NO781267L

NO781267L - ALFA AMYLASE INHIBITOR FROM A STREPTOMYCET AND PROCEDURE FOR THEIR RECOVERY

Info

Publication number: NO781267L
Application number: NO781267A
Authority: NO
Inventors: Volker Oeding; Werner Pfaff; Laszlo Vertesy; Hans-Ludwig Weidemueller
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1978-04-11
Filing date: 1978-04-11
Publication date: 1979-10-12

Description

a-amylase-inhibitor fra et streptomycet og fremgangsmåte til dets utvinning. α-amylase inhibitor from a streptomycete and method for its recovery.

Oppfinnelsen vedrører en ny inhibitor av glycosidhydrolaser i fordøyelseskanalen, spesielt a-amylase fra pankreas. Oppfinnelsen vedrører videre fremstillingen av en slik inhibitor ved fermentering av den spesifikke mikroorganismes streptomyces tendae, stamme 4158, samt dets varianter og metan-ter., den nevnte mikrobestamme som sådan og også fremgangsmåte til utvinning av inhibitoren fra fermentasjonsblandingen og til dens rensning. The invention relates to a new inhibitor of glycoside hydrolases in the digestive tract, especially α-amylase from the pancreas. The invention further relates to the production of such an inhibitor by fermentation of the specific microorganism streptomyces tendae, strain 4158, as well as its variants and methanes., the said microbe strain as such and also a method for extracting the inhibitor from the fermentation mixture and for its purification.

Inhibitorer av glycosidhydrolaser av.mikroorganismer, spesielt av aktinomyceter er kjent. De hittil nærmere under-søkte stoffer .tilhører kjemisk i klassen av oligo- eller poly-sakkarider. Tilsvarende inhibitorer med sannsynlig peptidkarak-ter er å beskrive som varmelabil, mer eller mindre lett ved hjelp av trypsin inaktiverbar og fremfor alt sammenligningsmes-sig mindre aktiv. Inhibitors of glycoside hydrolases of microorganisms, especially of actinomycetes are known. The substances examined in more detail so far belong chemically to the class of oligo- or polysaccharides. Corresponding inhibitors with probable peptide character can be described as heat-labile, more or less easily inactivated by trypsin and, above all, comparatively less active.

Det ble nu i fermentasjonsblandinger av streptomyces tendae, stamme 4158, funnet et høyaktivt hemstoff av a-amylase fra pankreas som lar seg innordne kjemisk til peptidene. A highly active inhibitor of α-amylase from the pancreas was now found in fermentation mixtures of streptomyces tendae, strain 4158, which can be incorporated chemically into the peptides.

Inhibitoren erkarakterisert veden molekylvekt fra 5000 - 10000, et absorbsjonsmaksimum i ultrafiolett lys ved 276 nm, et isoelektrisk punkt på 4,4 og. en aminosyresammensetning som nærmere angitt nedenfor. The inhibitor is characterized by molecular weight from 5000 - 10000, an absorption maximum in ultraviolet light at 276 nm, an isoelectric point of 4.4 and. an amino acid composition as detailed below.

Inhibitoren ifølge oppfinnelsen har en relativt høy molekylvekt. Den diffunderer ikke eller i beste fall til en meget liten del gjennom handelsvanlige dialyseringsmembraner som "Visking"-slanger. Selvsagt er bestemmelsen av den nøyaktige molekylvekt vanskelig, og man kommer med forskjellige bestemmel-sesmetoder til forskjellige resultater. Benytter man til mole-kylvektbestemmelsen den analytiske ultrasentrifuge (Biochemisches Taschenbuch, 2. del, side 746 - 767), så får man verdier på om trent 10000. Anvendes derimot molekylarsikter som "Sephadex" G-50 superfin, så fastslår man en molekylvekt på 5000 eller sågar lavere. Det er følgelig på grunn av de hittil foreliggende undersøkelsesresultater å anta en molekylvekt mellom 5000 og 10000. The inhibitor according to the invention has a relatively high molecular weight. It does not diffuse, or at best to a very small extent, through commercial dialysis membranes such as "Visking" tubing. Of course, the determination of the exact molecular weight is difficult, and different determination methods lead to different results. If you use the analytical ultracentrifuge for the molecular weight determination (Biochemisches Taschenbuch, 2nd part, pages 746 - 767), you get values of about 10,000. If, on the other hand, molecular sieves such as "Sephadex" G-50 superfine are used, then you determine a molecular weight of 5000 or even lower. It is consequently due to the research results available so far to assume a molecular weight between 5,000 and 10,000.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen er et farveløst stoff. Det absorberer imidlertid ultrafiolett lys med et ved 276 nm liggende maksimum, som ved 281'nm har en skulder. The compound according to the invention is a colorless substance. However, it absorbs ultraviolet light with a maximum at 276 nm, which has a shoulder at 281'nm.

El cm = —" Fi9' 1 gjengir et absorbsjonsspektrum. El cm = —" Fi9' 1 reproduces an absorption spectrum.

Inhibitoren er ifølge sin kjemiske struktur et<!>pepid.-Det kan spaltes ved hydrolyse i aminosyre. Det er hittil ikke lykkes ved siden av aminosyrene å påvise andre bestanddeler. Bestemmer man aminosyresammensetningen med den metode som er angitt av St. Moore og W. H. Stein (Methods in Enzymology, bind VI, side 819 - 831, utgitt, av Colovick og Kaplan i Academic Press, New York, London, 1963), så kan man fastslå følgende sammensetning: According to its chemical structure, the inhibitor is a peptide.-It can be split by hydrolysis into amino acids. It has so far not been successful in detecting other components besides the amino acids. If the amino acid composition is determined by the method indicated by St. Moore and W. H. Stein (Methods in Enzymology, volume VI, pages 819 - 831, published, by Colovick and Kaplan in Academic Press, New York, London, 1963), then one can determine the following composition:

Verdien av tryptofan ble vurdert av absorbsjonen av ultrafiolett lys. Det er selvsagt at resultatene av aminosyre-undersøkelsen ikke alltid tyder på et eneste heltallet mengdeforhold og at slike målinger generelt er beheftet med visse feil. Følgelig beror de i oppramsningen gjengitte variasjons- grenser ikke på en uenhetlighet av inhibitoren, men på den uunn-gålige målunøyaktighet av analysefremgangsmåten. Karakteristisk for inhibitoren ifølge oppfinnelsen er imidlertid at aminosyrene asparaginsyre, glutaminsyre, treonin, glycin, alanin og valin inntar en overgjennomsnittlig høy molekylar del av peptidet og at methionin i det rene stoff synes helt å mangle. Da methionin er en vidt utbredt aminosyre, er dens sterke fravær et godt karakteristisk trekk for inhibitoren ifølge oppfinnelsen og kan spesielt også ved anrikningsfremgangsmåter tjene til renhetsfastslå-ing av produktet. The value of tryptophan was assessed by the absorption of ultraviolet light. It goes without saying that the results of the amino acid test do not always indicate a single integer ratio and that such measurements are generally subject to certain errors. Consequently, the limits of variation given in the summary are not due to a non-uniformity of the inhibitor, but to the inevitable measurement inaccuracy of the analysis procedure. Characteristic of the inhibitor according to the invention, however, is that the amino acids aspartic acid, glutamic acid, threonine, glycine, alanine and valine occupy an above-average high molecular portion of the peptide and that methionine in the pure substance seems to be completely missing. As methionine is a widely distributed amino acid, its strong absence is a good characteristic feature of the inhibitor according to the invention and can, especially in enrichment procedures, serve to determine the purity of the product.

Inhibitoren ifølge oppfinnelsen reagerer positivt.på peptidreagenser,men negativt på fenolsvovelsyre. The inhibitor according to the invention reacts positively to peptide reagents, but negatively to phenolsulphuric acid.

a-amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen inneholder ingen sukkerdel. Derved, samt ved dens aminosyresammensetning, dens molekylvekt og dens isoelektriske punkt, adskiller den seg fra alle kjente a-amylase-inhibitorer. Rene preparater av inhibitoren har en aktivitet på 2 - 3 x 10- AIE/g. The α-amylase inhibitor according to the invention contains no sugar part. Thereby, as well as by its amino acid composition, its molecular weight and its isoelectric point, it differs from all known α-amylase inhibitors. Pure preparations of the inhibitor have an activity of 2 - 3 x 10- AIE/g.

For et stoff av peptidnatur har amylaseinhibitoren ifølge oppfinnelsen en bemerkelsesverdig termisk stabilitet. For a substance of a peptide nature, the amylase inhibitor according to the invention has a remarkable thermal stability.

Selv kokning i et nøytralt eller svakt surt medium (pH ca. 4 - 8) i løpet av ett minutt er uten nevneverdig innvirkning på dens glycosihydrolase-hemmende egenskaper. Even boiling in a neutral or slightly acidic medium (pH approx. 4 - 8) for one minute has no significant effect on its glycosihydrolase inhibitory properties.

Inhibitoren inaktiveres ved hjelp av pepsin, trypsin eller chymotrypsin sammenlignet med andre proteiner bare meget langsomt proteolytisk. Under det terapeutiske virkningstidsrom er det derfor ikke å regne med en nevneverdig aktivitetsnedsett-else i fordøyelseskanalen. The inhibitor is inactivated by pepsin, trypsin or chymotrypsin compared to other proteins only very slowly proteolytically. During the therapeutic period of action, there is therefore no significant decrease in activity in the digestive tract.

Inhibitoren har en høy virkningsspesifitet.. a-amylasen fra pankreas hemmes overordentlig sterkt, mens derimot bakteri-elle a-amylaser, f.eks. slike fra bacillus subtilis, ikke inhi-beres målbart. Videre er det ikke iakttatt noen virkning overfor 3-amylaser. The inhibitor has a high specificity of action.. the α-amylase from the pancreas is extremely strongly inhibited, while, on the other hand, bacterial α-amylases, e.g. those from bacillus subtilis, are not measurably inhibited. Furthermore, no effect has been observed against 3-amylases.

Allerede mindre doseringer av amylaseinhibitoren iføl-ge oppfinnelsen fører til en fullstendig hemning av den enzymatiske aktivitet av pankreasamylase. Dette funn kan ikke forkla-res med de klassiske hemmemekanismer, hvor hemmingen av den enzymatiske katalyse avhenger av relative mengdeforhold mellom inhibitor og substrat (stivelse). Det må heller antas en irre-versibel inaktivering av pankreasamylasen ved inhibitoren ifølge oppfinnelsen. Even smaller dosages of the amylase inhibitor according to the invention lead to a complete inhibition of the enzymatic activity of pancreatic amylase. This finding cannot be explained by the classic inhibitory mechanisms, where the inhibition of the enzymatic catalysis depends on the relative quantity ratio between inhibitor and substrate (starch). An irreversible inactivation of the pancreatic amylase by the inhibitor according to the invention must rather be assumed.

For fremstilling av amylaseinhibitoren betjener man seg ifølge oppfinnelsen av stammens streptomyces tendae 4158. Denne stamme adskiller seg fra originalstammen streptomyces tendae (Ettlinger et al., Arch.Mikrobiol. 31, 351 (1959)) med hensyn til dens spore-morfologi. Sporene er kuleformet og har en diameter på 1 y . Stammens egenskaper er som følger: Substratmycelets farve: gulbrun, ingen farveendring For the production of the amylase inhibitor, according to the invention, the strain streptomyces tendae 4158 is used. This strain differs from the original strain streptomyces tendae (Ettlinger et al., Arch. Mikrobiol. 31, 351 (1959)) with regard to its spore morphology. The tracks are spherical and have a diameter of 1 y. The strain's characteristics are as follows: Color of the substrate mycelium: yellowish brown, no color change

ved pH-forskyvningby pH shift

Det sporedannede luftmycels gråbrun (light grayish farve: redish brown ifølge ISCC The spore-forming aerial mycelium is grey-brown (light greyish colour: reddish brown according to ISCC

methods of designating methods of designating

colors)colors)

Sporekjedenes morfologi: retinaculum apertum (RA) Sporemorfologi: kuleformede spor med en gjennomsnittlig diameter på 1 y. Glatte til lett vorte-lignende overflater Melanindannelse på peptonmedium: positiv Morphology of the spore chains: retinaculum apertum (RA) Spore morphology: globular spores with an average diameter of 1 y. Smooth to slightly wart-like surfaces Melanin formation on peptone medium: positive

Nitratreduksjon: positiv Nitrate reduction: positive

Substratvurderingsspektrum: glucose ++ Substrate assessment spectrum: glucose ++

arabinose +arabinose +

sakkarose +sucrose +

xylose +xylose +

inositol ++inositol ++

mannitol ++mannitol ++

fruktose +fructose +

rhamnose ++rhamnose ++

raffinoseraffinose

cellulosecellulose

Stammens streptomyces tendae 4158 er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) under registreringsnr. 31210. The strain streptomyces tendae 4158 has been deposited at the American Type Culture Collection (ATCC) under registration no. 31210.

Fermenteringen kan gjennomføres ved 25 - 35°C, fortrinnsvis ved 28 - 30°C, enten submerst i ristekultur eller i forskjellig grove fermentasjonskar under omrøring og lufting. The fermentation can be carried out at 25 - 35°C, preferably at 28 - 30°C, either submerged in shaking culture or in various coarse fermentation vessels with stirring and aeration.

Som kulturmedium har det vist seg spesielt egnet en kombinasjon av karbon- og nitrogenkilder. Et slikt kulturmedium inneholder f. eks. ved siden av de ved kultur av mikroorganismer vanligvis anvendte uorganiske salter minst en karbonkilde, som stivelse, glucose, rørsukker, frukto.se, laktose, glycerol eller melasse samt minst en nitrogenkilde, som soyamel, kornsvellevann, gjærekstrakt, bomullsfrømel, jordnøttmel, peptoner, melke-pulver, nitrater eller ammoniumsalter. As a culture medium, a combination of carbon and nitrogen sources has proven particularly suitable. Such a culture medium contains e.g. in addition to the inorganic salts usually used in the culture of microorganisms, at least one carbon source, such as starch, glucose, cane sugar, fructo.se, lactose, glycerol or molasses and at least one nitrogen source, such as soy flour, corn-swelling water, yeast extract, cottonseed meal, peanut meal, peptones, powdered milk, nitrates or ammonium salts.

Som optimal sammensetning har det vist seg (vektpro-sent i oppløsning) 3 - 5 % oppløselig stivelse, 0,2 - 0,6 kornsvellevann, 0,5 - 1>5 % glucose, 0,5 - 1 % (NH4)2HP04, 0,3 - The optimal composition has been found to be (percent by weight in solution) 3 - 5% soluble starch, 0.2 - 0.6 grain swelling water, 0.5 - 1>5% glucose, 0.5 - 1% (NH4)2HP04 , 0.3 -

0,6 % soyamel, 0,5 - 1,5 % kaseinpepton. Også ved andre stivelsesholdige næringsmedier, f. eks. et slikt av 2 - 6 % jordnøtt-mel, 1-3 % potetstivelse, 3 - 5 % havremel, 3 - 5 % mysepulver, 1 - 2 % mysesirup, 1 - 2 % melkesukker, fås amylaseinhibitoren 0.6% soy flour, 0.5 - 1.5% casein peptone. Also with other starchy nutrient media, e.g. such a mixture of 2 - 6% peanut flour, 1-3% potato starch, 3 - 5% oat flour, 3 - 5% whey powder, 1 - 2% whey syrup, 1 - 2% milk sugar, the amylase inhibitor is obtained

i gode utbytter, idet valg av nitrogenkilde og pufferdel, hvis man er i det fysiologiske område, ikke er så avgjørende. Ned-settes imidlertid innholdets stivelse eller utglattes fullstendig, så går inhibitorutbyttet drastisk tilbake. Øker man på den annen side stivelseskonsentrasjonen vesentlig over 7 %, så blir på grunn av den høye viskositet mikroorganismenes oksygen-forfølgning suboptimal. Forbundet dermed synker inhibitorutbyttet. in good yields, as the choice of nitrogen source and buffer part, if one is in the physiological range, is not so decisive. However, if the starch in the content is reduced or smoothed out completely, the inhibitor yield drops drastically. If, on the other hand, the starch concentration is significantly increased above 7%, then due to the high viscosity, the microorganisms' pursuit of oxygen becomes suboptimal. In connection with this, the inhibitor yield decreases.

I fermenteringsblandinger arter dannelsen av inhibitoren vanligvis mellom 10. og 30. time av fermenteringen. I løpet av de neste 20 timer avsluttes den mest mulig. Lengre fermentasjonstider har ingen uheldig innvirkning på inhibitorutbyttet. Imidlertid øker dette heller ikke nevneverdig. Herav fremgår at fermenteringsblandingen er å holde i drift ca. 30 - 7 0 timer. In fermentation mixtures, the formation of the inhibitor usually occurs between the 10th and 30th hour of fermentation. During the next 20 hours, it will be terminated as much as possible. Longer fermentation times have no adverse effect on the inhibitor yield. However, this does not increase significantly either. From this it appears that the fermentation mixture is to be kept in operation for approx. 30 - 70 hours.

Til isolering av inhibitoren fjernes fra fermenter-ingsoppløsningen cellemassen ved sentrifugering, filtrering eller frasugning, da den største del av det virksomme stoff vanligvis befinner seg i den klare kulturvæske. To isolate the inhibitor, the cell mass is removed from the fermentation solution by centrifugation, filtration or suction, as the largest part of the active substance is usually found in the clear culture liquid.

Hvis på grunn av spesielle fermenteringsbetingelser en del av inhibitoren forblir i cellematerialet, så byr det ikke på noen vanskeligheter å ekstrahere det virksomme stoff herav ved egnede metoder, f. eks. ved utrøring med et vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, som metanol, idet det er en fordel med en ekstra maserering av cellematerialet. Det i ekstraher-ingsmidlet oppløste virksomme stoff kan ved hjelp av sentrifugering eller filtrering befris fra uoppløste cellebestanddeler og viderebearbeides som den klare kulturvæske. If, due to special fermentation conditions, part of the inhibitor remains in the cell material, then there are no difficulties in extracting the active substance from this by suitable methods, e.g. by stirring with a water-miscible organic solvent, such as methanol, as there is an advantage to an additional maceration of the cell material. The active substance dissolved in the extractant can be freed from undissolved cell constituents by centrifugation or filtration and further processed as the clear culture liquid.

Av kulturvæsken lar inhibitoren seg isolere ved i og for seg kjente fremgangsmåter fra protein- og peptidkjemien. Således egner det seg utfellingen med vannblandbare organiske oppløsningsmidler, som aceton, isopropanol eller andre.lavere alkoholer eller også med salter, som ammoniumsulfat. The inhibitor can be isolated from the culture liquid by methods known per se from protein and peptide chemistry. Thus, it is suitable for precipitation with water-miscible organic solvents, such as acetone, isopropanol or other lower alcohols or also with salts, such as ammonium sulphate.

Det er videre mulig å adsorbere inhibitoren på tilsvarende bærere, f. eks. på aktivkull, og å adskille disse ved filtrering eller sentrifugering fra den vandige oppløsning. It is also possible to adsorb the inhibitor on corresponding carriers, e.g. on activated carbon, and to separate these by filtration or centrifugation from the aqueous solution.

Det kan foregå i et vidt pH-område mellom 2 - 10, fortrinnsvis benytter mån imidlertid et område mellom pH 4 - 6. Ioneutvekslere kan likeledes anvendes til utskillelse av a-amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen. Da stoffet ifølge oppfinnelsen har såvel sure som også basiske egenskaper, altså er amfotært, kan det såvel reagere med kation- som også med anionutvekslere og fjernes ved hjelp av disse fra fermenteringsoppløsningen. Herved kan det anvendes de teknikker som prinsipielt er omtalt i kapitlet om ioneutvekslere i Biochemischen Taschenbuch, utgitt av H. M. Rauen i Springer-Verlag 1964, 2. del, side 808 - 824. It can take place in a wide pH range between 2 - 10, however preferably a range between pH 4 - 6 is used. Ion exchangers can also be used to separate the α-amylase inhibitor according to the invention. As the substance according to the invention has both acidic and basic properties, i.e. is amphoteric, it can react with both cation and anion exchangers and is removed with the help of these from the fermentation solution. In this way, the techniques that are described in principle in the chapter on ion exchangers in Biochemischen Taschenbuch, published by H. M. Rauen in Springer-Verlag 1964, 2nd part, pages 808 - 824, can be used.

Ved opparbeidelse av fermenteringsblandinger som inneholder stoff ifølge oppfinnelsen i kulturvæsken, er det ofte hensiktsmessig å konsentrere disse. Hertil kan det anvendes de kjente fremgangsmåter for destillasjon, ultrafiltrering, forstøvnings- og frysetørking eller andre kjente metoder. Av det således dannede konsentrat lar inhibitoren seg igjen ut-skille med de ovennevnte fremgangsmåter. Fra konsentrater som de inndampede kulturfiltrater danner kan inhibitoren også anrikes ved at de vesentlige forurensninger fjernes. Således har det for adskillelse av fettlignende stoffer vist seg egnet ek-straheringer med organiske oppløsningsmidler. Ved dialyse eller eventuelt ultrafiltrering (C.J.O. Rund P. Morris "Separa-tion methods in Biochemistry", Ditman Publishing, London 1976, side 944 - 950) kan oppløsningen befris for lavere molekylære stoffer. Høymolekylære stoffer, som nukleinsyrer, polysakkari-der eller mange eggehvitestoffer kan adskilles ved hjelp av fraksjonert utfelling ved utsaltning eller ved tilsetning av et med vann blandbart oppløsningsmiddel, som aceton eller en lavere alkohol. Tilsetning av utfellingsmidlet doseres i disse til-feller således at de lett utfellbare stoffer med molekylvekter over 100000 utfelles, mens a-amylase-inhibitoren forblir i opp-løsning. De omtalte anrikningstrinn kan kombineres og varieres i ønskelig rekkefølge. På denne måte kommer man til oppløsnin-ger som er sterkt anriket på inhibitor. When working up fermentation mixtures containing substance according to the invention in the culture liquid, it is often appropriate to concentrate these. For this purpose, the known methods for distillation, ultrafiltration, atomization and freeze drying or other known methods can be used. From the concentrate thus formed, the inhibitor can again be separated by the above-mentioned methods. From concentrates that the evaporated culture filtrates form, the inhibitor can also be enriched by removing the essential contaminants. Thus, extractions with organic solvents have proven suitable for the separation of fat-like substances. By dialysis or possibly ultrafiltration (C.J.O. Rund P. Morris "Separation methods in Biochemistry", Ditman Publishing, London 1976, pages 944 - 950) the solution can be freed of lower molecular substances. High molecular weight substances, such as nucleic acids, polysaccharides or many egg whites, can be separated using fractional precipitation by salting out or by adding a water-miscible solvent, such as acetone or a lower alcohol. Addition of the precipitating agent is dosed in these cases so that the easily precipitable substances with molecular weights above 100,000 are precipitated, while the α-amylase inhibitor remains in solution. The mentioned enrichment steps can be combined and varied in the desired order. In this way, solutions are obtained that are highly enriched in inhibitor.

Sluttrensningen kan foregå med forskjellige målrette-de fremgangsmåter som gel- og ioneutvekslerkromatografi eller med beslektede fremgangsmåter hvis skilleprinsipp ikke utelukk-ende beror på ioneutveksling, som f. eks. adskillelse på hydrok-sylapatit. Videre kan det anvendes oppløsningsmiddel- eller saltutfellinger, preparativ elektroforese eller andre i og for seg kjente fremgangsmåter. Spesielt har det vist seg egnet adskillelse på dietylaminoetyl-(DEAE-)-gruppeholdige ioneutvekslere samt fraksjonerte utfellinger med ammoniumsulfat eller eta-nol, idet det sågar kan fås krystallinsk materiale. The final purification can take place with various targeted methods such as gel and ion exchange chromatography or with related methods whose separation principle is not exclusively based on ion exchange, such as e.g. separation on hydroxylapatite. Furthermore, solvent or salt precipitation, preparative electrophoresis or other per se known methods can be used. In particular, separation on diethylaminoethyl (DEAE-) group-containing ion exchangers as well as fractionated precipitations with ammonium sulphate or ethanol have proven suitable, as crystalline material can even be obtained.

Egenskapene til inhibitoren ifølge oppfinnelsen er interessante med hensyn til dens anvendelse som terapeutikum mot diabetes og prediabetes samt adipositas og understøttelse av diet. The properties of the inhibitor according to the invention are interesting with regard to its use as a therapeutic against diabetes and prediabetes as well as adiposity and diet support.

Stivelsesholdige nærings- og nytelsesmidler fører hos dyr og mennesker til en økning av blodsukkeret og derved også til en øket insulinsekresjon av pankreas. Hyperglykemi kommer istand ved oppspalting av stivelsen i fordøyelseskanalen under innvirkning av amylase og maltase til glukose. In animals and humans, starch-containing food and pleasure products lead to an increase in blood sugar and thereby also to an increased secretion of insulin by the pancreas. Hyperglycaemia is resolved by breaking down the starch in the digestive tract under the influence of amylase and maltase into glucose.

Hos diabetikere er denne hyperglykemi spesielt utpre-get og langvarig. In diabetics, this hyperglycaemia is particularly pronounced and long-lasting.

Hos adipøse virker den formerte insulinsekresjon på lipogenesen og nedsetter lipolysen. In obese people, the increased insulin secretion affects lipogenesis and reduces lipolysis.

Den alimentære hyperglykemi samt hyperinsulinemi etter stivelsesopptak lar seg nedsette ved amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen. Denne virkning er dosisavhengig. Amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen lar seg derfor anvende som terapeutikum ved diabetes, prediabetes og adipositas samt til understøttelse av diet. For dette formål lønner det seg med en administrering, spesielt til måltidene. Doseringen som skal rette seg etter pasientens vekt samt det individuelle behov ut-gjør ca. 10000 - 300000 AIE, men kan imidlertid i begrunnede enkelttilfeller også ligge høyere eller lavere. The alimentary hyperglycaemia and hyperinsulinaemia after starch intake can be reduced by the amylase inhibitor according to the invention. This effect is dose dependent. The amylase inhibitor according to the invention can therefore be used as a therapeutic for diabetes, prediabetes and obesity as well as to support diet. For this purpose, it pays off with an administration, especially at meals. The dosage, which must be based on the patient's weight and individual needs, amounts to approx. 10,000 - 300,000 AIE, but can, however, in justified individual cases also be higher or lower.

Amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. Den kan anvendes som rent stoff, men også i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelse av de vanlige hjelpe- og bærestoffer. The amylase inhibitor according to the invention is particularly suitable for oral administration. It can be used as a pure substance, but also in the form of a pharmaceutical preparation using the usual auxiliary and carrier substances.

Også en kombinert anvendelse med andre legemidler, som blodsukkersenkende .eller lipidsenkende stoffer, kan være A combined use with other drugs, such as blood sugar-lowering or lipid-lowering substances, can also be

fordelaktig. Da høyeremolekulære peptider som sådanne ikke eller ikke i vesentlig grad resorberes fra fordøyelseskanalen, er det av stoffer ifølge oppfinnelsen ikke å vente noen toksikolo-gisk betenkelige bivirkninger. På grunn av den ikke uvanlige aminosyresammensetning er også eventuelle proteolytiske spalt-produkter å se på som fysiologisk ufarlige. Følgelig kan ved beneficial. Since higher molecular weight peptides as such are not or not to a significant extent resorbed from the digestive tract, no toxicologically questionable side effects are to be expected from substances according to the invention. Due to the not unusual amino acid composition, any proteolytic cleavage products are also to be regarded as physiologically harmless. Consequently, wood can

oral inngivning også høyere doser av amylaseinhibitoren ikke ses noen påfallende symptomer på forsøksdyrene. Også ved intravenøs applikasjon på mus (1 g/kg) ble inhibitoren ifølge oppfinnelsen tålt ved 24 timers iakttagelsestid uten synlig toksisk virkning. oral administration and higher doses of the amylase inhibitor, no striking symptoms are seen in the experimental animals. Also when intravenously applied to mice (1 g/kg), the inhibitor according to the invention was tolerated during the 24-hour observation period without visible toxic effects.

For undersøkelse av den farmakologiske virkning av amylaseinhibitoren fikk fastende, han-Wistar-rotter en vekt mellom 200 og 250 g hemstoff ifølge oppfinnelsen samtidig med 2 g For investigation of the pharmacological effect of the amylase inhibitor, fasting male Wistar rats were given a weight between 200 and 250 g of the heme substance according to the invention at the same time as 2 g

stivelse pr. kg legemsvekt administrert oral etter at det umid-delbart på forhånd foregikk et bloduttak for bestemmelse av ut-gansblodsukkerverdien. Ytterligere bloduttak foregikk etter 15 og 30 minutter samt etter 1, 2, 3 og 4 timer fra halevenen. Blodsukkerbestemmelsen ble gjennomført etter metoden av Hoffman i autoanalysør (J. Biol. Chem. 120, 51 (1937)). starch per kg body weight administered orally after a blood sample had been taken immediately beforehand to determine the initial blood sugar value. Further blood sampling took place after 15 and 30 minutes as well as after 1, 2, 3 and 4 hours from the tail vein. The blood sugar determination was carried out according to the method of Hoffman in an autoanalyzer (J. Biol. Chem. 120, 51 (1937)).

NZO-mus har en forstyrret glukosetoleranse. De egner seg derfor spesielt godt for undersøkelser hvor blodglucose-speilet påvirkes. Forsøksanordningen tilsvarer den hos rotter. Bloduttak foregikk fra orbitalvene-plexus. Blodsukkerforløpet forfølges over 3 timer. NZO mice have impaired glucose tolerance. They are therefore particularly suitable for investigations where the blood glucose level is affected. The experimental device corresponds to that in rats. Blood sampling took place from the orbital vein plexus. The blood sugar course is followed over 3 hours.

På analog måte foretas virksom stoffpåvisning på NMRI-mus. Bloduttak foregikk likeledes fra orbitalvene-plexus, og blodsukkerforløpet forfølges over 3 timer. In an analogous way, active substance detection is carried out on NMRI mice. Blood sampling also took place from the orbital vein plexus, and the course of blood sugar was monitored over 3 hours.

Under disse forsøksanordninger viste de med inhibitoren ifølge oppfinnelsen behandlende dyr en i forhold til ube-handlede dyr mindre protrahert blodsukkerøkning. Under these experimental arrangements, the animals treated with the inhibitor according to the invention showed a less prolonged rise in blood sugar compared to untreated animals.

AmylaseprøveAmylase test

En amylase-inhibitorenhet (AIE) er definert som den inhibitormengde som under prøvebetingelsene formår å hemme to amylaseenheter (AE) til-50 %. En amylaseenhet er etter inter-nasjonal overenskomst den enzymmengde som i løpet av ett minutt spalter 1 p ekvivalent glucosidiske bindinger i stivelsen. De yval spaltede glucosidiske bindinger bestemmer som uval redu-sert sukker fotometrisk med dinitrosalizylsyre. Angivelsene er beregnet som pmol maltose som fastslås ved hjelp av en maltose-vurderingslinje. An amylase inhibitor unit (AIE) is defined as the amount of inhibitor which, under the test conditions, manages to inhibit two amylase units (AE) to -50%. According to international agreement, an amylase unit is the amount of enzyme that cleaves 1 p equivalent of glucosidic bonds in the starch within one minute. The yval cleaved glucosidic bonds are determined as uval reduced sugars photometrically with dinitrosalicylic acid. The indications are calculated as pmol maltose which is determined using a maltose assessment line.

Prøvene gjennomføres på følgende måte:The tests are carried out in the following way:

a-amylase fra svinepankreas og oppløsningen som skal undersøkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfatpuffer, α-amylase from porcine pancreas and the solution to be examined are pre-incubated together in 1.0 ml of 20 mM phosphate buffer,

pH 6,9 + 10 mM NaCl 10 - 20 minutter ved 37°C. Den enzymatiske reaksjon startes ved tilsetning av 1,0 ml oppløselig stivelse ifølge Zulkowski (0,25 % i den angitte puffer). Etter nøyaktig 10 minutter stoppes reaksjonen med 2,0 ml dinitrosalizylsyre-farvereagens (etter Boehringer Mannheim: Biochemica-Information pH 6.9 + 10 mM NaCl 10 - 20 minutes at 37°C. The enzymatic reaction is started by adding 1.0 ml of soluble starch according to Zulkowski (0.25% in the indicated buffer). After exactly 10 minutes, the reaction is stopped with 2.0 ml dinitrosalicylic acid staining reagent (after Boehringer Mannheim: Biochemica-Information

II) og oppvarmes for farvefremkalling 5 minutter i kokende vann-bad. Etter avkjøling måles ekstinksjonen ved 546 nm mot reagens-blindverdi. Den 50 prosentige hemming bestemmes i sammenligning til uhemmet enzymreaksjon ved anvendelse av forskjellige inhibi-tormengder grafisk ved hjelp av sannsynlighetsopptegning. II) and heated for color development for 5 minutes in a boiling water bath. After cooling, the extinction is measured at 546 nm against the reagent blank value. The 50 percent inhibition is determined in comparison to uninhibited enzyme reaction using different amounts of inhibitor graphically by means of probability plotting.

Eksempel 1Example 1

Stammen streptomyces tendae 4158 podes på skrårør med en næringsbunn av følgende sammensetning: The strain streptomyces tendae 4158 is inoculated onto inclined tubes with a nutrient base of the following composition:

50 g havrefnokker50 g oat groats

ad. 1000 ml H20 pHA7,2ad. 1000ml H20 pHA7.2

De podede rør vikker .7 dager ved 3-0°C og holdes deretter ved +4°C. Sporene oppsvemmes med 10 ml sterilisert A. dest. eller fysiologisk NaCl-oppløsning fra skrårøret. 1,0 ml av suspensjonen tjener til podning. av en 300 ml Erlenmeyer-kolbe som er beskikket med 35 ml sterilisert næringsoppløsning med en pH-verdi på 7,7 og følgende sammensetning: The inoculated tubes are left for .7 days at 3-0°C and then kept at +4°C. The spores are flooded with 10 ml sterilized A. dest. or physiological NaCl solution from the inclined tube. 1.0 ml of the suspension is used for inoculation. of a 300 ml Erlenmeyer flask coated with 35 ml of sterilized nutrient solution with a pH value of 7.7 and the following composition:

1 % glucose1% glucose

1 % soyamel1% soy flour

0,2 5 % NaCl pH 7,70.25% NaCl pH 7.7

Kolben ristes ved 220 omdreininger pr. minutt 48 timer ved +30°C på en rystemaskin med en amplitude på 4 cm. Deretter overføres hver gang 5 ml av denne forkultur i flere Erlenmeyer-kolber som er fylt med 35 ml sterilisert næringsoppløsning og har en pH-verdi på 8,3. Sammensetningen av denne hovedkultur er følgende: The flask is shaken at 220 revolutions per minute 48 hours at +30°C on a shaking machine with an amplitude of 4 cm. Then each time 5 ml of this pre-culture is transferred into several Erlenmeyer flasks which are filled with 35 ml of sterilized nutrient solution and have a pH value of 8.3. The composition of this main culture is as follows:

4 % stivelse4% starch

0,4 % kornsvellevann0.4% grain swelling water

1,0 % glucose1.0% glucose

0,8 % (NH4)2HP04 0.8% (NH 4 ) 2 HPO 4

0,4% soyamel0.4% soy flour

1,0 % pepton pHA8,3 Hovedkulturene ristes likeledes ved +30°C med 200 omdreininger pr. minutt på en rystemaskin med en amplitude på 4 cm i 2 - 3 dager. Ved første, annen og tredje kulturdag bestemmes innholdet a-amylase-inhibitor i henhold til prøvefor-skriften. 1.0% peptone pHA8.3 The main cultures are likewise shaken at +30°C with 200 revolutions per minute on a shaking machine with an amplitude of 4 cm for 2 - 3 days. On the first, second and third day of culture, the α-amylase inhibitor content is determined in accordance with the test regulations.

Stammen streptomyces tendae 4158 gir under de omtalte forsøks- og kulturbetingelser gjennomsnittlig 100 AEI/ml ved en slutt-pH på 5,2. The strain streptomyces tendae 4158 gives an average of 100 AEI/ml under the mentioned test and culture conditions at a final pH of 5.2.

Eksempel 2Example 2

Blanding som i eksempel 1 velger imidlertid som hovedkultur et fermenteringskar på 300 1 samlet volum, som er fylt med 200 1 av en sterilisert næringsoppløsning av følgende sammensetning: Mixture as in example 1, however, chooses as the main culture a fermentation vessel of 300 1 total volume, which is filled with 200 1 of a sterilized nutrient solution of the following composition:

4 % stivelse4% starch

0,4 % kornsvellevann0.4% grain swelling water

1,0 % glucose1.0% glucose

0,8 % (NH4)2HP04 0.8% (NH 4 ) 2 HPO 4

1,0 % kaseinpepton1.0% casein peptone

0,1 % desmofen pH 8,3 - 8,5 Steriliseringstiden for blandingen utgjorde 45 minutter ved 121°C og 1 bar, idet glucosen steriliseres separat og etter avkjøling av fermenterere ved driftstemperatur ble tilført sterilt. 0.1% desmofen pH 8.3 - 8.5 The sterilization time for the mixture was 45 minutes at 121°C and 1 bar, the glucose being sterilized separately and after cooling the fermenters at operating temperature was added sterilely.

pH-verdien bør etter sterilisering utgjøre 6,8 og innstilles etter behov med sterilisert syre (2 n H^PC^) eller lut (2 n NaOH) på denne verdi. Poding blir hovedtrinnet med 20 1 tilsvarende 10 % og en som under eksempel 1 omtalt og i en liten fermenterer av 30 1 totalvolum fremstilt forkultur. After sterilization, the pH value should be 6.8 and adjusted as necessary with sterilized acid (2 n H^PC^) or lye (2 n NaOH) to this value. Grafting is the main step with 20 1 corresponding to 10% and one as mentioned under example 1 and in a small fermenter of 30 1 total volume prepared pre-culture.

Det fermenteres 50 - 70 timer ved 30°C. Luftningen utgjør 6 m 3/time ved en omrøring på 250 omdreininger pr. minutt og et overtrykk på 0,3 bar. It is fermented for 50 - 70 hours at 30°C. The aeration amounts to 6 m 3/hour at a stirring of 250 revolutions per hour. minute and an overpressure of 0.3 bar.

Ved prøveuttak overvåkes og forfølges fermenterings-forløpet med hensyn til inhibitoraktivitet, substratavbygning, biomasseutvikling og kulturoppløsningens fysikalsk-tekniske forhold (overflatespenning, viskositet, tetthet, osmotisk trykk). When sampling, the fermentation process is monitored and followed with regard to inhibitor activity, substrate degradation, biomass development and the physical-technical conditions of the culture solution (surface tension, viscosity, density, osmotic pressure).

Den maksimale inhibitoraktivitet oppnås fra 60. kultur time ved gjennomsnittlig 105 AIE/ml. Deretter tilføres fermenterer innholdet til opparbeidelsen. The maximum inhibitory activity is achieved from the 60th culture hour at an average of 105 AIE/ml. The contents are then added to the fermenter for processing.

Eksempel 3Example 3

Blanding som i eksempel 1 og 2 benyttes imidlertid som hovedtrinn en bioreaktor av 4000 samlet volum som er fylt med 2500 1 av følgende næringsoppløsning: Mixing as in examples 1 and 2, however, a bioreactor of 4,000 total volume is used as the main step, which is filled with 2,500 1 of the following nutrient solution:

6 % stivelse6% starch

1,0 % glucose1.0% glucose

0,4 % kornsvellevann0.4% grain swelling water

0,8 % (NH4)2HP040.8% (NH 4 ) 2 HPO 4

1,0 % soyapepton1.0% soy peptone

0,1 % desmofen pH^7,0 - 7,3 Steriliseringstiden for denne blanding utgjør 60 minutter ved 121°C og 1 bar, idet glucosen sterilfiltreres separt og tilpumpes etter fermentererens avkjøling til driftstemperatur til denne under sterile betingelser. 0.1% desmofen pH^7.0 - 7.3 The sterilization time for this mixture is 60 minutes at 121°C and 1 bar, the glucose being sterile filtered separately and pumped in after the fermenter has cooled to operating temperature to it under sterile conditions.

pH-verdien innstilles, hvis nødvendig, med steril syre (H^PO^) eller lut (NaOH) på en begynnelsesverdi på 7,0 - 7,3. The pH value is adjusted, if necessary, with sterile acid (H^PO^) or lye (NaOH) to an initial value of 7.0 - 7.3.

Podes med 200 1 av en under eksempel 2 omtalt og fremstilt forkultur. Inoculated with 200 1 of a pre-culture described and prepared under example 2.

Fermenteringstiden utgjorde 70 timer, idet det fermenteres ved en temperatur på 3 0°C, en luftning på 6 0 Nm /time, et overtrykk på 0,5 bar og ved 18 0 omdreininger pr. minutt. The fermentation time was 70 hours, as it is fermented at a temperature of 30°C, an aeration of 60 Nm/hour, an overpressure of 0.5 bar and at 180 revolutions per hour. minute.

Ved prøveuttak, som omtalt under eksempel 2, følges alle viktige prosess-, organisme- og aktivitetsdata over den samlede fermenteringstid. Etter 7 0 timers fermentering er det oppnådd en gjennomsnittlig aktivitetskonsentrasjon på 95 AIE/ml. Fermenteringen avbrytes derpå, og kulturoppløsningen tilføres opparbeidelsen. When sampling, as discussed under example 2, all important process, organism and activity data are monitored over the total fermentation time. After 70 hours of fermentation, an average activity concentration of 95 AIE/ml has been achieved. The fermentation is then interrupted, and the culture solution is added to the preparation.

Eksempel 4Example 4

10 1 av en filtrert kulturvæske med en virksomhet på 100 AIE/ml tørkes i en forstøvningstørker og gir 400 g av et lysebrunt pulver. Dette blir deretter for avfetning grundig gjennomrørt med en blanding av 1 1 metanol og 1 1 kloroform og deretter frasilt. Det ennu oppløsningsmiddelfuktige, uoppløste produkt hvori det virksomme stoff er inneholdt, oppløses i 3 1 vann, innstilles til pH 6,5 og blandes med 4,5 1 metanol. Det oppstår herved en lys fnokket utfelling som fjernes ved sentri-fuger ing og kasseres, da det bare inneholder betydelige mengder a-amylase-hemstoff. Det mørke overstående av metanolutfellin-gen som inneholder den ønskede inhibitor, befris deretter i vakuum for metanol og den nu til 2,5 1 oppkonsentrerte oppløs-ning dialyseres saltfri mot destillert vann. Retenatet.inneholder 9 g tørrstoff (spesifikk aktivitet 96 AIE/mg). Retenatet bringes deretter ved pH 5,5 med ammoniumsulfat til 50 % metning, hvortil det ved 250 ml er nødvendig 79 g av saltet. 10 1 of a filtered culture liquid with an activity of 100 AIE/ml is dried in a spray dryer and gives 400 g of a light brown powder. This is then thoroughly stirred for degreasing with a mixture of 1 1 methanol and 1 1 chloroform and then filtered off. The still solvent-moist, undissolved product in which the active substance is contained is dissolved in 3 1 of water, adjusted to pH 6.5 and mixed with 4.5 1 of methanol. This results in a light-colored precipitate that is removed by centrifugation and discarded, as it only contains significant amounts of α-amylase inhibitor. The dark supernatant of the methanol precipitate, which contains the desired inhibitor, is then freed from methanol in a vacuum and the solution, which has now been concentrated to 2.5 1, is dialysed salt-free against distilled water. The retenate contains 9 g dry matter (specific activity 96 AIE/mg). The retenate is then brought to 50% saturation at pH 5.5 with ammonium sulphate, for which 79 g of the salt is required for 250 ml.

Ved utsaltning oppstår en utfelling som inneholder rundt 90 %During salting out, a precipitate occurs that contains around 90%

av det aktive stoff. Etter sentrifugering kasseres det overstående. Utfellingen oppløser man igjen i destillert vann, og ved pH 8 blandes igjen med ammoniumsulfat, men denne gang i første rekke bare inntil 15 % metning og etter fjerning av utfellingen videre til 35 % metning. Utfellingen av utsaltningen mellom 15 og 35 % inneholder hovedmengden av amylaseinhibitoren. Denne fraksjonerte utfelling gjentas. of the active substance. After centrifugation, discard the supernatant. The precipitate is dissolved again in distilled water, and at pH 8 is mixed again with ammonium sulphate, but this time primarily only up to 15% saturation and after removal of the precipitate further to 35% saturation. The precipitate from the salting out between 15 and 35% contains the main amount of the amylase inhibitor. This fractional precipitation is repeated.

Det dannede produkt er etter dialyse og tørkningThe product formed is after dialysis and drying

360 mg med en spesifikk aktivitet på 992 AIE/mg. 350 mg av dette, råstoff oppdeles og anrikes i "Sephadex" G-50 fine i en 100 cm lang og 1,2 1 tagende glassøyle. Som svelle- og elueringsmiddel tjener vandig 5 millimolar-fosfatpufferoppløsning av pH 8, hvortil det er blitt satt 0,02 % natriumazid. Råstoffet oppløses i 15 ml av samme puffer og påføres på søylen. Elueringen foregår i løpet av to dager, idet det avtas fraksjoner av 15 ml innhold. De fire mest aktive fraksjoner samles, dialyseres saltfrie og frysetørkes. De gir 60 mg av et hvitt pulver med en aktivitet på 2520 AIE oc-amy lase-inhibi tor /mg . 360 mg with a specific activity of 992 AIE/mg. 350 mg of this raw material is divided and enriched in "Sephadex" G-50 fine in a 100 cm long and 1.2 1 glass column. Aqueous 5 millimolar phosphate buffer solution of pH 8, to which 0.02% sodium azide has been added, serves as swelling and eluent. The raw material is dissolved in 15 ml of the same buffer and applied to the column. The elution takes place over the course of two days, as fractions of 15 ml content are taken. The four most active fractions are collected, dialyzed salt-free and freeze-dried. They provide 60 mg of a white powder with an activity of 2520 AIE oc-amylase-inhibi tor /mg.

Eksempel 5Example 5

2200 1 kulturvæske avkjøles til 6°C og filtreres etter tilsetning av 2 % kiselgur over en kammerpresse. Filterka-ken (ca. 450 kg fuktig) kasseres, og det klare filtrat (1750 1 med en aktivitet på 95 AIE/ml) inndampes etter tilsetning av 500 g natriumazid over en fallstrømfordamper til 120 1. Det andre konsentrat avkjøles til 1°C og blandes med 120 1 forav-kjølt aceton langsomt under omrøring. Til fullstendig utfelling omrøres ennu en kvart time og etter tilsetning av 1 kg kiselgur klares over en senkepresse. Det faste stoff med filt- 2200 1 culture liquid is cooled to 6°C and filtered after adding 2% diatomaceous earth over a chamber press. The filter cake (approx. 450 kg moist) is discarded, and the clear filtrate (1750 1 with an activity of 95 AIE/ml) is evaporated after adding 500 g of sodium azide over a downdraft evaporator to 120 1. The second concentrate is cooled to 1°C and mixed with 120 1 of pre-cooled acetone slowly while stirring. For complete precipitation, stir for another quarter of an hour and, after adding 1 kg of diatomaceous earth, clear over a press. The solid substance with felt-

reringshjelpemidlet kasseres. Det acetoniske filtrat, som inneholder det virksomme stoff, blandes under omrøring og avkjøling med 380 1 aceton, hvorved det oppstår en omtrent 80 prosentig acetonisk suspensjon. Den dannede (2.) utfelling inneholder den ønskede amylaseinhibitor.. Den dannes ved at man lar utfellings-væsken stå uten omrøring. Herved synker bunnfallet, og det the cleaning aid is discarded. The acetonic filtrate, which contains the active substance, is mixed with stirring and cooling with 380 l of acetone, whereby an approximately 80 percent acetonic suspension is produced. The formed (2nd) precipitate contains the desired amylase inhibitor. It is formed by leaving the precipitation liquid to stand without stirring. In this way, the sediment falls, and that

overstående kan fjernes med hevert. Av det overstående av denne annen acetonutfelling kan det adskillés mindre mengder utfelling ved sentrifugering. Dette faste stoff oppløses ved pH 7 og til-settes til oppløsningen, og utfellingen (se nedenfor). Den i utfellingskaret gjenblivehde hovedutfelling oppløses i 120 1 vann ved pH 7, og den dannede oppløsning klares med en gjennom-løpssentrifuge ("Cepa",;1200Jomdreininger pr. minutt). Herved fjernes 90 g inaktive svevepartikler. Den klare vannfase konsentreres og dialyseres nu med et DDS-ultrafiltreringsanlegg (membran nr. 800) i 15 1. For å fullstendiggjøre avsaltningen, fortynnes retenatet med destillert vann og konsentreres igjen. Etter to til tre gangers gjentagelse er retenatet, hvori amylase-inhibitoren er inneholdt, praktisk talt saltfritt. Fra 50 1 opp-løsning av retenatet utfelles deretter hemmestoffet ved pH 5,5 ved tilsetning av 19,5 kg ammoniumsulfat, frasentrifugeres og det overstående kasseres. Utfellingen oppløses igjen i 40 1 vann og utfelles denne gang ved pH 7,5 med 12,5 kg ammoniumsulfat. Etter adskillelse av klarfasen i en rørsentrifuge utfelles utfellingen fraksjonert som i eksempel 4: Fra 40 1 av det igjen oppløste stoff helles pH 5,5 ved tilsetning av 3,2 kg ammoniumsulfat i første rekke en inaktiv utfelling som adskillés og kasseres. Deretter utskilles ved ytterligere oppkonsen-trering av den flytende fase med 7,4 kg ammoniumsulfat hoved-, delen av aktiviteten fra væsken. Denne utfelling samles, dialyseres mot destillert vann og frysetørkes. Det fremkommer 114 g av et brunt pulver med en aktivitet på 1100 AIE/mg. excess can be removed with a sieve. From the remainder of this other acetone precipitation, smaller amounts of precipitation can be separated by centrifugation. This solid is dissolved at pH 7 and added to the solution and the precipitate (see below). The main precipitate remaining in the precipitation vessel is dissolved in 120 1 of water at pH 7, and the resulting solution is clarified with a through-flow centrifuge ("Cepa", 1200 revolutions per minute). This removes 90 g of inactive suspended particles. The clear water phase is now concentrated and dialyzed with a DDS ultrafiltration system (membrane no. 800) in 15 1. To complete the desalting, the retentate is diluted with distilled water and concentrated again. After two to three repetitions, the retentate, in which the amylase inhibitor is contained, is practically salt-free. From a 50 1 solution of the retentate, the inhibitor is then precipitated at pH 5.5 by adding 19.5 kg of ammonium sulphate, centrifuged off and the excess discarded. The precipitate is dissolved again in 40 1 of water and this time precipitated at pH 7.5 with 12.5 kg of ammonium sulphate. After separation of the clear phase in a tube centrifuge, the precipitate is precipitated fractionally as in example 4: From 40 1 of the re-dissolved substance, pH 5.5 is poured by adding 3.2 kg of ammonium sulphate, firstly an inactive precipitate which is separated and discarded. Then, by further concentrating the liquid phase with 7.4 kg of ammonium sulphate, the main part of the activity is separated from the liquid. This precipitate is collected, dialyzed against distilled water and freeze-dried. 114 g of a brown powder with an activity of 1100 AIE/mg is obtained.

Til videre oppdeling fylles en glassøyle av 5 cm diameter og 50 cm høyde (omtrent 1 1 innhold) med DEAE-"Sephadex" A-25, som på forhånd blir ekvilibrert med -jq molar fosfor-puffer med pH 7,5 og 0,02 prosentig natriumazid. Nu oppløses 10 g stoff i 100 ml av samme puffer og påføres på søylen. Deretter vasker man søylen med 1 1 av samme puffer og så til-blandes til dette elueringsmiddel etterhvert kokesalt således at det sikres kontinuerlig gradient. Oppfanges søyleutstrømningen fraksjonert, så befinner amylaseinhibitoren seg i de fraksjoner hvori NaCl-konsentrasjonen .er ca. 0,5 molar. For further separation, a glass column of 5 cm diameter and 50 cm height (about 1 1 contents) is filled with DEAE-"Sephadex" A-25, which is previously equilibrated with -jq molar phosphorus buffer with pH 7.5 and 0, 02 percent sodium azide. Now dissolve 10 g of substance in 100 ml of the same buffer and apply to the column. The column is then washed with 1 1 of the same buffer and then sodium chloride is gradually added to this eluent so that a continuous gradient is ensured. If the column outflow is collected fractionally, then the amylase inhibitor is found in the fractions in which the NaCl concentration is approx. 0.5 molar.

Disse fraksjoner samles og dialyseres mot destillert vann. Frysetørkning gir 5,6 g lysebrunt stoff med en virkning på 2200 AIE/mg. These fractions are collected and dialyzed against distilled water. Freeze-drying gives 5.6 g of light brown substance with an effect of 2200 AIE/mg.

Hertil tilsluttes dessuten en gelkromatografisk rensning, som omtalt i eksempel 4. Av det 5,6 g materiale frem-kom 4,1 g av et farveløst pulver hvis aktivitet utgjorde 28 00 AIE/mg. Aminosyreanalysen av produktet gir etter en 20 timers saltsyrehydrolyse ved hjelp av en Beckman-multikromanalysator følgende sammensetning: A gel chromatographic purification, as described in example 4, is also added to this. From the 5.6 g of material, 4.1 g of a colorless powder whose activity amounted to 28 00 AIE/mg was obtained. The amino acid analysis of the product after a 20-hour hydrochloric acid hydrolysis using a Beckman multichrome analyzer gives the following composition:

Claims

1. Peptidic glycoside hydrolase inhibitor, characterized by a molecular weight of 5000 - 10000, an absorption maximum in UV light at 276 nm, an isoelectric point of 4.4 and the following amino acid composition:

2. Method for the preparation of a peptidic. Glucoside hydrolase inhibitor according to claim 1, characterized in that streptomyces tendea 4158 (ATCC no. 31210) is cultivated and the inhibitor is recovered from the culture.

3. Method according to claim 1, characterized in that streptomyces tendea 4158 is cultivated in a culture medium which contains at least one carbon source, at least one nitrogen source and organic salts.

4. Method according to claim 3, characterized in that the nutrient medium contains 3 - 5% soluble starch, 0.2 - 0.6% corn steep (corn swelling water), 0.5 - 1.5% glucose, 0.5 - 1% Na2HPC> 4, 0.3 - 0.6% soy flour and 0.5 - 1.5% casein peptone.

5. Method according to claim 3, characterized in that the nutrient medium contains 2 - 6% peanut flour,

1 - 3% potato starch, 3 - 5% oat flour, 3 - 5% whey powder,

1 - 2% whey syrup and 1 - 2% milk sugar.

6. Streptomyces tendea 4158 (ATCC no.-31210).

7. Use of the inhibitor according to claim 1 as a means of regulating the blood sugar level.

8. Means for regulating the blood sugar level, characterized by a content of a peptidic glycoside hydrolase inhibitor according to claim 1.