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"VACCIH CONTRE M ROUGEQLE ET PROCEDE POUR SA PREDATION"
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La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de vaooin tué contre la rougeole et le vaccin obtenu par ce procédé...
On connaît déjà plusieurs moyens de conférer une protection vis-à-vis de la rougeole. Parmi ces moyens, on , trouve l'utilisation de gamma-globulines ou de vaccina préparés à partir d'un virus de la rougeole vivant et atténué ou à partir d'un virus de la rougeole tué.
On sait que l'im- muni+' conférée par les gamma-globulines est de durée rela- tivement courte et que l'administration du vaccin vivant procure une immunité durable mais s'accompagne très souvent d'effets secondaires désagréables,
Des vaccina tuée peuvent être préparés par culture du virus our tissu embryonnaire de poulet ou, de préférence,. sur du tissu primaire de mammifère.
L'administration de vaccin tué ne présente pas ces inconvénients mais une bonne immunisation à l'aide do vaccin tué ne peut être réalisée qu'à partir d'une masse antigénique relativisent importante et on sait que la culture du virus de la roueeole dans les conditions ordinaires ne permet pas d'obtenir des concentrations suffisamment élevées en virus.
Afin d'obtenir une concentration suffisante, il était donc jusqu'à présent nécessaire lors de la préparation do vaccin tué de concentrer la suspension de virus tué par ion des particules stimulent la réponse anticorps et da reconstituer ensuite la suspension dans un volume au moins quatre fois plus concentré que le milieu de croissance,
En d'autres termes, la préparation de vaccin tué contre la rougeole sur culture de tissu primaire de mammifère comprenait jusqu'à présent essentiellement ! la préparation
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d'une culture de tissu primaire de mammifère -de préférence du *.issu rénal de singe-,
la propagation du virus de la rougeole dans ladite culture pour obtenir une suspension rela.- tivement diluée du virus dans le milieu de croissance, la clarification de la suspension obtenue, son inactivation, sa concentration par agglomération des particules stimulant la réponse anticorps et la reconstitution de la suspension
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dans un volume au moins quatre fois plus oQncentrè que le milieu de croissance.
La présente invention permet d'éviter le stade de concentration et le stade de reconstitution* Elle a également comme conséquence d'effectuer les opérations de
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clarification et d'inactivation sur des vol'uïa'es Y-4,àuitio Le procède suivant l'invention coa;ea4 fe"nt..il.. ment la préparation d'une culture de tis'$'V'1. pï'i'aae ,8,é mammifère -de préférence du tissu rénal de iar= :t'I#:s'è'>mencement et l'amorce de la propagation du viras àe 1a rougeole dans ladite culture en prdoende d Il'\!1'è GfQ,'à'f:lt:
a.1t normale de milieu de croissance, le resiplaoeïa'e'nt d'è ci volume de milieu de croissance par un vOl'Wi1é âU moins quatre fois plus réduit et la production dru v1Y"u ,rà'è \(tet ensemble agité d'un Mouvement tel qu'il aà4U.P.e wnx3 &i\i.'à'tr.1\.'Too bution continue du milieu de croinsancê 'èùr 1-e 'tàip1l% éT cellules 1 la clarification de la auspenoioa de 'Vi1:'1..]!" a'bm inactivation et, éventuellement, l'addition d'au moins un agent adsorbnnt au vaccin obtenu.
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Suivant la présente invention 1:a éùltaY<é d'là '.2'u' de la rougeole se réalise comme suit aU d'épart d''uth"e tdlutlhè tissulaire monocellulaire recouverue d'un Tnili'eu d'O 'c'ôeàthë
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classique (par exemple, solution dt Hnnko , additionnée de 0,5fi d'Iydrolysat de 13ctolbuminc et de 2% do uérum de veau ).
Le milieu est inocule Pvuc une zuspension du virus de la rougeole et incub6 à une température d'environ 360C.
Apres 30 à 40 heures environ, plus précisément lorsqu'apparat l'effet oytopathop,,rr.(j caractéristique du virus 3e la rougeole, on écarte le liquide surnageant et on lave aoigneur3emlt la culture avec wie solution saline isotoniqui, par uxoemple avec de la solution do Hanks. Aprbo 61iminntion (un liquides de lavage, un introduit une nouvelle quantité de m11iEW nutritif composa par 0xmplo de solution de Hanko adàltiona4e de 2% d'hydrolysat de plazma bovin, ladite nouvelle qu'an tité étant nu maximum 4gule au quart de lu quantitd qui o's trouvait îhitinll-ment, Ainsi par exemple, pour une boîte 'dI'é Roux du type standard qui dern8hdt approxifhntivcment $0 m11i\ litres dé milieu dù croiananou, on utilisera Moine d µ'0 millilitres environ.
Etnnt donne notnmmont lu fait que l'c fond aes boites de Roux nr: pr4ventu finn une nurfaàe .9i>Ééiàf>eiseiàént tlùnci cette qutintit6 réduite est inaufrinnhtc p2t bl1ignor convenablement In couche monoccllulniru un jà/(?H3ittlèlf.1 ' &tationnair& ; on remédie à cette orrandu en diapoënnt leo récipient sur un dispositif d'agitation lente qui bfëe'àl'6 le récipient dann In mcaurE néC!(,sst1ire pour bseurer Une d'istribution e ti- 1-.z liquide sur 111 dOl1èhc riton'..1..f Ainsi pr oxtmplut dann lu aad de boites du RouX) Co dispositif peut comporter un hiouveihent dH bnlanft prévu= quf*nt dûs flux et reflux aucuc-98ifu du liquide oie là 0u'd monocéllulaire ;
dans le cas de bouteilleb è²lihdiq'Oà te dispositif peut commnnder un mouvehient c1o rointion des b6àE< il"
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les autour de l'axe générateur du cylindre,
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T)7n: chaque can nénnnioiniJ, 1<, mouvement doit d'une part, ô1;re nuff'U3nrntolmt lent et régulier pour éviter le décollage de la culture de la paroi et suffisamment rapide pour empêcher la 4<.Jvi<;ntifin ie le culture.
La propagation, df, la culture de virus s'effectue à la tfimp6r,,tturo habjtuûllerncnt utilisée pour ce genre d'op6rntion, cas vuro bzz.
Ln Vith890 fie propC8tion de la culture du virus n'est pas R0nsiblLmnt influunoû par ces conditions prtioulirs et lorsque l'effet cytop1thognB atteint de 90 à 100% 3r la culture, l'ngintion est nrrétée et le virun oint rrS^o7 té.
Le clrifioti0n 1ù 1 ; suspension obtenue s'effectue <:ns>Àit<# :lni.v:3r J.'\..I11(: ou 1'?:tre Ci(-,a tcchru-ques bien connues rit, DpCl11ptL3, p1r 0xtmplu par centrifugation ou par fi7.trr!:z,ci..
L0 mili clarifia ,:1;t inmtivé au formaldéhyde ou ii 1.inirl<, ,1 1>r, 1trG 'nt 1'jn"aivtion classique et le Vt1':ln obtenu ,;;t '(.ve.-t;'.:;l.1J:mu,t 1"i':1':.JitiQnné d'un agent ;t:::1"t''n' -pnr ':x-rr.pi6 du phosphate ou de l'hydroxyde d'nluin!.-)".Lt;3 .,i ,ât:.*.t: d'agent njacrbant souhaîtnbles sont v:i 3::î,G...
61n 1 le pr0a?d du la prés nte invention ne son pas limité a l'utilisation de tissu rénal de singe, cc; tiaau pr4scrjtù r1nt l'nvcntgG d'avoir été déjà p:1.rticulihcr:.-:nt tien 4tiÀji4 r.ot'H du point de vue des v ,ru ,' .j.l v en".i. cc;: et son utilisation procure de ce fait eu vnc:,n résultant lune sécurité exceptionnelle. C' est pourquoi, in 2'oc^xre::c., il est préféré, malgré un certain inconvénient
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économique possible vis-à-vis d'autres cultures tiss@aires moins bien connues.
L'invention est illustrée par l'exemple lion limitatif suivant : Préparation de la culture monocellulaire de reins de singe
Une paire de reins de singe est prélevée asep@iquement etla partie corticale découpée en petits morceaux. Apris trois lavages successifs à l'aide de solution de Hanko, les morgeaux sont mis en contact avec une solution tamponnée do trypsing (2,5 g par litre). Le mélange est maintenu sous agitation continue pendant une dizaine de minutes à 37 C. Le surnageant est alors décanté et remplacé par un volume égal de solution tamponnée fraiche de trypsine.
La trypsinisation est continuée sous agitation jusqu'à épuisement des tissus, les cellules en suspension dans le liquide surnageant étant périodiquement extraites par centrifugation. Le sédiment obtenu est remis en suspension dans un milieu à base de solution de Hanks et comprenant
5 g d'hydrolysat de lactalbumine et 20 ml de sérum de veau par litre de solution de Hanks. La masse cellulaire est à nouveau séparée, les opérations de mise en suspension et de séparation sont encore répétées deux foie, de façon à effec- tuer un bon lavage des cellules.
Après le dernier lavage, le sédiment est remis en suspension dans un milieu à base de solution de Hanks addi- tionnée de 0,5% d'hydrolysat de lactalbumine et de 2 de sérum de veau et l'on procède à un comptage de cellulcn. Le volume est ajusté de façon à obtc.nir environ 80 x 106 cellules
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par litre de milieu.
Dans des bouteilles du type "Jena pénicilline" de '.} litres de capacité, on introduit 250 ml de la suspension (càd environ 20 x 106 cellules).
Les bouteilles sont alors incubées horizontalement et sans agitation à la température de 37 C.
Trois jours plus tard, le milieu nutritif est rem- placé par un même volume de milieu frais de même composition et, après une durée d'incubation de 5 à 6 jours, on constatu la formation d'une couche monocellulaire complète.
Préparation du vaccin
Le surnageant des cultures monocellulaires est éliminé par aspiration et remplacé par 250 ml de milieu frais de même composition. On procède slorr à l'ensemencement des cultures titulaires par inoculation d'un millilitre d'une suspension du virus de la rougeole à chaque culture et les bouteilles sont incubées à nouveau à 36 C.
Lorsque, ,près 30 à 40 heures, on constate l'appa- rition de l'effet cytopathogène caractéristique du virus de la rougoolo, on élimine le surnageant par aspiration ot on offectue deux lavnca successifs des cultures à l'aide do 250 ml de solution de Hanks par lavage. Les solutions de lavage sont écartées.
On introduit ensuite 50 ml de milieu nutritif à base de solution de Hanks comprenant 0,22% de bicarbonate de sodium, 0,3% do trometa@ol et 2 d'hydrolysnt de plasma bovin.
Les bouteilles sont alors flxées sur les plateaux rectangulaires (1 x 60 cm) d'une machine qui entraîne chaque
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plateau dans un mouvumunt ce Lrx:.c;i; autour d'un :1XI.: passant par le milieu der, petits côtÛ:3 du r:ct3nle for::;l: par chnque plateau. L'amplitude du wa.m:r;ni.; t.:t d'environ 5 cr.rxt;irn,tp ' . à l'cxtré:ité dor: plltl:;:}I1X let In périodicité du mou'iLmcnt est de 10 ?l.'l.2lCG.'.'(:r'iT.i; environ par .'713Yaüté ..
1:'cnt.r,.>wlc ;::;t ùizpo;:é dnnrJ une chambre thirmJsiAtiqig ,. réglée à 4-;,Qr-; ùt # .4 (=T.D:t7r;i:C.!'at de l'affût t Cf L01:';t#lO(.r est: contrôlé rfr,e7.irzrcnü. L5r#qu,: l' \:[1'<.:1. cytoV.thogi:t1;; itteint 90 à 100% d'.J ,(.;tlJ.hl, 11glt'Jtion.(:t l'incubation :1, ¯ eorit a.x'rft=ï:.
Aprè:; i-rr rIr, .= 'Je coryel.t.i.r,n r.:1. déc(JI1C('l'Jtion , ucce.ivr;, le contenu ,J(::1 L(jlJtLllLL:1 ont r4cn'l<à ,:1 10 ::u...rezj,ion QOnr.)(1ntrf: rh v-ir=ac: 'l;) rEet.r,:illz=: par ,]6<;:mtt\ t.ion.
La :3;:;r,c;r:.ian ohtfinub ,:Jt lrifiCù pur ','untr1.1'\Jgl)tirt.
A cette fin, on u,tiliUl.: un c;ntrii'tz;r.uz CEPA h (cou) (ment continu, u drlhit =3'c:r.virort )00 mi/minut-c' (vitco:n' dé rottion 15.000 tour:/mjnut(1). Li VlrlJ.:1 oesit nattits inoctivû par .t.,,> ...
'\\'- adjonction de fo.C'mol È une cGn:r.ntrctafm t inoeL;> du 1./a407 ' .
,( Ic: vaccin min#ii Irr3prrf plm't i;trv; tr'f!t1:Jf(rÓ dtlns des aznmr.tl,:; r')rltr:ri-.:ni, par r.f=;rnplr, de:! doac.3 individut-llcc do un millilitre. " ..(;ll ' , Adsorption du vaccin L'=:3:3rrt;t,x.rx (, ':n'L U l' 11 du vaccin pULl t, !1 i4alix<ar currcrr:r: ;,)uj l, lor;!rj1.t'r)(j ui;iliiJ<; 1>nr c;xra,rplu du L'alun O()!lîJ1tO ' n0nt t, n J ; o r 1, <: ri t . , .)¯ , ' A l.iLrY=:;! rJI! vrjccin :7.rlxi.i'Ir; ot inMcLiv'i obtenue ': >- ' ' 4t7zrun=: 1¯1 (;(31; <14<;ili d,un htut, (JI) ajoubu un titre d'un') ': ,1., t1(; 1.1.1 t l.on "i 1,Ôji d'.' è Y" ;0 .Ivl (;; 1 U j3 .< 'IiCJ et, 00IW .ye,t tt, t;i.OÈltn%k < on !"1jl.wtc. le i>1.1 du !!t1lnn{1.: a 'l,6 à 1 '<ii'i<i (1(: fioudu cnuitiquu:. 6"' :
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L'ngitntion est ensuite maintenue pndnnt 4 jours à 4 C.
Pouvo ir :ntisbrni.u<< du vnçc in Pour ddtorminor a pouvoir nnti.n3.que du vaccin obtenu rnÜvl1nt la pr:3('nt.(; invuntioii, on emploie 80 poussins de 2 b 3 Domnin63 rp1rti" on quatre: groupes de vingt poussins.
Le8 dux prcmicrn groupas sont inoculés avec le vaccin prPQr6 Huivunt .1.' .c.mpi.c donné ci-avant, un fies deux groupen rf:c:cvant du vaccin non dilu4, l'autre recevant du vaocin dilue dann 14 rapport de 1 à 6.
Les deux nutr,s groupes sont inoculés avec du vaccin de rdf6rGnC0 prnpar d1n 1<;r; mRmos conditions mais sans a,ita+ion et avec 250 ml de. milicuiriu lieu des 50 z1 employés donn 1 ' <;xemple ci-dc3:us. Un de ces groupes reçoit du vaccin non dilué t, .Autr0 reçoit lu vnccin dilué 1/6.
La .joar. fidrfiinisr& chaque poussin est de 0,5 ml. ï'a;;rrzriorntro: J fmit p1r voie: Rous- cutanée.
Que.,torzre joura 'lP':':': 1" vaccination, on prélève 5 ml d "" i;U1g 1.r;r . ='z .^.irx .:t on r;4p <rc le sërun des échantillons. tifrr: >=x 'ni^:.: z,;: cet <i4terrniJa± sur le sérum :rv;.r"nt li .4'i;xù<; Je 1;lr.o-i;,,,Jtr"iliJtiJn.
Ltr: r4;1<ait;t;J ::r,r.. r";'!".:T.t:48 d'1:13 le t:1tleu 'J1.4'"!n +;:
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REPONSE ANTIGENIQUE ETABLIE SUR POULETS
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<tb> dilution <SEP> Concentrntion <SEP> de <SEP> virus <SEP> Nombre <SEP> Somme <SEP> des
<tb>
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u neutralisé en logio d'nnimnux réponses
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<tb>
<tb> vaccin <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1og10 <SEP> pour <SEP> 20
<tb> nnimnux
<tb> Vaccin <SEP> suivant <SEP> l'invention
<tb> ,Ion <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> 34
<tb> dilué
<tb> 1/6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 18 <SEP> 18.9
<tb> Vaccin <SEP> de <SEP> référence
<tb> 'on <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 14 <SEP> 18 <SEP> 20
<tb> dilué
<tb>
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6 z z 19 8.4
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Par calcul au départ de ces résultats,
on trouve que le pouvoir antigénique du vaccin suivant l'invention est 5,17 fois plus élevé que celui du vaccin de référence utilisé, ce qui est statistiquement significatif pour P=0,05.