Nouvelles formes pharmaceutiques, leur préparation et les compositions qui les contiennent.
La présente invention concerne de nouvelles formes pharmaceutiques d'un principe actif, leur préparation et les compositions qui les contiennent.
Un médicament ou une drogue, pour exercer son effet, doit pouvoir pénétrer dans la cellule appropriée appelée cellule cible. Généralement cette pénétration s'effectue par diffusion du médicament ou de la drogue à travers la paroi cellulaire. Dans ces conditions, il s'établit un équilibre entre la concentration du principe actif dans la cellule et la concentration dans le milieu extérieur. Par ailleurs, le médicament ne pénètre pas toujours sélectivement dans les cellules cibles sur lesquelles il doit agir et,
par son action sur les cellules saines, le médicament peut exercer des effets secondaires néfastes qui peuvent nuire
à son utilité.
Un autre mode de pénétration intracellulaire est basé sur un mécanisme endocytaire au cours duquel les macromolécules sont incluses dans des vacuoles formées par l'invagination de la membrane cellulaire avant de fusionner avec les lysosomes.
Ce mécanisme endocytaire dont la prépondérance dépend du type cellulaire peut être utilisé en thérapeutique pour augmenter la sélectivité des agents thérapeutiques vis-à-vis des cellules susceptibles de ce mécanisme.
Pour que l'agent thérapeutique ait une taille suffisante pour participer à ce mécanisme endocytaire, il est possible de lier le principe actif à une macromolécule, telle qu'une protéine, qui sera désignée sous le nom de vecteur. Pour que le médicament puisse exercer en totalité ou en partie ses effets, il est nécessaire qu'il soit libéré à l'intérieur ou au voisinage immédiat de la cellule cible. En d'autres termes, la combinaison principe actif-vecteur ou drogue-vecteur doit répondre aux trois critères suivants :
1) être stable dans la circulation sanguine avant d'atteindre
les cellules cibles,
2) être dissociée ou scindée dans les cellules cibles ou dans
leur voisinage immédiat,
3) être capable de régénérer la drogue sous sa forme active.
Pour que le premier de ces critères soit satisfait, il est nécessaire que le lien entre la drogue et le vecteur soit de nature covalente, et que ce lien covalent résiste aux hydrolases présentes dans le sérum.
La combinaison drogue-vecteur pénétrant dans les cellules cibles par un mécanisme essentiellement endocytaire, il est nécessaire de tenir compte des propriétés des lysosomes pour satisfaire au second critère. En effet, le lien entre
la drogue et le vecteur peut être coupé soit chimiquement en milieu acide soit enzymatiquement au moyen des hydrolases acides des lysosomes. Mais encore faut-il, compte tenu du troisième critère, que la drogue soit libérée sous sa forme active. Il a été constaté qu'un tel résultat ne peut pas
être obtenu si le principe actif est lié directement à la macromolécule.
Il a été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, qu'on peut obtenir un médicament qui possède les caractéristiques désirées, si on intercale un lien temporaire désigné par le terme "bras",entre la drogue et le vecteur.
La présente invention concerne les nouvelles formes pharmaceutiques d'un principe actif qui peuvent être schématiquement représentées par :
<EMI ID=1.1>
leur procédé de préparation et les compositions qui les contiennent.
Selon l'invention, la "drogue" est constituée par un principe actif qui agit intracellulairement et qui contient dans sa molécule une fonction amine libre. A titre d'exemples de drogues à fonction amine libre peuvent être citées des anthracyclines ayant une activité antitumorale, telles que
la daunorubicine ou la doxorubicine, ou des quinoléines ayant des propriétés antimalariques, telles que la primaquine.
Selon l'invention, le "bras" est de nature peptidique et il contient, de préférence, 4 aminoacides. Il est particulièrement important que l'aminoacide, lié à la fonction amine libre de la "drogue" par sa fonction carboxylique, comporte un carbone asymétrique et possède la configuration L car les peptidases ou les hydrolases lysosomiales ne coupent que les liaisons peptidiques en a d'un carbone asymétrique.
D'un intérêt tout particulier pour remplir cette fonction
est la L-leucine. Par exemple, parmi les dérivés de la fonction amine des anthracyclines antitumorales, telles que
la daunorubicine il a été montré que la N-L leucyldaunorubicine est le produit qui, dans les conditions de la digestion lysosomiale libère la quantité la plus importante
de daunorubicine. Ainsi après 2 heures d'hydrolyse à pH 6,0,
la N-L leucyl-daunorubicine fournit 40 % de daunorubicine libre.
Si le bras entre la daunorubicine et le vecteur est une L-leucine, après 24 heures d'hydrolyse à pH 6,0 du produit vecteur-bras-drogue par des enzymes lysosomiaux purifiés,
15 % de la drogue va être libérée sous forme de daunorubicine libre. De plus, un taux de libération de la "drogue" libre beaucoup plus important est obtenu lorsque le nombre des aminoacides constituant le "bras" peptidique augmente et il peut atteindre 78 lorsque le peptide intermédiaire est constitué par l'enchaînement de 4 aminoacides. Ainsi selon l'invention, le "bras" intermédiaire est de préférence représenté par l'enchaînement :
<EMI ID=2.1>
dans lequel L-Leu est lié par sa fonction carboxylique à la fonction amine de la drogue et X représente 1, 2 ou 3 aminoacides, identiques ou différents, choisis parmi la L-alanine, la
glycine et la L-leucine.
D'un intérêt tout particulier sont les "bras" peptidiques L-ala-L-leu, L-ala-L-leu-L-ala-L-leu, (L-ala)3-L-leu, L-ala-L-leu-gly-L-leu, gly-L-leu-gly-L-leu; parmi ceux-ci l'enchaînement (L-ala-L-leu) dans lequel n est égal à 1 ou 2 convient particulièrement bien.
Selon l'invention, le "vecteur" est une macromolécule qui peut être endocytée sélectivement par les cellules cibles. De préférence la macromolécule est une protéine dont la nature est liée à l'action recherchée de la "drogue". Par exemple, dans le cas des dérivés des anthracyclines antitumorales, la sérum albumine bovine (BSA), la fétuine ou l'immunoglobuline peuvent être avantageusement utilisées. Dans le cas des quinoléines antimalariques, il est particulièrement intéressant d'utiliser l'asialofétuine qui est un vecteur allant spécifiquement dans les hépatocytes où se trouvent les parasites.
Selon l'invention, les nouvelles formes pharmaceutiques peuvent être obtenues par action d'un produit de formule générale :
<EMI ID=3.1>
dans laquelle le terme "Drogue" et le symbole X sont définis comme précédemment sur une protéine dans les conditions habituellement utilisées pour créer une liaison peptidique entre la fonction amine libre de l'aminoacide terminal du produit de formule générale (II) et les fonctions acides libres de la protéine.
Le "bras" peut également être accroché aux fonctions amines libres de la protéine après succinylation de la fonction amine libre de l'aminoacide terminal du produit de formule générale (II).
Généralement, la réaction s'effectue dans un milieu tamponné convenable tel qu'un milieu au tampon phosphate
(Phosphate Buffer Saline ou PBS) en présence d'un agent de condensation tel qu'un carbodiimide comme l'éthyl -1 (diméthyl-
<EMI ID=4.1>
entre 0 et 30[deg.]C. Il est particulièrement avantageux d'opérer en l'absence de lumière.
La nouvelle forme pharmaceutique selon l'invention est séparée du mélange réactionnel selon les méthodes physiques ou physicochimiques telles que la chromatographie sur un support approprié.
Le produit de formule générale (II) peut être obtenu par condensation d'un aminoacide convenable ou d'un peptide sous forme acide dont les fonctions amines sont protégées avec une drogue portant une fonction amine libre ou un dérivé de cette drogue portant une fonction amine libre en présence d'un agent de condensation selon les méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique.
De préférence, on réalise d'abord la condensation de la L leucine dont la fonction aminé est protégée sur la "drogue" puis la condensation successive des aminoacides destinés à constituer le bras sur la N-L-leucyl-"Drogue".
Comme agent de condensation, on utilise plus particulièrement un carbodiimide dans un solvant organique tel que le diméthyl-formamide, le chlorure de méthylène ou l'acétonitrile. La fonction acide de l'aminoacide peut aussi être activée sous forme d'ester avec le N-hydroxysuccinimide ou sous forme d'anhydride mixte.
Les groupements protecteurs des fonctions amines sont des groupements de type acyle (formyle) ou uréthane
<EMI ID=5.1>
(trityle). Ces groupements peuvent ensuite être éliminés dans des conditions qui ne doivent pas détruire la liaison peptidique formée. Par exemple, lorsque la fonction amine est protégée par un radical trityle, ce groupement protecteur peut être éliminé par hydrolyse en milieu acide.
Les nouvelles formes pharmaceutiques selon l'invention sont particulièrement utiles pour permettre une action sélective dans le domaine d'activité de la drogue de base. L'action des nouveaux médicaments étant plus spécifique, le même effet sera obtenu avec quantité plus faible de drogue;
par ailleurs, les effets secondaires néfastes pourront être fortement atténués sinon supprimés grâce à la moindre dissémination de la drogue en dehors des cellules cibles.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique.
Les nouveaux produits selon l'invention présentent des propriétés particulièrement intéressantes.
Ainsi les produits pour lesquels la drogue est la daunorubicine inhibent, in vitro, la croissance des cellules cancéreuses, telles que les cellules de la leucémie L1210 dans un milieu approprié. Par exemple, après 72 heures de culture,
la BSA-succinyl-L-ala-L-leu-L-ala-L-leu-daunorubicine, à une concentration voisine de 10 pg/cm provoque 90 % d'inhibition
de la croissance des cellules de leucémie L1210.
Les produits selon l'invention pour lesquels la
drogue est la primaquine provoquent, lorsqu'ils sont administrés par voie intraveineuse à des doses comprises entre 10 et 30 mg/kg, à des souris infestées par Plasmodium berghei, une augmentation du temps de survie supérieure à 400 % par rapport aux témoins non traités.
EXEMPLE 1.
a) Préparation de la L alanyl-L leucyl - L alanyl - L leucyl daunorubicine.
A une solution glacée de 1 g de daunorubicine
<EMI ID=6.1>
Après 5 minutes d'agitation, le pH est amené à 3,5 par addition d'acide sulfurique 6 N puis, après 15 minutes, le mélange réactionnel est neutralisé par addition de soude 1 N. La solution est extraite par 150 cm de chlorure de méthylène.
La phase organique est séchée sur sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à une température inférieure 50[deg.]C, le produit est purifié par chromatographie sur 60 g de silice en éluant avec un mélange chloroforme-méthanol (95-5 en volumes). On obtient ainsi, après évaporation du solvant, 690 mg de N-L leucyldaunorubicine qui, par addition de la quantité théorique d'acide chlorhydrique, fournit 715 mg de chlorhydrate de L leucyldaunorubicine fondant à 201[deg.]C avec décomposition.
A une solution agitée de 677 mg de L leucyl-daunorubicine (1 mmole) dans 16 cm de diméthylformamide, on ajoute
498 mg de N-trityl-L alaninate de N-hydroxysuccinimide (2,12 mmoles) et 0,140 cm de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à une température voisine de 20[deg.]C.
<EMI ID=7.1>
d'un mélange chloroforme-méthanol (99-1 en volumes), puis filtré sur une colonne de 45 g de gel silice. On obtient, après évaporation du solvant, 450 mg de N-trityl L alanyl-L leucyldaunorubicine. Ce produit est traité à froid par une solution
<EMI ID=8.1>
addition d'ammoniaque 12 N. Après extraction par le chloroforme, séchage sur sulfate de sodium, filtration et évaporation du solvant, formation du chlorhydrate et filtration du triphénylcarbinol, on obtient 470 mg de chlorhydrate de L alanyl - L leucyl-daunorubicine fondant à 205[deg.]C avec décomposition.
On dissout 250 mg de chlorhydrate de L alanyl-L
<EMI ID=9.1>
L leucinate de N-hydroxysuccinimide. En opérant comme précédemment pour la préparation de la L alanyl - L leucyldaunorubicine, on obtient 130 mg de chlorhydrate de L leucylL alanyl-L leucyl-daunorubicine fondant à 170[deg.]C avec décomposition.
On dissout 98 mg de chlorhydrate de L leucyl-L alanyl-L leucyl-daunorubicine dans 5 cm<3> de diméthylformamide.
<EMI ID=10.1>
L alaninate de N-hydroxysuccinimide. En opérant comme précédemment pour la préparation de la L alanyl-L leucyldaunorubicine, on obtient 65,5 mg de chlorhydrate de L alanylL leucyl - L alanyl- L leucyl-daunorubicine fondant à 217[deg.]C avec décomposition.
b) Couplage avec la sérum albumine bovine.
A 8 mg de chlorhydrate de L alanyl-L leucyl-L alanyl-L leucyl-daunorubicine en solution dans 2 cm d'eau distillée, on ajoute 100 mg de sérum albumine bovine en solution dans 3 cm de tampon phosphate (Phosphate Buffer Saline, PBS) .
Le mélange est conservé pendant 15 heures à l'obscurité, à une température voisine de 20[deg.]C, puis la solution est filtrée sur une colonne de 150 cm<3> de Biogel P-100 en éluant avec du tampon phosphate (Phosphate Buffer Saline, PBS).
La première fraction (14 cm<3>) qui correspond au produit couplé, est filtrée sur une colonne contenant l.g de Parapak Q (Waters) afin d'éliminer les traces éventuelles
de drogue fixée de façon non covalente. La solution est
<EMI ID=11.1>
drogue par cm et 3 mg de sérum albumine bovine par cm .
EXEMPLE 2.
a) Succinylation de la N-L-alanyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucyldaunorubicine.
On dissout 130 mg de chlorhydrate de N-L-alanyl-Lleucyl-L-alanyl-L-leucyl-daunorubicine (0,139 mmoles) dans
15 cm<3> d'eau bidistillée.
On ajoute 2 fois 14 mg d'anhydride succinique
(2 fois 0,14 mmoles) par petites fractions, tout en maintenant le pH à 7,5 par addition de soude 1 N.
A la fin de la réaction, le pH du mélange réactionnel est ajusté à 5,5 puis on extrait le produit formé par 3 fois
<EMI ID=12.1>
sement 3 fois à l'eau bidistillée, puis séchée sur sulfate de sodium.
Après évaporation de la phase organique, on obtient
100 mg de poudre rouge (rendement 72 %) qui est mise en
<EMI ID=13.1>
L-leu-L-ala-L-leu-daunorubicine.
b) Couplage avec la sérum albumine bovine
On dissout 8,7 mg de succinyl-alanyl-leucyl-alanylleucyl-daunorubicine dans 2 ml d'eau bidistillée et on ajoute
100 mg de sérum albumine bovine dissoute dans 2 ml de PBS et
10 mg de carbodiimide soluble [1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide, Pierce Chem., USA] dissous dans 1 ml
de PBS. Le mélange est agité lentement à 4[deg.]C pendant 16 h
à l'abri de la lumière puis la drogue couplée est séparée de la drogue libre par tamisage moléculaire sur une colonne de Biogel P-100 (Biorad Laboratories, USA). Le premier pic
<EMI ID=14.1>
volume de 46 ml. Ce qui donne un rendement de couplage de
16,9 � et un rapport molaire drogue/protéine de 1,4 ml. La solution est filtrée sur Millipore 0,2 p et conservée à 4[deg.]C.
EXEMPLE 3.
1. Préparation de la L leucyl-primaquine.
a) On agite pendant 24 heures un mélange de 600 mg de primaquine
(2,321 mmoles) et de 1,5 g de fluorénylméthoxycarbonyl L leucinate de N-hydroxysuccinimide (3,36 mmoles) dans 15 cm de diméthylformamide. L'évolution de la réaction est suivie par chromatographie en couche mince. Lorsque la réaction est terminée le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur silicagel en éluant par des mélanges chloroforme-méthanol contenant progressivement de 1 à 10 % de méthanol et enfin par un mélange chloroforme-méthanol-ammoniaque concentrée (900-100-8 en volumes). L'éluat est récupéré en une série de fractions qui sont examinées en chromatographie de couche mince, par rapport à des étalons après détection dans l'ultraviolet.
L'élimination du groupement protecteur de la fonction amine de la L leucine..est effectuée au moyen de pipéridine. Le précipité obtenu est séparé par filtration et le filtrat est neutralisé à pH 7 par une solution d'acide chlorhydrique N. La
<EMI ID=15.1>
La phase organique est séchée sur sulfate de sodium. Après filtration et concentration sous pression réduite (20 mm de mercure), on obtient 647 mg de L leucyl-primaquine. A 647 mg
<EMI ID=16.1>
chlorhydrique 1.N. On obtient ainsi une solution de dichlorhydrate de L leucyl-primaquine.
b) A une solution de 7,68 g de primaquine (0,030 mole) dans
125 cm de chloroforme sec refroidie à 0[deg.]C on ajoute, goutte à goutte, 4,65 g de N-carboxyanhydride de L leucine (0,030 mole) <EMI ID=17.1>
Après évaporation du solvant, le produit est purifié par chromatographie. On obtient ainsi 6,7 g de L leucyl-primaquine.
2. Préparation de la L alanyl-L leucyl-primaquine.
On agite un mélange de 4 g de L leucyl-primaquine
(10,75 mmoles) et de 4,65 g de trityl L alaninate de N-hydroxysuccinimide dans 30 cm de diméthylformamide. L'évolution de la réaction est suivie par chromatographie en couche mince. Après évaporation du solvant sous pression réduite (20 mm de mercure), le produit est purifié par chromatographie sur silice en éluant par des mélanges chloroforme-méthanol contenant progressivement de 1 à 10 de méthanol.
On obtient ainsi 5,21 g de N-trityl L alanyl-L leucyl-primaquine que l'on traite par 50 cm d'acide acétique
<EMI ID=18.1>
filtration, puis le filtrat est neutralisé à froid par addition
<EMI ID=19.1>
du mélange réactionnel par le chloroforme, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium. Après filtration et évaporation du solvant sous pression réduite (20 mm de mercure), on obtient 3,45 g de L alanyl-L leucyl-primaquine.
A 3,45 g de L alanyl- L leucyl-primaquine (7,78 mmoles), on ajoute 15,58 cm<3> d'une solution d'acide chlorhydrique normal. On obtient ainsi une solution de dichlorhydrate de L alanyl-L leucyl-primaquine qui est lyophilisée.
3. Préparation d'asialofétuine- L alanyl-L leucyl-primaquine.
<EMI ID=20.1>
2,5 cm<3> de tampon phosphate (Phosphate Buffer Saline) et on ajoute
50 mg de dichlorhydrate de L alanyl-L leucyl-primaquine et 50 mg de éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide. On laisse
en contact pendant 15 heures à l'abri de la lumière et à une température voisine de 20[deg.]C. Le mélange réactionnel est filtré sur une colonne de 125 cm<3> de Biogel P-100. On recueille des fractions de 150 gouttes.
L'asialofétuine-L alanyl-L leucyl-primaquine est recueillie dans les fractions 6 à 12.
L'asialofétuine peut être préparée de la manière suivante :
Une solution de 1 g de fétuine (Sigma Chem., EtatsUnis) dans 10 cm<3> de tampon acétate 0,2 M à pH 5,5 est passée,
en circuit fermé, à travers une colonne de neuraminidase insolubilisée (Sigma Chem., Etats-Unis) maintenue à 45[deg.]C.
Après 48 heures, la solution d'asialofétuine est récupérée; le gel est lavé par du chlorure de sodium 2 M et l'acide sialique est éliminé par dialyse de la solution pendant
12 heures contre de l'eau distillée. L'asialofétuine est purifiée
<EMI ID=21.1>
éluée par du tampon Tris 0,01 M à pH 8. Des fractions de
150 gouttes sont recueillies à l'aide d'un collecteur de fraction Gilson. Les tubes contenant l'asialofétuine sont réunis et la solution est dialysée contre de l'eau puis lyophilisée.
La présente invention concerne également les compositions médicinales contenant les nouvelles formes pharmaceutiques selon l'invention seules ou en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles. Ces compositions pourront être administrées par voie parentérale.
Les compositions selon l'invention pour administration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylène-glycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive,
ou des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également comprendre des agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants ou par irradiation. Elles peuvent être également préparées sous forme
de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.
L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention.
EXEMPLE.
On prépare selon la technique habituelle 100 cm<3> d'une solution stérile contenant une quantité de BSA-succinyl-L-alaL-leu-L-ala-L-leu-daunorubicine correspondant à 100 mg de daunorubicine libre. Cette solution est administrée en perfusion lente.
New pharmaceutical forms, their preparation and the compositions containing them.
The present invention relates to new pharmaceutical forms of an active ingredient, their preparation and the compositions containing them.
A drug or drug, in order to exert its effect, must be able to enter the appropriate cell called the target cell. Generally this penetration takes place by diffusion of the drug or drug through the cell wall. Under these conditions, a balance is established between the concentration of the active principle in the cell and the concentration in the external medium. In addition, the drug does not always penetrate selectively into the target cells on which it must act and,
through its action on healthy cells, the drug can exert harmful side effects that can harm
to its usefulness.
Another mode of intracellular penetration is based on an endocytic mechanism during which the macromolecules are included in vacuoles formed by the invagination of the cell membrane before merging with the lysosomes.
This endocytic mechanism, the preponderance of which depends on the cell type, can be used in therapy to increase the selectivity of therapeutic agents with respect to the cells susceptible to this mechanism.
In order for the therapeutic agent to be of sufficient size to participate in this endocytic mechanism, it is possible to link the active principle to a macromolecule, such as a protein, which will be designated by the name of vector. For the drug to fully or partially exert its effects, it must be released inside or in the immediate vicinity of the target cell. In other words, the active ingredient-vector or drug-vector combination must meet the following three criteria:
1) be stable in the bloodstream before reaching
target cells,
2) be dissociated or split in the target cells or in
their immediate vicinity,
3) be able to regenerate the drug in its active form.
For the first of these criteria to be satisfied, it is necessary that the link between the drug and the vector is of covalent nature, and that this covalent link resists the hydrolases present in the serum.
Since the drug-vector combination enters the target cells by an essentially endocytic mechanism, it is necessary to take into account the properties of the lysosomes in order to satisfy the second criterion. Indeed, the link between
the drug and the vector can be cut either chemically in an acid medium or enzymatically by means of the acid hydrolases of the lysosomes. But still it is necessary, taking into account the third criterion, that the drug is released in its active form. It has been found that such a result cannot
be obtained if the active ingredient is directly linked to the macromolecule.
It has been found, and this is what is the subject of the present invention, that a drug which has the desired characteristics can be obtained, if a temporary link designated by the term "arm" is inserted between the drug. and the vector.
The present invention relates to new pharmaceutical forms of an active principle which can be schematically represented by:
<EMI ID = 1.1>
their preparation process and the compositions containing them.
According to the invention, the "drug" consists of an active principle which acts intracellularly and which contains in its molecule a free amine function. As examples of drugs with a free amine function, mention may be made of anthracyclines having anti-tumor activity, such as
daunorubicin or doxorubicin, or quinolines having antimalarial properties, such as primaquine.
According to the invention, the "arm" is of peptide nature and it preferably contains 4 amino acids. It is particularly important that the amino acid, linked to the free amine function of the "drug" by its carboxylic function, has an asymmetric carbon and has the L configuration because peptidases or lysosomal hydrolases only cut the peptide bonds at a d 'an asymmetric carbon.
Of particular interest in fulfilling this function
is L-leucine. For example, among the derivatives of the amine function of antitumor anthracyclines, such as
daunorubicin it has been shown that the N-L leucyldaunorubicin is the product which, under the conditions of lysosomal digestion releases the most important quantity
daunorubicin. So after 2 hours of hydrolysis at pH 6.0,
N-L leucyl-daunorubicin provides 40% of free daunorubicin.
If the arm between daunorubicin and the vector is an L-leucine, after 24 hours of hydrolysis at pH 6.0 of the vector-arm-drug product by purified lysosomal enzymes,
15% of the drug will be released as free daunorubicin. In addition, a much higher free "drug" release rate is obtained when the number of amino acids constituting the peptide "arm" increases and it can reach 78 when the intermediate peptide consists of the chain of 4 amino acids. Thus according to the invention, the intermediate "arm" is preferably represented by the sequence:
<EMI ID = 2.1>
in which L-Leu is linked by its carboxylic function to the amine function of the drug and X represents 1, 2 or 3 amino acids, identical or different, chosen from L-alanine,
glycine and L-leucine.
Of particular interest are the peptide "arms" L-ala-L-leu, L-ala-L-leu-L-ala-L-leu, (L-ala) 3-L-leu, L-ala -L-leu-gly-L-leu, gly-L-leu-gly-L-leu; among these, the sequence (L-ala-L-leu) in which n is equal to 1 or 2 is particularly suitable.
According to the invention, the "vector" is a macromolecule which can be selectively endocyted by the target cells. Preferably the macromolecule is a protein whose nature is linked to the desired action of the "drug". For example, in the case of antitumour anthracycline derivatives, bovine serum albumin (BSA), fetuin or immunoglobulin can be advantageously used. In the case of antimalarial quinolines, it is particularly advantageous to use asialofetuin which is a vector which goes specifically to the hepatocytes where the parasites are found.
According to the invention, the new pharmaceutical forms can be obtained by the action of a product of general formula:
<EMI ID = 3.1>
in which the term "Drug" and the symbol X are defined as above on a protein under the conditions usually used to create a peptide bond between the free amine function of the terminal amino acid of the product of general formula (II) and the acid functions free of protein.
The "arm" can also be attached to the free amine functions of the protein after succinylation of the free amine function of the terminal amino acid of the product of general formula (II).
Generally, the reaction is carried out in a suitable buffered medium such as a phosphate buffered medium.
(Phosphate Buffer Saline or PBS) in the presence of a condensing agent such as a carbodiimide such as ethyl -1 (dimethyl-
<EMI ID = 4.1>
between 0 and 30 [deg.] C. It is particularly advantageous to operate in the absence of light.
The new pharmaceutical form according to the invention is separated from the reaction mixture according to physical or physicochemical methods such as chromatography on an appropriate support.
The product of general formula (II) can be obtained by condensation of a suitable amino acid or of a peptide in acid form whose amine functions are protected with a drug carrying a free amine function or a derivative of this drug carrying an amine function free in the presence of a condensing agent according to the usual methods used in peptide chemistry.
Preferably, the condensation of L leucine, the amino function of which is protected on the "drug" is first carried out, then the successive condensation of the amino acids intended to constitute the arm on the N-L-leucyl- "Drug".
As a condensing agent, use is more particularly made of a carbodiimide in an organic solvent such as dimethylformamide, methylene chloride or acetonitrile. The acid function of the amino acid can also be activated in the form of an ester with N-hydroxysuccinimide or in the form of a mixed anhydride.
The protective groups for the amine functions are groups of the acyl (formyl) or urethane type.
<EMI ID = 5.1>
(trityle). These groups can then be eliminated under conditions which must not destroy the peptide bond formed. For example, when the amine function is protected by a trityl radical, this protective group can be eliminated by hydrolysis in an acid medium.
The new pharmaceutical forms according to the invention are particularly useful for enabling selective action in the field of activity of the basic drug. The action of the new drugs being more specific, the same effect will be obtained with a smaller quantity of drug;
moreover, the harmful side effects could be greatly attenuated if not eliminated thanks to the least dissemination of the drug outside of the target cells.
The following examples, given without limitation, show how the invention can be put into practice.
The new products according to the invention have particularly advantageous properties.
Thus the products for which the drug is daunorubicin inhibit, in vitro, the growth of cancer cells, such as the L1210 leukemia cells in an appropriate medium. For example, after 72 hours of culture,
BSA-succinyl-L-ala-L-leu-L-ala-L-leu-daunorubicin, at a concentration close to 10 pg / cm causes 90% inhibition
of L1210 leukemia cell growth.
The products according to the invention for which the
drug is primaquine cause, when administered intravenously at doses between 10 and 30 mg / kg, in mice infested with Plasmodium berghei, an increase in survival time greater than 400% compared to untreated controls .
EXAMPLE 1.
a) Preparation of L alanyl-L leucyl - L alanyl - L leucyl daunorubicin.
To an ice cold solution of 1 g of daunorubicin
<EMI ID = 6.1>
After 5 minutes of stirring, the pH is brought to 3.5 by adding 6 N sulfuric acid and then, after 15 minutes, the reaction mixture is neutralized by adding 1 N sodium hydroxide. The solution is extracted with 150 cm of chloride. methylene.
The organic phase is dried over sodium sulfate. After filtration and concentration to dryness under reduced pressure (20 mm of mercury) at a temperature below 50 [deg.] C, the product is purified by chromatography on 60 g of silica eluting with a chloroform-methanol mixture (95-5 in volumes). There is thus obtained, after evaporation of the solvent, 690 mg of N-L leucyldaunorubicin which, by addition of the theoretical amount of hydrochloric acid, provides 715 mg of L leucyldaunorubicin hydrochloride melting at 201 [deg.] C with decomposition.
A stirred solution of 677 mg of L leucyl-daunorubicin (1 mmol) in 16 cm of dimethylformamide is added
498 mg of N-trityl-L alaninate of N-hydroxysuccinimide (2.12 mmol) and 0.140 cm of triethylamine. The reaction mixture is stirred for 24 hours at a temperature in the region of 20 [deg.] C.
<EMI ID = 7.1>
of a chloroform-methanol mixture (99-1 by volume), then filtered through a column of 45 g of silica gel. After evaporation of the solvent, 450 mg of N-trityl L alanyl-L leucyldaunorubicin are obtained. This product is cold treated with a solution
<EMI ID = 8.1>
addition of 12N ammonia. After extraction with chloroform, drying over sodium sulphate, filtration and evaporation of the solvent, formation of the hydrochloride and filtration of triphenylcarbinol, 470 mg of L alanyl-L leucyl-daunorubicin hydrochloride is obtained, melting at 205 [deg.] C with decomposition.
250 mg of L alanyl-L hydrochloride are dissolved
<EMI ID = 9.1>
N-hydroxysuccinimide leucinate. By operating as above for the preparation of L alanyl - L leucyldaunorubicine, 130 mg of L leucylL alanyl-L leucyl-daunorubicin hydrochloride are obtained, melting at 170 [deg.] C with decomposition.
98 mg of L leucyl-L alanyl-L leucyl-daunorubicin hydrochloride are dissolved in 5 cm 3 of dimethylformamide.
<EMI ID = 10.1>
N-hydroxysuccinimide alaninate. By operating as above for the preparation of L alanyl-L leucyldaunorubicin, 65.5 mg of L alanylL leucyl hydrochloride - L alanyl- L leucyl-daunorubicin melting at 217 [deg.] C with decomposition are obtained.
b) Coupling with bovine serum albumin.
To 8 mg of L alanyl-L leucyl-L alanyl-L leucyl-daunorubicin hydrochloride in solution in 2 cm of distilled water, 100 mg of bovine serum albumin in solution in 3 cm of phosphate buffer (Phosphate Buffer Saline) is added. PBS).
The mixture is stored for 15 hours in the dark, at a temperature in the region of 20 [deg.] C, then the solution is filtered through a 150 cm <3> column of Biogel P-100, eluting with phosphate buffer ( Phosphate Buffer Saline, PBS).
The first fraction (14 cm <3>) which corresponds to the coupled product, is filtered through a column containing 1 g of Parapak Q (Waters) in order to eliminate any traces
noncovalently attached drug. The solution is
<EMI ID = 11.1>
drug per cm and 3 mg of bovine serum albumin per cm.
EXAMPLE 2.
a) Succinylation of N-L-alanyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucyldaunorubicin.
130 mg of N-L-alanyl-Lleucyl-L-alanyl-L-leucyl-daunorubicin hydrochloride (0.139 mmol) are dissolved in
15 cm <3> of double-distilled water.
14 mg of succinic anhydride are added twice
(2 times 0.14 mmol) in small fractions, while maintaining the pH at 7.5 by adding 1N sodium hydroxide
At the end of the reaction, the pH of the reaction mixture is adjusted to 5.5 and then the product formed is extracted 3 times
<EMI ID = 12.1>
3 times with double distilled water, then dried over sodium sulfate.
After evaporation of the organic phase, we obtain
100 mg of red powder (72% yield) which is
<EMI ID = 13.1>
L-leu-L-ala-L-leu-daunorubicin.
b) Coupling with bovine serum albumin
8.7 mg of succinyl-alanyl-leucyl-alanylleucyl-daunorubicin are dissolved in 2 ml of double-distilled water and added
100 mg of bovine serum albumin dissolved in 2 ml of PBS and
10 mg of soluble carbodiimide [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, Pierce Chem., USA] dissolved in 1 ml
of PBS. The mixture is stirred slowly at 4 [deg.] C for 16 h
protected from light, then the coupled drug is separated from the free drug by molecular sieving on a column of Biogel P-100 (Biorad Laboratories, USA). The first peak
<EMI ID = 14.1>
volume of 46 ml. Which gives a coupling efficiency of
16.9 # and a drug / protein molar ratio of 1.4 ml. The solution is filtered through Millipore 0.2 p and stored at 4 [deg.] C.
EXAMPLE 3.
1. Preparation of L leucyl-primaquine.
a) A mixture of 600 mg of primaquine is stirred for 24 hours
(2.321 mmol) and 1.5 g of fluorenylmethoxycarbonyl L N-hydroxysuccinimide leucinate (3.36 mmol) in 15 cm of dimethylformamide. The progress of the reaction is followed by thin layer chromatography. When the reaction is complete the solvent is evaporated under reduced pressure. The residue obtained is purified by chromatography on silica gel, eluting with chloroform-methanol mixtures gradually containing from 1 to 10% methanol and finally with a chloroform-methanol-concentrated ammonia mixture (900-100-8 by volume). The eluate is recovered in a series of fractions which are examined by thin layer chromatography, compared to standards after detection in the ultraviolet.
The elimination of the protective group of the amine function of L leucine..is carried out by means of piperidine. The precipitate obtained is separated by filtration and the filtrate is neutralized to pH 7 with a hydrochloric acid N solution.
<EMI ID = 15.1>
The organic phase is dried over sodium sulfate. After filtration and concentration under reduced pressure (20 mm of mercury), 647 mg of L leucyl-primaquine are obtained. A 647 mg
<EMI ID = 16.1>
hydrochloric 1.N. A solution of L-leucyl-primaquine hydrochloride is thus obtained.
b) To a solution of 7.68 g of primaquine (0.030 mole) in
125 cm of dry chloroform cooled to 0 [deg.] C 4.65 g of L-leucine N-carboxyanhydride (0.030 mol) are added dropwise <EMI ID = 17.1>
After evaporation of the solvent, the product is purified by chromatography. 6.7 g of L leucyl-primaquine are thus obtained.
2. Preparation of L alanyl-L leucyl-primaquine.
A mixture of 4 g of L leucyl-primaquine is stirred
(10.75 mmol) and 4.65 g of trityl L alaninate of N-hydroxysuccinimide in 30 cm of dimethylformamide. The progress of the reaction is followed by thin layer chromatography. After evaporation of the solvent under reduced pressure (20 mm of mercury), the product is purified by chromatography on silica eluting with chloroform-methanol mixtures gradually containing from 1 to 10 of methanol.
5.21 g of N-trityl L alanyl-L leucyl-primaquine are thus obtained which is treated with 50 cm of acetic acid
<EMI ID = 18.1>
filtration, then the filtrate is cold neutralized by addition
<EMI ID = 19.1>
of the reaction mixture with chloroform, the organic phase is dried over sodium sulfate. After filtration and evaporation of the solvent under reduced pressure (20 mm of mercury), 3.45 g of L alanyl-L leucyl-primaquine are obtained.
To 3.45 g of L alanyl-L leucyl-primaquine (7.78 mmol), 15.58 cm <3> of a normal hydrochloric acid solution are added. A solution of L alanyl-L leucyl-primaquine dihydrochloride is thus obtained which is lyophilized.
3. Preparation of asialofetuin- L alanyl-L leucyl-primaquine.
<EMI ID = 20.1>
2.5 cm <3> of phosphate buffer (Phosphate Buffer Saline) and add
50 mg of L alanyl-L leucyl-primaquine dihydrochloride and 50 mg of ethyl-1 (3-dimethylamino-propyl) -3 carbodiimide. We let
in contact for 15 hours away from light and at a temperature close to 20 [deg.] C. The reaction mixture is filtered through a 125 cm 3 column of Biogel P-100. Fractions of 150 drops are collected.
Asialofetuin-L alanyl-L leucyl-primaquine is collected in fractions 6 to 12.
Asialofetuin can be prepared as follows:
A solution of 1 g of fetuin (Sigma Chem., United States) in 10 cm 3 of 0.2 M acetate buffer at pH 5.5 is passed,
in a closed circuit, through a column of insolubilized neuraminidase (Sigma Chem., United States) maintained at 45 [deg.] C.
After 48 hours, the asialofetuin solution is recovered; the gel is washed with 2 M sodium chloride and the sialic acid is removed by dialysis of the solution for
12 hours against distilled water. Asialofetuin is purified
<EMI ID = 21.1>
eluted with 0.01 M Tris buffer at pH 8. Fractions of
150 drops are collected using a Gilson fraction collector. The tubes containing asialofetuin are combined and the solution is dialyzed against water and then lyophilized.
The present invention also relates to the medicinal compositions containing the new pharmaceutical forms according to the invention alone or in combination with one or more compatible diluents or adjuvants. These compositions can be administered parenterally.
The compositions according to the invention for parenteral administration can be sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. As solvent or vehicle, it is possible to use propylene glycol, a polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil,
or injectable organic esters, for example ethyl oleate. These compositions can also include wetting agents, emulsifiers and dispersants. Sterilization can be done in several ways, for example using a bacteriological filter, by incorporating sterilizing agents into the composition or by irradiation. They can also be prepared in the form
sterile solid compositions which can be dissolved at the time of use in sterile water or any other sterile injectable medium.
The following example illustrates a composition according to the invention.
EXAMPLE.
100 cm <3> of a sterile solution containing an amount of BSA-succinyl-L-alaL-leu-L-ala-L-leu-daunorubicin corresponding to 100 mg of free daunorubicin is prepared according to the usual technique. This solution is administered as a slow infusion.