AT500143A1 - Cholinesterase-inhibitoren in liposomen sowie deren herstellung und verwendung - Google Patents

Description

-1. - -1. - • · · · • · • · TECHNISCHES GEBIET 5

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen auf der Basis von Cholinesterase-Inhibitoren in Liposomen, auf die Herstellung solcher Zusammensetzungen und auf deren therapeutische Anwendungsmöglichkeiten. 10

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Zentralgängige Inhibitoren der Cholinesterasen werden zur Pharmakotherapie der leichten und mittelschweren Alzheimer'schen Krankheit eingesetzt, um die 15 bei diesem Syndrom krankhaft verminderte Funktion des cholinergen Reizleitungssystems im Gehirn teilweise wiederherzustellen. Neuere Forschungen haben ergeben, dass viele Cholinesterase-Inhibitoren nicht nur durch unterschiedliche Mechanismen die Acetyl- und Butyrylcholinesterase blockieren, sondern auch direkte Wirkungen auf neuronale nikotinische Acetylcholin-20 Rezeptoren ausüben. Diese Rezeptoren, deren natürlicher Ligand Acetylcholin ist, finden sich nicht nur auf cholinergen Nerven, sondern auch im serotoner-gen und glutamatergen Nervensystem und steuern dort die Freisetzung des jeweiligen Neurotransmitters. 25 Diese Wirkung tritt bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen des betreffenden Agens ein, erfolgt an unterschiedlichen Rezeptor-Bindungsstellen des Rezeptors, und kann - zum Teil auch in Abhängigkeit von der Konzentration des Cholinesterase-Inhibitors selbst und/oder von der gleichzeitig bestehenden Acetylcholin-Konzentration - in einer Blockade oder einer Verstärkung der 30 Wirkung des Acetylcholins auf den Rezeptor resultieren.

Eine prototypische Rolle kommt dem in dieser Hinsicht besonders eingehend untersuchten Galantamin zu, da dieses bei Konzentrationen, die eine thera- .·?· • · · · · · I · · ► · · · · • · · * peutisch wirksame Cholinesterase-Hemmung bewirken, ein allosterisch modulierender Ligand an einer von der Acetylcholin-Bindungsstelle distinkten Bindungsstelle ist (Samochocki et al.f Acta Neurol Scand Suppl. 2000; 176: 68-73; Dalas-Bailador et al.f Mol Pharmacol. 2003; 64(5): 1217-26). Dadurch 5 wird die Wirkung der durch die Cholinesterase-Hemmung des Galantamins erhöhte Konzentration des Acetylcholins zusätzlich potenziert. Tacrin bindet offenbar ebenfalls an dieser und an einer weiteren Bindungsstelle des Rezeptors (Svensson und Nordberg, Neuroreport 1996; 7(13): 2201-5). Vergleichbare Hinweise existieren auch für Physostigmin (Onkojo et al., Eur J Biochem 10 1991; 200(3): 671-7) und für Donepezil. Auch für Galantamin wurde eine nicht-cholinerge anti-apoptotische Wirkung berichtet (Arroyo et al., Rev Neurol. 2002; 34(11): 1057-65), ebenso wie eine dem Nerve Growth Factor (NGF) entsprechende Wirkung (Capsoni et al., Proc Natl Acad Sei USA. 2002; 99(19): 12432-7). 15

Obwohl diese Studien in Hinblick auf die Behandlung der Alzheimer'sehen Demenz mit ihrem spezifischen cholinergen Defizit und der damit verbundenen Neurodegeneration durchgeführt wurden, sind sie auch für degenerative und schmerzhafte Erkrankungen des peripheren Nervensystems, insbesondere der 20 sensorischen Nerven, von hoher Bedeutung. Einerseits ist anti-nozizeptive Wirkung von Nikotin und anderen Substanzen, die an nikotinischen Rezeptoren agonistisch wirken, seit geraumer Zeit bekannt. Andererseits ist in den frühen Stadien der diabetischen sensorischen Neuropathie ebenso wie bei akuten Nervenläsionen die Konzentration von NGF in den betroffenen Abschnitten der 25 Haut stark vermindert. NGF bzw. eine diesem entsprechende neurotrophe Aktivität, die direkt oder über das eng mit NGF verbundene cholinerge System vermittelt wird, könnte hier die sensorische Funktion wiederherstellen. Diesbezügliche Studien waren jedoch wenig erfolgreich, vermutlich weil keine ausreichend hohen lokalen NGF-Konzentrationen ohne systemische Nebeneffekte 30 erzielbar waren (Anand, Prog Brain Res. 2004; 146 :477-92). Auch nikotini-sche Agonisten haben sich in ihrer diesbezüglichen therapeutischen Anwendbarkeit durch Nebenwirkungen wie Bluthochdruck und neuromuskuläre Paralyse beeinträchtigt gezeigt. Peripher wirkende Cholinesterase-Inhibitoren ·· · · • · ·· ♦ · ···· ♦ ♦

• · ·· gelten, wesentlich auch aufgrund der Nebenwirkungsproblematik, als für die analgetische Therapie am Menschen ungeeignet (Ghelardini et al., Presynaptic Auto- and Heteroreceptors in the Cholinergic Regulation of Pain. In: Trends in Receptor Research, Elsevier Science Publishers B.V., 1992). 5

Transdermale Formulierungen von Cholinesterase-Inhibitoren auf der Basis von

Pflastern, die den Wirkstoff in einem dermalen Penetrationsverstärker gelöst oder verteilt enthalten, sind bekannt. In beispielhafter Aufzählung solcher

A A passiven transdermalen Systeme seien erwähnt: EP-0376067, EP-0377147.

A A A do lin/OMW A 10 EP-0667774^ EP-0599952fund EP0517840ffür Physostigmin^j^9Ö3J 782· für Rivastigmin; EP-0680325jffür Galantamin, sowie ^0 0132115-für Huper- zin. Moriearty et al. (Methods Find Exp Clin Pharmacol 1993; 15(6): 407-12) beschreiben solche Systeme für Metrifonat bzw. dessen als Cholinesterase-

Inhibitor aktives Flydrolyseprodukt Dichlorvos und für Heptylphysostigmin. 15 Zwei weitere synthetische Abkömmlinge des Physostigmins, Thiacymserin und

Thiatolserin, werden von ihrem Entwickler ausdrücklich als besonders geeignet zur transdermalen Verwendung beschrieben.

Diese transdermalen Systeme sind sämtlich für Anwendungen ausgelegt, die 20 eine systemische Verabreichung des jeweiligen Wirkstoffes erfordern. Die Wahl der transdermalen Route ist in diesen Fällen durch den Wunsch gegeben, den Wirkstoff langsam und gleichmässig in die Blutbahn abzugeben und/oder den bei peroraler Aufnahme auftretenden „First Pass"-Abbau in der Leber zu vermeiden, sodass therapeutisch optimale Plasmaspiegel über längere Zeit 25 bestehen bleiben. Die systemische Wirkung wird dabei dadurch erzielt, dass der Wirkstoff die Haut auf dem Wege passiver Diffusion durchdringt und von subdermalen Kapillargefässen in den Blutstrom aufgenommen wird. Der Wirkstoff kann sich auch im Unterhaut-Fettgewebe vorübergehend ablagern bzw. binden, um von dort langsam in den Blutkreislauf ausgewaschen zu werden. In 30 der Haut selbst tritt beabsichtigterweise nur eine geringe Retention des Wirkstoffes auf. Die genannten Systeme sind daher für die Therapie des neuro-pathischen Schmerzes bzw. der Beeinträchtigung der dermalen sensorischen Funktion durch Neurodegeneration ungeeignet. ‘4 Μ *·· · ► · · · ι ···

Liposomen sind als Mittel zur kontrollierten Freisetzung pharmazeutischer

Wirkstoffe bekannt (z.B. siehe Übersicht bei Ulrich, Biosci Rep. 2002; 22(2): 129-50), insbesondere auch zur Verwendung in speziellen transdermalen ,

U>o ΜφΟΜίΑ A „Pflaster"-Systemen (z.B. geoffenbart in WO 8701938 und US-5718914jTund A ' 5 in Gelen (US-5064655|jL Auch die Formulierung von Lokalanästhetika in topisch applizierten Liposomen ist dem Fachmann bekannt; z.B. beschreibt US- Ä 4937078|l.iposomen, die übliche Natriumkanal-Blocker wie Tetracain, Lidocain usw. enthalten. 10 Eine liposomale Formulierung des Cholinesterase-Inhibitors Neostigmin zur Verwendung als Analgetikum ist zwar beschrieben (Grant et al., Acta Anaesthesiol Scand. 2002; 46(1): 90-4), wurde aber intrathecal (d.h. in das Bindegewebe) verabreicht, sodass die beobachtete analgetische Wirkung eine zentrale war. 15

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es stellte sich somit die erfindungsgemässe Aufgabe, einen Weg zu finden, Cholinesterase-Inhibitoren mit bekannter Wirkung auf neuronale nikotinische 20 Rezeptoren und/oder NGF-ähnlicher neurotropher Aktivität so zu verabreichen, dass sowohl die bekannten Nachteile von Pflasteranwendungen (z.B. Erfordernis einer möglichst planen Oberfläche für die Aufbringung des Pflasters; mögliche Hautirritationen; Wirkstoffkonzentration im Pflaster muss sehr hoch sein; Penetrationsverstärker können Hautschädigung bewirken), als auch die 25 Nachteile von invasiven Applikationsverfahren und anderen systemischen Anwendungsarten, insbesondere die mit der erforderlichen hohen Dosierung verbundenen, unerwünschten systemischen Nebenwirkungen, vermindert oder vermieden werden können. 30 Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung mit Cholinesterase-Inhibitoren bereit zu stellen, welche eine insgesamt niedrige, gleichzeitig jedoch ausreichend hohe lokale Dosierung dieser

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Wirkstoffe im Bereich der sensorischen Nervenendigungen der Haut unter gleichzeitig weitgehender Vermeidung ihrer Systemisierung erlaubt.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, 5 welche überall am Körper, insbesondere auch an "unebenen" Stellen, welche sich für eine Pflasteranwendung nicht eignen, z.B. an Füssen bei diabetischer Neuropathie, im Gesicht bei Trigeminusneuralgie, aufgebracht werden kann.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, 10 welche zu keinen Mazerationserscheinungen an der Haut führt, was insbesondere bei bereits vorgeschädigter und/oder fragiler Haut, beispielsweise bei Diabetikern, essentiell ist.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, 15 welche als steriles Produkt hergestellt und dadurch z.B. bei Herpes Zoster bereits im Bläschen-Stadium oder in der Abheilungsphase als Therapeutikum aufgebracht werden kann.

Es ist schliesslich auch ein Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu 20 stellen, welche in der Haut ein Wirkstoff-Depot produziert, aus dem kontinuierlich Substanz abgegeben wird, wodurch ausserdem eine bessere Bioverfügbarkeit und längere Halbwertszeit im Vergleich zur systemischen Anwendung erzielt wird. 25 Erfindungsgemäss werden diese Ziele durch die Bereitstellung eines liposoma-len Systems zur topischen Verabreichung von Cholinesterase-Inhibitoren erreicht. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass durch Einschluss von Cholin-30 esterase-lnhibitoren in Liposomen bestimmter Zusammensetzung und Grösse und anschliessende Formulierung dieser Liposomen in geeigneten galenischen Systemen zur transdermalen Verabreichung, die zuvor erwähnten Ziele verwirklicht werden können. Dabei hat sich zur Herstellung und Beladung der ·· ♦·· ·

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Liposomen mit Wirkstoff das in der WO 023625?· geoffenbarte, skalierbare Verfahren zur Wirkstoff-Verkapselung aufgrund seiner hohen Effizienz bei gleichzeitig äusserst schonenden Verfahrensbedingungen als besonders vorteilhaft erwiesen. Andere im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Her-5 Stellung und Beladung von Liposomen können aber ebenfalls angewandt werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG 10 Die Beladung von Liposomen mit Wirkstoffen kann in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: Beladung der Membran und Beladung der intraliposomalen wässrigen Phase. Nachdem Galantamin-Base in Ethanol löslich ist, wurde zuerst versucht, die Wirkstoffmoleküle in die liposomale Membran zu inkorporieren, was allerdings nicht gelang. Je mehr Galantamin in die Membran nicht 15 eingeschlossen und statt dessen durch Filtration entfernt wurde, desto mehr wurde auch von der Membran wieder abgegeben. Der Anteil an membrangebundenem und nicht gebundenem Galantamin war etwa gleich gross. Aus diesem Grunde wurde anschliessend versucht, die intraliposomale wässrige Phase mit Galantamin zu beladen. Dieser Vorgang kann auf zweierlei Arten 20 bewerkstelligt werden: durch aktives und passives Beladen. Ausgehend von Versuchen mit passiver Beladung von Liposomen mit Galantamin-HBr/Base in PBS-Lösung stellte sich bald heraus, dass sich damit keine stabilen Galanta-min-Liposomen-Suspensionen hersteilen lassen. Wie schon in den vorherigen Membran-Versuchen, diffundierte der Wirkstoff nun auch aus dem wässrigen 25 Milieu der Liposomen heraus, sobald nicht-eingeschlossener Wirkstoff aus dem Umgebungsmedium entfernt wurde.

Es war daher erforderlich, sich den Wirkstoff Galantamin etwas näher anzusehen. Dabei wurde gefunden, dass Galantamin ähnliche chemische Eigen-30 schäften wie Doxorubicin aufweist und durch pH-Gradienten-gesteuerte Beladung in Liposomen eingeschlossen werden kann. Für diese Art der aktiven Beladung ist das wichtigste Merkmal der Liposomenmembran/Liposomen-medium-Verteilungskoeffizient. Es wurde gefunden, dass der Octanol/Buffer- ♦ · ···· 4 • · ·*·· • m • ·· • * • 4 •-7 · • · ·*« 9 - 7 - · m • · 4 • •

Verteilungskoeffizient einen guten Hinweise für die Transmembran-Diffusion eines Stoffes liefert und daher für die Beladung mit Wirkstoff beziehungsweise für das Freisetzungsprofil relevant ist. Zudem muss der Wirkstoff protonierbare Aminogruppen enthalten, sodass bei niedrigem pH der Wirkstoff hydrophil und 5 bei neutralem oder alkalischem pH lipophil ist.

Unter Zugrundelegung dieses theoretischen Modells wurden Liposomen mit unterschiedlicher Lipidzusammensetzung, vorzugsweise mit langkettigen Phospholipiden und geringen Cholesterol-Konzentrationen), in einem geeigneten 10 Beladungspuffer, vorzugsweise in einem Zitronensäure/Natriumcarbonat-Puffer, hergestellt. Nachdem die Liposomen bei niedrigem pH hergestellt worden waren, wurde das umgebende Medium alkalisiert und dadurch ein pH-Gradient erzeugt. Nach Zusatz von Galantamin in das alkalisierte Medium migrierte der Wirkstoff dank dieses pH-Gradienten in die Liposomen hinein, 15 wurde dort protoniert und verblieb stabil in den Liposomen.

Bei Anwendung dieser Technik wird das Ausmass der Beladung bzw. die Beladungskapazität in erster Linie vom Verhältnis der pH-Werte innerhalb und ausserhalb der Liposomen bestimmt. In den durchgeführten Versuchen konn-20 ten mit Wirkstoff/Lipid-Verhältnissen im Bereich von 200 - 400 nmol Wirkstoff je pmol Lipid ähnliche Werte erzielt werden, wie sie aus der Literatur über aktiv beladene Liposomen bekannt sind. Eine Erhöhung der Wirkstoffkonzentration im Beladungsmedium führte zu keiner Steigerung der Beladungskapazität. 25

Die zuvor beschriebene aktive Beladung ist ein dreistufiger Vorgang, bestehend aus Vesikelbildung, Wirkstoffzugabe und Alkalisierung. Es war daher ein weiteres Ziel der Erfindung, ein einstufiges Herstellungsverfahren zu etablieren,

toOAooiSOitett A welches unter Verwendung des in der WOO2-36257 offenbarten Kreuzstrom-30 moduls realisiert werden konnte. Zu diesem Zweck wurde Galantamin in Zitronensäurelösung gelöst, mittels Kreuzstrom-Injektionstechnik in Liposomen eingeschlossen und unmittelbar anschliessend darauf die restliche Zitronen-

•χ. säurelösung mit einem Verdünnungspuffer (Zitronensäure/Natriumcarbonat pH 9,0 - 9,5) alkalisiert.

In den nachfolgenden Beispielen wird unter anderem gezeigt, dass die Qualität 5 der wirkstoffbeladenen Liposomen allein schon durch Variation, insbesondere durch Verringerung, des Cholesterolgehaltes in der Vesikelmembran verbessert werden kann, vor allem in Bezug auf deren Hautpenetrationsfähgkeit. Darüber hinaus belegen Stabilitätstests für die Produkte aus dem dreistufigen und dem einstufigen Verfahren, dass bei beiden Produkten selbst nach mehr als sechs 10 Monaten Lagerung, die Produktstabilität und -qualität unverändert geblieben ist.

Wo erforderlich oder gewünscht, kann durch Anhebung der mittleren Liposo- mengrösse von ca. 150 - 200 nm (wie in den hierin beschriebenen Experimen- j 15 ten zumeist verwendet) auf 300 bis 500 nm, die Beladungskapazität weiter erhöht werden. Zusätzlich lässt sich auch die Effizienz des Verfahrens, d.h. die Menge an liposomal eingeschlossenem Wirkstoff je ml Suspension, durch Erhöhung der Lipidkonzentration entweder während der Herstellung oder bei der anschliessenden Filtration der Vesikel noch weiter steigern. 20

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Abb.1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Herstellung der Liposomen. 25 Abb.2 zeigt HPLC-Resultate von Galantamin-Einschlussversuchen in Liposomen. Dunkle Balken stellen Galantamin im Retentat (d.h. liposomales Galantamin), helle Balken hingegen im Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und der leere Balken die Gesamtmenge an Galantamin dar; Ordinate: Galantamin in μg/ml. 30 Abb.3 zeigt HPLC-Resultate von Galantamin-Einschlussversuchen in Liposomen. Dunkle Balken stellen Galantamin im Retentat (d.h. liposomales Galantamin), helle Balken hingegen im Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und die leeren Balken die Gesamtmenge an Galantamin 5 5 Abb.4

Abb.5 10

Abb.6 15 Abb.7 20

Abb.8 25 Abb.9

Abb.10

Abb.11 dar; erste drei Balken: positiv geladene Liposomen mit Stearylamin; letzte drei Balken: negativ geladene Liposomen mit E-PG; 3A: Galantamin-HBr; 3B: Galantamin-Base. zeigt HPLC-Resultate von Galantamin-Einschlussversuchen in Liposomen. Dunkle Balken stellen Galantamin im Retentat (d.h. liposomales Galantamin), helle Balken hingegen im Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und der leere Balken die Gesamtmenge an Galantamin dar. zeigt die Ergebnisse eines Stabilitätstests mit aktiv beladenen Galantamin-Liposomen bei unterschiedlichem pH der wässrigen Phase; Ordinate: Wirkstoffkonzentration in nmol Wirkstoff pro pmol Lipid; Abszisse: Zeitraum in Wochen seit Herstellung der Präparate, zeigt HPLC-Daten der Beladung vorgeformter Liposomen mit Galantamin in Abhängigkeit von Temperatur und Beladungsdauer. Angaben in Prozent der vorgelegten Galantaminkonzentration, zeigt HPLC-Daten aktiv beladener Liposomen in Gegenwart eines Galantaminüberschusses aus zwei Herstellungsversuchen. Dunkle Balken stellen die Menge an nicht-eingeschlossenem, helle Balken jene an liposomal eingeschlossenem Galantamin dar. Die helle Linie zwischen den Dreieckssymbolen (zugehörige Werte: rechte Ordinate) weist auf das stabile Lipid/Wirkstoff-Verhältnis hin. zeigt Stabilitätsdaten eines Liposomen-Präparates, worin die Liposomen in einem einstufigen Verfahren aktiv mit Galantamin beladen wurden. Ordinate: Wirkstoffkonzentration in nmol Wirkstoff pro μιτιοΙ Lipid; Abszisse: Zeitraum in Wochen seit Herstellung der Präparate, zeigt Stabilitätsdaten von aktiv beladenen Galantamin-Liposomen: A) hergestellt im dreistufigen Verfahren; B) hergestellt im einstufigen Verfahren. zeigt Galantamin-Einschlussraten und Stabilität von aktiv beladenen DMPC-Liposomen. zeigt die Galantaminaufname in DPPC-Liposomen in Abhängigkeit des Cholesterolgehaltes. 30

Abb.12 Abb.13 5 Abb.14 10 Abb.15 Abb.16 15 Abb.17 Abb.18 20 Abb.19 Abb.20 25 Abb.21 zeigt einen Stabilitätstest von Galantamin-Liposomen, hergestellt nach der Ammoniumsulfat-Gradientenmethode. F1, F2, F3 bezeichnen Filtratproben, R steht für Retentat. zeigt die Stabilität von Galantaminliposomen mit Lipiden verschiedener Kettenlänge (A: C16undB: C14) in Hydrogelformulierungen, zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposo-malen Galantamin-Präparaten unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. Ordinate: ng Galantamin absolut in der jeweiligen Probe; Abszisse: Variationen der Lipidzusammensetzung, zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposo-malen Galantamin-Präparaten nach wiederholter Applikation, zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposo-malen Galantamin-Präparaten in Abhängigkeit der Probenmenge und der Penetrationsdauer. zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposo-malen Galantamin-Präparaten in Abhängigkeit der Hydrogel-Konzentration. zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit Galantamin-Präparaten in Form von Mikroemulsionen, zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit Hydrogel-Präparaten auf der Basis von frei vorliegendem Galantamin im Vergleich zu liposomal eingeschlossenem Galantamin, zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposo-malen Galantamin-Präparaten in Form einer Suspension bzw. als Gel. zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposo-malen Galantamin-Präparaten bei verschiedenen Hautproben.

Zur besseren Illustration wird die Erfindung anhand der nachfolgenden Beispiele weiter erläutert. Die Versuche wurden anhand von Galantamin als Wirkstoff, 30 entweder in Form der freien Base oder als HBr-Salz, durchgeführt. Es ist dem Fachmann aber einsichtig, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung Galantamin auch in Form seiner Enantiomere und seiner sämtlichen pharmakologisch akzeptablen Salze verwendet werden kann. Ebenso sind im Rahmen der vorlie- u ·· ·♦♦♦ • · · • ♦ ♦·· genden Erfindung chemische Derivate des Galantamins und deren Enantiomere, tooftti/oAittlA tooMv/okook M 0oju*AloiiKltoA so etwa die in WO £Η>Τ26&2, WO (ΗΊΟΟΊΟ und WO-017482Q beanspruchten

Moleküle, soweit diese Cholinesterase-Hemmstoffe und/oder nikotinische Rezeptor-Modulatoren sind und/oder neurotrophe, NGF-artige Wirkungen entfal-5 ten, mitumfasst, wobei Zusammensetzung und Grösse der Liposomen an die physikochemischen Eigenschaften dieser Moleküle angepasst werden können.

Im gleichen Sinne ist es dem Fachkundigen offensichtlich, dass auch andere Substanzen als Galantamin und dessen Salze und Derivate, soweit diese 10 Cholinesterase-Hemmstoffe und/oder nikotinische Rezeptor-Modulatoren sind und/oder neurotrophe, NGF-artige Wirkungen entfalten, ebenso in den Rahmen dieser Erfindung fallen. Hierzu zählen neben allen in der einführenden Beschreibung des Standes der Technik angeführten Substanzen, insbesondere auch die 00 HjooSjIOS A 0OJ0o4fOii 12* A

in WO 0205907Ί genannten Moleküle, ebenso wie die in WQ-0178728· und 00 £004/0 A 15 WO 01-08271 genannten Abkömmlinge des Donepezils, insbesondere auch dessen Fluoro-Derivat ER-127528.

Beispiel 1: Herstellung und Stabilitätsprüfung der Galantamin-Liposomen 20 Zur Vesikelherstellung wurden synthetisches Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, Genzyme, Schweiz) und Cholesterol (Solvay, Niederlande) eingesetzt. Einige Experimente wurden entweder mit Hühnerei-Phosphatidylglycerol (E-PG; Fa. Lipoid, Deutschland) oder mit Stearylamin (Sigma, USA) durchgeführt, um positive oder negative Ladungen in die liposomale Membran einzubringen. 25 Galantamin (Sanochemia AG, Austria) wurde als freie Base oder als HBr-Salz für die Einschlussversuche eingesetzt. Als Pufferlösungen wurden PBS (phosphate buffered saline) oder Zitronensäure in Kombination mit Natriumcarbonat verwendet. 30 Die Liposomen wurden bevorzugt mittels der scherkraftfreien Kreuzstrom-Injektionstechnik gemäss <WQrQ236257. hergestellt. Diese Technik ist sehr gut reproduzierbar und erlaubt das Einschliessen beliebiger Wirkstoffe in Liposomen. Diese kontinuierlich durchführbare, einstufige Methode gestattet es, durch Variation der Verfahrensbedingungen, insbesondere des Injektionsdruckes der Lipidphase, unilamellare Liposomen mit einer Lipid-Doppelschichtmembran ("Bilayer") mit definierter, vorwählbarer mittlerer Grösse und Grössenverteilung stabil herzustellen. Sie ist ausserdem unter ausgesprochen 5 milden Verfahrensbedingungen ausführbar und erlaubt es, auf den Einsatz möglicherweise schädigender Lösungsmittel sowie insbesondere auf die

Anwendung von Scherkräften zur Vesikelbildung, vollständig zu verzichten.

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Weitere Vorteile dieser Methode sind in iWO 02362-5-7 ausführlich beschrieben. 10 Darüber hinaus ist es mit dieser Methode möglich, sämtliche Reagenzien in steriler oder keimfreier Form bereitzustellen und die Liposomenherstellung und -beladung unter aseptischen Bedingungen durchzuführen, sodass schlussendlich ein steriles oder keimfreies Produkt in Form wirkstoffbeladener Liposomen resultiert. 15

Der Nachweis für eingeschlossenes Galantamin wurde, nach Ultrafiltration und/oder Diafiltration in einer Rührzelle (Amicon, USA) oder nach einer Gelfiltration über Sephadex G25 Säulen (Pharmacia, Deutschland), mittels rp-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography) geführt. Die 20 hauseigene rp-HPLC-Technik gestattet die quantitative Bestimmung des Membranbestandteiles Cholesterol und des Wirkstoffes Galantamin innerhalb eines einzigen Durchlaufes. Die Liposomengrösse und -Verteilung wurde mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) bestimmt. 25 Liposomenherstellung:

Die Liposomen werden bevorzugt mittels Kreuzstromtechnik hergestellt. Wie in Abb.1 dargestellt, besteht die Vorrichtung zur Liposomenherstellung aus einem Kreuzstrom-Injektionsmodul 1, Behältern für die polare Phase (Injektionspuffer 2 und Verdünnungspuffer 3), einem Behälter für die Ethanol/Lipid-Lösung 4 30 und einem Stickstoffkompressor 5. Die Injektionsöffnung im Kreuzstrommodul hat einen Durchmesser von ca. 250 pm. Die Lipidmischung wird bevorzugt in 96% Ethanol bei einer Temperatur im Bereich von - je nach Lipidauswahl bzw. Lipidzusammensetzung - 25 bis 60°C, beispielsweise im Falle von DPPC-

Liposomen bei einer Temperatur von 50 bis 55 °C, unter Rühren gelöst. Auch die Pufferlösungen werden vorzugsweise auf dieselbe Temperatur, beispielsweise 55 °C, temperiert. Während die polare Phase durch das Kreuzstrommodul mittels einer Pumpe 6, z.B. einer Peristaltikpumpe, gepumpt wird, wird 5 gleichzeitig die Ethanol/Lipid-Lösung unter beliebig vorwählbarem Druck in die polare Phase injiziert.

Variante I: li- DPPC, Cholesterol und Stearylamin (molares Verhältnis 7:2:1) werden zusam-10 men mit Galantamin in 96% Ethanol gelöst und in PBS-Puffer injiziert. Nach spontan erfolgter Ausbildung der Liposomen werden diese filtriert und sowohl das Retentat als auch das Filtrat mittels rp-HPLC analysiert. Wie aus Abb.2 ersichtlich, kann Galantamin auf diese Weise nicht stabil in die Liposomen integriert werden. Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und Retentat 15 (liposomal eingeschlossenes Galantamin) zeigen identische Wirkstoffkonzentrationen.

Es bedeuten in Abb.2: der 1.Balken: die Gesamtmenge an vorgelegtem Galantamin; der 2. und 3. Balken: die Wirkstoff-Verteilung in Filtrat und Retentat nach der 20 ersten (2. Balken) und nach einer weiteren Diafiltration (3. Balken).

Variante II:

Abermals wurden die Lipide in Ethanol gelöst. Für Versuche mit negativ geladenen Liposomen wurde Stearylamin durch Hühnerei-Phosphatidylglycerol (E-25 PG) ersetzt. Die Ethanol/Lipid-Lösung wird entweder in eine Lösung von PBS/Galantaminbase oder in eine PBS/Galantamin-HBr-Lösung injiziert.

Wie aus den Abbildungen Abb.3A und Abb.3B ersichtlich, liess sich Galantamin auch nach diesem Verfahren nicht zufriedenstellend in Liposomen ein-30 schliessen. Nach Filtration wurden in Filtrat und Retentat gleiche Mengen an Galantamin gefunden.

Es bedeuten in Abb.3A und Abb.3B: der l.und 4. Balken: die Gesamtmenge an jeweils vorgelegtem Galantamin; der 2. und 3. bzw. 5. und 6. Balken: die Wirkstoff-Verteilung in Filtrat und Retentat nach der ersten (2. und 5. Balken) bzw. nach einer weiteren Diafiltration (3. und 6. Balken). 5 Variante III:

Externe Beladung von Liposomen mit Galantamin mittels pH-Gradient. Die Lipide (molares Verhältnis DPPC : Cholesterol = 55 : 45) wurden in Ethanol gelöst und diese Lösung in 300 mM Zitronensäure pH 3,5 - 4,5 injiziert. Nach spontaner Vesikelbildung wird Galantamin-HBr zugesetzt und die Lösung mit 10 500 mM Natriumcarbonat alkalisiert. Auf diese Weise bildet sich ein pH-Gra-dient zwischen Innen- und Aussenseite der Lipidvesikel (Liposomen) aus. pH-Werte unter 2,5 sind aufgrund einsetzender Hydrolyseprobleme weniger geeignet, ebenso sind pH-Werte grösser 5,5 aufgrund des immer flacher werdenden pH-Gradienten nicht bevorzugt. 15

Wie aus Abb.4 ersichtlich, ist der Anteil an Galantamin im Filtrat wesentlich geringer als im Retentat, was bestätigt, dass ein Grossteil des Galantamins offensichtlich entlang dieses pH-Gradienten in die Liposomen migriert, dabei protoniert wird und im sauren Milieu innerhalb der Liposomen verbleibt. 20 Es bedeuten in Abb.4: der 1. Balken: die Gesamtmenge an vorgelegtem Galantamin; der 2. und 3. Balken: die Wirkstoff-Verteilung in Filtrat und Retentat nach der ersten (2. Balken) bzw. nach einer weiteren Diafiltration (3. Balken). 25 Dieses Produkt wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt und einem Stabilitätstest unterzogen. In Abb.5 wird die Produktstabilität über einen Zeitraum von 9 Wochen dargestellt.

Zur Bestimmung der Kinetik der aktiven Beladung von Liposomen mit Galanta-30 min wurde die Dauer des Beladungsvorganges untersucht und die optimale Beladungstemperatur ermittelt. Aus Abb.6 ist ersichtlich, dass innerhalb von rund 15 Minuten die gesamte Galantaminmenge in die Liposomen migriert und dass sowohl für die Wirkstoffaufnahme als auch für die Wirkstoffrückhaltung innerhalb der Liposomen eine Inkubationstemperatur im Bereich der Raumtem- peratur (18-22 °C) günstig ist. Die für einen Bereich von 22-40 °C ermittelten Unterschiede sind aber gering und spielen jedenfalls keine signifikante Rolle. Der negative Einfluss höherer Inkubationstemperaturen scheint sich in erster Linie auf die Stabilität der beladenen Liposomen auszuwirken, wobei bei 5 einer Temperatur von 60 °C der Wirkstoff Verlust nach 3 h Inkubation bereits in einem Bereich von ca. 20 - 25% liegt (Abb.6).

Um eine Erhöhung der Menge an liposomal eingeschlossenem Galantamin zu erreichen, wurde eine Lösung mit 8 - 10 mg Galantamin pro ml Lösung vor-10 bereitet. Wie aus Abb.7 ersichtlich, kann jedoch ein Überschuss an Galantamin (dunkle Balken; linke Ordinate) das Verhältnis Wirkstoff/Lipid nicht verbessern, welches in diesem Versuch bei etwa 200 - 300 nmol Galantamin je /ymol Lipid konstant bleibt (helle Linie zwischen den Dreieckssymbolen; rechte Ordinate). Die effektive Beladungsmenge bei aktiver externer Beladung über einen pH-15 Gradienten scheint also in erster Linie vom Gradienten und weniger von der vorgelegten Wirkstoffkonzentration abhängig zu sein.

Variante IV:

Nach erster Auswertung der vorangegangenen Resultate wurde ein einstufiges 20 Herstellungsverfahren etabliert. Die Lipide (DPPC : Cholesterol = 55 : 45 Mol%) wurden in Ethanol gelöst und die Lösung in eine Galantamin-HBr/Zitro-nensäurelösung (pH 3,5 - 4,5) injiziert, worauf unmittelbar nach spontan erfolgter Vesikelbildung eine Natriumcarbonat/Zitronensäure-Pufferlösung (pH 9,0 - 9,5) zwecks Verdünnung und Alkalisierung der Reaktionsmischung, d.h. 25 der entstandenen Liposomensuspension, zugesetzt wurde. Durch die Herstellung dieses pH-Gradienten unmittelbar nach der Vesikelbildung wird Galantamin nicht nur in einem Schritt in die Liposomen aufgenommen, sondern dort auch stabil zurückgehalten. Die Menge an solcherart liposomal aufgenommenem Galantamin lag - abhängig vom pH-Wert bzw. pH-Gradienten - in einem 30 Bereich von mindestens 100 nmol Galantamin pro μηηοΙ Lipid, vorzugsweise in einem Bereich von mindestens 150 - 400, beispielsweise bei einem pH-Wert von 3,5 häufig im Bereich von 250 bis 350 (Abbildungen 8-11). Die Stabilität dieses Produkts blieb über einen Beobachtungszeitraum von 6 Wochen voll- ständig erhalten (siehe Abb.8).

Beispiel 2: Herstellung und Vergleich von Galantamin-Präparaten in Form von Liposomen oder Mikroemulsionen mit variabler Lipidzusammensetzung 5

In diesem Beispiel wurden als Lipide synthetisches Dipalmitoylphosphatidyl-cholin (DPPC, Genzyme, Schweiz), Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC, Genzyme, Schweiz) und Cholesterol (Solvay, Niederlande) verwendet. Galantamin (Sanochemia AG, Austria) wurde als HBr-Salz für die liposomalen 10 Einschlussstudien verwendet. Als Pufferlösung wurde Zitronensäure/Natrium-carbonat eingesetzt.

Als zweite Möglichkeit der aktiven Beladung wurde die Ammoniumsulfat-Gra-dienten-Methode angewandt. Als wässrige Phasen für die Vesikelherstellung 15 wurden eine Ammoniumsulfatlösung und eine Glucoselösung eingesetzt. Dabei wurde abermals die Kreuzstromtechnik verwendet. Nach Entfernung von nichteingeschlossenem Galantamin mittels Gelfiltration, wurden sowohl die Wirkstoff- als auch die Lipidgehalte mittels rp-HPLC bestimmt. Liposomengrösse und -Verteilung wurden wiederum mittels Photonenkorrelationsspektroskopie 20 (PCS) bestimmt.

Neben Liposomen wurden auch Präparate in Form von Mikroemulsionen durch kräftiges Mischen bei stufenweiser Erhitzung mit mehreren Heizzyklen (Erhitzung bis 80°C) hergestellt. Als Ölphase wurde Isopropylmyristat (IPM) 25 eingesetzt. Tween und Span 20 kamen als Emulgator und Co-Emulgator zum Einsatz.

Liposomendesign und Stabilität :

Liposomenherstellung, Beladung und Analyse wurden wie in Beispiel 1 durch-30 geführt. Stabilitätstests von Liposomenproben mit einem molaren Lipidverhältnis DPPC : Cholesterol = 55 : 45 wurden fortgeführt. Ergebnisse sind in den Abbildungen 9A und 9B dargestellt. ·♦ • 9 9 ·· ·♦·· · • ·· • · • 9 - T7 -: ♦ · · ·· *#·· • · · • · · · « • · · # • «

Abb.9A zeigt Stabilitätsdaten der ersten erfolgreich nach der aktiven Methode mit Galantamin beladenen Liposomenprobe (dreistufiges Verfahren). Die Liposomen wurden in Gegenwart von 0,3 mol Zitronensäure (pH 3,5 - 4,5) hergestellt. Nach erfolgter Vesikelbildung wurde Galantamin zugesetzt und gleich-5 zeitig der pH-Wert der Lösung ausserhalb der Liposomen auf 7,5 angehoben. Der dadurch entstandene pH-Gradient zwischen der Innen- und Aussenseite der Liposomen führte zur Aufnahme von Galantamin in die Liposomen, in Abhängigkeit von der H+-lonenkonzentration innerhalb der Liposomen. 10 Abb.9B zeigt Stabilitätsdaten von Liposomenproben ähnlicher Zusammensetzung, wobei jedoch die Vesikelbildung und Galantaminbeladung unter Anwendung der Kreuzstromtechnik in einem einstufigen Verfahren erfolgten. Die Daten zeigen deutlich, dass der pH-Gradient und damit der Gehalt an liposomal eingeschlossenem Galantamin über einen Zeitraum von mehr als einem halben 15 Jahr konstant geblieben ist.

Zur Ermittlung der besten Liposomenformulierung in Bezug auf Membranflexibilität und die damit verbundenen Hautpenetrationseigenschaften wurden verschiedene Liposomensuspensionen mit unterschiedlicher Lipidzusammen-20 Setzung vorbereitet und getestet. Dabei wurden in erster Linie Phospholipide, gegebenenfalls in Kombination mit Cholesterol, eingesetzt. Es liegt jedoch im Rahmen der Erfindung, Phospholipide durch andere Lipide zu ersetzen oder zu ergänzen, beispielsweise durch Glykolipide, Cerebroside, Sulfatide oder Galac-toside. Typische Vertreter der einsetzbaren Lipide sind z.B. Phosphatidyletha-25 nolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phospha-tidylglycerol, Cardiolipin, Sphingomyeline, Plasmalogene, Glyceroglykolipide, Ceramid, Glykosphingolipide, neutrale Glykosphingolipide.

Eine Möglichkeit, die für transdermale Applikationen bedeutsame Membran-30 fluidität zu verbessern, besteht darin, den Phasenübergang der liposomalen Doppelschichtmembran zu reduzieren, welcher vornehmlich durch die Länge der Acylketten der Phospholipide, die Menge an Cholesterol und die Sättigung der Phospholipide bestimmt wird. Aus diesem Grunde wurde DPPC, ein Phos- pholipid mit einer Acylkettenlänge von 16 Kohlenstoffatomen, durch DMPC (Kettenlänge von 14 Kohlenstoffatomen) ersetzt, welches die Schmelztemperatur TM von ca. 45°C auf 31 °C erniedrigt. 5 Abb.10 zeigt Einschlussraten solcher Liposomensuspensionen, die mittels pH-Gradienten von 3,5 - 7,5 und von 4,0 - 7,5 hergestellt wurden. Nachdem zufriedenstellende Einschlussraten (vergleichbar mit jenen bei Verwendung von DPPC) erzielt wurden, wurden Proben genommen und auf ihre Stabilität hin geprüft (Abb.10). 10

Eine zweite Möglichkeit, die Membranrigidität zu senken und die Fluidität zu erhöhen besteht darin, den Cholesterol-Anteil in der Membran zu vermindern. Ausgehend von einem Verhältnis DPPC : Cholesterol von 55 : 45 Mol% (wie in der Literatur für Liposomenbeladung beschrieben), wurde die Cholesterolmen-15 ge sukzessive auf 38 bzw. 30 %, bezogen auf den Gesamtlipidgehalt, reduziert. In Abb.11 kann eine leichte Abnahme der Galantaminbeladung festgestellt werden, im Vergleich zu früheren Daten mit höheren Cholesterol-Gehalten. Diese Liposomen zeigten jedoch verbesserte Hautpenetrationseigenschaften, wie weiter unten noch beschrieben wird. Abb.11 zeigt ausserdem, 20 dass die beladenen Liposomen im Langzeitversuch stabil blieben und kein Galantamin verloren.

Entgegen Erkenntnissen aus früheren Arbeiten konnten auch cholesterolfreie Liposomen stabil hergestellt und erfolgreich mit Wirkstoff beladen werden, 25 sodass erfindungsgemäss der Cholesterolgehalt in einem Bereich von 0 - 50 Mol%, bezogen auf den Gesamtlipidgehalt, liegt.

Eine dritte Möglichkeit, liposomale Membranen flexibler zu machen, besteht darin, die voll gesättigten DPPC- oder DMPC-Lipide durch Hühnerei-Phospha-30 tidylcholin (E-PC), eine natürliche Lipidmischung mit ungesättigten Phospholipiden, zu ersetzen. Neben Stabilitätsproblemen bei Verwendung dieser natürlichen Lipide war es ausserdem erforderlich, die Liposomen unter Stickstoffatmosphäre herzustellen. Trotzdem ergaben diese Vesikel weder gute Resul- » • ···· · ·· · ·· · - T9 • · I · 4P 4*44 4 * 4 444 *44 « • · täte in Bezug auf die Vesikelgrösse und -homogenität, noch Verbesserungen in den Hautpenetrationseigenschaften, wie in den Beispielen 3-10 beschrieben.

Neben der Zitronensäure/Natriumcarbonat-Technik zur Erzeugung eines pH-5 Gradienten wird auch die Ammoniumsulfat-Gradientenmethode häufig angewandt. Mit dieser Methode werden Liposomen in Gegenwart eines Ammoniumsulfatpuffers (125 mmol) gebildet. Nach der Vesikelbildung wird die Ammoniumsulfatlösung ausserhalb der Liposomen mittels Diafiltration durch eine 5% Glucoselösung ersetzt, wodurch kleine amphiphile Moleküle in die Liposomen 10 geladen werden können und dort protoniert werden, während im Gegenzug NH3 aus den Liposomen entweicht. Dieser Vorgang stellt bekanntlich das mildere Verfahren gegenüber dem Zitronensäure/Natriumcarbonat-Verfahren dar. 15 Dennoch ergaben diese Versuche, jedenfalls bei Verwendung von Galantamin als Wirkstoff zur Beladung der Liposomen, keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Die Daten in Abb.12 zeigen, dass der Galantamineinschluss fehlgeschlagen ist, da im Retentat und im Filtrat gleiche Mengen an Wirkstoff aufgefunden werden konnten. Daher ist für den Einschluss von Galantamin in Liposo-20 men die Zitronensäure/Natriumcarbonat-Methode für die externe, aktive Beladung vorzuziehen, wobei es allerdings im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt, auch alternative, dem Fachmann bekannte, funktionell äquivalente Säure/Base-Systeme zur Ausbildung des gewünschten pH-Gradienten einzusetzen. So könnte Zitronensäure durch eine andere geeignete, pharmazeutisch 25 zulässige Säure, beispielsweise eine Mineralsäure wie Phosphorsäure, oder vorzugsweise durch eine organische Säure, insbesondere aus der Gruppe der essbaren organischen Säuren, wie z.B. Äpfelsäure, Fumarsäure, Weinsäure, gegebenenfalls auch Ascorbinsäure, ersetzt werden. Gleichermassen könnte auch Natriumcarbonat durch eine andere Base, insbesondere durch ein anderes 30 Alkali- oder Erdalkalicarbonat oder -bicarbonat ersetzt werden.

Unter "funktionell äquivalent" ist in diesem Zusammenhang die Fähigkeit zu verstehen, über die Lipiddoppelschichtmembran der Liposomen hinweg einen M • «·«« · ·« ··*· • f M • ·· ♦ · • • • • -2e-: • 1 «·« • • • • • • • • · · • • pH-Gradienten ausbilden zu können und dabei die Membranintegrität nicht zu zerstören, sodass eingeschlossener, insbesondere protonierter, Wirkstoff stabil - im Sinne der hierin offenbarten Stabilitätskriterien - in den Liposomen verbleibt. 5

Herstellung und Stabilitätsprüfung eines Galantamin-Liposomengels:

Zur Anwendung einer liposomalen Galantaminzusammensetzung als topisch einzusetzendes Therapeutikum werden die Liposomen bevorzugt in ein Hydrogel eingemischt, welches leichter auf die Haut aufzutragen ist, als eine reine 10 Suspension. Es liegt jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, auch andere galenische Formulierungen für die Galantamin-Liposomen herzustellen und topisch anzuwenden, insbesondere Formulierungen in Form von Lösungen, Lotions, Emulsionen, Tinkturen, Sprays, Salben, Cremes oder gegebenenfalls auch in Form imprägnierter textiler Gewebe oder Verbandsmaterialien. Dem 15 Fachmann auf dem Gebiet sind weitere Möglichkeiten vertraut, ebenso wie die dazu erforderlichen, pharmazeutisch zulässigen Begleit- und Zusatzstoffe zur Herstellung der verschiedenen galenischen Formulierungen.

In früheren Experimenten bewährt hat sich beispielsweise Carbopol 981 NF, ein 20 Hydrogel, welches in sehr geringen Konzentrationen eingesetzt werden kann. Es ist für den pharmazeutischen Einsatz zugelassen, relativ billig zu erwerben und in grossen Mengen verfügbar.

Folgende Liposomengele wurden für die Penetrationsstudien mit der Franz-25 Diffusionszelle hergestellt: DPPC:Cholesterol = 55:45/pH3,5 DPPC: Cholesterol = 62:38/pH3,5 DPPC: Cholesterol = 70:30/pH3,5 DMPC: Cholesterol =55:45/pH3,5 30 E-PC: Cholesterol =63:38/pH3,5 E-PC: Cholesterol =70:30/pH3,5

Zu diesem Zweck wurden die Vesikelsuspensionen durch Ultrafiltration konzentriert und nachfolgend unter Rühren mit einer vorgefertigten, sterilen Gel- ·* • • • t· ···· · • ·· «t • t ··«· • • • • -äi -: t » III • • • Ml • • • • t * 1 • • basis vermischt. Bei dieser Methode können die liposomalen Galantaminkonzentrationen entweder über die Ultrafiltration oder über die Anfangskonzentration der Gelbasis, die mit der Vesikelsuspension auf eine Carbopolkonzentration von 0,5 % verdünnt wird, variiert werden. 5

Standardmässig wurde auf allfälligen Wirkstoffverlust, der von Membranschädigungen während des galenischen Produktionsverfahrens und/oder von der Langzeitlagerung herrühren könnte, getestet. Für diesen Zweck wurde das Gel mit Puffer verdünnt und filtriert. Im Falle von Membranbeschädigungen wären 10 grössere Mengen an freigesetztem Galantamin im Filtrat nachweisbar. Wie aus den Abbildungen Abb.13A und Abb.13B ersichtlich, wird weder während der galenischen Formulierung noch während der nachfolgenden Lagerung über 19 Wochen bei 4°C ein signifikanter Anteil an Wirkstoff freigesetzt. Vielmehr verbleibt der Wirkstoff in den Liposomen auch nach der galenischen Formu-15 lierung mit Carbopol-Hydrogel und er zeigt ein gleichbleibendes Penetrationsprofil im Hauttest, was beweist, dass sowohl die Liposomen als auch der pH-Gradient in der Gelmatrix intakt geblieben sind. Für einen Vergleich bezüglich der Hautpenetrationseigenschaften wurde auch 20 freies Galantamin auf die gleiche Art und Weise mit Hydrogel vermischt und getestet. Ergebnisse werden in den Beispielen 3 bis 10 präsentiert.

Alternative Konzepte:

Neben Liposomen haben auch Mikroemulsionen in den letzten Jahren verstärkt 25 Aufmerksamkeit für topische Anwendungen bestimmter Wirkstoffe auf sich gezogen. Mikroemulsionen sind Dispersionen zweier miteinander nicht mischbarer Komponenten, die durch eine dritte, amphoterische Komponente stabilisiert werden. Aufgrund der Anwesenheit oberflächenaktiver Substanzen wie Emulgatoren und Co-Emulgatoren können Mikroemulsionen die Haut jedoch auf 30 ähnliche Art und Weise schädigen wie transdermale Pflaster.

Nach vorausgegangenen Literaturstudien wurden mehrere Mikroemulsionen (Tab.1) mit Galantamin als Wirkstoff hergestellt und anschliessenden Penetrationstests mit der Franz-Diffusionszelle unterzogen (Resultate siehe Beispiele 3 -12 ···· ► · · · ♦ «·» ♦ bis 10).

Tabelle 1: Mikroemulsionen Lecithin ME W/0 ME O/W ME 10 ml IPM 7,2 ml IPM 5,5 g H20 1,9 g SPC 0,2 g Chol 2,5 g IPM 135 μ\ H20 0,5 g H20 2 g Tween/Span20 10 mg Gal 2g Tween/Span20 11 mg Gal-HBr 10 mg Gal 5 mg Gal ME = Mikroemulsion; W/O = Wasser in Öl; O/W = Öl in Wasser 5 In allen hierin beschriebenen Versuchen zeigte sich, dass lediglich eine Verminderung des Cholesterolgehalts in der Liposomenmembran eine Verbesserung der transdermalen Pentrationseigenschaften mit sich brachte. Die angefertigten Liposomensuspensionen und liposomalen Gelpräparate sind bereits seit mehr als einem halben Jahr stabil und zeigen keine Veränderungen in den Produkt-10 eigenschaften.

Beispiele 3 -10: Hautpenetrationstests unterschiedlicher lipid-basierter Galantaminpräparate 15 Franz-Diffusionszelle:

Die Diffusionszelle stammte von PermGear, USA. Die Ausrüstung umfasste drei Diffusionszellen, jede mit einem wassergefüllten Doppelmantel auf einer Rührerkonsole montiert und mit einem Wasserbad zur Temperatursteuerung verbunden. Die Zellen selbst haben ein Fassungsvolumen von je 8 ml, einen 20 Hauthalter mit einer Oberfläche von 0,78 cm2 und eine Aufgabekammer mit 2 ml Fassungsvolumen.

Hautintegritätstest:

Für die Tests in der Franz-Diffusionszelle kam Schweinehaut zum Einsatz. Um 25 eine intakte Hautoberfläche sicherzustellen wurde jedes Hautstück vor und nach dem Experiment getestet. Nach Befestigung der Haut auf dem Hauthalter der Diffusionszelle wurden 2 ml Puffer auf die Haut aufgebracht und auf 32 °C ·#»·

»»« ♦ ± 1 temperiert. Nach 30 Minuten wurde die elektrische Leitfähigkeit, ein Mass für den Hautwiderstand und die Hautqualität, gemessen. Der Messwert hängt ab vom Ursprung der Haut, ihrer Dicke, dem verwendeten Puffersystem und der für die Messung verwendeten Ausrüstung. Auf der Basis mehrerer Grund-5 experimente wurde ein Grenzwert für die elektrische Leitfähigkeit der intakten Haut von < 1 mS/cm2 vor dem Aufträgen einer Probe festgelegt. Hautproben, die diese Anforderung nicht erfüllten, wurden für die Penetrationsexperimente nicht zugelassen. 10 Penetrationspuffer:

Nachdem die erfindungsgemässen Liposomen in 0,3 M Zitronensäurepuffer, eingestellt auf pH 7,5 mit 1 M Natriumcarbonatlösung, hergestellt wurden, wurde derselbe Puffer auch für alle Penetrationsversuche eingesetzt. 15 Probenbehandlung nach dem Pentrationsversuch:

Nach jedem beendeten Experiment wurde der Überschuss an Galantamin-Probe durch Waschen der Oberfläche mit Puffer entfernt. Danach wurde nochmals die elektrische Leitfähigkeit gemessen und die Hautprobe vom Halter entfernt. Zum Zwecke der Trennung der Epidermis (Oberhaut) von der Dermis (Leder-20 haut) wurde die Hautprobe auf eine elektrische Heizplatte gelegt und 30 Sekunden lang bei 60°C erwärmt. Nach dieser Wärmebehandlung kann die Epidermis ganz einfach mittels einer Pinzette abgehoben werden. Unmittelbar danach wurden Epidermis und Dermis jeweils getrennt voneinander in Plastikröhrchen überführt und bei -20°C eingefroren. Zur Galantaminextraktion wur-25 den 300 μΙ Puffer zur gefrorenen Probe in Gegenwart von flüssigem Stickstoff hinzugefügt und die tiefgefrorene Probe anschliessend in einer Kryo-Mühle pulverisiert. Das Pulver wurde sogleich in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei 4°C zentrifugiert, worauf der klare Überstand in ein sauberes Röhrchen transferiert und erneut bei -20°C bis zum Beginn der Analyse eingefroren 30 wurde. • · · · · ·

Quantifizierung des Galantamin-Überstandes:

Zur Bestimmung kleiner Mengen an Galäntamin wurde eine modifizierte, empfindlichere und schnellere rp-HPLC-Methode etabliert: HPLC: Agilent 1100 5 Säule: Thermo Hypersil Keystone 150 x 4,6 mm, 5μηι, 190A Gradient: linearer Gradient

Lösungsmittel A: H20/0,1%TFA

Lösungsmittel B: ACN/0,1%TFA 10 Detektion: DAD, 230nm

Quantifikationsbereich: 30 - 1000 ng/ml Injektionsvolumen: 100μΙ

Testmaterial: 15 Mehrere Proben mit unterschiedlichen Galantaminformulierungen wurden getestet. Änderungen im Aufgabevolumen und Penetrationsdesign wurden vorgenommen und sind in den Ergebnissen zusammengefasst.

Material: liposomale Galantaminsuspensionen: 20 C16/3,5/(55/45) 014/3,5/(55/45) liposomale Galantamingele: 016/3,5/(55/45) 016/3,5/(62/38) 25 016/3,5/(70/30) 014/3,5/(55/45) E-PC/3,5/(62/38) E-PC/3,5/(70/30) freie Galantamingele: 30 2 - 20 mg/g Gel

Galantamin-Microemulsionen:

Lecithin-ME (1 mg/ml) • · · MM • · ·· 9 52$ - MM • · ·

Wasser/Öl (W/0) - ME (1 mg/ml) Öl/Wasser (0/W) - ME (1,6 mg/ml)

Die verschiedenen liposomalen Galantaminformulierungen wurden unter Zuhil-5 fenahme der Kreuzstrominjektionstechnik hergestellt. Das Material wurde sowohl in Suspension als auch in einer Carbopol(981 NF)-Gelmatrix getestet. Variationen in der Membranzusammensetzung der Liposomen wurden durch den Einsatz verschiedener Lipide und unterschiedlicher Cholesterol-Gehalte (siehe Beispiele 1 und 2) erhalten. 10 Die nachfolgenden Penetrationsstudien wurden mit verschiedenen Probenvolumina, einfachen und mehrfachen Probenaufgaben durchgeführt, wobei in zeitlichen Abständen Proben zur Galantaminbestimmung genommen wurden. Die in den Abbildungen 14 bis 21 dargestellten Resultate basieren jeweils auf einem dreifachen Penetrationsexperiment. Die Diagramme zeigen die Resultate 15 in ng Galantamin absolut je analysierte Probe.

Die Ergebnisse werden unterteilt in Werte, die aus der Rezeptorflüssigkeit REZ ( = im Auffangbehälter gesammelte, durch die Haut penetrierte Flüssigkeit) und jene, die aus der Epidermis (EP) bzw. Dermis (DER) heraus bestimmt wurden. 20 Beispiel 3:

In Beispiel 3 werden die Ergebnisse verschiedener DPPC (C16)-Liposomen mit unterschiedlichen Cholesterolgehalten jenen von DMPC (C14)-Liposomen und E-PC-Liposomen gegenüber gestellt. Es wurde ein Probenvolumen von 50 μΙ einmal aufgetragen und über einen Zeitraum von 4 Stunden penetrieren gelas-25 sen. Alle getesteten Präparate wiesen vergleichbare Mengen an eingeschlossenem Galantamin auf und waren in 0,5% Carbopol 981 NF suspendiert. Die effektivste Formulierung in diesem Versuch war die Probe mit der C16/70/30 (Acylkettenlänge / Mol% Phospholipid / Mol% Cholesterol) Lipidzusammensetzung. In diesem Gel betrug die Cholesterolkonzentration in den Liposomen 30 30 Mol%. Die beiden anderen Präparate hatten wesentlich höhere Cholesterolanteile (38 bzw. 45 Mol%) und waren daher auch wesentlich rigider. Die aus diesem Versuch ermittelten Daten bestätigen die Theorie, dass stärker fluide Liposomen, d.h. weniger rigide Membranen, effizienter penetrieren (Abb.14). • · c · ?2»-s ln Abb.14 bedeuten: 1 = C16/55/45; 2= C16/62/38; 3= C16/70/30; 4= C14/55/45; 5= E-PC/62/38; 6= E-PC/70/30.

Beispiel 4: 5 In Beispiel 4 wurden die Penetrationseigenschaften von Gelproben nach wiederholter Aufbringung auf die Haut untersucht. Verglichen wurden zwei verschiedene Gele mit unterschiedlicher Lipidzusammensetzung bei gleichem Cholesterolgehalt. Die Proben wurden je dreimal ä 50 μΙ aufgetragen und zwar im Abstand von 4 Stunden. Überschüssiges Material wurde jeweils vor Aufbrin-10 gung der nächsten Probe entfernt.

Wie aus dem Diagramm (Abb. 15) ersichtlich, konnte zwar zum Schluss eine Erhöhung der Galantaminkonzentration erreicht werden, doch scheint die Penetration in die Epidermis bei dreimaligem Aufträgen des Materials irgendwie 15 behindert oder gebremst zu werden. Möglicherweise handelt es sich dabei um eine Art Sättigung, hervorgerufen durch das kleine Oberflächenareal des eingespannten Hautstücks in Kombination mit den hohen Anwendungsdosen. Es wurden für beide Proben vergleichbare Resultate erzielt, sodass ein Einfluss der Lipidzusammensetzung nicht offensichtlich erkennbar war (Abb. 15). 20 In Abb. 15 bedeuten: (Kettenlänge/Phospholipid/Cholesterol/Probenmenge gesamt) 1 = C16/55/45/50μΙ; 2= C16/55/45/100μΙ; 3= C16/55/45/150μΙ; 4= C14/55/45/50μΙ; 5= CI4/55/45/100μΙ; 6= C14/55/45/150μΙ; 25 Beispiel 5:

In Beispiel 5 wurden Gele mit C16-Liposomen mit hohen und niedrigen Cholesterolgehalten nach einmaligem Aufträgen miteinander verglichen. Probenvolumina von 150 μΙ und 50 μΙ wurden 4 bzw. 10 Stunden lang penetrieren gelassen. Die höchsten Galantaminmengen in der Haut wurden erneut bei Anwen-30 düng von Liposomen mit niedrigem Cholesterolgehalt gefunden. Auch hier scheinen niedrige Dosierungen vorteilhafter zu sein. Nach 4 und 10 Stunden wurden in der Epidermis dann hohe Galantaminmengen gefunden, wenn 50 μΙ eingesetzt wurden. Diese Resultate bestätigen die Werte, die in den Beispielen 3 und 4 erzielt wurden, d.h. die Verabreichung von Liposomen mit niedrigen Cholesterolgehalten bei gleichzeitig geringer Applikationsmenge insgesamt, könnte eine günstige Strategie bei der topischen Anwendung der erfindungs-5. gemässen Präparate im prophylaktischen oder therapeutischen Einsatz darstellen (Abb.16).

Dabei bedeuten in Abb.16: (Kettenlänge/Phospholipid/Cholesterol/Probenmenge/Penetrationsdauer) 1 = C16/55/45/150pl/4h; 2 = C16/70/30/150pl/4h; 3 = C16/55/45/50pl/4h; 10 4 = C16/70/30/50pl/4h; 5 = C16/55/45/150μΙ/1 Oh; 6 = C16/70/30/150μΙ/10h; 7 = C16/55/45/50μΙ/10h; 8 = C16/70/30/50μΙ/10h;

Beispiel 6:

In Beispiel 6 wurde der Einfluss der Gelkonzentration im Zusammenhang mit 15 drei verschiedenen Konzentrationen an freiem, in dem Gel suspendierten, Galantamin untersucht. 50 μΙ jeder Formulierung wurden einmal aufgetragen und das Penetrationsexperiment über 4 bzw. 10 Stunden durchgeführt (Abb. 17). Die ersten drei Balken in Abb. 17 repräsentieren die Ergebnisse mit 1% Carbopol 981 NF nach 4 h, die nächsten drei Balken jene mit 0,5 % Carbopol 981 NF 20 nach 10 h. Die Ergebnisse nach 4 h zeigen, dass freies Galantamin relativ schnell in das Hautgewebe diffundiert. Allerdings, wie an den 10 h-Werten erkennbar, wurde der freie Wirkstoff auch in hoher Konzentration in der Rezeptorflüssigkeit gefunden, sodass nur ein geringfügiger Depoteffekt zu erwarten ist (Abb. 17). 25

Beispiel 7:

In Beispiel 7 wurden verschiedene Applikationsstrategien getestet. Aus der Literatur ist bekannt, dass Mikroemulsionen als Trägersysteme für die Verabreichung von kleinen amphiphilen Molekülen nützliche Werkzeuge sein können. 30 Um dieses Konzept zu überprüfen, wurden verschiedene Mikroemulsionen (Lecithin; Wasser in Öl; Öl in Wasser) mit jeweils 1 mg Galantamin je ml hergestellt (siehe Beispiele 1 und 2).

Probenvolumina von 50 μΙ wurden je einmal aufgetragen und die Penetration wurde über eine Zeitraum von 4 h durchgeführt. Wie aus dem Diagramm (Abb.18) ersichtlich, waren die absoluten Galantaminmengen in der Haut niedriger als bei Verwendung des Hydrogels mit Liposomen. Ausserdem wurde 5 der Wirkstoff gleichermassen in Dermis (Lederhaut) und Rezeptorflüssigkeit verteilt, was darauf schliessen lässt, dass eine rasche Penetration bei bestenfalls marginaler Speicherung im Hautgewebe stattgefunden hat (Abb.18).

Diese Erkenntnisse stehen in Einklang mit jenen anderer Autoren und deuten auf einen ähnlichen Penetrationsmechanismus wie bei Verwendung von trans-10 dermalen Galantaminpflastern hin.

Beispiel 8:

In Beispiel 8 wurden die Ergebnisse mit freiem Galantamin in Hydrogel und Mikroemulsionen mit jenen der bevorzugten Liposomenzusammensetzung 15 (C16-Phospholipide mit geringem Cholesterolanteil) verglichen. In allen Versuchen wurden vergleichbare Galantaminkonzentrationen unter ähnlichen Bedingungen untersucht.

Wie aus dem Diagramm (Abb. 19) ersichtlich, wurden bei Verwendung der 20 Hydrogelformulierung mit freiem Galantamin beträchtliche Galantaminmengen in der Haut gefunden. Akzeptable Werte wurden auch mit der Liposomenfor-mulierung erhalten, weniger hingegen mit den Mikroemulsionen. Jedoch ist -wie schon in vorangegangenen Beispielen erläutert - das Ziel einer neuen topischen Wirkstoffformulierung nicht in erster Linie eine schnelle Hautpene-25 tration sondern vielmehr die Fähigkeit, ein Wirkstoffdepot in der Haut aufzubauen, aus welchem der Wirkstoff verzögert freigesetzt werden kann. Ein solches Depot könnte einerseits die Häufigkeit der Anwendung reduzieren und andererseits eine gleichmässigere, kontrollierte Abgabe des Wirkstoffes bewirken, was den therapeutischen Effekt steigern würde. Dies wird dann erreicht, 30 wenn der Wirkstoff - wie im Fall der erfindungsgemässen liposomalen Formulierungen - in den oberen Hautschichten und nicht in tieferen Bereichen gespeichert wird. • ·«·· • 0 0 09·· • • · 0 · 2$ • _ · • • t * · • • • 0 · 00 0 0 * •

Es bedeuten in Abb.19: 1 = Liposomen (CI 6/70/30); 2= 1,8 mg Galantamin frei in Hydrogel; 3= 1,8 mg frei in Lecithin-Mikroemulsion; 4= 1,8 mg frei in W/O-ME; und 5= 1,8 mg frei in 0/W-ME 5

Beispiel 9:

In Beispiel 9 wurden liposomale Formulierungen in Suspension und in Hydrogel mit einander verglichen. Die Verabreichung eines Überschusses von 1 ml lipo-somaler Suspension über einen Zeitraum von mindestens 24 h führte lediglich 10 zu geringer Penetrationswirksamkeit (Abb.20). Es scheint sich also zu bestätigen, dass eine geeignete Gelmatrix nicht nur die Liposomen stabilisiert und das Aufbringen angenehmer und bequemer macht, sondern auch die Liposomen näher an die Haut heran bringt und so die Penetrationswirkung erhöht.

Es bedeuten in Abb.20: 15 (Kettenlänge/Phospholipid/Cholesterol/Probenmenge/Penetrationsdauer/Art) 1 = C16/55/45/1 ml/24h/Suspension; 2= C14/55/45/1 ml/24h/Suspension; 3= C16/55/45/100pl/8h/Gel; 4 = C14/55/45/100pl/8h/Gel;

Beispiel 10: 20 Im allgemeinen scheint das in-vitro-Testen mittels der Franz-Diffusionszelle eine nützliche Methode für Penetrationsstudien mit verschiedenen liposomalen Formulierungen zu sein, auch wenn bestimmte Grenzen der Anwendbarkeit der Methode, speziell bei Einsatz liposomaler Gelformulierungen, zu Tage traten. Ausgehend von früheren Erfahrungen mit verschiedenen Liposomengels in vivo 25 war auch für die hierin beschriebenen in vitro-Penetrationstests zu erwarten, dass jedes Gel vollständig und ohne verbleibenden Überschuss an der Hautoberfläche in die Haut penetrieren kann. Dennoch ist es nicht gelungen, das Gel in den Experimenten mit der Franz-Diffusionszelle mit gleichem Erfolg zu verabreichen, In allen Versuchen blieb ein beträchtlicher Überschuss an Pro-30 benmaterial an der Hautoberfläche zurück. Dieser Nachteil hat vermutlich die Penetrationseffizienz negativ beeinflusst. Es ist daher zu erwarten, dass in vivo höhere Mengen an liposomalem Galantamin in die Haut penetrieren. ft ft 3i)-i . φ 9 9 • ·· ···· • ft · · · • · ···· • · · · · ft · ·

Immerhin wurden aber selbst in den hierin beschriebenen in vitro-Experimenten mit den diversen Liposomenformulierungen umgerechnet bis zu 1,8 x1016 Wirkstoffmoleküle je 0,78 cm2 Hautoberfläche in die Oberhaut (Epidermis) transportiert. 5

Um nachzuprüfen, ob eventuell die Hautentnahme mit dem Dermatom oder die Vorbehandlung der Haut für die beobachteten Applikationsprobleme verantwortlich sein könnte, wurden verschiedene Hautproben getestet (Abb.21). Anhand der Ergebnisse liess sich allerdings kein klarer Einfluss feststellen. Es 10 ist daher zu vermuten, dass die Haut selbst die erzielten Ergebnisse nicht wesentlich negativ beeinflusst hat.

Dabei bedeuten in Abb.21: 1 = Haut unbehandelt; Liposomen: 70/30 (Phospholipid/Cholesterol); 2= Haut mit Ethanol gereinigt; Liposomen: 70/30; 15 3= Haut mit Fettgaze behandelt; Liposomen: 55/45; 4= Haut mit Ethanol gereingt und mit Fettgaze behandelt; Liposomen: 55/45.

Jedenfalls lässt sich zusammenfassend sagen, dass liposomale Galantamin-Formulierungen in hydrophilem Gel eine vorteilhafte Darreichungsform darstel-20 len, wenn der Ort der Behandlung im dermalen Gewebe (Lederhaut) liegt, selbst wenn der Wirkstoff nur zweimal pro Tag auf die Haut aufgetragen wird. Durch die erfindungsgemässe, milde, nicht invasive und nicht hautreizende Anwendung des liposomal eingeschlossenen Wirkstoffes lässt sich ein beachtlicher Depoteffekt in der Epidermis und eine langsame, gleichmässige Frei-25 Setzung des Wirkstoffes in das darunter liegende dermale Gewebe erzielen.

Abkürzungen:

ACN DAD 5 DER DMPC DPPC E-PC E-PG 10 EP IPM NGF PBS REZ 15 rp-HPLC TFA 22. April 2004

vertreten durch: PATENTANWÄLTE

Acetonitril Diodenarraydetektor Dermis (Lederhaut)

Dimyristoylphosphatidylcholin Dipalmitoylphosphatidylcholin natürliches Phosphatidylcholin aus Eiern natürliches Phosphatidylglycerin aus Eiern Epidermis (Oberhaut)

Isopropylmyristat Nerve Growth Factor Phosphate Buffered Saline Rezeptorgefäss (Auffangbehälter) reversed phase High Performance Liquid Chromatography Trifluoressigsäure

Sanochemia Pharmazeut!ka AG

DIPL.-ING. MANFRED RFF.R DIPL'ING. REINHARD HEHENöEiuM

Dr. Karin Dungier (Ausweis-Nr. 419)

Claims (22)

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2. 22. April 2004 • · W$-2ÖiooO“pAT Sanochemia Pharmazeut!ka AG in Wien, AT . BEER & MEINER PATENTANWÄLTE KEG 1070 Wien, liadcngassc 8 PATENTANSPRÜCHE KD/A 1. Pharmazeutische Zusammensetzung auf der Basis eines in Liposomen eingeschlossenen Wirkstoffes zur topischen, transdermalen Applikation, 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen in ihrem Innerenjin saures, wässriges Milieu aufweisen und darin mindestens einen Cholinesterase-Hemmer, vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin, Galantamin, Physostigmin, Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder 10 ein Enantiomer oder Derivat zumindest einer dieser Verbindungen, enthalten.
3. 2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des wässrigen Milieus innerhalb der Liposomen in einem Bereich von 2,5 - 5,5, insbesondere in einem Bereich von 3,5 - 4,5 liegt. 15
4. 3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Milieu innerhalb der Liposomen eine organische Säure, insbesondere Zitronensäure, enthält.
5. 4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ausserhalb der Liposomen ein Milieu mit neutralem oder alkalischem pH-Wert, vorzugsweise einem pH-Wert von 7 bis 8, insbesondere einem pH-Wert von 7,5 vorliegt.
6. 5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen unilamellar sind und eine Lipid-Doppel-schichtmembran aufweiseri.
7. 6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch 30 gekennzeichnet, dass die Liposomen Phospholipide mit einer Acylkettenlänge von mindestens 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von mindestens 16 Kohlenstoffatomen, enthalten. 0 00 ··** M · · · • · · M» * t « · · · · • · · ··· ·· ··*
8. 7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Cholesterol in einer Menge von 0 - 50 Mol%, vorzugsweise von 30 - 45 Mol%, der Gesamtlipide enthalten.
9. 8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen eine mittlere Grösse im Bereich von 150 bis 500 nm aufweisen.
10. 9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch 10 gekennzeichnet, dass die Liposomen den Wirkstoff in einer Konzentration von mindestens 100, insbesondere von 150 - 400 nmol je μηιοΙ Lipid enthalten.
11. 10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Suspension, Lotion, Emulsion, Tinktur, 15 oder eines Sprays, Gels, einer Creme oder einer Salbe, vorzugsweise in steriler Form, vorliegt.
12. 11. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung auf der Basis eines in Liposomen eingeschlossenen Wirkstoffes, dadurch 20 gekennzeichnet, dass durch Injektion einer ethanolischen Lipidphase in eine saure wässrige Phase spontan Liposomen mit einem sauren, wässrigen Milieu in ihrem Inneren erzeugt werden, worauf die wässrige Phase neutralisiert oder alkalisiert wird, sodass sich zwischen der Innen- und Aussenseite der Liposomen ein pH-Gradient ausbildet und wobei der Wirkstoff entweder 25 a) in der sauren wässrigen Phase vorgelegt und im Zuge der spontan erfolgenden Liposomenbildung in die Liposomen aufgenommen, oder b) erst nach erfolgter Vesikelbildung der wässrigen Phase zugesetzt wird und entlang des pH-Gradienten in die Liposomen migriert. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Usation oder Alkalisierung unmittelbar nach erfolgter Liposomenbildung imen wird.

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13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Phase vor der Neutralisation oder Alkalisierung einen pH-Wert von 2,5 - 5,5, vorzugsweise von 3,5 - 4,5 und danach einen pH-Wert von 7 - 8, vorzugsweise von 7,5, aufweist. 5
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die saure wässrige Phase eine organische Säure, insbesondere Zitronensäure, enthält und die Neutralisation oder Alkalisierung durch Verdünnen der wässrigen Phase mit einem alkalischen Puffer, 10 insbesondere mit Natriumcarbonat, vorgenommen wird.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidphase Phospholipide mit einer Acylkettenlänge von mindestens 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von mindestens 16 15 Kohlenstoffatomen, enthält.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidphase Cholesterol in einer Menge von 0 - 50 Mol%, vorzugsweise von 30 - 45 Mol%, der Gesamtlipide enthält. 20
17. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkstoff mindestens ein Cholinesterase-Hemmer, vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin, Galantamin, Physostigmin, Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, 25 Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder ein Enantiomer oder Derivat zumindest einer dieser Verbindungen, in der wässrigen Phase vorgelegt oder der wässrigen Phase nach erfolgter Liposomenbildung zugesetzt wird.
18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung mit den mit Wirkstoff beladenen Liposomen in Form einer Suspension, Lotion, Emulsion,

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    Tinktur, oder eines Sprays, Gels, einer Creme oder einer Salbe, vorzugsweise in steriler Form, hergestellt wird.
19. 19. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der 5 Ansprüche 1 bis 10 als Medikament zur topischen Anwendung auf der Haut.
20. 20. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikamentes mit Depotwirkung in der Haut, zur Prophylaxe und/oder Therapie des dermalen neuropathischen 10 Schmerzes oder des neurophatiebedingten Verlustes der dermalen sensorischen Funktion.
21. 21. Verwendung wenigstens eines Cholinesterase-Hemmers, vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin, Galantamin, Physostigmin, 15 Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder eines Enantiomere oder Derivates zumindest einer dieser Verbindungen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur topischen Applikation mit Depotwirkung in der Haut, zur Prophylaxe und/oder Therapie 20 des dermalen neuropathischen Schmerzes oder des neurophatiebedingten Verlustes der dermalen sensorischen Funktion.
22. 22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, zur Verminderung oder Vermeidung unerwünschter systemischer Nebenwirkungen. Sanochemia Pharmazeutika AG vertreten durch: Dr. Karin Dungier (Ausweis-Nr. 419) PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. Af ANFRED BEER DiPL-lNG. REINHARD HEBcKfiEttflS Mk