NO338185B1 - Fluorescensmåler - Google Patents

Abstract

I apparat eller anordning for produksjonen og detektering av fluorescens på en sample-overflate, er høyden til anordningen over sampleoverflaten redusert, og tap av den utsendte fluorescensen på grunn av refleksjonstap og lysspredning blir minimalisert. Anordningen omfatter en tredimensjonalt krummet lysreflekterende overflate (40) som retter lys fra en lyskilde (32) på tvers av dens opprinnelige bane og fokuserer lyset på en illuminasjonssone (30) på eller under sampleoverflaten. Den reflekterende overflaten (40) innsamler også, retter og minst delvis kollimerer emittert eller utsendt fluorescens på tvers av den opprinnelige banen og mot en detektor (46).

Description

Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg til fluorescensmålere som er en anordning for å produsere og måle fluorescens, enten ved bruk av intensitets- eller tidsbestemte målinger.

Epifluorescensmikroskoper har konvensjonelt et lineært optisk arrangement hvori en sampellokalisering, strålesplitter og detektor er anordnet adskilt, for eksempel vertikalt, langs en felles akse i en første retning, med en eksitasjonslyskilde av til en side. Dette arrangementet dikterer en minimum høydebegrensning for å tilveiebrineg rom for fluorescenslys utsendt fra en sampellokalisering for å bli kollimert av et linsesystem, sendt gjennom strålesplitteren, filtrert for å fjerne bølgelengder forskjellig fra den til fluorescensen og sluttlig å bli fokusert på detektoren. Slikt et konvensjonelt arrangement er illustrert på fig. 1 som beskrevet mer detaljert nedenfor. I fluorescens-applikasjoner er intensiteten til den utsendte fluorescensen vanligvis svak. Enn videre blir fluorescensen utsendt isotropisk eller i samsvar med et Lambertiansk strålings-mønster dersom fluoroforen befinner seg i et lysspredemedium slik som hud. I begge tilfeller øker den detekterte fluorescensen med den numeriske åpningen til det optiske systemet. I den vanlige epifluorescensoppstillingen blir en stor numerisk åpning normalt tilveiebrakt ved bruken av et antall linser, som innfører refleksjonstap og lysspredning selv med belagte linser.

Andre fluorometre som har kurvede reflektorer er vist i WO/03/002973 og US2001/033381.

Det ville være ønskelig å utvikle et alternativt generelt optisk arrangement med redusert kompleksitet som kan bli brukt for å redusere den nødvendige høyden til anordningen målt fra en samplelokalisering.

Følgelig tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen nå en anordning i henhold til krav 1.

Anordningen kan videre omfatte et eksitasjonsfilter som velger en eksitasjonsbølge fra lyset utsendt av lyskilden som skal passeres til reflektoren.

Anordningen kan videre omfatte et emisjonsfilter som velger en utsendt fluorescens-bølgelengde som skal passeres til detektoren.

Anordningen kan omfatte en linse som fokuserer fluorescenslys på detektoren. Alternativt kan et ytterligere fokuserende reflektivt grensesnitt bli brukt.

Det eller hvert reflektorgrensesnitt kan hovedsakelig ha formen av en delvis parabol, torisk, toroidal eller biokonisk overflate. Et slikt reflektorgrensesnitt kan være parabolsk, torisk, toroidal eller bikonisk overflate. Sfæriske overflater og toriske overflater slik som hyperbler, paraboler, ellipser og oblatelliptisk reflektorgrensesnitt kan defineres med en ligning

hvori:

c er fra 0,07 til 0,5 og k er fra -1,5 til -0,7, hvor z er "sigingen" av z-koordinat langs

rotasjonsaksen, c er kurvaturen (resiprok til radiusen R), k er den koniske konstanten og r den radiale koordinaten. Andre overflater kan bli beskrevet med tilsvarende ligninger som involverer en tilføyd Taylor rekkeutvidelse. Tilsvarende er ligninger tilgjengelige for toroider, for eksempel faseterte toroider, eller stykkevis lineære toroider og for bikoniske overflater.

Reflektorgrensesnittet til reflektoren som retter lyset til illuminasjonssonen kan innbefatte den del av en paraboloid, torisk, toroidal eller bikonisk overflate som er generert ved kuttingen av en paraboloid, torisk, toroidal eller bikonisk overflate av en rett sirkulær sylinder oppreist sentrert på illuminasjonssonen.

Reflektorgrensesnittet kan fortrinnsvis hovedsakelig ha formen som en del av en halv paraboloide.

Anordningen kan videre innbefatte et hus som inneholder lyskilden, reflektor og detektor og som har en basisoverflate som inneholder et vindu for å passere eksitasjonslys ut av huset og motta fluorescenslys inn i huset og som for inngrep i bruk mot overflaten hvorved eller under hvilken fluorescensen opptrer.

Lysbanen danner fortrinnsvis en vinkel på ikke mer enn 10 grader med et plan definert av basisoverflaten.

Oppfinnelsen er kjennetegnet ved de i patentkravene angitte trekkene.

Oppfinnelsen skal nå bli ytterligere beskrevet og illustrert med henvisning til de medfølgende tegningene, hvori: Fig. 1 er et skjematisk sideoppriss av en konvensjonell epifluorescensmåleanordning; Fig. 2 er en perspektivtegning av en første utførelse av anordningen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen; Fig. 3 er en illustrasjon som viser sonen av et parabolsk speil hvori mest energi blir oppsamlet når lys blir utsendt fra en overflate over hvilken speilet ligger; Fig. 4 er et planriss ovenfra av en andre utførelse i henhold til oppfinnelsen; Fig. 5 er en perspektivtegning av anordningen på fig. 4; Fig. 6 er et tverrsnitt på linjen VI-VI' markert på fig. 4; Fig. 7 viser en modifikasjon av anordningen på fig. 4; Fig. 8 viser en tredje utførelse i henhold til oppfinnelsen i plan ovenfra; Fig. 9 er en kurve over variasjonen i form av et parabolsk speil med den koniske konstanten; og Fig. 10 er en kurve som viser variasjonen i forholdet av detektert optisk effekt og illuminasjonseffekt med endrende konisk konstant.

En vanlig oppstilling for epifluorescensmåling er vist på fig. 1. Den er designet for å produsere og detektere fluorescens på en samplelokalisering 10, som kan for eksempel være på eller under overflaten til et legeme eller artikkel, for eksempel på et mikroskop-dia. Det er typisk at en slik overflate vil være horisontal og av hensiktsmessige grunner blir dette antatt i den følgende beskrivelsen av anordningen. En eksitasjonslyskilde 12, slik som en LED, er posisjonert av til en side av samplelokaliseringen 10 og i en høyde på over samplelokaliseringen. LED sender ut eksitasjonslys 16 som blir sendt gjennom et eksitasjonsfilter 14 for å velge en ønsket eksitasjonsbølgelengde. Eksitasjonslyset faller på en vinklet strålesplitter 18 slik som en parallellside dikroisk strålesplitter 18. En del av eksitasjonslyset blir reflektert med de rette vinkler mot samplelokaliseringen og passerer gjennom en fokuseringslinsesystem 20 som omfatter en eller flere eller sammensatte linser.

Fluorescens og reflektert eksitasjonslys slipper ut fra samplelokaliseringen og blir innfanget av linsesystemet 20 og kollimert inn i en parallell stråle som passerer gjennom strålesplitteren 18 til et emisjonsfilter 22, som ideelt fjerner alt uten fluorescensbølge-lengden, og derfra til et andre linsesystem 24 som fokuserer fluorescensen på en detektor 26. Slik som linsesystemet 20, kan linsesystemet 24 omfatte en eller flere enkle eller sammensatte linser.

Hele anordningen har en total høyde over samplen på h', som er rundt 3xh.

Det har blitt foreslått å overvåke konsentrasjoner av kjemiske arter i menneske- eller dyrelegemet ved hjelp av fluorescensbaserte teknikker. Disse ville involvere å rette eksitasjonslyset på huden og detektere fluorescensemisjon fra huden. Relevant lære innbefatter WO00/02048, WO02/30275 og WO01/22869.

Vi har merket oss at det ville være ønskelig under slike omstendigheter og andre å redusere dimensjonen h 'til fluorescensdetekteringsanordningen som ble brukt.

Fig. 2 viser en utførelse av anordningen eller apparatet i henhold til oppfinnelsen. Her er apparatet vist plassert på overflaten til huden eller en tilsvarende overflate hvorpå fluorescens skal bli detektert. Av hensiktsmessige grunner vil i den følgende beskrivelsen planet til huden bli behandlet som horisontalt. En lyskilde 32 sender ut lys langs en bane parallelt med hudoverflaten, og bestemmer en høyde h for apparatet som er omtrent lik den totale høyden h' til anordningen.

Lyset passerer gjennom et eksitasjonsfilterl 34 til en dikroisk strålesplitter 38 anordnet i et vertikalt plan og blir avledet mot en halv paraboloideformet speilreflektor 40 som erstatter linsesystemet 20 til det konvensjonelle apparatet. Reflektorer fokuserer lyset ned på en illuminasjonssone 30 på hudoverflaten eller mot en illuminasjonssone hvilke under hudoverflaten. Reflektoren innsamler og kollimerer fluorescensemisjoner fra illuminasjonssonen og retter det utsendte lyset tilbake til strålesplitteren, som det passerer gjennom for å nå et emisjonsfilter 42. Derfra blir lyset fokusert av en linsesystem 44 av den samme typen som linsesystem 24 og blir detektert på en detektor 46.

Det kan ses at den vertikale høyden til apparatet har blitt redusert fra omtrent 3 x h på fig. 1 til bare h på fig. 2.

Generelt blir interferensfiltre brukt i fluorescensmålere som eksitasjons- og emisjons-filtre. Disse krever at det innfallende lyset er ortogonalt på planet til filteret dersom den forventede bølgelengdens passeringsegenskaper skal bli tilveiebrakt, fordi med skrått innfallende lys, vil filterpassasjebåndet bli forskjøvet mot kortere bølgelengde. Kollimering av lysstrålene som faller inn på disse filtre er derfor påkrevd.

Den paraboloide reflektoren 40 kan være konstruert på et antall måter for å produsere et reflekterende grensesnitt av den ønskede formen. For eksempel kan grensesnittet være mellom luft inne i paraboloiden og en reflektiv konkav indre overflate av et legeme. Alternativt kan grensesnittet være formet på den konvekse ytre overflaten av et fast hemi-paraboloid element, for eksempel et forsølvet ytre av en glass eller plast hemi-paraboloid blokk.

Hele det illustrerte apparatet eller anordningen vil være avgrenset av et hus eller kapsling (slik det ses på fig. 6) som har en bunnflate som inneholder en åpning som kan være fylt med et transparent vindu (passende av glass, kvarts eller i noen applikasjoner plast) for å beskytte optikken mot støv og fuktighet og for å tillate passasjen av eksitasjons- og fluorescenslys til og fra en sample i illuminasjonssonen. Anordningen eller apparatet kan således være en enkel åpning i kapslingen eller et optisk vindu.

Signaler fra detektoren kan bli matet til egnede elektronikkretser for analyse på en kjent måte. LED kan være drevet av passende elektronikkretser som kjent og LED forsyningskretser og de detekterte signalbehandlingskretser vil generelt danne del av en integrert krets for å produsere intensitet basert eller tidsløst (frekvensdomain) målinger av fluorescensen, for eksempel i en FRET (fluorescensresonans energioverføring) basert undersøkelse.

Det illustrerte apparatet tilveiebringer en høy numerisk åpning for innfangingen av fluorescens fra illuminasjonssonen, mens det muliggjør en kompakt optisk geometri egnet for bruk der rom er viktig, for eksempel i en anordning som skal bæres på kroppen.

Ikke hele den illustrerte paraboloide overflaten er nødvendig for å kunne tilveiebringe gode resultater. Paraboloiden behøver ikke, som vist, være anordnet med dens akse sammenfallende med overflaten hvorpå anordningen skal brukes, men kan være vinklet opp for å vinne noe ytterligere høyde over overflaten for detektoroptikken. Strålen av fluorescent lys behøver ikke være kollimert fullstendig av reflektoren, men kan delvis bli kollimert av et hjelpelinsesystem. Den fysiske illuminasjonssonen til apparatet behøver ikke å ligge i fokus til reflektoren. Reflektorgrensesnittet behøver ikke være i formen av en sann paraboloid. Disse konsepter blir ytterligere illustrert i påfølgende figurer.

Som vist på fig. 3, vil arealet til den paraboloide overflaten M som vil motta og kollimere ut til detektoren mesteparten av fluorescensen emittert fra illuminasjonssonen være den som er definert av krysningen til en rett sirkulær sylinder C sentrert på illuminasjonssonen med selve paraboloidoverflaten. Det gjenværende av den paraboloide overflaten behøver derfor ikke være tilstede. Det er klart dess mindre sylinder, dess mindre lys vil bli innfanget, så fortrinnsvis er minst så mye av paraboloiden tilstede som er definert av krysningen med en sylinder med en radius r som ikke er mindre enn 50%, fortrinnsvis ikke mindre enn 75%, mer å foretrekke ikke mindre enn 90% av avstanden merket/fira opprinnelsen til fokalpunktet til paraboloiden. Radiusen r til sylinderen behøver ikke å være mindre enn den fokale lengden til det parabolske speilet, som i tilfellet vist på fig. 3, men kan være større.

Mens et linsesystem er vist på fig. 2, hvilket system fokuserer lyset på detektoren, må det forstås at dette i stedet også kunne vært et reflektorsystem, som passende ligner på det som ble brukt til å fokusere eksitasjonslyset på illuminasjonssonen. Et slikt system er vist på fig. 4 til 6.

I det illustrerte apparatet er de illustrerte komponentene som på fig. 2 unntatt for at linsesystemet 44 er erstattet av en del parabolisk speil 45 som ligner speil 40, men er anordnet for å fokusere fluorescenslyset til siden hvor detektoren 46 nå er posisjonert. Slik det ses på fig. 6, omfatter apparatet et hus 50 som har en basisplate 52 som ligger på huden og inneholder et vindu 54 som tidligere beskrevet som definerer illluminasjonssonen 30. Huset omfatter øvre og nedre halvskjell som har interne formasjoner for å holde og opplagre de optiske komponentene, og skjellene er sikret sammen ved hjelp av skruer som vist.

Som vist på fig. 7, kan basisoverflaten til huset ligge i en vinkel a, som fortrinnsvis ikke overskrider 10°C, enda mer å foretrekke ikke overskrider 5°, i forhold til aksen til den paraboloide overflaten. Dette vil gi noe ytterligere rom for de optiske og elektroniske komponentene, men vil også resultere i noe ytterligere høyde ved detektorenden til apparatet. Denne modifikasjonen kan bli brukt både i forhold til utførelsen som bruker speil ved hver ende som vist og i forhold til utførelsen på fig. 2. Enn videre kan fokalpunktet til speilet 40 skille seg fra lokaliseringen til samplen, som vist på fig. 7 med avstanden 8, for å kompensere for strålingsmønsteret og spredningsegenskaper til samplen eller omgivende medium som i tilfellet med å detektere fluorescens under huden.

Som vist på fig. 8, kan et hjelpelinsesystem som omfatter en eller flere enkle eller sammensatte linser 41 anordnet i front av speil 40 bli brukt for å frembringe ytterligere koordinering.

Tilsvarende kan formen til reflektoren avvike fra den til en paraboloid for å kunne oppta til strålingsmønsteret og spredningsegenskapene til samplen eller omgivende medium som i tilfellet med å detektere fluorescens under huden. Dersom dette fører til en ufull-stendig kollimering av fluorescensemisj onene, kan ytterligere kollimering bli utført ved bruk av et hjelpelinsesystem 41 som illustrert.

Alternative kurvede overflater som kan bli brukt innbefatter toroidale, toriske og bikoniske overflater.

For en torisk overflate definert ved

er c fortrinnsvis innen området på 0,07 til 0,5 og k er fortrinnsvis innenfor området på -1,5 til -0,7, hvor z er "sigingen" av z-koordinaten langs rotasjonsaksen, c er kurvaturen (resiprok til radiusen R), og k er den koniske konstanten og r den radiale koordinaten. Formen til speilet er vist på fig. 9 for forskjellige verdier av den koniske konstanten.

På fig. 10 er innvirkningen av den koniske konstanten på den detekterte optiske effekten vist.

Illuminasjonssonen behøver ikke være et punkt eller et sirkulært areal, men av virkningen av bruken av ikke-paraboloide reflektorformer kan være langstrakte enten på tvers eller longitudinalt av aksen til reflektoren.

I denne spesifikasjon blir, dersom det ikke er indikert noe annet, ordet "eller" brukt i den forstand av en operatør som returnerer en sann verdi når enten det ene eller begge av de angitte tilstandene er tilfredsstilt, i motsetning til operatørens "eksklusivt eller" som krever at bare en av tilstandene er tilfredsstilt. Ordet "omfattende" er brukt i forstanden av "innbefattende" snarere enn å bety "bestående av".

Claims (10)

1. Anordning eller apparat som skal bæres på et menneske eller dyrs kropp for produksjonen av fluorescens i huden og detektering av nevnte fluorescens omfattende: en lyskilde (32) for å rette fluorescenseksitasjonslys langs en lysbane som strekker seg over en overflate av nevnte hud; en reflektor (40) som har et tredimensjonalt krummet, skjellignende lysreflekterende grense-snitt posisjonert for å motta lys fra lyskilden (32) som passerer over hudoverflaten langs et parti av lysbanen og å reflektere lyset på tvers i forhold til partiet av lysbanen for å fokusere lyset på en illuminasjonssone (30) på eller under nevnte hudoverflate for stimulering av fluorescens i sonen, og å innsamle fluorescenslys utsendt i sonen og å reflektere og minst delvis kollimere lyset for å passere tilbake langs partiet av lysbanen; en detektor (46) for å motta lyset utsendt som fluorescens etter refleksjon i grensesnittet, hvori den relative posisjonen til lyskilden (32), og reflektoren (40) er fast når de er i bruk; en strålesplitter (38) som reflekterer lys utsendt av lyskilden (32) for passasje til reflektoren (40) og motta fluorescenslys fra reflektoren og sende fluorescenslyset til detektoren (46); hvori nevnte reflektor (40), lyskilde (32) og detektor (46) er anordnet på en generelt koplanar måte og strålesplitteren (38) har et plant reflektivt grensesnitt som ligger i et plan ortogonalt til koplanariteten til reflektoren, lyskilden og detektoren, og planet som er definert av reflektoren, lyskilden og detektoren strekker seg over overflaten til nevnte hud.

2. Anordning ifølge krav 1, hvor anordningen videre omfatter et eksitasjonsfilter (34) som velger en eksitasjonsbølgelengde fra lyset utsendt av lyskilden for passasje til reflektoren.

3. Anordning ifølge krav 1 eller 2, hvor anordningen videre omfatter et emisjonsfilter (42) som velger en utsendt fluorescensbølgelengde for passasje til detektoren (46).

4. Anordning ifølge et hvilket som helst forutgående krav, hvor anordningen omfatter en linse eller en andre reflektor (44) som fokuserer fluorescenslys på detektoren (46).

5. Anordning ifølge et hvilket som helst forutgående krav, hvor reflektorgrensesnittet i hovedsaken har formen av en delvis paraboloiod, asfærisk, toroidal eller bikonisk overflate.

6. Anordning ifølge krav 5, hvor reflektorgrensesnittet er definert av en ligning

hvori: er c fra 0,07 til 0,5 og k er fra -1,5 til -0,7, hvor z er "sigingen" av z-koordinaten langs rotasjonsaksen, c er kurvaturen (resiprok til radiusen R), og k er den koniske konstanten og r den radiale koordinaten.

7. Anordning som angitt i krav 5 eller 6, hvor reflektorgrensesnittet innbefatter den del M av en paraboloid, asfærisk, toroidal eller bikonisk overflate som blir generert ved skjæringen av en paraboloid, asphærisk, toroidal eller bikonisk overflate av en rett sirkulær sylinder C oppreist sentrert på illuminasjonssonen (30).

8. Anordning som angitt i krav 5 eller 6, hvor reflektorgrensesnittet i hovedsaken har formen av en del av en halv paraboloid.

9. Anordning ifølge et hvilket som helst forutgående krav, hvor anordningen videre innbefatter et hus (50) som inneholder lyskilden (32), reflektor (40) og detektor (46) og har en basisoverflate (52) som inneholder et vindu for passasje av eksitasjonslys ut av huset og motta fluorescenslys inn i huset og er for inngrep i bruk mot overflaten ved eller under hvilken fluorescensen finner sted.

10. Anordning ifølge et hvilket som helst forutgående krav, hvor lysbanen danner en vinkel på ikke mer enn 10 grader med et plan definert av basisoverflaten.