AT398004B - Verfahren zur bestimmung von plasmin-alpha2- antiplasmin-komplexen unter verwendung eines komplexspezifischen monoklonalen antikörpers - Google Patents

Description

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Einleitung : a2-Antiplasmin ist der wichtigste Plasmininhibitor. Seine Reaktion mit Plasmin resultiert in der Bildung eines inaktiven Komplexes, zusammengesetzt aus je einem Molekül beider Komponenten. Zwei Stufen sind in diesem Prozeß involviert; erstens wird ein reversibler Komplex zwischen der lysinbindenden Stelle des Plasmin und der entsprechenden Stelle im Karboxylende des a2-Antiplasmin Moleküls gebildet. In der zweiten Stufe wird ein irreversibler Komplex durch die Spaltung einer Peptidbindung im Inhibitor gebildet. Während der Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin und der Plasminwirkung besteht ein Gleichgewicht zwischen der Bildung von Plasmin-a2-Antiplasmin Komplexen, welche hauptsächlich in der flüssigen Phase gebildet werden und der Bindung sowie Wirkung von Plasmin an der Fibrinoberfläche. Gebunden an Fibrin, ist Plasmin gegen die Hemmung durch a2-Antiplasmin geschützt. Sobald jedoch Fibrin völlig aufgelöst ist, wird das von der Fibrinoberfläche befreite Plasmin umgehend durch a2-Antiplasmin komplexiert.

Wann immer Fibrin in der Zirkulation entsteht, wird dieser Prozeß, aufgrund der wohlbekannten Wirkung von Fibrin auf den Gewebeplasminogen Akltivator (t-PA), von einer Aktivierung des fibrolytischen Systems begleitet. Gebildetes Plasmin wird daher zum Teil durch «2-Antiplasmin komplexiert und führt zu erhöhten Werten von Plasmin-a2-Antiplasmin Komplexen im Plasma. Solche erhöhten Werte an PAP-Komplexen wurden daher in vielen Fällen bei vermehrter Fibrinbildung gefunden, wie bei Thrombophilie, Hypercoagula-bilität, disseminierter intravasaler Gerinnung, Endotoxinschock, Leukämie, Lebererkrankungen, nephrotischem Syndrome und nach schweren chirurgischen Eingriffen. Sogar nach dem Venösen-Stau-Test wurden in den meisten Fällen erhöhte Plasmin-a2-Antiplasmin-Spiegel gefunden, in Übereinstimmung mit vermehrter Fibrinbildung und erhöhten Werten von Gewebeplasminogen-Aktivator im Venenokklusions-Plasma. Während in allen vorgenannten Fällen nur eine geringe Erhöhung der PAP-Konzentration zu beobachten ist, führt eine thrombolytische Therapie durch die ausgedehnte Aktivierung des fibrinolytischen Systems zu einer massiven Plasminbildung in der flüssigen Phase und einer maximalen PAP-Komplexbildung. Speziell nicht-fibrin-spezifische Plasminogen-Aktivatoren, wie Streptokinase oder Urokinase, können einen völligen Vebrauch von Plasmin-Inhibitoren verursachen und auf Grund von Plasminämie zu verstärkter Blutungsneigung führen. In diesem Fall ist die Plasmin-Wirkung nicht mehr auf Fibrin als sein spezifisches Substrat beschränkt, sondern kann auch auf unspezifische Substrate wie Fibrinogen oder andere Gerinnungsfaktoren übergehen. Die Bestimmung von Plasmin-e2-Antiplasmin-Komplexen kann daher einerseits als Indikator für eine generalisierte Plasminämie bei hyperfibrinolytischen Zuständen mit Fibrinogen und a2-Antiplasmin-Verbrauch und möglicher Blutungsneigung dienen, andererseits sind gering erhöhte Plasma-Spiegel von Plasmin-a2-Antiplasmin-Komplexen ein Hinweis für eine ständig stattfindende Thrombus-Bildung und Auflösung, wie im Fall von Thrombophilie.

Verfügbare Methoden zur Bestimmung von PAP :

Es wurden bereits mehrere Testmethoden zur Bestimmung von PAP-Komplexen publiziert, unter anderem zweidimensionale Immunelektrophorese, ein Latex-Test, RIA und in neuerer Zeit ELISA-Systeme. Zuerst wurde ein Latex-Agglutinations-Test zur Bestimmung von PAP-Komplexen von Plow et al. mit eher geringer Sensitivität vorgestellt. Anschliessend wurde eine zweidimensionale Elektrophorese beschrieben, bei der die unterschiedliche Mobilität von freiem und komplexiertem a2-Antiplasmin Anwendung findet. Diese Methode war noch immer nicht sensitiv genug und ziemlich zeitraubend sowie ungeeignet für eine größere Anzahl von Proben. Unter Verwendung von polyklonalem Antiserum, gegen einen Komplex aus a2-Antiplasmin und der B-Kette von Plasmin, wurde von Wiman et al. ein RIA entwickelt, welcher auf diese Weise unabhängig war von intaktem Plasminogen oder Plasmin. Es wurde aber immer noch intaktes «2-Antiplasmin zusammen mit dem PAP-Komplex entdeckt, allerdings in einem weitaus geringeren Ausmaß.

Ein großer Vorteil war die Entwicklung der Doppel-Sandwich-Technik wie in den ELISA-Systemen verwendet. Seither wurden verschiedene Methoden entwickelt; entweder unter Verwendung eines Antikörpers gegen a2-Anti-Plasmin als Bindungs-Antikörper und einem Antikörper gegen das Enzym für die Quantifizierung, oder vice versa Harpei et ai. hat ais Erster einen empfindlichen Assay mit einem polyklonalen Antikörper gegen o2.-Antiplasmin als Bindungs-Antikörper und POX-markierten Fab-Fragmen-ten gegen Plasminogen als Nachweis-System publiziert, wobei die Fab-Fragmente gegenüber intakten Antikörpern den Vorteil einer verminderten, unspezifischen Bindung von Plasminogen und anderen Plasma Proteinen bieten. Andere ELISA-Systeme wurden von Holvoet et al. und Mimuro et al. beschrieben, unter Verwendung von entweder zwei monoklonalen Antikörpern gegen je einen Teil des Komplexes oder einen polyklonalen und einem monoklonalen Antikörper. Erst kürzlich wurde ein Liposome-Immun-Lyse-Assay (LILA) von Hasada et al. vorgestellt Die bisher beschriebenen EUSA oder LILA Testsysteme wurden allerdings bis zu einem gewissen Grad durch den großen Überschuß von nicht-komplexiertem a2-Antiplas- 2

AT 398 004 B min oder Plasminogen im Vergleich zu der ziemlich niedrigen Konzentration des PAP-Komplexes beeinträchtigt, da alle oben beschriebenen Methoden Antikörper verwenden, die sowohl den Komplex als auch die nativen unkomplexierten Moleküle erkennen.

Daher empfehlen wir hier ein Testsystem, welches durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Neoantigen im PAP-Komplex als Bindungs-Antikörper sehr empfindlich ist und spezifisch für PAP-Komplexe.

Test Prinzip:

Der hier beschriebene Test ist ein solid phase-enzyme-immunassy, bei welchem MPW7AP, ein monoklonaler Antikörper spezifisch für das Neoantigen des PAP-Komplexes, an Plastik-Microtiter-Platten adsorbiert wird. Bei der Inkubation mit den Testproben werden die PAP-Komplexe selektiv gebunden und nach Entfernen von nichtgebundenem Material durch MPW2PG POX, einem Peroxidasemarkierten monoklonalen Antikörper gegen die Kringle 1-3 Region des Plasminogenteils im Komplex nachgewiesen. Quantifizierung von markierten Antigen-Antikörper Konjugaten werden durch ABTS erreicht, ein chromoge-nes Substrat für Peroxidase.

Material und Geräte: - 96-Napf Microtiter-Platten mit hoher Bindungs-Kapazität (z.B. NUNC Immunopiate Maxisorp 4-93454 oder GREINER ELISA Platten (Nr. 655061), Plattenverschlüsse (z.B. COSTAR 3095). - ELISA-Reader für 405 nm und 492 nm Wellenlänge (z.B. Anthos-Reader 2001, Zinsser, Österreich). - Antikörper gegen PAP Neoantigen MPW7AP und Antikörper gegen Kringle 1-3 Region von Plasminogen, Pox-markiert, MPW2PG POX Technoclone, Wien Österreich). - PAP Komplex Standard Plasma und PAP Komplex-depletiertes Plasma, Technoclone, Wien, Österreich). - ABTS 2-2' Azinobis (3-Äthylbenz-Thiazolinsulfonsäure von Boehringer Mannheim, Deutschland). - Aprotinin (TrasylolR) von Bayer Leverkusen, Deutschland). - 2-(Äthylmercurithio)-benzoesäure- Natriumsalz (ThimerosalR) 818957, Merck, Deutschland. - Polyoxyäthylensorbitan-Monooleat (Tween 20), P 13 79, Sigma, USA. - Serum Albium Bovine, reinst (BSA) ORHO 20/21, Behring, Deutschland. - Benzamidinchlorid 82012, Merck, Deutschland. Lösungen:

Beschichtungspuffer: 1,59 g Na2CO3.10H20,2,93 g NaHC03 100 mg Thimerosal mit destilliertem Wasser auf 11, pH 9,6. Beschichtungslösung: 20u/ml MPW7AP in Beschichtungspuffer; 100ul/Napf Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS): 8 g NaCI, 0,2 g KH2PO*, 1,44 g Na2HPO* mit destilliertem Wasser auf 11, pH 7,4 Wasch-Puffer: PBS + 0,5 % Tween 20 Blocklösung: PBS + 1 % BSA Verdünnungs-Pufferl (DB1): PBS + 1 % BSA + 2000 KlU/ml Aprotinin + 20 mM Benzamidinchlorid oder ein spezifischer Inhibitor für t-PA, z.B. PPACK Verdünnungs-Puffer 2 (DB2): DB1 + 1 % PAP deputiertes Plasma Verdünnungs-Puffer 3 (DB3): DB1 + 10 % PAP deputiertes Plasma Entwicklungs-Lösung: 10 ug/mt MPW2PG Box in DBt; 100 U-I/Napf Substrat-Puffer 1,29 g Zitronensäure Monohydrat, 1,375 g Na2HP0<..2H20 mit destilliertem Wasser auf 100 ml, pH 4,0 Substrat-Lösung: 1 mg ABTS/nl + 1 al H2Q2 30 % /ml in Substrat-Puffer, 100 ai/Napf Stop-Lösung: 320 mg NaF/100 ml destilliertes Wasser; 100 al/Napf 3

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Stabilität der Reagenzien:

Beschichtungs-Puffer und beschichtete Platten sind mit einer antimikrobellen Substanz versetzt und daher bei 4° C stabil. Andere proteinhältige Lösungen und Wasch-Puffer sollten frisch hergestellt oder 5 unter sterilen Bedingungen gehalten werden, um mikrobielles Wachstum zu verhindern. Antibiotika sollten in diesen Fällen nicht verwendet werden um nachteilige Reaktionen mit Peroxidase zu vermeiden.

Verfahren : io Beschichtung der Platten : Die Näpfe einer EUSA-Platte werden mit I00u.l/Napf Beschichtungslösung gefüllt - am besten durch Verwendung einer Mehrkanal-Mikropipette. Anschließend wird die Platte mit einer selbstklebenden Plastikfolie abgedeckt und für mindestens 16h oder auch für beliebig längere Zeit, bei 4"C gelagert. Vor der Verwendung wird die beschichtete Platte entleert und mit 100u.l/Napf Blocklösung versetzt und für 1h bei 37" C inkubiert, um überschüssige reaktive Gruppen auf der Plattenoberfläche zu blockieren. 15 Für alle Inkubationsschritte bleiben die Platten mit einer Plastikfolie abgedeckt.

Proben-Vorbereitung : Normales Zitrat oder EDTA-Plasma kann verwendet werden, es sollte aber beachtet werden, daß ungehemmte Plasminogen Aktivatoren zu einer in vitro Bildung von PAP-Komplexen führen. Speziell bei der Verlaufskontrolle einer thrombolytischen Therapie sollten daher den Blutproben bei der Abnahme immer Inhibitoren zugesetzt werden, (z.B. 2000KIU/ml Aprotinin + 20mM Benzamidin 20 Endkonzentration).

Die Plasmaproben werden 1:10 in DB1 für niedrige Konzentrationen und 1:100 für hohe Konzentrationen von PAP-Komplexen verdünnt. Es werden 100ul/Napf benötigt und Doppelbestimmungen empfohlen.

Standard-Vorbereitung : PAP-Komplex Standard Plasma wird in destilliertem Wasser gelöst und Serienverdünnungen von 1:100 bis 1:800 bzw. ein Nullwert hergestellt und zwar in DB3 zur Verwendung für 25 Proben mit niedrigen PAP Konzentrationen und in DB2 zur Verwendung für Proben mit hohen PAP-Konzentrationen. Auch hier sind I00ul/Napf und Doppelbestimmungen erforderlich.

Waschen der Platten : Zwischen allen Inkubationsschritten werden die Platten dreimal mit ca. 300ul/Napf Waschpuffer gewaschen, entweder händisch oder mittels automatischem Waschgerät. Nach jedem Waschvorgang wird die Platte auf einem saugfähigen Papier ausgeklopft. 30

Testvorgang:

1) Beschichten der ELISA Platten über Nacht bei 4*C

2) Inkubation mit Blocklösung 1h bei 37" C 35 3) Waschen

4) Inkubation der Proben über Nacht bei 4 · C 5) Waschen

6) Inkubation mit Pox-markiertem Antikörper 2h bei 37" C 7) Waschen 40 8) Inkubation mit Substratlösung 30min bei Raumtemperatur, vor Licht schützen 9) Zusatz der Stoplösung 10) Messen der Platte in einem ELISA Reader bei 405nm Testwellenlänge und 492nm Referenz Wellenlänge innerhalb von 2h 11) Erstellen der Eichkurve in linearem Maßstab und Ablesen der Probenwerte von der entsprechenden 45 Standardkurve für hohe bzw. niedere PAP Konzentrationen. Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor

Auswertung der Ergebnisse:

Zur Auswertung der Ergebnisse wird die Ablesung der Proben mit jener eines entsprechencfen PAP-50 Komplex Referenz Präparates verglichen.

Standardisierung:

Da Plasmin-a2-Antiplasmin Komplexe nur schwer in einer stabilen gereinigten Form hergestellt werden 55 können - der Komplex wird leicht proteolytisch gespalten und es können verschiedene Epitope entstehen, je nachdem ob der Komplex im Überschuß von Plasmin oder seines Inhibitors gebildet wird (1) - haben wir beschlossen, PAP-Komptexe direkt im Plasma herzustellen, und sie mit PAP-Komplexen aus gereinigten Komponenten zu eichen. Zu diesem Zweck wurde Zitrat-Plasma mit einer mehr als ausreichenden 4

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Konzentration an Urokinase inkubiert um eine maximal mögliche Menge von PIasmin-«2-Antiplasmin-Komplexen zu erhalten. Anschließend wurde die Reaktion durch Zusatz von Benzamidin und Trasylol gestoppt. Die so gebildeten Komplexe sind entweder gefroren bei -70 °C oder lyophiliziert bei 4eC stabil. Um die tatsächliche Menge der Komplexe im Standard Plasma zu bestimmen, wurden die ELISA Meßwerte dieses Standards mit jenen der PAP-Komplexe aus den gereinigten Komponenten verglichen. Zu diesem Zweck wurde Plasmin frisch aus gereinigtem Glu-Plasminogen durch Inkubation mit Urokinase-Sepharose hergestellt und, nach Entfernung der Urokinase-Sepharose, wurde die entstandene Aktivität mit S-2251 sofort und nach 30min Inkubation bei 37 °C mit gereinigtem e2-Antiplasmin bestimmt. Die Differenzen in der Plasmin Aktivität entspricht der Menge an geformten PAP-Komplexen (Fig.1).

Spezifizität:

Der beschriebene Test ist spezifisch für Plasmin-a2-Antiplasmin Komplexe und ergibt gute Plasma Recovery, vorausgesetzt der Standard war in PAP-depletiertem Plasma, in der selben Konzentration wie die zu testenden Plasma-Proben, gelöst.

Sensitivität und Normal-Werte:

In dieser Analyse liegt die untere Nachweisgrenze bei 10ng/ml im gereinigtem System wie auch im Plasma.

Normalwerte:

In einer normalen Kontrollpopulation liegen die PAP-Mittelwerte bei 152+/-72ng/ml für Zitrat und 132+/-72ng/ml für EDTA Plasma; in Serumproben sind die PAP- Werte meistens erhöht.

Pathologische Werte : Thrombolytische Therapie ergibt PAP-Plasma Werte von >800ng/ml. Bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit, die erfolgreich mit perkutaner transluminaler koronarer Angiographie (PTCS), behandelt wurden, lagen nach 12 Monaten noch erhöhte PAP-Werte vor (Fig.2).

Bestimmung von PAP-Komplsxen bei verschiedenen Gruppen von Patienten:

Methode Patienten Plasmaspiegel Gekreuzte Immun Elektrophorese disseminierte intravaskulare Gerinnung + + Carcinom/Leukämie + + RIA Krebs 1.2-3.6ug/ml Chirurgische Patienten 2.1 ug/ml "hoch fibrogene" Patienten PAP-Spiegel waren von prediktivem Wert für postoperative Venenthrombose 2.1ugml ELISA Carcinome 0.12-0.15UM Akute promyelotische Leukämie 0.28U.M hämorrhagischer Schock 0.28U.M Sepsis 0.24UM ELISA Lebererkrankungen oder Leberversagen 0.7u.g/ml DIC 6.9ug/ml Akute promyelotische Leukämie tl,5M.g/ml Schock t4,t ug/ml Sepsis 2,2 ug/ml Thrombotische thrornbocytopenische Purpura 2,1 ug/ml Septische Lupus Erythematoydis erhöht 5

Claims (5)

1. AT 398 004 B Kontrolle und Kallbrationsvorgänge: Im Moment ist kein PAP-Standard verfügbar. Daher wird eine Standardisierung erreicht durch Vergleich des verwendeten PAP Komplex Standard Plasmas, in welchem sich stabile Komplexe gebildet haben, mit PAP Komplexen, die unmittelbar frisch aus gereinigten Komponenten hergestellt wurden. Vergleiche von vorhandenen Daten mit Anderen: * Normal Plasma Voll aktiviertes Plasma Latex Agglutination (nur Titer) 1:4 1:512 Gekreuzte Immunelektrophorose semiquantitativ (0 bis + + +) 0 + + + Radioimmuno-Assay untere Nachweisgrenze 1,5 ug/ml 0-2 ug/ml n.d. ELISA - Anti a2-AP als Bindungsantikörper - Antiplasminogen F(ab)2 als Nachweis-Antikörper 4,1-3,5 mol/ml Plasmin-Äquivalent 177,6 gmol/ml ELISA ** - Anti Plasminogen (polyklonal) als Bindungsantikörper - Anti a2-AP monoklonal als Nachweis-Antikörper 0,2 ± 0,1 ug/ml n.d. LILA (gleiches System wie oben) 0,8 ± 0,4 ug/ml n.d. ELISA “ - Anti-Neoantigen monoklonal als Bindungsantikörper - Antiplasminogen monoklonal als Nachweis-Antikörper 152 ± 72 ng/ml >1 ug/ml ’ Auf Grund von mangelnder Verfügbarkeit mehrerer Reagenzien konnten keine direkten Vergleiche von Testsystemen durchgeführt werden. ” Dieses System entspricht einem PAP-Kit, welcher im Handel bei Teijin erhältlich ist. ” Gegenstand dieser Erfindung. Fig. 1 - Vergleich von PAP-Komplexen erstellt in Plasma mit PAP-Komplexen aus gereinigten Komponenten. Das Insert zeigt amidolytische Aktivität von frisch hergestelltem Plasmin inkubiert mit Puffer bzw. einem Überschuß an a2-Antiplasmin. Aus der Differenz der beiden Aktivitäten, entsprechend gehemmtem Plasmin, wird die Konzentration an entstandenen Komplexen berechnet. Fig. 2 - PAP Komplexe in Kontrollpersonen und Patienten mit koronarer Herzkrankheit. Patentansprüche 1. Methode zur Bestimmung von Plasmin-a2-Antiplasmrn Komplexen unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers spezifisch für ein Neoantigen im Komplex.
2. 2. Methode nach Anspruch 1 unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit den Charakteristika des Antikörpers MPW7AP.
3. 3. Methode nach Anspruch t und 2 unter Verwendung eines Sandwich EUSA Systems. 6 AT 398 004 B
4. 4. Methode nach Anspruch 3 unter Verwendung eines Anti-PAP-Neoantigen Antikörpers als Bindungsantikörper.
5. 5. Methode nach Anspruch 3 unter Verwendung des Anti-PAP-Neoantigen Antikörpers als Bindungsanti-5 körper und eines Antikörpers gegen Plasminogen als Nachweis-Antikörper. Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 70 75 20 25 30 35 40 45 50 7 55