NO881058L - Hepatosytt rettet vesikkel avleveringssystem. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et kjemisk strukturert avleveringssystem for retting av medisiner, hormoner, biologiske eller diagnostiske materialer mot hepasytter.

I US patent nr. 4.377.567 er vist anvendelse av de galak-tocyldiglyserid for å rette vesikler inneholdende medisiner, hormoner og andre biologiske eller diagnostiske materialer mot leveren. For full angivelse av teknikkens stand, så henvises det til dette tideligere patent som medtas som ref eranse.

I US patent nr. 4.091.088 undersøkes leverfunksjonen med et middel som er merket med teknetium .99m for anvendelse som et radiofarmasøytisk billeddannende middel for gallegangen. Dette materialet påvirker ikke leveren annet enn ved å tilveiebringe en sveipemulighet for diagnoser.

I US patentene nr. 4.318.898 og 4.350.674 vedrører pan-tobilære reseptorer og forårsaker en rask passasje til gallesystemet for diagnose, men ikke for behandling.

Britisk patent nr. 1.545.427 vedrører også det heptabilære system for diagnose av gallesystemet. Oppfinnelsen adskiller seg fra det ovenfor nevnte og all annen kjent teknikk, innbefattet tilgjengelig litteratur, ved at det er funnet at: a) den heptabilære reseptorrettede vesikkel vil ikke bare passere til gallesystemet, slik som kunne ventes

av det som tideligere er kjent,

b) det hepatosyttrettede vesikkelsystem målrettet mot hepatobilære reseptorer i hepatosyttene vil bli ut-nyttet for å avgi hormoner og medisiner til leveren.

Foreliggende oppfinnelse vedrører hovedsakelig oppdagelsen at bipolære lipidvesikler innholdende et farmasøytisk middel kan rettes mot de heptobilære reseptorer i en lever. Det er funnet at i steden for å passere i gjennom galle systemet som forventet, så vil en vesikkel rettet mot de heptobilære reseptorer bibeholdes av hepatosyttene med eksepsjonell effektivitet.

Med denne oppdagelse er den hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en hepatosyttrettet vesikkel (HDV) som er rettet mot de heptobilære reseptorer.

Det er derfor en hensikt med foreliggende oppfinnelse å fremme effektiviteten av hepatosyttrettede vesikler generelt ved å rette målmolekylet bort fra overflaten av vesikkelen.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å forsterke effektiviteten ved levermedisinering ved å få tilgang til de heptobilære reseptorewr i leveren.

En ytterligere hensikt med oppfinnelsen er å tilveiebringe et hepatosytt avleveringssystem omfattende en sammensetning av en vesikkel og et heptobilært målsøkende molekyl, hvori vesikkelens farmakologiske last frigjøres fra dens målsystem og blir tilbake i levercellene hvor de kan bevirke sin farmakologiske virkning.

Hovedhensikten med oppfinnelsen er implementering av oppdagelsen at den hepatosyttavgivende vesikkel kan rettes mot de hepatobilære reseptorer av hepatosyttene, og ikke bare passere gjennom gallesystemet, men at den farmakologiske last kan bibeholdes i hepatosyttene i leveren, og muliggjøre at den farmakologiske last kan utøve den farmakologiske virkning.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å forhindre kontakt mellom den farmakologiske last med celler og vev i legemeet som ikke er påtenkt som målvev og derved forsterke spesifi-siteten og virkningen av den farmakologiske last, samt nedsette den ikke-spesifikke toksysitet.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å muliggjøre anvendelse av HDV ved intradodenal (oral), intravenøs, subkutan og intramuskulære administrasjons ruter.

BESKRIVELSE AV TEGNINGENE.

Fig. 1 viser grafisk plasmaglykosenivåer for normale hund-modeller med avskåren nerve, undersøkt med hensyn til diabetes, og deretter normalisert ved hjelp av oppfinnelsen. Fig. 2 er et stolpediagram som sammenfatter de data som er vist i fig. 1. Fig 3 er en grafisk fremstilling av sukkernivået etter kontrollert dose av saltvann til en sukkersyk fastende hund og sammenlignet med resultatet etter administrasjon av HDV1. Fig. 4 viser grafisk forandring av glykoseavgivelse til opptak etter infusjon av HDV1. Fig. 5 er en grafisk sammenligning av effekten ved å korrigere mangel på kontrollserotonin i sukkersyke dyr via oral dosering. Fig. 6 er en grafisk sammenligning av effekten ved å korrigere mangel på kontrollserotonin i sukkersyke dyr via intravenøs injeksjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører blandinger og frem-gangsmåter for å avgi farmakologisk aktive midler, for-trinnsvis til leveren hepatosytter. Leveren består av to typer celler: hepatosytter eller metabolittceller og rektikuloendotealceller (RE celler) som er renovasjons-celler. Mere spesielt tilveiebringer oppfinnelsen lipid membran strukturer (vesikkeler, liposomer) dirigert av hepatosyttmålsøkende molekyler, og kobling av molekylene til lipidmembranen av vesikkelen for å føre farmasøytisk aktive midler så som insulin preferensielt til hepatosyttenes hepatobilære reseptorer, og ikke til RE cellene.

Oppfinnelsen har generell anvendelse for forbedring av effektiviteten av tilgjengelighet til hepatosytter pga. forlengelse av målmolekylet bort fra overflaten av vesikkelen. Imidlertid er den primære funksjon av den foretrukne utførelsesform, som beskrives mere detaljert, å få tilgjeng elighet til hepatosytter ved å utnytte de hepatosyttbilære reseptorer på heptosyttcellens overflate. Hepatosyttbilære reseptorer er kjent for å motta bestanddeler til leveren som skal avgis som galle til gallesystemet, mens lever (hepatosytt) behandling med liposomer generelt er oppnådd ved å få tilgang til hepatosyttenes Ashwell reseptorer ved hjelp av galaktosylmålsøkende molekyler.

Leveren er menneskelegemets største kjertel og som sådan mottar den en massiv blodtilførsel både gjennom portåren og leverarterien. Metabolsk er leveren det mest komplekse organ i menneskelegemet og blant mange andre multiple funksjoner kan den metabolisere/fordele medisiner som innføres i organismen. Leveren er også målorganet for farmakologisk aktive midler som dannes inne i legemet. Følgelig vil et forbedret middel for preferensiell avgivelse av medisiner til leveren tilveiebringe en måte å tillate at medisinen håndteres av legemet på en mere naturlig måte og derved forbedre den medisinske terapi.

Måten med hvilken leveren håndterer insulin illustrerer aktiviteten for dette viktige målorgan.

Insulin er et hormon som påvirker metabolismen av et dyr totalt sett. Den mest dramatiske effekt av dette hormon er dets evne til å nedsette konsentrasjonen av glykose i plasma. Inntatte karbohydratmåltid vil normalt fordøyes til glyskose i tarmen og deretter absorbert i portsirkulasjonen. Pankras vil reagere på karbohydrater i tarmkanalen med frigjørelse av insulin til portsirkulasjonen. Portåren fører absorbert glykose og frigitt insulin til leveren. I leveren vil insulinet regulere metabolismen av glykose ved hjelp av hepatosyttene. Ved en ukjent mekanisme vil leveren til-bakeholde det meste av insulinet, men vil frigjøre litt for å fremme glykoseutnyttelse av muskel- og fettvevet. Nedsettelse av blodglykose skyldes insulinets effekt både i leveren og i de ytre vev. Sålede mens pankras er kilden for insulin inne i organismen, så er leveren nøkkelen for dets

normale utnyttelse.

Insulinterapi for deabetis mellitus begynte i 1922. Ved vanlig medisinsk praksis blir insulin administrert subkultant fordi oral administrasjon av insulin er ineffektivt, trolig pga. proteolyse. Subkutant administrert insulin gir et lavere nivå av blodglykose, hovedsakelig som følge av dets virkning på muskel- og fettvevet. Imidlertid kan insulin administrert ved injeksjon neppe klassifiseres som nær normal tilstand. Det er viktig at det anatomiske arrangement av pankras i det normale individ er slik at høye nivåer av insulin som avgis av pankras som reaksjon på orale glykosebelastninger, føres med portsirkulasjonen til leveren før det går inn i den ytre sirkulasjon. Ved sammenligning vil, når insulin administreres subkultant til den sukkersyke pasient, de perifere vev først få tilgang til hormonet og kan nedsette nivået av insulin tilstede i leveren og som følge derav nedsette effektiviteten av leveren som en betydelig glykoseregulerende mekanisme. Insulin administrert ved injeksjon vil derfor ikke ha den samme fysiologiske virkning som insulin frigjordt fra pankras.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedret måte hvorved insulin og farmakologisk virksomme midler kan avgis preferensielt til leveren hos mennesker og lavere dyr.

Lipid membran strukturen som anvendes omfatter et bipolart lipid, og et målmolekylkonjugat.

Det foretrukne polare lipid anvendt ved utøvelse av foreliggende fremgangsmåte er distearolyl lecitin. Naturlig lecitin (fosfatidyl kolin, vitelin) omfatter en blanding av diglyserider av stearin- palme- eller oljesyrer forbundet til koliesteren av fosforsyre og finnes i alle levende planter og dyr. Vesikler fra slike polare lipider er kjente innen teknikkens stand. Den mindre "liposom" blir generelt omtalt som "vesikkel", men betegnelsene kan benyttes omhverandre i den etterfølgende beskrivelse. En vesikkel kan være unilaminær med en diameterstørrelse fra 250 Å til 5pm.

HDV er nyttig for å avgi medisiner, hormoner, biologiske-eller diagnostiske materialer til leveren. Leveren er et vanskelig organ å nå ved eksogent administrerte medisiner og HDV representerer således et enestående terapeutisk fremskritt som gjør det mulig å avlevere medisiner, hormoner, biologiske- og diagnostiske materialer på en mere effektiv og sikrere måte enn de som i dag er tilgjengelige. GRunnen til den "terapeutiske utilgjengelighet" av leveren for konvensjonell terapi er at levberen er anatomisk plassert på en slik måte at den er isolert fra resten av kroppen mht. blodsirkulasjon. Hoveddelen av leverens blod kommer til den via portavgivningssystemet som er et meget lokalisert, lavtrykks-venesystem som er beregnet for å føre absorberte næringsmidler (fordøyelsesprodukt) fra tarmene til leveren for metabolisme. Arterieblodtilførselen tar seg først av resten av legemet før en liten del av den når leveren via portsystemet.

I lys av det faktum at leveren er et vanskelig organ og nå med eksogent administrerte medisiner så tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et biologisk bæresystem som utnytter hule, bipolare llposomer i forbindelse med en familie av levermolekyler for å bevirke avlevering av den foreskrevne medisin.

Det følgende diagram viser skematisk basis-strukturen for et funksjonelt HDV

Den følgende struktur illustrerer den basiske liposom eller den bipolare lipidvesikkel:

hvor q er et polart lipid,

og representerer den lipofile del,

og hvor O representerer den hydrofile del.

Vesikkelen er en sfære med en vandig kjerne hvor sfæren er en bipolar lipid membran med hydrofile overflater og et lipofilt (hydrofobt) indre av membranen. Den vanndige kjernen kan inneholde vannøppløselige substanser så som medisiner, hormoner, mineraler, diagnostiske midler og biologiske midler. Lipofile bestanddeler kan ikke inneholdes i kjernevolumet, men i de bipolare lipid membraner.

Den målsøkende mekanisme krever at det molekylære målmolekyl er plassert på overflaten av liposomet eller vesikkelen på en slik måte at målmolekylene er tilgjengelig for samvirkn-ing med dets påtenkte reseptormolekyl som er på overflaten av den påtenkte celle. Målmolekylet er plassert slik at det utstrekker seg bort fra membranoverflaten. Se avbildningen ovenfor for en billedmessig representasjon.

HDV formes på en slik måte at en konektorpossesjon først innarbeides i membranen på det tidspunkt når membranen formes. Konnektorpossesjonen må ha en lipofil del som er fast innesluttet i og forankret til membranen. Den må også ha en hydrofil del som er kjemisk tilgjengelig for den vandige overflaten av vesikkelen. Den hydrofile del velges slik at den vil være kjemisk egnet til å gi en stabil kjemisk binding med målmolekylet som tilsettes senere.

Derfor bør tilknyttningsmolekylet ha et lipofilt anker og en hydrofil reaktiv gruppe egnet for omsetning med målmolekylet, og holde dette i dets riktige possisjon, nemlig utstrekkende seg fra vesikkelens overflate. I noen tilfeller er det mulig å tilknytte målmolekylet til forbindelses-molekylet direkte, men i de fleste tilfeller er det mere egnet å anvende et tredje molekyl som virker som en kjemisk bro og således forbinder forbindelsesmolekylen som er inne i membranen med målmolekylet som utstrekker seg tredimensjonalt ut fra vesikkeloverflaten.

Et viktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er det faktum at molekylet kan være et hvilket som helst molekyl som gjenkjennes av heptobilære reseptorer i hepatosytten. Betegnelsen "Heptabilær" er definert i 1965 utgaven av Dorland's Illutrated Medical Dictionary, W.B. Saunders

and Company, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A. som

"tilhørende lever og gallen eller gallekanalene.". De heptobilære reseptorer i hepatosyttene er istand til å gjenkjenne å innta i hepatosyttene et stort antall kjemiske strukturer. Målmolekylets natur er derfor klarere definert av dets biologiske spesifisitet for heptabilære reseptorer i hepatosyttene .

Defenls. loner

I foreliggende oppfinnelse kan det anvendes som målmolekyler en hvilken som helst kjemisk bestanddel som kan tas inn i hepatosyttene, og transporteres inn i gallesystemet. Pga. denne mangfoldighet er det nødvendig å ha denne biologiske defenisjon for målmolekylet istedenfor en kjemisk defenisjon.

Eksempler

Et antakk kjemiske strukturer som er kjemisk forskjellige vil generelt gjenkjennes som hepatobilære kjemikalier, og virke som effektive hepatosyttmålmolekyler. Pga. det store antall kjemikalier som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse som målmolekyler, er det nødvendig å tilveiebringe et passende antall kjemiske midler for å tilknytte disse molekyler til overflaten av vesikkelen. Denne variasjon krever derfor et antall forskjellige forbindelses- og kjemiske brosystemer for å tillate anvendelse av dette antall av kjemiske strukturer som vanligvis omtales som patobilære materialer.

Selv om hoveddelen av de hepatobilære målmaterialer vil kreve tilknytningsteknikkene som generelt beskrevet ovenfor, så vil noen være egnet for anvendelse som et enkelt molekyl, fordi de vil ha en kjmisk del som virker som "forbinder" og andre deler som virker som "målmolekyler". Eksempler på nyttige systemer vil derfor innbefatte representanter for multippel trinn (tilknytter- bro- mål-) systemet og enkelttrinnet som ovenfor beskrevet.

Den etterfølgende strukturformel er et eksempel på resultat av flertrinns-metoden, for å konstruere en hepatosyttrettet vesikkel (omtalt som HDV).

I den ovenfor viste struktur vil serien med linjer og små sirkeler symbolisere possisjonen av de polare lipidmembraner som inneslutter et vesikkelkjernevolum. Den strukturelle representasjon er helt ute av proposjoner for å lette illustrasjonen. De bipolare vesikler er i realiteten meget

store sammenlignet med tilknytter- målmolekylet.

Over parantesen merket "tilknytter" molekylet er et imino-dikarboksylsyremolekyl med en lipofil og en hydrofil ende. Den lipofile enden er den som inneholder benzenringen og som er vist innesluttet i den bipolare film av vesikkelen.

Den hydrofile del av sammenknytningsmolekylet vil utstrekke seg bort fra overflaten av vesikkelen pga. at den er vanntiltrekkende.

Over parantesen merket "målmolekyl" er i denne spesielle illustrasjon vist i en identisk imidodikarboksylsyre som tilknytningsmolekylet. Dette er en akseptabel, og muligens foretrukket utførelsesform, men er ikke på noen måte et eksklusivt krav. Dvs. at tilknytnings- og målmolekylene er vist som å være identiske i denne utførelsesform, men dette er ikke et krav. Det er et krav at denne foretrukne utførelsesform at målmolekylet er et molekyl som gjenkjennes av de hepatobilære reseptorer i leveren, i motsetning til sukker- type molekylene som normalt tiltrekkes til Ashwell reseptorene.

Over parantesen merket "bro ion" er en krom bro som vil forbinde de hydrofile, ladede terminale ender av de to imidodikarboksylsyregruppene. Disse to grupper vil normalt ikke forbindes med hverandre derfor anvendes kromionet for dette formål. Det finnes andre muligheter hvorved et hepatobilært målmolekyl kan knyttes direkte til et sammenknytningsmolekyl.

Det heptobilære målsøkende molekyl kan anvendes for å bringe en vesikkel inn i den del av leveren som normalt vedrører dannelse av gallevæsker. Etter foreliggende oppfinnelse kan det tenkes et stort antall mulige kombinasjoner av tilknytnings- og målmolekyler. Det er derfor kun opp til en oppfinnsom kjemiker å velge det størst mulige kombinasjoner for å oppnå de nødvendig e resultater. Det er ikke åpenbart at de heptobilære reseptorer vil akseptere et system som innbefatter en vesikkel og avgi vesikkelen i hepatosytten hvor den frigjør sin farmakologiske ladning og er effektivt mens resten av systemet passerer inn i gallegangen slik som man kunne forvente av det som måtte tas opp i de heptobilære reseptorer.

I et studium og forsøk utført for å underbygge oppfinnelsen så synes det som at meget store og et stort antall vesikkeler kan tas opp av hepatosyttene i gjennom de heptobilære reseptorer.

I. K. 1 em i

Å. Foretrukket hovedandel av bipolære lipidbestand-deler (75 - 9556).

1. De stearolyl lecitin (DSL)

2. Dipalmotoyl lecitin (DPL)

3. Andre lecitiner med kjedelengde CIO - C20

B. Mindre andel av andre bestanddeler (0,1 - 25$)

for stabilitet.

1. Kolestorol

2. Disetylfosfat

3. Albumin

C. Målmolekyler (0,1 - 10%)

Hepatosytt spesifisitet overføres til molekyler med de følgende strukturer som både har hydrofile

og hydrofobe deler:

Foretrukket målstruktur nr. 1

tur nr. 1 R

/ 2a

Ri Q

<R>2a \ HydrQf 1V \ Hydrofob/

Målsøking tilskrives denne del Foretrukket målstruktur nr. 2 hvori R^har de følgende struktur (er) og n = 1 - 3,

R £ „ a har de følgende struktur (er):

R„, har den følgende struktur:

Foretrukket målstruktur nr. 3

N - (3 bromo-2, 4,6- trimetylfenyl karbamoyl metyl)

imino dieddiksyre

Foretrukket målstruktur nr. 4

N - (3-cyano-4, 5 - dimetyl-2-pyrol karbamoyl metyl)

imino dieddiksyre

Foretrukket målstruktur nr. 5

Biliverdin (eller bilirubin)

D. foretrukne bro eksempler

1. Uorganisk salt av :

a. krom

b. kobolt

c. Jern

d. sink

2. Organiske a. etylen diamin

b. propylen diamin

Tilknvttere

Med hver av de foretrukne målstrukturer så er den foretrukne tilknytter den samme som målet. Denne preferanse er kun for fabrikantens bekvemmelighet.

Det bør bemerkes at i målstrukturene vil dieddiksyre-delen tilveiebringe oksygen-bindinger for tilknytning via en bro til et sammenknytningsmolekyl som utviser tilsvarende oksygenmottagende punkter. Bromolekylene tilveiebringer de nødvendige ligander for å forbinde hver av de fire oksygen-atomer, og deved sammenknytte mål- og sammenknytningsmole-kylene.

Selv om det ovenfor nevnte er foretrukket, er det ikke nødvendig at identiske molekyler anvendes som sammenknytnings- og målmolekyl med en broforbindelse. Et eksempel på et alternativt sammenknytningsmiddel som ikke anvender en bro, er å innarbeide albumin i vesikkelmembranen og deretter omsette propoenylgruppene av bilirubin som målsøker med en glysinaminogruppe til å gi en Schiffs-base. I dette eksempel anvendte således ikke noe bromolekyl som sådan. Det er derfor innen omfanget av oppfinnelsen å danne et en-trinns målsystem uten å anvende separate sammenknytnings- og bro-molekyler.

Disse er eksempler på materialer som innarbeides i HDV i et trinn, og som ikke krever fler-trinns tilsetning av bro- og deretter målmolekyler, selvom deler av de større molekylære konjugater kan betegnes som "tilknytter", "bro" og "mål".

Det er fire deler av det komplette, foretrukne HDV:

1. Vesikkel, som bærer en last

2. Vesikkel-tilknytningsmolekyl

3. Brobyggende molekyl

4. Målsøkende molekyl

I henhold til oppfinnelsen kan tilknyttermolekylene og målmolekylene være identiske, dvs. at to identiske molekyler som er forbundet via en spesifikk molekylær bro, som når den passende er tilknyttet vesikkeloverflaten danner det full-stendige HDV-system.

Det er også mulig å forbinde forskjellige molekyler ved hjelp av en bro, og derved muliggjøre valg av forskjellige nyttige kombinasjoner av målsøker- og forbindelsesmolekyler som ellers ikke ville være forenelige. Dette vil ligge innen fagområdet for en biokjemiker etter at foreliggende oppfinn-elseskonsept er forstått.

I de foretrukne målstrukturer som ovenfor nevnt for hepatobilære reseptorer hvor R^har den foretrukne struktur hvor n = 1 for å maksimalisere den negative ladning på karbonylene, "n" kan forøkes med ytterligere metyleniske (CH2) grupper med en samtidig nedsettelse av den negative ladning på karboksylgruppen, hvilket vil resultere i en progressivt svakere ligand tilknytning til broen.

Fremstilling av den foretrukne utførelsesform.

Denne utvikling beskriver kobling av et levermålsøkende middel til en vesikkelmembran i den hensikt å danne et nytt målsøkende system. Dette er en ordnet rekkefølge av hendelser som er nødvendig for en vellykket kobling av det målsøkende middel til vesikkelmembranen. Fremstilling av vesikkelmålsøkersystemet krever initial dannelse av en vesikkelstruktur med et tilknytningsmolekyl innsluttet i membranen. I løpet av denne utvikling har to spesielle ligander vært anvendt for å feste tilknytningsmolekylet til de målsøkende molekyler. Inetialt ble en uorganisk bestanddel, nemlig kromklorid anvendt. Bekymring vedrørende lang-tids kromforgiftning som følge av kontinuerlig vesikkel-dosering har utelukket krom fra ytterligere studier, men organiske ligander så som HgN-CH^-CCH2)n-NH2hvor n = 1-4 (dvs. etylen diamin) er et alternativ for koblings-formål. Imidlertid, fra et praktisk synspunkt vil begge ligander tjene den samme funksjon.

I det etterfølgende er beskrevet en reaksjonssekvens vedrørende de foskjellige trinn som inngår ved dannelsen av et HDV-system. Hvert trinn er spesielt i forhold til det neste trinn, og for hvert etterfølgende trinn i reaksjons-sekvensen. Dette er den foretrukne utførelses form.

Det første trinn i sekvensen krever at tilknytningsmolekylet og lipidkomponentene omfattende L- -distearolyl lecetin (DSL), disetylfosfat (DCP) og kolestorol (CHOL) sammen med humanserum av albumin (HSA) sammensettes til en vesikkelstruktur med en bipolarmembran.

Som et resultat vil tilknytningsmolekylet være orientert i et tredimensjonert rom som ovenfor nevnt. Denne tredimensjonale stilling av tilknytningsmolekylet danner plattformen for de etterfølgende reaksjoner som fører til strukturene som fullstendiggjør HDV. På dette trinn vil hele vesikkelen virke som en stor suspandert struktur adskilt med en jevn fordeling av tilknytningsmolekylene som er rettet tredimensjonalt for å ta del i den neste reaksjons-sekvens. Den hydr-file del av tilknytningsmolekylet peker ut i den vandige fase i mediet, mens den hydrofobe del av molekylet er nedgravd i den lipofile del av membranen. Da molekylstørrel-sen for tilknytningsmolekylet er liten sammenlignet med den for vesikkelen, og da kun en del av tilknytningsmolekylet er innesluttet i vesikkelstrukturen ved fremstillings tids-punktet så kan gjenværende ikke oppfangede tilknytnings-molekyler lett fjernes ved "Sephadex G-100-120" gelfiltrer ingskromatograf i.

I det neste trinn omsettes et fem ganger molært overskudd med hensyn til den initiale konsentrasjon av tilknytnings-molekyler, enten med CrCl3heksahydrat eller etylendiamin (som er eksempler på brodannende molekyler) med vesikkelstrukturen inneholdende forankrede tilknytningsmolekyl til å gi et vesikkeltilknytningsmolekyl- bromolekylkompleks. Som et resultat av dette trinn vil den riktige tredimensjonale orientering av bromolekylet etableres for etterfølgende binding av et målsøkende molekyl til vesikkeltilknytningsmolekyl- bromolekylkompleks.

I sluttrinnet blir de målsøkende molekyler tilsatt til vesikkel- tilknytnings- brokomplekser. Et fem gangers molært overskudd av målmolekylet omsettes med vesikkelstrukturen inneholdende vesikkeltilknytning- molekylbrokomplekset til å gi vesikkeltilknytnings- molekylbrodannende molekylmål molekylkonjugate som anvendes for vesikkelmålsøkende formål. Overskudd av ikke omsatt målmolekyl kan fjernes ved "Sephadex G-100-120" gelfiltreringskromatografi.

Summarisk vil den unike steriske symmetri og struktur av det målsøkende molekyl tillate at det blir funksjonelt og nyttig for dets målsøkende rolle. Den unike, tredimensjonale symmetri kan oppnås ved utnyttelse av reaksjons-sekvensene som ovenfor beskrevet.

Den nye kjemi som utvises av dette målsøkende system, er at et molekyl som både er hydrofilt og hydrofobt kan omdannes til en hydrofob målsøkende enhet med den samtidig nøytral-isering av den ladede del av molekylet ved ligand-dannelse, og i tillegg i den korrekte tredimesjonale orientering eller projeksjon av dens hydrofobe målsøkende del inn i det hydrofile vanndige media. Således vil sekvensen med hvilken disse molekyler omsettes fremme og etablere den riktige orientering av de uoppløselige hydrofobe grupper til tross for en ugjestfri omgivelse som utgjøres av det vanndige media mot hydrokarbonstrukturene. Ytterligere vil den negative ladning som tilveiebringes av disetylfosfat (en av membranbestandene) på overflaten av vesikkelen danne ladning- ladningfrastøtning mellom vesikkeler og fremme deres suspansjon og lagrings-stabilitet. Det negativt ladede fosfat ved den hydrofile ende av molekylet vil ved en nøytral pH være bevirkende til ladning-ladningavstøtende effekt som fører til vesikkelstabilisering.

Denne ladning-ladningavstøtning er sterk nok (trolig av annen størrelsorden) til å overvinne eventuelle van der Valls induserte dipol samvirkninger forårsaket av den hydrofobe fenylring, og de tilhørende R-grupper.

Fremgangsmåte ved fremstilling av HDV.

DSL - 69,12 mg, iminodieddiksyrekompleks 1,07 mg, DCP

- 14,1 mg,

CHOL - 5,0 mg

1,5 ml av CHCl3/MeOH (volumforhold 2:1) ble tilsatt for å oppløse reaktantene. Prøven ble plassert i en roterende inndamper og inndampet til tørrhet ved 60°C ± 0,3°C under langsom omrøring under vakuum. Deretter ble 2,4 ml nyfrem-stilt 40mM fosfatbuffer pH 7,4 med en konsentrasjon for henholdsvis HSA og serotonin, den aktive bestanddel ved 4,2 mg/ml og 10 mg/ml, ble tilsatt de tørkede lipidbe-standdeler. Prøven ble lydbehandlet under anvendelse av "Heat Systems Ultrasonic Cell Disruptor" ved innstilling nr. 4, forsynt med en transduser og et kopphorn ved 60°C ± 0,5°C i 15 min. Deretter ble prøven varmebehandlet ved 60°C ± 0,05°C ved langsom omdreining i 15 min. Deretter ble prøven sentrifugert i en " Triac Clinical Centrifuge" ved blodinnstilling i 15 min. ved romtempera-tur .

Deretter ble 1,5 ml av den overflytende væske kromatografert på et 1,5 x 25,0 cm "Sephadex G-100-120" kolonne som tidligere var bragt i likevekt ved 40mM fosfatbuffer pH 7,4. Denne første kromatografering ble utført i den hensikt å fjerne ikke-innfanget HSA og serotonin, den aktive bestanddel. Lipidvesikkelene ble deretter oppsamlet og deretter ble de omsatt med et fire ganger molært overskudd av CrCl3i forhold til den initiale konsentrasjon av vesikkeltiknytningsmolekylene. Vesikkelene ble deretter kromatografert under anvendelse av den samme buffer, for å fjerne ikke omsatt CrCl3. De oppsamlede vesikkeler ble deretter omsatt med et fem ganger molært overskudd av tilknytningsmolekylene. Etter dette trinn ble vesikkelene på ny rekromatografert under anvendelse av den samme buffer for å fjerne ikke omsatte molekyler. Etter denne avsluttende kromatografering ble vesikkelene lagret under nitrogen i kjøleskap med 5°C. Fenyl kvikksølv (II) nitrat kan anvendes som preserveringsmiddel (0,001 %).

In Vivoi undersøkelse av den foretrukne utførelsesform.

For å undersøke oppfinnelsen, ble en in vivo modell anvendt. Man må ha for øyet at forsøket går ut på vellykket avlevering av en farmasøytisk dose til leveren. Avlevering av lasten etableres ved å påvise den ønskede farmakologiske respons ved tilførsel av lasten til leveren.

Hele hensikten med oppfinnelsen, og følgelig åpenbarelse av de mange tillempningsmetoder, er i realiteten å etablere ved in vivo bestemmelse at den farmakologiske last medført i en vesikkel kan og er avlevert til leveren i varme blodede dyr, og at den farmakologiske last gjøres tilgjengelig for virkning i hepatosyttene. I den hensikt at den farmakologiske last vil virke ved dens reseptor må HDV effektivt "nedbrytes" og frigi lasten fra det beskyttende belegg i vesikkelen. Den farmakologiske last må deretter anvendes av leveren til å forårsake en hormonell kontroll av leveren, slik som i naturlig virkende tilstand i friske individer. Oppfinnelsen har også oppdaget og sikkert etablert, at leverlagring av glykose som inntas under et måltid ikke bare krever hormonet insulin, men også at en ko-faktor er nødvendig for riktig leverfunksjon. Denne ko-faktor er protonin. Serotonin er en kjemisk forbindelse, nemlig 5-hydroksytryptamin (5-HT), som er tilstede I blodplatene, fordøyelsekanalensslimhinne, mastceller og i karsionide turmorer. Serotonin er en kraftig vaskokonstriktor (Taber's Cyclopedic Medical Dictionary, 14. utgave). Oppfinneren har etablert at serotonin tiføres til portåren som fører til leveren, mens maten absorberes i tarmene og er kontrollert av det sentrale nervesystem. Det ble således funnet at ved å kutte av vagus nervus så kunne serotonin i portåren i det vesentlige elimineres. Det er nå påvist at når dette gjøres vil leveren ikke lenger omdanne næringsbes-tanddelen glykose til glykogen å lagre glykogenet. Isteden vil leveren tillate at all glykose føres til det perifere system, og derved danne overskuddsukker i blodet, og føre til symptomer på sukkersyke. Selv om det hele tiden er tilstrekkelig tilgjengelig insulin i leveren vil underskudd på serotonin føre til et overskudd av glykose i blodet.

Ved å tilveiebringe en serotonin last i den hepatosytt av-givende vesikkel og rette vesikkelen mot de heptobilære reseptorer i leveren og observere at leveren går tilbake til normal funksjon så har oppfinneren klart etablert evnen av målvesikkelsystemet, ifølge oppfinnelsen, til å avlevere en farmasøytisk dose til leveren, uansett hva dosen måtte være. Hvis diagnostisk materiale er ønsket, eller insulin eller tilfelle av hypoglycemia blokkeringsmidler for serotonin funksjonen, så har denne enestående evne for oppfinnelsen blitt etablert.

Følgelig, i en hund modell med normal insulin produksjon i bukspyttkjertelen så er det en utmerket bestemmelse for HDV å avskjære nervene til kjertlene som produserer serotonin, og etter påvisning av sukkersyke-symptomer ved et overskudd av blod glykose, tilføre serotonin (5HT) til leveren. Re-etablering av normal leverglkosekontroll, vil da bevise effektiviteten av HDV avlevert til hepatosyttene.

I et første studium ved undersøkelse av HDV-systemet ble en kronisk hund-modell valgt som tilsvarer de tidligere trinn av begynnende diabetes mellitus hos voksne, i det etter-følgende betegnet som diabetes mellitus type II.

I denne modell ble diabetes indusert ved sellektiv nerve avkutting. De normalt sunne hunder reagerte, før nerve-avkutting, på et standar måltid (en tredjedel karbohydrat) ved å ha svakt nedsatte nivåer av perifer blodglykose. Etter nerva avkutting bibeholdt hundene normalt fastende blod-glykoseverdier, men deres perifere blodglykose nivåer steg betydelig etter et standarisert måltid, og reagerte på tilsvarende måte som voksne ved påbegynnende diabetes.

Denne spesielle modell ble valgt for dette studium fordi den muliggjorde evaluering av HDV-systemet i våkne, ikke-bedøvede dyr.

Dette studium ble delt itre faser, studium av blodglykosere-sponsen for dyrene når de var i (1) normal tilstand, (2) diabet-lignende tilstand og (3) vellykket behandling av den diabet-lignende tilstand ved subkutanadministrering av HDV, inneholdende serotonin.

Forsøksplanen krevet fire normale sunne blandingshunder. Den første fase av dette studium var å bestemme blodglykoseresp-onsen for disse fire hundene til et standarisert glykosemål-tid, som er sammenlignbar med den orale glykosetoleranse bestemmelse hos mennesker. Den grafiske fremstilling viser

sammenlignende kurver for in vivo bestemmelse.

Data for denne normale fase er vist i den grafiske fremstilling som linjen indikert med henvisningstallet 10. Data er uttrkt som prosent av faste blodglykoseverdien tatt før foring. Da fire hunder ble anvendt er gjennomsnittet, eller middelverdien for dataene også plottet inn. De viste data ble statistisk analysert, og variasjonen i data er vist av de små vertikale stolper over og under datapunktene. Disse staver tilsvarer middelverdiens standar feil (SEM).

Etter erholdelse av de ovenforbeskrevne data, ble den aktuelle nerve avkuttet kirurgisk for indusere den diabet-lignende tilstan, og fikk deretter komme seg i en uke. på dette tidspunkt ble studiet igjen gjentatt og de erholdte data er vist som linjen indikert med henvisningstallet 12, sammen med feilstavene (SEM). Det kan klart ses fra de erholdte data at dyrenes respons var anderledes etter nerve avkutting. Stjernene (<*>) ved tidsdataene for 1, 2, 3 og 4 timene langs linje 10 indikerer ved statistisk analyse av de erholdte data ved den konvensjonelle student test, at blod-glykoseresponsen for hundene etter kirurgisk inngrep er statistisk forskjellig fra responsen for hundene før kirurgisk inngrep. Signifikant nivået er mindre enn 5% (og derfor angitt som p < 0,05). Dette betyr at det er mindre enn 5% sjanse at den observerte forskjell skulle oppstå ved en tilfeldighet.

Den tredje fase av studiet var å gjenta det standariserte foring av de diabetes-lignende hunder, men hvor hundene ble injesert subkultant med 1,0 ml HDV inneholdende serotonin. Den totale dose av serotonin i HDV var 150 mg serotonin, og ble administrert en time før foring, og umiddelbart etter at en basis-linje blodglykose-prøve var tatt. Responsen for HDV serotoninbehandlede, nerve-avkuttede hunder er vist med linje 14. Den unormale heving av blodglykose er normalisert. Ved 1, 2 og 4 timer punktene, var p < 0,06, p < 0,05 og

p < 0,05 for denne behandling, sammelignet med etter-nerve-avkutting-linjen 12.

Data fra disse undersøkelser er gjengitt som stolpediagrammet i fig. 2.

Den første stolpe viser at den gjennomsnittlige verdi for blodglykose (timene 1-4) for hundene før kirurgisk inngrep avtok ca 10% etter måltidet, sammenlignet med deres blod-glykoseverdi bestemt før spising. Den andre stolpe som viser den midlere blodglykoserespons (timene 1-4) tiltok etter et måltid, og stjernen indikerer at denne var statistisk signifikant (p < 0,01, student's t test) nerve-avkuttingen hadde forårsaket en hevning av blodglykosenlvået etter et måltid, og således induserer en diabetes-lignende tilstand. Den tredje stav viser effekten av HDV serotonin behandlingen. HDV serotonin senker signifikant hevingen av blodglykose etter et måltid.

Det er meget viktig å vit at ved studiene utført av oppfinneren er det etablert at serotonin administret ved denne dose (150 mg) ikke er effektiv, hverken ved intravenøs eller subkultan administrering med hensyn til å indusere en effekt som observeres med HDV-serotonin i disse forsøk.

Konklusjonene som kan trekkes fra disse data er:

1. Nerve-avkutting fører til en diabetis-lignende tilstand. 2. Effektene av nerve-avkutting kunne korrigeres med meget små doser av HDV inneholdene 5-HT.

I et andre forsøk ble undersøkt den hypoglysemiske (blodglykose senkende evne) effektivitet av HDV inneholdene 5-HT for fastende (ikke spisende). Stolpediagrammet i fig. 3 gjengir resultatene.

Fire hunder (nerve-avkuttet som i det første studium) ble anvendt ved dette studium i to forskjellige dager. Ved den første dag ble undersøkt effekten av saltvann og den andre dag ble effekten av HDV (med 5-HT) undersøkt med hensyn til plasma-glykosenivåene ved fasting. Forsøksprosedyren krevet at det ble erholdt en basislinje for plasma-glykose og ettefulgt av 1,0 ml subkultan injeksjon av saltlake (dag 1) eller HDV/5-HT (dag 2). En time senere ble en annen blod-prøve tatt for bestemmelse av plasma-glykose etter behandling. Glykose etterbehandling ble sammenlignet med basislinjen for plasma-glykoseverdiene. Eksperimentet med saltvannbehandling (kontroll) resulterte i forøket plasma-glykose sammenlignet med dens basislinjeverdier. Imidlertid resulterte HDV/5-HT behandlingen en signifikant (p < 0,01) nedsettelse av plasma-glykose ved fasting.

Konklusjonene basert på disse data er:

1. Kontroll saltvann-injeksjoner i fastende hunder produserer en svak (statistisk usignifikant) for-økning av plasma-glykose ved fasting. 2. HDV/5-HT injeksjoner ga en signifikant (p < 0,01, student's t test) nedsettelse av plasma-glykose ved fasting.

Den andre konklusjon, nemlig at administrasjon av HDV/5-HT og den resulterende nedsettelse i plasma-glykose ved fasting er ganske betydningsfull, særlig hvis man tar hensyn til at formålet med de viste forsøk var å etablere, med sikkerhet, at HDV avgir de farmakologiske midler til leveren. Derfor har man I oppfinnelsen først etablert serotoninets virkning mht. å programmere leveren til å oppta glykose, og deretter at administrering av serotonin i HDV med derav følgende reduksjon i glykose, hvilket etablerer uten noen som helst tvil at HDV er opptatt i leveren, og har forårsaket at denne fungerer som forventet av serotonin ved å stoppe glykose-avgivelse og påbegynne opptagelse av glykose.

Etter den initiale in vivi undersøkelse av de fire ovenfor nevnte hunder ble ytterligere forsøk utført på dyr, under anvendelse av fire forskjellige programmer. Disse fire programmer er indikert i det etterfølgende, og deretter gis en sammenfatning.

Det etterfølgende er en beskrivelse av fire supplementerende forsøk som dokumenterer anvendbarheten av HDV-systemet. I de ovenfor gitte opprinnelige forsøk er forsøksdata for hepatosyttavlevering av serotonin innbefattet. Dette system utnytter tilslutnings- bro og målkomplekset. Subkultane administrasjons ruter. Trekkene ved de opprinnelige forsøk og de fire supplementerende forsøk er summarik gjengitt i tabell 1. De viktige variable er:

1. Målmolekyl.

I det første forsøk og i de første tre supplementerende for-søk ble anvendt målmolkyl som vist ovenfor. I supplementerende forsøk nr. 4 ble anvendt biliverdin. Differansene mellom disse to materialer er meget betydningsfulle. For det første er N-(2,6 - diisopropyl fenyl karbamoyl metyl) imino dieddik syre et syntetisk materiale. Biliverdin er en naturlig forekommende metabolitt i legemet, og som anvendes for å danne galle. Da serotonin HDV virker med begge målmolekyler er det påvist at den heptobilære reseptor er en effektiv målmekanisme. Det finnes ingen kjent referanse i den medisinske litteratur hvor en naturlig forekommende metabolitt, så som biliverdin, er vist å kunne bære og deretter gjøre en farmakologisk last aktiv.

2. Forskjellige hormoner.

I det første eksperiment ble anvendt serotonin som den farmakologiske last. Leverens respons var omdannelse av hepatittglykose-avgivelse til opptagelse i sellektivt nerve-avkuttede dyr. I de supplementerende forsøk ble anvendt veksthormon og insulin, så vel som serotonin. Alle tre hormoner var effektive når de ble avlevert av HDV. Serotonin var effektiv med begge målmolekyler. Det er også viktig å anerkjenne "superpotensen" som tilveiebringes hormonene ved HDV-systemet. Kun en liten fraksjon av den vanlige dose er nødvendig for å gi en respons med HDV-systemet.

3. Forskjellige adminlstras. 1ons- ruter.

HDV-systemet muliggjør avlevering av medisiner og hormoner ved tre hovedruter for administresjon: subkultan injeksjon, intravenøs (eller artiell) infusjon og intraduodenal (oral). Med hensyn til intraduodenal administrasjon bør det forstås at det viktige trekk som skal oppnås er overføring av HDV fra tarmkanalene i gjennom tarmkanalvevet til blodet. Dette er oppnådd, hvilket er vist ved den farmakologiske respons. Den ytterligere utvikling av HDV til en oral doseform er forventet å skje ved rutine forsøk av fagmannen. Som et resultat av disse data er det eksperimentelt vist at den hepatobilære reseptor anvendt for å innsikte HDV og at molekyler, syntetiske eller naturlige metabolitter, som er tilstede i en viss form i gallen er egnete målmolekyler for foreliggende oppfinnelse. Følgelig er HDV ikke sellektiv for bæring av et hormon, men er en generisk bærer for alle medisiner og hormoner til hepatosyttene. Ytterligere er HDV et avleveringssystem som er anvendbar for adminisrering av medisiner og hormoner via fordøyelses trakten (oralt eller rektalt) og HDV kan også anvendes parenteralt (subkultant, intravenøst, Intraartielt etc).

Til nå i foreliggende beskrivelse har tilknyttermolekylet eller broen ikke blitt variert. De kritiske variable er:

1) bred spsifisitet for målmolekylene,

2) HDVs evne til å kunne administreres både oralt og parenteralt,

3) HDVs evne til å bære forskjellige typer hormoner, og

4) superpotensiering av medisinene eller hormonene.

Nå da disse kritiske punkter er vist ekperimentelt, kan til-knytteren og broen varieres. Imidlertid vil det være åpenbart for en hver med selv den mest elementære bakgrunn at målmolekylene må være knyttet til overflaten av vesikkelen. Straks de kjemiske naturer for vesikkelmembranen og målmolekylet er kjent er det mulig å konstruere et antall fungerende tilknyttere og broer. Hovedkravet for tllknyt-terene er at de er lipofile og innførbare i membranen, samt og ha en kompatibel reaktiv gruppe eksempelvis så som

som kan kobles enten direkte til målmolekylet eller Inderekte til målmolekylet via et bromolekyl. Eksempler på broer er gitt ovenfor.

SUPPLEMENTERENDE FORSØK 1.

HDV insulin ( HDVI) : intravenøst.

Hensikten med dette forsøk var å vise effektiviteten av HDV insulin, konstruert med de ovenfor gitte materialer i en insulinmanglende (diabetisk) hund. Responsen for HDV insulin som skulle bestemmes var omdannelse av leverglykose avgivelse til opptagelse ved å måle glykose (Beckman Glucose Analyzer) nivåene av simultant erholdt port- og lever-veneblod. Diabetes var indusert med fremgangsmåten ifølge Black, (AM. J. Pathol. Vol 98, No. 2, sidene 295-305, 1980) og prøvetagningen ble utført via portal- og levervene-kateteret spisst plassert under generell nakose. Hunden hadde fastet og hadde ikke inntatt mat iløpet av 24 timer og eksternt administrert Insulin ble stoppet i 48 timer.

Tilstanden av hepatittisk glykose-avgivelse skjer når leverveneglykose-nivå (i mg$) overstiger portveneglykose-nivå. Det motsatte er leverglykoseopptak.

Data for forsøket finnes i den grafiske fremstilling i

fig. 4. Ved "0" minutter er hunden i glykoseavgivelse og denne avgivelse bibeholdes gjennom "23" og "35" minutters-prøvene, selv om glykose infuseres via en mesenterial vene i

en mengde på 0,5 g/kg kroppsvekt/time. Et inntakt (ikke-diabetisk dyr) vil umiddelbart omdanne dette til glykose-opptagelse. Hundens diabetiske tilstand bekreftes ved at det ikke går over til glykoseopptak ved disse tidspunkter. Etter "35" minuttersprøven ble HDV insulin innfusert via den venstre eksterne halsåre i en mengde på 0,03 mU/kg min. Hundens omdannelse til leverglykoseopptak er dramatisk vist ved 48, 55, 68 og 80 min. selv om HDV-infusjonen stoppet ved 60 min. Den minimale infusjonshastigheten for insulin alene er 6,25 mU/kg min. Således er den effektive dose av HDVI 1/200 av den regulære insulindose, hvilket dokumenterer at HDVI er superpotent ved intravenøs infusjon i en diabetisk hund.

SUPPLEMENTERENDE FORSØK 2.

HDV vekst- hormon ( HDV- GH) : Subkultant

Hensikten med forsøket var å vise effektiviteten av HDVGH, konstruert med de ovenfor viste materialer, ved å stimulere vekst i hypofyse-ektomiserte rotter. HDVGH ble administrert til rottene daglig ved subkultan injeksjon. Kontroll rottene trengte 10 ytg GH pr. døgn (også gitt subkultant) for å bi-beholde den normale veksthastighet på 1 g vektøkning pr. døgn. HDVGH-behandlede rotter oppnådde normale veksthastig-heter med doser av HDVGH på 0,15 - 1,5 jjg/døgn. Følgelig så krever HDVGH kun 1/7-1/50 av de regulære dose av vekst- hormonet. HDVGH var således superpotent og effektivt, gitt ved subkultan injeksjon.

SUPPLEMENTERENDE FORSØK 3.

HDV serotonin : intraduodenal ( Oral)

Hensikten med dette forsøk var å vise effektiviteten av HDV serotonin, konstruert fra de ovenfor viste materialer i en sellektivt nerve-avkuttet hund som ikke manglet insulin, men som var i en sukkersyk-1ignende tilstand. I denne modell var responsen for HDV serotonin omdannelse av leverglykose avgivelse til opptagelse. Denne omdannelse ble bestemt ved å måle glykosenivåene (Beckman Glucose Analyzer) og samtidig erholde prøver fra port- og leverårene. Prøvetagningen ble utført ved hjelp av prøvetagningskateteret skrått plassert under generell narkose.

Tilstanden for leverglykose avgivelse finner sted når nivå for glykose (mg % >) i leveråren overstiger den for portåren. Leverens opptak av glykose er den motsatte situasjon.

Data for forsøkene finnes i den grafiske fremstilling i fig. 5. Ved "0" min, under kontrollperioden, så er dyret i en tilstand av leverglykoseavgivelse. Pga. den sellektive nerve-avkutting vil dyret forbli i avgivelses tilstand (ved 20 og 55 min.) selv om glykose infuseres i en mengde på

0,5 g/kg kroppsvekt/time via en mesenterialåre.

HDV serotonin injeseres i duodenum (0,8 ml inneholdende

3 jjg serotonin/kg) ved 60 min. Ved 80 min. og 100 min. har HDV serotonin omdannet hepatittglykose avgivelse til opptagelse.

Konklusjonen er :

1) HDV serotonin kan krysse lumen i tarmen og inn i blodet å avgi HDV serotonin til hepatosyttene hvor serotonin

frigjøres, og kan utføre dens farmakologiske funksjon, og 2) HDV serotonin er superpotent.

Den ene intraduodenale injeksjon av serotonin (3 jjg/kg) ga en farmakologisk effekt som ville kreve en intraportal infusjon på 10 - 30 pg/kg kropsvekt/min. i 30 min. (totalt infusert dose av serotonin pr. kg kroppsvekt). Den intraduodenale dose var 1/300 av den nøvendige intraportale dose av det frie hormon.

SUPPLEMENTERENDE FORSØK 4.

HDV serotonin : Intravenøst

Hensikten med forsøket var å demonstrere effektiviteten av HDV serotonin, konstruert fra de ovenfor viste materialer, i en sellektivt nerve-avkuttet hund. Hunden, infusert med glykose, hadde portåreglykoseverdier (mg % mål med Beckman Glucose Analyzer) som er mindre enn leverveneglykose, hvilket indikere en netto leverglykoseavgivelse. Dette frem-går klart av de data som er vist grafisk i fig. 6. Hunden er i en tilstand av glykoseavgivelse for tidspunktene 15, 30 og 40 min. Deretter ble HDV serotonin infusert i en mengde på

0,3 jjg/kg kroppsvekt/min. sammen med glykose. Leverglykoseavgivelse ble umiddelbart omdannet til opptagelse, og ble bibeholdt selv 30 min. etter avslutning av HDV serotonin infusj onen.

Dette eksperiment viser effektiviteten av forskjellige hepatobilære målmolekyler, nemlig biliverdin hvis struktur er vesentlig forskjellig fra N-2,6 diisopropylfenylkar-bamoylimino dieddiksyre anvendt i de tidligere forsøk. Forsøket viser også den typiske HDV "superpotency". I dette forsøk ble HDV serotonin infusert med en hastighet på

0,3 jjg/kg/min. Den nødvendige infusjonshastighet av fri serotonin er 30 mg/kg/min. Potensieringen i dette tilfellet er 100 ganger.

I det etterfølgende vedlegg er vist en klasse av heptobilære billed-dannende midler som sammensatt for å vise mange mulige målsøkende midler for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Det er 86 eksempler. Disse er alle satt sammen av en konsultert bio-kjemiker som anvendte som ledende kri-terie at målet må være et annerkjent patobilært middel, og en person med vanlig kjenskap som bio-kjemiker vil være istand til å følge den gitte lære for vellykket anvendelse av disse materialer som et hepatobilært mål for et lipid vesikkel.

VEDLEGG

Substituerte iminodiacetat ( IDA) komplekser.

N-(2,6-diisopropylfenyl karbamoyl metyl) imino dieddiksyre

(DISIDA)

(Hepatolitt)

N-(2,6-dietylfenyl karbamoyl metyl) imino dieddiksyre

(DIDA)

N-(2,6-dimetylfenyl karbamoyl metyl) imino dieddiksyre

(HIDA)

N-(4-isopropylfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre (PIPIDA) N-(4-butylfenyl karbamoylmetyl) iminodieddiksyre (BIDA)

N-(2,3-dimetylfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

N-(3-butylfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

(metabutyl)

N-(2-butylfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

(ortobutyl)

N-(4-tertiært butylfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

(paratertiært butyl)

N-(3-butoksyfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

(meta butoksy)

N-(2-heksyloksyfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

(orto heksyloksy)

N-(4-heksyloksyfenyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

(para heksyloksy)

Azo substituert iminodieddiksyre

iminodikarboksymetyl-2-naftyl keton

fthalein komplekson

N-(5, pregnen-3-yS-ol-2-oyl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre 3oc: 7<x: 12<X: trihydroksy-24-norcol anyl-23-iminodieddiksyre N-(3-bromo-2, 4, 6-trimetylfenylkarbamoyl metyl) iminodieddiksyre

Benzimidazol metyl iminodieddiksyre N-(3-cyano-4, 5-dimetyl-2-pyrryl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

N-(3-cyano-4-metyl-5-benzyl-2-pyrryl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre

Andre derivater av N-(3-cyano-4-metyl-2-pyrryl karbamoyl metyl) iminodieddiksyre etylendiamin - N,N - bis ( -2-hydroksy-5-bromofenyl acetat

N'acyl og N'sulfonyl etylen diamin - N,N dieddiksyre N1 substituert derivater av etylen diamin - N,N-dieddiksyre (EDDA)

N' - (p-t-butylbenzoyl) EDDA N' - (benzensulfonyl) EDDA N<1>- (p-klorbenzensulfonyl) EDDA

N<1>- (p-etylbenzensulfonyl) EDDA

Hepatobilære farvestoffer

rose benegal

kongo rødt

bromosulfthaiein bromofenol blått fenolfthalein

toluidin blått indocyanin grønt Hepatobilære kontrastmidler iodiparaid

ioglycaminsyre - (Biligram)

Gallesalter

bilirubin

kolyglycyliodohistamin tyroksinglukuronid Hepatobilære tiol komplekser penicillamin

-merkaptoisosmørsyre dihydrotioktinsyre 6-merkaptopurin ketoksal-bis (tiosemikarbazone)

Hepatobilære amin komplekser

1 - hydrazinofthalazin (hydralazin) sulfonyl urea

Hepatobilære amino syre Schiff base komplekser pyridoksyliden-glutamat

pyridoksyliden-isoleucin

pyridoksyliden-fenylalanin

pyridoksyliden-tryptofan

pyridoksyliden-5-metyl tryptofan

ytterligere pyridoksyliden-aminater 3-hydroksy-4-formyl-pyriden-glutaminsyre

Forskjellige hepatobilære komplekser tetracyklin

7-karboksy-8-hydroksyquinolin

fenolfthalekson

eosin

verograffin

Egnede sukkerderivater som kan anvendes for spesiell hepatosytt målsøking. Galaktose (1-6) Galaktose (1-1') diglyserid (DGDG)

Galaktose B (1-4) Glykose (1-1') diglyserid

(Laktose)

Galaktose B (1-4) Glykose (1-1') keramid (Laktose) f.eks., cytolipin H

Claims (4)

1. Blanding for intern administrasjon ved terapeutisk behandling av varmblodede dyr, karakterisert ved at den består av: en første komponent som er en medisinsk eller et diagnostisk middel, idet denne første komponent er innkapslet i eller assosiert med, en andre komponent som omfatter en lipid membranstruktur i form av vesikkeler eller liposomer, og en tredje komponent som er molekyl med en fet substituent festet til vesikkelveggen og en målsubstituent valgt fra klassen bestående av de kjemiske forbindelser som er klassifisert biologisk som galletiltrukkede forbindelser.

2. Fremgangsmåte ved fremstilling av en sammensatt dose av en leverterapeutisk forbindelse, karakterisert ved å samarbeide forbindelsen med en lipid vesikkel og tilknytte et kjemisk målmolekyl til vesikkelen, idet målmolekylet har en preferensiell affinitet for hepatobilære reseptorer.

3. Blanding for inter administrasjon ved avlevering av en effektiv dose av en forbindelse til leveren i et varmblodet dyr, karakterisert ved : en lipid vesikkel definert av en bipolar vegg og inneholdende en farmakologisk last påtenkt for intern utnyttelse av leveren, samt en forbindelse bestående av en lipofil substituent fastholdt i veggen av vesikkelen og forenet med et forbindelsesmolekyl til en målsubstituent valgt fra klassen bestående av de forbindelser som er klassifisert som galletiltrukkede, hvilen målsubstituent er orientert i et tredimensjonalt rom og utstrekker seg bort fra vesikkelveggen .

4. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den tredje komponent, målsubstituenten er et substituert iminodiacetat kompleks.