BE1022332A9 - Procédé de recherche d'un inhibiteur d'une odeur causée par le furanéol - Google Patents
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Abstract
On souhaite identifier une substance inhibant une odeur causée par la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone. La présente invention met à disposition un procédé de recherche d'un inhibiteur d'une odeur causée par la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone, comprenant : l'ajout d'une substance de test et de 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone à un récepteur olfactif OR5K1 ou à un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité de séquence d'acides aminés avec celui-ci ; la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide à la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone ; et l'identification d'une substance de test inhibant la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide, en se basant sur la réponse mesurée.
Description
PROCÉDÉ DE RECHERCHE D’UN INHIBITEUR D’UNE ODEUR CAUSÉE PAR LE
FURANÉOL
Description [Domaine de l'invention] [0001]
La présente invention concerne un procédé de recherche d’un inhibiteur d’une odeur causée par ie furanéol.
[Arrière-pian de l’invention] [0002]
Un grand nombre de molécules malodorantes qui diffèrent par leur polarité ou leur poids moléculaire sont observées dans nos environnements de vie. Jusqu’à présent, divers procédés de désodorisation ont été développés afin de désodoriser ces diverses molécules malodorantes. En général, de tels procédés de désodorisation sont globalement classés en procédés biologiques, procédés chimiques, procédés physiques et procédés sensoriels. Parmi les molécules malodorantes, les acides gras à chaîne courte fortement polaires ou les amines peuvent être désodorisé(e)s par ie procédé chimique, c’est-à-dire par une réaction de neutralisation. Les composés du soufre, comme un thiol, peuvent être désodorisés par ie procédé physique, c’est-à-dire par un traitement d’adsorption. Toutefois, il reste toujours un grand nombre de molécules malodorantes qui ne peuvent pas être traitées par les procédés de désodorisation conventionnels. En outre, ie problème du procédé de désodorisation basé sur ie traitement d’adsorption est qu’il a tendance à entraîner la réémission d’une mauvaise odeur. De plus, ces procédés conventionnels peuvent même masquer des odeurs autres que la mauvaise odeur d’intérêt. Par conséquent, il existe une demande en un procédé de désodorisation capable de surmonter ces problèmes.
[0003]
Un autre procédé connu implique de désodoriser une mauvaise odeur en augmentant fortement la perception d’une odeur différente à l’aide d’une fragrance. Dans ce procédé, en revanche, l’odeur de la fragrance peut provoquer une gêne. De plus, il est nécessaire de rechercher une substance odorante qui exhibe un effet désodorisant efficace sur la substance malodorante d’intérêt afin de masquer la mauvaise odeur par une odeur différente, comme celle d’un parfum, d’une fragrance, ou analogue. Jusqu’à présent, des tests sensoriels ont été réalisés par des experts afin d’évaluer les odeurs. De tels tests sensoriels, en revanche, sont associés à certains problèmes comme la nécessité de former des experts capables d’évaluer les odeurs et de faibles rendements. Par conséquent, les recherches antérieures visant à identifier une substance odorante qui exhibe un effet désodorisant n’ont pas été faciles à mettre en œuvre.
[0004]
Chez les mammifères tels que les humains, le sens de l’odorat fonctionne par un mécanisme où les molécules odorantes se lient à des récepteurs olfactifs sur les cellules nerveuses olfactives présentes dans l’épithélium olfactif, localisé dans la région supérieure de la cavité nasale, afin de transmettre les réponses des récepteurs à celles-ci au système nerveux central. Chez les humains, approximativement 400 récepteurs olfactifs ont été identifiés et les gènes codant pour ces récepteurs représentent approximativement 3 % de tous les gènes humains. En général, un ensemble de récepteurs olfactifs est associé à un ensemble de molécules odorantes. Cela signifie que des récepteurs olfactifs individuels peuvent être sensibles à une pluralité de molécules odorantes structuralement similaires avec différentes affinités, alors que des molécules odorantes individuelles peuvent être reconnues par une piuraiité de récepteurs oifactifs. Selon un autre rapport, une molécule odorante qui active un récepteur olfactif donné fonctionne comme un antagoniste qui inhibe l’activation d’un récepteur olfactif différent. Ces réponses combinées d’un ensemble de récepteurs olfactifs permettent la perception des odeurs individuelles.
[0005]
En conséquence, lorsqu’une molécule odorante donnée coexiste avec une molécule odorante différente, la molécule odorante différente peut inhiber la réponse d’un récepteur correspondant à la molécule odorante donnée, en ayant pour résultat la perception finale d’une odeur différente. Un tel mécanisme est appelé antagonisme d’un récepteur olfactif. L’altération d’une odeur causée par cet antagonisme de récepteur est une approche de désodorisation préférée étant donné que cette approche, à l’ïnverse des procédés de désodorisation qui impliquent d’ajouter une autre odeur, par exemple, un parfum, et une fragrance, peut spécifiquement annuler la perception d’une mauvaise odeur et n’entraîne aucune gêne dérivée d’une telle fragrance.
[0006]
Les agents bronzants (également appelés autobronzants ou bronzants sans soleil) sont des produits cosmétiques cutanés qui colorent la peau. Principalement, la dihydroxyacétone (DMA) est utilisée seule ou en combinaison avec l'érythrulose ou analogue en tant qu’ingrédient qui provoque un brunissement de la couleur de la peau. Un tel ingrédient réagit avec la couche supérieure de la peau afin de colorer la peau en brun. Bien que l’on pense que cette coloration se produit par une réaction de brunissement, les détails du mécanisme sous-jacent de cette réaction ont à peine été élucidés. La réaction de brunissement est également appelée réaction de Maillard dans le domaine de la chimie alimentaire. Ce terme fait référence à la réaction par laquelle un composé contenant de l’azote, comme un acide aminé ou une protéine, est poiymérisé avec un sucre réduit afin de former un polymère brun appelé mélanoïdine. La réaction de Maillard est impliquée dans la coloration des aliments ou la formation des composants des arômes provoquée par le réchauffement, etc. des aliments.
[0007]
La 2,5-diméthyi-4-hydroxy-3(2H)-furanone (furanéol) est une substance qui est connue pour posséder une odeur exprimée en tant que « fort arôme de caramel fruité », un « arôme de caramel brûlé », « sucre grillé », une « saveur de type curry », une « odeur de barbe à papa », etc. (Documents non brevets 1 à 4). Le document de brevet 1 décrit une boisson au goût de bière ayant un goût et une saveur, ou une odeur parfumée, qui est amplifiée par la formation de maltoî et de furanéol dans une solution de fermentation non diluée.
[Liste des citations] [Documents de brevet] [0008] [Document de brevet 1] WO 2009/078360 [Documents non brevet] [0009] [Document non brevet 1] Gosei Koryo - Kagaku To Shohin Chishiki - (Synthetic Flavor and Fragrance - Chemistry and Product Knowledge - en anglais), 2005, The Chemical Daily Co., Ltd.
[Document non brevet 2] J. Agric. Food Chem., 1997, 45 (6): 2217-2224 [Document non brevet 3] ACS Symp Ser., 2002, 836: 108-123 [Document non brevet 4] Anal Chim Acta., 2010, 657 (2): 198-203 [Résumé de l’invention] [0010]
La présente invention met à disposition : un procédé de recherche d'un inhibiteur d’une odeur causée par la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (furanéol), comprenant : l’ajout d’une substance de test et de 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (furanéol) à un récepteur olfactif OR5K1 ou à un polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec celui-ci ; la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide à la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (furanéol) ; et l’identification d’une substance de test inhibant la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide, en se basant sur la réponse mesurée.
[Brève description des dessins] [0011] [Figure 1] La Figure 1 montre les réponses de récepteurs olfactifs au furanéol. L’axe des abscisses représente des récepteurs olfactifs individuels. L’axe des ordonnées représente l’intensité de la réponse.
[Figure 2] La Figure 2 montre la réponse d’un récepteur olfactif OR5K1 à diverses concentrations de furanéol. n = 3, barre d’erreur = ± ES.
[Figure 3] La Figure 3 montre les résultats d’une évaluation sensorielle des effets inhibiteurs de divers composés sur l’odeur du furanéol. n = 3, barre d’erreur = ± ES.
[Description détaillée de l’invention] [0012]
Le terme « masquage » en relation à des odeurs, tel qu’utilisé dans la présente, fait référence à une approche générale pour annuler ou affaiblir la perception de i’odeur d’intérêt. Le « masquage » peut comprendre des approches chimiques, des approches physiques, des approches biologiques et des approches sensorielies. Des exemples de masquage comprennent : une approche arbitraire pour éliminer une molécule odorante, responsable de l’odeur d'intérêt, de l’environnement (par exemple, adsorption et décomposition chimique de la molécule odorante) ; une approche pour empêcher l’odeur d’intérêt d’être libérée dans l’environnement (par exemple, confinement) ; et un procédé qui implique d’ajouter une odeur différente d’un arôme, d’une fragrance, ou analogue, afin de réduire la perception de l’odeur d’intérêt.
[0013]
Le terme « masquage basé sur l’antagonisme d’un récepteur olfactif », tel qu’utilisé dans la présente, fait référence à une forme du « masquage » susmentionné au sens large. Cette approche utilise à la fois une molécule odorante de l’odeur d’intérêt et une molécule odorante différente pour ainsi inhiber la réponse d’un récepteur à la molécule odorante d’intérêt par la molécule odorante différente, en ayant pour résultat une modification de l’odeur qui est perçue par les individus. Le masquage basé sur l’antagonisme d’un récepteur olfactif est distinct de l’approche qui consiste à annuler l’odeur d’intérêt par une forte odeur différente d’une fragrance ou analogue, même si ces approches emploient toutes deux une molécule odorante différente. Un exemple de masquage basé sur l’antagonisme d’un récepteur olfactif est le cas de l'utilisation d’une substance, comme un antagoniste, qui inhibe la réponse d’un récepteur olfactif. Une substance inhibant la réponse d’un récepteur à une molécule odorante responsable d’une odeur particulière peut être appliquée au récepteur pour ainsi inhiber la réponse du récepteur à la molécule odorante. L’odeur qui est finalement perçue par les individus peut être par conséquent modifiée.
[0014]
Le terme « furanéo! », te! qu’utilisé dans la présente, fait référence à la 2,5-diméthy!-4-hydroxy-3(2H)-furanone. Le terme « odeur causée par le furanéo! » peut être une odeur provoquée par la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone, « L’odeur causée par le furanéo! » ou « l’odeur causée par la 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone », tel qu’utilisé dans la présente, peut être typiquement exprimée, par exemple, en tant qu’arôme de caramel ou odeur de sucre grillé. De plus, « l’odeur causée par le furanéo! » ou « l’odeur causée par la 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone », tel qu’utilisé dans la présente, peut être une odeur désagréable générée par l’application d’un agent autobronzant conventionnel sur la peau, plus spécifiquement une odeur désagréable, exprimée en tant que « odeur de sucre grillé » ou analogue, générée par l’application d’un agent bronzant contenant de la dihydroxyacétone (DHA) sur la peau.
[0015]
Le problème constaté des agents bronzants (agents autobronzants ou bronzants sans soleil) disponibles dans le commerce est leur odeur désagréable unique qui est exprimée en tant qu’odeur terreuse, de sucre grillé, etc. lors de l’application (D.M. Hindenlang et M.E. McDonnell, Cosmetics & Toiletries magazine, 2008, Vol. 123, No. 7, p. 67-74). Par conséquent, une amélioration de ces odeurs a été demandée. Suite à un examen de la cause de l’odeur désagréable, la 2,5-diméthyi-4-hydroxy-3(2H)-furanone (furanéo!), produite via du méthylgîyoxa! à partir de la dihydroxyacétone (DHA) contenue dans les agents bronzants, s'est avérée être une substance causale. Afin de réduire une telle odeur désagréable attribuée au furanéol, il a été nécessaire de contrôler l’odeur du furanéol.
[0016]
Les présents inventeurs ont recherché un récepteur olfactif qui était sensible au furanéol et ont réussi à identifier le récepteur. Le présent inventeur a également découvert qu’une substance qui inhibait la réponse du récepteur olfactif pouvait inhiber la perception d’une odeur causée par le furanéol par un masquage basé sur l’antagonisme d’un récepteur olfactif. En se basant sur ces découvertes, le présent inventeur a découvert qu'il est possible de rechercher une substance qui contrôle une odeur causée par le furanéol en utilisant la réponse du récepteur olfactif en tant qu’indicé.
[0017]
Dans le présent mémoire, l’identité de séquence entre des séquences de nucléotides ou des séquences d’acides aminés est calculée conformément au procédé de Lipman-Pearson (Science, 1985, 227: 1435-41). Spécifiquement, l’identité de séquence est calculée par une analyse en utilisant le programme de recherche d’homologie (taille des mots à comparer (ktup): 2) du logiciel de traitement des informations génétiques Genetyx-Win (Ver. 5.1.1: Software Development Co., Ltd.).
[0018]
Comme montré sur la Figure 1, le présent inventeur a identifié un récepteur olfactif OR5K1 en tant qu’unique récepteur sensible au furanéol parmi de nombreux récepteurs olfactifs. OR5K1 est un nouveau récepteur du furanéol qui, jusqu’à présent, n’avait pas été identifié comme étant sensible au furanéol. Comme montré sur la Figure 2, OR5K1 est sensible au furanéol de manière concentration-dépendante. Par conséquent, une substance qui inhibe la réponse d’OR5K1 peut modifier la perception d’une odeur causée par le furanéol dans le système nerveux central par un masquage basé sur l'antagonisme d’un récepteur olfactif, en entraînant l’inhibition sélective de l’odeur causée par le furanéol.
[0019]
Selon la présente invention, un inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol peut être efficacement recherché. L’inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol, identifié par la présente invention, peut sélectivement désodoriser l’odeur causée par le furanéol par un masquage basé sur l’antagonisme d’un récepteur olfactif, Par conséquent, l’inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol, identifié par la présente invention, peut désodoriser l’odeur causée par le furanéol, par exemple une odeur désagréable générée lors de l’application d’agents autobronzants conventionnels (également appelés bronzants sans soleil), sans entraîner de problèmes tels qu’une gêne dérivée de l’odeur d’une fragrance dans des procédés de désodorisation conventionnels utilisant un désodorisant ou une fragrance.
[0020]
Par conséquent, la présente invention met à disposition un procédé de recherche d’un inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol. Ce procédé comprend : l’ajout d’une substance de test et de furanéol à un récepteur olfactif OR5K1 ; la mesure de la réponse du récepteur olfactif au furanéol ; et l’identification d’une substance de test inhibant la réponse du récepteur olfactif, en se basant sur la réponse mesurée. La substance de test identifiée est sélectionnée en tant qu’inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol. Le procédé de la présente invention peut être un procédé réalisé in vitro ou ex vivo.
[0021]
Dans le procédé de la présente invention, une substance de test et la substance furanéol responsable de l’odeur sont ajoutées à un récepteur olfactif OR5K1. Un produit disponible dans ie commerce (par exemple, FURANEOL(R); Nihon Firmenich K.K.) peut être acheté et utilisé en tant que furanéol.
[0022]
La substance de test utilisée dans ie procédé de la présente invention n’est pas particulièrement limitée tant qu’il est souhaitable d’utiiiser ia substance en tant qu’inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol. La substance de test peut être une substance survenant à l’état naturel ou peut être une substance synthétisée de manière artificielle par un procédé chimique ou biologique ou analogue. En variante, la substance de test peut être un composé, une composition, ou un mélange.
[0023]
Le récepteur olfactif QR5K1 utilisé dans le procédé de la présente invention fait référence à un récepteur olfactif exprimé sur une cellule olfactive humaine qui est enregistré en tant que Gl: 115270955 dans GenBank. OR5K1 est codé par un gène possédant la séquence de nucléotides représentée par SEQ ID NO: 1. Cette protéine consiste en la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2.
[0024]
Dans le procédé de la présente invention, le récepteur olfactif OR5K1 peut être utilisé sous une forme arbitraire sauf si la forme perd sa sensibilité au furanéol. Par exemple, le récepteur olfactif peut être utilisé sous une forme comprenant : des tissus ou des cellules exprimant naturellement le récepteur olfactif, comme un osmorécepteur ou des cellules olfactives isolées à partir d’un organisme, ou des cultures de celles-ci ; les membranes de cellules olfactives comportant le récepteur olfactif; des cellules recombinantes génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur olfactif, ou des cultures de celles-ci ; les membranes des cellules recombinantes comportant le récepteur olfactif ; et des bicouches lipidiques artificielles comportant le récepteur olfactif. Ces formes sont toutes incluses dans la portée du récepteur olfactif utilisé dans la présente invention.
[0025]
Selon un aspect préféré, une cellule exprimant naturellement le récepteur olfactif, comme une cellule olfactive, ou une cellule recombinante génétiquement modifiée pour exprimer le récepteur olfactif, ou des cultures de l’une quelconque de ces cellules, sont utilisées en tant que récepteur olfactif OR5K1. La cellule recombinante peut être préparée par la transformation d’une cellule avec un vecteur comportant un insert du gène codant pour le récepteur olfactif.
[0026]
De préférence, un gène d’une protéine de transport de récepteur (RTF), avec le gène du récepteur olfactif, est transféré dans la cellule afin de promouvoir l'expression du récepteur olfactif sur la membrane cellulaire. De préférence, un gène RTP1S, de manière davantage préférée des gènes RTP1S et RTP2, avec le gène du récepteur olfactif, sont transférés dans la cellule. Des exemples de RTP1S et RTP2 comprennent la RTP1S humaine et la RTP2 humaine, respectivement. La RTP1S humaine est enregistrée en tant que Gl: 50234917 dans GenBank. Cette protéine est codée par un gène possédant la séquence génique représentée par SEQ SD NO: 3 et consiste en la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ID NO: 4. La RTP2 humaine est enregistrée en tant que G!: 258547120 dans GenBank, Cette protéine est codée par un gène possédant la séquence génique représentée par SEQ ID NO: 5 et consiste en la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ÎD NO: 6.
[0027]
En variante, un polypeptide qui consiste en une séquence d’acides aminés présentant une identité de séquence d’au moins 78 %, par exemple, 80 % ou plus, de préférence 85 % ou plus, de manière davantage préférée 90 % ou plus, toujours de manière davantage préférée 95 % ou pius, de manière encore davantage préférée 98 % ou plus, toujours de manière encore davantage préférée 99 % ou plus, avec la séquence d’acides aminés (SEQ ÎD NO: 4) de la RTP1S humaine ou la séquence d’acides aminés (SEQ ID NO: 6) de la RTP2 humaine, et qui favorise l’expression du récepteur olfactif sur la membrane cellulaire, comme avec la RTP1S ou RTP2 humaine, peut être utilisé à la place de la RTP1S ou RTP2 humaine. Par exemple, un variant de la RTP1S humaine qui est codé par un gène possédant la séquence génique représentée par SEQ !D NO: 7 et consiste en la séquence d’acides aminés représentée par SEQ !D NO: 8, présente 78,9 % d’identité de séquence avec la séquence d’acides aminés de la RTP1S humaine représentée par SEQ ID NO: 4, et possède îa fonction de favoriser l’expression du récepteur olfactif sur la membrane cellulaire. En variante, la RTP1S murine (Sei Signal., 2009, 2: ra9) présente également 89 % d’identité de séquence avec la séquence d’acides aminés de la RTP1S humaine représentée par SEQ ID NO: 4 et possède la fonction de favoriser l’expression du récepteur olfactif sur ia membrane celluiaire. Un tel variant de la RTP1S humaine et la RTP1S murine peuvent être utiiisés à la place de la RTP1S humaine dans la préparation de ia celluie recombinante exprimant le récepteur oifactif tel que susmentionné. En variante, un polypeptide variant de ia RTP1S qui présente une identité de séquence d’acides aminés d’au moins 80 %, par exemple 80 % ou plus, de préférence 85 % ou plus, de manière davantage préférée 90 % ou plus, toujours de manière davantage préférée 95 % ou plus, de manière encore davantage préférée 98 % ou plus, toujours de manière encore davantage préférée 99 % ou plus, avec le variant de ia RTP1S humaine consistant en la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ID NO: 8 ou la RTP1S murine, et qui favorise l’expression du récepteur olfactif sur ia membrane celluiaire, peut être également utilisé à la place de la RTP1S humaine dans la préparation de la celiuie recombinante exprimant le récepteur olfactif tel que susmentionné.
[0028]
Selon le procédé de la présente invention, la réponse du récepteur olfactif OR5K1 au furanéoi est mesurée suite à l’addition de la substance de test et du furanéol au récepteur oifactif. Cette mesure peut être réalisée par un procédé arbitraire connu dans l’art, en tant que procédé permettant de mesurer la réponse du récepteur olfactif, par exemple, la mesure d’un taux d’AMPc intraceiiulaire. Par exemple, on sait que le récepteur olfactif, lorsqu’il est activé par une moiécuie odorante, est conjugué avec une Gocs intracellulaire afin d’activer l’adényiate cyclase, en augmentant ainsi les taux d’AMPc intracellulaire (Mombaeris P. Nat Neurosci. 5, 263 à 278). Par conséquent, le taux d’AMPc intracellulaire suite à l’addition de la molécule odorante peut être utilisé en tant qu’indicé pour mesurer ia réponse du récepteur oifactif. Des exemples de procédés pour mesurer le taux d’AMPc comprennent un essai ELISA et de gène rapporteur. Un autre exemple du procédé permettant de mesurer la réponse du récepteur olfactif comprend une imagerie calcique.
[0029]
Ensuite, l’effet de la substance de test sur la réponse au furanéol est évaluée en se basant sur la réponse du récepteur olfactif mesurée afin d’identifier une substance de test inhibant la réponse. L’évaluation de l’effet de la substance de test peut être réalisée, par exemple, en comparant les réponses du récepteur au furanéol mesurées en présence de diverses concentrations de la substance de test. À titre d’exemple plus spécifique, les réponses du récepteur au furanéol sont comparées entre un groupe exposé à une concentration plus élevée de la substance de test et un groupe exposé à une concentration plus faible de la substance de test, entre un groupe exposé à la substance de test et un groupe non exposé à la substance de test, entre un groupe exposé à 1a substance de test et un groupe exposé à une substance de contrôle, ou entre avant et après l’addition de la substance de test. Lorsque l’addition de la substance de test ou l’addition d’une concentration plus élevée de la substance de test inhibe ia réponse du récepteur, cette substance de test peut être identifiée comme une substance inhibant la réponse du récepteur olfactif au furanéol.
[0030]
Dans le procédé de la présente invention, un polypeptide ayant une fonction équivalente à OR5K1 peut être utilisé en tant que récepteur olfactif à la place d’OR5K1. Des exemples du polypeptide comprennent un polypeptide qui consiste en une séquence d’acides aminés présentant une identité de séquence d’au moins 80 %, par exemple, 80 % ou plus, de préférence 85 % ou plus, de manière davantage préférée 90 % ou plus, toujours de manière davantage préférée 95 % ou plus, de manière encore davantage préférée 98 % ou pius, toujours de manière encore davantage préférée 99 % ou plus, avec la séquence d’acides aminés (SEQ ID NO: 2) d’OR5K1, et qui est sensible au furanéol.
[0031]
En variante, dans le procédé de la présente invention, IOR5K1 mentionné ci-dessus en tant que récepteur olfactif et des polypeptides ayant une fonction équivalente à celui-ci peuvent être chacun utilisés seuls ou peuvent être utilisés en une combinaison de deux de ceux-ci ou davantage.
[0032]
La substance de test identifiée par les procédures ci-dessus est une substance qui peut inhiber la perception, par un individu, d’une odeur causée par le furanéol en inhibant la réponse du récepteur olfactif au furanéol. Par conséquent, la substance de test identifiée par les procédures ci-dessus est sélectionnée comme un inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol. Par exemple, lorsque la réponse du récepteur, dans un groupe exposé à la substance de test et mesurée par les procédures ci-dessus, est réduite de préférence à 60 % ou moins, de manière davantage préférée à 50 % ou moins, encore de préférence à 25 % ou moins de celle observée dans un groupe non exposé à la substance de test (par exemple, le groupe mentionné ci-dessus non exposé à la substance de test, un groupe exposé à une substance de contrôle, ou avant l’addition de la substance de test), la substance de test peut être sélectionnée comme un inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol.
[0033]
La substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut inhiber l’odeur causée par le furanéol par un masquage olfactif basé sur l’inhibition de la réponse du récepteur olfactif au furanéol.
[0034]
Par conséquent, dans un mode de réalisation, la substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut servir d’ingrédient actif dans un inhibiteur d'une odeur causée par le furanéol. En variante, la substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut être contenue, en tant qu’ingrédient actif pour inhiber une odeur causée par le furanéol, dans un composé ou une composition destiné(e) à inhiber une odeur causée par le furanéol. En variante, la substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut être utilisée pour la production d’un inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol ou pour la production d’un composé ou d’une composition destiné(e) à inhiber une odeur causée par le furanéol.
[0035]
Dans un mode de réalisation, la substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut être utilisé en tant qu’ingrédient actif pour inhiber une odeur causée par le furanéol, par exemple un arôme de caramel, une odeur de sucré grillé, ou une odeur désagréable (par exemple, une odeur de sucre grillé), générée par l’application d’un agent autobronzant sur la peau ou suite à l’application d’un produit contenant de la DHA.
[0036]
Dans un mode de réalisation, la substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut être utilisée en tant qu'ingrédient actif pour inhiber une odeur causée par le furanéol dans chaque composé ou composition pour lequel/laqueile on souhaite inhiber une odeur causée par le furanéol, ou dans chaque environnement où l’on souhaite inhiber une odeur causée par le furanéol. En variante, la substance sélectionnée par le procédé de la présente invention peut être utilisée en tant qu’ingrédient actif pour inhiber une odeur causée par le furanéol, pour la production d’un composé ou d’une composition pour lequel/laqueile on souhaite inhiber une odeur causée par le furanéoi. Des exemples du composé ou de la composition pour lequel/laquelie on souhaite inhiber une odeur causée par le furanéol comprennent des agents bronzants (également appelés agents autobronzants ou bronzants sans soleil), par exemple, un agent bronzant contenant de la DHA en tant qu’agent colorant et d’autres agents bronzants qui emploient une réaction de brunissement, et d’autres produits contenant de la DHA. Du furanéol contenu en excès dans un aliment ou une boisson peut conférer un mauvais arôme. Par exemple, la présence de furanéol en excès dans du lait en poudre réduit sa saveur ou son goût. Par conséquent, d’autres exemples du composé ou de la composition pour lequel/laqueile on souhaite inhiber une odeur causée par le furanéol comprennent des aliments ou des boissons pour lesquels/îesquelles on souhaite réduire l’odeur du furanéol, ainsi que des compositions contenant les aliments ou les boissons.
[0037]
La composition suivante, le procédé de production, l’utilisation, ou le procédé seront en outre décrits dans la présente en tant que mode de réalisation exemplaire de la présente invention. En revanche, la présente invention n’est pas censée être limitée par ces modes de réalisation.
[0038] <1> Procédé de recherche d’un inhibiteur d’une odeur causée par le furanéol, comprenant : l’ajout d’une substance de test et de furanéol à un récepteur olfactif OR5K1 ou à un polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d'acides aminés avec celui-ci ; la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide au furanéol ; et l’identification d’une substance de test inhibant la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide, en se basant sur la réponse mesurée.
[0039] <2> Procédé selon <1>, dans lequel le récepteur olfactif ÖR5K1 est une protéine consistant en la séquence d’acides aminés représentée SEQ ID NO: 2.
[0040] <3> Procédé selon <1> ou <2>, dans lequel le polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec le récepteur olfactif OR5K1 est un polypeptide présentant de préférence au moins 85 %, de manière davantage préférée au moins 90 %, toujours de manière davantage préférée au moins 95 %, de manière encore davantage préférée au moins 98 %, toujours de manière encore davantage préférée au moins 99 % d’identité de séquence d’acides aminés avec le récepteur olfactif OR5K1.
[0041] <4> Procédé selon l’un quelconque de <1> à <3>, dans lequel le polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec le récepteur olfactif OR5K1 est un polypeptide qui présente de préférence au moins 85 %, de manière davantage préférée au moins 90 %, toujours de manière davantage préférée au moins 95 %, de manière encore davantage préférée au moins 98 %, toujours de manière encore davantage préférée au moins 99 % d’identité de séquence d’acides aminés avec le récepteur olfactif OR5K1 et qui est sensible au furanéol.
[0042] <5> Procédé selon l'un quelconque de <1> à <4>, dans lequel, de préférence, le récepteur olfactif OR5K1 ou le polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec celui-ci est exprimé sur une cellule recombinante génétiquement modifiée pour exprimer le récepteur olfactif ou le polypeptide.
[0043] <6> Procédé selon <5>, dans lequel, de préférence, la cellule recombinante est la cellule suivante : une ceüule co-transfectée avec un gène du récepteur olfactif ou du poiypeptide et un gène RTP1S ; une ceüule co-transfectée avec un gène du récepteur olfactif ou du polypeptide et les gènes RTP1S et RTP2 ; une cellule co-transfectée avec un gène du récepteur olfactif ou du polypeptide et un gène codant pour un polypeptide qui consiste en une séquence d’acides aminés présentant une identité de séquence d’au moins 78 %, de préférence 80 % ou plus, de manière davantage préférée 85 % ou plus, toujours de manière davantage préférée 90 % ou plus, de manière encore davantage préférée 95 % ou plus, toujours de manière encore davantage préférée 98 % ou plus, encore de préférence 99 % ou plus, avec la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ID NO: 4 et qui favorise l’expression du récepteur olfactif sur la membrane, comme avec la RTP1S humaine ; ou une cellule co-transfectée avec un gène du récepteur olfactif ou du polypeptide et un gène codant pour un variant de la RTP1S humaine.
[0044] <7> Procédé selon <5> ou <6>, dans lequel, de préférence, des cultures de la cellule recombinante sont utilisées en tant que récepteur olfactif OR5K1 ou polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec celui-ci.
[0045] <8> Procédé selon l’un quelconque de <1> à <7>, comprenant en outre de préférence la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l’absence de la substance de test.
[0046] <9> Procédé selon <8>, comprenant en outre de préférence les éléments suivants : lorsque la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en présence de la substance de test est réduite par comparaison à la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l'absence de la substance de test, la substance de test est identifiée comme une substance inhibant la réponse du récepteur ou du polypeptide au furanéoi.
[0047] <10> Procédé selon <8>, comprenant en outre de préférence les éléments suivants : lorsque la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en présence de la substance de test est réduite de préférence à 60 % ou moins, de manière davantage préférée à 50 % ou moins, encore de préférence à 25 % ou moins, de ia réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l'absence de la substance de test, ia substance de test est identifiée comme une substance inhibant la réponse du récepteur ou du polypeptide au furanéoi.
[0048] <11> Procédé selon l’un quelconque de <1> à <10>, dans lequel l’étape de mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide est ia mesure d’un taux d’AMPc intracellulaire par un essai ELISA ou de gène rapporteur, ou une imagerie calcique.
[Exemples] [0049]
Ci-après, la présente invention sera décrite plus spécifiquement en se référant aux Exemples.
[0050]
Exemple 1 Identification d’un récepteur olfactif sensible au furanéoi 1) Clonage d’un gène de récepteur olfactif humain
En se basant sur les informations de séquence enregistrées dans GenBank, chaque gène de récepteur olfactif humain a été cloné par PCR avec un kit Human Genomic DNA Female (G1521: Promega Corp.) en tant que matrice. Chaque gène ainsi amplifié par PCR a été inséré dans un vecteur pENTR (Invitrogen Corp.) conformément au manuel. Un site Noti-Ascl présent sur le vecteur pENTR a été recombiné dans un site Notl-AScl préparé en aval d’une séquence de marqueur Flag-Rho sur un vecteur pME18S.
[0051] 2) Préparation du vecteur pME18S-RTP1S humaine
Un gène RTP1S humain (SEQ ID NO: 3) codant pour la RTP1S humaine (SEQ ID NO: 4) a été inséré dans le site EcoRI-Xhol du vecteur pME18S.
[0052] 3) Préparation d’une cellule exprimant un récepteur olfactif
Des cellules HEK293 exprimant chacun des 400 types de récepteurs olfactifs humains ont été préparées. Chaque solution de réaction ayant la composition montrée dans le Tableau 1 a été préparée, a ensuite été laissée au repos pendant 15 minutes sur une paillasse propre, puis a été ajoutée à chaque puits d’une piaque à 96 puits (Becton, Dickinson and Company). Ensuite, les cellules HEK293 (3 x 105 cellules/cm2) ont été inoculées dans ceux-ci à 100 μΙ/puits puis ont été cultivées à 37 °C pendant 24 heures dans un incubateur maintenu à 5 % de CO2.
[0053] [Tableau 1]
[0054] 4) Essai de iuciférase
Les récepteurs olfactifs exprimés sur les cellules HEK293 sont conjugués avec une Gîxs intracellulaire afin d’activer i’adénylate cyclase, en augmentant ainsi les taux d’AMPc intracellulaire. Dans cette étude, leurs réponses au furanéol ont été mesurées en utilisant un essai de gène rapporteur iuciférase qui impliquait de surveiller l’augmentation du taux d’AMPc intracellulaire en tant qu’intensité de la luminescence dérivée d’un gène de la iuciférase de la luciole (fluc2P-CRE-hygro). De plus, les cellules ont été co-transfectées avec le gène rapporteur et un gène de fusion (hRluc-CMV) d’un gène de Iuciférase de Renilia en aval d’un promoteur du CMV afin de servir d’étalon interne pour corriger l’efficacité de transfection ou une erreur dans le nombre de cellules.
Un milieu a été retiré des cultures préparées dans le paragraphe 3) précédent. 75 μΙ d’une solution contenant du furanéol (3 mM) préparée avec un milieu CD293 (invitrogen Corp.) ont été ajoutés aux cultures résultantes. Les cellules ont été cultivées pendant 2,5 heures dans un incubateur à C02 afin d’exprimer les gènes de Iuciférase à des taux suffisants dans les cellules. L’activité Iuciférase a été mesurée en utilisant un système d’essai de Iuciférase Dual-Gio(TM) (Promega Corp.) conformément au manuel d’instructions du produit. L’intensité de la luminescence dérivée de la Iuciférase de la luciole induite par une stimulation avec du furanéol a été divisée par l’intensité de la luminescence dans les cellules sans stimulation par du furanéol afin de calculer une valeur, exprimée en tant qu’augmentation en fois, qui a été utilisée à son tour en tant qu’indicé de l’intensité de la réponse.
[0055] 5) Résultats
Suite aux mesures des réponses des 400 types de récepteur oifactifs au furanéol (3 mM), seul le récepteur olfactif OR5K1 exhibait une réponse au furanéol (Figure 1). OR5K1 est un nouveau récepteur du furanéol qui, jusqu'à présent, n’avait pas été identifié comme étant sensibie au furanéol.
[0056]
Exemple 2 Réponse concentration-dépendante d’OR5K1 au furanéol
Le récepteur olfactif OR5K1 (SEQ ID NO: 2) a été exprimé, avec la RTP1S humaine (SEQ ID NO: 4), sur des cellules HEK293 par les mêmes procédures que celles de l’Exemple 1, puis a été examiné pour la concentration-dépendance de sa réponse à diverses concentrations de furanéol (0, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 et 3000 μΜ). En conséquence, OR5K1 exhibait une réponse concentration-dépendante au furanéol (Figure 2).
[0057]
Exemple 3 identification d’un antagoniste d’OR5K1 84 types de substances de test ont été examinés pour leur activité antagoniste sur la réponse du récepteur olfactif OR5K1 au furanéol.
Du furanéol (3 mM) et chaque substance de test (100 μΜ) ont été ajoutés à des cellules HEK293 dans lesquelles l’expression du récepteur olfactif OR5K1 a été obtenue en utilisant les mêmes procédures que celles de l’Exemple 2. La réponse du récepteur olfactif a été mesurée afin d’évaluer une modification de la réponse du récepteur causée par l’addition de la substance de test.
Le taux d’inhibition de la réponse du récepteur par la substance de test a été calculé de la manière suivante : l’intensité de la luminescence dérivée de la luciférase de la luciole (Y) dans les cellules exprimant le récepteur olfactif OR5K1 sans stimulation par du furanéol a été soustraite de l’intensité de la luminescence dérivée de la luciférase de la luciole (X) induite par une stimulation avec du furanéol uniquement, afin de déterminer l’activité du récepteur (X - Y) basée sur la stimulation avec du furanéol uniquement. De la même manière, l’intensité de la luminescence (Y) dans les cellules sans stimulation par du furanéol a été soustraite de l’intensité de la luminescence (Z) induite par une stimulation avec le mélange de furanéol et la substance de test afin de déterminer l’activité du récepteur (Z - Y) en présence de la substance de test. Le taux de réduction de l’activité du récepteur (Z - Y) en présence de la substance de test par rapport à l’activité du récepteur (X - Y) basée sur la stimulation avec du furanéol uniquement a été calculé conformément à une formule montrée ci-dessous afin de déterminer le taux d’inhibition de la réponse du récepteur par la substance de test. Dans cet essai, une pluralité d’expériences indépendantes en double a été réalisée. Une moyenne des expériences dans chaque session d’analyse a été obtenue.
Taux d’inhibition (%) = {1 - (Z - Y) / (X - Y)} x 100
En conséquence, 17 types de substances de test présentaient un taux d’inhibition de la réponse d’OR5K1 au furanéol de 40 % ou plus (ce qui réduisait la réponse à 60 % ou moins), ce qui démontre que ces substances de test présentent une activité antagoniste contre OR5K1 (Tableau 2).
[0058] [Tableau 2]
[0059]
Exemple 4 Évaluation de l’aptitude d'un antagoniste d’OR5K1 à inhiber l’odeur du furanéol L’aptitude à inhiber l’odeur du furanéol de chaque substance de test présentant une activité antagoniste contre OR5K1, identifiée dans l’Exemple 3, a été confirmée par un test sensoriel.
Chaque membre d’un panel a senti un tissu contenant 0,5 g de furanéol (1 %) auquel 0,5 pl d’un arôme a été ajouté, puis a ensuite évalué l’intensité de l’odeur du
furanéoi par comparaison à un tissu auquel aucun arôme n’avait été ajouté. Le test d'évaluation sensorielle a été réalisé par 3 membres d’un panel L’odeur du furanéoi a été évaluée à 1 lorsqu’elle était fortement perceptible et à 5 lorsqu’elle était imperceptible.
En conséquence, l’ensemble des 17 types de substances de test ayant démontré qu’elles Inhibaient la réponse d’OR5K1 au furanéoi dans l’Exemple 3 inhibaient l’odeur du furanéoi (Figure 3).
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Procédé de recherche d’un inhibiteur d'une odeur causée par la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone, comprenant : l’ajout d’une substance de test et de 215-dίméthyl·4-hydroxy-3(2H)-furanone à un récepteur olfactif OR5K1 ou à un polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec celui-ci ; la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide à la 2,5-diméthyi-4-hydroxy-3(2H)-furanone ; et l’identification d’une substance de test inhibant la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide, en se basant sur la réponse mesurée.
- 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le récepteur olfactif OR5K1 est une protéine consistant en la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2.
- 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec le récepteur olfactif OR5K1 est un polypeptide qui consiste en une séquence d’acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence d’acides aminés représentée par SEQ ID NO: 2 et est sensible à la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone.
- 4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le récepteur olfactif OR5K1 ou le polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec celui-ci est exprimé sur une cellule recombinante génétiquement modifiée pour exprimer le récepteur olfactif ou le polypeptide.
- 5. Procédé seiort l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l'absence de la substance de test.
- 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel lorsque la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en présence de la substance de test est réduite à 60 % ou moins de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l’absence de la substance de test, la substance de test est identifiée comme une substance inhibant la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide à la 2,5-diméthy!-4~ hydroxy-3(2H)-furanone.
- 7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant en outre la mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l'absence de la substance de test.
- 8. Procédé selon la revendication 7, comprenant en outre les éléments suivants : lorsque la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en présence de la substance de test est réduite par comparaison à la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide en l’absence de la substance de test, la substance de test est identifiée comme une substance inhibant la réponse du récepteur ou du polypeptide à la 2,5-diméthyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone.
- 9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l’étape de mesure de la réponse du récepteur olfactif ou du polypeptide est la mesure d’un taux d’AMPc intracellulaire par un essai ELISA ou de gène rapporteur, ou une imagerie calcique.
- 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel des cultures de la cellule recombinante qui est génétiquement modifiée pour exprimer le récepteur olfactif ou le polypeptide sont utilisées en tant que récepteur olfactif OR5K1 ou polypeptide présentant au moins 80 % d’identité de séquence d’acides aminés avec celui-ci.
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