ) към Селскостопанската академия на Русия, който е избран за прототип.

Щамът е депозиран в колекцията на Държавното научно заведение „Руски научноизследователски институт по селскостопанска микробиология“ към Селскостопанската академия на Русия на 14.11.2011 г. под номер RCAM 00876, като средство за повишаване на продуктивността на растенията и защитата им срещу фитопатогенни микроорганизми.

Въпросният щам се отличава с висока фунгицидна и бактерицидна активност. Отчетена е също така висока стимулираща растежа активност на щама Bacillus subtilis 8А и базирания на него биопрепарат, което води до повишаване на добива. Експериментално е доказано, че ефективността на щама се дължи на способността на бактериите да образуват с растенията микробно-растителна система чрез колонизиране на ризосферата и кореновата система на растенията.

Поради факта, бактериалните щамове от таксономичната група Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum са депозирани в колекции, намиращи на далечно териториално разстояние от заявителя (дори в други държави), както и че в някои публикации не се посочва титъра на бактериалния щам, необходим за приготвянето на биопрепарата, за прототип е избран достъпният на заявителя бактериален щам Bacillus subtilis 8А, депозиран в колекцията на Държавното научно заведение „Руски научноизследователски институт по селскостопанска микробиология“.

Техническа същност на изобретението

Целта на изобретението да се изолира щам на ризосферни бактерии, подходящ за използване в селското стопанство, като продукт за защита на растенията от фитопатогенни микроорганизми, за подобряване на храненето на селскостопанските култури и повишаване на продуктивността на растенията, а също така позволяващ да се разшири арсеналът от подобни средства.

Целта се постига благодарение на факта, че като средство за повишаване на продуктивността на растенията и защитата им срещу фитопатогенни микроорганизми в селското стопанство се използва щам на ризосферните бактерии Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, който позволява да се разшири арсеналът от подобни средства.

Щамът на ризосферните бактерии Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 е изолиран от корен на зимна пшеница от сорта „Лира”, отглеждан на черноземни почви в Краснодарския край на Руската федерация.

Щамът е депозиран във Ведомствената колекция от полезни микроорганизми за селскостопански цели (RCAM) на Федералното държавно бюджетно научно учреждение „Руски научноизследователски институт по селскостопанска микробиология“ на 09.07.2015 г. под номер RCAM 03458, като средство за повишаване на продуктивността на растенията и защитата им срещу фитопатогенни микроорганизми (прилага се копие от сертификата за депозиране).

Щамът се характеризира със следните морфологично, културални и физиологично-биохимични свойства.

BG 67257 Bl

Клетките имат правилна пръчковидна форма със заоблени краища и монополярно перитрихиално разположени ресни. Размерът им е (0,9-1,8) мкм. Щамът образува спори, разположени в средата на клетката, дава положително оцветяване по Грам. След 24-часов период на растеж на течна хранителна среда се наблюдава натрупване на поли-Р-оксибутират. Растежът на течна и полутечна хранителна среда е микроаерофилен, метаболизмът - дихателен и ферментационен. Върху месопептонен агар образува сухи колонии с кремав цвят и пастообразна консистенция с грапави назъбени краища.

Колониите са с диаметър (5-12) mm. Оптималната температура за растеж е 33°С. При температура над 45°С и под 15°С растежът е бавен. Оптималната стойност на pH на средата е 6,8, растеж се наблюдава и при pH от 4,5 до 9.0. Щамът хидролизира казеин, желатин, нишесте и лакмусово мляко, като лакмусът се обезцветява. Щамът се отличава с висока каталазна активност, с амилазна, протеазна, липазна и фосфолипазна активност. Наблюдава се растеж при 50°С, 10% NaCI и 0,001% лизоцим.

Като единствен източник на въглерод, щамът използва арабиноза, ксилоза. маннит, глюкоза, галактоза, фруктоза, малтоза, сорбит, глицерин, декстрин, нишесте с образуване на киселина и рамноза и дулцит с образуване на основи. Използва предимно минералните форми на азот - амониеви соли и нитрати, както и аминокиселини и протеини.

По емпиричен път е установено, че бактериалният щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 повишава добива от растенията и проявява антагонистични свойства срещу причинителите на болести по селскостопанските култури и по-специално по:

- зимна и пролетна пшеница - срещу брашнеста мана (Erysiphe graminis), кафява ръжда (Puccinia recondita), базично гниене (Fusarium culmorum), базална бактериоза (Pseudomonas syringae);

- пролетен ечемик - срещу плесени по семената (Penicillium, Alternaria), кореново гниене (Bipolaris sorokiniana), тъмно кафяви петна (Drechlera sorokiana);

- главесто зеле и карфиол - срещу съдова бактериоза (Xanthomonas campestris), струпясване (Rhizoctonia solani), кореново гниене (Pythium irregulare);

- картофи - срещу мана (Phytophtora infestans), струпясване (Rhizoctonia solani), фузарийно увяхване (Fusarium oxysporum);

- захарно цвекло - срещу сечене (Pythium debarianum, Phoma betae), церкоспороза (кръгли истни петна) (Cercospora beticola);

- слънчоглед - срещу склероцийно (бяло) гниене (Sclerotinia sclerotiorum), фомопсис (сиви петна) (Phomopsis helianthi);

- лен - срещу фузариоза (Fusarium avenaceum Sacc, Fusarium oxysporum v. orthoceros f. lini (Boll) Bilai), бактериоза (Clostridium macerans Schard).

Също така по емпиричен път е установено, че бактериалният щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, се характеризира с фунгицидна активност срещу фитопатогенните гъби Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioides, Erysiphe graminis, Phytophtora infestans, Rhizoctonia 5 solani, Pythium irregular, Plasmopara viticola, Uncinula necator, Botrytis cinerea и c бактерицидна активност срещу фитопатогенните бактерии Xanihomonas campestris, Pseudomonas syringae, Clavibacter michiganense.

В таблици 1 и 2 са представени резултатите от скрининга за антагонистична активност срещу фитопатогенни микроорганизми на 3 щама ризосферни бактерии: Pseudomonas fluorescens АР-33 (микробен препарат „Планриз“), Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (микробен препарат „Фитоспорин“), Bacillus subtilis 8А (прототип), Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 (заявеният щам).

Изследвана е бактерицидната активност на 5 щама фитопатогенни бактерии: Pseudomonas syringae 8300, Pseudomonas syringae 2314, Erwinia carotovora A-l, Erwinia carotovora 3391, Clavibacter michiganense 17-1.

Първоначално c помощта на бактериологично йозе е извършена посявка на бактерии, като се разстила равномерно върху хранителен агар и се култивира за 48 h при температура 28°С. В деня на скрининга на бактерицидната активност е извършена посявка с щамовете на посочените фитопатогенни бактерии, като се разстила равномерно върху гладен картофен агар. След което върху новопосятата среда са пренесени агарови блокчета от чиста култура на тест-бактериите, изрязани със стерилен корков свредел. Пренасянето е извършено с помощта на стерилен скалпел и нагорещена пинсета. Петриевите блюда с блокчетата се култивират в продължение на 24 h при температура 28°С, след което е измерен диаметърът на формираните зони на инхибиране около блокчетата. Резултатите от скрининга са представени в Таблица 1.

Таблица 1. Антагонистична активност на ризосферни бактериални щамове срещу фитопатогенни бактерии

Бактериален шам	Зона на инхибиране на растежа, мм
ЕгнЬШ! сснтпатига АА	Ext.¹ 831Ю	Pseudomonas syringae 23 14	Eminin LUif'oiOYOi'U 3391	Ckivihiicier mk'higimeHse
Pseudimumas fhiiiresivns АР-М (..ПданриГ)	11.1Ж1.8	7.5*03	113* 1.0	12.5Ш	15.Ml.!
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 С.Фигоаюри1Г‘ \|		! 1.0 J 0.8	12.5*1.0	17.5*1.2	17.7*1.3
Bactihts .subitEis SA (прототип)	17.5*1.3	25.5*1.9	27.7*2.0	24.1*1.7	22.1*1.7
Bacillus iimyloliiiuetaciens subsp. plantarum BS89 (заявен)	20.5*1.7	35.1 ±2.5	49.7*3.7		42J : 2Λ*

BG 67257 Bl

Данните в Таблица 1 сочат, че заявеният бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, притежава по-висока антагонистична активност срещу фитопатогенни бактерии в сравнение с щама прототип Bacillus subtilis 8А.

Фунгицидната активност се определя срещу 5 фитопатогенни гъби: Phytophtora infestans, Rhizoctoma solani, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Pythium ultimum по метода на ямките в агар.

В нагрят и охладен до температура 37°С картофено-декстрозен агар е добавена спорова суспензия от гъби (10⁵ KOE/ml) в съотношение 1 mkl суспензии към 1 ml среда. Получената смес се излива в петриеви блюда, като след втвърдяване с нагорещен корков свредел се оформят 4 еднакви проходни отвора, разположени в квадрат. В отворите се налива по 100 mkl бактериална суспензия с клетъчен титър 10⁸ KOE/ml. Едното блюдо е оставено с празни ямки като контрола. Блюдата с ямките се култивират за 72 h при температура 28°С. Фунгицидната активност се определя по зоните, инхибиращи растеж на фитопатогенни гъби около ямките. Резултатите от скрининга са представени в Таблица 2.

Таблица 2. Антагонистична активност на ризосферни бактериални щамове срещу фитопатогенни бактерии

----------------------		Зона на мнхнбиране на растежа, мм
Бактериа.1ен щам	nyiaphima uifesians	KhiZndWKi	I'u.siirium culmunm	f usarium solan!	Hylhium uliimum
!Лкшри ri	3.5-0.2	1 1.1+0.7		12.8+0.9	12.5+1.1
Hadi! us sublilis ВНИИСХМ 128 („Фитосиорин!	1!. 1 +4).8	13.5+1.9	19.5+1.6	21.4+1.5	25,3
Dacilhis sublilis SA шроншш)	21.3 + 1.9	19.5 + 1.1	23.5+1.5	25J *2.o	27.7+2.1
Нас Ulus amyhiiqiicfacicns subsp. pkmtnrum BS89 (заявен)	28.7+1.9	35.8+2.9	37.3+2.9	30.7+1.8	45.3+3.1

BG 67257 Bl

От данните, посочени в Таблица 2, се вижда, че заявеният бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 притежава по-голяма антагонистична активност срещу фитопатогенни гъби в сравнение с щама прототип Bacillus subtil is 8А.

Пълното секвениране на генома сочи, че тази активност на щама Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, се дължи на наличието на гени, които кодират продуцирането фунгицидни и бактерицидни вещества: сърфактин, фенгицин, бациломицин Д, циклични липопептиди, бацилобактин, бацилолизин, бацилаен, макролактин. плантазолицин, амилоциклизин (Таблица 3).

Нерибозомните синтезирани пептиди (НСП), включват широк спектър от структурно нееднородни антибиотични съединения. Най-известните и добре изучени НСП включват сърфактин, фенгицин и итурин. Итуринът и фенгицинът са известни като основни фактори, определящи антифунгалната активност на различните бацили. [1]. Фенгицините са особено активни срещу мицелиалните гъби [2].

Сърфактините са необходими за образуването на биофилм и разпространението на бактерии в околната среда, като по този начин улесняват тяхното колонизиране в корените и тъканите на растенията и проява на биоконтролираща активност [3]. Също така сърфактините. а в по-малка степен и фенгицините, имат свойството да задействат защитните механизми на растенията [1].

Таблица 3. Клъстери на гените, участващи в синтеза на антибиотични метаболити на щама Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89

Клас съединени*	Нроду диран чнтаболнг	Клъстер 1СШ!	b и o /1 ο i и ч и а ф yi ι κ 1i и м
1 крибозомпи е и nr er крали и e π т или	Сърфам ин	«Д</й 7>	Образуване на биофнлм. антифушална активноет
Фешипии	/мЖДЕ	Ли ι ифу шаяка активност
Бани лом и шш	ЬтуСвАО	А нт ифу н гал на акт и внос г
Цикличен .шпопеп гид	iirsAECE>EF	Не е известна
Бацилибактин	MbASC'DEE	Синтез на сидерофори
Бацили ти		Лигибакт ериална активност
Нодикетиди	Дифицилин	MiA yXm'DEFG	Аигибактериална активност
Бацялеи	haeiKAAEGHUL	Антибактериална активност
Макролактин	7)i/(UH I	А н г и б акт е р и ал н а а к т и в 11 оет
Рибозомно продуцирани кратки пеп гиди	Плантазолицин	p:nFKGGiAJCD	Нематонидна и антибактериална активност
Амилониклизии		Литибактериална активност срещу грам-гн»ложитеяяи бактерии

BG 67257 Bl

Освен липопептидите, генният клъстер dhb участва в синтеза на сидерофора бацилибактин. Бактериалните сидерофори имат висок афинитет към тривалентното желязо и ефективно го свързват в желязодефицитна среда като почвите, в резултат на което железните йони стават по-трудно достъпни за фитопатогените и по този начин допринасят биоконтролиращата дейност на сидерофор-продуцираните бактерии [4]. Оперонът dhb, който управлява синтеза на бацилибактин, е сходен със същия оперон в грамотрицателни бактерии, продуциращи ентеробактин.

Щамът Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 има три големи гении клъстера, кодиращи поликетидите: дифицидин, бацилаен и макролактин (Таблица 3). Изброените три метаболита имат широка антибактериална активност срещу растителни и човешки патогени и имат потенциално приложение в медицината [5,6].

Геномът на щама Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, съдържа генен клъстер за производството на два рибозомно продуцирани кратки пептиди: плантазолицин и амилоциклизин (Таблица 3). Плантазолицинът представлява нов тип рибозомно продуцирани кратки пептиди с малък спектър на антимикробна активност срещу други бацили и по-специално В. anihracis (причинител на антракс) [7]. Този метаболит има способността да потиска нематоди, образуващи гали (новообразувания) по корените на растенията. Няколко други грам-положителни бактерии, включително Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Corynebacterium urealyticum DSM7109 and Brevibacterium linens BL2 имат подобен биосинтетичен клъстер в своите геноми [8]. Амилоциклизинът представлява цикличен пептид от групата на бактериоцините. Той притежава висока антибактериална активност срещу тясно свързаните грам-положителни бактерии - това предимство може да се използва за потискане на бактериалните конкуренти в ризосферата [7]. Генният клъстер асп, който контролира синтеза на този бактериоцин е широко разпространен сред видовете от рода Bacillus/Paenibacillus таксономични групи. В няколко вида Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum [9] е открит още един кратък пептид - мерасцидин, но щамът BS89 съдържа само фрагментарни части от целия генен клъстер и вероятно няма да може да синтезира мерасцидин.

Експериментално е установено, че бактериалният щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 освен фунгицидна активност срещу фитопатогенни бактерии и фитопатогенни гъби, притежава и фитостимулиращо действие по отношение на различни селскостопански култури (като репичка, пшеница).

Скринингът на стимулиращата растежа активност на бактериалните щамове е извършен по оригинална методика с използването на репички от сорта „Дуро и пшеница от сорта „Веда. За целта първоначално семената се стерилизират 2 min в 70% етанол и измиват със стерилна чешмяна вода. След това семената се накисват за 30 min в бактериална суспензия с клетъчен титър 10⁷ KOE/ml и поставят в стерилни влажни камери от по 20 бр. в три повтаряния. Контролните семена се накисват в стерилна чешмяна вода. След това растенията се инкубират във фитотрон за 72 h при t = 28°С. След инкубирането се измерва дължината на коренчетата и пониците, а стимулиращата растежа активност на тестваните бактериални щамове е определена спрямо контролните кълнове. Резултатите са представени в таблици 4 и 5.

Таблица 4. Стимулираща растежа активност на ризосферни бактериални щамове в кълнове на репичка

Вариант на оииιа	Средна дължина на кт^щна. мм	Средни дължина на зелената част на кълна, мм
Контрола(без третиране!	12, НО.7	19.5:13
Третиран Bacillus siiblilis 8А (прототип i	153 s 1,0	25.0ж2.1
Третиран ttadlhfs umykiliqiieUidens subsp. phmttintm BSH9 (заявенϊ	215 1,5	29/1:2.3

Според данните, представени в Таблица 4 се вижда, че заявеният щам бактерии Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 притежава по-висока стимулираща растежа активност на кълновете от репичка в сравнение с щама прототип Bacillus subtil is 8А.

Таблица 5. Стимулираща ръста активност на ризосферни бактериални щамове в кълнове на пшеница

BG 67257 Bl

Вариант на опита	Средна дължина на корена, мм	Средна дължина на зелената час т на кална. мм
Кон трола(без третиранеί	'Сч'.5	lo./sl.O
1 pel up III ВааНис suhiilis 8Λ lпрототип>	13,5 s 1.1	16.9 s 13
J pci upai liiu ilhfs шнуЬЖфпфистт subsp. pl_ttfihaum BS89 { МЯ1Ч H ’	РЪМ- К2	22. Η 1,7

Данните, представени в Таблица 5 сочат, че заявеният бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 притежава по-висока стимулираща растежа активност на пшеничените кълнове в сравнение с щама прототип Bacillus subtilis 8А.

Високата стимулираща растежа активност на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 вероятно се дължи на способността му да продуцира цяла редица витамини: тиамин (В1), рибофлавин (В2). никотинат (ВЗ), пантотенат (В5), биотин (В7), фолат (В9). кобаламин (В 12), менакинон (К2) (Таблица 6). Витамините са незаменими хранителни елементи, произведени е помощта на различни растения и бактерии [10]. Основната физиологична функция на витамините е да служат като кофактор в многобройните метаболитни процеси и като антиоксиданти. Шест от осемте известни витамини от група В са открити в генома Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 според базата данни на KEGG (от сървъра KAAS) и интелектуалния анализ на генома (Таблица 6). Това са тиамин (В 1), рибофлавин (В2), пантотенат (В5), витамин В6 (пиридоксин), биотин (В7) и фолат (В9). Също така е открит протеин, който синтезира кобаламин CobW (Prokka_00310), участващ в синтеза на витамин В12 и два ензима, участващи в метаболизма на никотината (витамин ВЗ), а именно никотинат фосфорибозилтрансфераза (Prokka_02867) и никотинат нуклеотид-пирофосфорилаза (Prokka_02473). Освен това в генома на щама Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 е открит диметил-метакинон-метилтрансфераза (Prokka_02063), ензим, който катализира последната стъпка в биосинтеза на витамин К2. Тези резултати позволяват да се предположи, че Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 може да продуцира и витамини ВЗ. В12 и К2.

Таблица 6. Витамини в генома на щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 и тяхната

BG 67257 Bl

Биологична функция.

Вид на витамина	Функнии в бактерията*	И,змток?ш функция в микробжофаспнсл)^ отношения**
Ншмин (BD	Цекарбокеилиране на кетоккселиии и граисам и на й ι и реакции	кофактор на декарьокеилирането на индоли шрувата (биосинтеза на нндолил онелш киселина), интониране на системната резистонтнои' на рзшсшоиа. стимулираш ефект върху грудкови бактерии
Рибофлавин Ш2)	Окисли реакции	Пилуииране на системната роистенпюсг на растенията, етимулирне растежа на растенията, лк пдшране на гените на ко.М)пикирането между бактериите, наречено ..ptioruiH-sensing Отюру мтю4т>л^
Ннктоннат (ВЗ)	Ншам инамид-алсшин дину клнотнд (NAD)	Намаляване на соления стрес, зашитните механизми
Пантотенат (В5)	Окисляване на кетокиселнии и иден тели на циклони групи	Не е известна
Пиридоксин (В6)	Трансамипиране. .имаминпране, лскарбокеилираие и рлцемишране на аминокиселини	Заши та сршну осмотинев и окси/шнтек стрес
Ьитонн (ΒΉ	Бшчиити инни реакции, накекнаши фиксиране на С 02	Стимулиране растежа на бактерии и колонизация
Фо м· ί В9)	Пренасяне на елшш^теродни единици, необходими за синтеза на тимнн. цхршнчш бази, серии, мил >нин и ч то и ‘	Не е известна
Кобаламин (В 12)	Πήη кя. 4 Ή «и инш групи	Образуване на &>бо>«>-рв-\|сбиаана еимошеи
Менакшюн (К2)	Транешдм пране на електрони	ί ic е пзвес! на

*Онлайн учебник по бактериология (http://textbookfbactgriology.net/nutgro 2.html) **Преглед на Palacios et al. (2014)

BG 67257 Bl

Примери за изпълнение на изобретението

По-долу е представен пример за получаване на течен биопрепарат на базата на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum BS89.

Първоначална култура

За получаването на жизнеспособна култура от бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, е използвана течна хранителна среда КЗБ (картофено-захарозен бульон), като за целта се приготвя отвара от 200 g обелени и нарязани на шайби картофи, сварени в 800 ml дестилирана вода за 20 min. След това бульонът се филтрира през памучна марля, добавя се захароза и pH-нивото на сместа се коригира до 7.0.

Получената течна хранителна среда се разпределя по 100 ml в обемни колби „Ерленмайер 750 ml и се стерилизира 30 min при 1 atm. След това хранителната среда в колбите се инокулира в съотношение: 1 епруветка с полегат хранителен arap (ХА). съдържащ чиста култура Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 на 1 колба. След това колбите се поставят в клатачка (180 об./min) и се култивират 48 h при температура 2 > 8°С. По този начин в колбите се получава първоначалната култура Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 в титър бактерии около 4· 10⁹ KOE/ml. която може да се съхранява в хладилник до 1 месец при температура 4-6°С за последващо посяване в оиореактори.

Работна култура

Работната култура от бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 за производствено култивиране се получава в биореактори на среда с меласа и царевичен екстракт. Стандартната инокулация с първоначална култура е 1 -3%, продължителността на култивиране е 72 h при температура 33°С. При отглеждането на работни култури се допуска повишаване на температурата до 37 С. Така се приготвя концентрат от бактериална суспензия на базата на щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantaium BS89 c минимален титър 1·10⁹ KOE/ml.

Течен микробен препарат на базата на щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89

Полученият концентрат на бактериалната суспензия на базата на щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 се разрежда със стерилна вода в съотношение 1:10 или 1:20 в зависимост от тигъра на получения концентрат на бактериалната суспензия. Получената течна форма престоява 3-5 дни при температура 20-25°С до получаването на минимален титър на бактериите 1 · 10⁸ KOE/ml препарат, след което микробният препарат е готов за използване в селското стопанство. Течният препарат се налива при стерилни условия в пластмасови бутилки или туби, предварително обработени със спирт. Срокът на съхранение на получения препарат е най-малко 24 месеца.

Експериментално е установено, че за ефективното използване на щама Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, съдържащ се в различни микробни препарати, концентрацията (количеството жизнеспособни клетки и спори) на бактериите трябва да бъде 10⁴-10⁹ клетки на 1 ml културална течност, тъй като използването на концентрации по-малки от 10⁴ κΐ/ml ще намали антагонистичното действие и ефекта, стимулиращ растежа, а увеличаването на концентрацията над 10⁹ к1/м1 не усилва действието и ефекта.

Ефективността на микробния препарат, получен по описания по-горе начин на базата на заявения ризосферен бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, е проверена с вегетационни опити със зимна пшеница от сорта „Веда“ и репичики от сорта „Дуро Краснодарско .

Опитите се провеждат като в 3-литрови съдове (за пшеницата и репичките) се насипва почва до достигане на тегло 3,4 kg. Преди засаждането на семената почвата се полива до пределна полска влагоемност с 200 ml чешмяна вода. Семената на репичките и пшеницата са предварително подбрани по размер, стерилизирани и покълнали в стерилни петриеви блюда със стерилна филтърна хартия. Еднаквите по размер кълнове са разделени на три части. Едната част в продължение на 30 min е инокулирана в течния препарат, базиран на щама прототип Bacillus subtilis 8А с титър 10⁷ KOE/ml, другата част е инокулирана в препарата, получен по описания по-горе начин на базата на заявения щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 c титър 10⁷ KOE/ml, а третата част от кълновете е третирана със стерилна вода (контрола). След 25 дни са извършени измервания на биомасата с репички, а след 30 дни - на биомасата с пшеница. Резултатите от опитите са представени в Таблици 7 и 8.

Таблица 7. Ефективност на ризосферните бактериални щамове при вегетационните опити с пшеница от сорта „Веда“

Вариант на опита: третиране е биопрепарат на базата на бактериален шам	Биомаса, г	Увеличение на контролната биомаса
г	%
Контрола (без третиране)	85
Bacitttu subtilis 8А (прототип)	ΙΟΙ	10	18.8
Bacillus amyloliquefyciem subsp. phmianm BS89 (заявен)	122	37	43.5

BG 67257 Bl

Таблица 8. Ефективност на ризосферен бактериален щам при вегетационните опити с репички от сорта „Дуро Краснодарско“

Вариант на опита: третиране с биопренараг на базата на бактериален там	Биомаса	Плодна маса
г	% увеличение при контролата	ММ	% увеличение нри контролата
Контрола(без грог пране)	42.5		18,0	..................................
Bacillus subtilis 8А (прототип)	50.2	18.1	29,1	61.7
Bacillus umylaliqucfacicns subsp. plantanitn BS89 Шявен)	65.3	5 3.6	38.5	1 13.9

При сравняване на резултатите от опитите с пшеница от сорта „Веда“ и репички от сорта „Дуро Краснодарско“, представени в таблици 7 и 8, може да се направи следния извод: микробният препарат, получен на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, има много по-ефикасно действие върху пшеницата и репичките в сравнение с микробния препарат, базиран на щама прототип Bacillus subtilis 8А.

BG 67257 Bl

По емпиричен път е установено, че за оптимално третиране на семената на селскостопанските растения следва да се използва 10% разтвор на микробния препарат, базиран на заявения ризосферен бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89. аза вегетиращи растения - (0,1-3)% разтвор на препарата.

Ефективното прилагане на щама Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 за повишаване на продуктивността и качеството на продукцията се определя чрез полски опити на зърнени, зеленчукови и технически култури (пролетна, зимна пшеница, ечемик, картофи, зеле, лен, слънчоглед, захарно цвекло) чрез третиране с три микробни препарата: „Фитоспорин“ на базата на бактериалния щам Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128), микробен препарат на базата на щама прототип Bacillus subtilis 8А и микробен препарат на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, получен по описания погоре начин.

Полските опити с пролетна пшеница от районирания сорт „Лада“ се провеждат в Краснодарския край на мощни черноземни, средно глинести, средно хумусни пови, с хумус (по Тюрин) - 3,24%, нитратен азот - 8,3 mg/kg, фосфор - 64 mg/kg, калий - 150 mg/kg, pH на водната среда - 6,46.

Полските опити са заложени по блоковия метод за повеждане на опити върху пробни площи в географска мрежа на Руския институт по торове, почвознание и аграрно дело (Оценка на ефективността на микробните препарати в земеделието /Под ред. на А. А. Завалии - М: Селскостопанска академия на Русия, 2000 г. - 82 стр.). Пробната посевна площ е 40 m², а големината на реколтната парцела е 30 м². Опитът се провежда в четири повторения. Засяването на пшеницата се извършва в земя с предшественик чиста угар при торов фон N₆Ps2 (моноамониев фосфат). Обработка преди засяване - култивация до дълбочина 5-7 cm. сеитбена норма на пролетната пшеница - 5,0 млн. кълняеми семена на хектар. В деня на засяването една част от семената на пшеницата не се третират с нищо (контрола), другата част е третирана с течен биопрепарат „Фитоспорин“ на базата на щама Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третата част от семената е обработена с течен биопрепарат на базата на щама Bacillus subtilis 8А (прототип), а последната част от семената - с течен препарат на базата на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, получен по описания по-горе начин. Третирането на семената пшеница се извършва на базата на 1 t семена - 1 1 от съответния биопрепарат се разрежда с 9 1 вода с добавяне на 20-30 g Na-CMC - натриева карбоксиметил целулоза.

Преди сеитбата почвата се култивира и ръчно се добавя минерален тор - моноамониев фосфат (NePs2), съгласно опитната схема, след това семената се засяват, като се обособяват отделни посевни площи според третирането със съответния биопрепарат и контролна зона.

Некореновата обработка на растенията се извършва на етап 3-5 листа и в края на братене, начало на вретенене чрез пръскане с ръчна пръскачка при съотношение на разтвора - 1 1 от съответния биопрепарат на 300 1 вода на 1 хектар.

Агротехниката за отглеждане на пшеница съответства на блоковата технология. Продуктивността се определя по добив зърно от реколта на парцела. Прибирането на реколтата се извършва с комбайн САМПО130. Добивът е приравнен към 100% чист посев и 14% влага. Количеството глутен се определя по стандарт ГОСТ 13586.1/68, а протеини - по ГОСТ 10846/91. Статистическата оценка на надеждността на получените резултати е извършена въз основа на дисперсионен анализ при 95% ниво на значимост. Резултатите от опита с пролетна пшеница са представени в Таблица 9.

Таблица 9. Влияние на ризосферния бактериален щам върху добива и качеството на зърното от пролетния сорт пшеница „Лада“ (Краснодарски край).

Вариант	Добив ><a	Увеличение на добина	Каче	стаи на зърното
нентнер/ха	нен-нер ча	ч	Imieu.	кочшрсснбиднтеъ	Клас зърно
Контрола	39,0	-	-	22.5	85	.>
[ЗасШмх subtilis В Н И ИС ХМ 128 („Фитоспорин”, стандарт)	42.5	4.3	11,0	2 3.5	80	3
Bacillus MibiUis 8А όιροtο ιии)	45.1	6J	15.6	24.0	80	?
amykilUjuefiic^ subsp, plantarum BS89 (заявен)	49,7	10.7	27.4	26.0	75	·»

BG 67257 Bl

Полските опити със зимен сорт пшеница „Мироновска 808 са проведени в Уляновска област на черноземни, излужени, средно мощни, глинести, средно хумусни почви, с хумус (по Тюрин) - 2,89%, нитратен азот - 9,5 mg/kg, фосфор - 79 mg/kg, калий - 140 mg/kg, pH на водната среда - 6,62.

Пробната посевна площ е 30 м², а големината на реколтната парцела е 25 м². Опитът се провежда в четири повторения. Засяването на пшеницата се извършва в земя с предшественик чиста угар при торов фон N&P52 (моноамониев фосфат). Обработка преди засяване - култивация до дълбочина 5-7 cm, сеитбена норма на зимната пшеница 4,8 млн. кълняеми семена на хектар.

В деня на засяването една част от семената на пшеницата не се третират с нищо (контрола), другата част е третирана с течен биопрепарат „Фитоспорин“ на базата на щама Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третата част от семената е обработена с течен биопрепарат на базата на щама Bacillus subtilis 8А (прототип), а последната част от семената - с течен препарат на базата на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, получен по описания по-горе начин.

Третирането на семената пшеница се извършва на базата на 1 t семена - 1 1 от съответния биопрепарат се разрежда с 9 1 вода с добавяне на 20-30 g Na-CMC - натриева карбоксиметил целулоза.

При всички опитни варианти по време на сеитбата под предпосевното култивиране ръчно се добавя минерален тор - моноамониев фосфат (ИбРзг) съгласно опитната схема, след което семената се засяват, като се обособяват отделни посевни площи според третирането със съответния биопрепарат и контролна зона.

Некореновата обработка на растенията се извършва на етап братене и в началото на вретенене чрез пръскане с ръчна пръскачка при съотношение на разтвора - 1 1 от съответния биопрепарат на 200 1 вода на 1 хектар.

Агротехниката за отглеждане на зимната пшеница съответства на блоковата технология. Прибирането на реколтата се извършва с комбайн САМПО-130. Добивът е приравнен към 100% чист посев и 14% влага. Количеството глутен се определя по стандарт ГОСТ 13586.1/68.

Статистическата оценка на надеждността на получените резултати е извършена въз основа на дисперсионен анализ при 95% ниво на значимост. Резултатите от опита със зимна пшеница са представени в Таблица 10.

Таблица 10. Влияние на ризосферния бактериален щам върху добива и качеството на зърното от зимния сорт пшеница „Мироновска 808“ (Уляновска област).

Вариат	Дебна на и.рно от шина шасиииа. цент пер ча	Увеличение на добива	1 Ту тен.
исн।нер-ха	%
Контрола	; 7	-	-	20.0
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (,.Фитос1юрян‘' - стандарт)	39.1	3.4	9.5	22S)
Bacillus subtilis 8А (πριιιοι ни)	41.5	5.8	16.2
Bacillus amyloliifuefyciens subsp. plantanim BS89 (заявен)	44.7	9.0	25.2	25.0

BG 67257 Bl

Полските опити с пролетния сорт ечемик „Прерия“ се провеждат в Краснодарския край на черноземни, мощни, средно глинести, средно хумусни почви, с хумус (по Тюрин) - 3,24%, нитратен азот - 8,3 mg/kg, фосфор - 64 mg/kg, калий -150 mg/kg, pH на водната среда - 6,46.

Пробната посевна площ е 40 м², а големината на реколтната парцела е 30 м². Опитът се провежда в четири повторения. Засяването на ечемика се извършва на земя с предшественик чиста угар при торов фон N₆Ps2 (моноамониев фосфат). Обработка преди засяване - култивация до дълбочина 5-7 cm, сеитбена норма - 4,0 млн. кълняеми семена на 1 хектар. В деня на засяването една част от семената на ечемика не се третират с нищо (контрола), другата част е третирана с течен биопрепарат „Фитоспорин“ на базата на щама Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третата част от семената е обработена с течен биопрепарат на базата на щама Bacillus subtilis 8А (прототип), а последната част от семената - с течен препарат на базата на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, получен по описания по-горе начин. Третирането на семената на ечемика се извършва на базата на 1 t семена -1 1 от съответния биопрепарат се разрежда с 9 1 вода с добавяне на 20-30 g Na-CMC - натриева карбоксиметил целулоза.

Преди сеитбата почвата се култивира, като за целта ръчно се добавя минерален тор - моноамониев фосфат (N6P52) съгласно опитната схема, след което се засяват семената на ечемика, като се обособяват отделни посевни площи според третирането със съответния биопрепарат и контролна зона.

Агротехниката за отглеждане на пролетния ечемик съответства на блоковата технология. Добивността се определя по добив зърно от реколта на парцела. Прибирането на реколтата се извършва с комбайн САМПО130. Добивът е приравнен към 100% чист посев и 14% влага. Количеството протеин се определя по стандарт ГОСТ 10846/91. Статистическата оценка на надеждността на получените резултати е извършена въз основа на дисперсионен анализ при 95% ниво на значимост. Резултатите от опита с пролетен ечемик са представени в Таблица 11.

Таблица 11. Влияние на ризосферния бактериален щам върху добива и качеството на зърното от пролетния сорт ечемик „Прерия (Краснодарски край).

Щам	Добив на торно οι ечемик, пет чер. хи	Увеличение на добива	Количество протеин в зърното
ценгнер \а		Г»
Контрола	41.0	-	-	9,0
ΆκUlus subtilis ВНИИСХМ 12Х ί ..Фигоснорин. ci андар т )	44.2	3 2	7.8	9.8
Bacillus subtilis 8А (прототип)	45.0	4.0	9.0	10.2
amyloliqueftickw subsp, pkiHUinw BS89 шявен)	48.3	7,3	17,8	12.5

BG 67257 Bl

Данните, представени в таблици 9, 10 и 11 сочат, че микробният препарат, получен на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, има по-силно въздействие върху добива и качеството на зърнените селскостопански култури в сравнение с биопрепарата, базиран на щама прототип Bacillus subtilis 8А.

Полски опити с картофи от сорта „Невски“ са проведени в Ленинградска област на слабо подзолисти глинести почви с хумус (по Тюрин) - 2,30%, нитратен азот - 22,1 mg/kg, фосфор - 315 mg/kg, калий - 52 mg/kg, pH н водата - 5,6.

Посадъчен материал: картофени клубени, подбрани от една партида затоплени и щателно почистени семена. Тегло на клубените за засаждане: 60-70 g, със „събудени очи“. Предшественик - едногодишна трева за зелен фураж. Торов фон - не е извършвано органично торене под картофите, минерални торове са добавяни при оформянето на браздите в съотношение NwoPnnoKno.

Пробната посевна площ е 50 м², а големината на реколтната парцела е 25 м². Опитът се провежда в четири повторения. Схема на садене - 75 х 30 cm, което означава гъстота на засаждане - 44 000 бр. клубени на 1 хектар. Към момента на прибиране не е определена средна гъстотата на растенията - 4л 500 бр. на хектар.

В деня на засаждането една част от картофените клубени не се третира с нищо (контрола), другата част е третирана с течен биопрепарат „Фитоспорин“ на базата на щама Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третата част е обработена с течен биопрепарат на базата на щама Bacillus subtilis 8А (прототип), а последната част - с течен препарат на базата на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantaium BS89, получен по описания по-горе начин. Преди саденето картофените клубени са третирани с разтвор в съотношение 1 1 от съответния биопрепарат на 9 1 вода на 1 t клубени.

Саденето на картофите се извършва с редосеялка на междуредие 75 cm и с гъстота на посева 400 бр. на 100 м², като се обособяват посевни площи според третирането със съответния биопрепарат и контролна зона.

Грижа за растенията: обработка на междуредията - два пъти преди поникване и един път след поникване; пръскане на растенията с хербицид „Титус“ (0,03 kg/ha) + „Тренд (0,2 kg/ha) и инсектицид „Актара на гранули, диспергиращи се във вода (0,06 kg/ha), с помощта на щангова пръскачка ОН-600 с разходна норма на работната течност 300 1/ha. Пръскането на растенията във всяка обособена площ се извършва с ръчна пръскачка е разтвор на съответния биопрепарат в съотношение - 1 1 от биопрепарата на дОО 1 вода на 1 хектар, като първото пръскане е на етап пълно поникване, а второто - на етап бутонизация. Косене на върховете преди прибиране на реколтата: с косачка БД-4-7. Прибиране на реколтата: с картофовадачка КТН-2Б с ръчно събиране на клубените. Резултатите от опита е картофи са представени в Таблица 12.

Таблица 12. Ефективност на ризосферните бактериални щамове при полските опити с картофи от сорта „Невски“ (Ленинградска област).

Вариант	Добив на картофи, ценгнер хз	Увеличение на добива
	%
Контрола	!91	•	-
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (..Фитоспорин“ - стандарт)	217	26	13.6
Bacillus subtilis 8А (прототип)	22$	34	17.8
Bacillus amyloliquefaciens subsp. platuarum BS89 (заявен)	251	би	31.4

BG 67257 Bl

Полските опити на малки площи с главесто зеле от сорта „Подарък“ са проведени в Ленинградска област на подзолисти глинести почви, с хумус (по Тюрин) - 3,50%, нитратен азот - 30,5 mg/kg, фосфор - 280 mg/kg, калий- 40 mg/kg, pH на водната среда 6,0.

За получаването на разсад семената на главестото зеле от сорта „Подарък“ се засяват в сандъчета с торфено-минерален субстрат, който се приготвя по следния начин: ливадно-подзолистата песъчливо-глинеста почва от опитното поле на ЕНУ ВНИИСХМ (30%) се смесва с торфена почва „Теравит , производство на фирма ЗАО МНПП „Фарт“ (50%), и промит кварцов пясък (20%) с добавен разтвор на препарата „Азофоска“, представляващ 100% NPK. Полученият субстрат се разбърква и разпределя в 4 сандъчета от по 10 kg всеки.

Зелето се третира е 0,1% разтвор на следните биопрепарата: на базата на щама Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ („Фитоспорин”- стандарт); на базата на щама прототип Bacillus subtilis 8А; на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, получен по описания по-горе начин. В три от сандъчетата се излива по 1 1 от 0,1% разтвор на всеки един от изброените по-горе биопрепарата, а в четвъртия - само вода (контрола).

Сандъчетата със зеле се поставят в парник при температура 15-20°С. Пикирането на растенията се извършва на етап 2-3 същински листа в торфени саксии с обем 0,5 1. поставени в пръст.

Едновременно с пресаждането на растенията от дадено сандъче в торфени саксии в гнездата се налива 0.1 % разтвор от препарата, вложен по-рано в съответния субстрат (а в контролата - вода), в съотношение 1 ml разтвор на 1 растение. Отглеждането на разсада се провежда в 30 повторения.

След това на етап 4-5 същински листа разсадът, заедно с буца пръст, се засажда за постоянно в почва, като се обособяват отделни посевни площи според третирането с един от посочените по-горе биопрепарата или вода. Размерът на площите е 5 т² с разстояние между редовете 50 cm, а между растенията в реда 35 cm. Агротехниката за отглеждане на зелето е общоприетата. За борба с вредителите растенията двукратно се третират c 0,15% разтвор на инсектицида димофос (40% емулсия) и се подхранват с минерални торове, както следва: на 3-та седмица след засаждането на разсада с N35P20K30 и на етап розетни листа с N30P20K35·

През вегетацията за всяка обособена посевна площ, според предишното третиране с един от упоменатите биопрепарати. се провежда двукратно пръскане на растенията с 0,5% разтвор на съответния биопрепарат при разчет 2 1/ha (2 1 на 400 1 вода на 1 ha) с ръчна пръскачка SOLO-456. Контролата не се пръска. Опитът се провежда в четири повторения. Резултатите от опита са представени в Таблица 13.

Таблица 13. Ефективност на ризосферните бактериални щамове при полски опити с главесто зеле от сорта „Подарък“ (Ленинградска област).

Вариант на опита {бактериален там)	Добив на зеле, ценжсрУа	Увеличение на добива
цен гнерХа	%
Контрола(без третиране)	390	-	-
subliib ВНИИСХМ 128 (Фитоспорин - стандарт)	408	18	4.6
Bacillus subtilis SA ( прототип)	415		6.4
Bacillus αηγΙ(>ίίφιφ<·ι<ίΐίχ subsp. plaMmim BS89 (заявения! )	451	61	15.6

BG 67257 Bl

От данните, представени в таблици 12 и 13, следва, че биопрепаратът, получен на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantation BS89, има по-силно въздействие върху добива (продуктивността) на зеленчуковите селскостопански култури в сравнение с биопрепарата, получен на базата на щама прототип Bacillus subtilis 8А.

Полските опити със захарно цвекло от сорта „Рамонско едносеменно 47“ са проведени в учебното опитно стопанство на Башкирския държавен аграрен университет, РепубликаБашкортостан, на излужени черноземни почви. Съдържанието на хумус в почвата е 5,8%, pH - 6,5, фосфор (по Чириков) - 91,1 mg/kg, калий (по Чириков) - 130,8 mg/kg. Сорбционният капацитет на почвите е доста висок 54-56 mg.eKB.. а степента на наситеност с бази е 96-98%.

Сеитбената норма на семената е около 5,5 kg/ha. Гъстотата на поникналите растения към момента на прибиране на реколтата е 80 хил. бр./ha. Метод на засяване на захарното цвекло - широколентов с разстояние между редовете - 45 cm, а при крайните редове - 50 cm. Оптималната дълбочина на засяване на семената в почвата е 3-4 cm. Пробната посевна площ е 50 m², а големината на реколтната парцела е 25 т². Опитът се провежда в четири повторения.

Цялата посевна площ е разделена на четири блока. Посевите във всеки отделен блок се третират с 0,5 Λ разтвор на един от следните биопрепарати: на базата на щама Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ („Фитоспорин - стандарт); на базата на щама прототип Bacillus subtilis 8А; на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, получен по описания по-горе начин, а контролният блок не се третира.

Третирането на растенията във всеки отделен блок става чрез двукратно пръскане с 0,5 /о разтвор на един от изброените по-горе биопрепарати при разчет 2 1 биопрепарат на 400 1 вода на 1 хектар с помощта на ръчна пръскачка SOLO-456, както следва: на етап 4-6 същински листа и затваряне на листата между редовете.

Контролата не се пръска. Опитът се провежда в четири повтаряния. Резултатите от опита със захарно цвекло са представени в Таблица 14.

Таблица 14. Ефективност на ризосферните бактериални щамове при полски опити със захарно цвекло от сорта „Рамонско едносеменно 47“ (Башкортостан).

Вариант на опита (бактериален шам)	Добив на захарно цнекло, нентнер ха	Увеличение на добива
центнер	О
Контрола(без третиране)	290	-	•
Bacillus subtilis 128 (..Фигостюрин''»	322		1 1.0
Bacillus subtilis 8А (nporoTmi j	зз I	41	14.1
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 (заявен)	355	65	22.4

Полските опити с маслодаен слънчоглед и лен са проведени в Ставрополския край на черноземни, средно мощни, средно глинести, средно хумусни почви с хумус (по Тюрин) - 3,71%, нитратен азот - 6,2 mg/kg, фосфор - 75 mg/kg, калий -180 mg/kg, pH на водната среда 7,15. Агротехника: земя с предшественик пролетен ечемик, засяването на слънчогледа и лена се извършва със сеялки за точна сеитба СКС-610 с дозиращ изсяващ апарат.

Вариантите на опита предвиждат засяване на семената лен и слънчоглед без третиране (контрола) и с третиране с биопрепарата, както следва: „Фитоспорин“ (на базата на щама Bacillus subtilis 128), препарат на базата на щама прототип Bacillus subtilis 8А и препарат на базата на заявения щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89. при разчет 2,0 1/t, както и третиране на растенията през вегетацията с посочените биопрепарата при разчет 1,0 1/ha.

Опитът е заложен по блоковия метод при пробна посевна площ 30 т² и големина на реколтната парцела 25 т². Опитът се провежда в четири повторения. Прибирането на реколтата лен и слънчоглед се извършва с малогабаритен комбайн „Винтерщайгер“ е определяне на добива от всички опитни варианти. Резултатите от опитите са представени в Таблици 15 и 16.

Таблица 15. Ефективност на ризосферните бактериални щамове при полски опити с маслодаен лен (Ставрополски край).

BG 67257 Bl

Вариан т на опита (препарати на базата на бактериален шам)	Добив па семе, иентнер/ха	Увеличение па добива
исш нер
Кошро.за (без третиране)	7.0	-	-
Bacillus subtilis 128 (Фитоснори н)	8.1	1.1	15.7
Bacillus subtilis 8А (прототаи)	8.5	1.5	21.4
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 (заявен)	1 1.3	4.3	614

Таблица 16. Ефективност на ризосферните бактериални щамове при полски опити с маслодаен слънчоглед (Ставрополски край)

Вариант на онша	Добив на слънчоглед.	У челиченHt	на добива
(бактериален иим)	uein пер xa	неигнер
Контрола(бел третирана!	12.3		-
Bacillus subtilis 128 (Фикчиорин!	13.5	1.2	9.8
Bacillus subtilis ЗА (ιιροτοι ίΗτ)	13.7	L4	1 1.4
Bacillus amyluliquefaciens subsp. plantarum BS89 (таявен)	17.1	4.8	39.1)

BG 67257 Bl

От представените в таблици 14, 15и 16даннисе вижда, че биопрепаратът, получен на базата на заявения бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, притежава по-силно въздействие върху добива (продуктивността) на технически селскостопански култури: захарно цвекло, лен, слънчоглед в сравнение с биопрепарата, получен на базата на щама прототип Bacillus subtilis 8А.

Тоест резултатите от тестването на биопрепарата, създаден на базата на бактериалния щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, потвърждават след проведените полски опити ефективността от неговото прилагане за повишаване на добива при отглеждането на такива селскостопански култури, като пшеница, ечемик, картофи, зеле, захарно цвекло, лен, слънчоглед, което доказва перспективното му използване в селското стопанство.

Следователно щамът на ризосферните бактерии Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 е подходящ за използване в селското стопанство като ефективно средство за повишаване на продуктивността на растенията и защитата им срещу болести, причинени от фитопатогенни микроорганизми, с което се разширява арсеналът от подобни средства.

Claims

1. Бактериален щам Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, депозиран във Федералното държавно бюджетно научно учреждение „Руски научноизследователски институт по селскостопанска микробиология“ под номер RCAM 03458, като средство за повишаване на продуктивността на растенията и тяхната защита срещу болести, причинени от фитопатогенни микроорганизми.

Литература

1. Ongena М, Jourdan Е, Adam A, Paquot М, Brans A, Joris В, Arpigny Л„ Thonart Р. 2007. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environ Microbiol 9: 1084-1090.

2. MalfanovaN, Franzil N, Lugtenberg B, Chebotar V, Ongena M. 2012. Cyclic lipopeptide profile of the plantbeneficial endophytic bacterium Bacillus subtilis C8. Arch Microbiol 194: 893-899.

3. Bais HP, Fall R, Vivanco JM. 2004. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol 134.307-319.

4. Kloepper J, Leong J, Teintze M. and Schroth MN. 1980. Pseudomonas sideropho-res: a mechanism explaining disease suppressive soils. Current Microbiology 4: 317-320.

5. Chen X.-H., R. Scholz, M. Borriss, H. Junge, G. Mogel, S. Kunz, and R. Borriss. 2009. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease. J. Biotechnol. 140:38-44.

6. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, et al. 2007. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat Biotechnol 25: 1007-1014.

7. Scholz R, Molohon KJ, Nachtigall J, Vater J, Markley AL, Sussmuth RD, Mitchell DA, BorrissR. 2011. Plantazolicin, a novel microcin B17/streptolysin S-like natural product from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. J Bacterid. 193: 215-224.

8. Molohon, K.J.; Melby, J.O.; Lee, J.; Evans, B.S.; Dunbar, K.L.; Bumpus, S.B.; Kelleher, N.L.; Mitchell, D.A. Structure determination and interception of biosynthetic intermediates for the plantazolicin class of highly discriminating antibiotics. ACS Chern. Biol, 6:1307-1313 (2011). doi:10.102 l/cb200339d.

9. He P, Hao K, Blom J, Ruckert C, Vater J et al. 2013. Genome sequence of the plant growth promoting strain Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B9601-Y2 and expression of mersacidin and other secondary metabolites. J Biotechnol 164: 281-291.

10. Palacios OA., Bashan Y, de-Bashan LE. 2014. Proven and potential involvement of vitamins in interactions of plants with plant growth-promoting bacteria: an overview. Biol. Fertil. Soils 50: 415-432.