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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen und Isolieren von Mikroorganismen, insbe- sondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen präsentieren.
Screening-Methoden für Zellen- oder Phagen-Display-Bibliotheken stellen auf dem Gebiet der Genome einen Geschwindigkeits-bestimmenden Engpass dar. Effiziente Methoden zum Sortieren von Zellen sind entweder teuer oder mit dem Risiko verbunden, die Zellen, die gescreent und isoliert werden sollen, zu beschädigen.
Anderseits sind billigere Methoden oft mit hohen Hintergrund-Signalen verbunden, die zu Prob- lemen bei der Detektion von Mikroorganismen (Zellen, Phagen usw. ), an welchen ein Interesse be- steht, führen. Zumindest führen solche Methoden mit hohen Hintergrund-Signalen zu einem hohen Arbeitsaufwand bei der Analyse positiver Signale mit einer hohen Rate falsch positiver Ergebnisse.
Die Identifizierung von Organismen, an welchen ein Interesse besteht, mit Antikörpern ist ein allgemeines Verfahren bei solchen Screening-Systemen sowie bei der Identifizierung, Trennung, Züchtung und Manipulation solcher Mikroorganismen.
Beispielsweise ist es bekannt, dass die Markierung einer Ziel-Entität mit fluoreszierenden mo- noklonalen Antikörpern (MABs) oder Antikörpern, die mit Färbereagentien verbunden sind, ein Selektionsmittel zur Identifizierung von Ziel-Zellen ist. Wenn jedoch eine solche Identifizierung manuell oder mechanisch vorgenommen wird, müssen zahlreiche Tätigkeiten, die Inkubationen und Waschschritte mit umfassen, durchgeführt werden. Anstelle einer solchen direkten Markierung mit monoklonalen Antikörpern ist eine indirekte Analyse üblich, bei welcher die biologischen Ziel- Mikroorganismen zuerst mit einem spezifischen MAB markiert werden, welcher nicht markiert ist.
Nach ausgiebigem Waschen zum Entfernen von ungebundenem spezifischen MAB wird ein zwei- ter Antikörper zugegeben, der markiert ist und den ersten Antikörper erkennt. Obwohl jedoch solche indirekte Methoden noch spezifischer sind, erfordern sie beträchtliche Mengen an Reagen- zien und zahlreiche Tätigkeiten, die bei solchen Identifizierungsprozessen angewendet werden.
Es wurde vorgeschlagen, magnetische Teilchen zu verwenden, die einen Antikörper an ihre Oberfläche gebunden haben, welcher an spezifische Proteine oder Antigene binden kann (US 5,466,574 und US 6,013,532). Es wurde auch vorgeschlagen, dass dieses Verfahren zur Trennung von Zellen, Zellkomponenten oder Viren mit einer charakteristischen Determinante aus einer Testprobe verwendet wird, z. B. zum Entfernen seltener Zellen, zur Abreicherung natürlicher Killer-Zellen, zur Bestimmung von Reticulozyten, für Phagozytose-Tests, für Obsonisierungsunter- suchungen, zur Detektion spezifischer Tumorzellen oder zur immunspezifischen Isolierung von Monozyten, Granulozyten oder anderen Zelltypen.
Bisher wurde noch nicht vorgeschlagen, ein solches System spezifisch zum Screenen und Isolieren lebensfähiger prokaryontischer und euka- ryontischer Zellen, beispielsweise aus einer Bibliothek von Zellen, die eine Bibliothek von Antige- nen innerhalb eines Membranproteins aufweisen, zu verwenden. Tatsächlich wird die Lebensfähig- keit der Zellen bei den Methoden des Standes der Technik häufig während der Screening- und Isolierungsvorgänge gemäss einem solchen Stand der Technik stark verringert. Daraus ergibt sich, dass eine grosse Anzahl von Ziel-Mikroorganismen während solcher Vorgangsweisen verloren geht oder getötet wird.
C1q ist ein Plasmaprotein, das ständig in relativ hoher Konzentration (70 bis 80 mg/l) anwe- send ist und Teil des klassischen Weges der Komplement-Aktivierung ist. Das C1q-Protein-Molekül weist 6 kugelförmige "Köpfe" auf, von welchen jeder eine A-, B- und C-Polypeptidkette enthält und eine 81-Reste-Verlängerung trägt, die Teil eines zentralen, Kollagen-artigen Tripel-Helix-Schwan- zes ist (Eggleton et al., Trends in CELL BIOL. 8 (1998), S. 428-431). Es ist bekannt, dass C1q an erster Stelle an ein Antigen bindet, gefolgt von der Bindung von C1s und C1r an C1q (wodurch der C1-Komponenten-Komplex gebildet wird), gefolgt von einer seriellen Bindung der anderen Kom- plement-Komponenten C2-C9). C1q bindet an eine Reihe verschiedener Zelltypen, wodurch eine Anzahl verschiedener Immunantworten und Entzündungsreaktionen ausgelöst wird.
Es ist be- schrieben, dass die Wechselwirkungen von C1q mit humanen Neutrophilen, Eosinophilen, Blut- plättchen, Endothelzellen und B-Lymphozyten entzündliche Reaktionen und adaptive Immunant- worten beeinflussen. Es ist auch beschrieben, dass C1q eine Anzahl verschiedener Funktionen in Fibroplasten moduliert.
Eine der wichtigeren biologischen Rollen von C1q ist die Erkennung von Antigen/Antikörper- Komplexen. C1q bindet an solche Komplexe, wenn ein Antigen an der äusseren Oberflächenmemb- ran eines pathogenen Bakteriums von einem Antikörper erkannt wird. Wenn C1q an solche
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Immunkomplexe bindet, führt die Aktivierung der anderen Komponenten-Faktoren durch diesen Bindungsvorgang zu einem Enzymkomplex an der Bakterienmembran, der zu einem Angriff und der Perforierung der Bakterienzellwand (Membran) und zur Lyse des Bakteriums führt.
Obwohl von C1q bekannt ist, dass es für Antikörper/Antigen-Immunkomplexe hoch spezifisch ist und es auch in Substanz-konjugierter Form zur Bestimmung oder Detektion eines spezifischen Antigens in einer Körperflüssigkeit oder in anderen biologischen Flüssigkeiten verwendet wurde, wurde noch nie vorgeschlagen, C1q bei einem Verfahren zum Isolieren lebensfähiger prokaryontischer und euka- ryontischer Zellen einzusetzen. Auf der Ebene der Zelldetektion wurden C1q oder C1q-Reagenzien verwendet, damit sie an fixierte und immobilisierte Zellen binden, um Oberflächen-Antigen oder intrazelluläre Substanzen von Mikroorganismen chemisch zu messen (vgl. US 4,882,423).
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Selektion und Isolierung le- bensfähiger Mikroorganismen, insbesondere lebensfähiger prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen präsentieren, vorzusehen, welches billig, einfach zu handhaben und hoch- selektiv ist, wenig Hintergrund hat und keine negativen Auswirkungen auf die Mikroorganismen, vorzugsweise zu selektierende Zellen, hat und daher zum Screenen grosser Bibliotheken anwend- bar ist, welche nur ein einziges oder ein paar Ziele, woran ein Interesse besteht, aufweisen.
Ausserdem ist es ein Ziel, ein solches Screening- und Isoliersystem insbesondere für Zellbiblio- theken vorzusehen, die eine Bibliothek von Antigenen in einer Aussenmembran-Display-Verbindung aufweisen und wobei die Erkennung des Antigens selbst dann möglich ist, wenn es als Insert in einem solchen Aussenmembran-Protein präsentiert ist.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren zum Screenen und Isolieren von Mikroorganis- men, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen aufweisen, gelöst, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - das Vorsehen einer Suspension einer Vielzahl lebensfähiger Mikroorganismen, die ein oder mehrere Mikroorganismen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, ent- halten, die mindestens eine Art von Antigen an ihrer Oberfläche präsentieren, - das In-Berührung-Bringen dieser Suspension von Mikroorganismen mit einer Lösung, die
Antikörper enthält, welche an die zumindest eine Art von Antigen binden, - das Inkubieren dieser Suspension mit diesen Antikörpern, um ein Binden der Antikörper an das (die) Antigen (e) zuermöglichen,
- das In-Berührung-Bringen dieser Suspension von Mikroorganismen mit Antikörper/Antigen-
Komplexen an ihrer Oberfläche mit C1q-Molekülen, um eine Bindung der C1q-Moleküle an die an der Oberfläche befindlichen Antikörper/Antigen-Komplexe zu ermöglichen, und - das Isolieren lebensfähiger Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryon- tischer Zellen, die C1q-Moleküle aufweisen, die an einen Antikörper/Antigen-Komplex an ih- rer Oberfläche gebunden sind.
Es war überraschend, dass mit der Verwendung von C1q-Molekülen ein schnelles. und einfa- ches sowie kostengünstiges Verfahren zum Screenen, Selektieren und Isolieren lebensfähiger Mik- roorganismen, insbesondere fragiler prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, vorgesehen werden konnte. Obwohl man vom Komplement weiss, dass es Zellen, die einen Antigen/Antikörper- Komplex an ihrer Oberfläche präsentieren, schwer schädigt und es deshalb bisher nur in Verbin- dung mit Nekrochemie verwendet wurde (z. B.
US 4,882,423), zeigte es sich im Verlauf der vorlie- genden Erfindung, dass die Verwendung der C1q-Moleküle und-Reagenzien zum Screenen und Isolieren lebensfähiger Zellen durchführbar ist, ohne zu riskieren, seltene oder fragile Zellen infolge von Problemen mit der Lebensfähigkeit in Verbindung mit dem Screening-Verfahren zu verlieren.
Ausserdem haben C1q-Moleküle einen weiteren Vorteil im Vergleich zu einem sekundären Anti-
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gerer Affinität an lgG2 und lgG4 binden. Daher kann man Epitope spezifisch isolieren, die eine Komplement-vermittelte Lyse bewirken könnten.
Gemäss bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist die Suspension der Vielzahl lebensfähiger Mikroorganismen eine Bibliothek von Mikroorganismen auf, worin jeder ein- zelne Mikroorganismus mindestens ein unikes Antigen präsentiert, das für die Mehrheit der Viel- zahl an Mikroorganismen nicht üblich ist. Dieses Antigen oder diese Bibliothek von Antigenen kann vorzugsweise von pathogenen Organismen abstammen, z. B. von einer genomischen Bibliothek eines solchen Mikroorganismus. Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein
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solches Antigen ein randomisiertes Peptid, beispielsweise von randomisierten DNA-Sequenzen generiert (Grabowska et al., Virology 269 (2000), 47-53; Rowley et al., J. Immunol. 164 (2000), 3413-3419) sein.
Eine andere bevorzugte Alternative ist die Präsentation von "expressed sequence tags" (ESTs), vorzugsweise von ESTs, die von spezifischen EST-Bibliotheken mit bekannter Spezi- fität stammen, z.B. von spezifischen Organismen oder spezifischen Zelltypen.
Solche Mikroorganismen, in welchen heterologe Antigene präsentiert sind, werden durch nor- male Screening-Methoden wegen ihrer erhöhten Fragilität, insbesondere in Bezug auf ihre Memb- ran-Stabilität, sogar noch stärker gefährdet. Daher ist es sogar noch überraschender, dass beim vorliegenden C1q-System die Anzahl der lebensfähigen Zellen sogar für ein Screenen auf einzelne oder seltene Zellen/Antigene hoch genug ist.
Bevorzugte Zellen, die zur Präsentation von Antigenen gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind prokaryontische und eukaryontische Zellen, die im Labor unter herkömmli- chen Bedingungen leicht zu handhaben sind. Insbesondere Zellen mit etablierten Techniken zur Genmanipulation sind bevorzugt.
Wie oben festgestellt, wird bevorzugt, dass das (die) zu präsentierende (n) an die Antikorper zu bindende (n) für die Mikroorganismen heterolog ist (sind), d. h., dass das Antigen nicht im Wildtyp von solchen Mikroorganismen vorhanden ist (beispielsweise solche Mikroorganis- men genetisch modifiziert).
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Antikörper enthaltende Lösung mehr als eine einzige Antikörperspezies auf. Das erfindungsgemässe Verfahren ist zum Screenen einer gemischten Antikörperlösung geeignet, die beispielsweise aus menschlichem oder tierischem Serum stammt, das absichtlich in Bezug auf ein spezifisches Antigen oder eine ganze Antigen- Bibliothek gezogen oder auf andere Weise verursacht wurde (z. B. durch spezifische Plasmaselek- tion). Dadurch ist das vorliegende System perfekt für ein Klonierungssystem, wie in WO 99/30151 beschrieben, geeignet.
Bevorzugte Antikörperlösungen sind daher Antikörper-Präparationen (insbesondere IgG-Präpa- rationen), die aus menschlichem Blut stammen, insbesondere von Patienten mit Antikörpern gegen das Pathogen der Antigen-Bibliothek, auf die gescreent werden soll. Besonders geeignet sind Hyperimmunoglobulin-Präparationen von beispielsweise HAV-, HBV-, HCV-, HIV-Patienten oder von Patienten, die Infektionen mit beispielsweise Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercu- losum, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, paeruginosa oder Chlamydia pneumoniae, oder andere klinisch relevante Infektionen mit viralen, prokaryontischen oder eukary- ontischen Pathogenen überstanden haben.
Wenn eine Antigen-Bibliothek in einem oder angrenzend an ein Oberflächenprotein eines Mikroorganismus, z. B. eines Bakteriums, wie E. coli, präsentiert wird, kann es oft schwierig sein, einen Komplex aus einem Antigen, einem Antikörper und einem C1q-Molekül zu bilden, insbe- sondere, wenn das Antigen in einer ziemlich unnatürlichen Umgebung präsentiert wird. Anderseits würde, wenn solch ein Immunkomplex oder die Detektion eines solchen Immunkomplexes bewir- ken würde, dass der Immunkomplex die Zellwand schädigt oder zerreisst, die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen schwer gefährdet.
Tatsächlich war es überraschend, dass das Screenen, die Detektion und das Isolieren mit C1q-Molekülen sogar bei Antigenen möglich war, die als integraler Teil des Oberflächenproteins der Mikroorganismen präsentiert wurden, insbesondere in jenen Fällen, wo dieses Antigen als integraler Teil des Aussenmembranproteins präsentiert wird (wie z.B. in WO 99/30151 beschrieben).
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist das bei der vorliegenden Erfindung verwendete C1q-Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C1q, Substanz-konjugiertem C1q, synthe- tischem C1q-Peptid, Oberflächen-gebundenem C1q oder Mischungen solcher Komponenten.
Insbesondere wird C1q, das mit spezifischen Marker-Substanzen konjugiert ist, bevorzugt. Solche Marker-Substanzen können Signal-aussendende Substanzen sein, wie Enzymsubstrate, Farbstoffe oder Pigmente, magnetisierbare Substanzen, Spender oder Akzeptoren für Elektronenübertragung, radioaktive Materialien, Metallverbindungen und Metallzusammensetzungen, die Signale aussen- den, welche von den Sensororganen oder einem Ausseninstrument detektierbar sind, Enzyme oder Coenzyme, die zur Aussendung detektierbarer Signale modifiziert werden können, Biotinylierung, Agglutinierungssubstanzen, die zusammenkommen, um dadurch leicht detektiert zu werden, Zellfunktions-regulierende Substanzen, beispielsweise bestimmte Enzyme, die auf die Gegensub-
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stanzen wirken, welche mit C1q konjugiert sind, um letzteren irgendwelche Funktionen zu verleihen, und Substanzen,
wie hochpolymere Materialien, die die mit C1q konjugierten Antigene fangen oder reversibel fixieren. C1q kann aus verschiedenen Tieren, einschliesslich Schafen, Kaninchen, Meerschweinchen, Rindern, Pferden, Hunden, Mäusen und den Menschen isoliert werden und mittels herkömmlicher Reinigungsvorgänge hergestellt werden. Es ist auch möglich, synthetische C1q-Peptide zu verwenden, die den wesentlichen Teil für Immunkomplex-Erkennung und-Bindung enthalten. Beispiele für solche C1q-Moleküle, insbesondere Substanz- oder Oberflächen- gebundene C1qs, sind dem Fachmann im Prinzip bekannt und beispielsweise in US 4,882,423 und 4,143,124 beschrieben.
Gemäss bevorzugten Ausführungsformen ist das C1q-Molekül auf einer festen Matrix, insbesondere auf magnetischen Teilchen, immobilisiert, und sind die Mikroorganismen, an welchen ein Interesse besteht, durch Affinitätsreinigung unter Verwendung solcher magnetischer Teilchen gereinigt. Es war überraschend, dass dieses Verfahren zum Isolieren lebensfähiger Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, geeignet ist, die gegebenenfalls in Bezug auf ihre Oberflächenproteine genetisch manipuliert sind. Obwohl die magnetische Immobilisierung und Manipulation von Zellen im Prinzip bekannt ist (vgl. z. B. US 6,013,532), ist es jedoch bekannt, dass bei solchen Tätigkeiten normalerweise eine grosse Anzahl von Ziel-Mikroorganismen verloren geht oder getötet wird.
Ausserdem wurden solche magnetische Verfahren nur bei normalen, nicht-manipulierten oder fragilen Zellen angewendet, und niemals in Verbindung mit dem Komplement-System, von welchem bekannt ist, dass es eine starke Auswirkung auf die Integrität der Oberfläche solcher Mikroorganismen und ihre Lebensfähigkeit hat.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Kultur von Mikroorganismen, die ein Antigen präsentieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemäss isolierten Mikroorganismen, die durch das vorliegende Verfahren identifiziert werden, gegebenenfalls von den Antikörpern und der C1q Molekülen getrennt werden, geklont werden und gegebenenfalls in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet werden, beispielsweise um den Antigen- oder Immunkomplex zu identifizieren.
Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Set zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, umfassend - eine Suspension einer Mehrzahl lebensfähiger Mikroorganismen, die ein oder mehrere Mik- roorganismen enthalten, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, welche mindestens eine Antigen-Art an ihrer Oberfläche aufweisen, - eine Suspension von Antikörpern, welche an die mindestens eine Antigen-Art binden, und - mindestens eine C1q-Molekül-Art.
Die drei Mindest-Komponenten des Sets gemäss der vorliegenden Erfindung können an die spezifischen, oben beschriebenen Ausführungsformen angepasst werden und gegebenenfalls in lyophilisierter Form und/oder zusammen mit geeigneten Hilfsstoffen vorliegen. Vorzugsweise sind auch weitere Reagenzien oder Einrichtungen zum Isolieren der Zellen im Set inkludiert, z. B. Vorrichtungen zur magnetischen Trennung von Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und Isolierung von Antigenen, insbesondere Antigenen, die aus pathogenen Organismen stammen, um Vakzinen vorzusehen.
Das Verfahren ist im Beispiel und in den Zeichnungsfiguren weiter beschrieben, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.
Fig. 1 und Fig. 2 zeigen die C1q-vermittelte Ganzzellen-Affinitätsreinigung.
Beispiel
C1q kann Bakterien, die ein spezifisches Epitop (T7-Epitop) präsentieren, speziell isolieren:
Versuchsvorgang :
Einzelne Kolonien von DH5a-Zellen, die das Plasmid pEH1-LamBT7 oder das Plasmid pEH3 (nur den Vektor) enthalten, welche in 5 ml LBKan bzw. LBchl suspendiert waren, wurden etwa 4 h
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lang bei 37 C inkubiert. Bei einer OD600von 0,2 wurden die Zellen mit 0,1mM IPTG 1,5 h lang bei 37 C induziert. Eine Mischung von mit T7-Epitop-markiertem LamB exprimierenden Zellen und nicht-Epitop-exprimierenden Zellen (Verhältnis = 102 : 106) wurde mit 10 ng T7-spezifischem Anti- körper entweder mit oder ohne 10 ug Human-IgGs (zuvor an E coli DH5Ó voradsorbiert) inkubiert.
Das Reaktionsvolumen war 100 ul (Puffer: 25 mM HEPES-CI, pH 7,4,2,5 mM CaCI2, 10 mM MgCI2, 0,1% BSA), die Inkubationstemperatur betrug 4 C, die Röhrchen wurden auf eine Schüttelvorrichtung gegeben (Rotator Drive STR4, Stuart Scientific).
Nach der Inkubation mit 5 ug biotinyliertem C1q wurde 1 ml HEPES-Puffer zugegeben, und die Eppendorf-Röhrchen wurden 15 min lang bei 4 C (8.000 U/min, Biofuge, Heraeus) zentrifugiert, das Zell-Pellet wurde noch einmal mit 1 ml frischem Puffer gewaschen. Danach wurden die Zellen in 100 ul Puffer resuspendiert, und 10 ul Streptavidin-gekoppelte MicroBeads (Miltenyi) wurden zugegeben.
Nach 50 min wurde die Inkubationsmischung mit 1,5 ml HEPES verdünnt und auf MS-Säulen (Miltenyi) geladen. Nach dem Waschen (3 x 1 ml Puffer) wurde die Säule vom Magnet genommen, und die gebundenen Zellen wurden mit 1,5 ml Puffer eluiert. Danach wurde die Elutionsfraktion noch einmal auf eine MS-Säule für eine zweite Trenn-Runde geladen (die Wasch- und Elutionsvo- lumina waren 3 x 1 ml bzw. 1,5 ml).
Inkubationszeit : t7-Monoklonaler Antikörper : 1 h lang, biotinyliertes C1q: über Nacht (16 h), 50 min mit MicroBeads, die mit Streptavidin konjugiert waren.
Die Fraktionen 1 + 2,3 + 4 und 5 + 6 wurden gepoolt, und die Hälfte des Volumens wurde auf LB-Platten plattiert, die entweder Kanamycin oder Chloramphenicol enthielten.
Ergebnis : Anzahl von Zellen, die beim Versuch verwendet wurden (E. coli Stamm DH5a)
LamB T7 (Kanamycin-Resistenz) : 67 pEH3 (nur Vektor) (Chloramphenicol-Resistenz): 1,5 x 105
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Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen, dass C1q-Bakterien, die ein spezifisches Epitop (T7-Epitop) an der Oberfläche präsentieren, aus einer Vielzahl von Bakterien,
die dieses Epitop nicht präsentieren, isolieren kann. Nach einer einzigen Trenn-Runde wurden mehr als 50% positive Baktenen mit einem Hintergrund von nur 10-20 Zellen (aus 1,5 x 105 Zellen ! ) gewonnen. Bei einem direkten Vergleich führte der sekundäre Antikörper, der anstelle von C1q verwendet wurde, zu einem viel höheren Hintergrund von 300-500 Zellen, die kein Epitop präsentierten.
Wie aus dem vorliegenden Beispiel ersichtlich, funktioniert C1q derzeit am besten mit LamB- Aussenmembranprotein oder ähnlichen Proteinen, das (die) an der Oberfläche ein Homotrimer bildet (bilden). Wenn man daher ein heterologes Peptid in eine der Loops insertiert, wird dieses Epitop drei Mal sehr nahe an einander präsentiert. Dies wird natürlich für eine effiziente C1q- Bindung bevorzugt, da eine starke Bindung nur auftritt, wenn C1q an mindestens zwei Antigen- gebundene IgGs gleichzeitig bindet.
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The invention relates to a method for screening and isolating microorganisms, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which present an antigen.
Screening methods for cell or phage display libraries represent a speed-determining bottleneck in the field of genomes. Efficient methods for sorting cells are either expensive or associated with the risk of the cells that are to be screened and isolated being to damage.
On the other hand, cheaper methods are often associated with high background signals, which lead to problems in the detection of microorganisms (cells, phages, etc.) in which there is an interest. At least, such methods with high background signals result in a lot of work when analyzing positive signals at a high rate of false positive results.
The identification of organisms in which there is interest with antibodies is a general method in such screening systems and in the identification, separation, cultivation and manipulation of such microorganisms.
For example, it is known that the labeling of a target entity with fluorescent monoclonal antibodies (MABs) or antibodies which are linked to staining reagents is a selection means for identifying target cells. However, if such identification is done manually or mechanically, numerous activities involving incubations and washing steps have to be carried out. Instead of such direct labeling with monoclonal antibodies, indirect analysis is customary, in which the biological target microorganisms are first labeled with a specific MAB which is not labeled.
After extensive washing to remove unbound specific MAB, a second antibody is added which is labeled and recognizes the first antibody. However, although such indirect methods are more specific, they require significant amounts of reagents and numerous activities that are used in such identification processes.
It has been proposed to use magnetic particles that have an antibody bound to their surface that can bind to specific proteins or antigens (US 5,466,574 and US 6,013,532). It has also been suggested that this method be used to separate cells, cell components or viruses with a characteristic determinant from a test sample, e.g. B. for the removal of rare cells, for the depletion of natural killer cells, for the determination of reticulocytes, for phagocytosis tests, for obsonization tests, for the detection of specific tumor cells or for the immunospecific isolation of monocytes, granulocytes or other cell types.
It has not yet been proposed to use such a system specifically for screening and isolating viable prokaryotic and eukaryotic cells, for example from a library of cells that have a library of antigens within a membrane protein. In fact, in the methods of the prior art, the viability of the cells is often greatly reduced during the screening and isolation processes according to such a prior art. As a result, a large number of target microorganisms are lost or killed during such procedures.
C1q is a plasma protein that is constantly present in relatively high concentrations (70 to 80 mg / l) and is part of the classic way of activating complement. The C1q protein molecule has 6 spherical "heads", each of which contains an A, B and C polypeptide chain and carries an 81 residue extension that forms part of a central, collagen-like triple helix swan - zes ist (Eggleton et al., Trends in CELL BIOL. 8 (1998), pp. 428-431). C1q is known to bind first to an antigen, followed by the binding of C1s and C1r to C1q (thereby forming the C1 component complex), followed by serial binding of the other complement components C2- C9). C1q binds to a number of different cell types, triggering a number of different immune responses and inflammatory responses.
The interactions of C1q with human neutrophils, eosinophils, platelets, endothelial cells and B-lymphocytes have been described to influence inflammatory reactions and adaptive immune responses. C1q is also described to modulate a number of different functions in fibroblasts.
One of the more important biological roles of C1q is the detection of antigen / antibody complexes. C1q binds to such complexes when an antigen on the outer surface membrane of a pathogenic bacterium is recognized by an antibody. If C1q to such
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Binding immune complexes, the activation of the other component factors through this binding process leads to an enzyme complex on the bacterial membrane, which leads to an attack and perforation of the bacterial cell wall (membrane) and to the lysis of the bacterium.
Although C1q is known to be highly specific for antibody / antigen-immune complexes and has also been used in substance-conjugated form to determine or detect a specific antigen in a body fluid or other biological fluid, C1q has never been suggested use a method for isolating viable prokaryotic and eukaryotic cells. At the cell detection level, C1q or C1q reagents were used to bind to fixed and immobilized cells in order to chemically measure surface antigen or intracellular substances of microorganisms (cf. US 4,882,423).
It is therefore an object of the present invention to provide a method for the selection and isolation of viable microorganisms, in particular viable prokaryotic and eukaryotic cells which present an antigen, which is inexpensive, easy to handle and highly selective, has little background and has no negative effects on the microorganisms, preferably cells to be selected, and can therefore be used for screening large libraries which have only one or a few targets of interest.
In addition, it is an aim to provide such a screening and isolation system, in particular for cell libraries that have a library of antigens in an outer membrane display connection, and wherein the detection of the antigen is possible even when it is inserted as such Outer membrane protein is presented.
These tasks are solved by a method for screening and isolating microorganisms, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which have an antigen, which is characterized by the following steps: the provision of a suspension of a large number of viable microorganisms which comprise one or more Contain microorganisms, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which present at least one type of antigen on their surface, - bringing this suspension of microorganisms into contact with a solution which
Contains antibodies which bind to the at least one type of antigen, - incubating this suspension with these antibodies in order to enable the antibodies to bind to the antigen (s),
bringing this suspension of microorganisms into contact with antibody / antigen
Complexes on their surface with C1q molecules to enable the C1q molecules to bind to the antibody / antigen complexes on the surface, and isolating viable microorganisms, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which have C1q molecules which are bound to an antibody / antigen complex on their surface.
It was surprising that with the use of C1q molecules a quick one. and a simple and inexpensive method for screening, selecting and isolating viable microorganisms, in particular fragile prokaryotic and eukaryotic cells, could be provided. Although the complement is known to damage cells that present an antigen / antibody complex on their surface, it has therefore only been used in connection with necrochemistry (e.g.
No. 4,882,423), it was found in the course of the present invention that the use of the C1q molecules and reagents for screening and isolating viable cells can be carried out without risking rare or fragile cells as a result of problems related to viability to lose with the screening process.
In addition, C1q molecules have another advantage compared to a secondary anti
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bind greater affinity to lgG2 and lgG4. It is therefore possible to specifically isolate epitopes that could result in complement-mediated lysis.
According to preferred embodiments of the present invention, the suspension of the large number of viable microorganisms has a library of microorganisms, in which each individual microorganism presents at least one unique antigen which is not common for the majority of the large number of microorganisms. This antigen or library of antigens can preferably be derived from pathogenic organisms, e.g. B. from a genomic library of such a microorganism. According to another preferred embodiment, a
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such antigen can be a randomized peptide, for example generated from randomized DNA sequences (Grabowska et al., Virology 269 (2000), 47-53; Rowley et al., J. Immunol. 164 (2000), 3413-3419).
Another preferred alternative is to present expressed sequence tags (ESTs), preferably ESTs derived from specific EST libraries with known specificity, e.g. of specific organisms or specific cell types.
Such microorganisms, in which heterologous antigens are presented, are even more endangered by normal screening methods because of their increased fragility, in particular with regard to their membrane stability. It is therefore even more surprising that in the present C1q system, the number of viable cells is high enough even for screening for single or rare cells / antigens.
Preferred cells used for the presentation of antigens according to the present invention are prokaryotic and eukaryotic cells, which are easy to handle in the laboratory under conventional conditions. Cells with established techniques for gene manipulation are particularly preferred.
As stated above, it is preferred that the antibody to be presented (s) to be presented is heterologous to the microorganisms, i. that is, the antigen is not present in the wild type of such microorganisms (e.g., such microorganisms genetically modified).
According to another preferred embodiment, the antibody-containing solution has more than a single antibody species. The method according to the invention is suitable for screening a mixed antibody solution which, for example, originates from human or animal serum, which was intentionally drawn in relation to a specific antigen or an entire antigen library or was caused in some other way (for example by specific plasma selec- tion). As a result, the present system is perfectly suitable for a cloning system, as described in WO 99/30151.
Preferred antibody solutions are therefore antibody preparations (in particular IgG preparations) which originate from human blood, in particular from patients with antibodies against the pathogen of the antigen library to be screened for. Hyperimmunoglobulin preparations of, for example, HAV, HBV, HCV, HIV patients or of patients who have infections with, for example, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosum, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, paeruginosa or Chlamydia pneumoniae, or other clinically, are particularly suitable have survived relevant infections with viral, prokaryotic or eukaryotic pathogens.
If an antigen library in or adjacent to a surface protein of a microorganism, e.g. B. a bacterium such as E. coli, it can often be difficult to form a complex from an antigen, an antibody and a C1q molecule, especially when the antigen is presented in a rather unnatural environment. On the other hand, if such an immune complex or the detection of such an immune complex would cause the immune complex to damage or tear the cell wall, the viability of the microorganisms would be seriously endangered.
In fact, it was surprising that screening, detection and isolation with C1q molecules was possible even with antigens presented as an integral part of the surface protein of the microorganisms, especially in those cases where this antigen is presented as an integral part of the outer membrane protein (as described for example in WO 99/30151).
According to a preferred embodiment, the C1q molecule used in the present invention is selected from the group consisting of C1q, substance-conjugated C1q, synthetic C1q peptide, surface-bound C1q or mixtures of such components.
In particular, C1q, which is conjugated to specific marker substances, is preferred. Such marker substances can be signal-emitting substances, such as enzyme substrates, dyes or pigments, magnetizable substances, donors or acceptors for electron transmission, radioactive materials, metal compounds and metal compositions which emit signals which can be detected by the sensor organs or an external instrument, Enzymes or coenzymes that can be modified to emit detectable signals, biotinylation, agglutinating substances that come together to be easily detected thereby, cell function regulating substances, for example certain enzymes that respond to the counter
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stamps conjugated with C1q to give the latter any functions, and substances
such as highly polymeric materials that capture or reversibly fix the C1q-conjugated antigens. C1q can be isolated from various animals, including sheep, rabbits, guinea pigs, cattle, horses, dogs, mice and humans, and can be prepared using conventional purification procedures. It is also possible to use synthetic C1q peptides that contain the essential part for immune complex recognition and binding. Examples of such C1q molecules, in particular substance- or surface-bound C1qs, are known in principle to the person skilled in the art and are described, for example, in US Pat. Nos. 4,882,423 and 4,143,124.
According to preferred embodiments, the C1q molecule is immobilized on a solid matrix, in particular on magnetic particles, and the microorganisms in which there is interest are purified by affinity purification using such magnetic particles. It was surprising that this method is suitable for isolating viable microorganisms, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which may have been genetically manipulated with regard to their surface proteins. Although the magnetic immobilization and manipulation of cells is known in principle (see, for example, US Pat. No. 6,013,532), it is known, however, that a large number of target microorganisms are normally lost or killed in such activities.
In addition, such magnetic methods have only been applied to normal, non-manipulated, or fragile cells, and never in conjunction with the complement system, which is known to have a strong impact on the integrity of the surface of such microorganisms and their viability.
According to a further aspect, the present invention relates to a method for producing a culture of microorganisms which present an antigen, which is characterized in that the microorganisms isolated according to the invention, which are identified by the present method, are optionally separated from the antibodies and the C1q molecules are cloned and, if necessary, grown in a suitable growth medium, for example to identify the antigen or immune complex.
In another aspect, the present invention relates to a set for carrying out the method according to the invention, comprising - a suspension of a plurality of viable microorganisms which contain one or more microorganisms, in particular prokaryotic or eukaryotic cells which have at least one type of antigen on their surface , - a suspension of antibodies that bind to the at least one antigen type, and - at least one C1q molecule type.
The three minimum components of the set according to the present invention can be adapted to the specific embodiments described above and optionally in lyophilized form and / or together with suitable auxiliaries. Preferably, further reagents or devices for isolating the cells are included in the set, e.g. B. Devices for magnetic separation of microorganisms, in particular prokaryotic and eukaryotic cells.
Another aspect of the present invention relates to the use of the method according to the present invention for the identification and isolation of antigens, in particular antigens derived from pathogenic organisms, in order to provide vaccines.
The method is further described in the example and in the drawing figures, without being restricted to these.
1 and 2 show the C1q-mediated whole cell affinity purification.
example
C1q can specifically isolate bacteria that present a specific epitope (T7 epitope):
Test procedure:
Individual colonies of DH5a cells containing the plasmid pEH1-LamBT7 or the plasmid pEH3 (only the vector), which were suspended in 5 ml LBKan or LBchl, were grown for about 4 hours
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incubated for long at 37 C. At an OD600 of 0.2, the cells were induced with 0.1mM IPTG at 37C for 1.5 hours. A mixture of cells expressing T7 epitope-labeled LamB and non-epitope-expressing cells (ratio = 102: 106) was incubated with 10 ng T7-specific antibody either with or without 10 µg human IgGs (previously on E coli DH5Ó pre-adsorbed) incubated.
The reaction volume was 100 ul (buffer: 25mM HEPES-CI, pH 7.4.2.5mM CaCl2, 10mM MgCl2, 0.1% BSA), the incubation temperature was 4C, the tubes were placed on a shaker ( Rotator Drive STR4, Stuart Scientific).
After incubation with 5 µg of biotinylated C1q, 1 ml of HEPES buffer was added, and the Eppendorf tubes were centrifuged at 4 C (8,000 rpm, Biofuge, Heraeus) for 15 min, the cell pellet was again rinsed with 1 ml fresh buffer washed. The cells were then resuspended in 100 ul of buffer and 10 ul of streptavidin-coupled MicroBeads (Miltenyi) were added.
After 50 min the incubation mixture was diluted with 1.5 ml of HEPES and loaded onto MS columns (Miltenyi). After washing (3 x 1 ml buffer) the column was removed from the magnet and the bound cells were eluted with 1.5 ml buffer. The elution fraction was then loaded again onto an MS column for a second round of separation (the washing and elution volumes were 3 × 1 ml and 1.5 ml, respectively).
Incubation time: t7 monoclonal antibody: 1 h, biotinylated C1q: overnight (16 h), 50 min with MicroBeads conjugated with streptavidin.
Fractions 1 + 2,3 + 4 and 5 + 6 were pooled and half the volume was plated on LB plates containing either kanamycin or chloramphenicol.
Result: Number of cells used in the experiment (E. coli strain DH5a)
LamB T7 (kanamycin resistance): 67 pEH3 (vector only) (chloramphenicol resistance): 1.5 x 105
EMI5.1
<tb> ciq <SEP> (ug <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5
<Tb>
<Tb>
<tb> Human IgGs <SEP> (ug) <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<Tb>
<Tb>
<tb> T7-Ab <SEP> (ng) 10 <SEP> 10
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> washing <SEP> (Ms) <SEP> specific <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 51 <SEP> 44
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> washing <SEP> (MS) <SEP> specific <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> Elution <SEP> specific <SEP> 36 <SEP> 0
<Tb>
<Tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯nonspecific <SEP> <10 <SEP> <10
<Tb>
Table 1
These results show that C1q bacteria that present a specific epitope (T7 epitope) on the surface are made up of a variety of bacteria,
that cannot present, isolate this epitope. After a single round of separation, more than 50% positive bacteria with a background of only 10-20 cells (from 1.5 x 105 cells!) Were obtained. In a direct comparison, the secondary antibody used in place of C1q resulted in a much higher background of 300-500 cells that did not present an epitope.
As can be seen from the present example, C1q currently works best with LamB outer membrane protein or similar proteins that form a homotrimer on the surface. Therefore, if you insert a heterologous peptide into one of the loops, this epitope is presented three times very close to each other. This is of course preferred for efficient C1q binding, since strong binding only occurs when C1q binds to at least two antigen-bound IgGs at the same time.
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