BG107299A

BG107299A - Употреба на lactobacillus casei в имуностимулиращи пептиди

Info

Publication number: BG107299A
Application number: BG107299A
Authority: BG
Inventors: Eric Postaire; Benjamin Bonavida
Original assignee: Compagnie Gervais Danone
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2003-07-31
Also published as: JP2003534284A; CA2410350A1; NO20025595L; HUP0302041A3; US20040029127A1; FR2809312A1; IL152980A0; EP1283714B1; HRP20020935A2; DE60121327T2; DK1283714T3; ES2267763T3; HK1055898A1; EP1283714A1; FR2809312B1; BG65884B1; CA2410350C; SK18272002A3; EA005081B1; CN1430518A

Abstract

Изобретението се отнася до употребата на Lactobacillus casei в състав за орално приложение, предназначен за усилване на имунитет, специфичен към патогенни микроорганизми. Съставът може да бъде прилаган като храна или хранителна добавка.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението е свързано с употребата на бактерии на млечната киселина с цел създаване на потенциал за специфична имунна реакция срещу инфекциозен агент.

Бактериите на млечната киселина (LAB) обикновено се използват за производство на ферментирали хранителни продукти, по-специално млечни продукти.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Ефектът от действието на бактериите на млечната киселина върху здравето, първоначално са предположени в проучванията на Мечников (The prolongation of life. 1^st ed. New York: GP Putman’s Sons, 1908) и оттогава са били обект на много изследвания.

Сега е общопризнато, че различните бактерии на млечната киселина могат да играят роля, която благотворно влияе на здравето. Тези бактерии също са известни като ’’протобиотици” име, което означава живи микроорганизми, които когато се приемат в стомаха в достатъчно количество, упражняват положителен ефект върху здравето, който превъзхожда ефекта от обикновените храни. Пробиотичните бактерии, поспециално са описани измежду видовете, принадлежащи към произход

Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus и Lactococcus, които обикновено се използват в млечната промишленост.

Счита се, че пробиотиците специално въздействат на нивото на чревната флора посредством забавяне развитието на патогенни микроорганизми, и/или посредством по-пряко действие върху имунната система. Например, наблюдавано е, че приемането в стомаха на пробиотични бактерии, води до намаляване на патогенните бактерии; по отношение на имунната система, и са докладвани различни ефекти; активиране на клетките, участващи в специфични или неспецифични имунни реакции, като лимфоцити и макрофаги, увеличение на нивото на имуноглобини и по-специално на IgA; увеличение на нивото на активиращите имунната система цитокини, и т.н. (за преглед, виж например MEYDANI и НА (Am J ClinNutr, 71, 861-7217, 2000).

Общо казано, изследванията проведени с различни пробиотични бактерии на млечната киселина са с тенденция да заключат, че някои видове или поне някои култури от тези видове, имат имунностимулиращи свойства. От друга страна, механизмът/ите в основата на тези свойства и компонентите от имунната система, които потенциално са включени остават неизвестни. Затова се явява необходимост да се осветлят тези аспекти и поспециално, да се предложат по-целенасочени приложения на различните видове или култури от протобиотични бактерии.

Няколко изследвания проведени с хора и животни предполагат, че бактериите от вида L. casei оказват благоприятен ефект върху здравето, и по-специално положителен ефект върху имунната система.

По-този начин е показано при мишки, че въвеждане в стомаха на ферментирало мляко, съдържащо L. casei култура DN-114 001 увеличава съпротивителната способност срещу инфекция със Salmonella typhimurium [PAUBERT-BRAQUE et al. Int J Immunother, 4:153, (1995)] и веднага се наблюдава активирането на макрофаги и нарастване на циркулиращите IgA.

Културата DN-114 001 бе заложена на 30 декември, 1994 в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) [Национална сбирка от култури на микроорганизми], съхранявана в Институт Пастьор, 25 rue du Docteur Roux, в Париж, под номер 1-1518; тази култура и нейните комбинации с ферменти на кисело мляко, прилагани за приготвяне на ферментирали млечни продукти, са описани в РСТ заявката WO 96/20607 от името на COMPAGNIE GERVAIS DANONE.

Едно скорошно изследване проведено върху хора също докладва, че консумацията на ферментирало мляко, съдържащо L. casei култура DA-114 001 предизвиква усилване на съпротивителните способности срещу Salmonella typhimurium. Този ефект се дължи на действие върху неспецифичен естествен имунитет [YOON et al., Int J Immunother; 15, 79-89 (1999)].

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретателите са изследвали дали L. casei също има влияние върху придобит имунитет, който за разлика от естествения имунитет, се проявява в специфична имунна реакция срещу даден патогенен агент.

За тази цел, изобретателите са изследвали ефекта от L. casei, въведен орално in vivo, върху ex vivo стимулиране нарастването на Т-клетки като реакция към антигени представители на различни типове общи патогенни агенти: бактериален антиген (тетанус); гъбичен антиген (Candida) и вирусен антиген (грип).

Изследователите са наблюдавали за всеки от изпитваните антигени, че въвеждане в стомаха на L. casei води до увеличение в капацитета за нарастване на Т клетки и по-специално на подпопулации от CD* като реакция на активиране със споменатия антиген. Този ефект се демонстрира по-характерно в случай с антиген на грип.

Обект на настоящото изобретение е употребата на бактериална култура от вида L. casei за изготвяне на състав, който може да се въвежда орално, за да усили специфична системна имунна реакция срещу един патогенен микроорганизъм.

Това усилване на имунната реакция се постига от увеличаване капацитета на нарастване на Т-клетките, специфични за антигените от споменатите патогенни микроорганизми.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Според едно предпочитано изпълнение на настоящото изобретение, споменатият микроорганизъм е патоген разпространен във въздуха, поспециално патоген на дихателните пътища.

Тези патогени са по-специално бактерии или вируси; измежду тях, ще се споменат например, риновируси, дихателен синцитиален вирус (RSV), и миксовируси (ортомиксовируси като вирусите на грип (грип тип А, В или С), или парамиксовируси и по-специално пара-грипния).

В контекста на приложението на настоящото изобретение, споменатата култура L. casei може да се използва самостоятелно или в комбинация с други бактерии на млечната киселина от вида L. casei или от други видове. Преимуществено културата може да се използва в комбинация с ферменти на кисело мляко, а именно Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus.

Културата може да се използва под изцяло бактериална форма, която може да бъде жива или не, а също и под формата на бактериален лизат или под формата на бактериални фракции.

За предпочитане, съставът изготвен в контекста на употреба, в съответствие с изобретението да съдържа поне 10⁵, за предпочитане поне Z η Λ , в общия случай между 1x10 и 1.5x10 , клетки на£. casei за ml.

Когато L. casei се използва в комбинация с ферменти на кисело мляко, η споменатия състав също преимуществено включва поне 10 , за 0 Λ предпочитане между 2x10 и 1x10 , клетки S. thermophilus за ml, и поне 5x10 и за предпочитане 4x10 и 2x10 , клетки L. bulgaricus за ml.

Една култура на L. casei, която може да бъде особено подходяща за употреба в настоящото изобретение е CNCM културата 1-1518.

Съставите приготвени в съответствие с изобретението могат да се въвеждат под формата на храни или на хранителни добавки. Те могат да бъдат, например млечни продукти и по-специално ферментирали млечни продукти, включващи поне споменатата култура на L. casei, вариантно комбинирана с други бактерии на млечната киселина, например с ферменти на кисело мляко.

Съставите приготвени в съответствие с настоящото изобретение могат да се използват в контекста на предпазване от и лечение на патологични условия от инфекциозен произход и по-специално от вирусен произход, и по-специално на грип. За предпочитане, за да се получи оптимален ефект, те трябва да се приемат за най-малко една седмица, и за предпочитане за поне десет дни в количество, съответстващо на абсорбирането на поне 10⁷, за предпочитане поне 10⁸, в общия случай между 10⁹ и 10¹⁰, клетки на L. casei.

Настоящото изобретение ще бъде по-ясно разбрано с помощта на едно последващо описание, което се отнася до неограничаващи изобретението примери, илюстриращи свойствата на една култура на Lactobacillus casei за усилване специфичната реакция към микробни антигени.

ПРИМЕР 1: ДЕЙСТВИЕ НА LACTOBACILLUS CASEI ВЪРХУ НАРАСТВАНЕТО НА Т-КЛЕТКИ КАТО РЕАКЦИЯ КЪМ АНТИГЕННА СТИМУЛАЦИЯ

За да се изпита ефекта от въвеждане в стомаха на ферментирал млечен продукт, включващ културата на Lactobacillus casei DN-114 001 (CNCM I1518) върху нарастването на Т-клетки като реакция на антигенна симулация бе извършено двойно изследване на сляпо спрямо неутрално вещество (placebo).

Условията на това изследване са както следва:

Индивиди

Към Департамента за инфекциозни заболявания, Болничен център на Вашингтон бяха привлечени 88 здрави индивида от 18 до 50 годишна възраст. Индивиди, имащи клинична история на хепатит или на проблеми с носа, със сърдечносъдови смущения, с имунни или гастроентериологични заболявания, с тежка форма на астма или на захарен диабет, индивиди преминали лечение с антибиотици или имуноподтискащи медикаменти през последните три месеца преди началото на изследването, индивиди страдали от алкохолизъм или с алкохолна зависимост, индивиди с известна непоносимост или свръхчувствителност към млечни продукти, индивиди на ниско калорична диета, такива ваксинирани срещу грип през предходния сезон, а също така и бременни жени и кърмачки, бяха изключени от изследването.

Последователността и условията на изследването бяха одобрени от Комитета за изследвания към Болничен център на Вашингтон, а също и от Борда за проверка на институциите, който контролира изследвания провеждани върху хора.

Избраните индивиди произволно бяха разделени на две групи:

Една група от 47 индивида (26 жени и 21 мъже) получаваше дневно 100 ml ферментирал млечен продукт, съдържащ 2% мазнини, ферменти на кисело мляко (L. Bulgaricus и S. thermophilus) и култура на Lactobacillus casei DN-114 001, който се продава от DANONE под търговската марка ACTIMEL.

Една група от 41 индивиди (22 жени и 19 мъже) получаваше неутрално вещество в продължение на 28 дни: по 100 ml на ден мляко разредено с вода (1/5, обемно) подсилено със захар, за да се постигне калорична стойност еквивалентна на тази на ACTOMEL.

Индивидите от двете групи бяха помолени, за продължителността на изследването, да се въздържат от употреба на кисело мляко или други ферментирали млечни продукти.

Средната (стандартното отклонение е дадено в скоби) възраст на индивидите в група ACTIMEL и групата на неутрално вещество беше съответно 36 (7.3) и 32.7 (7.4).

От всеки индивид от двете групи, преди да започне консумиране на ACTIMEL или неутралното вещество (placebo), беше взета кръвна проба (55 ml) с цел да се определят базовите стойности. На индивидите бяха дадени дати за контролни посещения на 9, 18 и 28 ден като те попълниха кратки въпросници по отношение на тяхното здравословно състояние, възможните странични ефекти, а също за развитието на някакво заболяване, което е възможно да изкриви интерпретацията на резултатите. При всяко посещение за целите на имунологични експерименти се вземаше кръвна проба.

За всяка кръвна проба от даден индивид се извършваха пълно преброяване на кръвните клетки и химически анализ на кръвта. Освен това, с помощта на дебитна цитометрия се извършваше фенотипен анализ на левкоцитите и на техните подгрупи (Т клетки и подгрупи, В клетки, моноцити и NK клетки).

Измерване нарастването на клетките

По долу е описана реакцията в образуването на Т клетки определена ex vivo посредством измерване включването на ³HTdR, при индивидите от групата ACTIMEL и индивидите от групата с неутрално вещество (placebo), по отношение на три микробни антигена: Candida, тетанус и грип.

Приготвяне на клетки:

ml хепаризирана кръв от всеки от взетите образци се обработват по следния начин: епруветката се центрофугира за 10 мин при 1500 об/мин. Плазмата внимателно се прехвърля в надписани криоепруветки и се съхранява при 70°С [sic]. Кръвта се прехвърля в 15 ml епруветка за центрофугиране и се разрежда до 1 : 3 с PBS. В 50 ml епруветка за центрофугиране се добавят 10 ml от Ficell-hypaque и се покриват с 30 ml от разредената кръв. Епруветката се центрофугира за 2 мин при 2000 об/мин. при околна температура. Горният слой от PBS се изтегля и моноядрените клетки се обединяват и прехвърлят в 15 ml епруветка за центрофугиране. Добавят се 10 ml HBSS, разбъркват се и се центрофугират за 10 мин; ** повърхностният слой се изтегля и оформената гранула се суспендира повторно в 2-3 ml HBSS. Добавят се 8 ml HBSS и епруветката се центрофугира при 1500 об/мин. за 5 мин. Тази последователност се повтаря два пъти и възстановените клетки се суспендират отново в 1-2 ml PBS, след което се разбъркват. Клетките се преброяват като се проверява тяхната жизненост посредством изключване с Trypan Blue, като получената е

концентрация се довежда до 2 х 10 /ml.

Приготвяне на антигени:

Антиген на тетанус: приготвянето се извършва в деня на изпитването. Разтвор за съхранение се изготвя посредством разреждане на токсоид на тетанус (CONNAUGHT LABORATORY, Willowdale, Canada) до 1 : 1000 в PBS.

Антигени на Candida albicans: разтвор за съхранение се приготвя посредством разреждане на антигени на Candida albicans (BAYER CO, Elkert, IN) до 1 : 1000 в PBS.

Антигени на грип: разтвор за съхранение се приготвя посредством разреждане на приготвени антигени на вирус на грип (NIBSC, Herts, England) до 1 : 125 в PBS.

Използват се плочки за микротитриране (96 кладенчета). Във всяко кладенче се поставя 100 μΐ от антигенния разтвор и 100 μΐ от клетки при окончателна концентрация от 2 х 10⁵ клетки за кладенче. В контролни кладенчета се поставят 100 μΐ PBS вместо антигенен разтвор. Плочките се инкубират при 37°С, 5% СО₂ за 5 дни: 18 часа преди края на инкубацията, се добавят 20 μΐ от 50 pCi/ml ³HTdR (NEW ENGLAND NUCLEAR, Boston, МА). Добивът от клетки от кладенчетата на всяка плочка се получава върху филтри и тези филтри се броят непосредствено в бета-брояч MATRIX 1000 (PACKARD INSTRUMENTS), за да се измери включването на ³HTdR, което се изразява в СРМ (преброявания за минута).

За всеки индивид от групата получила ACTIMEL и за всеки индивид от групата получила неутрално вещество нарастването на клетките се оценява посредством определяне индекса на стимулиране (SI), според следната формула:

SI := Среден CPM стимулирани клетки________________.

Среден СРМ нестимулирани клетки (контролно кладенче)

Статистически анализ

За да се обобщи реакцията на нарастване на Т клетките при подлагане на антиген от всеки вид за всяка от групите от изследването и по всяко време на измерване бяха използвани методите на дескриптивна статистика (средна стойност, стандартно отклонение, медиана). Поради систематичната грешка от разпределение на реакцията на нарастване за данните за нарастване се използва трансформация към натурален логаритъм.

За статистическо моделиране [LITTELL et al. SAS Systems for Mixed Model, North Carolina: SAS Institute Inc. (1996)] се използват вариациите в реакцията на нарастване сравнени с базовата стойност. Модификациите на реакцията на нарастване сравнени с базовата стойност във функция от времето, са представени като се използва метода за изглаждане по крива, както е описано от DIGGLE et al. [Analysis of Longitudinal Data, New York: University Press Inc. 1994].

За да се изследва траекторията на реакцията на нарастване бе разработен смесен линеен модел. Този модел позволява настройване на данните за нарастване към квадратична крива за всяка група от изследването.

Този модел се определя от следното уравнение:

Yijt = aij+ pijT + p2jT² +e_ijt,i= 1,...n, j = 1, 2, t= 1,2,3,4, в което:

Yjti отбелязва вариацията в реакцията за нарастване сравнена с базовата стойност за индивид i в продуктова група j във време t като за всяка променлива е приложена трансформация към натурален логаритъм,

Yijt = Log (нарастване във време t) - Log (базова стойност).

ccjj отбелязва прекъсването за индивид i в продуктова група j. То отразява случаен ефект в модела. 0Сц ~ MVN (0, G), G съдържа компонентите на вариантата в диагоналната структура (MVN разпределение на мултинормална променлива).

βlj и β2j са коефициенти на регресия на Т и Т за продуктова група j;

Т е момента на измерване (ден 0, 9, 18, или 28), а Т е квадратичния израз на Т.

Sy е коефициента на грешката:

£jjt ~ MVN ( 0, R) и R = σ Ι_η, в което 1_п отбелязва матрицата на идентичност пхп.

Бяха извършени статистически тестове за следните хипотези:

а) Тест при който оценения коефициент на регресия е 0.

Но: β lj = 0 към Hi: β lj = 0 (за линеен израз) и Но : β2] = 0 към Hi : $2j = 0 (за квадратичен израз)

Ако β 1 j и 32j не са различни от 0 няма траектория.

Ако P2j е значително различно от 0 налице е квадратична траектория.

Ако само βΐ] е значително различно от нула налице е линейна траектория.

в) Сравнява се дали траекториите на двете групи са идентични.

Н_о: βΐι = β1₂ към Hi: βΐι = β1₂ (за линеен израз) и Но : β2ι = β2₂ към Hi : β2ι = β2₂ (за квадратичен израз).

За извършване на анализа бе използван статистически пакет SAS.

Резултати

Таблица I по-долу дава демографските данни по отношение на индивидите и оценката на базовата стойност за нарастване на клетките.

Таблица I

Демографски данни неутрално и базови стойности	Неутрално вещество	ACTIMEL	Сравнение между вещество и ACTIMEL
Пол Женски	22	26	Chi-квадратичен тест
Мъжки	19	21	р= 0.826
Възраст Средна (SD)	(7-)31	36.0+/- 7.3	Т-ТЕСТ
Медиана		37	р= 0.038
Етнос Бял	26	25	Chi-квадратичен тест
Черен	12	17	ОЧАКВАНА
			СТОЙНОСТ ЗА
ДРУГ	3	5	р = 0.652
Левко- Средно (SD)	5997	5810	Т - тест
цити	(1451)	(1399)
Медиана	5992	5990	р = 0.540
Лимфо- Средно (SD)	1932 (567)	2009 (554)	Т-ТЕСТ
цити
Медиана	1812	1993	р = 0.519
СОЗ⁺СО4⁺Средна (SD)	865 (327)	907 (325)	Т-тест
Медиана	740	818	р = 0.546
СОЗ⁺СО8⁺Средна (SD)	469 (205)	431 (181)	Т-тест
Медиана	417	403	р = 0.360
CD3⁺CD25⁺CpeflHa(SD)	380 (200)	408 (182)	Т-тест
Медиана	349	392	р = 0.489
СОЗ⁺СО45⁺Средна (SD)	1384 (488)	1411 (434)	Т-тест
Медиана	1354	1382	р = 0.783

SD = стандартно отклонение.

Нарастване на Т-клетки като реакция на специфични микробни антигени

Средните стойности, стандартните отклонения и медианите на ex vivo нарастването на периферни моноядрени клетки (РВМС) за всяка група (ACTIMEL и неутрално вещество) в различни времена за вземане на пробата, са дадени в таблица 2 по-долу.

Таблица 2

Антиген	Неутрално вещество	ACTIMEL
Ден 0	Ден 0	Ден 18	Ден 28	Ден 0	Ден 9	Ден 18	Ден 28
Candida
Средно	2.3	2.7	2.9	1.9	3.0	3.2	4.3	2.3
SD	2.0	3.1	4.1	1.2	3.4	3.5	5.6	2.6
Медиана	1.5	1.7	1.6	1.6	1.7	1.7	2.0	1.4
Тетанус
Средно	7.3	11.8	7.9	8.7	8.4	8.7	10.3	7.8
SD	7.8	12.3	8.0	8.1	15.8	10.4	11.8	8.2
МЕДНА	5.2	6.3	5.1	6.7	3.5	5.2	5.0	5.1
НА
Грип
Средно	14.2	21.7	17.0	17.3	13.0	19.7	20.3	13.9
SD	11.4	19.1	19.6	15.7	12.6	17.1	16.6	12.7
Медиана	11.1	16.5	9.8	12.0	9.6	16.9	17.0	11.0

SD = стандартно отклонение

Няма значителни различия между двете групи от изследването по отношение базовите стойности (ден 0) за реакцията на нарастване към трите микробни антигена.

На Фигура 1 са показани вариациите в реакцията на нарастване във времето за всеки антиген за двете изследвани групи : Група ACTIMEL: непрекъсната линия; група с неутрално вещество: прекъсната линия.

В Таблица 3 по-долу са дадени резултатите от статистическото моделиране.

Таблица 3

АНТИГ ЕН	ПРОМЕНЛИ ВА	Оценка на Параметъра	Стандартна грешка	Нотест параметър=0	Сравнение на 2-те криви
Candida	Placebo Т Гр2	0.017 -0.0007	0.014 0.0005	Р=0.232 Р=0.208	Но: β1ι=β1₂ Р=0.540 Но: β2₁₌β2₃ Р=0.458
ACTIMEL Т ^2	0.028 -0.0012	0.013 0.0005	Р=0.030 Р=0.013
Тетанус	Placebo Т гр2	0.034 -0.0008	0.014 0.0005	Ρ=Ό.Ο22 Р=0.141	Но: β1ι=β1₂ Р=0.630 Но: β2₁₌β2₂ Р=0.626
ACTIMEL Т	0.043 -0.0011	0.013 0.0005	Р=0.001 Р=0.020
Грип	Placebo Т	0.022 -0.0004	0.017 0.0006	Р=0.181 Р=0.475	Но: β1ι=β1₂ Р=0.045 Но: β2ι=β2₂ Р=0.027
ACTIMEL Т rj-i2	0.068 -0.0023	0.015 0.0006	Р=0.0001 Р=0.0001

Candida:

В групата ACTIMEL базовата реакция 3.0+/-3.4 в ден 0 нараства до 3.2+3.5 в ден 9 и 4.3+5.6 в ден 18, след което спада до 2.3+2.6 в ден 28 Таблица 2). Коефициентите определени за линейния израз Т и за квадратичния израз Т² са съответно 0,028 и 0.0012 (Таблица 3). Двете стойности, статистически значително са различни от 0 (съответно, р=О.ОЗО и 0.013). Тези наблюдения внушават, че има значителна положителна тенденция на изменение в реакцията на нарастване на клетките към антигена Candida. Реакцията на нарастване отначало се увеличава, след това намалява както е показано на Фигура 1а.

Групата с неутралното вещество (placebo) за периода на изследването показва малка промяна. Коефициентите на регресия определени за Т и Т са 0.017 и 0.0007. Тези стойности не се различават значително от 0 (съответно, р=0.232 и 0.208). Тези наблюдения показват, че в контролната група няма значима промяна в реакцията на нарастване за периода на изследването. Както е показано на Фигура 1а, кривата за групата с неутрално вещество е по-плоска от тази на групата с ACTIMEL. Въпреки че групата с ACTIMEL показва значителна траектория, в противоположност на групата с неутрално вещество, разликата между двете криви не достига нивото на статистическа значимост (р=0.540 за Т и р=0.458 за Т², Таблица 3).

Тетанус :

За групата с ACTIMEL, реакцията постепенно нараства от базовото ниво до ден 18, след което спада. Коефициентите на регресия определени за Т и Т² са съответно 0.043 и 0.0011 (Таблица 3). Тези две стойности за значително различни от 0 (съответно р=0.001 и 0.020). Както в случая при Candida, положителната промяна в реакцията на нарастване при групата с ACTIMEL за периода на провеждане на изследването е значителна. При групата с неутрално вещество, средната стойност нараства от 7.3 в ден 0 до 11.8 в ден 9, след което спада до 7.9 в ден 18 и отново нараства до 8.7 в ден 28 (Фигура 1в). Дори и при незначителен коефициент за израза от втора степен, Т² (-0.0008, р=0.141, Таблица 3), значимият коефициент определен за Т (0.034, р=0.022, Таблица 3) показва ефект в траекторията. При това, ако групата с ACTIMEL се сравни с групата с неутрално вещество, статистическите тестове не показват някаква значителна разлика между двете криви (р=0.639 и 0.626, съответно за Т и Т ).

Грип:

Групата с ACTIMEL показва по-ясна промяна в сравнение с групата с неутрално вещество. Средната стойност нараства от 13±12.6 в ден 0 до 19.7±17.1 в ден 9 остава на това ниво до ден 18 и спада до 13.9±12.7 в ден 28 (Фигура 1с). Двата коефициента определени за Т и Т значително се различават от 0 (р=0;001). Тези статистически данни означават, че положителната промяна в реакцията за нарастване на клетките по време на изследването е значителна (Таблица 2).

Групата с неутрално вещество показва изменения подобни на тези наблюдавани при тетанус. Средните стойности нарастват до ден 9, спадат до ден 18, и отново нарастват до ден 28, както е показано на Фигура 1с. Двата определени коефициента на регресия не се различават значително от 0 (стойностите за р са съответно 0.181 и 0.475 за Т и Т ), което показва, че няма значителна траектория във вариациите на реакцията за нарастване към антигена на грип.

Когато параметрите определени за група ACTIMEL и групата с неутрално вещество се сравнят, се наблюдават значителни разлики, както за линейните параметри, така и за квадратичните параметри (р=0.045 за Т и р=0.027 за т²) (Таблица 3). Тези заключения показват, че вариациите в реакцията за нарастване на клетките между двете групи от изследването се различават значително.

ПРИМЕР 2: ДЕЙСТВИЕ НА LACTOBACILLUS CASEI ВЪРХУ НАРАСТВАНЕТО НА Т ЛИМФОЦИТНИ ПОДКЛАСОВЕ КАТО РЕАКЦИЯ НА СТИМУЛИРАНЕ С АНТИГЕН НА ГРИП

Точното естество на подклас(ове) Т, който реагира in vitro на микробни антигени не е известно. Предполага се, че или всеки един от специфичните подкласове на Т лимфоцитите, като тези представени от фенотиповете CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ и CD3+CD45+ могат да се считат за първично реагиращи, или тези комбинирани подкласове могат да допринасят за общата реакция за нарастване на клетки спрямо усилващи антигени.

При предварително предположение, че специфичните лимфоцитни подкласове са главните реагенти на усилващите антигени, бяха извършени анализи, използващи статистическия модел описан в Пример 1 по-горе, за Т клетки подкласове CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ CD3+CD45+ , с цел да се определи дали реакцията за нарастване на клетките постигната за всеки от 4-те подкласа се различава значително между групата с ACTIMEL и групата с неутрално вещество.

В тези анализи, стойностите за реакция за нарастване на клетките, първоначално основани на пълните РМВС, бяха преобразувани, за всеки подклас, в нови стойности изчислени според пълната честота на CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ и CD3+CD45+ Т клетки във всяка кръвна проба. След което статистически анализи бяха проведени за всеки подклас, както е описани в Пример 1 по-горе.

Средните стойности, стандартните отклонения и медианите за всяка от групите с ACTIMEL и неутрално вещество, за четири левкоцитни подкласа са дадени в таблица 4 по-долу.

ч»

Таблица 4

Левкоцитен подклас	НЕУТРАЛНО ВЕЩЕСТВО	ACTIMEL
Ден 0	Ден 9	Ден 18	Ден 28	Ден 0	Ден 9	Ден 18	Ден 28
CD3+CD4+ Средно	101	149	113	125	87.4	131	133	107
SD	84.0	130	117	127	104	90.2	112	127
Медиана	72.8	111	74.5	91.0	63.0	103	92.0	64.5
CD3+CD8+ Средно	192	268	251	251	230	301	365	244
SD	155	250	289	336	375	286	554	302
Медиана	167	218	140.5	168	105	180	214	126
CD3+CD25+ Средно	250	377	260	354	177	267	310	270
SD	219	374	208	462	139	163	210	305
Медиана	185	263	228	247	159	262	251	177
CD3+CD45+ Средно	63.5	87.6	73.0	76.2	52.1	78.7	87.1	69.1
SD	54.1	70.9	81.3	79.7	72.2	56.3	79.2	95.2
Медиана	47.5	66.6	43.1	51.4	34.0	64.0	67.8	41.0

SD = Стандартно отклонение

Разликите между базовите стойности на двете групи от изследването не са значими статистически.

Като се използва статистическия модел описан в пример 1 по-горе, за всеки от четирите лимфоцитни подкласа са анализирани вариациите в нарастването на клетките, съответстващо на тези базови стойности като реакция на антиген на грип. На Фигура 2 са показани вариациите в нарастването на клетките по логаритмична скала за всеки от тези подкласове и за всяка от двете групи от изследването.

Резултатите от статистическото моделиране са даден в Таблица 5 по долу.

Таблица 5

Лимфоцитен подклас	Променлива	Оценка на параметъра (SE)	Но тест: параметър= 0	Сравнение между двете криви
CD3+CD45+	Placebo Т Т²	0.015 (0.016) -0.0003 (0.0006)	Р=0.352 Р=0.597	Н_о: β1₁₌β1₂ Р=0.015 Н_о: β2₁₌β2₂ Р=0.016
ACTIMEL Т т²	0.071 (0.015) -0.0024 (0.0006)	РС0.001 Р0.001
CD3+CD25+	Placebo Т Т²	0.024 (0.016) -0.0004 (0.0006)	Р=0.144 Р=0.463	Но: β1ι=β1₂ Р=0.031 Но: β2,.β2₂ Р=0.030
ACTIMEL Т	0.071 (0.015) -0.0022 (0.0006)	Р<0.001 Р0.001
CD3+CD8+	Placebo Т гр2	0.014(0.017) -0.0003 (0.0006)	Р=0.410 Р=0.671	Но: β1,.β1₂ Р=0.013 Н»: β2,.β2₂ Р=0.012
ACTIMEL Т Т²	0.070 (0.015) -0.0024 (0.0006)	Р0.001 Р<0.001
CD3+CD4+	Placebo Т	0.022 (0.017) -0.0005 (0.0006)	Р-0.203 Р=0.436	Н»: β1,.β1₂ Р=0.028 Ц>: β2„β2₂ Р=0.024
ACTIMEL Т Т²	0.072 (0.015) -0.0025 (0.0006)	Р0.001 Р<0.001

SE = стандартна грешка

Реакциите за нарастване на клетките за всеки от четирите лимфоцитни подкласа са в съответствие с тези наблюдавани за общите РМВС. По време на излагане на антиген на грип, в група е ACTIMEL се наблюдават значителни вариации и за четирите лимфоцитни подкласа. Тези вариации могат да се представят като квадратични функции на времето.

За четирите подкласа в групата с неутрално вещество се наблюдават малки вариации.

Освен това, разликите между двете групи са значителни за всички левкоцитни подкласа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тези резултати показват, че за трите изпитани антигена има увеличение в реакцията за нарастване на клетки, предизвикано от антигенен ускорител, което е по-голямо в групата с ACTIMEL отколкото в групата с неутрално вещество. В случая с антиген на грип, увеличението в групата с ACTIMEL е съществено значително, в сравнение с това наблюдавано в групата с неутрално вещество, както за РВМС, така и за всеки от подкласовете Т-клетки: CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ и

CD3+CD45+.

От това става ясно, че употребата на ACTIMEL въведен в разглежданите индивиди, под формата на имунологично иницииране in vivo, води до ex vivo реакция на техните Т клетки към микробни антигени, и поспециално към антигени на грип, която е по-добре изразена от тази наблюдавана при групата с неутрално вещество.

Това увеличаване в реакцията е свързано с честотата и състоянието на активиране на CD3 + Т клетки и техните подкласове, в индивидите от групата на ACTIMEL.

Освен това положителната връзка с наличието на активиращ маркер на CD25, предполага участието на едно in vivo активиране на Т-клетки специфични за грип, изразяващи рецептори CD25 IL-2, които са в състояние да реагират по-ефективно на антигените на грипа. Анализът на подкласовете от Т-клетки също предполага, че реакцията за нарастване на клетки вероятно включва както подклас CD4⁺, така и CD8⁺, съответстващи на антигена на грипа. Важността на Т - подклас CD3⁺/CD8⁺ при анализа на нарастването на клетки предполага възможността за in vivo иницииране на депо от специфични за грипа CD8+ цитотоксични клетки.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Употреба на бактериална култура от вида L. casei за приготвяне на състав, който може да се въведе орално за подсилване на специфична системна имунна реакция срещу патогенни микроорганизми.
2. Употреба според претенция 1, характеризираща се с това, че споменатия патогенен микроорганизъм е патоген на дихателните пътища.
3. Употреба според всяка една от претенции 1 и 2 , характеризираща се с това, че споменатия патогенен микроорганизъм е вирус подбран от риновируси, дихателен синцитиален вирус и миксовируси.
4. Употреба според претенция 3, характеризираща се с това, че споменатият вирус е един грипен вирус.
5. Употреба според всяка една от претенции 1 до 4 характеризираща се с това, че споменатата култура/,, casei е CNCM култура 1-1518.
6. Употреба според всяка една от претенции 1 до 5, характеризираща се с това, че споменатия състав е под формата на храна или хранителна добавка.
7. Употреба според всяка една от претенции от 1 до 6, характеризираща се с това, че споменатия състав е под формата на ферментирал млечен продукт.