NO341982B1

NO341982B1 - Polymyxin derivater og anvendelser derav

Info

Publication number: NO341982B1
Application number: NO20090674A
Authority: NO
Inventors: Martti Vaara; Timo Vaara
Original assignee: Northern Antibiotics Ltd
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2018-03-05
Also published as: JP2010500331A; EP3078672A1; PL2057185T3; ES2575521T3; RU2009107857A; DK2057185T3; NZ575421A; IL196693B; EP2057185A1; RU2455311C2; WO2008017734A1; SI2057185T1; CN103059106A; NO20090674L; HRP20160552T1; EP2057185A4; CN101501063A; KR20150008198A; CN103059106B; BRPI0715095B8

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder et polymyksinderivat i hvilket R1, R2 og R3 er valgfrie og R1, R2, R3, R5, R8 og R9 er kationiske eller nøytrale aminosyrerester som er utvalgt slik at det totale antall positive ladninger ved fysiologisk pH er minst to, men ikke mer enn tre, og et kombinasjonsprodukt som omfatter minst to slike derivater. Oppfinnelsen gjelder videre en fremgangsmåte for behandling, lindring eller fjerning av en infeksjon i et individ som skyldes en gram negativ bakterie ved tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse til individet, en fremgangsmåte for sensitivisering av gram negative bakterier overfor antibakterielt middel ved samtidig eller sekvensiell i hvilken som helst rekkefølge tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av det antibakterielle middel og et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse til individet, fremgangsmåte for utvikling i antibiotika, for reduksjon av nefrotoksisiteten, for å forbedre de farmakokinetiske egenskapene til naturlige polymyksiner og oktapeptiner og for sensitivisering av klinisk viktige bakterier overfor en komplementbasert vertsforsvarsmekanisme som foreligger i serum. Endelig gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av slike polymyksinderivater.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder polymyksinderivater og anvendelse av disse ved behandling av infeksjoner som skyldes gramnegative bakterier.

Polymyksinderivatene kan ha antibakterielle virkninger eller sensibilisere bakteriene for å fremme virkningene av andre antibakterielle midler. Oppfinnelsen er angitt i patentkravene.

Oppfinnelsens bakgrunn

Sepsis dreper hvert år mer enn 215000 amerikanere. Man har anslått at 750000 amerikanere er infisert med alvorlig sepsis og at 29 % av disse dør av sepsis hvert år. Død grunnet sepsis utgjør 9 % av alle dødsfall i de forente stater. Sepsis dreper like mange amerikanere som myokardinfeksjoner, og enda flere enn trafikkulykker.

To til tre millioner amerikanere får hvert år en sykehusinfeksjon, og 10 % av disse infeksjonene utvikles til sepsis. Mer enn 90000 av disse pasientene dør av sepsis grunnet infeksjon i sykehus.

Alvorlig sepsis og septisk sjokk (alvorlig sepsis kombinert med lavt blodtrykk) tok hvert år opptil 135000 liv i intensivavdelingene (ICU) i den europeiske union ifølge helserapporten for 2000 fra OECD. I Storbritannia dør hvert år 5000 av 100 000 pasienter som har fått en sykehusinfeksjon av sepsis i sykehus med akuttpleie som tilhører NHS-organisasjonen.

Dødsfallene har økt år etter år, grunnet det faktum at antall pasienter som er predisponert for sepsis, f.eks. eldre pasienter, for tidlig fødte barn og kreftpasienter, har økt, ikke minst siden mange alvorlige sykdommer i større grad kan behandles nå enn tidligere. Videre har anvendelsen av invasive medisinske innretninger og aggressive behandlingsformer økt.

Gram-negative bakterier er årsaken til mer enn 40 % av alle septikemiske infeksjoner, og mange av de gramnegative bakteriene er ekstremt multiresistente. Gram-negative bakterier utgjør en større utfordring for behandling enn grampositive bakterier, siden de besitter en unik struktur, den ytre membran, som sin ytterste struktur. Lipopolysakkaridmolekyler plassert i den ytre membranen inhiberer mange antibakterielle midlers diffusjon dypere inn i cellen, hvor de endelige mål foreligger. Mer enn 95 % av de nye antibakterielle midlene som ble isolert fra naturen eller syntetisert kjemisk i 1972-1991 manglet aktivitet mot gramnegative bakterier (Vaara 1993).

Polymyksinene er en gruppe av nært beslektede antibiotiske forbindelser som dannes av stammer av Paenibacillus polymyxa og beslektede organismer. Disse kationiske medikamentene er relativt enkle peptider med en molekylvekt på tilnærmet 1000. Polymyksinene, f.eks. polymyksin B, er dekapeptidantibiotika, dvs. at de består av ti (10) aminoacylrester. De er bakteriedrepende og spesielt effektive mot gramnegative bakterier som Escherichia coli og andre arter av Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter baumannii , og andre. Imidlertid har polymyksinene alvorlige bivirkninger, innbefattet nefrotoksisitet og nevrotoksisitet. Disse medikamentene har følgelig begrenset anvendbarhet som terapeutiske midler grunnet høy systemisk toksisitet.

Polymyksiner har blitt anvendt i behandling av alvorlige infeksjoner som skyldes disse bakteriene, men grunnet toksisiteten opphørte stort sett anvendelsen av dem på 1970-tallet, hvor nyere, bedre tolererte antibiotika ble utviklet. Den senere fremkomsten av multiresistente stammer av gramnegative bakterier har gjort det nødvendig å anvende polymyksiner terapeutisk som en siste utvei, trass i toksisiteten, og siden mange av de mindre toksiske antibiotika allerede har mistet sin effektivitet mot visse stammer av disse bakteriene har anvendelsen av polymyksiner igjen økt.

Følgelig har polymyksinene nå blitt tilbakekalt til det terapeutiske arsenal, om enn, grunnet toksisiteten, i svært begrenset skala. Systemisk (dvs. ikke-topisk) anvendelse av dem er imidlertid hovedsakelig begrenset til behandling av livstruende infeksjoner som skyldes multiresistente stammer av Ps. aeruginosa og A. baumannii, så vel som karbapenemresistente enteriske bakterier.

Polymyksinene består av en syklisk heptapeptiddel og en lineær del som består av en tripeptiddel og en hydrofob fettsyrehale som er koblet til α-aminogruppen til den N-terminale aminosyrerest i tripeptidet, og kan representeres ved den generelle formel:

hvori R1-R3 står for tripeptidsidekjededelen, R4-R10 for heptapeptidringdelen og R(FA) står for den hydrofobe fettsyrehale som er koblet til α-aminogruppen til den N-terminale aminosyreresten i tripeptidet.

Polymyksingruppen omfatter følgende polymyksiner: A1, A2, B1-B6, C, D1, D2, E1, E2, F, K1, K2, M, P1, P2, S, og T (Storm et al. 1977; Srinivasa og Ramachandran 1979). Alle polymyksiner er polykationiske og besitter fem (5) positive ladninger, bortsett fra polymyksin D, F og S, som besitter fire (4) positive ladninger. Det bør bemerkes at modifiserte polymyksiner som mangler fettsyredelen R(FA), men som fortsatt har R1-R10, har én ekstra positiv ladning sammenlignet med de naturlige polymyksinene de er avledet fra, grunnet den frie α-aminogruppen i derivatets N-ende. Følgelig bærer f.eks. et slikt derivat av polymyksin B eller polymyksin E i alt seks (6) positive ladninger.

Det klinisk anvendte polymyksin B og polymyksin E skiller seg fra hverandre kun i aminosyrerest R6, som er en D-fenylalanylrest i polymyksin B og en D-leucylrest i polymyksin E.

Videre klassifiseres sirkulin A og B som polymyksiner (Storm et al., 1977). De skiller seg kun fra andre polymyksiner ved at de har en isoleucylrest i posisjon R7, mens andre polymyksiner enten har en treonylrest eller en leucylrest i denne posisjonen. For en oversikt over strukturen til noen polymyksiner, se tabell 1.

Tabell 1

Strukturen til utvalgte polymyksiner og oktapeptid, så vel som utvalgte derivater av disse

Polymyksin B er representert ved følgende formel:

Polymyxin B

(SEQ ID NO:1)

Kommersielt tilgjengelige er en blanding i hvilken R-FA hovedsakelig er 6-metyloktanoyl (6-MOA i polymyksin B1), men også kan være en beslektet fettsyregruppe, f.eks. 6-metylheptanoyl (6-MHA, i polymyksin B2), oktanoyl (i polymyksin B3) eller heptanoyl (polymyksin B4) (Sakura et al. 2004). Alle disse variantene er like aktive mot gramnegative organismer som E. coli (Sakura et al. 2004). Helt i analogi med dette er i polymyksin E1 (Kolistin A) og i sirkulin A R-FA 6-MOA, mens R-FA i polymyksin E2 (Kolistin B) og i sirkulin B er 6-MHA. En rekke forskere har koblet forskjellige hydrofobe grupper, innbefattet forskjellige fettsyrerester, til N-enden av polymyksinderivater og polymyksinanaloger og har vist at de resulterende derivatene har kraftig antibakteriell aktivitet (Chihara et al.

1973, Sakura et al. 2004 og US patentsøknad 2006004185). Selv derivatet som bærer den voluminøse hydrofobe 6-fluorenylmetoksykarbonylresten som R-FA er nesten like aktiv som polymyksin B når det gjelder inhibering av veksten av E. coli og andre gramnegative bakterier (Tsubery et al. 2001).

Heptapeptidringstrukturen er essensiell for biologisk aktivitet (Storm et al.1997). Et derivat med en oktapeptidring er signifikant mindre aktiv som et antibiotikum.

En rekke modifikasjoner av polymyksiner og flere polymyksinlignende syntetiske molekyler har blitt fremstilt, og innen visse grenser har de bevart sin biologiske aktivitet. Modifikasjonene omfatter, men er ikke begrenset til, modifikasjoner i sidekjeden, så vel som molekyler i hvilke en iboende hydrofob aminosyrerest (f.eks. DPhe eller Leu) har blitt erstattet med en annen hydrofob aminosyrerest eller i hvilke den kationiske Dab-gruppen har blitt erstattet med en annen kationisk aminoacylrest, f.eks. Lys, Arg eller en orinitinrest (Storm et al. 1997, Tsubery et al.

2000a, Tsubery et al. 2002, US patentsøknad nr. 2004082505, Sakura et al. 2004, US patentsøknad nr. 2006004185).

Andre modifikasjoner som fører til i det minste delvis mikrobiologisk aktive forbindelser omfatter, men er ikke begrenset til, alkanoylestere i hvilke OH-gruppene i treonylrestene danner estere med alkanoylgrupper, f.eks. propionyl og butyryl (US patentskrift nr. 3 450 687).

Oktapeptinene er ellers identiske med polymyksiner men har en kovalent binding i stedet for aminosyrerestene R1-R2 (tabell 1). I den foreliggende oppfinnelse er R-posisjonene nummerert på tilsvarende måte som posisjonene i de naturlige polymyksinene, og følgelig er den eneste aminoacylrest i sidekjeden til oktapeptinene definert som R3. Følgelig er oktapeptinene oktapeptider, mens alle naturlige polymyksiner er dekapeptider, og de har kun fire (4) positive ladninger. R -FA-restene i forskjellige oktapeptiner (A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1) omfatter følgende rester: 3-OH-8-metyldekansyre, 3-OH-8-metylnonansyre og β-OH-6-metyloktansyre. Derivater som har en fettsyrerest med fra 6-18 karbonatomer har kraftig antibakteriell aktivitet mot E. coli (Storm et al. 1977).

Det første mål for polymyksinene i gramnegative bakterier er bakterienes ytre membran (OM), som utgjør en effektiv permeabilitetsbarriere mot mange skadelige midler, innbefattet store (med en molekylvekt på over 700 d) antibiotika, så vel som hydrofobe antibiotika. Ved å bindes til lipopolysakkarid (LPS)-molekylene som er eksponert på den ytre overflate av OM ødelegger polymyksinene strukturen og funksjonen til OM og permeabiliserer (dvs. gjør permeabel) som en følge av dette OM overfor polymyksin selv, så vel som overfor mange andre skadelige midler (Nikaido og Vaara 1985, Vaara 1992, Nikaido 2003). Det endelige og dødelige mål (det bakteriedrepende mål) for polymyksinene antas å være bakterienes cytoplasmamembran (den indre membran).

Flere forsøk har blitt gjort på å redusere polymyksinenes toksisitet. Behandling av polymyksin E (Kolistin) med formaldehyd og natriumbisulfitt gir kolistin sulfometat, i hvilket de frie aminogruppene til de fem diaminosmørsyrerestene delvis har blitt substituert med sulfometylgrupper (tabell 1). Sammensetningene består av udefinerte blandinger av mono-, di-, tri-, tetra- og pentasubstituerte forbindelser. De sulfometylerte sammensetningene vil når de oppløses i vann i utgangspunktet mangle både den antibakterielle aktivitet og toksisiteten til utgangsmolekylet, men etter hvert som forbindelsene begynner å dekomponeres i løsningen, i blodet eller i vevene, slik at det dannes mindre substituerte derivater og fritt kolestin blir både den antibakterielle aktivitet og toksisiteten delvis tilbake vunnet. Videre varierer tilsynelatende den opprinnelige sulfometyleringsgrad mellom de kommersielt tilgjengelige farmasøytiske sammensetningene. Mange andre måter som alle de frie aminogruppene kan blokkeres på har blitt publisert.

Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, dannelse av ustabile Shiffbaser med aminosyrer (Storm et al. 1977).

Polymyksin E-nonapeptid (PMEN, kolistin-nonapeptid, tabell 1), som erholdes ved enzymatisk behandling av polymyksin E og som mangler R-FA og R1, ble i 1973 vist å være mindre toksisk enn utgangsforbindelsen i en analyse av akutt toksisitet (umiddelbar død, formodentlig grunnet direkte nevromuskulær blokkering) i mus (Chirara et al. 1973). Forbindelsen manglet imidlertid også den antibakterielle aktivitet, målt ut fra evnen til å inhibere bakterievekst (Chirara et al. 1973).

Vaara og Vaara viste derimot at polymyksin B-nonapeptid (PMBN, tabell 1) har bevart evnen til å permeabilisere OM i gramnegative bakterier (Vaara og Vaara 1983a,b,c, US patentskrift nr. 4 510 132, Vaara 1992). Selv om forbindelsen mangler den direkte antibakterielle aktivitet (dvs. evnen til å inhibere bakterievekst) er den følgelig i stand til å sensibilisere (dvs. gjøre sensitive, også betegnet å gjøre følsomme/mottakelige) bakteriene overfor mange antibakterielle midler, f.eks. hydrofobe antibiotika, så vel som store antibiotika og noen andre skadelige midler.

PMBN sensibiliserer også bakteriene overfor den bakteriedrepende aktivitet av det humane komplementsystem, som foreligger i ferskt humant serum som et forsvarssystem i første linje mot angripere (Vaara og Vaara, 1983a, Vaara et al. 1984, Vaara 1992). Forbindelsen sensibiliserer videre bakterien overfor den samlede bakteriedrepende aktivitet av serumkomplement og humane polymorfonukleære hvite celler (Rose et al.1999).

PMBN ligner på PMEN ved at forbindelsen er mindre toksisk enn ikke-modifiserte polymyksiner i analysen av akutt toksisitet i mus. I andre toksikologiske analyser viste flere kriterier at PBMN var mindre toksisk enn utgangsforbindelsen, men dette polymyksinderivatet ble fortsatt vurdert til å være for nefrotoksisk for klinisk anvendelse (Vaara 1992).

PMBN bærer fem (5) positive ladninger. Påfølgende undersøkelser viste, ganske som forventet, at PMEN, som også bærer fem (5) positive ladninger, så vel som deacylpolymyksin B og deacylpolymyksin E, som begge bærer seks (6) positive ladninger, er kraftige midler for sensibilisering av bakterier overfor andre antibiotika (Viljanen et al. 1991, Vaara 1992). Det har i tillegg blitt vist at et enda mer strukturelt redusert derivat, polymyksin B-oktapeptid (PMBO), har bevart en svært effektiv permeabiliserende aktivitet, mens polymyksin B-heptapeptid (PMBH) er mindre aktivt (Kimura et al.1992). PMBN, PMEN og PMBO har fem (5) positive ladninger, mens PMBH kun har fire (4) positive ladninger. Denne forskjellen kan forklare den svakere aktivitet av PMBH.

Gruppen til Ofek, Tsubery og Friedkin beskrev nylig polymyksinlignende peptider som var koblet til kjemotaktiske peptider, f.eks. fMLF, som tiltrekker seg polymorfonukleære leukocytter (US patentsøknad nr. 2004082505, Tsubery et al.

2005). De beskrev peptidene fMLF-PMBN, MLF-PMBN, fMLF-PMEN, fMLF-PMBO og MLF-PMBO, som alle bærer fire (4) positive ladninger og som sensibiliserer gramnegative bakterier overfor antibiotika, selv om ingen sammenlignende undersøkelser med økende konsentrasjoner av forbindelsene ble publisert (Tsubery et al. 2005).

For å undersøke strukturene og de funksjonelle egenskapene til polymyksinene har noen få arbeider blant andre forbindelser beskrevet polymyksinderivater med færre enn fire (4) positive ladninger.

Teuber (1970) har beskrevet behandling av polymyksin B med eddiksyreanhydrid, noe som gir et sammensetning som inneholder polymyksin B, så vel som de mono-, di-, tri-, tetra- og penta-N-acetylerte formene derav. Teuber separerte også hver av disse gruppene og rapporterte ikke-kvantitativt, ved anvendelse av en agardiffusjonsanalyse, at de pentaacetylerte og tetraacetylerte formene manglet evnen til å stanse veksten av Salmonella typhimurium, mens di- og monoacetylerte former hadde denne evnen. Den triacetylerte form hadde en viss evne til dette.

Srinivasa og Ramachandran (1978) isolerte delvis formylerte polymyksin B-derivater og viste at et diformylderivat, og også et triformylderivat, inhiberte veksten av Pseudomonas aeruginosa. De beskrev ikke forbindelsenes evne til å sensibilisere bakterier overfor antibiotika. Videre viste de i 1980 at de frie aminogruppene i triformyl-polymyksin B i aminosyrerestene R1 og R3 så vel som de frie aminogruppene i diformyl polymyksin B i aminosyrerestene R1, R3 og R5 er essensielle, mens de frie aminogruppene i R8 og R9 ikke er essensielle for vekstinhiberingen (Srinivasa og Ramachandran, 1980a).

Et forkortet polymyksin B-derivat, oktanoyl-polymyksin B-heptapeptid, har blitt beskrevet av Sakura et al. (2004). Tilkobling av oktanoylresten til N-enden av aminosyrerest R4 i polymyksin B-heptapeptid fører til en forbindelse med kun tre (3) positive ladninger. Sakura et al. fant at oktanoyl-polymyksin B-heptapeptid inhiberer veksten av bakterier kun i svært høy konsentrasjon (128 μg/ml), mens de andre derivatene, f.eks. oktanoyl-polymyksin B-oktapeptid og oktanoyl-polymyksin B-nonapeptid, som begge har fire (4) ladninger, var svært kraftige midler for inhibering av bakterievekst.

US patentsøknad nr. 2006004185 beskrev nylig visse polymyksinderivater og -intermediater som kan anvendes for syntese av nye peptidantibiotika. De antibakterielle forbindelsene som ble beskrevet hadde fire (4) eller fem (5) positive ladninger.

Weinstein, J. et al., Selective Chemical modifications of polymyxin B, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1998, vol.8 , nr. 23, side 3391-3396, gjør kjent polymyksinderivater som har fire (4) positive ladninger eller mer. En forbindelse som innehar seks (6) positive ladninger ble funnet å ha best toksisitetaktivitetsprofil.Clausell, A. et al., Influence of polymyxins on the structural Dynamics of Escherichia coli lipid membranes, Talanta, 2003, vol. 60, nr. 2 -3, side 225-234, gjør kjent forbindelser som har et totalt antall positive ladniger på enetn fem (5) eller ingen.

Thomas, C. J. et al., Kinetics of the interaction of endotoxin With polymyxin B and its analogs: a surface plasmon resonance analysis, FEBS Letters, 1999, vol. 445, side 420-424 gjør kjent flere analoger av polymyksin der antallet positive ladninger er fire (4) og som inneholder to lysinrester I en sidekjede.

Det foreligger fortsatt et trengende behov for effektive behandlingsformer for bakterielle infeksjoner, særlig for infeksjoner som skyldes multiresistente gramnegative bakterier.

Oppsummering

Foreliggende oppfinnelse gjelder et polymyksinderivat med den generelle formel (I),

der

R1 er fraværende eller Abu,

R2 er valgt fra gruppen som består av Ser, Thr, D-Thr og D-Ala, og

R3 er valgt fra gruppen som består av Thr, D-Thr, Ser, D-Ser, D-Ala, Dab og Abu, R4 er Dab,

R6 er D-Phe eller D-Leu,

R7 er Leu, Thr eller Ile,

R5, R8 og R9 er hver Dab eller Abu,

R10 er Leu, eller Thr, og

R(FA) er valgt fra gruppen som består av oktanoyl- (OA), dekanoyl- (DA), og 6-metylheptanoyl- (6-MHA) rester, hvori nevnte aminosyrerester er utvalgt slik at det totale antall positive ladninger ved fysiologisk pH er tre, og det totale antall positive ladninger i heptapeptidringdelen R4-R10 er minst to, hvorved nevnte polymyksinderivat fremdeles innehar antibakteriell aktivitet mot gramnegative bakterier og/eller innehar evnen til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler, eller et farmasøytisk aksepterbart salt av nevnte derivater.

Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse et derivat i hvilket R1-R10 er valgt fra gruppen bestående av SEKV. ID nr. 10-20 og 22.

Oppfinnelsen gjelder også et kombinasjonsprodukt som omfatter to eller flere av derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse og et farmasøytisk sammensetning som omfatter et slikt derivat eller en kombinasjon av slike derivater og farmasøytisk aksepterbare bærere og eksipienter.

Videre gjelder foreliggende oppfinnelse anvendelse av et polymyksinderivat av formel (I) for fremstilling av et medikament for behandling, lindring eller fjerning av en infeksjon i et individ som skyldes en gramnegativ bakterie. Nevnte bakterie kan være valgt fra gruppen bestående av Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, og Acinetobacter baumannii.

I en annen utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse anvendelse av et polymyksinderivat av formel (I) for fremstilling av et medikament for sensibilisering av gramnegative bakterier overfor et antibakterielt middel. Nevnte antibakterielle middel kan være valgt fra gruppen bestående av klaritromycin, azitromycin, erytromycin og andre makrolider, ketolider, klindamycin og andre linkosaminer, streptograminer, rifampin, rifabutin, rifalazil og andre rifamyciner, fusidinsyre, mupirocin, oksazolidinoner, vankomycin, dalbavancin, telavancin, oritavancin og andre glykopeptidantibiotika, fluorokinoloner, bacitracin, tetrasyklinderivater, beta-laktamantibiotika, novobiosin, pleuromutiliner, folatsynteseinhibitorer, deformylaseinhibitorer og inhibitorer av bakterielle efflukspumper.

Videre angår oppfinnelsen anvendelse av et polymyksinderivat av formel (I) for fremstilling av et medikament for sensibilisering av gramnegative bakterier overfor en komplementbasert vertsforsvarsmekanisme som foreligger i serum.

Endelig gjelder foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et polymyksinderivat av formel (I) som omfatter å modifisere en naturlig eller syntetisk polymyksin- eller oktapeptinforbindelse eller et derivat derav som har 4-6 positivt ladde aminosyrerester ved å erstatte 1-4 av disse aminosyrerestene med nøytrale aminosyrerester eller en kovalent binding eller ved å omdanne 1-4 av disse aminosyrerestene til nøytrale aminosyrerester, for å oppnå et polymyksinderivat med formel (I) i henhold til krav 1, som har 2 eller 3 positivt ladde aminosyrerester.

Definisjoner

”Fysiologisk pH” viser som anvendt heri til en pH-verdi som er høyere enn 7,0 og lavere enn 7,6, f.eks. en pH-verdi i området fra 7,1 til 7,5, f.eks. i området fra 7,2 ti.

7,4.

”Positiv ladning” betegner som anvendt heri positive ladninger ved den ovenfor definerte fysiologiske pH.

Et ”kationisk” molekyl viser som anvendt heri til et molekyl som inneholder én el ler flere positive ladninger.

”Aminosyrerest” viser som anvendt heri til hvilken som helst naturlig, ikke naturlig eller modifisert aminosyrerest, både i L- og D-konfigurasjon.

”Ekvivalente aminosyrerester” er som begrepet anvendes heri ment å omfatte åpenbare modifikasjoner av f.eks. aminosyrer som hører til ikke-naturlige aminosyrer eller derivater derav, men som bibeholder den erstattede aminosyrerest strukturelle og/eller funksjonelle egenskaper.

”Naturlige polymyksiner” viser som anvendt heri til polymyksiner og sirkuliner.

”Polymyksinderivat” viser for foreliggende oppfinnelses formål til syntetiske eller semisyntetiske derivater av naturlige polymyksiner eller oktapeptiner som har en syklisk heptapeptiddel (eller heptapeptidringdel) R4-R10 og en sidekjede som er koblet til den N-terminale aminoacylrest R4. Sidekjeden kan bestå av R(FA)-triaminoacyl(R1-R3), R(FA)-diaminocyl(R2-R3), R(FA)-monoaminoacyl(R3) eller av R(FA) alene.

”Forbindelser” omfatter som anvendt heri alle stereokjemiske isomerer av forbindelsen.

”Sensibiliserende aktivitet” eller ”evne til å sensibilisere” er som begrepet anvendes heri ment å omfatte enhver evne til å forhøye en bakteries sensitivitet, gjøre en bakterie sensitiv overfor eller gjøre en bakterie utsatt for et antibakteriel t middel.

Forkortelser

Fettsyrer: FA, fettsyrerest; 6-MOA og MOA, 6-metyloktanoylresten, 6-MHA og MHA, 6-metylheptanoylresten, MO(H)A, blandingen av 6-metyloktanoyl, 6-metylheptanoyl og beslektede fettsyrerester som opptrer i polymyksin B, OHMDA, 3-OH-8-metyldekansyre, OA, oktanoylrest, DA dekanoylrest,

Aminosyrer: Dab, α, γ-diamino-n-butyrylresten, fDab, N- γ-formyl-diamino-nbutyrylresten, acDab, N- γ-acetyldiamino-n-butyrylresten, Abu, αaminobutyrylresten, Thr, treonylresten, Ser, serinylresten, Phe, fenylalanylresten, Leu, leucylresten, Ile, isoleucylresten, Ala, alanylresten, sm-Dab, γ-sulfometylert α, γ-diamino-n-butyrylrest. Enbokstavkoder for modifiserte aminosyrerester: X, Dab, Z, Abu, B, N- γ-fDab, J, N- γ-acDab.

Peptider: DAPB, deacylpolymyksin B, DAC, deacylkolistin, PMBN, polymyksin B-nonapeptid, PMEN, polymyksin E-nonapeptid, PMBO, polymyksin B-oktapeptid, PMHP, polymyksin B-heptapeptid.

Andre: cy, syklo (for å betegne peptidets sykliske del, omgitt av parenteser), f, formyl, ac, acetyl, LPS, lipopolysakkarid, OM, ytre membran, CFU, kolonidannende enhet. Symbolet * anvendes heri for å angi aminosyrerestene mellom hvilke heptapeptidringdelen av forbindelsen er lukket, slik at resten av molekylet danner en sidekjede.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det har nå blitt funnet at polymyksinderivater som inneholder minst to (2), men ikke flere enn tre (3) positive ladninger fortsatt besitter antibakteriell aktivitet mot gramnegative bakterier og/eller besitter evnen til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler, f.eks. antibiotika, semisyntetiske antibiotika, kjemoterapeutiske midler og vertens forsvarsfaktorer, f.eks. komplement.

Denne reduksjonen av antall positive ladninger kan forbedre de farmakologiske egenskapene til derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse sammenlignet med naturlige polymyksiner og deres kjente derivater. Nærmere bestemt kan den redusere forbindelsenes toksisitet, innbefattet nefrotoksisitet, og/eller redusere den frigjøring av histamin fra vertsvevet som forbindelsene utløser og/eller føre til mer egnede farmakokinetiske egenskaper, f.eks. lengre halveringstid i serum eller lavere følsomhet overfor inaktivering via polyanioniske bestanddeler av vev og puss, sammenlignet med de klinisk anvendte polymyksinene og deres tidligere beskrevne og karakteriserte derivater, f.eks. polymyksin B-nonapeptid.

Foreliggende oppfinnelse gjelder følgelig et polymyksinderivat som kan representeres ved den generelle formel I:

(I)

hvori

R1 er fraværende eller Abu,

R2 er valgt fra gruppen som består av Ser, Thr, D-Thr og D-Ala, og

R6 er D-Phe eller D-Leu,

R7 er Leu, Thr eller Ile,

R5, R8 og R9 er hver Dab eller Abu,

R10 er Leu, eller Thr, og

R(FA) er valgt fra gruppen som består av oktanoyl- (OA), dekanoyl- (DA), og 6-metylheptanoyl- (6-MHA) rester, hvori nevnte aminosyrerester er utvalgt slik at det totale antall positive ladninger ved fysiologisk pH er tre, og det totale antal l positive ladninger i heptapeptidringdelen R4-R10 er minst to, hvorved nevnte polymyksinderivat fremdeles innehar antibakteriell aktivitet mot gramnegative bakterier og/eller innehar evnen til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler, eller et farmasøytisk aksepterbart salt av nevnte derivater.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R(FA) 6-metyloktansyre (6-MOA), 6-metylheptansyre (6-MHA), oktansyre, heptansyre, nonansyre, 3-OH-6-metyloktansyre, 3-OH-8-metyldekansyre, 3-OH-8-metylnonansyre, 3-OH-8-dekansyre og 3-OH-6-metyloktansyre. Eksempler på kjente derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R(FA) er γ-fenylsmørsyre, isovaleriansyre, 9-fluorenylmetoksykarbonsyre, en serie av uforgrenede fettsyrer fra C:9 til C:14 så vel som iso C:9- og iso C:10-fettsyrer.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse kan R(FA) være hvilken som helst hydrofob fettsyrerest og er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av oktanoylrester, dekanoylrester og 6-MHA-rester.

En fagperson kan lett påvise ekvivalenter av disse foretrukne hydrofobe R(FA)-restene, som kan utvelges fra gruppen som består av f.eks. en om ønskelig substituert acylrest eller alkylrest, en om ønskelig substituert isoalkylrest, en om ønskelig substituert sykloalkylrest, en om ønskelig substituert alkenylrest, en om ønskelig substituert sykloalkenylrest, en om ønskelig substituert arylrest, en om ønskelig substituert heteroarylrest, en om ønskelig substituert heterosyklisk rest, hvori disse restene fortrinnsvis har flere enn fem (5) karbonatomer og hvori substitusjonene også kan omfatte substitusjonene som om ønskelig er innført mellom resten og peptidets N-ende. R(FA) kan også være et område av et hydrofobt oligopeptid. Eksempler på mulige R(FA)-rester omfatter (men er ikke begrenset til) restene oktanoyl, nonanoyl, isononanoyl, dekanoyl, isodekanoyl, undekanoyl, dodekanoyl, tetradekanoyl, syklohexanoyl, sykloheptanoyl, syklooktanoyl, syklononanoyl, sykloisononanoyl, syklodekanoyl, sykloisodekanoyl, sykloundedanoyl, syklododekanoyl, syklotetradekanoyl, heksanoyl, heptanoyl, og 9-fluorenylmetoksykarbonyl.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R1 Dab eller fraværende (dvs. erstattet med en kovalent binding). Eksempler på kjente derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R1 er Ala eller en kovalent binding.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse kan R1, dersom R1 foreligger, være Abu.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R2 Thr eller fraværende (dvs. ersta ttet med en kovalent binding). Eksempler på kjente derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R2 er O-acetyl-Thr, O-propionyl-Thr, O-butyryl-Thr eller en kovalent binding.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse er R2 valgt fra gruppen bestående av Ser, Thr, DThr og DAla.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R3 Dab, DDab eller DSer. Eksempler på en rekke kjente syntetiske derivater som ha antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R3 er Lys eller 2-amino-4-guanidinosmørsyre.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse er R3 valgt fra gruppen bestående av Thr, DThr, Ser, DSer, DAla, Dab og Abu.

En fagperson vil lett kunne påvise ekvivalente rester til disse foretrukne restene R1, R2 og R3 og kan utvelge slike fra en gruppe som består av f.eks. en kovalent binding, alanin, 2-aminoadipinsyre, α-n-smørsyre, N-(4-aminobutyl)glycine, αaminosmørsyre, γ-aminosmørsyre, α-amino-kaproinsyre, aminosyklopropankarboksylate, aminoisosmørsyre, aminonorbornylkarboksylat, α amino-n-valeriansyre, arginin, N ω-metylarginin, asparagin, α-metylaspartat, aspartinsyre, N-benzylglycin, N-(2-karbamyletyl)glycin, N-(karbamyletyl)glycin, 1-karboksy-1(2,2-difenylehylamino)syklopropan, cystein, N α-metyldiamino-nsmørsyre, Nγ-acetyldiamino-n-smørsyre, Nγ-formyldiamino-n-smørsyre, Nγ-metyldiamino-n-smørsyre, N -(N-2,2-difenyletyl)karbamylmetyl-glycin, N -(N-3,3-difenylpropyl) karbamylmetyl(1)glycin, N-(3,3-difenylpropyl) glycin, glutaminsyre, glutamin, glycin, t-butylglycin, 2-amino-4-guanidinosmørsyre, N-(3-guanidinopropyl)glycin, histidin, homofenylalanin, isodesmosin, isoleucin, leucin, norleucin, hydroksylysin, N α-metyllysin, lysin, N α-metylhydroksylysin, N αmetyllysin, Nε-acetylhydroksylysin, Nε-acetyllysin, Nε-formylhydoksylysin, Nε-formyllysin, Nε-metylhydroxylysin, Nε-metyllysin, metionin, α-metyl- γaminobutyrat, α-metyl-aminoisobutyrat, α-metylsykloheksylalanin, α-naftylalanin, norleucin, norvalin, α-metylornitin, N α-metylornithin, N δ-acetylornitin, N δ-formylornitin, N δ-metylornitin, ornitin, penicilamin, fenylalanin, hydroksyprolin, prolin, N α-metyldiamino-n-propionsyre, N β-acetyldiamino-n-propionsyre, N βformyldiamino-n-propionsyre, N β-metyldiamino-n-propionsyre, fosfoserin, serin, fosfotreonin, treonin, tryptofan, tyrosin, norvalin, og valin.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R4 Dab. Eksempler på syntetiske derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R4 er Lys.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse er R4 Dab.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R5, R8 og R9 Dab. Eksempler på syntetiske derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R5, R8 og R9 kan være Lys eller 2-amino-4-guanidinosmørsyre.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse er R5, R8 og R9 hver Dab eller Abu.

En fagperson vil lett kunne påvise ekvivalente aminosyrerester til disse foretrukne aminosyrerestene og kan utvelge slike fra en gruppe som består av f.eks. diaminosmørsyre, diaminopropionsyre, lysin, hydroksylysin, ornitin, 2-amino-4-guanidinosmørsyre, glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin, D-fenylalanin, metionin, treonin, serin, α-amino-n-smørsyre, α-amino-n-valeriansyre, α-aminokaproinsyre, Nε-formyl-lysin, Nε-acetyllysin, Nε-metyllysin, Nε-formylhydroksylysin, Nε-acetylhydroksylysin, Nε-metylhydroksylysin, L-N αmetylhydroksylysin, Nγ-formyldiamino-n-smørsyre, Nγ-acetyldiamino-n-smørsyre, Nγ-metyldiamino-n-smørsyre, N β-formyldiamino-n-propionsyre, D-N βformyldiamino-n-propionsyre, N β-acetyldiamino-n-propionsyre, N β-metyldiaminon-propionsyre, N δ-formylornitin, N δ-acetylornitin og N δ-metylornitin.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R6 DPhe eller DLeu og R7 er Leu, Ile, Phe eller Thr. Syntetiske derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R6 er DTrp og R7 er Ala.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse er R6 DPhe eller DLeu, og R7 er Leu, eller Ile eller Thr.

En fagperson vil lett kunne påvise ekvivalente aminosyrerester til disse foretrukne hydrofobe aminosyrerestene og kan utvelge slike fra en gruppe som består av f.eks. fenylalanin, α-amino-n-smørsyre, tryptofan, leucin, metionin, valin, norvalin, norleucin, isoleucin og tyrosin. En fagperson vil også innse at den ekvivalente aminosyrerest til treonin er serin.

I naturlige polymyksiner og oktapeptiner er R10 Thr og Leu. Eksempler på kjente derivater som har antibakteriell aktivitet omfatter derivater i hvilke R10 er O-acetyl-Thr, O-propionyl-Thr eller O-butyryl-Thr.

I et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse er R10 Thr eller Leu.

En fagperson vil også innse at den ekvivalente aminosyrerest til treonin er serin.

Nærmere bestemt utvelges foretrukne aminosyrerester på en slik måte at R8 og R9 ikke begge er formylert dersom R(FA)-R1-R2-R3 utgjør den native polymyksin B-sidekjede, og når R(FA) er direkte koblet til R4 så er R(FA) dekanoyl.

De spesifikke posisjonene til de maksimalt tre (3) positive ladningene som det vises til heri ovenfor, kan være lokalisert i heptapeptidringdelen og/eller i sidekjeden, dersom sidekjeden foreligger. Dersom tre (3) positive ladninger foreligger i derivatene ifølge oppfinnelsen, kan disse tre (3) positive ladningene være plassert i heptapeptidringdelen, eller to (2) positive ladninger kan være lokalisert i heptapeptidringdelen mens den gjenværende positive ladning er lokalisert i sidekjeden, eller én (1) positiv ladning kan være lokalisert i heptapeptidringstrukturen mens de gjenværende to (2) positive ladningene er plassert i sidekjeden. Fortrinnsvis foreligger minst to (2) positive ladninger i heptapeptidringdelen.

I én utførelse kan derivater ifølge foreliggende oppfinnelse være utvalgt fra gruppen av derivater i hvilke R1-R10 er valgt fra gruppen bestående av Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 10; Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 11; Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 12; Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 13; Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 14; Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-], dvs.

SEKV. ID nr. 15; Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu-], dvs. SEKV. ID nr. 16; Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 17; Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-], dvs. SEKV. ID nr.18; Thr-Abucy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr.19; DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr.20; Thr-Dab-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. SEKV. ID nr. 22.

I andre utførelser kan derivater ifølge foreliggende oppfinnelse være valgt fra gruppen bestående av: OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 10; DA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. DA-SEKV. ID NR. 10; OA-Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 11; OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 12; DA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. DA-SEKV. ID NR. 13; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 13; MHA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. MHA-SEKV. ID NR. 13; MHA-Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. MHA-SEKV. ID NR. 14; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 15; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 16; OA-Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 17; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 18; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 19; OA-DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 20; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 22.

Derivater ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 10; DA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. DA-SEKV. ID NR. 10; OA-Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 11; OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 12; DA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. DA-SEKV. ID NR. 13; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 13; MHA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. MHA-SEKV. ID NR. 13; MHA-Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. MHA-SEKV. ID NR. 14; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 15; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 16; OA-Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 17; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 18; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 19; OA-DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], dvs. OA-SEKV. ID NR. 20.

Som vist i eksempelseksjonen heri kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som kun bærer tre (3) positive ladninger være svært aktive midler for inhibering av veksten av gramnegative bakterier eller for sensibilisering av dem overfor antibakterielle midler, og selv derivater som kun bærer to (2) positive ladninger kan ha den samme virkning, om enn i et mer moderat nivå.

For direkte antibakteriell aktivitet er minst to (2) og mer foretrukket tre (3) positive ladninger lokalisert i heptapeptidringdelen, og for sensibiliserende virkning er minst én (1) og mer foretrukket to (2) eller tre (3) positive ladninger lokalisert i heptapeptidringdelen. Videre vil nærvær av to hydroksylgrupper i sidekjededelen i signifikant grad forhøye den direkte antibakterielle aktivitet.

Arbeidene til Tauber (1970), Srinivasa og Ramachandran (1980a) og Sakura et al. (2004) beskriver blant andre polymyksinderivater derivater som kun har to (2) eller tre (3) positive ladninger. den antibakterielle aktiviteten av de beskrevne derivatene er imidlertid svært svak og klinisk irrelevant (Sakura et al. 1980), forklart ut fra aminosyrerestene, i fullstendig motsetning til funnene i den foreliggende oppfinnelse (Srinivasa og Ramachandran 1980a) eller ikke tilskrevet noen spesifikk aminosyrerest i det hele tatt, grunnet ufullstendig rensing (Teuber 1970). Videre verken beskriver, foreslår eller motiverer noen av arbeidene som er sitert ovenfor til undersøkelser av slike derivaters evne til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler. Som eksemplene på den foreliggende oppfinnelse klart viser kan man ikke forutsi et polymyksinderivats evne til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler basert på evnen til å inhibere veksten av disse. F.eks. er en klinisk irrelevant konsentrasjon av oktanoylpolymyksin B-heptapeptid på opptil 128 μg/ml nødvendig for å inhibere veksten av E. coli (Sakura et al.2004), mens en mengde på ned til 4 μg er tilstrekkelig for en moderat sensibilisering av bakterien overfor rifampin, som vist i eksempelseksjonen heri.

De acetylerte polymyksinderivatene som beskrives av Teuber (1970) er blandinger av derivater som er acetylert på forskjellige måter. Eddiksyreanhydrid kan reagere med hvilken som helst av de fem frie aminogruppene i polymyksin B-molekylet og i et monoacetylert polymyksin. Følgelig er et monoacetylert polymyksin ifølge Teuber en blanding av fem monoacetylerte polymyksinderivater som alle er acetylert på en forskjellig aminogruppe. Et diacetylert polymyksin ifølge Teuber er en blanding av ti forskjellige diacetylerte derivater, mens triacetylert polymyksin også er en blanding av ti forskjellige triacetylerte derivater. Teuber gjorde ingen forsøk på å isolere disse derivatene fra blandingene. Problemet med slike modifiserte polymyksiner er at den delvise modifisering kan føre til redusert spesifisitet. Derfor er noen av aminogruppene som er viktige for den antibakterielle aktivitet delvis substituert (og følgelig inaktivert), mens noen av de ikke-viktige aminogruppene fortsatt er delvis ikke-substituert. Videre kan substitusjonsgraden føre til variasjon fra porsjon til porsjon.

Polymyksinderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse er derimot isolerte og strukturelt klart definerte og identifiserte forbindelser.

Srinivasa og Ramachandran (1980a) foreslo at de frie aminogruppene i sidekjeden til triformyl-polymyksin B i aminosyrerestene R1 og R3 så vel som de frie aminogruppene i diformylpolymyksin B i aminosyrerestene R1, R3 og R5 er essensielle, mens de frie aminogruppene i R8 og R9 ikke er essensielle for vekstinhiberingen av Pseudomonas aeruginosa. I motsetning til deres konklusjoner omfatter forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse både forbindelser som mangler de frie aminogruppene i R1 og R3 og som har frie aminogrupper i R5, R8 og R9, og som fortsatt er kraftige midler mot Ps. aeruginosa så vel som andre gramnegative bakterier.

Et forkortet polymyksin B-derivat, oktanoyl-polymyksin B-heptapeptid, har blitt beskrevet av Sakura et al. (2004). Tilkobling av aktanoylresten til N-enden av aminosyrerest R4 i polymyksin B-heptapeptid fører til en forbindelse med kun tre (3) positive ladninger. Sakura et al. fant at oktanoyl-polymyksin B-heptapeptid inhiberer veksten av bakterier bare i en svært høy (og klinisk irrelevant) konsentrasjon (128 μg/ml), mens de andre derivatene, f.eks. oktanoyl-polymyksin B-oktapeptid og oktanoyl-polymyksin B-nonapeptid, som begge har fire (4) ladninger, er svært kraftige midler for inhibering. Sakura et al. verken beskrev eller foreslo evnen til oktanoyl-polymyksin B-heptapeptid til å sensibilisere bakterier overfor antibakterielle midler, og beskrev heller ikke at en lengre fettsyrehale forhøyer den antibakterielle aktivitet, som vist i eksempelseksjonen heri.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i ett aspekt nye polymyksinderivater med kun to (2) eller tre (3) positive ladninger som fortsatt kan inhibere veksten av én eller flere gramnegative bakteriearter og/eller sensibilisere én eller flere gramnegative bakteriearter overfor et antibiotikum eller et antibakterielt middel.

Bakteriers følsomhet overfor et antibakterielt middel kan bestemmes ved hjelp av to mikrobielle fremgangsmåter. En hurtig, men grov, fremgangsmåte benytter kommersielt tilgjengelige filtrerpapirskiver som har blitt impregnert med en spesifikk mengde av det antibakterielle middel. Disse skivene plasseres på overflaten av agarskåler som har blitt inokulert med en suspensjon av organismen som skal analyseres, og skålene observeres for soner med vekstinhibering. En mer nøyaktig teknikk, analyse av følsomheten i fortynnede medier, omfatter klargjøring av reagensrør som inneholder seriefortynninger av medikamentet i flytende dyrkningsmedium, og så inokulering av organismen som skal analyseres i rørene. Den laveste medikamentkonsentrasjon som inhiberer veksten av bakterien etter en egnet inkubasjonstid rapporteres som den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC).

Derivater ifølge foreliggende oppfinnelse kan inhibere veksten av eller sensibilisere overfor antibakterielle midler klinisk viktige gramnegative bakterier, f.eks. bakterier som tilhører arter fra slektene Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bordetella, Branhamella, Campylobacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Pasteurella, Plesiomonas, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, og Yersinia. Bakterien kan f.eks. være Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, andre arter av Enterobacter, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, andre arter av Pseudomonas, Acinetobacter baumannii, så vel som mange andre arter av ikkefermenterende gramnegative bakterier. Bakterien kan også omfatte Helocobakter pylori, så vel som andre klinisk viktige gramnegative bakterier.

Bakterieinfeksjonene som kan behandles omfatter f.eks. bakteriemi, septikemi, infeksjon i hud og myke vev, lungebetennelse, meningitt, infeksjoner i bekkenbukhinneområdet, fremmedlegemeinfeksjon, feber hos hematologiske pasienter, infeksjon forbundet med en intravenøs slange eller en annen form for kateter, kanyle og/innretning, infeksjon i mange-tarmkanalen, i øyet eller i øret, overfladiske hudinfeksjoner og kolonisering av mage-tarmkanalen, slimhinner og/eller hud av potensielt skadelige bakterier.

De bakterielle infeksjonssykdommene omfatter (men er ikke begrenset til), alvorlige infeksjoner ervervet i sykehus, infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, infeksjoner hos organtransplantasjonspasienter, infeksjoner i intensivavdelinger (ICU), alvorlige infeksjoner i brannsår, alvorlige samfunnservervede infeksjoner, infeksjoner hos pasienter med cystisk fibrose samt infeksjoner som skyldes multiresistente gramnegative bakterier.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot kombinasjoner av to eller flere derivater ifølge foreliggende oppfinnelse for kombinasjonsbehandling. Kombinasjonene kan omfatte derivater med et forskjellig spektrum av antibakteriell aktivitet eller en evne til å sensibilisere forskjellige arter eller stammer av gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler.

Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse er rettet mot farmasøytiske sammensetninger som omfatter polymyksinderivater ifølge foreliggende oppfinnelse, deres saltformer, utvalgte kombinasjoner av dem og om ønskelig et antibakterielt middel, utformet sammen med ett eller flere farmasøytisk aksepterbare bærestoffer eller én eller flere farmasøytisk aksepterbare eksipienter. Disse forenkler prosesseringen av de aktive forbindelsene til sammensetninger som kan anvendes farmasøytisk og omfatter f.eks. fortynningsmidler, fyllstoffer, bufringsmidler, tykningsmidler, fuktingsmidler, dispersjonsmidler, solubiliseringsmidler, suspensjonsmidler, emulsjonsmidler, bindemidler, stabilisatorer, desintegrasjonsmidler, innkapslingsmidler, belegningsmidler, innstøpingsmidler, smøremidler, fargestoffer og smaksstoffer, så vel som absorpsjonsmidler, absorpsjonsfremmende midler, fuktighetsbevarende midler, konserveringsmidler og lignende som er velkjente blant fagfolk.

Farmasøytiske sammensetninger omfatter sammensetninger i hvilke de aktive bestanddelene foreligger i en mengde som effektivt oppnår det ønskede formål. Nærmere bestemt betyr en terapeutisk effektiv mengde en mengde av forbindelse som er effektiv for behandling, forebyggelse, lindring eller fjerning av sykdomssymptomene eller for å forlenge overlevelsen av individet som behandles ved et rimelig forhold mellom nyttevirkning og risiko, noe som gjelder for enhver medisinsk behandling. Fastsettelsen av en terapeutisk effektiv mengde ligger godt innenfor evnene til medisinsk fagpersonale.

Sammensetningene kan fremstilles ved fremgangsmåter som er velkjente innen faget, f.eks. ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter for sammenblanding, oppløsning, innkapsling, innfanging, frysetørking, emulgering og granulering. Den egnede utforming avhenger av den valgte tilførselsvei, og det farmasøytiske sammensetning kan utformes for umiddelbar frigjøring eller langsom frigjøring (f.eks. for å forlenge den terapeutiske virkning og/eller forbedre tolererbarheten). Videre kan utformingene med fordel foreligge i enhetsdoseform, fremstilt ved fremgangsmåter som er kjent innen farmasifaget.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter (men er ikke begrenset til) sammensetninger som er beregnet for intravenøs, intramuskulær, oral eller topisk tilførsel, så vel som sammensetninger som tilføres som en stikkpille eller en inhalerbar aerosol. Sammensetningene omfatter intravenøse, intramuskulære, intraperitoneale, subkutane, intramidulære, intratekale, intraventrikulære, intranasale eller intraokulære injeksjoner og inhalerbare aerosoler, så vel som sammensetninger beregnet for rektal, oral, intravaginal, transmukosal eller transdermal tilførsel.

For parenteral tilførsel (f.eks. ved bolusinjeksjon, hurtige infusjoner eller langsomme infusjoner) kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse så vel som kombinasjonene som beskrives ovenfor utformes som egnede salt- eller esterformer i sterile, vandige løsninger, fortrinnsvis fysiologisk kompatible væsker som saltvann, 5 % dekstrose, Ringers løsning og Hanks løsning. Utformingen kan også omfatte organiske løsemidler som propylenglykol, polyetylenglykol, propylenglykol eller beslektede forbindelser, så vel som konserveringsmidler og surfaktanter.

Farmasøytisk aksepterbare syreaddisjonssalter kan fremstilles fra uorganiske og organiske syrer. Salter avledet fra uorganiske syrer omfatter saltsyre, hydrogenbromid, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende. Salter avledet fra organiske syrer omfatter eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyrodruesyre, oksalsyre, eplesyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, ptoluensulfonsyre, salisylsyre og lignende.

I tillegg kan de farmasøytiske sammensetningene for parenteral tilførsel være suspensjoner eller emulsjoner i oljebaserte eller vandige bærestoffer og kan inneholde utformingsmidler som suspensjonsmidler, stabilisatorer og/eller dispersjonsmidler. Egnede lipofile bærere og løsemidler omfatter fettoljer, f.eks. naturlige og/eller syntetiske fettsyreestere, f.eks. etyloleat og triglyserider, eller liposomer. Suspensjonene kan inneholde forbindelser som forhøyer suspensjonens viskositet, f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran.

De parenterale sammensetningene kan foreligge i enhetsdoser eller i forseglede beholdere med flere doser, f.eks. ampuller og medisinflasker, og kan lagres i frysetørket (lyofilisert) tilstand, slik at kun tilsetning av den sterile flytende eksipient, f.eks. vann for injeksjon, er nødvendig umiddelbart før bruken.

For oral tilførsel omfatter sammensetninger i fast form f.eks. pulvere, tabletter, piller, drasjeer, pastiller, kapsler, poser og mikrogranulære sammensetninger.

Farmasøytiske sammensetninger kan fremstilles ved anvendelse av en fast eksipient, om ønskelig maling av den resulterende blanding og prosessering av blandingen til et granulat, om ønskelig etter tilsetning av egnede tilleggsstoffer, for erholdelse av tabletter eller drasjekjerner. Et fast bærestoff/en fast eksipient kan være én eller flere forbindelser som også virker som fortynningsmidler, solubiliseringsmidler, smøremidler, suspensjonsmidler, bindemidler, konserveringsmidler, smaksstoffer, fuktingsmidler, tablettdesintegrerende midler eller innkapslingsmateriale. Egnede bærestoffer omfatter, men er ikke begrenset til, magnesiumkarbonat, magnesiumstearat, talkum, dekstrose, laktose, pektin, stivelse, gelatin, tragant, metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose, en voks med lavt smeltepunkt, kakaosmør og lignende.

Flytende sammensetninger som er egnet for oral tilførsel omfatter f.eks. vandige løsninger, siruper, eliksirer, vandige suspensjoner, emulsjoner og geler. Vandige løsninger kan fremstilles ved å oppløse den aktive bestanddel i vann og tilsette egnede stabilisatorer og tykningsmidler, så vel som fargestoffer og smaksstoffer. Vandige suspensjoner kan fremstilles ved å dispergere den finfordelte aktive bestanddel i vann sammen med et viskøst materiale, f.eks. naturlige eller syntetiske gummier, resiner, metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og andre velkjente suspensjonsmidler. Emulsjoner kan fremstilles i løsninger i vandige propylenglykolløsninger eller inneholde emulsjonsmidler som lecitin, sorbitanmonooleat eller akasia.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller kombinasjonene som beskrives ovenfor kan også utformes for topisk tilførsel. De aktive forbindelsene sammenblandes under sterile betingelser med farmasøytisk aksepterbare bærestoffer/eksipienter, innbefattet eventuelle nødvendige bufringsmidler og konserveringsmidler. Salver, kremer og lotioner kan f.eks. utformes med en vandig eller oljebasert basis ved tilsetning av egnede emulsjonsmidler, dispersjonsmidler, suspensjonsmidler, tykningsmidler, stabilisatorer eller fargestoffer. Alminnelig anvendte eksipienter omfatter fett og oljer fra dyr og planter, vokser, parafiner, stivelse, cellulosederivater, tragant og polyetylenglykol.

Andre topiske utforminger omfatter, men er ikke begrenset til, øredråper, øyedråper og transdermale plastre.

For transdermal så vel som transmukosal tilførsel kan penetrasjonsmidler som er generelt kjente innen faget anvendes i utformingen.

For tilførsel ved inhalering leveres forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og kombinasjonene som beskrives ovenfor i form av en aerosolspraytilførsel fra en ventilator, en beholder under trykk eller en nebulisator ved anvendelse av en egnet drivgass, f.eks. diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan eller karbondioksid. Når det gjelder en aerosol under trykk kan doseringsenheten bestemmes ved å benytte en ventil som tilfører en utmålt mengde. Kapsler og patroner av f.eks. gelatin for anvendelse i en inhalator eller insuflator kan utformes til å inneholde en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbasis, f.eks. laktose eller stivelse.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og kombinasjonene som beskrives ovenfor kan også utformes til rektale sammensetninger, f.eks. retensjonsklysterer eller stikkpiller, ved anvendelse av konvensjonelle stikkpillebasiser som kakaosmør, andre glyserider, polyetylenglykol eller en stikkpillevoks.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament for anvendelse av de beskrevne polymyksinderivatene eller en kombinasjon av slike derivater som en del av den kliniske behandling av (eller forebyggende profylaktisk behandling av) mennesker eller dyr som lider av en infeksjonssykdom og omfatter tilførsel til individet av en terapeutisk effektiv dose av minst ett derivat ifølge foreliggende oppfinnelse, om ønskelig i kombinasjon med et antibakterielt middel.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament for anvendelse i sensibilisering av gramnegative bakterier overfor et antibakterielt middel, hvori derivatet ifølge foreliggende oppfinnelse tilføres samtidig eller sekvensielt i hvilken som helst rekkefølge med en terapeutisk effektiv mengde av det antibakterielle middel.

Derivatet ifølge foreliggende oppfinnelse og det antibakterielle middel kan tilføres sammen som én utforming eller via forskjellige tilførselsveier. F.eks. kan polymyksinderivatet tilføres intravenøst mens det antibakterielle middel tilføres intramuskulært, intravenøst, subkutant, oralt eller intraperitonealt. Alternativt kan derivatet tilføres intramuskulært eller intraperitonealt, mens det antibakterielle middel tilføres intravenøst, intramuskulært eller intraperitonealt, eller derivatet kan tilføres i aerosolform eller nebulisert form mens det antibakterielle middel f.eks. tilføres intravenøst. Derivatet og de antibakterielle midlene kan tilføres samtidig eller sekvensielt, så lenge som de tilføres på en måte som er tilstrekkelig til at begge oppnår effektive konsentrasjoner i infeksjonssetet.

”Terapeutisk effektivitet” bygger på et vellykket klinisk utfall og krever ikke at et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse, om ønskelig i kombinasjon med et antibakterielt middel, dreper 100 % av bakteriene som inngår i en infeksjon.

Vellykket behandling avhenger av at det oppnås et nivå av antibakteriell aktivitet i infeksjonssetet som er tilstrekkelig til at bakteriene inhiberes på en måte som forskyver balansen til fordel for verten. Dersom vertens forsvarssystem er maksimalt effektivt kan den antibakterielle virkning som er nødvendig være moderat. En reduksjon av organismebelastningen med kun én logg (en faktor på 10) kan tillate at vertens egne forsvarsmekanismer kontrollerer infeksjonen. I tillegg kan en forsterking av en tidlig bakteriedrepende/bakteriostatisk virkning være viktigere enn en bakteriedrepende/bakteriostatisk virkning over lengre tid. Disse tidligere begivenhetene er en signifikant og avgjørende faktor i terapeutisk suksess, siden de gir vertens forsvarsmekanismer tid til å aktiveres. En økning av den bakteriedrepende evnen kan være spesielt viktig for infeksjoner som meningitt og infeksjoner i bein eller ledd.

Den terapeutiske effektivitet av et antibakterielt middel avhenger av bakterieartens følsomhet overfor det antibakterielle middel med den klinisk relevante konsentrasjon av derivatet ifølge foreliggende oppfinnelse. Evnen til forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse til å forbedre den terapeutiske effektivitet av antibakterielle midler in vivo kan vises i dyremodeller in vivo, f.eks. peritonitt i mus eller bakteriemianalyser i kanin, og kan forutsies basert på en rekke in vitro analyser, innbefattet (1) bestemmelse av den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) av et antibakterielt middel som er nødvendig for å inhibere veksten av en gramnegativ bakterie i 24 timer, (2) bestemmelse av virkningen av et antibakterielt middel på den kinetiske vekstkurve for en gram negativ bakterie og (3) sjakkbrettanalyse av MIC for seriefortynninger av antibakterielt middel, alene eller i kombinasjon med seriefortynninger av forbindelsen eller forbindelsene. Eksempler på modeller eller analyser er velkjente innen faget.

Ved anvendelse av in vitro bestemmelse av MIC etter 24 timer kan et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse vises å redusere MIC for det antibakterielle middel. Med dette resultatet forventes det at samtidig tilførsel av forbindelsen in vivo vil øke en gramnegativ bakteries følsomhet overfor det antibakterielle middel. En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan også vises å redusere MIC for et antibakterielt middel fra det området hvor organismen anses som klinisk resistent til et område hvor organismen anses som klinisk følsom. Med dette resultat forventes det at samtidig tilførsel in vivo av én eller flere forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse og det antibakterielle middel vil reversere resistensen og effektivt overføre den antibiotikaresistente organisme til en antibiotikafølsom organisme.

Ved å måle virkningen av antibakterielle midler på in vitro vekstkurven for gramnegative bakterier i nærvær eller fravær av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan forbindelsen vises å forhøye den tidlige antibakterielle virkning av antibakterielle midler innenfor et tidsrom på fortrinnsvis mindre enn 24 timer. En forsterkning av tidlige bakteriedrepende/vekstinhiberende virkninger er viktig for å avgjøre det terapeutiske utfall.

Et polymyksinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse og et antibakterielt middel kan også ha synergistiske eller gjensidig forsterkede virkninger ut over hvert enkelt middels virkninger alene eller de additive virkningene av midlene sammen. I en sjakkbrettanalyse kan kombinasjonen av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse og antibakterielle midler føre til en ”synergistisk” fraksjonell inhiberende konsentrasjonsindeks (FIC). Sjakkbrettfremgangsmåten bygger på additivitet, som antar at resultatet som observeres med flere medikamenter er summen av de separate virkningene av medikamentene som analyseres, ifølge dette systemet vurderes en FIC som er lavere enn 0,5 som synergi, 1 vurderes som additiv og høyere enn 1 men lavere enn 2 vurderes som uten betydning.

Antibakterielle midler som er egnet for anvendelse i kombinasjon med derivater ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter f.eks. makrolider, f.eks. klaritromycin, acitromycin og erytromycin, ketolider, linkosaminer, f.eks. klindamycin, streptograminer, rifamyciner, f.eks. rifampin, rifabutin og rifalasid, fusidinsyre, mupirocin, oksazolidinoner, glykopeptidantibiotika, f.eks. vankomycin, dalavancin, telavancin og oritavancin, fluorokinoloner, tetrasyklinderivater, hydrofobe derivater av penicilliner, cefalosporiner, monobaktamer, karbapenemer, penemer og andre betalaktamantibiotika, novobiocin, pleuromutiliner, folatsynteseinhibitorer, deformulaseinhibitorer og inhibitorer av bakterielle efflukspumper. En fagperson innen feltet behandling av gramnegative infeksjoner vil lett kunne påvise andre klinisk relevante antibakterielle midler som kan være anvendbare. Disse antibakterielle midlene er fortrinnsvis utvalgt fra en gruppe som består av hydrofobe eller moderat hydrofobe antibakterielle midler som den ytre membran hos gramnegative bakterier virker som en effektiv permeabilitetsbarriere for.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av de her beskrevne forbindelser eller kombinasjoner av dem for sensibilisering av klinisk viktige bakterier som er opplistet heri overfor vertens komplementbaserte forsvarsmekanisme (som foreligger i ferskt humant serum og dyreserum) ved å utsette bakteriene for virkningen av slike forbindelser under en klinisk infeksjon eller en mistenkt infeksjon. Vertsforsvaret kan f.eks. utøves ved den kombinerte virkning av komplement og polymorfonukleære leukocytter.

Medisinsk fagpersonell vil lett kunne optimalisere effektive doser og tilførselsskjemaer for forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, så vel som for de anvendte antibiotika ved tilførsel sammen, idet faktorer som er velkjente innen faget tas i betraktning, innbefattet typen av individ som skal doseres, individets alder, vekt, kjønn og medisinske tilstand, tilførselsveien, individets nyrefunksjon og leverfunksjon, den ønskede virkning, den benyttede forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse og individets toleranse overfor den. Doser av alle antimikrobielle midler bør justeres for pasienter med svekket nyrefunksjon eller leverfunksjon, grunnet den reduserte metabolisme og/eller ekskresjon av medikamentene hos pasienter med disse tilstandene. Dosene for barn bør også reduseres, generelt ut fra kroppsvekten.

Den totale daglige dose av et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse som tilføres til et menneske eller dyr kan variere, f.eks. i en mengde fra 0,1-100 mg pr. kg kroppsvekt, fortrinnsvis fra 0,25-25 mg/kg kroppsvekt.

Fagfolk vil forstå at den optimale behandlingskur, dvs. antall doser som tilføres pr. dag over et definert antall dager, vil avgjøres av egenskapene og omfanget til tilstanden som skal behandles, tilførselsformen, tilførselsveien og tilførselssetet og pasienten som behandles, og at kuren kan optimaliseres ved hjelp av konvensjonelle teknikker.

Videre tilveiebringes en fremgangsmåte for analyse av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor forbindelsen er et derivat av et naturlig polymyksin eller optapeptin, hvori derivatet kun har 2-3 positive ladninger, i motsetning til den naturlig forekommende forbindelse som det er avledet fra, for antibakteriell aktivitet mot en skadelig gramnegativ bakterie og/eller for evne til å sensibilisere bakterien overfor antibakterielle midler og/eller komplement som foreligger i serum, hvor fremgangsmåten omfatter trinnet å sette bakterien i forbindelse med derivatet av et naturlig polymyksin eller oktapeptin og identifisere derivater som besitter antibakteriell aktivitet og/eller sensibiliserende aktivitet overfor bakterien.

Videre tilveiebringes en fremgangsmåte for analyse av polymyksin- og oktapeptinderivater med redusert binding til nyrevev eller bestanddeler av nyrevev i eller fra forsøksdyr eller av humant opphav ved å måle deres reduserte evne til kompetitivt å blokkere bindingen av aminoglykosider til vevet eller blokkere bindingen av andre forbindelser som vites å bindes dertil.

I et videre aspekt tilveiebringes en fremgangsmåte for utvikling av nye antibiotika som omfatter trinnene å tilveiebringe en naturlig polymyksin- eller oktapeptinforbindelse eller et derivat derav med i alt fire eller fem positive ladninger eller i alt seks positive ladninger, som i deacylpolymyksiner, erstatte fra 1-4 aminosyrerester som bærer én eller flere positive ladninger med en aminosyrerest som ikke har en positiv ladning eller med en kovalent binding, slik at det dannes et polymyksinderivat med to eller tre positive ladninger, analyse av derivatforbindelsen for antibakteriell aktivitet mot gramnegative bakterier og/eller for evnen til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor et antibakterielt middel og utvelge forbindelser som har antibakteriell aktivitet mot gramnegative bakterier eller som har evne til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor et antibakterielt middel.

Videre tilveiebringes i samsvar med foreliggende oppfinnelse et semisyntetisk polymyksinderivat som kan erholdes ved kjemisk eller enzymatisk behandling av naturlig forekommende polymyksiner henholdsvis oktapeptiner eller varianter av disse som er dannet av genetisk modifiserte organismer. Kjemisk behandling omfatter, men er ikke begrenset til, behandling med eddiksyreanhydrid, maursyre, hydrazin og oksalsyre. Enzymatisk behandling omfatter, men er ikke begrenset til, behandling med enzymer som polymyksindeacylase, fisin, papain, bromelain, subtilopeptidaser, subtilisin, kolistinhydrolase og nagarse.

Foretrukne forbindelser ifølge én utførelse er mindre kationiske enn naturlige polymyksiner eller oktapeptiner, har kun to (2) eller tre (3) positive ladninger og er:

(a) i stand til å inhibere veksten av Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa eller Acinetobacter baumannii og/eller å sensibilisere hvilken som helst av disse overfor antibiotika, og/eller

(b) mindre toksiske enn klinisk anvendte polymyksiner, vist i en dyremodell in vivo, og/eller

(c) mindre nefrotoksiske enn klinisk anvendte polymyksiner, vist i en dyremodell og/eller i en in vitro analyse som måler forbindelsenes affinitet overfor nyrestrukturer, og/eller

(d) i stand til å føre til mindre frigjøring av histamin fra vevene enn klinisk anvendte polymyksiner ved topisk tilførsel eller ved inhalering som en aerosol, og/eller

(e) farmakokinetisk mer fordelaktige, f.eks. ved å ha en lengre halveringstid i serum og/eller ved å inaktiveres i mindre grad enn klinisk anvendte polymyksiner av polyanioniske bestanddeler av vev og puss.

Fremgangsmåter for syntese av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til de påfølgende fremgangsmåtene som beskrives nedenfor. For syntese av en spesifikk forbindelse vil en ekspert innen faget kunne utvelge en egnet fremgangsmåte.

1. Semisyntetiske derivater av polymyksiner og oktapeptiner som bærer en uladd heptapeptiddel og en modifisert acyl-aminoacylsidekjede kan fremstilles ved fremgangsmåtene som kan beskrives som følger:

Beskyttelse av de frie aminogruppene i utgangsmaterialet (polymyksin eller oktapeptin eller modifikasjoner av disse) ved fremgangsmåter som er kjent blant fagfolk. Beskyttelsen kan oppnås ved anvendelse av grupper som t-butoksykarbonyl (tBoc), fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc), benzyloksykarbonyl (CBZ, Z), allyloksykarbonyl (ALOC), 3-pyridyl-N-oksid-metoksykarbonyl (som beskrevet i patentskriftet GB 1323962), ved anvendelse av Schiffs baser, f.eks. benzaldehyd, ved fremgangsmåten som beskrives i japansk patentskrift nr. 7115630/1971, eller lignende som kan fjernes ved konvensjonelle betingelser som er forenlige med produktets egenskaper.

Under betingelser hvor den lave løselighet i vann kan by på et problem i de påfølgende trinn kan beskyttelsen innføres ved anvendelse av negativt ladde blokkeringsgrupper, f.eks. et sulfonsyrederivat av Fmoc eller et karboksylsyrederivat av Fmoc, hvor fremgangsmåten beskrives i US patentsøknad nr. 2006004185. Løseligheten i vann kan også økes ved å koble en egnet, fjernbar, negativt ladd og svært hydrofil blokkeringsgruppe til OH-gruppen til treonin.

Deretter behandles forbindelsen enzymatisk med enzymer som polymyksindeacylase, polymyksinhydrolase, papain, ficin, bromelain, subtilopeptidase, nagarse eller andre enzymer som fjerner en endedel fra sidekjeden eller til og med hele sidekjeden i polymyksin- eller oktapeptinforbindelser. Denne behandlingen kan om ønskelig følges av degraderingsfremgangsmåten til Edman. Den resulterende forbindelse mangler hele sidekjeden og består kun av den sykliske heptapeptiddel, men har en fri N-terminal alfa-aminogruppe.

Alternativt kan polymyksiner og oktapeptiner som har aminogrupper som er beskyttet med benzyloksykarbonyl behandles med oksalsyre eller maursyre for dannelse av beskyttede deacylderivater, hvor fremgangsmåten beskrives av Kurihara et al. (1974). Fremgangsmåten følges av videre enzymbehandling som ovenfor og/eller ved Edman-degradering for erholdelse av et heptapeptid.

Deretter kobles en egnet gruppe til den frie alfa-aminoposisjonen i heptapeptidringdelen. Gruppen kan inneholde en acylrest eller en beslektet rest, så vel som eventuelle aminosyrerester, fortrinnsvis opptil tre aminosyrerester. F.eks. kan en semisyntetisk forbindelse med en acylgruppe og to aminosyrerester fremstilles ved å addere til det ovenfor beskrevne heptapeptid en syntetisk N-(acyl)-treonyl-Dtrenoyl-rest. Dette kan oppnås ved konvensjonelle, generelle teknikker som er kjent blant fagfolk innen organisk kjemi, hvor disse teknikkene omfatter anvendelse av N-hydroksysuksinimidtilkoblede aminosyrerester som beskrevet i US patentsøknad nr. 2006004185. I denne spesielle syntesen kan fremgangsmåten omfatte anvendelse av 2-N-(n-oktanoyl)-threonyl-Dthreonyl-N-hydroksysuksinimid.

2. Acylerte polymyksin-nonapeptider som bærer tre (3) frie aminogrupper.

Polymyksin D har kun fire (4) positive ladninger. De frie aminogruppene i polymyksin D beskyttes ved hjelp av midlene som er beskrevet ovenfor. Dette følges av en enzymatisk behandling og et valgfritt Edman-degraderingstrinn for erholdelse av et nonapeptid, som så kan acyleres med acylisotiocyanat (ifølge fremgangsmåten som er velkjent blant fagfolk og som beskrives i US patentskrift nr. 2006004185), med acylklorid (ifølge fremgangsmåten som er velkjent blant fagfolk og som beskrives i Chihara et al.1974) eller ved anvendelse av grupper koblet til N-hydroksysuksinimid (ifølge fremgangsmåten som er velkjent blant fagfolk og som beskrives i US patentskrift nr. 2006004185). Endelig fjernes beskyttelsesgruppene.

På analog måte kan acylert polymyksin S-nonapeptid og acylert polymyksin F-nonapeptid fremstilles. Begge har kun tre (3) frie aminogrupper.

3. Acylerte polymyksin- og oktapeptinheptapeptider. Heptapeptider kan fremstilles ved nagarse-behandling av de naturlige forbindelsene som beskrevet av Kimura et al. 1992. Alternativt kan de fremstilles ved behandling med andre enzymer, f.eks. polymyksinacylase, polymyksinhydrolase, fisin, papain, bromelain og subtilopeptidase, fulgt av eventuelle Edman-degraderingstrinn. De kan også fremstilles ved deacylering av de naturlige forbindelsene med hydrazin eller syrer, f.eks. maursyre og oksalsyre, fulgt av Edman-degraderingstrinn. Heptapeptidet kan så acyleres, f.eks. ved anvendelse av acylkloridteknikken som er velkjent blant fagfolk og som beskrives i Chihara et al. (1974). Det acylerte polymyksinheptapeptid bærer kun tre (3) frie aminogrupper.

4. Fullt ut syntetiske polymyksin- og oktapeptinderivater kan fremstilles ved de svært konvensjonelle fremgangsmåtene som er kjent blant fagfolk. Slike fremgangsmåter omfatter syntese i væskefase, så vel som fremgangsmåtene for syntese i fast fase som f.eks. beskrives av Sakura et al. (2004), Tsuberi et al.

(2000a, 2000b, 2002, 2005) og Ofek et al. (2004). Fremgangsmåtene omfatter f.eks. anvendelse av beskyttelsesmidler som Fmoc, tBoc og CBZ i strategiske posisjoner, så vel som sykliseringstrinnet hvor DPPA (difenylfosforazidat) eller en blanding av benzotrizol-1-yl-oksy-tris-pyrrolidinofosfoniumheksafluorfosfat (PyBop), N-hydroksybenzotriazol (HoBt), og N-metylmorfolin (NMM) anvendes. Fmocderivater av mange ikke-trivielle aminosyrer så vel som av D-aminosyrer er kommersielt tilgjengelige.

5. Eksempler på reaksjoner som er forbundet med omdanning av de frie aminogruppene for fremstilling av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse med to eller tre positive ladninger kan omfatte (men er ikke begrenset til) følgende reaksjoner:

A) reaksjon mellom en fri aminogruppe i forbindelsen med en konjugasjonsgruppe som omfatter en reaktiv epoksidgruppe, slik at det dannes en βhydroksyaminbinding,

B) reaksjon mellom en fri aminogruppe i forbindelsen og en konjugasjonsgruppe som omfatter et reaktivt sulfonylhalid, slik at det dannes en sulfonamidbinding,

C) reaksjon mellom en fri aminogruppe i forbindelsen og en konjugasjonsgruppe som omfatter en reaktiv karboksylsyre, slik at det dannes en aminbinding,

D) reaksjon mellom en fri aminogruppe i forbindelsen og en konjugasjonsgruppe som omfatter en reaktiv aldehydgruppe (under reduserende betingelser), slik at det dannes en aminbinding,

E) reaksjon mellom en fri aminogruppe i forbindelsen og en konjugasjonsgruppe som omfatter en reaktiv ketongruppe (under reduserende betingelser), slik at det dannes en aminbinding,

F) reaksjon mellom en fri aminogruppe i forbindelsen og en konjugasjonsgruppe som omfatter en reaktiv isocyanatgruppe, slik at det dannes en ureabinding.

Referanseliste

Alle referanser som siteres i den foreliggende patentsøknad inkorporeres heri ved referanse i sin helhet.

Chihara S, Tobita T, Yahata M, Ito A, Koyama Y. 1973. Enzymatic degradation of colistin. Isolation and identification of α-N-Acyl α,γ-diaminobutyric acid and colistin nonapeptide. Agr Biol Chem 37:2455-2463.

Chihara S, Ito A, Yahata M, Tobita T, Koyama Y. 1974. Chemical synthesis, isolation and characterization of α-N-fattyacyl colistin nonapeptide with special reference to the correlation between antimicrobial activity and car-bon number of fattyacyl moiety. Agric Biol Chem 38:521-529.

Kimura Y, Matsunaga H, Vaara M.1992. Polymyxin B octapeptide and polymyxin B heptapeptide are potent outer membrane permeability-increasing agents. J Antibiot 45:742-749.

Kurihara T, Takeda H, Ito H, Sato H, Shimizu M, Kurosawa A. 1974. Studies on the compounds related to colistin. IX. On the chemical deacylation of colistin and colistin derivatives. Yakugaku Zasshi 94:1491-1494.

Nagai J, Saito M, Adachi Y, Yumoto R, Takano M. 2006. Inhibition of gentamicin binding to rat renal brush-border membrane by megalin ligands and basic peptides. J Control Release 112:43-50.

Nikaido H. 2003. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. Microbiol Molec Biol Rev 67:593-656.

Nikaido H, Vaara M. 1985. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol Rev 49:1-32.

Rose F, Heuer KU, Sibelius U, Hombach-Klonisch S, Ladislau K, Seeger W, Grimminger F. 1999. Targeting lipopolysaccharides by the non-toxic polymyxin B nonapeptide sensitizes resistant E. coli to the bactericidal effect of human neutrophils. J Infect Dis 182:191-199.

Sakura N, Itoh T, Uchida Y, Ohki K, Okimura K, Chiba K, Sato Y, Sawanishi H. 2004. The contribution of the N-terminal structure of polymyxin B peptides to antimicrobial and lipopolysaccharide binding activity. Bull Chem Soc Jpn 77:1915-1924.

Srinivasa BD, Ramachandran LK. 1978. Chemical modification of peptide antibiotics: Part VI - Biological activity of derivatives of polymyxin B. Ind J Biochem Biophys 14:54-58.

Srinivasa BD, Ramachandran LK. 1979. The polymyxins. J Scient Industr Res 38:695-709.

Srinivasa BD, Ramachandran LK. 1980. Essential amino groups of polymyxin B. Ind J Biochem Biophys 17:112-118.

Storm DR, Rosenthal KS, Swanson PE. 1977. Polymyxin and re-lated peptide antibiotics. Annu Rev Biochem 46:723-63.

Teuber M. 1970. Preparation of biologically active mono-N-acetyl(14C)-derivatives of the membrane-specific polypeptide antibiotic polymyxin B. Z Naturforsch 25b:117.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Fridkin M. 2000a. Structure-function studies of polymyxin B nonapeptide: Implications to sensitization of Gram-negative bacteria. J. Med Chem 43:3085-3092.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Fridkin M. 2000b. The functional association of polymyxin B with bacterial lipopolysaccharide is stereospecific: Studies on polymyxin B nonapeptide. Biochemistry 39:11837-11844.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Fridkin M. 2001. N-terminal modifications of polymyxin B nonapeptide and their effect on antibacterial activity. Pep-tides 22:1675-1681.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Eisenstein M, Fridkin M. 2002. Modulation of the hydro-phobic domain of polymyxin B nonapeptide: effect on outer-membrane permeabilization and lipopolysaccharide neutralization. Molecular Pharmacology 62:1036-42.

Tsubery H, Yaakov H, Cohen S, Giterman T, Matityahou A, Fridkin M, Ofek I. 2005. Neopeptide antibiotics that function as opsonins and membranepermeabilizing agents for gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 49:3122-3128.

Vaara M. 1992. Agents that increase the permeability of the outer membrane.

Microbiol Rev 56:395-411.

Vaara M. 1993. Antibiotic-supersusceptible mutants of Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Antimicrob Agents Chemother 37:2255-2260.

Vaara M, Vaara T. 1983a. Sensitization of Gram-negative bacteria to antibiotics and complement by a nontoxic oligopeptide. Nature (London) 303:526-528.

Vaara M, Vaara T. 1983b. Polycations sensitize enteric bacteria to antibiotics.

Antimicrob Agents Chemother 24:107-113.

Vaara M, Vaara T. 1983c. Polycations as outer membrane-disorganizing agents. Antimicrob Agents Chemother 24:114-122.

Vaara M, Viljanen P, Vaara T, Mäkelä P. 1984. An outer membrane disorganizing peptide PMBN sensitizes E. coli strains to serum bactericidal action. J Immunol 132:2582-2589.

Viljanen P, Matsunaga H, Kimura Y, Vaara M.1991. The outer membrane permeability-increasing action of deacylpolymyxins. J Antibiotics 44:517-523.

EKSEMPLER

De påfølgende eksemplene illustrerer visse utførelser av den foreliggende oppfinnelse og skal ikke oppfattes som begrensende for oppfinnelsens omfang.

Eksempel 1.

Peptidsyntese

Polymyksinderivater (”NAB-peptider” eller ”NAB-forbindelser”) ble syntetisert ved konvensjonell fast fase kjemi ved anvendelse av standard Fmoc-beskyttelsesstrategi. Aminosyren i C-enden er kommersielt tilgjengelig allerede festet til den faste fasen og danner når den spaltes fra resinet med syre en C-terminal karboksylsyre.

Strategien i beskyttelsen var å anvende tre nivåer av ortogonal beskyttelse, tidsbegrenset Fmoc-beskyttelse av alfa-aminogruppene, grupper som fjernes under syrekløyvingstrinnet, og semipermanent beskyttelse for å beskytte reaktive sidekjedegrupper mens sykliseringsreaksjonen finner sted. Etter avkløyving av peptidet fra resinet får den frie C-terminale karboksylsyre reagere med en aminogruppe i sidekjeden til én av aminosyrene, slik at det dannes et sykli sk peptid. Etter sykliseringstrinnet fjernes de semipermanente beskyttelsesgruppene for erholdelse av NAB-peptid.

Følgelig ble aminosyrens alfa-aminogruppe beskyttet med fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc), og Fmoc ble fjernet ved hjelp av 20 % piperidin i DMF for hver syklus. Aminosyren som deltar i sykliseringen, f.eks. diaminosmørsyre, ble beskyttet med t-butoksykarbonyl (tBoc), en syrelabil gruppe som ble fjernet i avkløyvingstrinnet. Alle de andre aminosyrene med funksjonelle grupper i sidekjeden ble beskyttet med en gruppe som er stabil under syrekløyvingstrinnet, dvs. benzyloksykarbonyl (Z). Aminosyrene fenylalanin og leucin har av naturlige grunner ikke behov for sidekjedebeskyttelse. Aminoenden var ubeskyttet, dette tillot en direkte reaksjon i acyleringsfremgangsmåten.

Syntesetrinnene ble utført i et kommersielt, automatisert synteseinstrument som benyttet O-(6-klorbenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HCTU) som aktivator.

6-metylheptansyre (6-MHA) var fra Ultra Scientific Inc., North Kingstown, RI, USA (produktnr. FLBA 002). Andre fettsyrer var fra en standard leverandør.

Acyleringen ble utført ved anvendelse av et fire gangers molart overskudd av hver aminosyre eller fettsyren, et fire gangers molart overskudd av aktivatoren HCTU (se ovenfor) og et åtte gangers molart overskudd av N-metylmorfolin. Reaksjonstiden var 30 min.

Aminosyrene ble erholdt i allerede beskyttet tilstand fra en standard leverandør. Peptidet ble fjernet fra resinet ved reaksjon med en løsning av 95 % trifluoreddiksyre og 5 % vann i 2 timer ved romtemperatur for erholdelse av det delvis beskyttede produkt. Det resulterende peptid ble utfelt med dietyleter.

Den benyttede sykliseringsblanding var benzotriazol-1-yl-oksy-tris-pyrrolidinofosfoniumheksafluorfosfat (PyBop), N-hydroksybenzotriazol (HoBt) og N-metylmorfolin (NMM) i et molart overskudd på 2, 2 henholdsvis 4. Peptidet ble løst i dimetylformamid, og sykliseringsblandingen ble tilsatt og fikk reagere i 2 timer. Det sykliserte, beskyttede peptid ble utfelt ved tilsetning av kald dietyleter.

Gjenværende PyBop ble fjernet ved vask av peptidet med vann.

De gjenværende beskyttelsesgruppene (Z) i sidekjedene ble fjernet ved katalytisk dehydrogenering. Peptidet ble løst i eddiksyre-metanol-vann (5:4:1) under hydrogenatmosfære og i nærvær av en palladium-trekull-katalysator.

Peptidet ble renset ved revers fasekromatografi ved anvendelse av konvensjonelle gradienter av acetonitril:vann:trifluoreddiksyre. Produktet ble tørket ved frysetørking.

Utbyttet var 20-40 mg, som utgjør tilnærmet 20 %-40 % av det teoretiske utbyttet, beregnet ut fra den molare mengde (tilnærmet 100 mikromol) av den første aminosyrerest som var bundet til resinet.

Renheten, estimert ved revers fase-HPLC, var høyere enn 95 %. For acylerte peptider viste Edman-degraderingsproduktet ingen aminosyrerest, noe som viser at α-aminogruppen i den N-terminale aminosyrerest som ventet var blokkert grunnet vellykket N-acylering. Innenfor den eksperimentelle feil var de erholdte masser som forventet ut fra de teoretiske verdiene.

Eksempel 2.

Direkte antibakteriell aktivitet av forbindelsene mot E. coli

Peptider syntetisert i eksempel 1, alle med minst to (2), men ikke flere enn tre (3) positive ladninger, ble undersøkt for evne til å inhibere veksten av E. coli. Dette ble analysert ved benyttelse av LB-agar (LB Agar Lennox, Difco, BD, Sparks, MD, USA)-skåler. Indikatororganismen E. coli IH3080 (K1:O18) var en innkapslet stamme som opprinnelig ble isolert fra et nyfødt barn med meningitt (Vaara et al.

1984) og ble erholdt fra det Nasjonale Institutt for Folkehelse, Helsinki, Finland.

Fra en over natts kultur av IH3080 på LB-agar ble en suspensjon av tilnærmet 10<8>celler/ml fremstilt i 0,9 % NaCl. Uttak av denne suspensjonen ble så pipettert over på agarskålene, og skålene ble forsiktig omrystet for jevn spredning av suspensjonen over hele overflaten av platen. Deretter ble den ikke-absorberte delen av suspensjonen fjernet ved anvendelse av en pasteurpipette. Etter tørking av overflaten ble små brønner (diameter 2 mm) utboret i skålene (5 brønner pr. skål) ved anvendelse av et sterilt, tynt metallrør med skarp kant, en pipettespiss for én gangs bruk og vakuumsug. En alternativ fremgangsmåte benyttet en vattpinne for å spre inoculumet. Prøver (4 μl og 10 μl) av peptidløsningen i 0,9 % NaCl (i en konsentrasjon på 1 μg/ml og 0,1 μg/ml) ble så pipettert over i brønnene, og prøvevæsken fikk absorberes. Kontrollene omfattet 0,9 % NaCl-løsning uten analyseforbindelse. Skålene ble så inkubert i 18 timer ved 37<o>C, hvoretter diameteren av vekstinhiberingssonene rundt hver brønn ble målt, selve brønnens diameter var ikke redusert. Endelig ble diameterne omregnet til overflateareal for vekstinhibering (i kvadrat mm).

Tabell 2 viser derivatenes antibakterielle aktivitet mot E. coli i HT3080, sammenlignet med aktiviteten av en lik mengde polymyksin B, så vel som aktiviteten av noen polymyksinderivater som ikke er forbundet med den foreliggende oppfinnelse. NAB 734, NAB737, NAB739 og NAB740 var de mest antibakterielle forbindelsene, og var til og med mer antibakterielle enn polymyksin B mot E. coli IH3080. en brønn som inneholdt 4 μg NAB739 ga et vekstinhiberingsområde som var på hele 133 mm<2>. I alle disse fire NAB-forbindelsene består sidekjeden av to aminoacylrester som bærer hydroksylgrupper.

I motsetning til NAB739 var NAB7061 ikke antibakterielt i en mengde på 4 μg. Forbindelsen viste imidlertid merkbar antibakteriell aktivitet i en mengde på 10 μg. NAB7061 skiller seg fra NAB739 kun ved at forbindelsen har Abu (i stedet for DSer) i R3. Forlengelsen av fettsyredelens lengde fra fettet i en lengde fra C8 i NAB761 til C10 i NAB7062 førte til en merkbart forhøyet antibakteriell aktivitet som viste seg ved 4 μg. I tillegg viste tre andre peptider (NAB738, NAB716 og NAB719) merkbar antibakteriell aktivitet, om enn klart svakere enn NAB739 og de andre mest antibakterielle forbindelsene.

En felles egenskap for forbindelsene som er direkte antibakterielle overfor E. coli var nærværet av tre positive ladninger, av hvilke enten alle tre eller i det minste to forelå i egnede posisjoner i den sykliske delen. I det siste tilfellet påvirket ladningenes relative posisjoner i signifikant grad styrken av den antibakterielle aktiviteten mot E. coli.

Videre har, som vist i tabell 2, også sidekjedens struktur og lengde en signifikant virkning på graden av antibakteriell aktivitet. Nærvær av en sidekjede som består av minst to aminoacylrester ser ut til å være viktig for forbindelsene som er antibakterielle mot E. coli, siden forbindelsene som enten mangler R2 (NAB713) eller både R2 og R3 (oktanoyl-PBHP) også manglet den direkte antibakterielle aktivitet under betingelsene som ble anvendt i analysen. Det forventes imidlertid at mangelen på disse aminosyrerestene kan kompenseres ved å anvende en mer forlenget gruppe enn en oktanoylgruppe som R(FA).

Tabell 2

Strukturen av forbindelsene og deres antibakterielle aktivitet* mot Escherichia coli IH3080

<* Antibakteriell aktivitet målt som vekstinhibering (i kvadratmillimeter) rundt en brønn som inneholder 4>eller 10 mikrogram av en forbindelse på LB-skåler

**Enbokstavkoder for aminoacylrester: A, Ala, F, Phe, K, Lys, L, Leu, S, Ser, T, Thr, X, Dab, Z, Abu, B, N -γ-formyl-Dab, J, N- γ-acetyl-Dab. Understrekede bokstaver angir aminosyrerester som foreligger i D-konfigurasjon. Uthevet skrift angir aminosyrerester som bærer en positiv ladning. Et uthevet plusstegn viser<den positive ladning til α-aminogruppen i peptidets frie N-ende. Forkortelse: cy, syklo.>

***I sekvenslisten er X, Z, B, J og aminosyrer i D-konfigurasjon angitt som Xaa og definert som modifiserte aminosyrerester (MOD_RES).

Eksempel 3.

Direkte antibakteriell aktivitet av utvalgte NAB-forbindelser mot Acinetobacter baumannii og Pseudomonas aeruginosa

Direkte antibakteriell aktivitet av tolv NAB-forbindelser mot Acinetobacter baumannii ATCC 19606 og Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ble analysert ved anvendelse av fremgangsmåten for bestemmelse av følsomhet som beskrives i eksempel 2. Resultatene vises i tabell 3. Fem forbindelser (NAB7062, NAB734, NAB737, NAB739 og NAB740) hadde påvisbar aktivitet mot A. baumannii. I eksempel 2 ble de samme forbindelsene vist å være svært aktive mot E. coli. Den antibakterielle aktivitet av NAB739 og NAB740 var like sterk, om ikke sterkere enn aktiviteten av polymyksin B.

Mot P. aeruginosa var de mest aktive NAB-forbindelsene NAB739, NAB740 samt NAB836, som er fullstendig inaktiv mot E. coli og Acinetobacter baumannii.

NAB740 var den mest aktive forbindelsen, og aktiviteten var like sterk som aktiviteten av polymyksin B. Alle de tre NAB-forbindelsene mangler positive ladninger i sidekjeden og var fortsatt aktive mot P. aeruginosa. Dette funn strider med konklusjonen til Srinivasa og Ramachandran (1980a) om at de frie aminogruppene i R1 og R3 er avgjørende for vekstinhibering av P. aeruginosa.

Overraskende nok er NAB736 temmelig effektiv mot P. aeruginosa, mens oktanoyl-PMBH er mye mindre effektiv. Følgelig har en forlenging av R(FA)-delen fra C8-C10 en markant virkning på aktiviteten.

Tabell 3

Antibakteriell aktivitet* av tolv (12) nye forbindelser mot Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa

g p

Eksempel 4

Direkte antibakteriell aktivitet av NAB734 mot utvalgte gramnegative bakterier

Elleve gramnegative bakteriestammer (ni forskjellige arter) følsomhet overfor NAB734 og polymyksin B ble sammenlignet ved anvendelse av fremgangsmåten for bestemmelse av følsomhet som er beskrevet i eksempel 2. Stammene omfattet stammer som tilhørte artene Serratia marcescens og Proteus mirabilis, som begge generelt vites å være resistente overfor polymyksin. Videre ble bestemmelsen av følsomhet også utført ved anvendelse av den grampositive bakterie Staphylococcus aureus, som også generelt vites å være polymyksinresistent. Ti av stammene kom fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) og én fra CCUG (kultursamlingen til Gøteborg universitet, Sverige). Kilden til E. coli IH3080 er beskrevet i eksempel 2. Polymyksin B-sulfat var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Resultatene i tabell 4 viser at NAB734 generelt kan anses som å være tilnærmet like aktiv som polymyksin B mot E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae og Citrobacter freundii. Forbindelsen ser ut til å være noe mindre aktiv enn polymyksin B mot Acinetobacter baumanni og åpenbart mindre aktiv enn polymyksin B mot Pseudomonas aeruginosa. Representanter for kjente polymyksinresistente bakteriearter var også resistente overfor NAB734. Dette tyder på at NAB734 har en svært spesifikk antibakteriell virkning og at virkningsmåten i stor grad ligner på virkemåten til polymyksin B.

Tabell 4

Antibakteriell aktivitet* av NAB734 mot utvalgte gramnegative bakterier og Staphylococcus aureus

Eksempel 5.

NAB-forbindelsenes evne til å sensibilisere E. coli IH3080 overfor et modellantibiotikum, rifampin

Nye NAB-peptider ifølge foreliggende oppfinnelse som alle bar minst to (2), men ikke flere enn tre (3) positive ladninger, ble også undersøkt for evne til å sensibilisere E. coli IH3080 overfor rifampin. Dette ble analysert i parallell med bestemmelsene av følsomhet som er beskrevet i eksempel 2 og ved benyttelse av LB-skåler som inneholdt økende konsentrasjoner (0,1 μg/ml, 0,3 μg/ml, 1 μg/ml) av rifampin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Tabell 5 viser aktiviteten av NAB-forbindelsene (4 μg) mot E. coli IH3080 i nærvær av rifampin (0,1 og 1 μg/ml), sammenlignet med aktiviteten av en tilsvarende mengde av tidligere beskrevne forbindelser som vites å sensibilisere gramnegative bakterier overfor antibakterielle midler, dvs. polymyksin B-heptapeptid, deacylpolymyksin B, deacylcolistin, polymyksin B-nonapeptid samt polymyksin B. Forbindelsene omfattet også oktanoyl-PMBH, et middel som tidligere ikke har blitt rapportert å kunne sensibilisere bakterier overfor antibiotika.

Flere NAB-forbindelser sensibiliserte E. coli IH3080 overfor den antibakterielle virkningen av en rifampinkonsentrasjon ned til 0,1 μg/ml. I fravær av de analyserte forbindelsene var det nødvendig med en hundre ganger høyere konsentrasjon (10

μg/ml) av rifampin for den inhiberende virkning. Flere forbindelser som manglet en merkbar, direkte antibakteriell aktivitet i en mengde på 4 μg kunne sensitivitere målbakterien overfor rifampin. Slike forbindelser omfattet NAB7061, NAB717, NAB718 og NAB733.

Videre inhiberte de fleste av NAB-forbindelsene som hadde direkte antibakteriell aktivitet, dvs. antibakteriell aktivitet i fravær av rifampin (se eksempel 2), målbakterien enda mer effektivt i nærvær av rifampin. Evnen til de mest aktive forbindelsene, NAB734, NAB737, NAB738 og NAB739, var åpenbart enda bedre enn evnen til PMBN, den velkjente, effektive forbindelse for permeabilisering av OM.

De mest aktive NAB-forbindelsene bærer tre (3) positive ladninger og har minst to (2) positive ladninger plassert på egnet vis i den sykliske del, hvor den relative plassering av disse påvirker graden av sensibiliserende aktivitet. Det bør imidlertid bemerkes at NAB716, som kun bærer to positive ladninger i den sykliske del og som har den tredje positive ladningen i form av en DAB-rest i R3, i påvisbar grad kan sensibilisere E. coli overfor rifampin.

Blant serien av forbindelser med en oktanoylrest som R(FA) hadde oktanoyl -PMHP, som mangler både R2 og R3, den laveste sensibiliserende aktivitet, mens NAB713, som mangler R2, hadde en noe bedre aktivitet og NAB7061, som har både R2 og R3, hadde en bemerkelsesverdig aktivitet. Dette viser at nærvær av R2 og R3 er fordelaktig. Fraværet av disse kan imidlertid i det minste delvis kompenseres ved å forlenge R(FA)-delen, som i NAB736. Denne forbindelsen har en dekanoylrest som R(FA)-delen, mangler både R2 og R3 og er temmelig aktiv som en sensibiliserende forbindelse.

NAB-forbindelser som har begge sine to (2) positive ladninger i den sykliske del var mindre aktive enn de ellers strukturelt analoge NAB-forbindelsene som har alle sine tre (3) positive ladninger i den sykliske del, eller, for én forbindelse (NAB708), uten aktivitet under de benyttede betingelser.

NAB-forbindelser som bærer to (2) positive ladninger i sidekjeden og én (1) positiv ladning i den sykliske del har svært moderat, om noen aktivitet under de benyttede betingelser. NAB735, som har alle sine tre (3) positive ladninger i sidekjeden, er innaktiv under de benyttede betingelser. Igjen påvirket ladningenes relative posisjoner i den sykliske del graden av sensibiliserende aktivitet.

Tabell 5

Antibakteriell aktivitet av forbindelsene (4 μg) mot E. coli IH3080 i nærvær av rifampin*

*Antibakteriell aktivitet målt som vekstinhibering (i kvadratmillimeter) rundt en brønn inneholdende 4 μg av en forbindelse i plater uten rifampin eller med rifampin (0,1 eller 1 μg/ml)

**Verdien i parentes ble erholdt ved anvendelse av en brønn som inneholdt 10 μg av forbindelsen

Eksempel 6.

NAB-forbindelsenes evne til å sensibilisere Acinetobacter baumannii og Pseudomonas aeruginosa overfor et modellantibiotikum, rifampin

NAB-peptider forbundet med den foreliggende oppfinnelse ble også undersøkt for evne til å sensibilisere A. baumannii og P. aeruginosa overfor rifampin (tabell 6).

Dette ble analysert i parallell med bestemmelsene av følsomhet som er beskrevet i eksempel 3 og ved benyttelse av LB-skåler som inneholdt økende konsentrasjoner (0,1 μg/ml, 0,3 μg/ml, 1 μg/ml) av rifampin.

Flere NAB-forbindelser hadde en svært markant evne til å sensibilisere A. baumannii overfor rifampin. Evnen til de mest aktive forbindelsene, NAB734, NAB737 og NAP739, var åpenbart enda bedre enn evnen til PMBN, den velkjente og effektive forbindelse for permeabilisering av OM. NAB739 inhiberte veksten av P. aeruginosa noe bedre i nærvær enn i fravær av rifampin.

Tabell 6

Antibakteriell aktivitet av tolv (12) nye forbindelser (4 μg) mot Acinetobacter baumannii og Pseudomonas aeruginosa i nærvær av rifampin (0,1 eller 0,3 μg/ml)

*Antibakteriell aktivitet målt som vekstinhibering (i kvadratmillimeter) rundt en brønn inneholdende 4 μg av en forbindelse i skåler uten rifampin (kontroll) eller med rifampin (0,1 eller 0,3 μg/ml)

Eksempel 7.

NAB7061 sensibiliserer E. coli, Klebsiella pneumoniae, og Enterobacter cloacae overfor et bredt utvalg av antibakterielle midler

Den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) for et representativt sett av klinisk anvendte antimikrobielle midler ble bestemt for to stammer av E. coli (ATCC25922 og IH3080), K. pneumoniae ATCC13883 og E. cloacae ATCC23355 ved anvendelse av Mueller-Hinton-agarmedium (produkt nr. LabO39, LabM Ltd., Bury, Lances, UK) i nærvær av NAB7061 (4 μg/ml) så vel som i fravær av oppfinnelsen. MIC ble bestemt ved anvendelse av E-strimler (Biodisk Ltd. Solna, Sverige) ifølge produsentens instruksjoner. Den benyttede NAB7061-konsentrasjonen inhiberte ikke alene vekten av målbakteriene. MIC for NAB7061 for E. coli IH3080 og K.

pneumoniae ATCC1388 var > 16 μg/ml, for E. coli ATCC25922 16 μg/ml og for E. cloacae ATCC23355 8 μg/ml.

Resultatene vises i tabell 7. NAB7061 i en konsentrasjon på 4 μg/ml kunne sensibilisere de analyserte stammene overfor rifampin med en faktor som varierte fra 170-1500. Sensibiliseringsfaktor er definert som forholdet mellom MIC for et antibiotikum i fravær av NAB7061 og MIC i nærvær av 4 μg/ml NAB7061.

Ekstremt høye sensibiliseringsfaktorer ble også observert for klaritromycin (63-380), mupirosin (24-512), azitromycin (31-94), erytromycin (21-48) og, for noen av stammene, for fusidinsyre, kinupristin-dalfopristin, klindamycin, linezolid og vankomycin. Alle disse antibakterielle midlene er bemerkelsesverdig hydrofobe eller store (vankomycin) og vites å ekskluderes av intakt OM i gramnegative bakterier, men penetrere skadd OM. Ingen signifikant sensibilisering (sensibiliseringsfaktor < 2, analysert ved anvendelse av E. coli ATCC25922) ble funnet for piperacillin, ceftazidim, cefotaksim, levofloksasin, ciprofloksacin, meropenem og tobramycin, alle midler som er hydrofile eller relativt hydrofile og som intakt OM ikke er en effektiv permeabilitetsbarriere for.

Tabell 7

Sensibiliseringsfaktorer* for utvalgte antibakterielle midler ved en NAB7061-konsentrasjon på 4 μg/ml

*Sensibiliseringsfaktoren er forholdet mellom MIC for det angjeldende antibiotikum i fravær av NAB 7061 og MIC i nærvær av 4 μg/ml NAB 7061

**Resultater fra fem uavhengige bestemmelser

***Resultater fra to uavhengige bestemmelser

Eksempel 8.

Følsomheten av 33 forskjellige stammer av gramnegative bakterier overfor rifampin og klaritromycin i nærvær av NAB7061 (4 μg/ml)

Den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) av rifampin og klaritromycin for et representativt sett av forskjellige stammer av kliniske relevante gramnegative bakterier ble bestemt ved E-analysefremgangsmåten som i eksempel 7 og ved anvendelse av Mueller-Hinton-agar med eller uten NAB7061 (4 μg/ml). Denne konsentrasjonen av NAB7061 inhiberte ikke i seg selv veksten av målbakter iene. Stammene hadde sitt opphav hos ATCC (11 stammer), CCUG (11 stammer) og NCTC (The National Collection of Type Cultures, Colindale, UK, 2 stammer). Åtte stammer (F-stammene) ble erholdt fra Mobidiag Ltd., Helsinki, Finland. Kilden for E. coli IH3080 er gitt i eksempel 2. Sensibiliseringsfaktoren ble definert som i eksempel 7.

Resultatene vises i tabell 8. For alle stammer (17) som tilhørte gruppen som består av E. coli, K. oxytoca, E. cloacae og C. freundii var MIC av rifampin så lav som < 0,125 μg/ml i nærvær av NAB7061 (4 μg/ml), og sensibiliseringsfaktoren varierte fra 85-2000. Svært like resultater ble erholdt med klaritromycin. For femten av sytten stammer som tilhørte gruppen som består av E. coli, K. oxytoca, E. cloacae og C. freundii var MIC av klaritromycin så lav som < 0,25 μg/ml i nærvær av NAB7061 (4 μg/ml), og for alle de 17 stammene varierte sensibiliseringsfaktoren fra 90-1000. Stammer av K. pneumoniae var noe mer resistente overfor begge antibiotika, og sensibiliseringsfaktoren varierte mellom 10 og 500. For de tre stammene av A. baumannii varierte sensibiliseringsfaktoren mellom 24 og 125, og de resulterende MIC-verdiene var temmelig lave (for rifampin < 0,125 μg/ml og for klaritromycin < 0,5 μg/ml).

Tabell 8

Evnen til NAB 7061 til å sensibilisere gramnegative bakterier overfor modellantibiotika (rifampin og klaritromycin)

Eksempel 9.

NAB7061 sensibiliserer karbapenemresistente stammer av Acinetobacter overfor karbapenemer

Den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) av to karbapenemer, imipenem og meropenem, for tre stammer av A. baumannii ble bestemt ved E-analysefremgangsmåten som i eksempel 7 og ved anvendelse av Mueller-Hintonagar med eller uten NAB7061 (4 μg/ml). Denne konsentrasjonen av NAB7061 inhiberte ikke i seg selv veksten av målbakteriene. Sensibiliseringsfaktoren ble definert som i eksempel 7. Resultatene vises i tabell 9. NAB7061 sensibiliserte begge de karbapenemresistente stammene (F263, F264) overfor begge karbapenemer med en faktor > 4.

Tabell 9

Antibakteriell aktivitet av Acinetobacter baumannii-stammer overfor imipenem og meropenem i fravær av NAB7061 og i nærvær av NAB7061 (4 μg/ml)

Eksempel 10.

NAB7061 sensibiliserer E. coli overfor komplement i ferskt normalt serum Evnen til NAB7061 til å sensibilisere en innkapslet, glatt stamme av E. coli overfor den bakteriedrepende virkning av normalt marsvinserum (GPS) ble undersøkt ifølge fremgangsmåten som beskrives av Vaara et al. (1984). E. coli IH3080 (018, K1) ble dyrket i LB-medium (LB-medium Lennox, Difco, BD, Sparks, MD, USA) ved 37<o>C i en ristemaskin med roterende risting til den tidlige logaritmiske vekstfase, vasket med PBS (fosfatbufret saltvann, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4x 2H2O og 0,2 g KH2PO4pr. liter) og resuspendert i PBS til tilnærmet 10<9>celler/ml). GPS ble anvendt som komplementkilde. Serum ble lagret ved -70<o>C før anvendelse. For inaktivering av serum inkubert ved 56<o>C i 30 min.

Den eksperimentelle fremgangsmåte var som følger. 10 % GPS i PBS ble inokulert med tilnærmet 500 CFU (kolonidannende enheter) av bakterier pr. ml og overført i porsjoner på 0,2 ml til brønner i mikrotiterplater. Brønnene inneholdt allerede økende mengder av NAB7061 i 0,020 ml 0,9 % NaCl. Platen ble inkubert ved 37<o>C i 2 timer, hvoretter innholdet i hver brønn ble overført til LB-skåler. Skålene ble inkubert over natten ved 37<o>C, og de utviklede koloniene ble talt.

Resultatene vises i tabell 10. NAB7061 reduserte i seg selv ikke i signifikant grad CFU-tallet i fravær av GPS eller i nærvær av varmeinaktivert 10 % GPS. Imidlertid var en konsentrasjon av NAB7061 så lav som 2 μg/ml tilstrekkelig til å redusere CFU-tallet med en faktor på tilnærmet 100 i nærvær av 10 % ferskt GPS. Følgelig virker NAB7061 synergistisk med det bakteriedrepende komplementmaskineri som foreligger i friskt serum, i likhet med PMBN, et middel som er velkjent for å ha denne egenskap.

Tabell 10

Den synergistisk bakteriedrepende aktivitet av NAB7061 og 10 % marsvinserum (GPS) mot E. coli IH3080 (O18:K1)*

Eksempel 11.

Redusert affinitet av NAB7061 overfor brush-border-membranen (BBM) i nyrebark

Binding av forbindelsene ifølge oppfinnelsen til isolert brush-border-membran (BBM) fra nyrebark kan måles indirekte ved å måle evnen til å inhibere bindingen av radioaktivt merket gentamycin til BBM. Følgelig inhiberer forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som har lavere affinitet for BBM enn for polymyksin B bindingen av radioaktivt merket gentamycin i mindre grad enn polymyksin B gjør.

BBM ble isolert fra nyrebark fra albino-hannrotter ved anvendelse av Mg<2+>/EGTA-utfellingsteknikken som beskrevet av Nagai et al. (2006). Bindingen av gentamycin ble målt ifølge fremgangsmåten som beskrives av Nagai et al. (2006) ved å inkubere BBM-vesikler (20 μl) i 10 mM HEPES (pH 7,5) med 300 mM mi nærvær av 20 μM [<3>H] gentamycin (American Radiolabeld Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA)) med eller uten forbindelsen som skulle analyseres eller en positiv kontroll. Etter inkubering i 60 min. ved 4<o>C ble 1 ml iskald buffer som beskrevet ovenfor tilsatt, og blandingen ble filtrert gjennom et Millipore-filter (0,45 μm, HAWP). Filteret ble vasket med buffer, og gjenværende radioaktivitet i filteret ble målt ved anvendelse av en væskescintillasjonsteller. IC50-verdiene ble bestemt som i Nagai et al. (2006) ved anvendelse av Hill-ligningen.

IC50-verdiene ( μM) for den undersøkte NAB-forbindelse og kontrollene var som følger: 187,3 24,3 for NAB7061 (gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter, begge med tre parallelle bestemmelser), 39,3 5,5 for polymyksin B (gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter, hvert med tre parallelle bestemmelser) og 90,2 9,7 for umerket gentamycin (tre parallelle bestemmelser). Følgelig er affiniteten av NAB7061 for BBM bare tilnærmet halvparten av affiniteten av gentamycin for BBM og tilnærmet 1/5 av affiniteten av polymyksin B for BBM.

Eksempel 12.

Aktiviteten av NAB7061 i en eksperimentell E. coli-peritonittmodell i mus En suspensjon av E. coli IH3080 (K1:O18) i saltvann (0,9 % NaCl) ble fremstil t fra en over natts kultur på en blodagarskål (Statens Seruminstitutt, København, Danmark). Alle mus (NMR1-hunnmus fra Harlan Scandinavia, Allerød, Danmark, kroppsvekt 25-30 g) ble inokulert intraperitonealt med 0,5 ml av suspensjonen inneholdende 0,96 x 10<6>CFU pr. ml i den laterale, nedre kvadrant av buken. Etter 1 time ble CFU-tallet bestemt fra tre mus, og de gjenværende musene (4 mus pr. gruppe) ble behandlet med en subkutan injeksjon av 0,2 ml erytromycinløsning i saltvann (tilsvarende 5 mg/kg kroppsvekt), NAB7061-løsning i saltvann (tilsvarende 5 mg/kg kroppsvekt) eller både erytromycin og NAB7061 (tilsvarende 5 mg/kg kroppsvekt av begge medikamenter, tilført i 2 separate seter). Kontrollgruppen ble tilført to 0,2 ml injeksjoner av saltvann. 4,5 timer etter infeksjonen ble alle mus bedøvet med CO2og avlivet. Sterilt saltvann (2 ml) ble injisert intraperitonealt, og buken ble forsiktig massert før den ble åpnet og væsken oppsamlet. Egnede fortynninger av væsken ble utsådd på blodagarskåler, skålene ble inkubert over natten og koloniene ble talt.

1 time etter infeksjonen var CFU-tallet 0,74 (+ 0,7) x 10<6>pr. ml. 4,5 timer etter infeksjonen (tilsvarende 3,5 timer etter behandlingen) var CFU-tallet (pr. ml) 11,1 (+ 6,2) x 10<6>(kontrollgruppen), 8,9 (+ 6,4) x 10<6>(erytromycingruppen), 1,1 (+ 0,6) x 10<6>(NAB 7061-gruppen), og 2,1 (+ 1,2) x 10<6>(NAB pluss erytromycingruppen). Følgelig økte bakterietallet i fravær av NAB 7061 med en faktor på 15 (saltvannsgruppen) eller en faktor på 12 (erytromycingruppen), mens de tilsvarende faktorene i nærvær av NAB 7061 varierte fra 1,5-3.

Eksempel 13.

Toksisitetsundersøkelser av NAB7061

Toksisiteten i unge rotter (kroppsvekt tilnærmet 150 g ved undersøkelsens begynnelse) ble bestemt ved tilførsel av doser (1, 2, 4, 8, 16 og 32 mg/kg pr. dag) av NAB7061 samt kontrollforbindelsen polymyksin B intravenøst to (2) ganger daglig i to uker. En gruppe på ti (10) rotter ble undersøkt for hvert doseringsskjema. Kliniske observasjoner ble utført daglig, kroppsvekten ble målt to ganger i uken og fôrinntaket to ganger i uken. Mot slutten av uke 2 ble alle dyrene avlivet.

Kontrollforbindelsen, polymyksin B, påvirket kroppsvektsøkningen på negativ måte i en dose så lav som 1 mg/kg pr. dag, mens den laveste dosen av NAB7061 som hadde denne virkningen var 8 mg/kg. Polymyksin B førte til døden i en dose på 32 mg/kg pr. dag (100 % dødelighet), mens alle rotter som ble tilført NAB7061 levde gjennom hele undersøkelsen. Mot undersøkelsens avslutning var ureanitrogeninnholdet i blodet (BUN) 15 % høyere i gruppen som ble tilført 16 mg polymyksin/kg pr. dag enn i kontrollgruppen eller gruppen tilført en lav dose av polymyksin (1 mg/kg pr. dag). I gruppen som ble tilført NAB7061 i en dose på 16 mg/kg pr. dag ble ingen slik økning funnet, og i gruppen som ble tilført NAB7061 i en dose på 32 mg/kg pr. dag var økningen 7 %.

Histopatologisk analyse av nyrene ble utført for alle dyr og histopatologisk undersøkelse av alle vev utført for de tre høydosegruppene av NAB7061. Ingen NAB7061-relaterte patologiske funn ble observert ved generell patologisk analyse og histopatologisk analyse av organene eller ved histopatologisk analyse av nyrene fra dyr som var tilført NAB7061.