NO971448L

NO971448L - Rekombinante anti-Fas-antistoffer og DNA for disse

Info

Publication number: NO971448L
Application number: NO971448A
Authority: NO
Inventors: Nobufusa Serizawa; Kimihisa Ichikawa; Kaori Nakahara; Shin Yonehara
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1997-10-02
Also published as: AU724579B2; KR100277769B1; ID16796A; IL120553A0; HUP9700676A3; ZA972726B; NO971448D0; AU1655297A; NZ314496A; CA2201185A1; KR970070198A; MX9702422A; CZ96397A3; HUP9700676A2; HU9700676D0; CN1167115A; EP0799891A1

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante antistoffer rettet mot Fas, spesielt human-Fas, og mot DNA som koder for slike antistoffer. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytiske preparater som inneholder slike antistoffer, og som er ment for behandling av autoimmunsykdommer, inkludert reumatoid artritt, idet preparatene eventuelt videre inneholder en cellevekstinhibitor. Foreliggende oppfinnelse vedrører også anti-Fas-komplementaritetsbestemmende områder (CDR-er) og deres anvendelse ved dannelsen av slike antistoffer, og mot DNA som koder for slike CDR-er.

Oppfinnelsens bakgrunn

Cellers fysiologiske død i en levende organisme under naturlige forhold er kjent som apoptose og skilles fra den patologiske død av celler, dvs. nekrose [jf Kerr et al.

(1972), Br. J. Cancer, 26, 239 et seg.]. Apoptose er et eksempel på programmert celledød, dvs. hvor visse celler er programmert på forhånd til å dø i en levende organisme under naturlige forhold, slik som når den aktuelle celle har utført en forutbestemt funksjon. Apoptose er kjennetegnet ved slike morfologiske endringer som blant annet krummet celleoverflate, kondensert kjernekromatin og fragmentert, kromosomal DNA.

Apoptose har en viktig rolle å spille ved fjerning av celler som gjenkjenner autoantigen under prosessen med T- og B-lymfocyttdifferensiering. Oppstart av såkalt autoimmunsykdom skjer generelt ved tilkomsten av autoreaktive lymfocytter som skriver seg fra svikt i apoptose under lymfocyttdifferensiering [jf Keiichi Nakayama et al. (1995), Mebio 12 (10), 79-86].

Fas er et cellemembranmolekyl som er involvert i apoptose i immunokompetente celler [jf Yonehara, S. et al.

(1989), J. Exp. Med. 169, 1747 et seg., Trauth, B.C. et al.

(1989), Science 24, 301 et seg, og Itoh, N. et al., infra].

Murine, monoklonale antistoffer er blitt frembrakt mot human-Fas-antigenet [jf Itoh, N. et al. (1991), Cell 66, 233-243 og Yonehara, supra, som beskriver et monoklonalt antistoff betegnet CH11 som er spesifikt for human-Fas]. Disse anti-human- Fas-antistoffene har apoptoseinduserende, cytotoksisk aktivitet og er blitt foreslått som potensielle terapeutiske midler for autoimmunsykdommer, slik som AIDS, samt tumorer [jf japansk ikke-behandlet patentpublikasjon nr. Hei 2-237935 og japansk ikke-behandlet patentpublikasjon nr. Hei 5-503281] . Ogasawara et al. [Nature (1993), 364, 806-809] rapporterer at murine anti-Fas-antistoffer hurtig dreper villtypemus, bevise-lig ved massiv apoptose i leveren.

Monoklonale antistoffer mot human-Fas er også kjent fra de følgende publikasjoner: J. Exp. Med. (1989), 169, 1747-1756, WO 91/10448, Science (1989), 245, 301-305, Cell (1991), 66, 233-243, J. Imm. (1992), 149, 3166-3173 og Internat. Im-mun. (1994), 6, (12) 1849-1856.

Reumatisme, spesielt reumatoid artritt, antas å skrive seg fra proliferasjonen av synoviocytter, ledsaget av flere forskjellige immunologiske unormaliteter. Proliferasjonen av synoviocytter ledsages vanligvis av inflammatorisk, cellulær infiltrasjon og nedbrytning av ben. Vevsnedbrytning rundt det angrepne ledd ved kronisk, reumatoid artritt forår-sakes åpenbart av unormal produksjon av cytokiner fra inflam-matoriske synoviocytter. Undersøkelse av ledd hos pasienter med reumatisme avslører unormal proliferasjon av synoviocytter, hyperplasi av synovialvilli, flerlags synoviocytter, etc.

[jf Daniel J. McCarty (1985), i "Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology", 10. utg., Lea & Febiger]. Medisinering for reumatisme omfatter for tiden hovedsakelig antiinflammatoriske legemidler, slik som steroider og immunomodulatorer. Dersom det var mulig å inhi-bere unormal proliferasjon av synoviocytter, burde ethvert slikt middel være anvendbart ved behandlingen av reumatisme.

Synoviocytter ved reumatisme prolifererer ikke på en ubegrenset måte [jf Daniel J. McCarty (1985), i "Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology", 10. utg., Lea & Febiger], og det er blitt vist at apoptose inntrer i syno-viocyttene til pasienter med reumatisme. Fas-antigen uttrykkes på membranen til synoviocytter og Nakajima et al. [Nakajima, T. et al. (1995), Arthritis Rheum. 38, 485-491] og Aono et al.

[Abstraets of the 38th Meeting of Japan Rheumatism Society

(1994), s. 487, og artikler fra 1994 Meeting of Japan Cancer Society (1994), s. 388] undersøkte hvorvidt cytotoksiske anti-human-Fas-antistoffer kunne indusere apoptose i unormalt prolifererte synoviocytter fra pasienter med reumatisme. De var i stand til å indusere høye nivåer av apoptose i unormalt prolifererte synoviocytter fra pasienter med reumatisme, sammenlignet med en kontroll som omfatter synoviocytter fra pasienter

med andre sykdommer enn reumatisme.

Anti-human-Fas-antistoff er således i stand til selektivt å indusere apoptose ikke bare i lymfocytter, men også i unormalt prolifererte synoviocytter, slik at anti-human- Fas-antistof f burde være anvendbart som et antireumatisk middel.

Administrering av murine, monoklonale antistoffer til mennesker som et farmasøytisk preparat ment for kronisk administrering, vil imidlertid svært sannsynlig forårsake flere forskjellige problemer på grunn av antigenisiteten som skriver seg fra den murine opprinnelse. Anafylaktisk sjokk vil sann-synligvis opptre, og gjentatt dosering kan redusere virkningsfullhet eller fremskynde reduksjon i blodnivåer etc, effekter som er uønsket dersom antistoffet skal anvendes i klinisk praksis.

Forsøk på å overvinne problemene forbundet med murine, monoklonale antistoffer har involvert anvendelse av teknikk med rekombinant DNA for å oppnå et kimært antistoff hvor det konstante område i museantistoffet er blitt erstattet med det konstante område i det tilsvarende humanantistoff [jf Morrison, S.L. et al. (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 6851-6855]. Ved en alternativ fremgangsmåte for humanisering av det murine antistoff er den murine CDR som er til stede i det variable område for museantistoff [jf Jones, P.T. et al.

(1986), Nature, 321, 522-525], blitt innføyet i humanantistoff ved en i det vesentlige ekvivalent fremgangsmåte. For å fremstille et slikt genteknisk antistoff er det først nødvendig å klone DNA som koder for både H- og L-kjedeunderenhetene som utgjør museantistoffet. Disse kjedene gjenkjenner spesifikt målantigenet slik at belysning av deres sekvenser avslører primærstrukturen til det variable område som inneholder CDR, og dette kan så brukes ved fremstillingen av et humanisert antistoff.

Hittil har det ikke vært noen beskrivelse av noen del av CDR i et monoklonalt, cytotoksisk muse-anti-human-Fas-antistoff, eller av en DNA-sekvens for dette.

O<p>pfinnelsens formål

Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å til-veiebringe én eller flere nukleotidsekvenser som koder for variable antistoffområder og som muliggjør konstruksjonen av et humanisert antistoff som er spesifikt for human-Fase.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ved et første aspekt tilveiebringer således foreliggende oppfinnelse et rekombinant protein hvor proteinet omfatter minst ett område som tilsvarer et variabelt immunoglobulinområde, hvor det i det minste ene område gjør det mulig for proteinet å gjenkjenne og spesifikt bindes til et antigen, idet antigenet er human-Fas, og hvor proteinet har i det vesentlige ikke mer immunogenisitet hos en menneskepasient enn et humanantistoff.

Andre formål, mål, aspekter og utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse vil fremtre klart nedenunder.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en skjematisk oversikt over konstruksjonen av et cDNA-bibliotek for å muliggjøre kloning av DNA som koder for hele lengden av hver underenhet i CH11, og

figur 2 er et diagram som viser fremgangsmåten for kloning og amplifisering av DNA som koder for hele lengden av hver underenhet i CH11.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Slik det her er brukt, vedrører uttrykket "rekombinant" ethvert stoff som er blitt erholdt ved hjelp av gentek-nikk, forutsatt at det aktuelle stoff enten er modifisert fra det opprinnelige stoff eller uttrykt på en annen måte eller i et annet system enn originalen.

Uttrykket "protein" vedrører generelt enhver sekvens av aminosyrerester bundet sanunen ved hjelp av peptidbroer, og kan omfatte oligopeptider så vel som polypeptider og multimer-peptider eller polypeptidsammenstillinger.

Området som tilsvarer et variabelt immunoglobulinområde, har en struktur som er karakteristisk for et variabelt immunoglobulinområde, og kan tilsvare det variable område i enten H-kjeden eller L-kjeden i et immunoglobulin. Ved de foretrukne utførelsesformer har proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse minst to slike områder, ett som tilsvarer et variabelt H-kjedeområde, og ett som tilsvarer et variabelt L-kjedeområde, som begge er spesifikke for human-Fas.

Proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse har i det vesentlige ikke mer immunogenisitet hos en menneskepasient enn et humanantistoff på grunn av det faktum at den delen av antistoffet som tilsvarer et heterologt, konstant område, ikke er til stede. Proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan således ha et variabelt område eller områder som skriver seg fra et murint, monoklonalt antistoff, men det konstante murin-område er blitt eliminert. Som et resultat av dette har proteinene ifølge oppfinnelsen bare det samme nivå av immunogenisitet som f.eks. et humanantistoff fra en alternativ kilde for pasienten på grunn av det faktum at variable murinområder er tilstrekkelig like de hos mennesker, slik at ethvert forøkt nivå av immunogenisitet bare kan skrive seg fra en eventuell annen aminosyresekvens hvor det eller de variable områdene er en del.

De variable områdene Ifølge foreliggende oppfinnelse kan skrive seg fra hvilken som helst kilde hvorfra det er mulig å frembringe antistoffer mot human-Fas. Selv om dette mest passende er mus, er det også mulig med andre kilder, slik som rotter og kaniner, selv om disse og høyere dyr er tilbøye-lige til å være mindre passende.

De variable områdene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være til stede i proteinet i hvilken som helst egnet kon-figurasjon. På sitt enkleste kan proteinet bestå hovedsakelig av bare ett variabelt område, selv om virkningsfullheten av slike proteiner er tilbøyelig til å være mye redusert. Dette skyldes delvis mangel på stabilisering av tertiærstrukturen selv om binding fortsatt kan observeres.

På et høyere nivå kan proteinet bestå hovedsakelig av ett variabelt H-kjedeområde og ett variabelt L-kjedeområde sammen i forbindelse. Slik forbindelse kan være ved direkte binding eller kan være i form av en fleksibel peptidbinding som involverer én eller flere ekstra aminosyrerester. Slike konstruksjoner har den fordel at de ikke har noen ekstra pep-tidsekvens som kan gi opphav til potensiell immunogenisitet.

Selv om det er mulig for proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse bare å ha ett variabelt område, er det foretrukket at de har minst to. Videre er det foretrukket at de to er avledet fra ett bestemt antistoff, slik som CH11, ett fra hver av H- og L-kjedene, for derved nærmere å etterligne et naturlig antistoff. I dette henseende er det ønskelig at de variable sekvensene er komplett bundet til konstante humanområder, spesielt de passende, konstante områdene fra H- og L-kjedene.

Med utførelsesformen ovenfor er det foretrukket at de to variable områdene hver for seg er en del av et større polypeptid og at de to polypeptidene er i stand til å inngå forbindelse med hverandre slik at det dannes en antistoffhetero-dimer.

Typen av antistoffet er ikke av avgjørende betydning for foreliggende oppfinnelse og kan være av hvilken som helst passende type hvor proteinet ifølge oppfinnelsen virkelig tilsvarer en antistofftype. For eksempel kan typen være IgG, IgM eller IgE, og typen kan f .eks. være helt avhengig av adminis-treringsvei. Selv om CH11 er et IgM-molekyl, kan de variable områdene like gjerne være plassert i en IgG-konstruksjon. Fak-tisk har vi oppdaget at dersom en IgM-typekonstruksjon anvendes, men uten J-kjeden som danner en pentamerantistoffstruktur med 5 tunge og lette kjedepar, økes apoptotisk aktivitet fem ganger eller til og med mer.

Det vil forstås at foreliggende oppfinnelse videre tilveiebringer DNA og RNA som koder for hvilket som helst av de ovenfor identifiserte proteiner, spesielt DNA. Nevnte DNA kan ganske enkelt kode for proteinet, eller kan f.eks. kode for et bestemt polypeptid dersom proteinet er heterodimert.

Det vil også forstås at nevnte DNA kan være i hvilken som helst egnet form slik at den kan inkorporeres i en vektor, passende en ekspresjonsvektor. Den kan også være forbundet med hvilke som helst andre egnede sekvenser, slik som ledersek-venser, eller f.eks. sekvenser for ekspresjon av det kodede

•protein i form av et fusjonsprotein.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en vertscelle transformert med en vektor som definert ovenfor, og et system for ekspresjon av et protein ifølge oppfinnelsen som omfatter en slik vertscelle transformert med én eller flere ekspresjonsvektorer som inneholder den ovenfor nevnte DNA. Proteinet ifølge oppfinnelsen kan erholdes fra slike systemer etter dyrking av systemet ved hjelp av standardteknikker.

Visse, foretrukne aspekter og utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse følger nå: Et genteknisk fremstilt immunoglobulinprotein som spesifikt binder til human-Fas hvor immunoglobulinproteinet består hovedsakelig av en H-kjedeunderenhet og en L-kjedeunderenhet, idet H-kjedeunderenheten omfatter en aminosyresekvens representert ved den følgende generelle

formel (I):

hvor FRH1er en aminosyresekvens som omfatter 13-30 aminosyrerester, CDRHXer aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 1, FRH2er en aminosyresekvens som omfatter 14 aminosyrerester, CDRH2er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 2, FRH3er en aminosyresekvens som omfatter 32 aminosyrerester, CDRH3er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 3, og FRH4er en aminosyresekvens som omfatter 11 aminosyreres ter, hvor hver aminosyresekvens er bundet til den neste via en peptidbinding; hvor L-kjedeunderenheten omfatter en aminosyresekvens representert ved den følgende generelle formel (II):

hvor FRLXer en aminosyresekvens som omfatter 23 aminosyreres ter, CDRLjer aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 4, FRL2er en aminosyresekvens som omfatter 15 aminosyrerester, CDRL2er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 5, FRL3er en amino-

syresekvens som omfatter 32 aminosyrerester, CDRL3er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 6, og FRL4er en aminosyresekvens som omfatter 10 aminosyrerester, idet hver av aminosyresekvensene er bundet til den neste via en peptidbinding.

Det ovenfor nevnte protein er foretrukket når H-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr. 1-116 i SEKV.ID NR. 8, og/eller hvor L-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr. 1-112 i SEKV.ID NR. 10.

Det ovenfor nevnte protein er mer foretrukket når H-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr. 1-571 i SEKV.ID NR. 8, og/eller L-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr. 1-219 i SEKV.ID NR. 10.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre DNA som koder for en H-kjedeunderenhet som omfatter et peptid med formel (I) som definert ovenfor. Vi foretrekker slik DNA når den omfatter nukleotidsekvensen representert ved nukleotidene nr. 58-405 i

SEKV.ID NR. 7.

Også foretrukket er DNA som hybridiserer med slik DNA, idet sensetråden koder for en immunoglobulin H-kjedeunderenhet som er i stand til spesifikt å binde human-Fas, sammen med en L-kjedeunderenhet som omfatter en aminosyresekvens med den generelle formel (II). Det er foretrukket at sl DNA er i stand til å hybridisere ved 60-70 °C og i 6 x SSC.

DNA som koder for en L-kjedeunderenhet som omfatte en aminosyresekvens representert ved den generelle formel (II), er også foretrukket, spesielt når den omfatter nuklec tidsekvensen representert ved nukleotidene nr. 58-393 i SEKV.ID NR. 9. DNA som hybridiserer slik DNA og hvis tilsv ende sensetråd koder for en immunoglobulin L-kjedeunderen)

som spesifikt binder til human-Fas-antlgen, sammen med en kjedeunderenhet som definert ovenfor, som omfatter en ami syresekvens med den generelle formel (I), er også foretr'spesielt når hybridisering skjer ved 60-70 °C i 6 x SSC.

Videre foretrukket er en rekombinant DNA-vekto inneholder hvilken som helst av den DNA som er beskreve for, særlig de rekombinante DNA-vektorene pCR3-H123 og

L103, celler transformert med slike vektorer og spesielt E. colt pCR3-H123 (FERM BP-5247) og E. colt pCR3-L103 (FERM BP-5248).

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulinprotein som spesifikt gjenkjenner human-Fas-antigen, omfatter: dyrking av en celle transformert ved hjelp av en DNA-vektor beskrevet ovenfor under betingelser som muliggjør ekspresjon av DNA som koder for immunoglobulin H-kjede- eller L-kjedeunderenheten som finnes i vektoren, og

utvinning av immunoglobulinproteinet fra kulturen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av CDR-er, uansett om de er bundet eller ikke bundet ved hjelp av rammeområder (FR-er) som identifisert ovenfor, og DNA som koder for slike, ved konstruksjon av humaniserte antistoffer og proteiner generelt, som selektivt binder human-Fas.

Hovedsakelig har vi nå med hell klonet genene som koder for hver av H-, L- og J-kjedene i et monoklonalt anti-human- Fas-IgM-antistoff. Et cDNA-bibliotek fremstilt fra et hybridom som produserer antistoffet, ble brukt, og det var mulig å klarlegge hele nukleotidsekvensen i hvert gen og deres tilsvarende aminosyresekvenser. Ut fra disse var det mulig å oppnå CDR-sekvensene til H- og L-kjedene. Ekspresjonsvektorer som omfatter H-, L- og J-kjedene, ble konstruert, og det ble funnet at cytotoksiske proteiner med lignende aktivitet mot anti-human-Fas-antistoff lot seg erholde fra supernatanten i en kultur erholdt ved samtransfektering av dyrkede dyreceller med disse vektorene.

DNA ifølge foreliggende oppfinnelse kan fås ved først å fremstille poly(A)<*>RNA fra musehybridomceller som produserer monoklonalt anti-humant-Fas-antistoff, slik som CH11. Poly(A)<*>RNA-en kan så omdannes til cDNA ved å anvende en reverstranskriptase og rense cDNA-en som koder for H-, L- og eventuelt J-kjeden i antistoffet. Yonehara et al. [(1989), J. Exp. Med. 169, 1747 et seg.] oppnådde et monoklonalt anti-humant-Fas-antistof f som ble betegnet CH11, ved fusjon av musemyelomceller med muselymfocytter etter at musene var blitt immunisert med den Fas-uttrykkende humandiploidfibroblastcel- lelinje FS-7. CHll-antistoffet er konunersielt tilgjengelig fra Medical Biological Laboratory Co., Ltd., Japan.

Poly(A)<*>RNA kan fås enten ved først å fremstille total-RNA og så rense poly(A)<*>RNA fra total-RNA-en under anvendelse av f.eks. en affinitetskolonne pakket med oligo(dT)-cellulose, oligo(dT)-latekskuler, etc, eller den kan fås ved å rense poly(A)<*>RNA direkte fra cellelysater under anvendelse av slike affinitetsmaterialer som beskrevet ovenfor. Total-RNA kan f.eks. fremstilles ved hjelp av slike metoder som: alkalisk sukrosedensitetsgradientultrasentrifugering [jf Dougherty, W.G. og Hiebert, E. (1980), Virology, 101, 466-474], guanidintiocyanat-fenol-metoden, guanidintiocyanat-trifluorcesium-metoden og fenol-SDS-metoden. Ved den foretrukne fremgangsmåte gjøres det imidlertid bruk av guanidintiocyanat og cesium-klorid [jf Chirgwin, J.M. et al. (1979), Biochemistry, 18, 5294-5299] .

Den enkelttrådede (ss) cDNA erholdt ved anvendelse av reverstranskriptase som beskrevet ovenfor, kan så omdannes til dobbelttrådet (ds) cDNA. Egnede fremgangsmåter for erholdelse av ds-cDNA-en omfatter Sl-nukleasemetoden [jf Efstratiadis, A. et al. (1976), Cell, 7, 279-288] og Gubler-Hoffman-metoden [jf Gubler, U. og Hoffman, B.J. (1983), Gene, 25, 263-269]. Vi foretrekker imidlertid å anvende Okayama-Berg-metoden [jf Okayama, H. og Berg, P. (1982), Mol Cell. Biol. 2, 161-170].

Den ovenfor erholdte ds-cDNA kan så integreres i en kloningsvektor, og den resulterende, rekomblnante vektor kan så anvendes til å transformere en egnet mikroorganisme, slik som E. coil. Trans formant en kan så velges ut ved å anvende en standardmetode, slik som ved utvelgelse med hensyn på tetra-syklinresistens eller ampicillinresistens som kodes for av den rekomblnante vektor. Dersom E. coli anvendes, kan transforma-sjon utføres ved hjelp av Hanahan-metoden [jf Hanahan, D.

(1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580]. Alternativt kan den rekomblnante vektor innføres i kompetente celler fremstilt ved hjelp av sameksponering for kalsiumklorid og enten magnesiumklorid eller rubidiumklorid. Dersom det anvendes et plasmid som vektor, er det svært ønskelig at plasmidet inneholder et legemiddelresistent gen, slik som nevnt ovenfor, for å lette utvelgelse. Det er mulig med brutal utvelgelse, men ikke foretrukket. Selv om plasmider er blitt omtalt, vil det forstås at andre kloningsredskaper, slik som lambda-fager, kan anvendes. Fremgangsmåter for utvelgelse av transformanter med den ønskede DNA omfatter de følgende: (1) Screening under anvendelse av en syntetisk oligonukleotidprobe Dersom hele eller en del av aminosyresekvensen til det ønskede protein er blitt belyst, kan en kort sammenheng- ende sekvens som også er representativ for det ønskede protein, anvendes til å konstruere en oligonukleotidprobe. Proben koder for aminosyresekvensen, men det kan, på grunn av den genetiske kodes degenerasjon, være et stort antall prober som kan fremstilles. Det vil således normalt bli valgt en amino syresekvens som bare kan kodes for av et begrenset antall oligonukleotider. Antallet oligonukleotider som det er nødven-dig å fremstille, kan reduseres ytterligere ved utbytting av inosin der hvor hvilken som helst av de fire normale basene kan anvendes. Proben merkes så på passende måte, slik som med<32>P,<35>S eller biotin, og hybridiseres så med denaturert, transformert DNA fra transformanten som er blitt immobilisert på et nitrocellulosefilter. Positive stammer viser seg ved påvisning av markøren på proben.

(2) Polymerasekjedereaksj on

Dersom hele eller en del av aminosyresekvensen til det ønskede protein er blitt klarlagt, kan sense- og anti-senseoligonukleotidprimere som tilsvarer separate, ikke-sam-menhengende deler av aminosyresekvensen, syntetiseres, slik som ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet i (1) ovenfor. Disse primerne kan så anvendes i polymerasekjedereaksjonstek-nikken [jf Saiki, R.K. et al. (1988), Science, 239, 487-491] under anvendelse av templat-DNA-en. Templat-DNA-en som her anvendes, kan være cDNA syntetisert ved hjelp av en revers-transkriptasereaksjon under anvendelse av mRNA erholdt fra et hybridom som fremstiller anti-human-Fas-antistoff, slik som det som uttrykker CH11. Det således syntetiserte DNA-fragment kan enten bli integrert direkte i en plasmidvektor, slik som ved anvendelse av et kommersielt sett, eller kan merkes med f.eks.32P,<35>S eller biotin, og så anvendes som en probe for kolonihybridisering eller plakkhybridisering, hvorved man får den ønskede klon.

Monoklonalt antistoff CH11 er et immunoglobulin M-molekyl ("IgM"), et kompleks som omfatter fem underenheter hver av H- (u-kjeden) og L-kjeden, og én J-kjede. For å klarlegge partielle aminosyresekvenser for underenhetene må således underenhetene separeres, og dette kan gjøres ved å anvende en egnet teknikk, slik som elektroforese, kolonnekroma-tografi, etc. som er godt kjent for fagfolk innen teknikken. Så snart underenhetene er blitt separert, kan de sekvenseres, slik som ved anvendelse av et automatisk proteinsekvenserings-apparat (f.eks. PPSQ-10 fra Shimadzu), for å bestemme aminosyresekvensen til i det minste N-enden av hver underenhet. Oligonukleotider/primere kan så fremstilles ved å anvende denne kunnskap.

Innhøsting av DNA som koder for hver underenhet av det monoklonale anti-human-Fas-antistoff, fra de passende transformanter erholdt ovenfor, kan utføres ved hjelp av velkjente teknikker, slik som de beskrevet av Maniatis, T. et al.

[i "Molecular Cloning a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)]. For eksempel kan det området i DNA som koder for den ønskede underenhet, fjernes fra plasmid-DNA etter å ha skilt fraksjonen som tilsvarer vektor-DNA-en, fra en transformant som er blitt bestemt til å ha det nødvendige plasmid.

E. coll-DH5a er blitt transformert med plasmider som inneholder DNA som koder for tung-, lett- og J-kjeden i CH11, fremstilt som beskrevet ovenfor, og de resulterende tre transformanter (betegnet henholdsvis E. colt pCR3-H123, E. coil pCR3-L103 og E. coli pCR3-J1123) er blitt deponert i overensstemmelse med bestemmelsen i Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer ved Research Institute of Life Science Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 28. februar 1996, og er blitt tildelt deponeringsnumrene henholdsvis FERM BP-5427, FERM BP-5428 og FERM BP-5429. E. coli DH5a inneholdende disse plasmidene, kan dyrkes på en direkte sammenlignbar måte med E. coil DH5a som ikke har disse plasmidene. Alle deponerte stammer kan velges ut etter sin resistens mot ampicillin. DNA-en ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor fås ved å anvende disse deponeringene. Dette kan f.eks. gjøres enten ved å dyrke deponeringene og isolere plasmidene, eller ved å anvende polymerasekjedereaksjonen (PCR) under anvendelse av plasmidene som templater.

Der det er passende kan DNA-sekvenser sekvenseres i overensstemmelse med forskjellige velkjente metoder innen teknikken, inkludert f.eks. den kjemiske modifikasjonsteknikken til Maxam-Gilbert [jf. Maxam, A.M. og Gilbert, W. (1980) i "Methods in Enzymology" 65, 499-276] og dideoksykjedeterminer-ingsmetoden under anvendelse av M13-fag [jf Messing, J. og Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269-276]. I de senere år har en ytterligere fremgangsmåte for sekvenser av DNA vunnet bred anerkjennelse og omfatter bruken av et fluorogent fargestoff istedenfor den vanlige, radioaktive isotop i dideoksymetoden. Hele prosessen er datamaskinstyrt, inkludert avlesningen av nukleotidsekvensen etter elektroforese. Egnet apparatur for denne prosessen er f.eks. Perkin-Elmer sekvensroboten "CATA-LYST 800" og Perkin-Elmer modell 373A DNA-sekvenseringsapparat. Anvendelsen av denne teknikk gjør bestemmelsen av DNA-nukleotidsekvenser både effektiv og sikker.

Fra de således bestemte nukleotidsekvenser for den DNA som koder for H- og L-kjedene i CH11, sammen med sekvensdataene for N-endene av H- og L-kjedene, var det følgelig mulig å bestemme hele aminosyresekvensen til H- og L-kj edene i CH11.

Rammeområder (FR-er) er til stede i de variable områdene til H- og L-kjedene i immunoglobuliner og tjener til å flankere det variable område og skille CDR-ene fra hverandre. Følgelig er det én mer FR sammenlignet med antall CDR-er i hvert variabelt område. Rammeområdene bidrar også til den tre-dimensjonale struktur til det variable område for derved å hjelpe til ved antigen binding ved å stabilisere tertiærstrukturen til området. Som illustrasjon av terminologien anvendt til hver FR og CDR i det variable område, er FR^ rammeområdet i N-enden av det variable område i H-kjeden. Når man arbeider seg mot C-enden, finner man henholdsvis CDRHlfFRH2, CDRH2, FRH3, CDRH3og til sist FRH4. En lignende nomenklatur gjelder for L-kjeden slik at det første rammeområde betegnes FRL1#etc.

Både immunoglobulin H- og L-kjedene omfatter et variabelt område og et konstant område. Det variable område er sammensatt av CDR-er, og, som beskrevet ovenfor, både H-kjeden og L-kjeden har tre CDR-er bundet sammen med hverandre og flankert av fire rammeområder.Aminosyresekvensene til de konstante områdene er de samme, uansett antigen som gjenkjen-nes, og dette er tilfellet for både H- og L-kjedene hver for seg, forutsatt at immunoglobulinklassen er den samme. I mot-setning til dette er aminosyresekvensen til det variable område, særlig CDR-ene, egenartet for hvert antistoff. Ifølge en sammenligningsundersøkelse vedrørende aminosyresekvenser til et antall antistoffer er imidlertid både lokaliseringen av CDR-ene og lengden av rammesekvensene som binder dem sammen, praktisk talt konstant mellom antistoffenheter av den samme undergruppe [Kabat, E.A. et al. (1991), i "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol. II": U.S. Department of Health and Human Services]. Med denne kunnskap er det derfor mulig å bestemme lokaliseringen av CDR-ene, rammeverksområdene og det konstante område i hver av H- og L-kjedene til CH11 ved sammenligning av aminosyresekvensene vi hadde bestemt med de kjente aminosyresekvensene.

Det vil forstås at rammeområdene er viktige for å skille CDR-ene fra hverandre og hjelpe til ved den steriske bestemmelse av struktur til de variable områder, men at, forutsatt at disse kravene imøtekommes, er den virkelige størr-else og sekvens til hvert rammeområde ikke av avgjørende betydning for foreliggende oppfinnelse, forutsatt at FR-ene ikke er ansvarlige for binding av antigenet. Følgelig kan hvilken som helst egnet aminosyresekvens anvendes for hvert FR. Det ble imidlertid observert at rammeområder konserveres sammen i naturen, og av denne grunn foretrekker vi generelt å bibeholde områder som enten er identiske med eller som nært tilsvarer de som finnes i CH11 (Yonehara et al., supra).

Selv om kjedelengdene til rammeområdet generelt be- vares i det vesentlige, spesielt innenfor immunoglobulinunder-typer, er det blitt fastslått at FRHXsom befinner seg i N-enden av H-kjeden, noen ganger kan være kortere enn forventet. Istedenfor 30 aminosyrer kan således FRHXvære så kort som 13 aminosyrer i muse-lgM, og det er blitt fastlagt en minimal lengde på 19 aminosyrer for en u 2a-undertype for CH11 [jf Kabat et al., ibid]. Kjedelengden til rammeområdet i N-enden av H-kjeden kan følgelig være hva som helst mellom 13 og 30 aminosyrer. Dette området er fortrinnsvis fra 19 til

30 aminosyrer og mest foretrukket 30 aminosyrer.

Generelt vil det forstås at rammeområdene i begge endene av det variable område (FRHXog FRH4i H-kjeden) er av mindre betydning enn de interstitielle rammeområdene som fak-tisk forbinder CDR-ene (FRH2og FRH3i H-kjeden). De flanker-ende rammeområder kan følgelig variere med opp til ca. 60% i lengde fra normen for enhver gitt antistofftype, mens de interstitielle rammeområder kan variere i lengde bare i en begrenset utstrekning som vanligvis er bare ca. én aminosyre. I noen tilfeller vil enhver variasjon i lengde kunne resultere i vesentlig redusert virkningsfullhet, og fagfolk innen teknikken vil lett være i stand til å fastslå de nødvendige para-metrene for enhver gitt konstruksjon med variabelt område.

Dersom det er ønsket å konstruere en endret sekvens hvor hvilken som helst eller hvilke som helst aminosyrer er delert i aminosyresekvensen, kan f.eks. kassettmutasjons-metoden anvendes [jf Toshimitsu Kishimoto, "Shin-Seikagaku Jikken Kouza (New Biochemistry Experiment Series) II: Nucleic Acid III, Recombinant DNA Technology", s. 242-251].

Hvilke som helst passende aminosyresekvenser kan bindes til den C-terminale ende av begge variable områder forutsatt at de ikke skadelig påvirker antigenbindingsevnen til antistoffet, med mindre dette er av en bestemt grunn, slik som for å danne et forløpermolekyl, f.eks. i form av en ledersek-vens. Når det er til stede en C-terminal sekvens, foretrekker vi generelt at den tilsvarer et humant, konstant område fra den passende H- og L-kjede.

DNA ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst egnet fremgangsmåte, slik som ved kjemisk syntese under anvendelse av vanlige metoder, slik som fosfattriestermetoden [jf Hunkapiller, M. et al. (1984), Nature 310, 105-111, og Grantham, R. et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9, r43-r74]. De forskjellige kodonene for aminosyrer er velkjente, og deres utvelgelse kan være totalt vil-kårlig selv om det generelt er foretrukket å gjøre utvelgelsen basert på hyppigheten av bruk av kodonene for den utvalgte vert. Dersom en annen teknikk enn direkte kjemisk syntese anvendes, kan det være ønsket å delvis modifisere kodonene i den oppnådde sekvens, og dette kan f.eks. utføres ved hjelp av setespesifikk mutagenese [jf Mark, D.F. et al. (1984), Proe.Nati. Acad. Sei. USA, 82, 5662-5666] under anvendelse av, som primere, syntetiske oligonukleotider som innlemmer den ønskede modifikasjon.

Ved foreliggende oppfinnelse hvor det er spesifisert at DNA kan hybridisere med annen DNA, kan dette fastslås ved hjelp av teknikker som er godt kjent innen fagområdet. For eksempel kan, for å fastslå hvorvidt en viss sekvens hybridiserer med enhver annen bestemt sekvens, én eller annen sekvens merkes med f.eks. [a-<32>P] dCTP under anvendelse av den vilkår-lige primermetoden [jf Feinberg A.P. og Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem., 132, 6-13] eller f.eks. "nick"-translåsjons-metoden [Maniatis, T. et al. (1982), i "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY]. Én DNA-tråd anvendt ved en hybridiseringstest, adsorberes passende på f.eks. en nitrocellulosemembran eller en nylonmembran og immobiliseres på denne ved oppvarming eller UV-bestråling under anvendelse av vanlige metoder. Ved én bestemt utførel-sesform kan membranen så senkes ned i en prehybridiseringsopp-løsning Inneholdende 6 x SSC, 5% (volum/volum) Denhardts opp-løsning og 0,1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS), og det kan inkuberes ved 55 °C i over 4 timer. Den andre, merkede tråd tilsettes så til prehybridiseringsoppløsningen inntil en endelig spesifikk aktivitet på 1 x 10<6>cpm/ml, og det inkuberes over natten ved 60 °C. Deretter vaskes membranen i 6 x SSC ved romtemperatur fem ganger i 5 minutter hver gang. Etter videre vasking ved 57 "C i 20 minutter underkastes membranen så auto-radiografi for å bestemme hvorvidt hybridisering har funnet sted. DNA-hybridisering med DNA ifølge foreliggende oppfinnelse kan således fremstilles og isoleres [Maniatis, T. et al.

(1982) i "Molecular doning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY].

Integrering av DNA ifølge foreliggende oppfinnelse som således oppnås i en ekspresjonsvektor, muliggjør transfor-masjon av prokaryote eller eukaryote vertsceller. Slike ekspresjonsvektorer vil vanligvis inneholde egnede promotere, replikasjonsseter og sekvenser som er involvert i genekspre-sjon, noe som gjør det mulig for DNA å bli uttrykt i vertscel-len.

Egnede, prokaryote vertsceller omfatter f.eks. E. coli ( Escherichia coli) og Bacillus subtil is. For å uttrykke genet av interesse i slike vertsceller kan disse vertscellene transformeres med en plasmidvektor som inneholder et replikon avledet fra en art som er forenlig med verten, vanligvis med et replikasjonsopprinnelsessted og en promotersekvens, slik som lac-UV5. Disse vektorene har fortrinnsvis sekvenser som er i stand til å tilføre den transformerte celle en seleksjons-fenotype.

En egnet stamme av E. coli er stamme JM109 avledet fra E. coli K12. Egnede vektorer omfatter pBR322 og plasmidene i pUC-serien. Egnede promotere omfatter laktosepromoteren (lac) og tryptofanlaktosepromoteren (tre). Generelt vil det forstås at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til anvendelsen av8like verter, vektorer, promotere, etc, som ek-semplifisert her, og at hvilke som helst egnede systemer, om ønsket, kan anvendes.

En egnet, foretrukket stamme av Bacillus subtilis er stamme 207-25, og en foretrukket vektor er pTUB228 [jf Ohmura, K. et al. (1984), J. Biochem., 95, 87-93]. En egnet promoter er regulatorsekvensen i Bacillus subtills-a-amylasegenet. Om ønsket, kan DNA-sekvensen som koder for signalpeptidsekvensen i a-amylase, bindes til DNA-en ifølge foreliggende oppfinnelse for å muliggjøre ekstracellulær utskillelse.

Egnede, eukaryote celleverter omfatter de som stammer fra hvirveldyr, gjær, etc. Egnede hvirveldyrceller omfatter f.eks. apecellelinjen [jf Gluzman, Y. (1981), Cell, 23, 175- 182]. Egnede gjær omfatter Saccharomyces cerevxsiae og Schizo-saccharomyces pombe.

Generelt er kravene til egnede ekspresjonsvektorer for hvirveldyrceller at de omfatter: en promoter som vanligvis er oppstrøms for genet som skal uttrykkes, et RNA-spleisesete, et polyadenyleringssete og en transkripsjonstermineringssek-vens, etc. Som ønsket, kan de i tillegg, om nødvendig, inneholde et replikasjonsopprinnelsessted. Et egnet plasmid er pSV2dhfr som inneholder SV40-tidligpromoteren [jf Subramani,

S. et al. (1981), Mol. Cell. Biol., 1, 854-884].

Egnede, eukaryote mikroorganismer er gjær, slik som S. cerevtstae, og egnede ekspresjonsvektorer for gjær omfatter pAH301, pAH82 og YEp51. Egnede vektorer inneholder f.eks. promotere til alkoholdehydrogenasegenet [jf Bennetzen, J.L. og Hall, B.D. (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018-3025] eller kar-boksypeptidase-Y-GAL10-promoteren [jf Ichikawa, K. et al.

(1993), Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1686-1690]. Om ønsket, kan DNA-sekvensen som koder for signalpeptidsekvensen til kar-boksypeptidase Y, være bundet til DNA-en som skal uttrykkes, for å muliggjøre ekstracellulær utskillelse.

I det tilfellet COS-celler anvendes som verter, omfatter egnede vektorer SV40-replikasjonsopprinnelsesstedet som muliggjør autonom vekst, en transkripsjonspromoter, et transkripsjonstermineringssignal og et RNA-spleisesete. Eks-presjonsvektorene kan anvendes til å transformere cellene ved hjelp av hvilken som helst egnet metode, slik som DEAE-deks-tranmetoden [jf Luthmann, H. og Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 12, 1295-1308], fosfatkalsium-DNA-samutfellings-metoden [jf Graham, F.L. og van der Eb, A.J. (1973), Virology, 52, 456-457] og elektroporasjonsmetoden med elektrisk puls [jf Neumann, E. et al. (1982), EMBO J., 2, 841-845]. Ved en foretrukket utførelsesform samtransfekteres COS-celler med to separate ekspresjonsvektorer, én som inneholder DNA som koder for et protein som omfatter det variable område i H-kjeden til CH11, og én som inneholder DNA som koder for et protein som omfatter det variable område i L-kjeden til CH11, idet disse vektorene uttrykkes samtidig for å frembringe et rekombinant, anti-humant Fas-antistoff.

Transformanter ifølge foreliggende oppfinnelse kan dyrkes ved å anvende vanlige metoder, idet de ønskede proteiner uttrykkes enten intra- eller ekstracellulært. Egnede kulturmedier omfatter forskjellige vanlig brukte medier og vil generelt bli valgt ut etter den valgte vert. For eksempel omfatter egnede medier for COS-celler RPMI-1640- og Dulbeccos modifiserte Eagles minimalessensielle medium som, om ønskes, kan suppleres med bovint fosterserum (FBS). Kulturtemperaturen kan være hvilken som helst egnet temperatur som ikke på merk-bar måte undertrykker cellens evne til proteinsyntese og er fortrinnsvis i området 32-42 °C, mest foretrukket 37 °C, spesielt for pattedyrceller. Om ønsket, kan dyrkingen utføres i en atmosfære som inneholder 1-10% (volum/volum) karbondiok-sid.

Proteinet uttrykt ved hjelp av transformantene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan isoleres og renses ved hjelp av forskjellige velkjente fremgangsmåter for separasjon, alt etter hvorvidt proteinet uttrykkes intra- eller ekstracellulært, og avhengig av slike vurderinger som de fysiske og kjemiske egenskapene til proteinet. Egnede, spesifikke fremgangsmåter for separasjon omfatter: behandling med vanlig anvendte utfel-lingsmidler for protein, forskjellige kromatografimetoder, slik som ultrafiltrering, molekylsiktkromatografi (gelfiltrer-ing), adsorp8jonskromatografi, ionebytterkromatografi, affini-tetskromatografi og væskekromatografi med høy yteevne (HPLC), dialyse og kombinasjoner derav.

Ved anvendelse av slike metoder som beskrevet ovenfor, kan det ønskede protein lett erholdes i høye utbytter og ved høy renhet. Antistoffet fremstilt ved den foretrukne ut-førelsesform, kan mangle J-kjeden dersom det ikke er noe ekstra plasmid som koder for J-kjeden. I et slikt tilfelle har vi fastslått at de resulterende H- og L-kjedeheterodimerene har en cytotoksisitet som er omtrent fem ganger høyere enn cytotoksisiteten til CH11.

Den spesifikke bindingsaktivitet til proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse for Fas-antigen kan bestemmes f.eks. ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Ved én bestemt utførelsesform av ELISA immobiliseres Fas-antigen på bunnen av brønner i en 96-brønners plate, og testprotein inn- føres i brønnene, hvoretter cellene vaskes for å fjerne ubun-det protein. Etter vasking eksponeres brønnene for et enzym-merket antistoff som er spesifikt for proteinet, slik som det konstante område i proteinet. Cellene vaskes så på nytt, og en eventuell markør som er tilbake i brønnen, påvises. cDNA som koder for human-Fas-antigen, er tidligere blitt beskrevet, og fremgangsmåter for innføring av cDNA i dyreceller for ekspresjon derav, er også kjent [jf Itoh, N. et al. (1991), Cell 66, 233-243]. Antigen for anvendelse i den ovenfor nevnte ELISA-metode kan fås fra kultursupernatanten til celler som er blitt transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende genet som koder for et fusjonsprotein omfattende det ekstracellulære område i human-Fas-antigenet og det ekstracellulære område i muse-interleukin-3-reseptoren, som beskrevet i Itoh (supra).

Cytotoksisitet for proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fastslås f.eks. ved A dyrke celler som uttrykker Fas {f.eks. human lymfocyttcellelinje HPB-ALL [jf Morikawa, S. et al. (1978), Int. J. Cancer, 21, 166-170] og Jurkat (American Type Culture No. TIB-152)} i medium hvor testprøven er blitt eller vil bli tilsatt, og bestemme overlevelsesfor-holdet ved hjelp av MTT-analyse [jf Green, L.M. et al. (1984), J. Immunological Methods, 70, 257-268].

Ved å anvende DNA-en ifølge foreliggende oppfinnelse kan det konstrueres kimært museantistoff hvor de konstante områdene er blitt erstattet med de konstante områdene i huraan-immunoglobulin [jf Morrison, S.L. et al. (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 6851-6855].

Likeledes er det mulig å konstruere en Fv-fraksjon sammensatt hovedsakelig bare av de variable områdene i H- og L-kjedene hvor denne er en enkel tkjede-Fv (scFv) [jf Hus ton, J.S. et al. (1988), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, 5879 et seg.] hvor H- og L-kjedene er bundet sammen ved hjelp av et fleksibelt peptid.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan

således anti-Fas-antistoff med en redusert immunogenisitet hos mennesker fremstilles ved å konstruere et humanisert antistoff som omfatter de konstante områdene i humanantistoff sammen med CDR-ene i et murint human-anti-Fas-antistoff [jf Jones, P.T.

et al. (1986), Nature, 321, 522-525].

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter og terapeutiske preparater for behandling av til-standene henvist til ovenfor. Slike preparater omfatter vanligvis en terapeutisk effektiv mengde av proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer for dette. Preparatet kan administreres på hvilken som helst egnet måte, slik som ved hjelp av parenteral, intra-venøs, subkutan eller topisk administrering. Når tilstanden som skal behandles er lokal, er det særlig foretrukket å ad-ministrere proteinet så nært stedet som mulig. For eksempel kan det oppleves alvorlig reumatisk smerte i store ledd, og proteinet kan administreres på slike steder. Systemisk admin-istrerte proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse administreres særlig foretrukket i form av en pyrogenfri, terapeutisk, særlig parenteralt, akseptabel, vandig oppløsning. Fremstillingen av slike farmasøytisk akseptable proteinoppløs-ninger når det gjelder slike aspekter som pH, isotonisitet, stabilitet og lignende, er godt innenfor kunnskapen til fagfolk på området. I tillegg kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte slike ytterligere ingredienser som kan vurderes som passende, slik som cellevekstretarderingsmidler og andre medikamenter.

Doseringsregimet for de forskjellige tilstander som kan behandles med proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse, vil lett være åpenbare for fagfolk innen teknikken, idet det tas i betraktning forskjellige faktorer, slik som tilstanden, kroppsvekten, kjønnet og kosten til pasienten, alvorligheten av eventuelle symptomer, tidspunkt, ønskeligheten av gjentatt behandling samt eventuelle andre passende, kliniske faktorer. Som en generell retningslinje bør den daglige dose vanligvis være i området 1-1 000 ug protein pr. kg kroppsvekt.

Oppfinnelsen vil nå bli forklart nærmere under hen-visning til de følgende eksempler, hvor eksemplene er illus-trerende, men ikke bindende, for foreliggende oppfinnelse. Eventuelle metoder, fremstillingsoppløsninger og lignende som ikke er spesifikt definert, kan finnes i "Molecular Cloning - A Laboratory Handbook" (supra). Alle oppløsninger er vandige og laget i sterilt, avionisert vann med mindre noe annet er angitt.

Eksempel 1

Kloning av DNA som koder for det variable område i monoklonalt museantistoff CH11 mot human- Fas- antigenet

(1-1) Fremstilling av polv( A)! RNA

Total-RNA ble fremstilt fra et CH11-produserende hybridom (erholdt fra Yonehara, supra) i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet av Chirgwin og medarbeidere [se Chirgwin, J.M. et al. (1979), Biochemistry, 18:5294]. Nærmere bestemt ble det CH11-produserende hybridom [se Yonehara, S. et al., (1994), International Immunology 6, 1849-1856] dyrket i ASF 104-medium (Ajinomoto) inneholdende 10% (volum/volum) bovint fosterserum (Gibco). Omtrent 6,7 x IO<8>celler ble inn-høstet ved sentrifugering, og supernatanten ble kassert. Den resulterende pellet av celler ble så blandet straks med 60 ml 4 M guanidintiocyanatoppløsning (Fluka). Cellene i den resulterende suspensjon ble deretter lysert ved å aspirere cellesuspensjonen gjennom en sprøyte utstyrt med en nål av størr-else 21 tre ganger. Det således erholdte cellelysat ble belagt på 3 ml 5,7 M cesiumklorid/O,1 M EDTA-oppløsning (pH 7,5) i et ultrasentrifugeringsrør (13PA:Hitachi Koki), og røret ble sentrifugert i en Hitachi RPS-40T-sentrifuge (13PA-rør, 150 000 x g ved 20 °C i 18 timer) for å utfelle RNA-en. Den utfelte RNA ble oppløst i vann, det ble ekstrahert med kloroform/1-butanol (4:1, volum/volum) og så på nytt utfelt med 100% etanol.

Poly(A)<*>RNA ble deretter renset fra den totale, resulterende RNA fremstilt ovenfor, ved hjelp av rutinemetoder [jf Maniatis, T. et al. (1988), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2. utg.), Cold Spring Harbor Lab., 7.26-7.28]. Nærmere bestemt ble en engangspolystyrenkolonne (0,7 cm i diameter) pakket med 100 mg oligo dT-cellulose (Pharmacia, type 7). Kolonnen ble ekvilibrert med en ladningsbuffer omfattende

20 mM tris-saltsyre (pH 7,6), 0,5 M natriumklorid, 1 mM etylendiamintetraacetat (EDTA) og 0,1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS). Total-RNA (omtrent 1,2 mg) ble så oppløst

i et totalvolum på 400 ul vann ved å varme opp ved 65 °C i 5 minutter, og så ble 400 ul ladningsbuffer (laget ved det dobbelte av den ovenfor nevnte konsentrasjon) tilsatt til opp-løsningen. Den resulterende blanding ble avkjølt til romtemperatur og så helt over på kolonnen. Fraksjonen som passerte rett gjennom kolonnen, ble utvunnet, varmet opp ved 65 "Ci ytterligere 5 minutter og helt tilbake på kolonnen. Kolonnen ble deretter vasket med 10 ml ladningsbuffer og så ytterligere vasket med 5 ml ladningsbuffer inneholdende 0,1 M natriumklorid for å fjerne ikke-adsorbater og også ikke-spesifikke adsorbater. Deretter ble 5 ml elueringsbuffer [10 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 1 mM EDTA og 0,05% (vekt/volum) SDS] helt på kolonnen for å eluere spesifikke adsorbater. Det resulterende eluat ble utvunnet i fraksjoner å 200 pl. Den tredje og fjerde 200 pl elueringsfraksjon (400 pl totalt) ble slått sammen og blandet med 40 pl 3 M natriumacetat (pH 4,0) og 1 ml etanol. Den resulterende blanding ble lagret ved -20 °C over natten. Den neste dag ble blandingen sentrifugert i en sentrifuge (10 000 x g, 4 °C i 10 minutter) for å utvinne pel let en. Denne pellet ble brukt som poly (A) *RNA-prøven og ble lagret ved -80 °C inntil den var påkrevet for bruk.

(1-2) Klonin<g>av DNA som koder for de variable områder

cDNA-fragmenter som koder for de variable områder i H- og L-kjeden i muse-anti-Fas-antigen (CH11), ble klonet ved hjelp av "RT-PCR" som kombinerer reverstranskripsjon (under anvendelse av reverstranskriptase-RT) med polymerasekjedereaksjonen (PCR). Kombinasjonen av disse teknikkene muliggjorde spesifikk amplifikasjon av en ønsket sekvens fra poly(A)<*>RNA-prøven avledet fra det CH11-produserende hybridom fremstilt i (1-1).

To sett av primere for RT-PCR-reaksjonen ble valgt ut fra "Ig-Prime"-settet (Novagen). MuIgVH5'-B og MuIgMVH3'-l ble brukt til å amplifisere et område i H-kjeden, mens MuIgxVL5' og MuIgMVL3'-l ble brukt til å amplifisere et område i L-kjeden. RT-PCR-reaksjoner ble utført ved å anvende henholdsvis både H-kjedeprimersettene og L-kjedeprimersettene.

a) ReverstranskrIptasereaks1on

En reverstranskriptasereaksjonsoppløsning (44 ul) ble

laget på følgende måte. 10 mM tris-saltsyre (pH 8,3), 50 mM kaliumklorid, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dTTP, 1,5 mM magnesiumklorid, 2,5 pmol av H- og L-kjede-3'-sideprimeren, 50 ng av poly(A)<*>RNA fremstilt i (1.1) og 20 enheter reverstranskriptase (Biochemical Kogyo Co., Ltd.) avledet fra Moloney murint leukemivirus (MMLV), ble slått sammen og den resulterende blanding inkubert ved 42 °C i 1 time.

b) Amplifikaslon ved hlelp av PCR

Reverstranskriptasereaksjonsoppløsningen fremstilt i

a), ble blandet med 25 pmol av henholdsvis H-kjede- eller L-kjede-5'-primer og med 5 enheter Taq-DNA-polymerase ("ampli-Taq" DNA-polymerase erholdt fra Perkin Eimer, Japan) inntil et sluttvolum på 100 pl reaksjonsbuffer levert i sett (buffere og oppløsninger for enzymer er som levert med leverandørens sett, med mindre annet er angitt). Den totale, resulterende reaksjonsblanding ble varmet opp ved 94 °C i 2 minutter og så underkastet en varmesyklus på 94 °C i 1 minutt, 50 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter. Denne syklusen ble gjentatt 30 ganger. Oppløsningen ble så holdt ved 72 °C i ytterligere 10 minutter. Et genamplifiserings-PCR-system 9600 (Perkin Eimer, Japan) ble brukt for å regulere reaksjonstemperaturen i alle PCR-reaksjonene.

c) Analyse av PCR- produkt

En porsjon av PCR-reaksjonsblandingen fremstilt ib),

ble analysert ved hjelp av gelelektroforese på en 1,5% (vekt/- volum) agarosegel (FMC Bioproducts). Produktet av hver av fl-og L-kjede-PCR-reaksjonene ble erholdt som et bånd på ca.

430 bp. Bånds tør r el sen ble beregnet ved å sammenligne den med molekylvektsmarkørene som også var blitt kjørt på den samme gel.

d) Kloning av PCR- produkt

Hvert av PCR-produktene erholdt i b), ble ligert i

separate plasmidvektorer under anvendelse av et originalt TA-kloningssett (Invitrogen). Nærmere bestemt ble 50 ng av pCRII-

vektoren og fire enheter av T4-DNA-ligase (begge inkludert i settet) tilsatt til en ligasereaksjonsbuffer [6 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 6 mM magnesiumklorid, 5 mM natriumklorid, 7 mM p-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM spermidin og 0,1 mg/ml bovint serumalbumin]. Ligasereaksjons-buf feren inneholdt også en porsjon av PCR-reaksjonsblandingen som var valgt ut slik at den inneholdt omtrent 10 ng av det ønskede PCR-produkt som beregnet ved hjelp av gelelektroforese i c) ovenfor. Den resulterende blanding ble inkubert ved 14 "C i 15 timer.

Deretter ble 2 ul av ligasereaksjonsblandingen blandet med 50 ul av E. coli, stamme TOP10F' (inkludert i settet), som tidligere var blitt laget kompetent ved hjelp av tilsetning av 2 ul 0,5 M p-merkaptoetanol. Den resulterende trans-formasjonsblanding ble plassert på is i 30 minutter, varmet opp ved 42 "C i 30 sekunder og så plassert på is igjen i ytterligere 2 minutter. Deretter ble blandingen så tilsatt til 500 ul SOC-medium [2% (vekt/volum) trypton, 0,5% (vekt/volum) gjærekstrakt, 0,05% (vekt/volum) natriumklorid, 2,5 mM kaliumklorid, 1 mM magnesiumklorid, 20 mM glukose], og den resulterende blanding ble dyrket med rotasjonsristing i 1 time (37 °C, 110 opm). Den resulterende kultur ble så spredd ut på L-nær-ingsagarmediumplater [1% (vekt/volum) trypton, 0,5% (vekt/- volum) gjærekstrakt, 0,5% (vekt/volum) natriumklorid, 0,1%

(vekt/volum) glukose, 0,6% (vekt/volum) "Baeto Agar" (Difco)] inneholdende 100 ug/ml ampicillin, og platene ble dyrket ved 37 °C over natten uten risting.

Ampicillinresistente kolonier frembrakt ved hjelp av denne fremgangsmåten, ble valgt ut og skrapet bort med platinapinner. Celler fra de utvalgte kolonier ble dyrket separat i 5 ml L-næringsmedium inneholdende 100 ug/ml ampicillin ved 37 °C over natten. Kulturene ble så sentrifugert for å pelletere cellene, og plasmid-DNA ble fremstilt fra cellene ved å anvende fremgangsmåten med alkalisk lyse (jf Maniatis, T. et al., supra). Et plasmid for hvert av H- og L-primerset-tene ble erholdt, og disse ble betegnet pVH4 (plasmidet inneholdende fragmentet amplifisert ved å anvende H-kjedeprimersettet) og pVL8 (plasmidet inneholdende fragmentet amplifisert

ved å anvende L-kjedeprimersettet).

Eksempel 2

Bestemmelse av aminosyresekvensen og nukleotidsekvensen til de variable områdene i CH11

(2-1) Bestemmelse av de N- terminale aminosvresekvenser i de

variable områder i H- k-) eden og L- kleden i CH11

a) Fremstilling av CH11

Det CH11-produserende hybridom (se eksempel 1) ble

dyrket til et celleantall på 2 x IO<8>i et AS F 104-medium (Ajinomoto) inneholdende 10% (volum/volum) bovint serum (Gibco), og dette preparatet ble så dyrket i 50 ml serumfrittASF 104-medium ved 37 °C i 5 dager. Deretter ble kulturen sentrifugert (Tommy Seikos nr. 4 sentrifuge, 15 000 x g, 4 "C i 15 minutter), og supernatanten ble samlet opp. CH11 ble erholdt fra kultursupernatanten ved å anvende et "E-Z-Sep"-antistoffrensesett (Pharmacia Biotech).

b) En porsjon av det rensede CH11, tilsvarende 100 ul av supernatanten fremstilt i a), ble tilsatt til 10 ul av

100 mM tris-saltsyrebufferen (pH 6,8) inneholdende 10%

(volum/volum) B-merkaptoetanol og 4% (vekt/volum) SDS. Den resulterende blanding ble denaturert ved å varme opp ved 95 °C i 5 minutter. Den denaturerte prøve ble så underkastet elektroforese på en 12% (vekt/volum) polyakrylamidgel. Etter elektroforese ble gelen senket ned i overføringsbuffer [25 mM tris-borsyre (pH 9,5), 10% metanol (volum/volum)], og det ble ristet ved romtemperatur i 15 minutter. Proteinbåndene på gelen ble så overført på en polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) (Nippon Millipore Ltd.) under anvendelse av et semi-drive-blottingsapparat (Iwaki Glass Co., Ltd.) ved en konstant strømstyrke på 0,2 A ved 4 °C i 1 time. Deretter ble PVDF-membranen farget med en 0,1% (vekt/volum) "Coomassie Brilliant Blue"-oppløsning og avfarget med 100% metanol. Bare to hoved-proteinflekker kunne ses, tilsvarende H-kjeden og L-kjeden. Disse proteinflekkene ble skåret ut, og gelen som inneholdt dem, ble tørket ved romtemperatur. c) Aminosyresekvensen til proteinene overført på PVDF-membranen i b), ble analysert ved å anvende et gassfase-proteinsekvenseringsapparat (PPSQ-10, Shimadzu Corporation) under anvendelse av den automatiske Edman-metode [se Edman, P. et al. (1967), Eur. J. Biochem. 1, 80 et seg.]. Den N-terminale aminosyresekvens i det variable område av H-kjeden i CHll og den N-terminale aminosyresekvens i L-kjeden ble således bestemt og er vist som SEKV.ID NR. hhv. 13 og 14 i sekvenslisten.

(2-2) Bestemmelse av DNA- nukleotldsekvens

De totale nukleotidsekvensene til cDNA-en som koder for de variable områdene i H- og L-kjedene i CHll, ble bestemt ved å sekvensere innføvelsene i plasmidene hhv. pVH4 og pVL8 (fremstilt i eksempel 1).

pCRII-vektoren har en SP6-promotersekvens og en T7-promotersekvens, og disse flankerer eventuell innføyet cDNA, hvorved sekvensen til innføyelsene av pVH4 og pVL8 kunne bestemmes ved å anvende oligonukleotidprimere (Perkin Eimer, Japan) som tilsvarer sekvensene. Prøver for sekvensanalyse ble fremstilt ved å anvende disse primerne og et fargeprimer-syk-lussekvenseringssett (Perkin Eimer, Japan). Plasmid-DNA fra

plasmidene pVH4 eller pVL8 ble brukt som et templat. Sekvensen til hver cDNA-innføyelse ble bestemt ved å anvende et DNA-sekvenseringsapparat (modell 373, Perkin Eimer, Japan). cDNA-nukleotidsekvensen til det variable H-kjedeområde er vist i

SEKV.ID NR. 15, og cDNA-nukleotidsekvensen til det variable L-kjedeområde er vist i SEKV.ID NR. 16.

Den N-terminale aminosyresekvens i H-kjeden i CHll representert ved aminosyre nr. 1-15 i SEKV.ID NR. 13 i sekvenslisten, tilsvarer fullstendig aminosyresekvensen kodet for av nukleotidnumrene 32-76 i SEKV.ID NR. 15. Det ble derfor utledet at plasmid pVH4 inneholder DNA som koder for det variable område i H-kjeden i CHll.

Den N-terminale aminosyresekvens i L-kjeden i CHll, representert ved aminosyrenumrene 1-21 i SEKV.ID NR. 14 i sekvenslisten, tilsvarer fullstendig aminosyresekvensen kodet for av nukleotidnumrene 29-91 i SEKV.ID NR. 16. Det ble derfor utledet at plasmid pVL8 inneholder DNA som koder for det variable område i L-kjeden i CHll.

Eksempel 3

Kloning av DNA som koder for den fullstendige H- kjede og L-kjede, og de fullstendige J- k-) eder 1 CHll

(3-1) Fremstilling av et cDNA- bibliotek

Et cDNA-bibliotek ble fremstilt ved hjelp av Okayama-Berg-metoden [Okayama, H. et al. (1987), Methods in Enzymology 154, 3-28]. Nærmere bestemt ble 5 ug poly(A)<*>RNA som fremstilt i eksempel 1-1 (a) fra det CHll-produserende hybridom, tilsatt til 30 ul reaksjonsblanding {50 mM tris-saltsyre [pH 8,3], 6 mM magnesiumklorid, 40 mM kaliumklorid, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP, 2 ug vektorprimer [3'-oligo(dT)-halet.pcDV-1]: Pharmacia) inneholdende 75 enheter reverstranskriptase (Seikagaku Kogyo, Co., Ltd.) avledet fra fugle-myeloblastosevirus (AMV). Den resulterende blanding ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter.

Deretter ble et ekvivalent volum fenol-kloroform (1:1, volum/volum) tilsatt til reaksjonsblåndingen, og det ble grundig blandet. Den resulterende blanding ble sentrifugert (10 000 x g, romtemperatur, 5 minutter), og vannlaget ble utvunnet (denne fremgangsmåten med å ekstrahere med fenol:kloroform og utvinne den vandige supernatant er heretter henvist til som "fenol-kloroform-ekstraksjon"). Til det resulterende vannlag ble det tilsatt 35 ul 4 M ammoniumacetat og 140 pl etanol, og den resulterende blanding ble avkjølt ved -70 °C i 15 minutter og så sentrifugert (10 000 x g, 4 °C, 15 minutter). Pelleten ble vasket med en 75% (volum/volum) oppløs-ning av etanol og så tørket under redusert trykk.

Den tørkede utfelling ble så oppløst i 13 pl destillert vann, og så ble 5,6 pl terminaltransferasereaksjonsblan-ding [140 mM natriumkakodylat, 30 mM tris-saltsyre (pH 6,8),

1 mM koboltklorid, 0,5 mM DTT, 0,3 pg polyadenylsyre (polyA, Pharmacia), 0,2 mM dCTP] tilsatt, og den resulterende reaksjonsblanding ble inkubert ved 37 "Ci 5 minutter. Terminal-deoksynukleotidyltransferase (21 enheter, Pharmacia) ble så tilsatt i overensstemmelse med leverandørens instruksjoner, og reaksjonen fikk forløpe i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble så underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon. Så ble 20 ul 4 M ammoniumacetat og 80 ul etanol tilsatt til det utvundne vannlag, og blandingen ble avkjølt ved -70 "C i 15 minutter og så sentrifugert (10 000 x g ved 4 °C i 15 minutter). Pelleten ble vasket med en 75% (volum/volum) oppløsning av etanol og tørket under redusert trykk.

DNA-utfellingen erholdt på denne måte, ble oppløst i 30 pl reaksjonsblanding [10 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 60 mM natriumklorid, 7 mM magnesiumklorid], og 30 enheter av restriksjonsenzym Hindlll ble tilsatt til den resulterende opp-løsning. Når det anvendes et restriksjonsenzym, men det ikke er angitt noen buffer, er den bufferen som anvendes, generelt bufferen som er levert sammen med enzymet. I det tilfellet at DNA fordøyes med to enzymer, utføres fordøyelse med de to en-zymene etter hverandre. Etter den første fordøyelse utfelles DNA-en, oppslemmes på nytt og fordøyes så med det andre enzym. Utfellings- og resuspensjonsteknikker er velkjente innen fagområdet (jf Maniatis et al., supra). Alle restriksjonsenzymene og bufferne som anvendes i de foreliggende eksempler, ble levert av Takara Shuzo.

DNA-en fikk fordøyes ved 37 °C over natten i fordøy-elsesoppløsningen. Deretter ble reaksjonsblandingen underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon. Så ble 35 pl 4 M ammoniumacetat og 140 pl etanol tilsatt til det utvundne vannlag, og blandingen ble avkjølt ved -70 °C i 15 minutter. Blandingen ble sentrifugert (10 000 x g, 4 " C x 15 minutter) for å utfelle DNA-en, og den resulterende pellet ble vasket med en 75%

(volum/volum) oppløsning av etanol og tørket under redusert trykk. Den således fremstilte, utfelte DNA ble brukt som en cDNA-prøve i etterfølgende fremgangsmåter.

Parallelt ble plasmid-DNA fra vektoren pcDL-SRa.296 [jf Takebe, Y. et al. (1989), "JIKKEN IGAKU (Experimental Medicine)", 7, s. 95-99] fordøyd med restriksjonsenzymet Pstl. Produktet av fordøyelsen ble behandlet med dGTP og terminal-deoksynukleotidyltransferase (Pharmacia) for å addere oligo-dG til den 3'-terminale ende på følgende måte: pcDL-SRa296-DNA (100 ug, til stede i 50 ul) ble tilsatt til 10 ul 10x terminaldeoksynukleotidyltransferasebuffer [lx buffer: 1,4 M natriumkakodylat, 0,3 M Tris-HCl, (pH 7,6), 10 ul DTT (1 mM), 20 ul 0,1 mM<3>H-dGTP (Dupont) og 10 ul ter-minaltransferase (210 IU, Pharmacia)]. Blandingen ble inkubert i 40 minutter ved 37 "C og så blandet med et likt volum av TE-buffermettet fenol. Etter å ha stått ble vannlaget fjernet og underkastet en fenol-kloroform-ekstraksjon. Etter at både fenol- og fenol-kloroformekstraksjonene var blitt utført, ble DNA-en utfelt ved å anvende etanol, og den ble på nytt opp-slemmet i 50 pl TE-buffer.

Den totale, utfelte DNA ble fordøyd med restriksjonsenzymet Hindlll, og produktene av fordøyelsen ble separert ved hjelp av gelelektroforese på en 1,8% (vekt/volum) agarosegel. Et bånd på 800 bp ble skåret ut fra gelen og ekstrahert fra gelen ved å anvende et "GENECLEAN"-sett (Funakoshi) i henhold til produsentens instruksjoner. Den resulterende DNA ble opp-løst i 100 pl TE-buffer, og 100 pl etanol ble tilsatt. Slutt-konsentrasjonen av DNA var 0,09 pg/pl.

Det resulterende produkt ga en linker-DNA hvor oligo (dG) er festet til SRa-promotoren (figur 1).

Den utfelte, tørkede cDNA-prøve fremstilt ovenfor, ble oppløst i 10 pl TE-buffer [10 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 1 mM EDTA]. En porsjon av den resulterende oppløsning (1 pl) ble tilsatt til reaksjonsbuffer [10 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 1 mM EDTA, 100 mM natriumklorid] inneholdende 0,08 pmol av linker-DNA-en fremstilt ovenfor. Den resulterende blanding ble varmet opp ved 65 °C i 5 minutter og så inkubert ved 42 °C i 30 minutter. Deretter ble 10 pl 10x ligasebuffer [10 mM ATP, 660 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 66 mM magnesiumklorid, 100 mM DTT], 76 pl destillert vann og 1 pl 10 mM B-nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD, Boehringer Mannheim) tilsatt til reaksjonsblandingen, og den resulterende blanding ble avkjølt på is i 10 minutter. E. coli-DNA-ligase (8,4 pg ekvivalent, Pharmacia) ble så tilsatt til den avkjølte reaksjonsblanding, og det hele ble inkubert ved 12 °C over natten.

Etter denne inkubasjonen ble 2 pl nukleotidoppløsning (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP), 0,5 pl 10 mM

NAD, 42 ug ekvivalent av E. coli-DNA-ligase (Pharmacia),

4,1 enheter DNA-polymerase I (Pharmacia) og 5,5 enheter ribo-nuklease H (Pharmacia) tilsatt til reaksjonsblandingen. Den resulterende blanding ble så inkubert ved 12 °C i 1 time og så ved 22 °C i en ytterligere time. cDNA-biblioteket fremstilt på denne måte, ble lagret ved -20 °C inntil det trengtes.

(3-2) Kloning ved hlelp av PCR

a) Fremstilling av primer

I tilfellet med H-kjeden ble aminosyresekvensen til

det variable område i H-kjeden i CHll, som bestemt i eksempel 2, sammenlignet med antistoffaminosyresekvensdatabasen fremstilt av Kabat et al. [se Kabat E.A. et al. (1991), i "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II", U.S. Department of Health and Human Services]. Det ble bestemt at H-kjeden (u-kjede) i CHll var underklasse 2A. En oligonukleotidprimer ble derfor syntetisert slik at den ville hybridisere med en del av det 5'-ikke-translaterte område i DNA-en som koder for muse-H-kjeden, underklasse 2a. Oligonukleotid-primeren som ble valgt ut, hadde sekvensen: 5'-CTAAGGGAAT TCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA-3' (H5-1; SEKV.ID NR. 17 i sekvenslisten).

Det ble også utformet en oligonukleotidprimer som ville hybridisere med en del av det 3' -ikke-translaterte område i CHll-H-kjeden. Utformingen av oligonukleotidet ble basert på nukleotidsekvensen til den DNA som koder for det konstante område i M-kjeden i museglobulin rapportert av Goldberg et al. [se Goldberg, I.G. et al. (1981), Gene 25, 33-42], og sekvensen som ble valgt ut, var: 5'-TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGG TTGA-3' (H3-1; SEKV.ID NR. 18 i sekvenslisten).

For L-kjeden ble aminosyresekvensen til det variable område i L-kjeden i CHll, som bestemt i eksempel 2, sammenlignet med antistoffaminosyresekvensdatabasen fremstilt av Kabat og medarbeidere (supra). Det ble funnet at L-kjeden i CHll var underklassek2. En oligonukleotidprimer ble derfor utformet slik at den ville hybridisere med en del av det 5'-terminale, ikke-translaterte område i DNA-en som koder for muse-L-kjede, underklassek2. Ollgonukleotidprlmeren som ble valgt ut, hadde sekvensen: 5'-AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC-3' (L5-1; SEKV.ID NR. 19 i sekvenslisten).

Det ble også utformet en oligonukleotidprimer som ville hybridisere med en del av det 3'-ikke-translaterte område. Utformingen av oligonukleotidet ble basert på nukleotidsekvensen til den DNA som koder for det konstante område i k-kjede-immunoglobulin, registrert under registreringsnavnet MUSIGB1L1 (tilvekst nr. D14630). Sekvensen som ble brukt, var: 5'-ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT-3' (L3-1; SEKV.ID NR.

20 i sekvenslisten).

I tilfellet med J-kjeden er det ikke noe variabelt område, og både sekvensen til den DNA som koder for J-kjeden, og aminosyresekvensen til J-kjeden er kjent [jf Cann, G.M. et al. (1982), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, 6656-6660]. Basert på dette funn ble det syntetisert oligonukleotidprimere som ville hybridisere med en del av de 5'- og 3'-ikke-translaterte områder i den DNA som koder for J-kjeden. Disse oligonukleotidene hadde sekvensene: 5'-TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT-3' (J5-1; SEKV.ID NR. 21 i sekvenslisten) og 5'-ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAC CT-3' (J3-1; SEKV.ID NR. 22 i sekvenslisten).

Disse oligonukleotidprimerne ble alle syntetisert ved å anvende et automatisk DNA-synteseapparat 380B (Perkin Eimer, Japan) ved hjelp av fosforamidittmetoden [se Mattrucci, M.D. og Caruthers, M.H. (1981), J. Am. Chem. Soc, 103, 3185-3191]. Etter at syntesen var fullstendig, ble hver primer spaltet fra bæreren og avbeskyttet, og så frysetørket. Det resulterende produkt ble oppløst i destillert vann og lagret ved -20 °C inntil det trengtes.

b) Ampiifikaslon av målqen ved hjelp av PCR

PCR-reaksjonsoppløsning [10 mM tris-saltsyre (pH

8,3), 50 mM kaliumklorid, 1,5 mM magnesiumklorid, 2,5 mM dATP, 2,5 mM dGTP, 2,5 mM dCTP, 2,5 mM dTTP] ble fremstilt, og 0,1 ul av cDNA-biblioteket beskrevet i eksempel 4-1, 1 enhet Taq-DNA-polymerase (Perkin Eimer, Japan) og 15 pmol av ollgonukleotidprlmeren (fremstilt i 3-2a) ble tilsatt til 100 ul av

PCR-reaksjonsoppløsningen, og det ble varmet opp ved 94 °C i

2 minutter. Den resulterende blanding ble så underkastet en varmesyklus ved 94 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt og 72 'C i 2 minutter. Denne syklusen ble gjentatt 30 ganger. Etter den siste syklusen ble oppløsningen holdt ved 72 °C i ytterligere

10 minutter.

Kombinasjonene av primerne som ble brukt i de respek-tive reaksjoner, er som følger:

H5-1 og H3-1 (for H-kjede),

L5-1 og L3-1 (for L-kjede) og

J5-1 og J3-1 (for J-kjede).

c) Analyse av PCR- produkt

Etter at PCR-reaksjonen i b) var blitt utført, ble en

porsjon av reaksjonsblandingen analysert ved hjelp av gelelektroforese på en 0,8% (vekt/volum) agarosegel i tilfellet med H-kjeden. For L- og J-kjedene ble det brukt en 1,5%

(vekt/volum) agarosegel (agarose ble erholdt fra FMC Bioproducts). Produktet av PCR-reaksjonen var et bånd på omtrent 1 900 bp for H-kjeden, 800 bp for L-kjeden og 650 bp for J-kjeden. Båndstørrelsene ble beregnet ved sammenligning med molekylvektsmarkører kjørt på den samme gel.

d) Kloning av PCR- produkt

Hvert av PCR-produktene erholdt i b), ble ligert i en

plasmidvektor under anvendelse av et eukaryot TA-kloningssett (Invitrogen). Nærmere bestemt ble 60 ng av pCR3-vektor (inkludert i settet) og fire enheter T4-DNA-ligase tilsatt til ligasereaksjonsbuffer [6 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 6 mM magnesiumklorid, 5 mM natriumklorid, 7 mM p-merkaptoetanol,

0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidin, 0,1 mg/ml bovint serumalbumin] inneholdende en porsjon av PCR-reaksjonsblandingen. Volumet av PCR-reaksj onsblandingen ble valgt slik at den inneholdt ca. 10 ng av det ønskede PCR-produkt, som beregnet ved hjelp av gelelektroforese. Den resulterende blanding ble inkubert ved 14 °C i 15 timer.

En porsjon av ligasereaksjonsblandingen (2 ul) ble blandet med 50 ul E. coli-celler, stamme TOP10F' (inkludert i settet), gjort kompetent ved tilsetning av 2 ul 0,5 M B-merkaptoetanol. Den resulterende blanding ble plassert på is i 30 minutter, varmet opp ved 42 °C i 30 sekunder og så igjen plassert på is i 2 minutter. SOC-medium (500 ul, som beskrevet ovenfor) ble så tilsatt til denne blandingen, og den resulterende blanding ble dyrket ved 37 "C med rotasjonsristing

(110 opm) i 1 time. Kulturvæsken ble så spredd ut på L-nær-ingsagarmediumplater inneholdende 100 ug/ml ampicillin, og det ble dyrket ved 37 °C over natten. Ampicillinresistente kolonier som fremkom, ble så skrapet av med en platinapinne og dyrket i 5 ml L-næringsmedium inneholdende 100 ug/ml ampicillin ved 37 °C over natten. Disse kulturene ble sentrifugert for å utfelle celler som så ble brukt til å fremstille plasmid-DNA ved hjelp av den alkaliske lysemetode (Maniatis et al., supra).

Tre av de resulterende plasmider ble betegnet pCR3-H123 (plasmidet som omfatter H-kjedekodende cDNA), pCR3-L103 (plasmidet som omfatter L-kjedekodende cDNA) og pCR3-J1123 (plasmidet som omfatter J-kjedekodende cDNA). Kompetente celler av E. coil stamme DH5a (Gibco) ble transformert med ett av plasmidene pCR3-H123, pCR3-L103 og pCR3-J1123, og de resulterende transformanter ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 28. februar 1996, under deponeringsnumrene hhv. FERM BP-5427, FERM BP-5428 og FERM BP-5429. DNA som koder for H-, L- og J-kjedene i CHll, ble lett fremstilt fra disse stam-mene ved hjelp av velkjente metoder.

Eksempel 4

Bestemmelse av total nukleotidsekvens for den cDNA som koder for CHll- H- kjede. - L- kjede og - J- kjeder

(4-1) Bestemmelse av nukleotidsekvens i DNA

M-kjeden i museimmunoglobulin består av et N-terminalt, variabelt område som inneholder ca. 110 rester, og et konstant område som inneholder ca. 470 rester, ved siden av det variable område, k-kjeden i museimmunoglobulin består av et N-terminalt, variabelt område som inneholder ca. 110 rester, og et konstant område som inneholder 107 rester, ved siden av det variable område. Det ble forutsagt at de fullstendige nukleotidsekvensene til cDNA-ene som koder for CH11-H-kjeden og -L-kjeden, ville bestå av nukleotidsekvenser som koder for kjente, konstante områder, og som ble ligert til nukleotidsekvenser som koder for de variable områdene av kjedene, som identifisert i eksempel 2 [jf Kabat E.A. et al.

(1991), i "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II": U.S. Department of Health and Human Services].

Nukleotidsekvensen som koder for J-kjeden i CHll, ble antatt å være den samme som den for den kjente J-kjedesekvens.

Basert på disse antatte nukleotidsekvenser, ble det syntetisert 20 nukleotider lange oligonukleotidprimere tilsvarende sekvenser i H-, L- og J-kjedene, atskilt av kodende intervaller på 60 til 200 bp. Disse primerne ble brukt for sekvensanalyse.

Sekvensene til de syntetiserte oligonukleotidprimere var som følger:

Hver oligonukleotidprimer ble syntetisert ved hjelp av fosforamidittmetoden under anvendelse av et automatisk DNA-synteseapparat (modell 380B: Perkin Eimer, Japan). Prøver for sekvensanalyse av H-kjeden ble fremstilt ved å anvende DNA fra plasmid pCR3-H123. Prøver for sekvensanalyse av L-kjeden ble fremstilt ved å anvende DNA fra plasmid pCR3-L103. Prøver for sekvensanalyse av J-kjeden ble fremstilt ved å anvende DNA fraPCR3-J1123. PCR-reaksjonen ble utført ved å anvende et "Prism Ready Reaction Terminator Cycle" sekvenseringssett (Perkin Eimer, Japan) på følgende måte.

pCR3-H123 (1,5 ug) og 4,8 pmol primer (SHF-2) ble blandet til et sluttvolum på 16 ul i destillert vann. En porsjon av denne pCR3-Hl23/primerblanding (9,5 ul) ble blandet med 10,5 ul av en forblanding inneholdende Taq-DNA-polymerase. Hele denne fremgangsmåten var i overensstemmelse med instruk-sjonene i settet. Den resulterende blanding ble plassert i en automatisk reaktor (katalysator: Perkin Eimer, Japan). Reak-sjonssyklusen som ble anvendt, var som følger: 95 °C i 30 sekunder, 50 °C i 15 sekunder og 60 °C i 4 minutter, gjentatt 25 ganger.

Etter fullførelse av reaksjonssyklusene ble 80 pl sterilisert vann tilsatt til den resulterende oppløsning, og

DNA-en i den resulterende blanding ble ekstrahert to ganger ved hjelp av fenol/kloroform-metoden. Det utvunne vannlag ble blandet med 15 ul 2 M natriumacetat og 300 pl etanol, etterfulgt av sentrifugering for å utvinne utfellingen. Utfellingen ble vasket med en 70% (volum/volum) oppløsning av etanol og tørket under redusert trykk, og så ble det oppløst i 3 pl prøveoppløsning (4 pl 0,25 M EDTA, 100 pl formamid og 15 pl sterilisert vann).

Sekvenseringsreaksjoner ble kjørt og analysert på et DNA-sekvenseringsapparat (modell 373A, Perkin Eimer, Japan) for de 32 H-kjedeprimerne, de 11 L-kjedeprimerne og de 11 J-kjedeprimerne.

Sekvensdataene erholdt for hver primer, ble slått sammen og integrert for å bestemme den fullstendige nukleotidsekvens til H-, L- og J-kjedene i CHll. cDNA-nukleotidsekvensene for hver plasmidinnføyelse er vist ved hjelp av SEKV.ID NR. hhv. 7, 9 og 11 i sekvenslisten. Aminosyresekvensene som tilsvarer disse nukleotidsekvensene, er vist ved hjelp av SEKV.ID NR. hhv. 8, 10 og 12 i sekvenslisten.

(4-2)Prlmærstruktur for H- kjeden i CHll

Nukleotidsekvensen til det variable H-kjedeområde, vist som nukleotid nr. 32-379 i SEKV.ID NR. 15 i sekvenslisten, ble funnet å være identisk med nukleotidsekvensen til nukleotidnumrene 58-405 i SEKV.ID NR. 7.

Aminosyresekvensen vist som aminosyrenumrene 117-571 i SEKV.ID NR. 8, ble funnet å være identisk med aminosyresekvensen i det konstante H-kjedeområde avledet fra muse-IgM når det ble sammenlignet med databasen med antistoffaminosyresekvenser [Kabat E.A. et al., supra].

Aminosyresekvensen vist som aminosyrenumrene -19 til -1 i SEKV.ID NR. 8, ble bestemt til å være en signalsekvens i H-kjeden i CHll.

Nukleotidsekvensen vist som nukleotidnumrene 406 til 1770 i SEKV.ID NR. 7, ble funnet å være identisk med nukleotidsekvensen til det konstante H-kjedeområde i muse-IgM.

Basert på disse resultatene, kunne den totale nukleotidsekvens fastslås sammen med den totale aminosyresekvens.

(4-3) Primærstruktur for CHll- L- klede

Nukleotidsekvensen til det variable L-kjedeområde, vist som nukleotidnumrene 29-364 i SEKV.ID NR. 16 i sekvenslisten, ble funnet å være identisk med nukleotidsekvensen til nukleotidnumrene 58-393 i SEKV.ID NR. 9.

Aminosyresekvensen vist som aminosyrene nr. 113-219 i SEKV.ID NR. 10, ble funnet å være identisk med aminosyresekvensen i det konstante muse-KL-kjedeområde når det ble sammenlignet med Kabats database med antistoffaminosyresekvenser. Aminosyresekvensen vist som aminosyrene nr. -19 til -1 i SEKV.ID NR. 10, ble bestemt å være en signalsekvens for L-kjeden.

Nukleotidsekvensen vist som nukleotidnumrene 394-714 i SEKV.ID NR. 9, ble fastslått å være fullstendig identisk med nukleotidsekvensen i det konstante muse-KL-kjedeområde.

(4-4) Primærstruktur for J- kjede i CHll

Aminosyresekvensen vist som aminosyrene nr. 1-137 i SEKV.ID NR. 12, ble sammenlignet med antistoffaminosyresekvensdatabasen og funnet å være identisk med den kjente muse-J-kjede.

Nukleotidsekvensen vist som nukleotidnumrene 67-477 i SEKV.ID NR. 11, ble funnet å være identisk med nukleotidsekvensen til den kjente muse-J-kjede.

Aminosyresekvensen vist som aminosyrenumrene -22 til -1 i SEKV.ID NR. 12, ble bestemt å være en signalsekvens for J-kjeden i CHll.

(4-5) Bestemmelse av komplementaritetsbestemmende områder

( CDR)

Både stillingen og aminosyresekvensen til hvert CDR i de variable områdene i H-kjeden og L-kjeden i CHll, bestemt som beskrevet ovenfor, ble identifisert ved sammenligning med Kabats antistof f aminosyresekvensdatabase (. supra). Denne data basen viser at aminosyrekjedelengden i rammeområdet i det variable område er i det vesentlige konstant hos forskjellige antistoffer, forutsatt at undertypen er den samme, og forutsatt at aminosyresekvensene har noen felles kjennetegn. CDR-ene som er til stede mellom slike rammeområder, er imidlertid sekvenser som er spesifikke for hvert antistoff.

Ved sammenligning av aminosyresekvensen i det variable område i CHll-H-kjede med sekvensen til muse-u2a-undertype, ble CDR i CHll-H-kjeden vist å være representert ved aminosyrenumrene 31-35 i SEKV.ID NR. 8 (CDRHX, svarende til SEKV.ID NR. 1 i sekvenslisten), 50-66 i SEKV.ID NR. 8 (CDRH2, svarende til SEKV.ID NR. 2 i sekvenslisten) og 99-105 i SEKV.ID NR. 8 (CDRH3, svarende til SEKV.ID NR. 3 i sekvenslisten).

Når aminosyresekvensen i det variable område i CH11-L-kjede ble sammenlignet med sekvensen til muse-K2-undertypen, ble CDR i L-kjeden vist å være representert ved aminosyrenumrene 24-39 i SEKV.ID NR. 10 (CDRLX, svarende til SEKV.ID NR. 4 i sekvenslisten), 55-61 i SEKV.ID NR. 10 (CDRL2, svarende til SEKV.ID NR. 5 i sekvenslisten) og 94-102 i SEKV.ID NR. 10 (CDRL3, svarende til SEKV.ID NR. 6 i sekvenslisten).

Når aminosyresekvensen i det variable område i CH11-L-kjede ble sammenlignet med sekvensen til muse-K2-undertypen, ble CDR i L-kjeden vist å være representert ved aminosyrenumrene 24-39 (CDRLlrsvarende til SEKV.ID NR. 4 i sekvenslisten), 55-61 (CDRL2, svarende til SEKV.ID NR. 5 i sekvenslisten) og 94-102 (CDRL3, svarende til SEKV.ID NR. 6 i sekvenslisten) i SEKV.ID NR. 10 i sekvenslisten.

Eksempel 5

Eks<p>resjon av genene som koder for hver underenhet i CHll i COS- 1- celler

(5-1) Konstruksjon av ekspresjonsvektor

DNA fra høyekspresjonsvektoren pME18S [se Hara, T. et al. (1992), Embo J. 11, 1875 et seg.] ble fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal. De resulterende fordøyelsespro-dukter ble separert ved hjelp av agarosegelelektroforese på en 0,8% agarosegel. Etter elektroforese ble gelen farget med eti-diumbromid (0,25 ug/ml) for å farge DNA-en. Et bånd på omtrent 3 000 bp ble skåret ut fra gelen og overført til et dialyserør (permeasjonsgrense: 12 000-14 000 Da, Gibco) sammen med 250 ul TBE-agarosegelelektroforesebuffer (TBE-buffer:Tris 0,089 M, borat 0,089 M, EDTA (pH 8,0) 0,002 M), og røret ble lukket. Det lukkede rør ble plassert i en undervannstype elektro-foresetank inneholdende mer av agarosegelelektroforese-bufferen, og DNA-en ble elektroforetisk eluert fra gelen (150 V, 15 minutter). Dialyserøret ble tatt ut, og DNA-eluatet i røret ble utvunnet og underkastet fenol/kloroform-ekstraksjon.

Parallelt ble plasmid pCR3-H123, fremstilt som beskrevet i eksempel 3 d), og som inneholdt den DNA som koder for CHll-H-kjeden, fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal. Det 1 900 bp store EcoRI-Xbal-fragment ble isolert og renset ved hjelp av agarosegelelektroforese på en 0,8% gel som beskrevet i 5-1 ovenfor. Dette cDNA-fragment ble ligert til det 3 kb store EcoRI-Xbal-fragment i pME18S, isolert som ovenfor, ved å anvende DNA-ligeringssett, versjon 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Plasmid pCR3-L103, fremstilt i eksempel 3, inneholdende den DNA som koder for CHll-L-kjeden, ble fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal. Et 840 bp stort EcoRI-Xbal-fragment inneholdende cDNA-plasmidinnføyelsen, ble isolert og renset ved hjelp av agarosegelelektroforese på en 0,8% gel som beskrevet i 5-1 ovenfor. Dette cDNA-fragment ble ligert til det 3 kb store EcoRI-Xbal-fragment i pME18S erholdt ovenfor, under anvendelse av DNA-ligeringssett, versjon 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Plasmid pCR3-J1123 fremstilt i eksempel 3 som inneholdt den DNA som koder for CHll-J-kjeden, ble fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal. Et 640 bp EcoRI-Xbal-fragment inneholdende cDNA-plasmidinnføyelsen, ble isolert og renset ved hjelp av agarosegelelektroforese på en 0,8% gel som beskrevet i 5-1 ovenfor. Dette cDNA-fragment ble ligert til det 3 kb store EcoRI-Xbal-fragment i pME18S erholdt ovenfor, under anvendelse av DNA-ligeringssett, versjon 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Etter at ligeringsreaksjonene var blitt fullført, ble JM109 E. coli kompetente celler (Takara Shuzo) transformert under anvendelse av hver reaksjonsblanding, og kolonier ble valgt ut for ampicillinresistente stammer. Plasmid-DNA ble fremstilt fra de transformerte stammer ved hjelp av alkalisk lyse (Maniatis, supra). Den resulterende plasmid-DNA ble for-døyd med EcoRI og Xbal, noe som så ble etterfulgt av agarosegelelektroforese på en 0,8% gel for å bekrefte at DNA med den ønskede størrelse var blitt klonet.

Ekspresjonsvektoren som inneholder den DNA som koder for CHll-H-kjeden, ble betegnet pHEX126. Ekspresjonsvektoren som inneholder den DNA som koder for CHll-L-kjeden, ble betegnet pLEX004, og ekspresjonsvektoren som inneholder den DNA som koder for CHll-J-kjeden, ble betegnet pJEX004.

(5-2) Ekspresjon i COS- 1- celler

COS-1-celler ble transformert med pHEX126, pLEX004 og pJEX004 ved elektroporasjon under anvendelse av GTE-1-appar-atet (Shimadzu Corporation). Nærmere bestemt ble COS-l-celler (American Type Culture Collection nr. CRL-1650) dyrket i en 225 cm<2>dyrkingskolbe (Sumitomo Bakelite). Cellene ble dyrket inntil en halvsammenflytende tilstand i Dulbeccos modifiserte Eagles minimalessensielle medium ("DMEM", Nissui Pharmaceutical) inneholdende 10% (volum/volum) bovint fosterserum (CSL). Mediet ble fjernet, og cellene ble behandlet to ganger med 3 ml trypsin-EDTA-oppløsning (Sigma) ved 37 °C i 3 minutter. Cellene ble utvunnet og så vasket to ganger med en fos-fatbufret saltoppløsningsbuffer (PBS, pH 8,0) (Nissui Pharmaceutical). De vaskede COS-l-celler ble regulert til en tetthet på 6 x IO<7>celler /ml med PBS( -) -buffer (8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HP04, 0,2 g KH2P04pr. liter, Nissui Seiyaku Co.).

DNA ble fremstilt fra hver av pHEX126, pLEX004 og pJEX004 som koder for alle tre underenhetene i CHll, under anvendelse av et plasmid-maksiprep.-sett (Maxiprep DNA-rense-system, Promega). En porsjon (20 ug) av hvert plasmid-maksi-prep. ble utfelt under anvendelse av etanol, og utfellingen ble oppløst i 20 pl PBS(-)-buffer. DNA-en fremstilt på denne måte, ble brukt for transfeksjon av COS-l-cellene. Alle trans- feksjoner utført ved å anvende mer enn ett plasmid, gjorde bruk av 20 ug av hvert plasmid.

En suspensjon av COS-l-celler (20 ul, 1,2 x 10<6>celler) fremstilt på denne måte, ble blandet med 20 ul av hver prøve, og den resulterende blanding ble plassert i en elektroporasjonskyvette (Shimadzu Corporation) med et elektrodemellomrom på 2 mm. Kyvetten ble plassert i elektroporasjonsappa-ratet, og to 600 V, 30 usekunders pulser ble påført med ett sekunds mellomrom mellom pulsene. Blandingen av cellene og DNA ble tilsatt til 10 ml DMEM inneholdende 10% (volum/volum) bovint fosterserum, så overført til en celledyrkingsplastskål (diameter: 90 mm, Sumitomo Bakelite) og dyrket ved 37 °C under 7,5% C02i 24 timer. Deretter ble kultursupernatanten fjernet, og cellene ble vasket med et serumfritt DMEM-medium. Nyfremstilt, serumfritt DMEM-medium ble tilsatt (10 ml) og dyrking fortsatt ved 37 °C under 7,5% C02i 24 timer. Kultursupernatanten ble så utvunnet.

COS-l-cellene ble transfektert ved å anvende ett av plasmidene eller en kombinasjon av plasmidene, som angitt nedenunder. Kultursupernatanten ble utvunnet i hvert tilfelle.

[A] : bare pME18S

[B] : bare pHEX126

[C] : bare pLEX004

[D] : bare pJEX004

[E] : pHEX126 og pLEX004

[F] : pHEX126, pLEX004 og pJEX004.

Eksempel 6

Påvisning av anti- Fas- antistoff

Anti-Fas-antistoffet fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse, ble påvist separat ved hjelp av to metoder.

(1) Den første metoden var Western blotting. Protein-prøven ble kjørt på en SDS-polyakrylamidgel under betingelsene som er vist nedenunder, og prøveproteinene ble separert ved hjelp av elektroforese (hele denne fremgangsmåten er kjent som SDS-polyakrylamidgelelektroforese eller "SDS-PAGE"). Proteinene ble overført til en nitrocellulosemembran og omsatt med et antistoff som er spesifikt for anti-Fas-antistoffet. Kryssreaksjon av antistoffet med mål-anti-Fas-proteinet er, i nærvær av egnede substrater, påvisbar ved hjelp av lysemisjon på en fotografisk film. (2) Den andre metoden måler bindingsaffinitet til Fas-antigenet.

(6-1) Western blotting

Testprøven av kultursupernatant (1 ml) ble dialysert mot 5 1 rent vann, så tørket under redusert trykk under anvendelse av et sentrifugalkonsentreringsapparat (CC-101, Tomy Seiko). Det resulterende produkt ble tilsatt til 10 ul av en prøvebuffer [2% (vekt/volum) SDS (elektroforesegrad, Bio-Rad), 5% (volum/volum) B-merkaptoetanol (Sigma), 10% (volum/volum) glyserol, 0,1% (vekt/volum) bromfenolblått] og grundig blandet. Den resulterende suspensjon ble varmet opp ved 100 "C i 5 minutter, hvorved man fikk en prøve som er egnet for elektroforese. Hele elektroforeseprøven ble fylt på en brønn i en SDS-polyakrylamidgel (4-20% gradientgel, buffersammensetning pr. liter: tris 3,0 g, glysin 14,4 g, SDS 10 g, pH 8,3), og gelen ble kjørt ved en konstant strømstyrke på 20 mA (romtemperatur, 1 time).

Så snart elektroforesen var blitt utført, ble proteiner overført fra gelen til en nitrocellulosemembran under anvendelse av den halvtørre blottingsmetode [se Towbin, H. et al. (1979), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, 4350 et se?.]. Det bestemte apparat og de bestemte betingelser som ble anvendt, var som følger:

Overføringsbuffer: 20 mM tris, 150 mM glysin,

10% (volum/volum) metanol Blottingsutstyr: produsert av Iwaki Glass Driftsbetingelser: 4 °C, 0,2 A (konstant strøm-styrke), 1 time.

To nitrocellulosemembraner for Western blotting ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Etter Western-overføring ble gelene sølvfarget under anvendelse av et "Sil Best Kit" (Naka-rai Tesuku Kabushiki-Kaisha).

Én av de to nitrocellulosemembranene fra Western blotting fremstilt som beskrevet ovenfor, ble anvendt for påvisning av H-kjede (u-kjede) og den andre for påvisning av L-

kjede (K-kjede). De følgende fremgangsmåter ble brukt.

Etter Western-overføringen ble nitrocellulosemembranene senket ned i vandig oppløsning inneholdende 3% (vekt/- volum) gelatin (Bio-Rad), 20 mM tris-saltsyre (pH 7,5) og 500 mM natriumklorid. Membranene ble forsiktig ristet ved romtemperatur i 1 time (fremgangsmåten beskrevet "Etter Western-overføring" er her henvist til som "blokkering"). De således blokkerte nitrocellulosemembraner ble senket ned i en fortynnet antistoffoppløsning og forsiktig ristet ved romtemperatur i 2 timer. De resulterende antistoffoppløsninger ble preparert ved å fortynne enten 2,5 ul peroksidasemerket geite-anti-muse-IgM-antistoff (u-kjedespesifikt: Jackson Immuno Research Laboratories) eller 25 ul peroksidasemerket, monoklonalt anti-muse-K-kjede-antistoff fra rotte (Zymed Laboratories) med 10 ml buffer [20 mM tris-saltsyre (pH 7,5), 500 mM natriumklorid], heretter henvist til som "TBS".

Hver nitrocellulosemembran ble så senket ned i 20 ml TTBS som er TBS inneholdende 2% (volum/volum) "Tween 20" (Bio-Rad) og vasket ved forsiktig risting ved romtemperatur i 15 minutter. De behandlede membraner ble vasket med 20 ml TTBS som så ble drenert bort. Gjenværende peroksidaseaktivitet på denne nitrocellulosemembranen ble påvist ved å anvende et ECL Western blotting-påvisningssystem (Amersham). Nærmere bestemt emitterer substratet i dette systemet lys i løpet av en kjemisk reaksjon under den katalytiske virkning av peroksidase. Lysemisjonen kan påvises på fotografisk film ved å anvende et ECL minikamera (Amersham) og film som fremkalles med én gang (type 667, Polaroid). Bildene som ble tatt, ble sammenlignet med de sølvfargede geler for å identifisere proteinbåndene som ble bundet spesifikt til antistoffene.

Antistoffer mot muse-M-kjeden kryssreagerte med et proteinbånd på omtrent 78 000 Da. Et bånd med denne størrelse var til stede i supernatanten til COS-l-celleprøver som var blitt overført med pHEX126, enten alene eller med et annet plasmid. Disse prøvene tilsvarte [B], [E] og [F] i eksempel 5.

Antistoffer mot muse-K-kjeden kryssreagerte med et proteinbånd på omtrent 26 000 Da. Et bånd med denne størrelse var til stede i supernatanten fra COS-l-celleprøver som var blitt transfektert med pLEX004, enten alene eller med et annet plasmid. Disse prøvene tilsvarte [C], [E] og [F] ifølge eksempel 5.

Antistoffet fremstilt ved hjelp av hybridomet, ble analysert ved Western blotting under anvendelse av den samme metodikk. Man kunne se at bånd som tilsvarer H- og L-kjeden i CHll fra hybridomet, hadde den samme størrelse som de erholdt fra de transfekterte COS-l-celler.

(6-2) Bekreftelse av Fas- blndinqsevne ved hlelp av ELISA

(a) Fremstilling av antigen

Ekspresjonsvektoren pME18S-mFas-AIC [se Nishimura, Y. et al. (1995), Mol. Immunol., 154, 4395-4403] koder for et fusjonsprotein som består av det ekstracellulære område i muse-Fas-antigen og det ekstracellulære område i muse-interleukin 3-reseptor. Den del av vektoren som koder for det ekstracellulære område i muse-Fas-antigen, ble erstattet med et DNA-fragment som koder for det ekstracellulære område i human-Fas-antigen. Denne nye ekspresjonsvektoren, phFas-AIC2, som koder for et fusjonsprotein bestående av det ekstracellulære område i human-Fas-antigenet og det ekstracellulære område i muse-interleukin 3-reseptoren, ble fremstilt som beskrevet nedenunder.

Oligonukleotidprimere ble utformet og syntetisert for å muliggjøre PCR-amplifikasjon av DNA som koder for det ekstracellulære område i Fas-antigen. DNA-templatet som ble anvendt, var plasmidvektoren pCEV4 [Itoh, N. et al. (1991), Cell, 66, 233-243] som inneholder den cDNA som koder for human-Fas-antigenet. Sekvensene til de utvalgte oligonukleotider var som følger:

Oligonukleotidprimere ble også utformet og syntetisert for å muliggjøre PCR-amplifikasjon av den DNA som koder for det ekstracellulære område 1 muse-interleukin 3-reseptoren. DNA-templatet som ble anvendt, var plasmidvektoren pME18S-mFas-AIC (Nishimara, Y. et al., 1995, Mol. Immunology, 154, 4395-4403). Sekvensene til oligonukleotidene var som føl-ger:

PCR-reaksjonen ble utført ved å anvende de ovenfor nevnte plasmider, oligonukleotidprimerne og LA-PCR-settet (Takara Shuzo Co., Ltd.) under de følgende betingelser:

Sammensetning av reaksjonsblanding:

Destillert vann ble tilsatt for å gi et sluttvolum på 250 ul, og bufferen, dNTP-blandingen og Taq-polymerasen ble inkludert i settet.

Temperaturbetingelser:

Prøven ble først varmet opp ved 94 °C i 2 minutter. Reaksjonsblandingen ble så underkastet en varmesyklus ved 94 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter, og denne syklusen ble gjentatt 30 ganger, etterfulgt av oppvarming ved 72 °C i ytterligere 10 minutter.

Produktene av hver PCR-reaksjon ble atskilt ved hjelp av elektroforese på en 8% polyakrylamidgel (kjørt i TBE-buffer, ved 100 V i 2 timer). Et bånd på omtrent 460 bp ble skåret ut fra gelen, svarende til DNA-fragmentet som inneholder genet som koder for det ekstracellulære område i human-Fas-antigenet. Et bånd på omtrent 1 300 bp ble også skåret ut fra gelen, svarende til DNA-fragmentet som inneholder genet som koder for det ekstracellulære område i muse-interleukin 3-reseptoren. DNA-fragmenter ble eluert fra gelen som beskrevet i eksempel 5.

De to DNA-fragmentene erholdt etter den første PCR-reaksjon, ble brukt sammen 1 en andre PCR-reaksjon, sammen med oligonukleotidprimerne C3N og N3N. Hver primer hybridiserer til ett av de opprinnelige fragmenter. Når de ble anvendt i en PCR-reaksjon, amplifiserer primerne et fragment av DNA hvor to polypeptidkodende gener er ligert i den samme leseramme. Den andre PCR-reaksjon ble utført under de følgende betingelser:

Sammensetning av reaksjonsblanding:

Destillert vann ble tilsatt for å lage et sluttvolum på

250 ul.

Varmesyklu8betingelsene var identiske med de som ble brukt i PCR-reaksjonen umiddelbart ovenfor.

En porsjon av reaksjonsblandingen fra den andre PCR

ble fylt og kjørt på en agarosegel, noe som bekreftet at det ønskede PCR-produkt på omtrent 1 700 bp var blitt amplifisert. Det gjenværende av reaks j onsblandingen ble så ut felt ved å anvende etanol. Den utfelte DNA ble fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal, og fordøyelsesproduktene ble separert ved hjelp av agarosegelelektroforese på en 1% (vekt/volum) agarosegel. Et bånd på omtrent 1 700 bp ble skåret ut fra gelen, og DNA-en ble renset fra gelen på en lignende måte som den beskrevet i eksempel 5.

Parallelt ble 2 ug pME18S-mFas-AIC-DNA fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal. Produktene fra fordøyelsen ble separert ved hjelp av gelelektroforese på en 0,8% (vekt/- volum) agarosegel, og et bånd på omtrent 3 000 bp ble skåret ut fra gelen. DNA-en ble isolert og ligert til det 1 700 bp store PCR-produkt (fremstilt ovenfor) under anvendelse av et DNA-ligeringssett, versjon 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Den totale reaksjonsblanding (10 pl) ble brukt til å transformere kompetente celler av JM109 E. coli (Takara Shuzo), og det ble gjort en utvelgelse med hensyn på amplcllllnreslstente kolonier. Én slik ampicillinresistent transformant ble dyrket ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, og plasmid-DNA ble fremstilt fra cellene ved hjelp av alkalisk lyse (Maniatis, supra). Det resulterende plasmid ble betegnet phFas-AIC2.

phFAS-AIC2-DNA ble transfektert i COS-l-celler ved hjelp av elektroporasjon under anvendelse av GTE-1-apparatet. Nærmere bestemt ble COS-l-cellene dyrket i fire 225 cm<2>dyrk-ingskolber (Sumitomo Bakelite). Cellene ble dyrket til en halvsammenflytende tilstand i DMEM inneholdende 10% (volum/- volum) bovint fosterserum (CSL). Mediet ble fjernet, og cellene ble behandlet to ganger med 3 ml trypsin-EDTA-oppløsning (Sigma) ved 37 °C i 3 minutter. Cellene ble utvunnet og så vasket to ganger med en PBS(-)-buffer (Nissui Pharmaceutical). De vaskede COS-l-celler ble regulert til en tetthet på 6 x 10<7>celler/ml med PBS(-)-buffer.

phFa8-AIC2-plasmid-DNA ble fremstilt ved å anvende et plasmidmassefremstillingssett (Maxiprep DNA Purification System, Promega) og 200 ug av denne plasmid-DNA ble utfelt ved hjelp av etanol og så oppløst i 200 ul PBS(-)-buffer.

En porsjon av cellesuspensjonen (20 ul, 1,2 x IO<6>celler) og 20 ul plasmidoppløsning ble blandet, og den resulterende blanding ble innført i en elektroporasjonskyvette med et elektrodemellomrom på 2 mm. Kyvetten ble plassert i elek-troporasjonsapparatet, og to 600 V, 30 usekunders pulser ble påført prøven med et mellomrom på 1 sekund mellom pulsene. Denne fremgangsmåte ble utført på ti prøver.

Celle-DNA-blandingene av de 10 prøvene ble slått sammen og tilsatt til 50 ml DMEM inneholdende 10% (volum/volum) bovint fosterserum, og den resulterende blanding ble overført til en 225 cm<2>celledyrkingskolbe (Sumitomo Bakelite). Cellene ble dyrket ved 37 °C under 7,5% C02i 24 timer. Deretter ble kultursupernatanten fjernet, og cellene ble vasket med serumfritt DMEM-medium. Nyfremstilt, serumfritt DMEM-medium (50 ml) ble så tilsatt til kulturen, og cellene ble dyrket ved 37 "C under 7,5% C02 i ytterligere 24 timer. Deretter ble kultursupernatanten utvunnet.

(b) ELISA

Aliquoter av COS-l-kultursupernatantene (100 ul) ble pipettert over i brønner i en 96-brønners immunoplate (Maxi-sorb, Nunk) og lagret ved 4 °C over natten. Dette resulterer i dannelsen av en fast fase av protein på den indre overflate av brønnen, inneholdende det ekstracellulære område i human-Fas-antigen. Hver brønn ble vasket med PBS inneholdende 0,05%

(volum/volum) "Tween-20" (EIA-finhetsgrad, Bio-Rad), og så ble 100 ul PBS inneholdende 0,5% (vekt/volum) bovint serumalbumin (BSA) tilsatt. Platen fikk stå ved romtemperatur i 1 time for å bevirke blokkering.

Hver brønn ble vasket med PBS inneholdende 0,05%

(volum/volum) "Tween 20", og så ble et CHll (standard) fremstilt i eksempel 2 sammen med 100 ul fortynnede testprøveopp-løsninger fremstilt i eksempel 5, pipettert over i brønnene. Reaksjonen fikk fortsette ved romtemperatur i 4 timer.

Brønnene ble så vasket med PBS inneholdende 0,05%

(volum/volum) "Tween-20". En porsjon (100 ul) peroksidasemerket, monoklonalt anti-muse-IgM-antistoff fra rotte (1/2 000 fortynning, Zymed Laboratories) ble pipettert over i hver brønn, og reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur i 2 timer.

Brønnene ble så vasket ytterligere med PBS inneholdende 0,05% (volum/volum) "Tween-20". En porsjon (100 ul) sub-stratoppløsning (peroksidasesubstratsett ABTS, Bio-Rad) ble pipettert over i hver brønn for å starte opp en fargereaksjon. Absorbansverdiene til hver brønn ved 405 nm og 492 nm ble målt ved å anvende en mikroplateavleser, og absorbansavlesingen ved 492 nm ble trukket fra absorbansavlesingen ved 405 nm. De således erholdte verdier ble sammenlignet med verdiene for CH11-standarden for å evaluere testprøvens evne til å binde til proteinet som inneholder det ekstracellulære område i human-Fas- antigen.

Resultatene er vist i tabell 1 nedenunder. Som det kan ses, ble binding observert ved å anvende supernatanter [E]

(pHEX126 og pLEX004) og [F] (pHEX126, pLEX004 og pJEX004), fremstilt i eksempel 5.

Eksempel 7

C<y>totokslsltetsanalvse

Cytotokslslteten til hver COS-l-cellekultursuper-natant fremstilt i eksempel 5, ble bestemt ved hjelp av MTT-analysemetoden [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid] beskrevet nedenunder.

Humanlymfocyttcellestammen HPB-ALL [se Morikawa, S. et al. (1978), Int. J. Cancer, 21, 166-170] ble dyrket på et RPMI1640-medium (Nissui Pharmaceutical) inneholdende 20 mM HBPES (HEPES: N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre), 50 uM 2-merkaptoetanol og 10% (volum/volum) bovint fosterserum (Equitec Bio) under 5% C02ved 37 °C i 3 dager. En porsjon (75 ul) av COS-1-cellekultursupernatanter fremstilt i eksempel 5, ble pipettert over i brønner 1 96-brønners dyrkingsplate, og så ble det tilsatt 25 ul HPB-ALL-celler (regulert til 2 x 10s celler/ml). Cellene ble dyrket ved 37 °C i nærvær av 5% C02i 12 timer. Til hver brønn i skålen ble det tilsatt 10 ul av en 5 mg/ml vandig oppløsning av MTT (Sigma), og platen ble inkubert i 4 timer. Etter inkubasjonen ble 100 pl av en opp-løsning inneholdende 50% (volum/volum) N,N-dimetylformamid og 20% (vekt/volum) SDS tilsatt til hver brønn. Absorbansverdiene for hver brønn ble avlest ved 590 nm og 620 nm under anvend else av en mikroplateavleser (Nippon Intermed Ltd.). Absorbansen ved 620 nm ble trukket fra absorbansen ved 590 nm. Dess høyere verdi, dess større antall levedyktige celler var tilbake i brønnen. De oppnådde verdier er gjengitt i tabell 2 nedenunder.

De COS-l-cellekulturer som ble transfektert med et enkeltplasmid i eksempel 5 ([A], [B], [C] og [D]), oppviste alle høye verdier som er sammenlignbare med verdiene til de ikke-transfekterte celler. De cellene som ble samtransfektert med pHEX126 og pLEX004 ([E] og [F]), oppviste lave verdier som er sammenlignbare med verdiene til en blindprøve hvor ingen celler var til stede. Av disse resultatene ble det funnet at et cytotoksisk stoff fremstilles ved samekspresjon av den DNA som koder for CHll-H-kjeden og CHll-L-kjeden.

Eksempel 8

Komparativ antistoffcvtotoksisitet ( ED50- test)

Cytotoksisitet til antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ble evaluert ved hjelp av en ED50-test. Slik det her er brukt, er ED50den konsentrasjon av antistoff hvor 50% av en prøve av celler som uttrykker Fas-antigenet, ble drept. Før måling av ED50var det nødvendig å beregne nøyaktig konsen-

trasjonen av antistoffene under testing.

8-1 Bestemmelse av antistoffkonsentrasjon

I hver brønn i en 96-brønners ELISA-plate (NUNC) ble det pipettert 100 ul av en anti-muse-IgM-antistoffoppløsning (0,5 ug/ml i 50 mM Na2HC03, pH 9,6, innkjøpt fra BIOSYS), og platen ble inkubert over natten ved 4 °C. Antistoffoppløsnin-gen ble så kassert, og hver brønn ble vasket fire ganger med PBS inneholdende 0,5% "Tween-20" (heretter henvist til som

"PBS-T" ).

"Super-Block"-blokkeringsbuffer (Pierce) ble laget i PBS i overensstemmelse med produsentens instruksjoner, og

100 ul av denne buffer ble pipettert over i hver brønn. Platen ble så inkubert ytterligere i 4 timer ved 37<6>C. Deretter ble blokkeringsoppløsningen fjernet, og hver brønn ble vasket fire ganger med PBS-T.

En 100 pl prøve av hvert antistoffpreparat som skulle testes, ble tilsatt til hver brønn i platen. Testprøvene om-fattet CHll og supernatantene [E] og [F] ifølge eksempel 5. Forskjellige standardpreparater omfattende muse-IgM (Zymed) fortynnet til forskjellige konsentrasjoner, ble brukt. Etter at prøvene var blitt tilsatt til brønnene, ble platen inkubert ved 37 °C i 4 timer. Deretter ble test- og standardoppløsnin-gene fjernet, og hver brønn ble vasket fire ganger med PBS-T.

En prøve av pepperrotperoksidasekonjugert anti-muse-IgM (100 pl av en 1/1 000 fortynning i PBS) ble tilsatt til hver brønn. Denne oppløsning ble så fjernet, og hver brønn ble vasket med PBS-T fire ganger.

En 100 pl stor prøve fremstilt fra et pepperotperok-sidasesubstratsett (Biorad), ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble absorbansavlesninger gjort ved både 405 og 492 nm under anvendelse av en mikroplateavleser.Absorbansen ved 492 nm ble så trukket fra avlesningen ved 405 nm.

Ved å anvende absorbansverdiene for standardprøvene var det mulig å konstruere en standardkurve hvorfra konsentra-sjonen av hvert testantistoff kunne bestemmes.

Det var da mulig å evaluere ED50.

(8-2) ED5 0- bereanlnq

De tre antistoffoppløsningene av hhv. CHll, supernatant [E] (inneholdende H- og L-kjeder) og supernatant [F]

(inneholdende H-, L- og J-kjeder) ifølge eksempel 5 ble inkubert med HBP-ALL-celler. En MTT-analyse, beskrevet i eksempel 7, ble brukt til å fastlegge hvor mange celler som ble drept av hver antistoffoppløsning.

MTT-resultatene for hvert antistoff ble beregnet som en funksjon av proteinkonsentrasjon oppnådd i (8-1) ovenfor for å bestemme ED50-verdien, idet MTT ble brukt som negativ kontroll og resultatene for HBP-ALL dyrket i fravær av antistoff som positiv kontroll. Resultatene er vist i tabell 3.

Resultatene ovenfor viser klart at produktet som finnes i supernatant [E], overraskende har omtrent fem ganger høyere aktivitet enn både CHll og produktet inneholdt i supernatant [F]. Det ser sannsynlig ut at en IgM-struktur dannes av produktet som finnes i supernatant [F], mens produktet inneholdt i supernatant [E], danner enkle antistoffpar og at ED50under disse omstendigheter økes betydelig.

Claims

1. Rekombinant protein, karakterisert ved at proteinet omfatter minst ett område som tilsvarer et variabelt immunoglobulinområde, hvor det minst ene område gjør det mulig for proteinet å gjenkjenne og bindes spesifikt til et antigen, idet antigenet er human-Fas, og hvor proteinet har praktisk talt ikke mer immunogenisitet hos en menneskepasient enn et humananti-stof f.

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det består hovedsakelig av bare ett variabelt område.

3. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det består hovedsakelig av to variable områder, hvor ett av de variable områder tilsvarer et variabelt H-kjedeområde og det andre tilsvarer et variabelt L-kjedeområde.

4. Protein ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at de variable områdene er knyttet sammen ved hjelp av en fleksibel peptidbinding.

5. Protein ifølge krav 1, 3 eller 4, karakterisert ved at det har minst to av de variable områdene, idet de variable områdene er avledet fra et eneste monoklonalt antistoff.

6. Protein ifølge krav 5, karakterisert ved at de variable områdene er helhetlig bundet til konstante humanområder.

7. Protein ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at de variable områdene tilsvarer enten et variabelt H-kjedeområde eller et variabelt L-kjedeområde, og er hver for seg bundet til henholdsvis et konstant H-kjedeområde eller et konstant L-kjedeområde.

8. Protein ifølge hvilket som helst av kravene 5-7, karakterisert ved at de variable områdene hver for seg er en del av et større polypeptid, og at de to polypeptidene inngår forbindelse slik at det dannes en antistof f heterodimer .

9. Protein ifølge hvilket som helst av kravene 5-8, karakterisert ved at de variable områdene enten er identiske med eller nært tilsvarer de som finnes i CHll.

10. Genteknisk fremstilt immunoglobulinprotein som spesifikt bindes til human-Fas, karakterisert ved at immunoglobulinproteinet består hovedsakelig av en H-kjedeunderenhet og en L-kjedeunderenhet, hvor H-kjedeunderenheten omfatter en aminosyresekvens representert ved den følgende generelle formel (I):

hvor FRHX er en aminosyresekvens som omfatter 13-30 aminosyrerester, CDRHX er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 1, FRH2 er en aminosyresekvens som omfatter 14 aminosyrerester, CDRH2 er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 2, FRH3 er en aminosyresekvens som omfatter 32 aminosyrerester, CDRH3 er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 3, og FRH4 er en aminosyresekvens som omfatter 11 aminosyrerester, hvor hver av aminosyresekvensene er bundet til den neste via en peptidbinding; hvor L-kjedeunderenheten omfatter en aminosyresekvens representert, ved den følgende generelle formel (II):

hvor FRLX er en aminosyresekvens som omfatter 23 aminosyrerester, CDRLj er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 4, FRL2 er en aminosyresekvens som omfatter 15 aminosyrerester, CDRL2 er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 5, FRL3 er en amino syresekvens som omfatter 32 aminosyrerester, CDRL3 er aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 6, og FRL4 er en aminosyresekvens som omfatter 10 aminosyrerester, hvor hver av aminosyresekvensene er bundet til den neste via en peptidbinding.

11. Protein ifølge krav 10, karakterisert ved at H-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr.

1-116 i SEKV.ID NR. 8.

12. Protein ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at L-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr.

1-112 i SEKV.ID NR. 10.

13. Protein ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at H-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr.

1-571 i SEKV.ID NR. 8.

14. Protein ifølge krav 11, 12 eller 13, karakterisert ved at L-kjedeunderenheten omfatter aminosyresekvensen representert ved aminosyrene nr.

1-219 i SEKV.ID NR. 10.

15. RNA, karakterisert ved at den koder for et protein ifølge ethvert forutgående krav.

16. DNA, karakterisert ved at den koder for et protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-14.

17. DNA, karakterisert ved at den koder for et peptid med formel (I) som definert i krav 10.

18. DNA ifølge krav 17, karakterisert ved at den omfatter nukleotid sekvensen representert ved nukleotidene nr. 58-405 i SEKV.ID NR. 7.

19. DNA, karakterisert ved at den hybridiserer med DNA ifølge krav 18, en sensetråd som tilsvarer den hybridiserende DNA som koder for en immunoglobulin H-kjedeunderenhet som er i stand til spesifikt å binde human-Fas, sammen med en L-kjedeunderenhet som omfatter en aminosyresekvens med den generelle formel (II) som definert i krav 10.

20. Hybridiserende DNA ifølge krav 19, karakterisert ved at den hybridiserer ved 60-70 °C og i 6 x SSC.

21. DNA, karakterisert ved at den koder for en L-kjedeunderenhet som omfatter en aminosyresekvens representert ved den generelle formel (II) som definert i krav 10.

22. DNA ifølge krav 21, karakterisert ved at den omfatter nukleotidsekvensen representert ved nukleotidene nr. 58-393 i SEKV.ID NR. 9.

23. DNA, karakterisert ved at den hybridiserer med DNA ifølge krav 22, en sensetråd som tilsvarer den hybridiserende DNA som koder for en immunoglobulin L-kjedeunderenhet som er i stand til spesifikt å binde human-Fas, sammen med en H-kj edeunderenhet som omfatter en aminosyresekvens med den generelle formel (I) som definert i krav 10.

24. Hybridiserende DNA ifølge krav 23, karakterisert ved at den hybridiserer ved 60-70 °C og i 6 x SSC.

25. Vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA ifølge hvilket som helst av kravene 16-24.

26. Vektor ifølge krav 25, karakterisert ved at den er en ekspresjonsvektor .

27. Vektor, karakterisert ved at den er valgt fra pCR3-H123 og pCR3-L103.

28. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge hvilket som helst av kravene 25-27.

29. Vertscelle, karakterisert ved at den er E. coli pCR3-H123 (FERM BP-5247).

30. Vertscelle, karakterisert ved at den er E. coli pCR3-L103 (FERM BP-5248).

31. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulinprotein som spesifikt gjenkjenner human-Fas-antigen, karakterisert ved at en celle ifølge hvilket som helst av kravene 28-30 dyrkes under betingelser som mulig-gjør ekspresjon av DNA som koder for immunoglobulin H-kjede-eller L-kjedeunderenheten som finnes i vektoren, og immunoglobulinproteinet utvinnes fra kulturen.

32. Anvendelse av CDR-er valgt fra CDRH1 , CDRH2 , CDRH3 , CDRLlr CDRL2 og CDRL3 , som definert i krav 10, og kombinasjoner derav, ved konstruksjon av humaniserte antistoffer.

33. Anvendelse av DNA som koder for CDR-er valgt fra CDRHi , CDRH2 , CDRH3 , CDRLX , CDRL2 og CDRL3 , som definert i krav 10, og kombinasjoner derav, ved konstruksjon av DNA som koder for humaniserte antistoffer.

34. Anvendelse av et protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-14 ved fremstilling av et medikament for behandling av en autoimmunsykdom.

35. Anvendelse ifølge krav 34, hvor autoimmunsykdommen er reumatisme.