NO336112B1

NO336112B1 - Anti-Aß-antistoffer og fremgangsmåte for fremstilling, samt nukleinsyremolekyler som koder for slike antistoffer, og vektorer og vertsceller omfattende nevnte nukleinsyremolekyler, i tillegg til farmasøytiske og diagnostiske preparater, så vel som spesifikke anvendelser av antistoffmolekylene, nukleinsyremolekylene, vektorene eller vertscellene¿

Info

Publication number: NO336112B1
Application number: NO20043891A
Authority: NO
Inventors: Manfred Brockhaus; Corinna Löhning; Michael Bardoff; Bernd Bohrmann; Walter Huber; Titus Kretzschmar; Hansruedi Loetscher; Christer Nordstedt; Christine Rothe
Original assignee: Hoffmann La Roche; Morphosys Ag
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2004-09-16
Publication date: 2015-05-18
Also published as: CY1118037T1; US20100172907A1; IL163563A0; KR20040086422A; SI2368907T1; RU2004128259A; AR088368A2; PT2368907T; WO2003070760A3; CN102887953A; CO5601037A2; US20130136747A1; CN101781368A; ES2590684T3; PL372269A1; EP1481008A2; EP2368907B1; US8216577B2; US20050169925A1; JP2005527199A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår antistoffmolekyler i stand til spesifikt å gjenkjenne to områder av P-A4-peptidet, der det første området omfatter aminosyresekvensen AEFRHDSGY som vist i SEKV. ID nr. 1, eller et fragment derav, og der det andre området omfatter aminosyresekvensen VHHQKLVFFAEDVG som vist i SEKV. ID nr. 2, eller et fragment derav, hvori nevnte antistoff molekyl omfatter a) en variabel VL- region omfattende komplementære bestemmende regioner, L-CDR1, L-CDR2 og LCDR3, hvor

i) L-CDR1 omfatter SEKV ID nr. 143;

ii) L-CDR2 omfatter SEKV ID nr. 144 og

iii) L-CDR3 omfatter SEKV ID nr. 95 og

b) en variabel VH-region omfattende komplementære bestemmende regioner, H-CDR1, H-CDR2 og H-CDR3 der

i) H-CDR1 omfatter SEKV ID nr. 146;

ii) H-CDR2 omfatter SEKV ID nr. 192 og

iii) H-CDR3 omfatter SEKV ID nr. 93.

Videre beskrives nukleinsyremolekyler som koder oppfinnelsens antistoffmolekyler og vektorer og vertsceller omfattende nevnte nukleinsyremolekyler. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen preparater, fortrinnsvis farmasøytiske eller diagnostiske preparater, omfattende oppfinnelsens forbindelser, så vel som spesifikke anvendelser av antistoffmolekylene, nukleinsyremolekylene, vektorene eller vertscellene ifølge oppfinnelsen.

Flere dokumenter er angitt i beskrivelsen. Hver av disse (inkludert produsenters spesifikasjoner, instruksjoner osv.) anses som en del avbeskrivelsen.

Rundt 70 % av alle tilfeller av dementia skyldes Alzheimers sykdom som assosieres med selektiv skade av hjerneområder og neurale kretser som er kritiske for kognisjon. Alzheimers sykdom karakteriseres ved neurofibrillære sammenfiltringer, og særlig i pyramidale neuroner i hippocampus og tallrike amyloide plakk inneholdende for det meste en tett kjerne av amyloide avsetninger og defuserte ringer.

De ekstracellulære neurittiske plakk inneholder store mengder av et predominant, fibrillært peptid betegnet "amyloid p", "A-p", "Ap4", "p-A4" eller "Ap"; se Selkoe

(1994), Ann. Rev. Cell Biol. 10, 373-403, Koo (1999), PNAS bind 96, s. 9989-9990, US 4 666 829 eller Glenner (1984), BBRC 12, 1131. Dette amyloid p er avledet fra "Alzheimers forløper protein/p-amyloid forløperprotein" (APP). APP'er er integrale membranglykoproteiner (se Sisodia (1992), PNAS bind 89, s. 6075) og spaltes endoproteolytisk i Ap-sekvensen av en plasmamembranprotease, a-sekretase (se Sisodia

(1992), loe. eit). Videre fører ytterligere sekretaseaktivitet, særlig P-sekretase- og y-sekretaseaktivitet til ekstracellulær frigivning av amyloid-P (AP), omfattende enten 39 aminosyrer (AP39), 40 aminosyrer (AP40), 42 aminosyrer (AP42) eller 43 aminosyrer (Ap43); se Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1078 til 1083; WO 00/72880 eller Hardy (1997), TINS 20, 154.WO 0139796 A2 (CHALIFOUR R. ET AL.) beskriver fremstilling av vaksiner ved bruk av AP peptid. EP 0683234 Al (SUZUKI N. ET AL.) beskriver antistoffer som binder til det C-terminale området av Ap peptidet. CTNuallain B. et al. "Conformational Abs recognizing a generic amyloid fibril epitope" PNAS 2002, Vol.55, side 1485-1490, beskriver antistoffer som spesifikt gjenkjenner en amyloid fibrilleepitop. Ingen av publikasjonen beskriver antistoffmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det er verdt å merke seg at Ap har flere naturlig forekommende former, hvorved de humane former er referert til som de ovenfor nevnte AP39, AP40, AP41, AP42 og AP43. Den mest prominente form AP42, har aminosyresekvensen (med start fra N-terminus): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA (SEKV. ID nr. 27). I Ap41, Ap40, Ap39 mangler de C-terminale aminosyrer A, IA og VIA. I Ap43-form innbefattes det en ytterligere treoninrest ved C-terminus av den ovenfor angitte sekvens (SEKV. ID nr. 27).

Den tid som medgår til å nukleere Ap40-fibriler ble påvist å være signifikant lenger enn den for å nukleere AP42-fibriler; se Koo, loe. eit. og Harper (1997), Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407. Som angitt av Wagner (1999), J. Clin. Invest 104, 12391332, ble AP42 hyppigere funnet assosiert med neurittisk plakk og anses å være mer fibrilogent in vitro. Det ble også antydet at AP42 tjener som "såkorn" i den nukleasjonsavhengige polymerisering av ikke-krystallinske AP-peptider; Jarrett (1993), Cell 93, 1055-1958.

Det skal påpekes at modifisert APP-prosessering og/eller generering av ekstracellulært plakk inneholdende proteinholdige avsetninger, ikke bare er kjent fra Alzheimers patologi, men også fra individers lidelser av andre neurologiske og/eller neurodegenerative lidelser. Disse lidelser omfatter blant annet Down's syndrom, arvelig cerebral hemorragi med amyloidosis av hollandsk type, Parkinson's sykdom, ALS (amyotrofisk lateral sklerose), Creutzfeld Jacobs sykdom, HlV-relatert demens og motor neuropati.

For å forhindre, behandle og/eller lindre lidelser og/eller sykdommer relatert til den patologiske avsetning av amyloide plakk, må midler og fremgangsmåter som enten interfererer med P-amyloid plakkdannelse, som er i stand til å forhindre AØ-aggregering, og/eller er nyttige ved depolymerisering av allerede dannet amyloide avsetninger eller amyloide P-aggregater.

I henhold til, og i betraktning av de alvorlige defekter av modifiserte og/eller patologisk amyloid biologi, er midler og fremgangsmåter for behandling av amyloidrelaterte lidelser meget ønskelig. Særlig er det ønskelig med effektive medikamenter som enten interfererer med patologisk amyloid aggregering, eller som er i stand til depolymerisering av aggregert Ap. Videre er det ønskelig med diagnostiske midler for blant annet å påvise amyloide plakk.

Det tekniske problem som oppfinnelsen således tar sikte på å løse, er de behov som er beskrevet ovenfor.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse et antistoffmolekyl som spesifikt er i stand til å gjenkjenne to områder av P-A4/Ap4-peptidet, der det første området omfatter aminosyresekvensen AEFRHDSGY (SEKV. ID nr. 1), eller et fragment derav, og det andre området omfatter aminosyresekvensen VHHQKLVFFAEDVG (SEKV. ID nr. 2) eller et fragment derav hvori nevnte antistoff molekyl omfatter a) en variabel VL- region omfattende komplementære bestemmende regioner, L-CDR1, L-CDR2 og LCDR3, hvor

iv) L-CDR1 omfatter SEKV ID nr. 143;

ii) L-CDR2 omfatter SEKV ID nr. 144 og

iii) L-CDR3 omfatter SEKV ID nr. 95 og

i) H-CDR1 omfatter SEKV ID nr. 146;

ii) H-CDR2 omfatter SEKV ID nr. 192 og

iii) H-CDR3 omfatter SEKV ID nr. 93.

Innenfor oppfinnelsens kontekst relaterer uttrykket "antistoffmolekyl" til fullimmunoglobulinmolekyler, fortrinnsvis IgM'er, IgD'er, IgE'er, IgA'er eller IgG'er, mer foretrukket IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 eller IgG4 så vel som deler av slike immunglobulimolekyler som Fab-fragmenter eller Vl-, Vh- eller CDR-områder. Videre angår uttrykket modifiserte og/eller endrete antistoffmolekyler som kimære og humaniserte antistoffer. Uttrykket relaterer også til modifiserte eller endrete monoklonale eller polyklonale antistoffer så vel som rekombinant eller syntetisk genererte eller syntetiserte antistoffer. Uttrykket relaterer også til intakte antistoffer så vel som til antistoffragmenter/deler derav, som separerte lette og tunge kjeder, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. Uttrykket "antistoffmolekyl" omfatter også antistoffderivater, de bifunksjonelle antistoffer og antistoffkonstrukter som enkelkjede Fvs (scFv), bispesifikke scFvs eller antistoffusjonsproteiner. Ytterligere detaljer når det gjelder uttrykket "antistoffmolekyl" ifølge oppfinnelsen, er gitt nedenfor.

Uttrykket "spesifikk gjenkjenning" betyr innenfor oppfinnelsens kontekst at antistoffmolekylet er i stand til spesifikt å interagere med og/eller binde til minst to aminosyrer i hvert av de to områder av 0-A4 som definert her. Uttrykket relaterer til spesifisiteten hos antistoffmolekylet, dvs. til dets evne til å diskriminere mellom de spesifikke områder av P-A4-peptidet, som definert her, og et annet ikke-relatert område av P-A4-peptidet eller et annet ikke APP-relatert protein/peptid/(ikkerelatert) testpeptid. I henhold til dette kan spesifisiteten bestemmes eksperimentelt med fremgangsmåter kjent innen teknikken og fremgangsmåter som beskrevet her. Slike fremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til western blot, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-tester og peptidskann. Slike fremgangsmåter omfatter også bestemmelsen av Kn-verdier som blant annet illustrert i de vedlagte eksempler. Peptidskann (pepspot analyse) benyttes rutinemessig for å kartlegge lineære epitoper i et polypeptidantigen. Den primære sekvens av polypeptidet syntetiseres suksessivt på aktivert cellulose med peptider som overlapper hverandre. Gjenkjennelsen av visse peptider når det gjelder antistoffer som skal testes med henblikk på sin evne til å påvise eller gjenkjenne en spesifikk antigen/epitop, bedømmes ved rutinefargeutvikling (sekundært antistoff med pepperotperoksidase og 4-klornaftol og hydrogenperoksid) ved en kjemoluminsensreaksjon eller tilsvarende midler, som er velkjent i teknikken. Når det blant annet gjelder kjemoluminsensreaksjon, kan reaksjonen kvantiteres. Hvis antistoffet reagerer med et visst sett av overlappende peptid, kan man dedusere den minimale sekvens av aminosyrer som er nødvendige for reaksjon; se illustrerende eksempel 6 og vedlagte tabell 2.

Den samme analyse kan avdekke to spredtliggende klustere av reaktive peptider som indikerer gjenkjennelsen av en diskontinuerlig, dvs. konformasjonell epitop i det antigene polypeptid (Geysen (1986), Mol. Immunol. 23, 709-715).

I tillegg til pepspotanalysen, kan standard ELISA-analyse gjennomføres. Som demonstrert i de vedlagte eksempler kan små heksapeptider kobles til et protein og belegges til en immunoplate og omsettes med antistoffer som skal testes. Bedømmelsen kan gjennomføres ved standard fargeutvikling (for eksempel sekundært antistoff med pepperotperoksidase og tetrametylbenzidin med hydrogenperoksid). Reaksjonen i visse brønner bedømmes ved optisk densitet, for eksempel ved 450 nm. Typisk bakgrunn (= negativ reaksjon) kan være 0,1 OD, typisk positiv reaksjon kan være 1 OD. Dette betyr at differansen (forholdet) positiv: negativ kan være mer enn faktor 10. Ytterligere detaljer er gitt i de vedlagte eksempler. I tillegg er kvantitative fremgangsmåter for bestemmelse av spesifisiteten og evnen til "spesifikk gjenkjenning" av de her definerte to områder av P-A4-peptidet gitt nedenfor.

Uttrykket "to områder av P-A4-peptidet" relaterer til to områder som definert ved deres aminosyresekvenser vist i SEKV. ID nr. 1, og 2 i forhold til de N-terminale aminosyrene 2 til 10, og til de sentrale aminosyrer 12 til 25 av P-A4-peptid. Uttrykket "P-A4-peptid" innenfor oppfinnelsens kontekst angir de her ovenfor beskrevne AP39, Ap41, Ap43, fortrinnsvis Ap40 og Ap42. Ap42 er også angitt i den vedlagte SEKV. ID nr. 27. Det skal bemerkes at uttrykket "to områder av P-A4-peptidet" også relaterer til en "epitop" og/eller en "antigen determinant" som omfatter de her definerte to områder av P-A4-peptid eller deler derav. I henhold oppfinnelsen er de to områder av P-A4-peptidet atskilt (på nivå av aminosyresekvensen) i primærstrukturen av P-A4-peptidet med minst én aminosyre, fortrinnsvis minst to, helst minst tre, aller helst minst fire, spesielt minst fem, helt spesielt minst seks, ganske spesielt minst ni og mest foretrukket minst tolv aminosyrer. Som vist her og som dokumentert i de vedlagte eksempler, gjelder at oppfinnelsens antistoffer/antistoffmolekyler påviser/interagerer med og/eller binder til to områder av P-A4-peptidet, som definert her, hvorved de to områder er atskilt (på primærstrukturnivå av aminosyresekvensen) av minst én aminosyre og der sekvensen som skiller de to områder/"epitop" kan omfatte mer enn ti aminosyrer, fortrinnsvis 14, og aller helst 15 eller 16 aminosyrer. For eksempel gjelder atMSR-3 Fab gjenkjenner/ detekterer/interagerer med to områder av P-A4-peptidet hvori nevnte første område omfatter aminosyrene 3 og 4 (EF) og nevnte andre område omfatter aminosyrene 18 til 23 (VFFAED). I henhold til dette kan den separerende sekvens mellom regionen/epitopene som skal påvises/gjenkjennes ha en lengde på 13 aminosyrer på primæraminosyresekvensstrukturen. Tilsvarende gjelder at MSR #3.4H7 IgGl, et optimalisert og modent antistoffmolekyl som er avledet fra MSR-3, og inneholdt i et IgGl-rammeverk, påviser/interagerer med/binder til to epitoper/områder av P-A4 som omfatter det første område posisjoner 1 til 4 (DAEF) og i det andre område posisjoner 19 til 24 (FFAEDV) av P-A4, som definert her. I henhold til dette gjelder at MSR #3.4H7 IgGl gjenkjenner/påviser /interagerer med/binder til to epitoper/områder som på primæraminosyresekvensnivå er atskilt av 14 aminosyrer. Som beskrevet i detalj i de vedlagte eksempler, kan affinitetsmodning og konvertering av monovalente oppfinneriske Fab-fragmenter til fullengde IgGl-antistoffer resultere i en viss utvidelse av epitopene/områdene som er påvist med pepspot, ELISA-analyser og liknende. Derfor er antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen i stand til samtidig, og uavhengig å gjenkjenne to områder av P-A4-peptidet/Ap4 der områdene omfatter aminosyresekvensene som vist i SEKV. ID nr. 1 (eller deler derav) og aminosyresekvensen som vist i SEKV. ID nr. 2 (eller en eller flere deler derav). Pga. den potensielle utvidelse av epitopene som detaljert her, er det imidlertid også tatt sikte på at aminosyrene i tett nærhet til sekvensene av SEKV. ID nr. 1 og 2, blir påvist/gjenkjent, dvs. at ytterligere aminosyrer er del av de to områder som skal påvises/gjenkjennes. I henhold til dette er det også tatt sikte på at for eksempel den første aminosyre av AP (1-42) som definert her, nemlig D (asparginsyre) i del av en epitop påvises/gjenkjennes, eller at aminosyrene lokalisert etter området av Ap (1-42) som definert i SEKV. ID nr. 2, påvises/gjenkjennes. Nevnte ytterligere aminosyre kan for eksempel være aminosyren i posisjon 26 av SEKV. ID nr. 27 (P-A4/AP (1-42)), nemlig S (serin).

Uttrykket kan også angå en konformasjonell epitop, en strukturell epitop eller en diskontinuerlig epitop, bestående av nevnte to områder eller deler derav, se også Geysen

(1986), loe. eit. Innenfor oppfinnelsens kontekst er en konformasjonell epitop definert ved to eller flere diskrete aminosyresekvenser som er atskilt i den primære sekvens som kommer sammen på overflaten når polypeptidet foldes til det native protein (Sela,

(1969) Science 166, 1365 og Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen er ment spesifikt å binde til/interagere med en eller flere konformasjonelle/strukturelle epitoper bestående av og/eller omfattende de to områder av P-A4 som beskrevet her, eller deler derav, som beskrevet nedenfor.

"Antistoffmolekylene" ifølge oppfinnelsen er antatt å omfatte en samtidig og uavhengig dual spesifisitet til (a) et aminosyrestrekk omfattende aminosyrene 2 til 10 (eller en eller flere deler derav) av P-A4 og (b) et aminosyreområde omfattende aminosyrene 12 til 25 (eller én eller flere deler derav) av P-A4 (SEKV. ID nr. 27). Fragmenter eller deler av disse strekk omfatter minst to, fortrinnsvis minst tre aminosyrer. Foretrukne fragmenter eller deler er i det første område/strekk av SEKV. ID nr. 27, aminosyresekvensene AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD eller HDSG og i det andre området/strekk av SEKV. ID nr. 27 aminosyresekvensene HHQKL, LV, LVFFAE,

VFFAED, VFFA eller FFAEDV. Som nevnt ovenfor kan fragmentene også omfatte ytterligere aminosyrer eller være deler av fragmentene som definert her. Spesifikke eksempler er DAE, DAEF, FRH eller RHDSG.

Et antall antistoffer som spesifikt gjenkjenner AP-peptider er beskrevet i teknikken. Disse antistoffer er hovedsakelig oppnådd ved immunisering av dyr med Api-40 eller Ap 1-42 eller fragmenter derav ved bruk av standard teknologier. I henhold til publiserte data, gjenkjenner monoklonale antistoffer som ble generert ved immunisering med det komplette AP-polypeptid (1-40 eller 1-42) eksklusivt en epitop nær N-terminusen av Ap. Videre er eksempler antistoffene BAP-1 og BAP-2 (Brockhaus, ikke publisert) som ble generert ved immunisering av mus med Api-40 og som gjenkjenner aminosyrene 4-6 innenfor konteksten av større AP-peptider; se det vedlagte eksempel 7, tabell 2 samt eksempel 12, tabell 7. Antistoffer som gjenkjenner den midtre del av Ap stammer fra immunisering med mindre peptider. For eksempel ble antistoffet 4G8 generert ved immunisering med AP-peptidet 1-24 og gjenkjenner eksklusivt sekvensen 17-24 (Kim,

(1988) Neuroscience Research Communication 2, 121-130). Mange andre monoklonale antistoffer er generert ved immunisering av mus med AP-avledete fragmenter, og antistoffer som gjenkjenner den C-terminale ende av Api-40 og Api-42 brukes utstrakt for å atskille og kvantitere de tilsvarende AP-peptider i biologiske fluider og vev ved ELISA, western blot og immunohistokjemisk analyse (Ida et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 22908-22914; Johnson-Wood et al., (1997), Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1994), 1550-1555; Suzuki et al., (1994), Science 264, 1336-1340; Brockhaus (1998), Neuro Rep. 9, 1481-1486). BAP-17 er et muse monoklonalt antistoff som genereres ved immunisering av mus med AP-fragment 35-40. Det gjenkjenner spesifikt den C-terminale enden av Apl-40 (Brockhaus (1998) Neuroreport 9, 1481-1486).

Det er antatt at immuniseringen med T-celleavhengige antigener (ofte dårlige immunogener) krever en proteolytisk spalting av antigenet til endosomer av antigenpresenterende celler. In v/vø-seleksjonen av høyaffinitetsantistoffer etter immunisering, drives av kontakten av hjelper-T-celler til antigenpresenterende celler. De antigenpresenterende celler presenterer kun korte peptider og ikke polypeptider med større størrelser. I henhold til dette har disse celler et komplisert (men velkjent) maskineri til endocytoseantigener, nedbryting av antigenene til endosomer, kombinering av valgte peptider med egnete MHC klasse-II-molekyler, og å eksportere peptid-MHC-komplekset til celleoverflaten. Dette er der den antigenspesifikke gjenkjennelsen av T-celler inntrer, med det formål å tilveiebringe hjelp for å modne B-celler. B-cellene som mottar mest T-cellehjelp har den beste sjanse til å utvikle seg til antistoffutskillende celler, og å proliferere. Dette viser at antigenprosessering ved proteolyse er et viktig trinn for generering av høyaffinitetsantistoffrespons in vivo og kan forklare dominansen av den N-terminale AP-epitop i tidligere monoklonale og polyklonale antistoffer, oppnådd ved immunisering.

I motsetning til dette drives seleksjonen av antistoffer/antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen av den fysiske adherens av Fab-uttrykkende phager til antigenet. Det er ingen nedbryting av antigenet som er involvert i denne in vz/rø-seleksjonsprosessen. Phagene som uttrykker Fab med den høyeste affinitet mot antigenet, velges og propageres. Et syntetisk bibliotek benyttes i de vedlagte eksempler for å velge spesifikke antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen, som er spesielt egnet for å unngå enhver mulighet for enkle, kontinuerlige epitoper som ofte finnes i biblioteker som stammer fra immuniserte B-celler.

Det skal bemerkes at den kjente teknikk ikke har beskrevet antistoffmolekyler som gjenkjenner to uavhengige områder av AP4 som spesifikt gjenkjenner (a) diskontinuerlige/strukturelle/konformasjonelle epitoper og/eller som er i stand til samtidig å uavhengig gjenkjenne to områder/epitoper av AP4.

Vaksinasjon av transgene mus som overuttrykker mutant, human APPV7i7F(PDAPP-mus) med Ap 1-42, resulterte i en så å si fullstendig prevensjon av amyloid avsetning i hjernen når behandling ble startet i unge dyr, dvs. før start av neuropatologiene, mens en reduksjon av allerede dannete plakk ble observert i eldre dyr, noe som antydet en antistoffmediert klaring av plakk (Schenk et al., (1999), Nature 400, 173-177). Antistoffene som ble generert ved denne immuniseringsprosedyre var reaktive mot N-terminus av AP4 som dekker en epitop rundt aminosyrene 3-7 (Schenk et al., (1999), loe. eit.; WO 00/72880). Aktiv immunisering med Api-42 reduserte også oppførselsforringelse og hukommelsestapet i forskjellige transgene modeller for Alzheimers sykdom (Janus et al., (2000) Nature 408, 979-982; Morgan et al., (2000) Nature 408, 982-985). Etterfølgende studier med perifert administrerte antistoffer, dvs. passiv immunisering, har bekreftet at antistoffer kan tre inn i sentralnervesystemet, dekorere plakk og indusere klaring av pre-eksisterende amyloid plakk i APP-transgene mus (PDAPP-mus) (Bard et al., (2000) Nat. Med. 6, 916-919; WO 00/72880). I disse studier var de monoklonale antistoffer med den mest potente in vivo- og ex vivo-effektivitet (utløsning av phagocytose i eksogene, mikrogliale celler) de som gjenkjente Ap4 N-terminale epitoper 1-5 (mab 3D6, IgG2b) eller 3-6 (mab 10D5, IgGl). Likeledes viste polyklonale antistoffer som var isolert fra mus, kanin eller aper etter immunisering med Api-42 en tilsvarende N-terminal epitop-spesifisitet og var også effektive med henblikk på utløsning av phagocytose og in vivo plakk-klaring. I motsetning induserte C-terminalspesifikke antistoffer som binder til Api-40 eller Api-42 med høy affinitet, ikke phagocytose i ex v/vo-analysen og var ikke effektiv in vivo ((WO 00/72880). Monoklonalt antistoff m266 (WO 00/72880) ble dyrket mot Api3-28 (sentraldoméne av AP) og epitop-kartlegging bekreftet antistoffspesifisiteten til å dekke aminosyrene 16-24 i AP-sekvensen. Dette antistoff binder ikke godt til aggregert AP og amyloide avsetninger og reagerer kun med oppløselig (monomerisk) AP, dvs. proteiner som er tilsvarende andre velkjente og kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoffer (4G8; Kim, (1988) Neuroscience Research Communications 2, 121-130; kommersielt tilgjengelig fra Signet Laboratories Inc., Dedham, MA, USA) som gjenkjenner den samme epitop.

In vivo ble m266-antistoffet nylig funnet markert å redusere AP-avsetning i PDAPP-mus etter perifer administrering (DeMattos, (2001) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 98, 8850-8855). Imidlertid og i motsetning til N-terminale spesifikke antistoffer, dekorerte ikke m266 amyloidplakk in vivo, og det ble derfor hyotesisert at hjerne AP-byrden ble redusert ved et antistoffindusert skift i likevekten mellom CNS og plasma Ap, som resulterte i akkumulering av hjerneavledet AP I periferien, fast kompleksert til m266 (DeMattos, (2001) loe. eit).

Antistoffene/antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen kombinerer, ved samtidig (for eksempel i en strukturell/konformasjonell epitop dannet av N-terminalen og sentralområdet av PA4, som beskrevet her) og uavhengig (for eksempel i pepspot-analyser som dokumentert i den vedlagte eksperimentelle del) som binder til N-terminalen og sentralepitopene, kombinerer egenskapene for et N-terminalt spesifikt antistoff, og et sentralepitopspesifikt antistoff i et enkelt molekyl. Antistoffer med dualepitopspesifisitet som beskrevet ifølge oppfinnelsen, anses å være mer effektivt in vivo, særlig i medisinske og diagnostiske situasjoner, for eksempel å redusere amyloid plakkbyrde eller amyloidogenese eller for påvisning av amyloide avsettinger og plakk. Det er velkjent at det i prosessen med Ap4-aggregering og amyloid avsetting, inntrer konformasjonelle forandringer og mens sentralepitopen lett er tilgjengelig i oppløselig i AP4, synes den å være gjemt og mindre reaktiv i aggregert eller fibrillært AP4. Det faktum at det sentrale/middel epitopspesifikke antistoff m266 er effektivt in vivo, antyder at nøytralisering av oppløselig AP4 også kan være en kritisk parameter. Antistoffene/antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen kan på grunn av dualepitopspesifisiteten binde både til fibrillær og oppløselig AP4 med lik effektivitet, og tillater derved interaksjon med amyloid plakk så vel som nøytralisering av A04. Uttrykket "samtidig og uavhengig binding til N-terminal- og sentral-middelepitopen av P-A4" som benyttet her i konteksten med oppfinnelsens antistoffmolekyler relaterer til det faktum at antistoffene/antistoffmolekylene som her beskrives, kan påvise og/eller binde til begge epitoper samtidig, dvs. på samme tid (for eksempel på konformasjonelle/strukturelle epitoper dannet av N-terminalepitopen (eller en eller flere deler derav) og sentralepitopene (eller en eller flere deler derav) av PA4, som definert her), og at de samme antistoffmolekyler imidlertid også er i stand til å påvise/binde til hver av de definerte epitoper på en uavhengig måte som blant annet påvist ved pepspotanalysen som vist i eksemplene.

Klaring av amyloid plakk in vivo i PDAPP-mus etter direkte applikasjon av antistoffene til hjernen, er ikke avhengig av IgG-undergruppe og kan også involvere en mekanisme som ikke er Fc-mediert, dvs. ingen involvering av aktivert mikroglial i plakk-klaringen (Bacskai, (2001), Abstract Society for Neuroscience 31. Annual Meeting, 10-15 november, 2001, San Diego). Denne observasjon står i motsetning til det som er postulert i en tidligere studie av Bard (2000), loe. eit.

I en annen studie ble antistoffer dyrket mot Api-28- og Api-16-peptider funnet å være effektive ved disaggregering av AP-fibriller in vitro, mens et antistoff spesifikt for AP13-28 var meget mindre aktivt i denne analyse (Solomon, (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 4109-4112). Prevensjon av AP-aggregering ved et anti-Api-28-antistoff (AMY-33) er også rapportert (Solomon, (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93, 452-455). I den samme studie interfererte antistoff 6F/3D, som var dyrket mot AP-fragment 8-17, noe med Zn<2+->indusert AP-aggregering, men hadde ingen virkning på selve aggregeringen som var indusert av andre aggregeringsinduserende midler.

Effektiviteten for de forskjellige antistoffer i disse in v/zro-analyser, korrelerer med tilgjengeligheten av deres epitoper i Ap4-aggregater. N-terminus er eksponert og N-terminalspesifikke antistoffer induserer klart de-polymerisering, mens sentralområdet og C-terminus er skjult og ikke lett tilgjengelig, og således er antistoffer mot disse epitoper meget mindre effektive.

Undersøkelser med henblikk på epitoptilgjengelighet for antistoffet, har vist at i aggregert Ap er den N-terminale epitop eksponert, og reagerer med BAP-1-antistoffet, mens den midtre eller sentrale epitop forblir kryptisk, dvs. at ingen binding av 4G8- antistoffet ble observert. I monomerisk Ap er imidlertid begge epitoper åpne og gjenkjennes på samme måte av begge tidligere, kjente antistoffer.

I motsetning ble det ifølge foreliggende oppfinnelse overraskende funnet at de heri beskrevne antistoffmolekyler gjenkjente to diskontinuerlige aminosyresekvenser, for eksempel en konformasjonell/strukturell epitop på Ap-peptidet. To "diskontinuerlige aminosyresekvenser" betyr innen oppfinnelsens kontekst at de nevnte to aminosyresekvenser som danner N-terminal-, henholdsvis sentral/middel-epitoper, er separert på P-A4 i sin primærstruktur ved minst to aminosyrer som ikke er del av noen av epitopene.

Bindingsområdet for et antistoff Fab (= paratope) opptar en molekyloverflate på rundt 30 x 30 Å i størrelse (Laver, Cell 61 (1990), 553-556). Dette er tilstrekkelig til å komme i kontakt med 15 til 22 aminosyreresidier som kan være til stede på flere overflateløkker. Den diskontinuerlige epitop som gjenkjennes av oppfinnelsens antistoffmolekyler inntar en konformasjon der N-terminal- (restene 2 til 10 eller deler derav) og middel AP-peptidsekvensen (restene 12 til 25 eller deler derav) er i tett nærhet. Bare innen denne konformasjon oppnås det maksimale antall antigen-antistoff kontakter og den laveste frie energitilstand.

Basert på energetiske beregninger er det antydet at et mindre undersett på 5-6 rester, som ikke er arrangert i noen lineær sekvens, men er spredd over epitopoveflaten, bidrar med mest av bindingsenergien, mens omgivende rester kun utgjør et komplementært mønster (Laver (1990) loe. eit).

Oppfinnelsens antistoffer/antistoffmolekyler er i stand til å binde til aggregert AP og reagerer sterkt med amyloid plakk i hjernen hos AD-pasienter (som dokumentert i de vedlagte eksempler). I tillegg er de i stand til å depolymerisere/desintegrere amyloide aggregater.

Uten ønske om å være bundet av noen teori, antas det at den

konformasjonelle/strukturelle epitop (bestående av de to områdene av AP4 eller en eller flere deler av områder som beskrevet her) partielt å være eksponert i aggregert Ap. Det er imidlertid kjent at hoveddelen av middel/andre epitop/område alene ikke fritt er tilgjengelig i disse AP-aggregater (basert på de dårlige reaktiviteter av middelepitopspesifikke antistoffene 4G8 og m266). På den andre side og i lys av betraktningene ovenfor, er det sannsynlig at én eller flere rester av midtområdet er

komponenter av den konformasjonelle epitop, og i konjunksjon med restene fra det N-terminale område er tilgjengelig for antistoffene ifølge oppfinnelsen, og bidrar derved betydelig til bindingsenergien for antistoff-Ap4-interaksjonen. Reaktiviteten for oppfinnelsens antistoffmolekyler med den konformasjonelle epitop i aggregert AP, er derfor unik og klart forskjellig fra a-Ap4 -antistoffene som er beskrevet i den kjente teknikk. Likeledes, og som påpekt ovenfor, er et ytterligere unikt trekk med oppfinnelsens antistoff er/antistoffmolekyler deres evne til samtidig og uavhengig å binde til/gjenkjenne to separate epitoper på P-A4, som definert heri og i de vedlagte eksempler.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er oppfinnelsens antistoffmolekyl et antistoffmolekyl der minst to områder av P-A4, som spesifikt skal gjenkjennes av antistoffet, danner en konformasjonell/strukturell epitop eller en diskontinuerlig epitop; se Geysen (1986), loe. eit; Ghoshai (2001), J. Neurochem. 77, 1372-1385; Hochleitner

(2000), J. Imm. 164, 4156-4161; Laver (1990), loe. eit. Uttrykket "diskontinuerlig epitop" betyr innen oppfinnelsens kontekst ikke-lineære epitoper som er sammensatt fra rester fra distante deler av polypeptidkjeden. Disse rester kommer sammen på overflaten når polypeptidkjeden folder seg til en tredimensjonal struktur for å danne en konformasjonell/strukturell epitop. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer foretrukne, uventete epitoper innen P-A4, som resulterer i den oppfinneriske generering av spesifikke antistoffmolekyler, spesifikt i stand til å interagere med disse epitoper. Disse antistoffer/antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen, gir en basis for øket effektivitet og et redusert potensiale for bivirkninger. Som angitt ovenfor, er oppfinnelsens antistoffer imidlertid også i stand til uavhengig å interagere med hver av de definerte to områder/epitoper av P-A4, for eksempel i pepspot-analyser som dokumentert i de vedlagte eksempler.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse unike verktøy som kan benyttes for depolymerisering av aggregert Ap-fibriller in vivo og in vitro, og/eller som er i stand til å stabilisere og/eller nøytralisere en konformasjonell epitop av monomerisk AP, og derved i stand til forhindre den patologiske AP-aggregering. Det er videre tatt sikte på at oppfinnelsens antistoffer binder til AP-avsetninger på kanten av amyloid plakk, blant annet i hjernen til en som lider av Alzheimer og effektivt oppløser de patologiske protofibriller og fibriller.

I en foretrukket utførelsesform gjenkjenner antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen minst to konsekutive aminosyrer i de to områder av AP4 som definert her, mer foretrukket gjenkjenner nevnte antistoffmolekyl i det første området en aminosyresekvens omfattende aminosyrene: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD eller HDSG og i det andre område en aminosyresekvens omfattende aminosyrene: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED, VFFA eller FFAEDV. Ytterligere fragmenter eller utvidete deler omfatter: DAE, DAEF, FRH eller RHDSG

Foretrukne antistoffmolekyler omfatter et variabelt Vn-område som kodet av et nukleinsyremolekyl som vist i SEKV. ID nr. 3, 5 eller 7, eller et variabelt Vn-område som vist i aminosyresekvensen som angitt i SEKV. ID nr. 4, 6 eller 8. Sekvensene som vist i SEKV. ID nr. 3 og 4 angir det kodende område, henholdsvis aminosyresekvensen av VH-området til det parentale antistoff MSR-3 (MS-Roche 3), sekvensene i SEKV. ID nr. 5 og 6 angir de kodende områder, henholdsvis aminosyresekvensene av Vn-området til det parentale antistoff MSR-7 (MS-Roche 7) og SEKV. ID nr. 7 og 8 angir det kodende område, henholdsvis aminosyresekvensen for VH-området til det parentale antistoff MSR-8 (MS-Roche 8). Foretrukne antistoffmolekyler somomfatter et variabelt VL-område som kodet av et nukleinsyremolekyl som vist et SEKV. ID nummer valgt fra gruppen bestående av SEKV. ID nr. 9, 11 eller 13, eller et variabelt VL-område som vist i aminosyresekvensen angitt i SEKV. ID nr. 10, 12 eller 14. SEKV. ID nr. 9 og 10 tilsvarer VL-området av MSR-3, SEKV. ID nr. 11 og 12 tilsvarer VL-området av MSR-7, og SEKV. ID nr. 13 og 14 tilsvarer VL-området av MSR-8 er tilveiebragt. Som illustrert i de vedlagte eksempler blir de parentale antistoffer MSR-3, MSR-7 og MSR-8 benyttet for ytterligere å generere optimaliserte antistoffmolekyler med enda bedre egenskaper og/eller bindingsaffiniteter. Noen av de tilsvarende og mulige strategier, er eksemplifiserte og vist i de vedlagte eksempler.

Optimaliseringsstrategien som er illustrert i de vedlagte eksempler fører til et antall inventive, optimaliserte antistoffer. Disse optimaliserte antistoffer deler med sine parentale antistoffer, CDR-3 doménet av VH-området. Mens det opprinnelige rammeverkområdet (som vist i vedlagte figur 1) forblir den samme, er CDR1-, CDR2-og/eller Vl-CDR3-området forandret i de modne/optimaliserte antistoffmolekylene. Illustrerende, modifiserte sekvensdeler for optimaliserte antistoffmolekyler er vist i vedlagte tabell 1. Fortetrukne antistoffer er også optimaliserte antistoffmolekyler som er avledet fra de her beskrevne MSR-3, MSR-7 og MSR-8, og som spesifikt er i stand til å reagere med/spesifikt å gjenkjenne de to områder av P-A4-peptidet som definert her. Særlig kan CDR-områder, fortrinnsvis CDRl-er, mer foretrukket CDRl'er og CDR2'er, og mest foretrukket CDRl'er, CDR2'er og CDR3'er som definert her, er benyttet for å generere ytterligere antistoffer/antistoffmolekyler, blant annet ved CDR- podingsmetoder, som velkjent i teknikken, se Jones (1986), Nature 321, 522-515 eller Riechmann (1988), Nature 332, 323-327. Mest foretrukket er antistoffer/antistoffmolekyler så vel som aminosyrefragmenter eller derivater, er avledet fra de parentale antistoffer, som beskrevet her og ovenfor, deler CDR3-doménet av VH-området med minst ett av de parentale antistoffer. Som vist nedenfor er det også tatt sikte på at genererte, kryssklonete antistoffer skal anses som optimaliserte/modne antistoffer/antistoffmolekyler. I henhold til dette kan foretrukne antistoffmolekyler også omfatte eller avledes fra antistoffer/antistoffmolekyler som karakteriseres ved Vh-områder som vist i en hvilken som helst av SEKV. ID nr. 32 til 45 eller VL-områder som vist i SEKV. ID nr. 46 til 59, eller som kan omfatte et CDR-3-område som definert i en hvilken som helst av SEKV. ID nr. 60 til 87. En spesiell utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter optimaliserte antistoffmolekyler omfattende et variabelt VH-område som vist i SEKV. ID nr. 89 og et variabelt VL-område som vist i SEKV. ID nr. 91. En annen spesiell utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter optimaliserte antistoffmolekyler omfattende et variabelt VH-område som kodet av et nukleinsyremolekyl som vist i et SEKV. ID nr. 88 et variabelt VL-område kodet for av et nukleinsyremolekyl som vist i SEKV ID nr. 90.

Bortsett derfra kan det være et eller flere CDR-områder, fortrinnsvis et eller flere CDR3-områder. Et spesielt foretrukket antistoffmolekyl av den optimaliserte type, omfatter et H-CDR3 somkarakteriserti SEKV. ID nr. 92 eller 93 og/eller et L-CDR3, somkarakteriserti SEKV. ID nr. 94 eller 95. Det er foretrukket at antistoffene/antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved deres spesifikke reaktivitet ved P-A4 og/eller peptider avledet fra nevnte P-A4. For eksempel kan optiske tettheter i ELISA-tester, som vist i vedlagte eksempler etableres og forholdet mellom de optiske tettheter kan benyttes for å definere den spesifikke reaktivitet for de parentale eller de optimaliserte antistoffer. I henhold til dette er et foretrukket antistoff ifølge oppfinnelsen et som reagerer i en ELIS A-test med P-A4 for å komme frem til en optisk tetthet målt ved 450 nm, som er 10 ganger høyere enn den optiske tetthet målt uten P-A4, dvs. med en faktor 10 over bakgrunnen. Fortrinnsvis gjennomføres målingen av den optiske tetthet noen minutter (for eksempel 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7 minutter) etter start av fargeutviklingsreaksjonen for å optimalisere forholdet signal:bakgrunn.

Foretrukne antistoffmolekyl omfatter minst én CDR-3 av et VL-område som kodet av et nukleinsyremolekyl som vist i SEKV. ID nr. 15, 17 eller 19 eller minst én CDR3-aminosyresekvens av et VL-område som vist i SEKV. ID nr. 16,18 eller 20 og/eller nevnte antistoffmolekyl omfatter minst én CDR3 av et VH-område som kodet av et nukleinsyremolekyl som vist i SEKV. ID nr. 21, 23 eller 25, eller minst en CDR3-aminosyresekvens av et Vn-område som vist i SEKV. ID nr. 22, 24 eller 26. Mest foretrukket er antistoffer omfattende minst én CDR3 av et Vn-område som definert her. CDR3-doméne som er nevnt her angår de illustrerende parentale antistoffmolekyler MSR-3, MSR-7 eller MSR-8. Som vist i de vedlagte tabeller 1, 8 eller 10, kan imidlertid modne og/eller optimaliserte antistoffmolekyler som kan oppnås ved fremgangsmåtene beskrevet i de vedlagte eksempler, omfatte modifiserte Vr-, Vl-, CDR1-, CDR2- og CDR3-områder. I henhold til dette er antistoffmolekylet fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av MSR-3, MSR-7 eller MSR-8, eller en affinitetsmaturert versjon av MSR-3, MSR-7 eller MSR-8. Affinitetsmaturerte så vel som kryssklonete versjoner av MSR-3, MSR-7 og MSR-8 omfatter blant annet antistoffmolekyler omfattende CDR1-, CDR2- og/eller CDR3-områder, som vist i tabell 1 eller 8 ellerkarakteriserti en hvilken som helst av SEKV. ID nr. 15 til 20, 21 til 26, 60 til 74, 75 til 87, 92 og 93 eller 94 og 95, så vel som i SEKV. ID nr. 354 til 413. Mest foretrukket omfatter antistoffet minst én CDR, fortrinnsvis en CDR1, mer foretrukket en CDR2, mest foretrukket en CDR3 som vist i vedlagte tabell 1 og 8, eller som dokumentert i vedlagte tabell 10.

Det skal påpekes at affinitetmodningsteknikker er velkjente og beskrevet i de vedlagte eksempler og blant annet av Knappik (2000), J. Mol. Biol. 296, 55; Krebs (2000), J. Imm. Meth. 254, 67-84; WO 01/87337; WO 01/87338; US 6 300 064; EP 96 92 92 78.8 og ytterligere referanser gitt nedenfor.

I en mer foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er antistoffmolekylet et fullstendig antistoff (Immunoglobulin, som et IgGl, et IgG2, et IgG2b, et IgG3, et IgG4, et IgA, et IgM, et IgD eller et IgE), et F(ab)-, F(ab')2-fragment, et enkelkjedeantistoff, et kimært antistoff, et CDR-podet antistoff, en bivalent antistoffkonstruksjon,, et kryssklonet antistoff eller et syntetisk antistoff. Antistoffmolekylet kan også være er et Fabc-, Fv-, Fab'-fragment eller et antistoffusjonsprotein. Videre er det tatt sikte på genetiske varianter av immunglobulingener. Genetiske varianter av for eksempel immunglobulin tung G kjede subklasse 1 (IgGl) kan omfatte Glm(17)- eller Glm(3)-allotypisk markør i CH1-doménet, eller Glm(l)- eller Glm(non-l)-allotypiske markør i CH3-dom€net. Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen omfatter også modifiserte eller mutante antistoffer som mutant IgG med forbedret eller forringet Fc-reseptorbinding eller komplementaktivering. Det er også tatt sikte på at antistoffene ifølge oppfinnelsen fremstilles på konvensjonell måte, for eksempel produksjon av spesifikke, monoklonale antistoffer generert ved immunisering av pattedyr og fortrinnsvis mus, med peptider omfattende de to områdene av PA4, som definert her, for eksempel den N-terminale og sentrale område/epitop omfattende (a) aminosyrene 2 til 10 (eller en eller flere deler derav) av P-A4 og (b) et aminosyrestrekk omfattende aminosyrene 12 til 25 (eller én eller flere deler derav) av P-A4 (SEKV. ID nr. 27). I henhold til dette kan fagmannen på området generere monoklonale antistoffer mot et slikt peptid og kan avsøke de oppnådde antistoffer for evne til samtidig og uavhengig å binde til/reagere med det N-terminale og sentrale område/epitop av P-A4 som definert her. Tilsvarende avsøkingsfremgangsmåter er beskrevet i de vedlagte eksempler.

Som illustrert i de vedlagte eksempler, kan oppfinnelsens antistoffer/ antistoffmolekyler lett og fortrinnsvis rekombinant konstrueres og uttrykkes. Fortrinnsvis omfatter antistoffmolekylet minst ett, mer foretrukket minst to, fortrinnsvis minst tre, mer foretrukket minst fire, mer foretrukket minst fem og mest foretrukket seks CDR'er av de her definerte MSR-3-, MSR-7- eller MSR-8-parentale antistoffer eller av affinitetsmodning/optimaliserte antistoffer avledet fra nevnte parentale antistoffer. Det skal bemerkes at mer enn seks CDR'er kan omfattes i rekombinantproduserte antistoffer ifølge oppfinnelsen. Fagmannen på området kan lett benytte informasjonen som er gitt i de vedlagte eksempler for å dedusere tilsvarende CDR'er av de parentale så vel som de affinitetsoptimaliserte antistoffer. Eksempler på optimaliserte antistoffer som er oppnådd ved modning/optimalisering av de parentale antistoffer er blant annet vist i vedlagte tabell 1.

Et modent/optimalisert antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen er for eksempel MSR-7.9H7, som også karakteriseres ved sekvenser som vedlagt her og som omfatter SEKV. ID nr. 88 til 95 og som angir VH-området av MSR-7.9H7 (SEKV. ID nr. 88 og 89), VL-området av MSR-7.9H7 (SEKV. ID nr. 90 og 91), H-CDR3 av MSR-7.9H7 (SEKV. ID nr. 92 og 93) så vel som L-CDR3 av MSR-7.9H7 (SEKV. ID nr. 94 og 95). Illustrerende antistoffmolekyl 7.9H7 er avledet fra parentalt antistoff MSR7 og er et spesielt eksempel ifølge oppfinnelsen på et optimalisert/modent antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen. Dette antistoffmolekyl kan ytterligere modifiseres i henhold til oppfinnelsen, for eksempel i form av krysskloning, se nedenfor og vedlagte eksempler.

Som dokumentert i de vedlagte eksempler omfatter antistoffet ifølge oppfinnelsen også kryssklonete antistoffer, dvs. antistoffer omfattende forskjellige antistoffområder (for eksempel CDR-områder) fra ett eller flere parentale eller affinitetsoptimaliserte antistoffer, som beskrevet her. Disse kryssklonete antistoffer kan være antistoffer i flere forskjellige rammeverk, hvorved det mest foretrukne rammeverk er et IgG-rammeverk, enda mer foretrukket et IgGl-, IgG2a- eller IgG2b-rammeverk. Det er spesielt foretrukket at antistofframmeverket er et mammalsk-, og aller helst et humant rammeverk. Doméne av de lette og tunge kjeder har den samme generelle struktur, og hvert doméne omfatter fire rammeverksområder der sekvensene er relativt konserverte, forent av tre hypervariable doméner, kjent som komplementaritetsbestemmende områder (CDR1-3).

Som benyttet her angår et "humant rammeverksområde" et rammeverksområde som i det vesentlige er identisk (omkring 85 % eller mer, vanligvis 90-95 % eller mer) med rammeverksområdet på et naturlig forekommende humant immunglobulin. Rammeverksområdet til et antistoff, dvs. de kombinerte rammeverksområder for de deltagende lette og tunge kjeder, tjener til å posisjonere og å innrette CDR'ene. CDR'ene er primært ansvarlige for binding til en epitop eller et antigen. Det er verdt å merke seg at ikke bare kryssklonete antistoffer som beskrevet her kan være til stede i et foretrukket (humant) antistofframmeverk, men også antistoffmolekyler omfattende CDR'er fra blant annet de parentale antistoffene MSR-3, -7 eller -8, som beskrevet her eller av modnede antistoffer avledet fra nevnte parentale antistoffer, kan innføres i et immunglobulinrammeverk.

Som vist i de vedlagte eksempler er det blant annet mulig ved genetisk konstruksjon, som kjent i teknikken, å overføre hele lette kjeder fra en optimalisert donorklon til en optimalisert reseptorklon. Eksempel på en optimalisert donorklon er for eksempel L-CDR1 (LI) og et eksempel på en optimalisert reseptorklon er H-CDR2 (H2). Epitopspesifisitet kan bevares ved å kombinere klonene som har de samme H-CDR-3-områder. Ytterligere detaljer er gitt i det illustrerende eksempel 13.

Foretrukne kryssklonete antistoffmolekyler er valgt fra gruppen bestående av MS-R #3.3Hlx3.4L9, MS-R #3.4Hlx3.4L9, MS-R #3.4H3x3.4L7,

MS-R #3.4H3x3.4L9, MS-R #3.4H7x3.4L9, MS-R #3.4H7x3.4L7,

MS-R #3.6H5x3.6L 1, MS-R #3.6H5x3.6L2, MS-R #3.6.H8x3.6.L2,

MS-R #7.2H2x7.2L 1, MS-R #7.4H2x7.2Ll, MS-R #7.4H2x7.12L2,

MS-R #7.9H2x7.2Ll(Ll), MS-R #7.9H2x7.12Ll, MS-R #7.9H2x7.12L2, MS-R#7.9H2x7.12L2(Ll+2), MS-R #7.9H4x7.12.L2, MS-R #7.1 lHlx7.2Ll, MS-R#7.11Hlx7.11Ll,MS-R#7.11 H2x7.2L 1 (L 1), MS-R #7.11 H2x7.9L 1 (L 1), MS-R #7.11 H2x7.12L 1 eller MS-R #8. 1H1x8.2L1.

Genereringen av kryssklonete antistoffer er også illustrert i de vedlagte eksempler. De ovenfor nevnte foretrukne, kryssklonete antistoffer/antistoffmolekyler, er optimaliserte/modne antistoffmolekyler avledet fra parentale antistoffer, som beskrevet her, særlig fra MSR-3 og MSR-7.1 tillegg er ytterligere karakteriserende CDR-sekvenser og V-områder av de kryssklonete antistoffmolekyler/antistoffer gitt i de vedlagte SEKV. ID nr. 32, 33, 46 og 47 (MSR 3.6H5x3.6.L2; VH-, VL-områder); 34, 35, 48 og 49 (MSR 3.6H8x3.6.L2; VH-, VL-områder); 36, 37, 50 og 51

(MSR 7.4H2x7.2.Ll; VH-, VL-områder); 38, 39, 52 og 53 (MSR 7.9H2x7.12.L2;

VH-, VL-områder); 40, 41, 54 og 55 (MSR # 7.9H4x7.12.L2; VH-, VL-områder); 42, 43, 56 og 57 (MSR #7.11 Hlx7.11.Ll; VH-, VL-områder); og 44, 45, 58 og 59

(MSR #7.11 Hi x7.2.Ll; VH-, VL-områder). Tilsvarende CDR3-områder av disse spesielt foretrukne kryssklonete antistoffmolekyler er angitt i SEKV. ID nr. 60 til 87. For ytterligere MSR-antistoffmolekyler kan Vh-, Vl-, CDR-områder deduseres fra de vedlagte tabeller 8 eller 10 og fra de vedlagte sekvenslister, særlig SEKV. ID nr. 32 til 95 for MS-R antistoffer/antistoffmolekyler #3.6H5x3.6L2, #3.6H8x3.6L2, #7.4H2x7.2Ll, #7.9H2x7.12L2, #7.9H4x7.12L2, #7.11Hlx7.11Ll,

#7.11Hlx7.2Ll og #7.9H7 eller SEKV. ID nr. 294 til 413 for MSR-R antistoffer/antistoffmolekyler MS-R #3.3Hlx3.4L9, #3.4Hlx3.4L9, #3.4H3x3.4L7, #3.4H3x3.4L9, #3.4H7x3.4L9, #3.4H7x3.4L7, #3.6H5x3.6Ll, #7.2H2x7.2Ll, #7.4H2x7.12L2, #7.9H2x7.2Ll, #7.9H2x7.12Ll, #7.11H2x7.2Ll, #7.11H2x7.9Ll, #7.1 1H2x7. 12L1 eller #8. 1H1x8.2L1 .1 henhold til dette og ved siden av VH-området som definert ovenfor, kan foretrukne antistoffmolekyler omfatte VH-områder som definert i en hvilken som helst av SEKV. ID nr. 294 til 323. Tilsvarende angir SEKV. ID nr. 324 til 353 foretrukne VL-områder, som ved siden av VL-områder som definert ovenfor, som kan være inneholdt i oppfinnelsens antistoffmolekyler. Tilsvarende CDR-3-områder er beskrevet ovenfor, så vel som i ytterligere sekvenser som vist i SEKV. ID nr. 354 til 413.

Oppfinnelsens antistoffmolekyler kan lett fremstilles i tilstrekkelige mengder, blant annet ved rekombinante fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, se for eksempel Bentley, Hybridoma 17 (1998), 559-567; Racher, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40

(1994), 851-856; Samuelsson, Eur. J. Immunol. 26 (1996), 3029-3034.

Teoretisk er i oppløselig P-A4 (monomerisk/oligomerisk) både den N-terminale- og midtepitopene tilgjengelige for antistoffinteraksjon og antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen, kan enten binde til en terminal- eller midtepitopen separat, men under disse betingelser vil maksimal affinitet ikke oppnås. Det er imidlertid mer sannsynlig at en optimal kontakt til antistoffparatopen vil oppnås ved samtidig binding til begge epitoper, dvs. tilsvarende interaksjoner med aggregert P-A4. Således er antistoffer ifølge oppfinnelsen unike anti-AP-antistoffer i det at de binder til aggregert P-A4 (via interaksjon med den N-terminale- og midtepitopen), og samtidig også er i stand til å stabilisere og nøytralisere den konformasjonelle epitop i oppløselig P-A4. Disse antistoffer er distinkte overfor den kjente teknikks antistoffer.

Mest foretrukket er antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen som har en affinitet til AP eller definerte fragmenter derav med en Ko-verdi lavere enn 2000 nM, fortrinnsvis lavere enn 100 nM, mer foretrukket lavere enn 10 nM, mest foretrukket lavere enn 1 nM. Målingen av slike affiniteter kan gjennomføres ved fremgangsmåter som vist i eksemplene og som er kjent i teknikken. Slike fremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til "BIACORE"-analyser (www.biacore.com; Malmquist (1999), Biochem. Soc. Trans. 27, 335-340) og fast faseanalyser ved anvendelse av merkete antistoffer eller merket Ap.

Fortrinnsvis er antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen i stand til å dekorere/reagere med/binde til amyloid plakk i in vitro (post mortem) hjernesnitt fra pasienter som lider av amyloidrelaterte lidelser som Alzheimers sykdom. Likeledes er det også foretrukket at oppfinnelsens antistoff/antistoffmolekyler forhindrer AP-aggregering in vivo så vel som i in v/rro-analyser som vist i de vedlagte eksempler. Tilsvarende er antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen foretrukket for å depolymerisere AP-aggregat in vivo- og/eller in v/zro-analyse, som vist i eksemplene. Denne evne hos oppfinnelsens antistoffer/antistoffmolekyler er blant annet å kunne benyttes til medisinske formål, særlig i farmasøytiske sammensetninger, som beskrevet nedenfor.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et nukleinsyremolekyl som koder et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, som definert her.

Nevnte nukleinsyremolekyl kan være et naturlig nukleinsyremolekyl og også et rekombinant nukleinsyremolekyl. Nukleinsyremolekylet ifølge oppfinnelsen kan derfor være av naturlig opprinnelse, syntetisk eller også semisyntetisk. Det kan omfatte DNA, RNA, så vel som PNA og kan være en hybrid derav.

Det er åpenbart for fagmannen at regulatoriske sekvenser kan adderes til nukleinsyremolekylet ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan det benyttes promotere, transkripsjonene enhancere og/eller sekvenser som tillater indusert ekspresjon av polynukleotider ifølge oppfinnelsen. Et egnet induserbart system er for eksempel tetrasyklinregulert genekspresjon som beskrevet for eksempel av Gossen og Bujard (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 5547-5551) og Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62), eller et dexametasoninduserbart genekspresjonssystem, som beskrevet for eksempel av Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519.

Videre er det tatt sikte på for ytterligere formål, at nukleinsyremolekylet for eksempel kan inneholde tioesterbindinger og/eller nukleotidanaloger. Nevnte modifikasjoner kan være nyttige for stabilisering av nukleinsyremolekylet mot endo- og/eller eksonukleaser i cellen. Nevnte nukleinsyremolekyler kan transkriberes med en egnet vektor inneholdende kimære gener som tillater transkripsjon av nevnte nukleinsyre i cellen. I denne forbindelse skal det også være klart at polynukleotidet ifølge oppfinnelsen kan benyttes for "genmålsøkende"- eller "genterapeutiske"- tilnærminger. I en annen utførelsesform er nevnte nukleinsyremolekyler merket. Fremgangsmåter for påvisning av nukleinsyrer er velkjent i teknikken, for eksempel Southern og Northern blotting, PCR eller primerforlengelse. Denne utførelsesform kan være nyttig i screeningsmetoder for å bekrefte vellykket innføring av oppfinnelsens nukleinsyremolekyler under genterapiaktiviteter.

Nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen kan være et rekombinant produsert, kimært nukleinsyremolekyl omfattende en hvilken som helst av de ovenfor nevnte nukleinsyremolekyler, enten alene eller i kombinasjon. Fortrinnsvis er nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen del av en vektor.

Foreliggende oppfinnelse angår derfor også en vektor, omfattende nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen.

Vektoren ifølge oppfinnelsen kan for eksempel være et plasmid, kosmid, et virus, en bakteriofag eller en annen vektor benyttet for eksempel konvensjonelt i genetisk konstruksjon, og kan videre omfatte gener som markørgener som tillater seleksjon av vektoren i en egnet vertscelle under egnete betingelser.

Videre kan vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse, i tillegg til nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen, omfatte ekspresjonskontrollelementer som tillater riktig ekspresjon av de kodende områder, i egnete verter. Slike kontrollelementer er velkjente for fagmannen, og kan inkludere en promoter, en spleisekassett,

translasjonsinitieringskodon, translasjon og innføringssete for innføring av et innskudd i

vektoren. Fortrinnsvis er nukleinsyremolekylet ifølge foreliggende oppfinnelse operativt forbundet til nevnte ekspresjonskontrollsekvens som tillater ekspresjon i eukaryote eller prokaryote celler.

Kontrollelementer som sikrer ekspresjon i eukaryote og prokaryote celler er velkjente for fagfolk på området. Som nevnt ovenfor omfatter det vanligvis regulatoriske sekvenser som sikrer initiering av transkripsjon og evt. poly-A-signaler som sikrer terminering av transkripsjon og stabilisering av transkripsjonen. Ytterligere regulatoriske elementer kan inkludere transkripsjonene så vel som translasjonelle enhancere, og/eller naturlig assosierte eller heterologe promoterområder. Mulige regulatoriske elementer som tillater ekspresjon i for eksempel pattedyrvertsceller omfatter CMV-HSV-tymidinkinasepromoteren, SV40, RSV-promoteren (Rous Sarkoma Virus), human forlengelsesfaktor la-promoteren, den glukokortikoidinduserbare MMTV-promoteren (Moloney musetumorvirus), metallotionein- eller tetrasyklininduserbare promotere, eller enhancere som CMV- eller SV40-enhancer. For ekspresjon i nøytrale celler er det tatt sikte på at neurofilament-, PGDF-, NSE-, PrP- eller thy-1-promotere kan anvendes. Nevnte promotere er velkjente innen teknikken, og blant annet beskrevet av Charron (1995), J. Biol. Chem. 270, 25739-25745. For ekspresjon i prokaryote celler er det beskrevet et stort antall inkludert, for eksempel tac-lac-promoteren eller trp-promoteren. Ved siden av elementer som er ansvarlige for initiering av transkripsjon, kan slike regulatoriske elementer også omfatte transkripsjonstermineringssignaler som SV40 poly-A-sete eller tk-poly-A-setet, nedstrøms for polynukleotidet. I denne kontekst er det kjent egnete ekspresjonsvektorer som Okayama-Berg cDNA-ekspresjonsvektor pcDVl (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORTl (GIBCO BRL), pX (Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), gjær to-hybrid vektorer som pEG202 og dpJG4-5 (Gyuris

(1995) Cell 75, 791-803), eller prokaryote ekspresjonsvektorer som Xgtl 1 eller pGEX (Amersham-Pharmacia). Ved siden av nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen kan vektoren videre omfatte nukleinsyresekvenser som koder sekresjonssignaler. Slike sekvenser er velkjente for fagmannen. Videre, avhengig av ekspresjonssystemet anvendt, kan ledersekvenser som er i stand til å styre polypeptidene ifølge oppfinnelsen til et cellulært rom, tilsettes kodingssekvensene av nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen, og dette er velkjent i teknikken. Ledersekvensen(e) sammensettes i egnete faser med translasjons-, initierings- og termineringssekvenser, og fortrinnsvis en ledersekvens som er i stand til å styre sekresjonen av translatert protein, eller et protein derav, inn i det periplasmiske rom eller ekstracellulære medium. Evt. kan den heterologe sekvens kode et fusjonsprotein inkludert et C- eller N-terminalt identifiseringspeptid som gir ønskete karakteristika, for eksempel stabilisering eller forenklet rensing av uttrykte, rekombinante produkter. Når først vektoren er innarbeidet i den egnete vert, blir verten holdt under betingelser som er egnet for høynivåekspresjon av nukleotidsekvensen, og etter ønske kan oppsamling og rensing av antistoffmolekylene eller fragmentene derav ifølge oppfinnelsen, følge etter dette.

Oppfinnelsen angår i henhold til dette også verter/vertsceller omfattende en vektor som definert her. Slike verter kan være nyttige for prosessering for oppnåelse av antistoffer/antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen, så vel som i medisinske/farmasøytiske oppsett. Nevnte vertsceller kan også omfatte transduserte eller transfekterte neuronalceller som neuronale stamceller, fortrinnsvis adultneuronale stamceller. Slike vertsceller kan være nyttige ved transplantasjonsterapier.

Videre kan vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse også være en ekspresjons-, en genoverførings- eller geninnsiktingsvektor. Genterapi basert på innføring av terapeutiske gener i celler ved ex- vivo eller in vivo teknikker, er en av de viktigste anvendelser ved genoverføring. Transgene mus som uttrykker et nøytraliserende antistoff rettet mot nervevekstfaktor, er generert ved anvendelse av "neuroantistoff '-teknikken: Capsoni, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 97 (2000), 68266831 og Biocca, Embo J. 9 (1990), 101-108. Egnete vektorer, fremgangsmåter eller genavleveringssystemer for in vitro- eller in v/vø-genterapi, er beskrevet i litteraturen og er velkjent for fagmannen, se for eksempel Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79

(1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5 580 859; US 5 589 466; US 4 394 448 eller Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, og i deri angitte referanser. Særlig er nevnte vektorer og deres genavleveringssystemer også beskrevet ved genterapitilnærminger i neurologisk vev/celler (se blant annet Blomer, J. Virology 71 (1997), 6641-6649) eller i hypotalamus (se blant annet Geddes, Front Neuroendocrinol. 20 (1999), 296-316, eller Geddes, Nat. Med. 3 (1997), 1402-1404). Ytterligere egnete genterapikonstrukter for anvendelse i neurologiske celler/vev, er kjent i teknikken, for eksempel hos Meier

(1999), J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58, 1099-1110. Nukleinsyremolekylene og vektorene ifølge oppfinnelsen kan være konstruert for direkte innføring inn i cellen, eller for innføring inn i cellen via liposomer, virale vektorer (for eksempel adenovirale eller retrovirale), elektroporering, ballistisk (for eksempel genpistol) eller via andre avleveringssystemer. I tillegg kan et baculoviralt system anvendes som eukaryot ekspresjonssystem for nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen. Innføringen og den genterapeutiske tilnærmelse, bør fortrinnsvis føre til ekspresjon av et funksjonelt antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, hvorved nevnte uttrykte antistoffmolekyl er spesielt nyttig i behandling, lindring og/eller prevensjon av neurologiske lidelser relatert til anormale amyloid syntese, sammensetning og/eller aggregering, som for eksempel Alzheimers sykdom og liknende.

I henhold til dette kan nukleinsyremolekylet ifølge foreliggende oppfinnelse og/eller de ovenfor beskrevne vektorer/verter ifølge oppfinnelsen, være spesielt nyttige som farmasøytiske preparater. Nevnte farmasøytiske preparater kan anvendes i genterapitilnærminger. I denne kontekst er det tatt sikte på at nukleinsyremolekylene og/eller vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å modulere, endre og/eller modifisere den (cellulære) ekspresjon og/eller konsentrasjon av antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen eller et eller flere fragmenter derav.

For genterapianvendelser kan nukleinsyrer som koder peptider ifølge oppfinnelsen eller fragmenter derav, klones inn i et genavleveringssystem, for eksempel et virus, som benyttes for infeksjon og for å gi sykdomsforbedrende eller -helbredende effekter i den infiserte celle eller organisme.

Foreliggende oppfinnelse angår også en vertscelle som er transfektert eller transformert med vektoren ifølge oppfinnelsen, eller en ikke-human vert som bærer vektoren ifølge oppfinnelsen, dvs. til en vertscelle eller en vert som er genetisk modifisert med et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen eller med en vektor omfattende et slikt nukleinsyremolekyl. Uttrykket "genetisk modifisert" betyr at vertscellen eller verten i tillegg til sitt naturlige genom, omfatter et nukleinsyremolekyl eller en vektor ifølge oppfinnelsen, som ble innført i cellen eller verten eller i en av forgjengerne/foreldrene. Nukleinsyremolekylet eller vektoren kan være til stede i den genetisk modifiserte vert eller vertscelle, enten som et uavhengig molekyl utenfor genomet, spesielt som et molekyl som er i stand til replikering, eller kan være stabilt integrert i vertscellen eller vertens genom.

Vertscellen ifølge oppfinnelsen kan være en hvilken som helst prokaryot eller eukaryot celle. Egnete prokaryote celler er de som generelt benyttes for kloning som E. coli eller Bacillus subtilis. Videre omfatter eukaryote celler for eksempel fungale eller animalske celler. Eksempler på egnete fungale celler er gjærceller, fortrinnsvis de av genuset Saccharomyces og spesielt de av spesies Saccharomyces cerevisiae. Egnete animalceller er for eksempel innsektsceller, vertebratceller, fortrinnsvis pattedyrceller, som for eksempel HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Disse vertsceller, for eksempel CHO-celler, kan tilveiebringe post-translasjonelle modifikasjoner til antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen, inkludert lederpeptidfjerning, folding og sammensetting av H-(tung) og L- (lett) kjeder, glykosylering av molekylet på korrekte sider, og sekresjon av det funksjonelle molekyl. Ytterligere egnete cellelinjer som er kjent i teknikken, kan oppnås fra cellelinjedepoter som "the American Type Culture Collection" (ATCC). I henhold til oppfinnelsen er det videre tatt sikte på at primærceller/cellekulturer kan funksjonere som vertsceller. Nevnte celler ble spesielt avledet fra insekter (som insekter av spesiene Drosophilia eller Blatta) eller pattedyr (som menneske, svin, mus eller rotte). Disse vertsceller kan også omfatte celler fra og/eller avledet fra cellelinjer som neuroblastomcellelinjer. De ovenfor nevnte primærceller er velkjent i teknikken og omfatter blant annet primær astrocytter, (blandete) spinalkulturer eller hippocampalkulturer.

I en mer foretrukket utførelsesform er vertscellen som er transformert med vektoren ifølge oppfinnelsen, en neuronal celle, en neuronal stamcelle (for eksempel en adult neuronal stamcelle), en hjernecelle eller en celle (linje) avledet derfra. Imidlertid kan også en CHO-celle omfattende nukleinsyremolekylt ifølge oppfinnelsen være spesielt nyttig som vert. Slike celler kan gi de korrekte sekundærmodifikasjoner på de uttrykte molekyler, dvs. antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen. Disse modifikasjonene omfatter blant annet glykosyleringer og fosforyleringer.

Verter kan være ikke-humane pattedyr, fortrinnsvis mus, rotte, sau, kalv, hund eller aper av forskjellige typer. Nevnte pattedyr kan være uunnværlige for utvikling av en helbredelse, særlig en for neurologiske og/eller neurodegenerative lidelser som nevnt ovenfor. Videre kan vertene ifølge oppfinnelsen være spesielt nyttige ved fremstilling av antistoffmolekyler (eller fragmenter derav) ifølge oppfinnelsen. Det er tatt sikte på at antistoffmolekylene (eller fragmentene derav) isoleres fra verten. Dvs. at det blant annet er tatt sikte på at nukleinsyremolekylene og/eller vektorene som e beskrevet her, er innarbeidet i sekvenser for transgen ekspresjon. Innføringen av oppfinnelsens nukleinsyremolekyler som transgener i ikke-humane verter, og deres etterfølgende ekspresjon kan benyttes for fremstilling av oppfinnelsens antistoffer. For eksempel kan ekspresjonen av ett eller flere slike transgener i melken til det transgene dyr, gi en mulighet for å oppnå oppfinnelsens antistoffmolekyler i kvantitative mengder, se blant annet US 5 741 957; US 5 304 489 eller US 5 849 992. Nyttige transgener i dette henseende omfatter nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen, for eksempel kodende sekvenser for de lette og tunge kjeder av antistoffmolekylene som beskrevet her, operativt forbundet til promoter- og/eller enhancerstrukturer fra et brystkjertelspesifikt gen som kasein eller P-lactoglobulin.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, omfattende dyrking av vertscellen, som beskrevet her under betingelser som tillater syntese av antistoffmolekylet og gjenvinning av antistoffmolekylet fra kulturen.

Oppfinnelsen angår også et preparat omfattende et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen eller et antistoffmolekyl fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, og evt. ytterligere molekyler, enten alene eller i kombinasjon, og for eksempel molekyler som er i stand til å interferere med dannelse av amyloid plakk, eller som er i stand til depolymerisering av allerede dannet amyloid plakk. Uttrykket "preparat" som benyttet her, omfatter minst én forbindelse ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er et slikt preparat et farmasøytisk eller et diagnostisk preparat.

Preparatet kan foreligge i fast eller flytende form, og kan blant annet foreligge i form av ett eller flere pulvere, tabletter, oppløsninger eller aerosoler. Preparatet kan omfatte ett eller flere antistoffer/antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen eller nukleinsyremolekyler, vektorer eller verter ifølge oppfinnelsen. Det er også tatt sikte på at preparatet omfatter minst to, og fortrinnsvis tre, helst fire og aller helst fem antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen eller nukleinsyremolekyler som koder nevnte antistoffmolekyler. Preparatet kan også omfatte optimaliserte antistoffer/antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen, oppnåelige ved de fremgangsmåter som er beskrevet her, og i de vedlagte eksempler.

Det er foretrukket at det farmasøytiske preparat evt. omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel. Det her beskrevne farmasøytisk preparat kan være spesielt nyttig for behandling av neurologiske og/eller neurodegenerative lidelser. Disse lidelser omfatter, men er ikke begrenset til Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), arvelig cerebral hemorragi med amyloidose av hollandsk type, Down's syndrom, HTV-demens, Parkinson's sykdom og aldersrelaterte neuronale lidelser. Det farmasøytiske preparatet ifølge oppfinnelsen er blant annet tenkt som potent inhibitor av amyloid plakkdannelse eller som en potent stimulator for depolymerisering av amyloid plakk. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor farmasøytiske preparater omfattende forbindelser ifølge oppfinnelsen for anvendelse ved behandling av sykdommer/lidelser assosiert med patologisk APP-proteolyse og/eller amyloid plakkdannelse.

Eksempler på farmasøytisk egnete bærere, eksipienser eller fortynningsmidler er velkjent i fagfeltet og inkluderer fosfatbufrete saltoppløsninger, vann, emulsjoner, for eksempel olje/vann-emulsjoner, forskjellige typer fuktemidler, sterile oppløsninger osv. Preparater omfattende slike bærere, kan formuleres i henhold til velkjente, konvensjonelle fremgangsmåter. Disse farmasøytiske preparater kan administreres til individer i egnete doser. Administrering av de egnete preparater kan gjennomføres på forskjellige måter, for eksempel ved intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær, topisk, intradermal, intranasal eller intrabronkial administrering. Det er spesielt foretrukket at administreringen gjennomføres ved injeksjon og/eller avlevering, for eksempel til et sete i en hjernearterie eller direkte inn i hjernevevet. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan også administreres direkte til det målsøkte setet, for eksempel ved biolistisk avlevering til et eksternt eller internt målsete, som hjernen. Doseregimet vil bestemmes av legen og forskjellige kliniske faktorer. Som velkjent i den medisinske teknikk, avhenger dosene for en hvilken som helst pasient av mange faktorer, inkludert pasientens størrelse, kroppens overflateareal, alder og den spesielle forbindelse som skal administreres, kjønn, tid og administreringsrute, generell helse og andre medikamenter som administreres samtidig. Proteinholdige farmasøytiske aktive stoffer kan være til stede i mengder mellom 1 ng og 10 mg/kg kroppsvekt/dose; imidlertid kan doser under eller over dette eksempelområdet benyttes, særlig tatt i betraktning de ovenfor nevnte faktorer. Hvis regimet er en kontinuerlig infusjon, bør den også ligge i området fra 1 ug til 10 mg enheter/kg kroppsvekt/minutt.

Forløpet kan overvåkes ved periodisk bedømmelse. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres lokalt eller systemisk. Det er verdt å merke seg at perifert administrerte antistoffer, kan trenge inn i sentralnervesystemet, se blant annet Bard (2000), Nature Med. 6, 916-919. Preparater for parenteral administrering inkluderer sterile, vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige oppløsningsmidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer som olivenolje og injiserbare, organiske estere som etyloleat. Vandige bærere inkluderer vann, alkoholiske/vandige oppløsninger, emulsjoner eller suspensjoner, inkludert salt-og bufrete media. Parenterale bærere inkluderer natriumkloridoppløsninger, Ringers dextrose, dextrose og natriumklorid, Ringers laktat, eller ikke-flyktige oljer. Intravenøse vehikler inkluderer fluide og næringsanrikere, elektrolyttanrikere (som de basert på Ringers dextrose) og liknende. Konserveringsmidler og andre tilsettinger kan også være til stede, for eksempel antimikrobiobielle midler, antioksidanter, chelateringsmidler og inerte gasser og liknende. Videre kan det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen omfatte ytterligere midler avhengige av den tilsiktete anvendelse av det farmasøytiske preparat. Slike midler kan være medikamenter som virker på sentralnervesystemet, for eksempel neurobeskyttende faktorer, kolinesteraseinhibitorer, agonister av Ml-muskariniske reseptor, hormoner, antioksidanter, inflammasjonsinhibitorer osv. Det er spesielt foretrukket at det farmasøytiske preparat omfatter ytterligere midler som for eksempel neurotransmittere og/eller substitusjonsmolekyler for neurotransmittere, vitamin E eller a-liponsyre.

De farmasøytiske preparater,, eller anvendelsen av oppfinnelsen, som beskrevet ovenfor, kan benyttes for behandling av alle typer sykdommer som hittil ikke er kjente, eller er relatert til eller avhengig av patologisk APP-aggregering eller patologisk APP-prosessering. De kan være spesielt nyttige for behandling av Alzheimers sykdom og andre sykdommer der ekstracellulære avsetninger av amyloid-P synes å spille en rolle. De kan hensiktsmessig anvendes i mennesker, selv om behandling av dyr også ligger innenfor fremgangsmåtene, anvendelsene og preparatene beskrevet heri.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er preparatet ifølge oppfinnelsen som er beskrevet et diagnostisk preparat som videre evt. omfatter egnete midler for påvisning. Det diagnostiske preparat omfatter minst én av de ovenfor nevnte forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Nevnte diagnostiske preparat kan omfatte forbindelsene ifølge oppfinnelsen, og særlig og fortrinnsvis antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen, i oppløselig form/væskefase, men det er også tatt sikte på at preparatene er bundet til/festet til og/eller forbundet med en fast bærer.

Faste bærere kan benyttes i kombinasjon med det diagnostiske preparat, som definert her, eller forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan være direkte bundet til nevnte faste bærere. Slike bærere er velkjente i teknikken og omfatter blant annet kommersielt tilgjengelige kolonnematerialer, polystyrenkuler, latekskuler, magnetiske kuler, kolloide metallpartikler, glass- og/eller silisiumbrikker og overflater, nitrocellulosestrimler, membraner, ark, duracytter, brønner og vegger i reaksjonsbeholdere, plastrør osv. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, og særlig antistoffene ifølge oppfinnelsen, kan bindes til mange forskjellige bærere. Eksempler på velkjente bærere er glass, polystyren, polyvinylklorid, polypropylen, polyetylen, polykarbonat, dekstran, nylon, amyloser, naturlig og modifiserte celluloser, polyakrylamider, agaroser og magnetitt. Bæreren kan være enten oppløselig eller uoppløselig for oppfinnelsens formål. Egnete markører og fremgangsmåter for merking er identifisert ovenfor, og er i tillegg nevnt nedenfor. Egnete fremgangsmåter for fiksering/immobilisering av oppfinnelsens forbindelser er velkjent i fagfeltet og inkluderer, men er ikke begrenset til ioniske, hydrofobe, kovalente interaksjoner og liknende.

Det er spesielt foretrukket at det diagnostiske preparat ifølge oppfinnelsen benyttes for påvisning og/eller kvantitering av APP- og/eller APP-prosesserende produkter, som amyloid-P eller for påvisning og/eller kvantitering av patologiske og/eller (genetisk) modifiserte APP-spaltingsseter.

Som illustrert i de vedlagte eksemplene, er forbindelsene ifølge oppfinnelsen, og særlig oppfinnelsens antistoffmolekyler, spesielt nyttige som diagnostiske midler ved påvisning av genuint, humant amyloid plakk i hjernedeler hos Alzheimers pasienter ved indirekte immunfluoresens.

Det er foretrukket at forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i et diagnostisk preparat i påvisbar, merket tilstand. Et antall teknikker er tilgjengelige for merking av biomolekyler, og er velkjente for fagmannen på området, og anses å ligge innenfor rammen av oppfinnelsen. Slike teknikker er for eksempel beskrevet av Tijssen, "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH og von Knippenburg (red.), bind 15 (1985), "Basic methods in molecular biology"; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer et al., (red.) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987), eller i serien "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.

Det er mange forskjellige markører og fremgangsmåter for merking som er velkjente for fagmannen. Eksempler på typene markører som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er enzymer, radioisotoper, kolloide metaller, fluorescente forbindelser, kjemiluminescente forbindelser og bioluminescente forbindelser.

Vanlig anvendte markører omfatter blant annet fluorokromer (som fluorescein, rodamin, Texasrødt etc.), enzymer (som pepperotperoksidase, P-galaktosidase, alkalisk fosfatase), radioaktive isotoper (som 32 P eller<125>I), biotin, digoksygenin, kolloide metaller, kjemi- eller bioluminesente forbindelser (som dioksetaner, luminol eller akridiner). Merkingsprosedyrer er på samme måte som kovalent kobling av enzymer eller biotinylgrupper, ioderinger, fosforyleringer, biotinyleringer osv., velkjente i teknikken.

Påvisningsfremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til autoradiografi, fluorescens mikroskopi, direkte og indirekte enzymatiske reaksjoner osv. Vanlig anvendte påvisningsanalyser omfatter radioisotopiske eller ikke-radioisotopiske fremgangsmåter. Disse omfatter blant annet Western blotting, overlappanalyse, RIA (radioimmunoanalyse) og IRMA (immun radioimmunometrisk analyse), EIA (enzymimmunoanalyse), ELISA (enzymkoblet immunosorbentanalyse), FIA (fluorescent immunoanalyse), og CLIA (kjemoluminescent immunoanalyse).

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved oppfinnelsens fremgangsmåte av et nukleinsyremolekyl, en vektor eller en vert ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk eller et diagnostisk preparat for forebygging, behandling og/eller diagnose av en sykdom assosiert med amyloid genese og/eller amyloid plakkdannelse.

Det er videre foretrukket forbindelsene, som beskrevet her, særlig antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen, anvendes for fremstilling av farmasøytiske preparater for forebygging og/eller behandling av neuropatologier assosiert med modifisert eller anormal APP-prosessering og/eller amyloidogenese.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for disintegrasjon av P- amyloide plakk og et farmasøytisk preparat omfattende et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for anvendelse i disintegrasjonen av P- amyloide plakk.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for passiv immunisering mot P-amyloide plakk dannelse, og et farmasøytisk preparat omfattende et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for anvendelse i passiv immunisering mot P-amyloide plakk dannelse.

Antistoffmolekylene, for eksempel i form av (konstruerte) immunglobuliner som antistoffer i et IgG-rammeverk, særlig et IgGl-rammeverk eller i format av kimære antistoffer, bispesifikke antistoffer, enkeltkjede Fv'er (scFVer) eller bispesifikke scFv'er og liknende, anvendes ved fremstilling av de her beskrevne farmasøytiske preparatene. Videre er antistoffmolekylene også nyttige ved diagnostiske prosedyrer, som dokumentert i de vedlagte eksempler, fordi antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen spesifikt interagerer med/påviser A04 og/eller amyloide avsettinger/plakk. Derfor er en oppfinnerisk anvendelse av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, anvendelsen for fremstilling av et farmasøytisk preparat mot en neurologisk lidelse som krever lindring, for eksempel ved desintegrering av P-amyloid plakk, ved amyloid (plakk) klaring eller ved passiv immunisering mot P-amyloid plakkdannelse. Som illustrert i de vedlagte eksempler er oppfinnelsens antistoffmolekyler spesielt nyttige ved prevensjon av AP-aggregering og ved depolymerisering av allerede dannede amyloidaggregater. I henhold til dette er oppfinnelsens antistoffer for anvendelse ved reduksjon av patologisk amyloidavsettinger/plakk, ved klaring av amyloid plakk/plakk forløpere, så vel som i neuronal beskyttelse. Det er spesielt tatt sikte på antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen benyttes ved in vivo prevensjon av amyloid plakk, så vel som ved in vivo klaring av preeksisterende amyloidplakk/avsettinger. Videre kan antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen benyttes i passive immuniseringshandlinger mot AP4. Klaring av Ap4/Ap4-avsettninger kan blant annet oppnås ved den medisinske anvendelse av antistoffer ifølge oppfinnelsen som omfatter en Fc-del. Nevnte Fc-del av et antistoff kan være spesielt nyttig ved Fc-reseptormedierte immunresponer, for eksempel tiltrekning av makrofager (fagocyttiske celler og/eller mikroglia) og/eller hjelperceller. For mediering av Fc-del-relaterte immunresponser er antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis i et (humant) IgGl-rammeverk. Som diskutert her er de foretrukne individer for behandling med oppfinnelsens antistoffmolekyler, nukleinsyremolekylene som koder de samme eller deler derav, vektorene ifølge oppfinnelsen eller vertscellene ifølge oppfinnelsen, et humant individ. Andre rammeverk, som IgG2a- eller IgG2b-rammeverk for oppfinnelsens antistoffmolekyler, er det også tatt sikte på. Immunglobulinrammeverk i IgG2a- og IgG2b-formatet er spesielt tatt sikte i museoppsett, for eksempel ved vitenskapelige anvendelser av oppfinnelsens antistoffmolekyler, for eksempel i tester på transgene mus som uttrykker (humant) villtype- eller muterte APP, APP-fragmenter og/eller AP4.

De ovenfor angitte sykdommer assosiert med amyloidogenese og/eller amyloid plakkdannelse omfatter, men er ikke begrenset til demens, Alzheimers sykdom, motor neuropati, Parkinson's sykdom, ALS (amyotrofisk lateral sklerose), scrapie, HIV- relatert demens så vel som Creutzfeld Jacobs sykdom, arvelig cerebral hemorragi med amyloidosis av hollandsk type, Down's syndrom og aldersrelaterte neuronale lidelser. Antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen og preparatene som tilveiebringes her, kan også være nyttige ved lindring eller prevensjon av inflammatoriske prosesser i forbindelse med amyloidogenese og/eller amyloid plakkdannelse.

Videre kan det frembringes et sett omfattende minst ett antistoffmolekyl, minst ett nukleinsyremolekyl, minst én vektor eller minst én vertscelle ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis kan settet videre omfatte evt. en eller flere buffere, lagringsoppløsninger og/eller ytterligere reagenser eller materialer som kreves for gjennomføring av medisinske, vitenskapelige eller diagnostiske analyser og formål. Videre kan deler av settet være pakket individuelt i ampuller eller flasker eller i kombinasjoner i beholdere eller multibeholderenheter.

Settet kan fordelaktig blant annet benyttes ved ulike anvendelser, som nevnt her, for eksempel som diagnostiske sett, som forskningsverktøy eller medisinske verktøy. I tillegg kan settet ifølge oppfinnelsen inneholde midler for påvisning egnet for vitenskapelige, medisinske og diagnostiske formål. Fremstillingen av settene følger fortrinnsvis standard prosedyrer som er velkjent i fagfeltet.

Optimalisering av et antistoffmolekyl, som definert kan omfatte trinnene

(a) å konstruere et bibliotek av diversifiserte Fab-aminosyrefragmenter avledet fra et antistoff omfattende minst én CDR3 av et VH-område som kodes av et nukleinsyremolekyl som vist i SEKV. ID nr. 21, 23 eller 25, eller minst én CDR3-aminosyresekvens av et Vn-område som vist i SEKV. ID nr. 22, 24 eller 26; (b) å teste de resulterende Fab-optimaliseringsbibliotek ved panning mot AØ/A04;

(c) å identifisere optimaliserte kloner; og

(d) å uttrykke valgte optimaliserte kloner.

Optimalisering av antistoffene/antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen er også dokumentert i de vedlagte eksempler, og kan omfatte valg for eksempel for høyere affinitet for én eller begge områder/epitoper av P-A4, som definert her, eller valg for forbedret ekspresjon og liknende. I en utførelsesform omfatter valget for høyere affinitet for én eller begge områder/epitoper av p\A4 valg for høyere affinitet til (a) et aminosyrestrekk omfattende aminosyrer 2 til 10 (eller en eller flere deler derav) av P-A4 og/eller (b) et aminosyrestrekk omfattende aminosyrer 12 til 25 (eller en eller flere deler derav) av p<->A4 (SEKV. ID nr. 27).

Fagmannen på området kan lett utøve oppfinnelsenved å anvende oppfinnelsens lære. Optimaliseringprotokoller for antistoffer er velkjent i fagfeltet. Disse optimaliseringsprotokoller omfatter blant annet CDR walking mutagenese som beskrevet og illustrert her, og beskrevet hos Yang (1995), J. Mol. Biol. 25, 392-403; Schier (1996), J. Mol. Biol. 263, 551-567; Barbas (1996), Trends. Biotech 14, 230-34 eller Wu (1998), PNAS 95, 6037-6042; Schier (1996), Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Moore (1997), J. Mol. Biol. 272, 336.

"Panning"-teknikker er også kjent, se for eksempel Kay (1993), Gene 128,

59-65. Videre gir publikasjoner som Borrebaeck (1995), "Antibody Engineering", Oxford University, 229-266; McCafferty (1996), "Antibody Engineering", Oxford University Press; Kay (1996), A Laboratory Manual, Academic Press optimaliseringsprotokoller som kan modifiseres i henhold til oppfinnelsen.

Optimaliseringsfremgangsmåten kan videre omfatte et trinn (ca) der de optimaliserte kloner optimaliseres ytterligere ved kassettmutagense, som vist i de vedlagte eksempler.

Fremgangsmåten for optimalisering av et antistoffmolekyl som beskrevet her er videre illustrert i de vedlagte eksempler som affinitetsmodning av parentale antistoffer/antistoffmolekyler i stand til spesifikt å gjenkjenne to områder av P-A4 peptidet/Abeta4/Ap/Ap4/pA4.

Fortrinnsvis er nevnte AP/AP4 (også betegnet som PA4 i oppfinnelsens kontekst) i trinn (b) i fremgangsmåten, som beskrevet ovenfor, aggregert AP/AP4. Nevnte panning kan gjennomføres (som beskrevet i de vedlagte eksempler) med øket stringens for binding. Stringensen kan økes blant annet ved å redusere Ap/Ap4-konsentrasjonen eller ved å forhøye (analyse) temperaturen. Testing av det optimaliserte bibliotek ved panning er velkjent for fagmannen og beskrevet av Kay (1993), loe. eit. Fortrinnsvis gjennomføres identifiseringen i trinn (c) ved rangering i henhold til de laveste Kd-verdiene.

Mest foretrukket blir identifiseringen i trinn (c) gjennomført ved «koff-rangering». «Koff-rangering» er kjent for fagmannen og beskrevet av Schier (1996), loe. eit.; Schier

(1996), J. Mol. Biol. 255, 28-43 eller Duenas (1996), Mol. Immunol. 33, 279-286.

Videre er «koff-rangering» illustrert i de vedlagte eksempler. Off-hastighetskonstanten kan måles som beskrevet i de vedlagte eksempler.

Som nevnt ovenfor kan de identifiserte kloner uttrykkes for ytterligere evaluering. Ekspresjonen kan gjennomføres på en i og for seg kjent måte, blant annet som vist i de vedlagte eksempler. Ekspresjonen kan blant annet føre til uttrykte Fab-fragmenter, scFv'er, bispesifikke immunglobuliner, bispesifikke antistoffmolekyler, Fab- og/eller Fv-fusjonsproteiner, eller fulle antistoffer, som IgG'er, særlig IgGl.

Optimaliserte antistoffer og særlig optimaliserte Fab'er eller optimaliserte IgG'er, fortrinnsvis IgGl 'er, kan testes ved fremgangsmåter som vist i de vedlagte eksempler. Slike fremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til testing av bindingsaffiniteter, bestemmelsen av Ko-verdier, pepspotanalyser, ELISA-analyser, RIA-analyser, CLIA-analyser, (immuno-) histologiske studier (for eksempel farging av amyloide plakk), depolymeriseringsanalyser eller antistoffavhengige P-A4 fagocytoser.

Optimaliserte antistoffer kan fremstilles ved krysskloning. Denne fremgangsmåte er også illustrert i de vedlagte eksempler og omfatter kombinering av uavhengig optimaliserte CDR-områder, for eksempel ved å kombinere uavhengig optimaliserte H-CDR2 og L-CDR2 fra modne kloner med H-CDR3, fortrinnsvis den samme H-CDR3.

Et farmasøytisk preparat kan fremstilles ved en fremgangsmåte omfattende trinnene

(a) å optimalisere et antistoff i henhold til fremgangsmåten beskrevet her og

illustrert i de vedlagte eksempler; og

(b) å formulere det optimaliserte antistoff/antistoffmolekyl med en fysiologisk akseptabel bærer, som beskrevet ovenfor.

Således tilveiebringes et farmasøytisk preparat fremstilt ved ovennevnte fremgangsmåte, og omfatter ytterligere optimaliserte antistoffmolekyler som spesifikt er i stand til å gjenkjenne to områder av P-A4 peptidet/Abeta4/Ap/A4p/pA4, som beskrevet ovenfor.

Ytterligere illustrerende sekvenser er vist i de vedlagte sekvenslister, og er også vist i vedlagte tabeller, særlig tabellene 1, 8 og 10.

Figurene viser:

Figur 1 Sekvensoppsummering av "HuCAL"-Fabl-bibliotek

Nummereringen er i henhold til VB ASE bortsett fra gapet i VLA. posisjon 9. I VB ASE er gapet satt til posisjon 10 ( Chothia et al., 1992). I sekvensoppsummeringen er alle CDR3-rester som ble holdt konstante indikerte. Tilsvarende sekvenser som ble benyttet for HuCAL-Fabl-biblioteket, kan finnes i de vedlagte sekvenslister.

A: aminosyresekvens

B: DNA-sekvens

Figur 2 Fab displayvektor "pMORPH" 18_Fab

Vektorkart og DNA-sekvens inkludert restriksjonsseter

Figur 3 Fab ekspresjonsvektor "pMORPH" x 9_Fab

Vektorkart og DNA-sekvens inkludert restriksjonsseter

Figur 4 Sekvenser av de parentale Fab-fragmenter MS-Roche-3, MS-Roche-7

og MS-Roche 8

A: aminosyresekvens

B: DNA-sekvens

Figur 5 Indirekte immunfluoresens av amyloid plakk fra et kryostatsnitt av human temporal cortex. Plakkene ble merket MS-R #3.2 Fab (øvre plater) og MS-R #7.4 Fab (nedre plater) ved 20 ug/ml (venstre plater) og 5 ug/ml (høyre plater) under stringente blokkeringsbetingelser. Bundet MS-R Fab ble påvist ved geite-antihumant-Cy3. Figur 6 Indirekte immunfluoresens av amyloide plakk fra et kryostatsnitt av human temporal cortex. Disse plakk ble merket med MS-R #3.3 IgGl (øvre plater) og MS-R #7.12 IgGl (nedre plater) ved 0,05 ug/ml (venstre plater) og 0,01 ug/ml (høyre plater) under stringente blokkeringsbetingelser. Bundet MS-R IgGl-antistoff ble påvist ved geite-antihumant (H+L)-Cy3. Figur 7 Indirekte immunfluoresens av amyloide plakk fra et kryostatsnitt av human temporal cortex ved anvendelse av antistoffer etter sluttaffinitetsmodning. Disse plakk ble merket med MS-R #7.9.H7 IgGl (MAB 31, topp plate),

MS-R #7.11.Hl x7.2.Ll IgGl (MAB 11, middel plate) og MS-R #3.4.H7, (bunn plate). Antistoffene ble anvendt ved 0,05 ug/ml (venstre plater) og 0,01 ug/ml (høyre plater) under stringente blokkeringsbetingelser. Bundet MS-R IgGl-antistoff ble påvist ved geite-antihumant (H+L)-Cy3.

Skala: 8,5 mm =150 (im.

Figur 8 Polymeriseringsanalyse. Anti-AP-antistoffer forhindrer innarbeiding av

biotinylert AP i på forhånd dannete AP-aggregater.

Figur 9 De-polymeriseringsanalyse. Anti-AP-antistoffer induserer frigivning av

biotinylert AP fra aggregert Ap.

Figur 10 In vivo dekorering av amyloide plakk i en APP/PS2-dobbeltransgen mus etter intravenøs injeksjon av 1 mg MS-Roche IgG #7.9.H2 x 7.12.L2. Etter tre dager ble musen perfusert med fosfatbufret saltoppløsning og avlivet. Nærværet av humant IgG bundet til amyloide plakk, ble påvist ved konfokal mikroskopi etter merking av kryostatsnitt fra frontal cortex med et geite-antihumant IgG-Cy3-konjugat (plate B). Det samme snitt ble motfarget med et anti-AP-musemonoklonalt antistoff (BAP-2-Alexa488-konjugat, plate A) for å visualisere amyloidplakkposisjonen. Individuelle røde (plate B) og grønne (plate A) kanaler, sammensmeltet bilde (plate D) og ko-lokaliserte (plate C) signaler er vist.

Skala: 1 cm = 50 um.

Figur 11 In vivo dekorering av amyloidplakk i en APP/PS2-dobbeltransgen mus etter intravenøs injeksjon av 1 mg MS-Roche IgG #7.9.H4 x 7.12.L2. Forsøksbetingelser og fargingsprosedyren var identisk med det beskrevet i forklaringen til figur 10.

Skala: 1,6 cm = 50 (im.

Figur 12 In vivo dekorering av amyloidplakk i en APP/PS2-dobbeltransgen mus etter intravenøs injeksjon av 1 mg MS-Roche IgG #7.11.Hl x 7.2.L1 (MAB 11). Forsøksbetingelser og fargingsprosedyren var identisk med det beskrevet i forklaringen til figur 10.

Skala: 1,4 cm = 70 um.

Figur 13 In vivo dekorering av amyloidplakk i en APP/PS2-dobbeltransgen mus etter intravenøs injeksjon av 2 mg MS-Roche IgG #7.9.H7 (MAB 31) på dag 0, 3 og 6. Etter 9 dager ble musen perfusert med fosfatbufret saltoppløsning og avlivet. Nærværet av humant IgG bundet til amyloide plakk, ble påvist ved konfokal mikroskopi etter merking av kryostatsnitt fra frontal cortex med et geite-antihumant IgG-Cy3-konjugat (plate B). Det samme snitt ble motfarget med et anti-AP-musemonoklonalt antistoff (BAP-2-Alexa488-konjugat, plate A) for å visualisere amyloidplakkposisjonen. Individuelle røde (plate B) og grønne (plate A) kanaler, sammensmeltet bilde (plate D) og ko-lokaliserte (plate C) signaler er vist.

Skala: 1,6 cm = 80 um (platene A, B, C); 1,0 cm = 50 um (panel D)

Figur 14 In vivo dekorering av amyloidplakk i en APP/PS2-dobbeltransgen mus etter intravenøs injeksjon av 2 mg MS-Roche IgG #7.11.Hl x 7.2.L1 (MAB 11) på dag 0, 3 og 6. Forsøksbetingelser og fargingsprosedyren var identisk med det beskrevet i forklaringen til figur 13.

Skala: 1,6 cm = 80 (im.

Figur 15 Bindingsanalyse av anti-AP-antistoffer på celleoverflate APP.

Antistoffbinding til humant APP-transfekterte HEK293-celler og ikke-transfekterte kontrollceller ble analysert ved strømningscytometri.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1: Konstruksjon og screening av et humant kombinatorisk

antistoffbibliotek ("HuCAL"-Fab 1)

Kloning av " HuCAL "- Fab 1

"HuCAL"-Fab 1 er et fullsyntetisk, modulært humanantistoff bibliotek i Fab antistoff-fragmentformat. "HuCAL"-Fab 1 bla sammensatt ved å starte med et antistoffbibliotek i enkeltkjedeformat ("HuCAL"-scFv; Knappikk, ( 2000), J. Mol. Biol. 296, 57- 86).

VX- posisjoner 1 og 2. De opprinnelige "HuCAL"-mastergener ble konstruert med sine autentiske N-termini: VLXl: QS (CAGAGC), VLX2: QS (CAGAGC), og VLX3: SY (AGCTAT). Sekvenser inneholdende disse aminosyrer er vist i WO 97/08320. Under "HuCAL"-bibliotekkonstruksjonen, ble de første to aminosyrer forandret til DI for å lette bibliotekkloning (EcøRI-sete). Alle "HuCAL"-bibliotekene inneholder VLX-gener med .EcøRV-sete GATACT (DI) ved den 5' ende. Alle "HuCAL"-K-gener (mastergener og alle gener i biblioteket) inneholder DI ved den 5' ende (figur IA og B).

VH- posisjon 1. De opprinnelige "HuCAL"-mastergener ble konstruert med sine autentiske N-termini: VH1A, VH1B, VH2, VH4 og VH6 med Q (=CAG) som den første aminosyre og VH3 og VH5 med E (= GA A) som den første aminosyre. Sekvenser inneholdende disse aminosyrer er vist i WO 97/08320. Under kloningen av "HuCAL"-Fab 1-biblioteket ble aminosyren i posisjon 1 av VH forandret til Q (CAG) i alle VH-gener (figur IA og B).

Design av CDR- bibliotekene

Vk1/ Vk3 posisjon 85. Fordi kassettmutageneseprosedyren som ble benyttet for å innføre CDR3-biblioteket ( Knappik, ( 2000(, loe. eit.), kan posisjon 85 i VkI og Vk3 enten være T eller V. Under "HuCAL"-scFvl-bibliotekkonstruksjonen ble således posisjon 85 av VkI og Vk3 variert som følger: VkI original, 85T (kodon ACC); VkI bibliotek, 85T eller 85V (TRIM-kodoner ACT eller GTT); Vk3 original, 85V (kodon GTG); Vk3 bibliotek, 85T eller 85V (TRIM-kodoner ACT eller GTT); det samme gjelder for "HuCAL"-Fab 1.

CDRS- design. Alle CDR3-rester som ble holdt konstant, er indikert i figur 1A og B. CDR3 lengde. Den designerte CDR3 lengdefordeling er som følger: Rester som ble variert er vist i parenteser (x) i figur 1. VkCDR3, 8 aminosyreresidier (posisjon 89 til 96) (leilighetsvis 7-10 rester) med Q89, S90 og D92 fikserte; og VH CDR3, 5 til 28 aminosyreresidier (posisjon 95 til 102) (leilighetsvis 4-28), med Dl 01 fiksert.

"HuCAL"-Fab 1 ble klonet inn i en phagmid ekspresjonsvektor "pMORPH" 18_Fabl (figur 2). Denne vektor omfatter Fd-fragmentet med en phoA-signalsekvens fusert ved C-terminusenden til et avkortet gen-UI-protein av filamentøs phag, og videre omfatter den lette kjedeVL-CL med en ompA-signalsekvens. Begge kjeder er under kontroll av lac-operonet. De konstante doméner CX, Ck og CH1 er syntetiske gener som er fullt kompatible med det modulære system til "HuCAL" ( Knappikk, ( 2000), loe. eit.).

Hele VH-kjeden ( Munl/ Styl- fragment) ble erstattet med et 1205 bp dummy-fragment inneholdende P-laktamase transkripsjonsenheten (bla) for derved å lette etterfølgende trinn for vektorfragmentfremstilling og for å tillate seleksjon av komplett VH-fjerning.

Etter VH-erstatning ble VLA fjernet med EcdRUDrdm og VLkmed EcoWJBslWL og erstattet med bakteriell alkalisk fosfatase (genfragment (1420 bp).

Da variabiliteten for de lettere kjeder er lavere enn den til de tyngre kjeder, ble kloningen startet med lettkjedebiblioteker. VLx- og VLK-lettkjedebibliotekene diversifiserte i L-CDR3, som ble generert for "HuCAL"-scFv-biblioteket (Knappikk,

(2000), loe. eit.), ble også benyttet for kloning av "HuCAL"-Fab 1. Når det gjelder X besto de av XI-, X2- og X3-"HuCAL"-rammeverket, og hadde en total variabilitet på 5,7 x IO<6>. VLx-fragmentene ble forsterket ved 15 PCR-sykler (Pwo-polymerase) med primerne 5' -GTGGTGGTTCCGATATC-3' (SEKV. ID nr. 28) og

5' -AGCGTCAC ACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCC AAGAACGGTTA-3'

(SEKV. ID nr. 29). PCR-produkter ble digestert med EcoKV/ DraKL og gelrenset. Når det gjelder VL^-biblioteket ble bap-dummyen fjernet med EcoKV/ DraTIL fra bibliotekvektoren. 2 ug gelrenset vektor ble ligert med et 3-gangers molart overskudd av VLx-kjeder i 16 timer ved 16 °C og ligeringsblandingene ble elektroporert i 800 ul E. coli TOPlOF-celler (Invitrogen), som til sammen ga 4,1 x 10 ouavhengige kolonier. Transformantene ble forsterket rundt 2000 ganger i 2 x YT/1 % glukose/34 ug/ml kloramfenikol/100 ug/ml ampicillin, høstet og lagret i 20 % (vekt/volum) glyserol ved -80 °C.

K-bibliotekene omfatterk1,k2,k3 ogK4-"HuCAL"-mastergenene med en total variabilitet på 5,7 x IO6. VLic-kjedene ble oppnådd ved restriksjonsdigestering med EcdRNIBsFNl og gelrenset. Når det gjelder VLic-biblioteket ble bap-dummyen fjernet med EcoRV/ BslWI fra bibliotekvektoren. 2 (ag gelrenset vektor ble blandet med et 5-gangers molart overskudd av VLic-kjeder. Ligering og transformasjon inn i E. coli TOPlOF-celler (Invitrogen), ble gjennomført som beskrevet for VL^-kjeder, og ga til sammen 1,6 x 10 uavhengige kolonier.

DNA for de to lettkjedebibliotekene ble preparert og bla-dummyen ble fjernet ved MunVStyl, for derved å generere de to vektorer for innskyting av VH-sub-bibliotekene. VH-bibliotekene av "HuCAL"-scFv ble benyttet for generering av "HuCAL"-Fab 1. VH-bibliotekene av "HuCAL"-scFv består av mastergenene VH1A/B-6, diversifisert med to VH-CDR3 trinukleotidbibliotekkassetter som skiller seg i CDR3-lngdene separat, og hvert VH-bibliotek ble kombinert med VLk- og med VL^-biblioteket. For genereringen av "HuCAL"-Fab 1 DNA fra disse, ble det fremstilt VH-biblioteker som bevarer den opprinnelige variabilitet. DNA ble digestert med MunVStyl og gelrenset. Et 5-gangers molart overskudd av VH-kjedene ble ligert med 3 ug VLx-bibliotekvektoren, og med 3 ug VLic-bibliotekvektoren i 4 timer ved 22 °C. Ligeringsblandinger ble elektroporert for hver vektor i 1200 ul E. coli TOPlOF-celler (Invitrogen), som ga til sammen 2,1 x 10<10>uavhengige kolonier. Transformantene ble forsterket rundt 4000 ganger i 2 x YT/1 % glukose/34 ug/ml kloramfenikol/10 ug/ml tetrasyklin, høstet og lagret i 20 % (vekt/volum) glyserol ved -80 °C.

Som kvalitetskontroll ble de lette og tunge kjeder av enkeltkloner sekvensert med 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEKV. ID nr. 30) henholdsvis 5'-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3' (SEKV. ID nr. 31).

Fagmid gjenvinning, fagforsterkning og rensing

"HuCAL"-Fab 1 ble forsterket i 2 x TY medium inneholdende 34 ug/ml kloramfenikol, 10 ug/ml tetrasyklin og 1 % glukose (2 x TY-CG). Etter hjelperfaginfeksjon (VCSM13) ved 37 °C ved en OD600på rundt 0,5, sentrifugering og resuspensjon i 2 x TY/34 ug/ml kloramfenikol/50 ug/ml kanamycinceller ble dyrket over natten ved 30 °C. Fag ble PEG-presipitert fra supernatanten (Ausubel, (1998), Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., New York, USA), resuspendert i PBS/20 % glyserol og lagret ved -80 °C. Fagforsterkning mellom to panningsrunder ble gjennomført som

følger: mid-log fase TG1-celler ble infiserte med fortynnet fag og brakt på plate på LB-agar supplert med 1 % glukose og 34 ug/ml kloramfenikol. Etter inkubering over natten ved 30 °C ble kolonier skrapet av, justert til en OD600på 0,5 og hjelperfag ble tilsatt som beskrevet ovenfor.

Eksempel 2: Fastfase panning

Brønner av "MaxiSorp" mikrotiterplater F96 (Nunc) ble belagt med 100 ul 2,5 uM humant AØ (1-40) peptid (Bachem) oppløst i TBS inneholdende 0,05 % volumprosent NaN?, og den forseglete plate ble inkubert i tre dager ved 37 °C der peptidet er tilbøyelig til å aggregere på platen. Etter blokking med 5 % ikke-fet tørrmelk i TBS, ble 1-5 x IO12 "HuCAL"-Fab fag renset som ovenfor, tilsatt i en time ved 20 °C. Etter flere vasketrinn ble bundne fager eluert ved pH-eluering med 500 mM NaCl, 100 mM glysin pH 2,2 og deretter nøytralisering med IM Tris-Cl pH 7. Tre runder panning ble utført med fagforsterkning mellom hver runde som beskrevet ovenfor, og vaskestringensen ble øket fra runde til runde.

Eksempel 3: Subkloning av selektert Fab-fragmenter for ekspresjon

De Fab-kodende innskudd av de valgte "HuCAL"-Fab-fragmenter ble subklonet inn i ekspresjonsvektoren "pMORPH"x7_FS for å lette hurtig ekspresjon av oppløselig Fab. DNA-fremstillingen av de valgte "HuCAL"-Fab-kloner ble digestert meåXbaVEccRI, for således å kutte ut Fab-kodende innskudd (ompA-VL og phoA-Fd). Subkloning av de rensete innskudd inn i XbaVEcoRI kutter vektor "pMORPH"x7, som tidligere bar et scFv-innskudd, førte til en Fab-ekspresjonsvektor som ble betegnet "pMORPH"x9_Fabl (figur 3). Fab'er uttrykt i denne vektor bærer to C-terminale markører (FLAG og Strep) for påvisning og rensing.

Eksempel 4: Identifisering av Ap-bindings-Fab-fragmenter med ELISA

Brønner av "MaxiSorp" mikrotiterplater F384 (Nunc) ble belagt med 20 ul 2,5 uM humant AP (1-40) peptid (Bachem) oppløst i TBS inneholdende 0,05 % volumprosent NaN3, og den forseglete plate ble inkubert i tre dager ved 37 °C der peptidet er tilbøyelig til å aggregere på platen. Ekspresjon av individuelle Fab ble indusert med 1 mM IPTG i 16 timer ved 22 °C. Oppløselig Fab ble ekstrahert fra E. coli ved BEL-lysering (borsyre, NaCl, EDTA og lysozym inneholdende buffer pH 8) og benyttet i en ELISA. Fab-fragmentet ble påvist med et alkalisk fosfatasekonjugert geite-anti-Fab-antistoff (Dianova/Jackson Immuno Research). Etter eksitering ved 340 nm ble emisjonen ved 535 nm lest ut etter tilsetting av AttoPhos-fluorescens-substrat (Roche Diagnostics).

Eksempel 5: Optimalisering av antistoff-fragmenter

For å optimalisere bindingsaffiniteten av de selekterte AP-bindingsantistoffragmenter, ble noen av Fab-fragmentene, MS-Roche-3 (MSR-3), MS-Roche-7 (MSR-7) og MS-Roche-8 (MSR-8) (figur 4), benyttet for å konstruere et bibliotek av Fab-antistoff-fragmenter ved å erstatte den parentale VLk3-kjede med en samling av alle kappa-kjeder Kl-3, diversifisert i CDR3 fra "HuCAL"-biblioteket ( Knappik et al, 2000).

Fab-fragmentene MS-Roche-3, -7 og -8 ble klonet via XbaVEcoRI fra "pMORPH"x9_FS inn i "pMORPH" 18, en fagbasert vektor for fagdisplay av Fab-fragmenter, for å generere "pMORPH" 18_Fabl (figur 2). En K-kjedesamling ble klonet inn i "pMORPH" 18_Fabl viaX/jalVS^M-restriksjonsseter.

Det resulterende Fab-optimaliseringsbibliotek ble screenet ved panning mot aggregert humant Ap (1-40) peptid belagt på en fast bærer som beskrevet i eksempel 2. Optimaliserte kloner ble identifisert ved «Koff-rangering» i en Biacore-analyse som beskrevet i eksempel 8. De optimaliserte kloner MS- Roche- 3. 2, 3. 3, 3. 4, 3. 6, 7. 2, 7. 3, 7. 4, 7. 9, 7. 11, 7. 12, 8. 1, 8. 2, blekarakterisertvidere og viste forbedret affinitet og biologisk aktivitet sammenliknet med utgangsfragmentene MS-Roche-3, MS-Roche-7 og MS-Roche-8 (figur 4). De oppsummerte CDR'er henviser til det "HuCAL"-konsensusbaserte antistoffgenet VH3k3. Fab-fragmentet MS-Roche-7.12 ble oppnådd ved kloning av HCDR3 av parentalklon MS-R 7 inn i et "HuCAL"-Fab-bibliotek som bærer diversitet i alle seks CDR-områder ved bruk av en designprosedyre identisk med den for CDR3-kassetter, beskrevet av Knappik et al., 2000. Bibliotekkassettene ble konstruert sterkt fokusert på den kjente naturlige fordeling av aminosyrer og etter konseptet med kanonisk CDR-konformasjoner etablert av Allazikani (Allazikani et al., 1997). I motsetning til "HuCAL"-mastergenene inneholder imidlertid klonen MS-Roche 7.12 aminosyre S i posisjon 49 av VL-kjeden (se vedlagte tabell 1).

De optimaliserte Fab'er viste etter den første affinitetsmodning forbedret karakteristika i forhold til MS-Roche-3-, MS-Roche-7- og MS-Roche-8-utgangsklonene (figur 4). Bindingsaffinitetene for modne Fab'er til Api-40 og Api-42 var betydelig øket, og ga Ko-verdier i området 22-240 nM, sammenliknet med 850-1714 nM for parentalklonene (tabell 3). Immunohistokjemianalyse av amyloid plakk i humant AD-hjernesnitt, viste også betydelig øket fargingsprofil av de modnede kloner, dvs. at det ble oppnådd bedre forhold signal:bakgrunn, og positiv plakkfarging ble påvist ved relativt lave konsentrasjoner av de modnede Fab'er (figur 5).

For videre optimalisering ble VH CDR2-områdene og VL CDR1-områdene av et sett av aminosyrefragmenter avledet fra L-CDR3 optimalisert MS-Roche-3, -7 og -8 (tabell 1; figur 4), optimalisert ved kassettmutagenese ved anvendelse av trinukleotiddirigert mutagenese (Virnekås et al., 1994). Derfor ble en trinukleotidbasert HCDR2-kassett og en trinukleotidbasert LCDR1-kassett konstruert ved anvendelse av en konstruksjonsprosedyre identisk med den til CDR3-kassettene beskrevet av Knappik et al., 2000. Bibliotekskassettene ble konstruert med sterk fokus på den kjente, naturlige fordeling av aminosyrer og ved å følge konseptet med kanonisk CDR-konformasjoner etablert av Allazikani (Allazikani et al., 1997). Protokollen som ble benyttet for optimalisering av de i utgangspunktet valgte aminosyrefragmenter, vil etterlikne prosessen med affinitetsmodning ved somatisk hypermutasjon som observeres under den naturlige immunrespons.

De resulterende biblioteker ble avsøkt separat som beskrevet ovenfor og førte til optimaliserte kloner enten i H-CDR2- eller i L-CDR1 -området. Alle kloner ble identifisert som ovenfor ved en forbedret «Koff» mot Api-40-fiber etter en «Koff-rangering» i Biacore, og viste forbedret affinitet enten til Api-40 eller Api-42 eller begge, ved sammenlikning med den tilsvarende opphavsklon (tabell 3). Tabell 1 inneholder sekvenskarakteristika for de parentale, så vel som for sekvensene av de optimaliserte kloner. CDR'ene som er opplistet refererer til det "HuCAL"-konsensusbaserte

antistoffgen VH3k3.

For eksempel ble affiniteten for MS-Roche-7 parental-Fab mot Ap 1-40 forbedret med en faktor på over 35 fra 1100 nM til 31 nM etter L-CDR3-optimalisering (MS-Roche- 7.9) og videre forbedret til 5 nM etter H-CDR2-optimalisering (MS-Roche-7.9H2), som vist i tabell 3.

H-CDR2- og L-CDR1 -optimaliseringsprosedyre ikke bare økte affiniteten, men resulterte også for noen av klonene i en betydelig forbedret farging av amyloid plakk i AD-hjernesnitt, særlig observert med MS-Roche 7.9H2 og 7.9H3.

Eksempel 6

Konstruksjon av " HuCAL " immunoglobulinekspresjonsvektorer

Tungkjedekloning.

Det multiple kloningssetet av pcDNA3.1+ (Invitrogen) ble fjernet ( NheVApaT), og en stuffer som var kompatibel med restriksjonssetene som ble benyttet for "HuCAL"-designen, ble innskutt for ligering av ledersekvensene ( NheVEcoBl), VH-doméner ( Murilf), og immunglobulinkonstante områder ( BlpVApaT). Ledersekvensen (EMBL 83133) ble utstyrt med en Kozak-sekvens (Kozak, 1987). Konstante områder av humant IgG4 (EMBL K01316), og serum IgAl (EMBL J00220), ble skåret inn i overlappende oligonukleotider med lengder på rundt 70 baser. Tause mutasjoner ble innført for å fjerne restriksjonsseter som ikke var kompatible med "HuCAL"-designen. Oligonukleotidene ble spleiset ved overlappforlengelses-PCR.

Under subkloning fra Fab inn i IgG, ble VH-DNA-sekvenser av Fab skåret ut via MfeVBlpl og ligert inn i IgG-vektoren som ble åpnet via EcoKVBlpl. EcoKL ( g/ aattc) og Mfel ( c/ aattg) deler kompatible, kohesive ender ( aatt) og DNA-sekvensen av det opprinnelige Mfel- setet i Fab forandres fra: c/ aattg til: g/ aattg etter ligering inn i IgG-ekspresjonsvektoren, og ødelegger derved både Mfel- og ÆcoRI-setet, og således fører til en aminosyreforandring fra Q (kodon: caa) til E (kodon: gaa).

Lettkjedekloning.

Det multiple kloningssetet av pcDNA3. l/Zeo+ (Invitrogen) ble erstattet med to forskjellige stuffere. K-stufferen ga restriksjonsseter for innføring av en K-leder ( NheVEcoRY), "HuCAL"scFv Vic-doméner ( EcoRV/ BsWI), og detK-kjedekonstante området ( BsIWVApaT). De tilsvarende restriksjonsseter i X-stufferen var NheVEcoRV (X-leder), EcoRV/ Hpal (VX-doméner), og HpaVApal (X-kjedekonstant område), te-lederen (EMBL Z00022) så vel som X-lederen (EMBL J00241), var begge utstyrt med Kozak-sekvenser. De konstante områder av humant k- (EMBL L00241) og X-kjede (EMBL Ml 8645) ble sammensatt ved overlappforlengelses-PCR, som beskrevet ovenfor.

Generering av IgG- uttrykkende CHO- celler.

CHO-K1-celler ble kotransfektert med en ekvimolar blanding av IgG- tung- og lett-kjedeekspresjonsvektorer. Dobbeltresistente transfektanter ble valgt med 600 ug/ml G418 og 300 ug/ml Zeocin (Invitrogen), fulgt av begrenset fortynning. Supernatanten av enkeltkloner ble bedømt på IgG-ekspresjon ved fangings-ELISA. Positive kloner ble utvidet i RPMI-1640 medium supplert med 10 % ultralav IgG-FCS (Life Technologies). Etter justering av pH-verdien i supernatanten til 8.0 og steril filtrering, ble oppløsningen underkastet standard protein-A-kolonnekromatografi (Poros 20 A, PE Biosystems).

Eksempel 7: Pepspotanalyse med dekapeptider

Den følgende aminosyresekvens omfattende Ap (1-42) ble delt i 43 overlappende dekapeptider med et rammeskift på 1 aminosyre.

ISEVKM^AEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGWI42ATV

IV (SEKV. ID nr. 414). I henhold til dette representerer DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVIA (SEKV. ID nr. 27), som vedlagt aminosyrene 1 til 42 av Ap4/p-A4-peptid.

De 43 dekapeptidene ble syntetisert med N-terminal acetylering og C-terminal kovalent binding til et celluloseark ("pepspot") fra en kommersiell leverandør (Jerini BioTools, Berlin). Cellulosearket ble inkubert i 2 timer på en vuggeplattform med monoklonalt antistoff (2 ug/ml) i blokkeringsbuffer (50 mM Tris HC1, 140 mM NaCl, 5 mM NaEDTA, 0,05 % NP40 (Fluka), 0,25 % gelatin (Sigma), 1 % bovint serumalbuminfraksjon V (Sigma), pH 7,4). Arket ble vasket tre ganger tre minutter på en vuggeplattform med TBS (10 mM Tris HC1, 150 mM NaCl, pH 7,5). Det ble deretter fuktet med katodebuffer (25 mM Tris base, 40 mM 6-aminoheksansyre, 0,01 % SDS, 20 % metanol) og overført til en halvtørr blottingsstabel med peptidsiden mot en PVDF-membran (Bio-Rad) av samme størrelse.

Den halvtørre blottingsstabelen består av nyfuktete filterpapir (Whatman nr. 3), som er noe større enn peptidarket:

3 papirer fuktet med katodebuffer

peptidarket

et ark av PVDF-membran fuktet med metanol

3 papirer fuktet med anodebuffer 1 (30 mM Tris base, 20 % metanol)

3 papirer fuktet med anodebuffer 2 (0,3 mM Tris base, 20 % metanol).

Overføringen gjennomføres ved en strømtetthet mellom katode og anode på 0,8 mA/cm2 i 40 minutter, som er tilstrekkelig til å eluere mesteparten av antistoffet fra cellulosearket, og avsette dette på PVDF-membranen. PVDF-membranen utbyttes så mot en andre PVDF-membran og overføres i ytterligere 40 minutter for å sikre fullstendig eluering fra cellulosearket.

PVDF-membranen nedsenkes i blokkeringsbuffer i 10 minutter. Deretter tilsettes HRP-merket antihumant lg H+L (Pierce) i 1:1000 fortynning og membranen inkuberes på en vuggeplattform i en time. Den ble vasket 3x10 minutter med TBST (TBS med 0,005 % Tween20). Fargen fremkalles ved nedsenking av membranen i en oppløsning laget av 3 mg 4-klornaftol oppløst i 9 ml metanol med 41 ml PBS (20 mM Na-fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,2) en 10 ul 30 % hydrogenperoksid (Merck). Etter fremkallingen av blåsorte flekker, ble membranen vasket grundig med vann og tørket.

Fastslåelsen av antistoffreaktive pepspots foretas ved visuell inspeksjon gjennom en transparent spot-matrise. Epitopene av antistoffet defineres som den minimale aminosyresekvens i reaktive peptider. For sammenlikning analyseres musemonoklonale antistoffer (BAP-2, BAP-1, BAP-17, BAP-21, BAP-24 og 4G8) på samme måte, bortsett fra ved bruk av HRP-merket antimuse-Ig i stedet for antihumant lg.

Det skal påpekes at affinitetsmodning og konvertering av de monovalente Fab-fragmenter til fullengde-IgGl-antistoffer vanligvis resulterer i en viss utvidelse av epitopgjenkjennelsessekvensen som antydet ved pepspot- og ELISA-analyser. Dette kan relateres til rekruttering av flere kontaktpunkter i antistoff-antigen interaksjonsarealet som en konsekvens av affinitetsmodning eller en sterkere binding til den minimale epitop, slik at også svake interaksjoner med naboaminosyrer kan påvises. Det sistnevnte kan være tilfelle når AØ-avledete peptider probes med fullengde-IgG-antistoffer. Som vist i tabell 2 for pepspotanalyse, blir gjenkjennelsessekvenser av de N-terminal epitopene og midtepitopene forlenget med opptil 3 aminosyrer når opphavs-Faber og tilsvarende fullt modnede IgG-antistoffer sammenliknes. Imidlertid må man huske på at dekapeptidene modifiseres for kovalent festing ved den C-terminale aminosyre, og denne aminosyren behøver derfor ikke være lett tilgjengelig for fullengdeantistoffet pga. sterisk hindring. Dersom dette er tilfelle, vil den siste C-terminale aminosyre ikke bidra betydelig til epitopgjenkjennelsessekvensen og en potensiell reduksjon av den minimale gjenkjennelsessekvens med kun en aminosyre i C-terminalenden må tas med i betraktning i pepspotanalysen som benyttes ifølge foreliggende oppfinnelse.

Tallene refererer til de essensielle aminosyrer fra Api-40-sekvensen som må være til stede i dekapeptidet for optimal binding av antistoffet. En svak peptidreaktivitet, og således et svakt bidrag til epitopen, er antydet i parenteser.

Eksempel 8. Bestemmelse av KD-verdier for MS-R Fab- og MS-R IgGl-antistoffbinding til Apl-40- og Ap 1-42 fibere in vitro ved overflateplasmonresonans

(SPR)

Binding av anti-AP-antistoffer (Fab'er og IgGl) til fibrillær Ap, ble målt online ved overflateplasmonresonans (SPR) og affinitetene for de molekylære interaksjoner ble bestemt, som beskrevet av Johnson, Anal. Biochem. 1997, 249, 165-173. Biacore2000-og Biacore3000-instrumenter ble benyttet for disse målinger. Api-40- og Api-42-fibre ble generert in vitro ved inkubering av syntetiske peptider ved en konsentrasjon på

200 ug/ml i 10 mM Na-acetatbuffer (pH 4,0) i 3 dager ved 37 °C. Elektronmikroskopisk analyse bekreftet en fibrillær struktur for begge peptider, Api-40 viste predominant kortere (<1 mikron) og Api-42 predominant lengre (>1 mikron) fibere. Disse fibere antas å representere aggregerte AP-peptider i humant AD-hjerne nærmere enn ikke godt definerte blandinger av amorfe aggregater og ikke-strukturerte presipitater. Fibrene ble fortynnet 1:10 og koblet direkte til en "Pioneer Sensor Chip Fl" som beskrevet i produsentens instruksjonsbok (BIAapplication Handbook, versjon AP, Biacore AP, Uppsala, 1998). I de første forsøk ble det funnet at valgte MS-Roche-Fab'er skilte seg vesentlig i sin reaksjonskinetikk og derfor måtte dataanalysemodus forandres tilsvarende. For bindere med lav kinetisk Kd, ble verdiene beregnet ved kurvetilpasning av de tidsavhengige sensorresponser, dvs. fra forholdet koff/kon. Bindere med hurtig kinetikk ble analysert ved tilpasning av de konsentrasjonsavhengige sensorresponser ved likevekt (adsorpsjonsisotermer). Kn-verdier ble beregnet fra Biacore sensogrammer basert på den totale Fab-konsentrasjon, som bestemt ved en proteinanalyse. For kloner avledet fra den første og andre affinitetsmodningssyklus, ble innholdet av aktivt Fab i hvert preparat bestemt ved Biacore i henhold til en fremgangsmåte, som bestemt av Christensen, Analytical Biochemistry (1997) 249, 153-164. Kort sagt ble tidsavhengig proteinbinding til Api-40 fibere som var immobilisert på en Biacore chip, målt under assosiasjonsfasen under massebegrensete betingelser ved forskjellige strømningshastigheter for analyttoppløsningen. Betingelsene for massebegrensning ble realisert ved immobilisering av høye mengder AP-fibere (2300 responsenheter) på brikkeoverflaten for en målekanal og ved å arbeide ved relativt lave analyttkonsentrasjoner, dvs. 160 nM (basert på den totale Fab-proteinkonsentrasjon).

En oppsummering av KD-verdiene for valgte MS-Roche-kloner som er identifiserte i primærsøk av HuCAL-biblioteket og deres tilsvarende modne derivater etter første og andre affinitetsmodningssyklus, er vist i tabell 3.1 den første affinitetsmodningssyklus ble tungkjede CDR3 (VH-CDR3) holdt konstant og optimalisering ble fokusert på diversifisering av lettkjede-CDR3 (VL-CDR3). I den andre affinitetssyklus ble det gjennomført diversifisering av VL-CDR1 og VH-CDR2. Noen av binderne fra den første modningssyklus ble konvertert til fullengde-IgGl-antistoffer i henhold til den teknologi som er beskrevet av MorphoSys, som beskrevet i eksempel 6, og KD-verdier som bestemt ved Biacore, som beskrevet ovenfor. KD-verdiene for fullengde-IgG-binding til Api-40- og Api-42-fibere er vist i tabell 4.

Modne derivater fra både L-CDR1- og H-CDR2-bibliotek ble etter andre mmodningssyklus identifisert og tillatt kombinering av lette og tunge kjeder. Krysskloningsstrategien er beskrevet i eksempel 13. Enten ble hele lette kjeder, LCDR1 eller LCDR1+2 byttet ut. Kn-verdier for valgte kryssklonete Fab'er er vist i tabell 8.

Noen av Fab'ene fra den første og andre modningssyklus og fra de kryssklonete bindere, ble konvertert til fullengde humant IgGl-antistoffer, i henhold til den teknologi som er beskrevet av MorphoSys, som beskrevet i eksempel 6. Kn-verdiene for IgG-binding til Api-40- og Api-42-fibere ble bestemt ved Biacore. Kort sagt ble en kinetisk modell for den trinnvise dannelse av et bivalent kompleks benyttet, og Kp-verdiene ble beregnet ved en analyse av Scatchard-typen for likevektsbinding. Pga. den meget langsomme assosiasjonsprosess ved lav antistoffkonsentrasjon (flere timer for å nå likevekt), ble likevektsbindingsdata oppnådd ved ekstrapolering av assosiasjonskurvene til lange tidsintervaller. På- og av-hastighetene for dannelse av monovalent og bivalent kompleks ble bestemt via kurvetilpasningsprosedyren, og benyttet for ekstrapolering. Basert på disse Req-verdier ble en Scatchard-analyse gjennomført og Kn-verdier for dannelsen av det monovalente og bivalente kompleks ble bestemt. Data er oppsummert i tabell 5. Fra det rettkurvete Scatchard-plot ble en høyere (bivalent) og lavere (monovalent) affinitetsinteraksjon avledet for MS-R IgG'er avledet fra den andre affinitetsmodningssyklus og krysskloner. Disse to affiniteter representerer de nedre og øvre Ko-verdier for området, som indikert i tabell 5. Kd-verdier for MS-R Fab-binding til Api-40- og Api-42-fibere som bestemt ved Biacore. For klonene avledet fra den første og andre affinitetsmodningssyklus er verdiene korrigerte for innhold av aktivt Fab til stede i hver prøve som beskrevet i teksten.

a: Verdier ble beregnet fra konsentrasjonsavhengige sensorresponser ved likevekt, n.d.: Ikke bestemt.

KD-verdier MS-R IgGl-binding til Api-40- og Api-42-fibere som bestemt ved Biacore. IgG ble avledet fra MS-R-Fab'er valgt etter første affinitetsmodningssyklus. Verdiene er korrigerte for innhold av aktive MS-R IgG til stede i hver prøve som beskrevet i teksten.

KD-verdier for MS-R IgGl binding til A01-40- og A01-42-fibere som bestemt ved Biacore. IgG'ene ble avledet fra MS-R-Fab'er valgt etter første og andre affinitetsmodningssyklus og fra kryssklonete Fab'er. Verdiene er korrigerte for innholdet av aktive MS-R IgG'er til stede i hver prøve som beskrevet i teksten. De to KD-ver dier som er gitt for MS-R IgG'er avledet fra det andre afffinitetsmodningstrinn og kryssklonete bindere, representerer høyere og lavere affinitetsinteraksjon som beregnet fra de rettkurvete Scatchard plottene. Med et antall ytterligere MS-R IgG'er (for eksempel MS-RIgG7.9.H2x7.12.L2 og MS-RIgG7.9.H4x7.12.L2), ble det oppnådd komplekse, rettkurvete Scatchard blott, og bestemmelse av KD-ver dier var derfor ikke mulig.

Eksempel 9: Farging av genuint, humant amyloid plakk i hjernesnitt av en Alzheimers pasient ved indirekte immunfluorescens.

Valgte MS-Roche Fab'er og fullengde-IgGl ble testet for binding til P-amyloid plakk ved immunohistokjemianalyse. Kryostatsnitt av ikke-fikserte vev fra humant temporal korteks (oppnådd post mortem fra en pasient som hadde positiv diagnose for Alzheimers sykdom), ble merket ved indirekte immunfluorescens ved anvendelse av MS-Roche Fab'er eller fullengde human-IgGl-antistoffer ved forskjellige konsentrasjoner. Fab'er og IgGl-antistoffer ble avdekket ved geiteantihumant, affinitetsrenset F(ab')2fragment konjugert til Cy3 henholdsvis geiteantihumant (H+L) konjugert til Cy3. Begge sekundære reagenser ble oppnådd fra Jackson Immuno Research. Kontroller inkluderte en ikke-relatert Fab og de sekundære antistoffer alene, som alle ga negative resultater. Typiske eksempler på plakkfarging med utvalgte MS-Roche Fab'er og MS-Roche IgGl-antistoffer, er vist i figurene 5 til 7.

Eksempel 10: Polymeriseringsanalyse: Forhindring av Ap-aggregering

Ved inkubering i vandig buffer i flere dager aggregerte syntetisk AP spontant, og dannet fibrillære strukturer som er tilsvarende de som sees ved amyloide avsetninger i hjernen

hos Alzheimerpasienter. Søker har utviklet en in vitro analyse for å måle innarbeidingen av biotinylert AP i på forhånd dannete AP-aggregater for å analysere AP-nøytraliserende potensiale av AP-antistoffer og andre AP-bindingsproteiner som albumin (Bohrmann et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 15990-15995). Virkningen av små molekyler på Ap-aggregering kan også analyseres ved denne analyse.

Eksperimentell prosedyre:

NUNC Maxisorb mikrotiterplater (MTP) belegges med en 1:1 blanding av

Apl-40 og Apl-42 (2 uM hver, 100 ul/brønn) ved 37 °C i tre dager. Under disse betingelser ble høyaggregert, fibrillær AP adsorbert og immobilisert på brønnens overflate. Beleggoppløsningen ble så fjernet og platene tørket ved romtemperatur i 2-4 timer. (De tørkete plater kan lagres ved -20 °C). Restbindingsseter blokkeres ved tilsetning av 300 ul/brønn fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,05 % Tween-20 (T-PBS) og 1 % bovint serumalbumin (BSA). Etter 1-2 timers inkubering ved romtemperatur ble platene vasket 1 x med 300 ul T-PBS. En oppløsning av 20 nM biotinylert Apl-40 i 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,2 (TBS) inneholdende 0,05 % NaN? og seriefortynnet antistoff tilsettes (100 ul/brønn) og platen inkuberes ved 37 °C over natten. Etter vasking 3 x med 300 ul T-PBS ble et streptavidin-POD konjugat (Roche Molecular Biochemicals) fortynnet 1:1000 i T-PBS inneholdende 1 % BSA, tilsatt i en mengde av 100 ul/brønn og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Brønnene ble vasket 3 x med T-PBS og 100 ul/brønn av en ny fremstilt tetrametylbenzidin (TMB) oppløsning ble tilsatt. [Fremstilling av TMB-oppløsning: 10 ml 30 mM sitronsyre, pH 4,1 (justert med KOH) + 0,5 ml TMB (12 mg TMB i 1 ml aceton + 9 ml metanol) + 0,01 ml 35 % H2O2]. Reaksjonen stanses ved tilsetting av 100 ul/brønn 1 N H2SO4og absorbans avleses ved 450 nm i en mikrotiterplateleser.

Resultat:

Figur 8 viser at MS-Roche IgGl-antistoffer forhindret inkorporering av biotinylert Api-40 i på forhånd dannete Api-40/Ap 1-42 aggregater. AP-nøytraliseringskapasiteten for disse fullengdehumane IgG'er var tilsvarende den til det musemonoklonale antistoff BAP-1, som var generert ved en standard immuniseringsprosedyre og spesifikt gjenkjenner aminosyrerestene 4-6 av AP-peptid ved analyse ved pepspot-teknikken, som beskrevet i eksempel 7. Musemonoklonalt antistoff BAP-2, som også reagerer utelukkende med aminosyrene 4-6 (Brockhaus, ikke publisert) var betydelig mindre aktivt ved denne analyse. Enda lavere aktivitet ble funnet med Api-40 C-terminalt spesifikt antistoff BAP-17 (Brockhaus, Neuroreport 9 (1998), 1481-1486) og det monoklonale antistoff 4G8 som gjenkjenner en epitop mellom posisjon 17 og 24 i AP-sekvensen (Kim, 1988, Neuroscience Research Communication, bind 2, 121-130). BSA ved en konsentrasjon på opptil 10 ug/ml påvirket ikke innarbeidingen av biotinylert AP, og tjente som negativ kontroll. Ved høyere konsentrasjoner, dvs. større enn 100 ug/ml, er BSA imidlertid rapportert å inhibere binding av biotinylert Ap til på forhånd dannete Ap-fibere (Bohrmann, (1999) J. Biol. Chem. 21A (23), 15990-5), som indikerer at interaksjonen av BSA med AP ikke er av høy affinitet.

Eksempel 11: Depolymeriseringsanalyse: Frigivning av biotinylert Ap fra aggregert Ap

I et tilsvarende forsøksoppsett ble MS-Roche IgG-antistoffers potensiale med henblikk på indusering av depolymerisering av aggregert Ap. Biotinylert Ap 1-40 ble først innarbeidet i på forhånd dannete Api-40/AP 1-42-fibere før behandling med forskjellige anti-AP-antistoffer. Frisetting av biotinylert Ap ble målt ved anvendelse av den samme analyse som beskrevet i polymeriseringsanalysen.

Forsøksprosedyre

NUNC Maxisorb mikrotiterplater (MTP) belegges med en 1:1 blanding av

Api-40 og Api-42, som beskrevet ved polymeriseringsanalysen. For innarbeiding av biotinylert Ap ble de belagte plater inkubert over natten med 200 ul/brønn 20 nM biotinylert Apl-40 i TBS, inneholdende 0,05 % NaN3ved 37 °C. Etter vasking 3 x 300 ul/brønn T-PBS, ble antistoffer som var seriefortynnet i TBS inneholdende 0,05 % NaN3, tilsatt og inkubert ved 37 °C i 3 timer. Platen ble vasket og analysert med henblikk på nærvær av biotinylert Api-40, som beskrevet ovenfor.

Resultat:

Figurene 9A til D viser at oppfinnelsens antistoffer induserte depolymerisering av aggregert AP som målt ved frigivning av innarbeidet, biotinylert Api-40. MS-R-antistoffene og det musemonoklonale antistoff BAP-1 var tilsvarende aktivt, mens BAP-2-, BAP-17- og 4G8-antistoffene var klart mindre effektive ved frisetting av biotinylert Ap fra massen av immobiliserte Ap-aggregater. BAP-1 kan klart differensieres fra MS-R-antistoffene pga. reaktiviteten med celleoverflatefullengde APP (se figur 15), og antistoffer som BAP-1 med slike egenskaper er ikke brukbare for terapeutisk anvendelse da potensielle, autoimmunologiske reaksjoner kan induseres. Det er interessant å merke seg at BAP-2, på tross av spesifisiteten for aminosyrerest 4-6, som eksponeres i aggregert Ap, har en klart lavere aktivitet i denne analyse, som indikerer at ikke alle N-terminusspesifikke antistoffer a priori er like effektive med henblikk på frigivning av Ap fra f or dannete aggregater. MS-Roche IgG'ene er klart overlegne BAP-2 med henblikk på depolymeriseringsaktiviteten. Den relativt lave aktivitet for BAP-17 (C-terminusspesifikk) og 4G8 (aminosyrerest 16-24-spesifikk) i denne analyse skyldes den kryptiske art av disse to epitoper i aggregert Ap. Som allerede bemerket i polymeriseringsanalysen, hadde BSA ved de konsentrasjoner som her ble benyttet, ingen effekt på aggregert Ap.

MS-R-antistoffer avledet fra den andre affinitetsmodningssyklus og fra de kryssklonete bindere, viser generelt en høyere effektivitet ved depolymeriseringsanalysen (sammenlikning av figur 9A med figurene 9B og 9C), noe som er konsistent med den økete bindingsaffinitet for disse antistoffer (se tabellene 3-5). De monoklonale antistoffer AMY-33 og 6F/3D er rapportert å forhinder AP-aggregering in vitro under visse forsøksbetingelser (Solomon, (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93, 452-455; AMY-33 og 6F/3D antistoffer oppnådd fra Zymed Laboratories Inc., San Francisco (Order nr. 13-0100) henholdsvis Dako Diagnostics AG, Zug, Sveits (Order nr. M087201)). Som vist i figur 9D var begge disse antistoffer fullstendig inaktive i depolymeriseringsanalysen.

Eksempel 12: Epitopanalyse ved ELISA på peptidkonjugater De følgende heptapeptider (enkeltbokstavkode) ble oppnådd ved fastfasesyntese og renset ved væskekromatografi ved anvendelse av teknikker kjent innen faget.

Peptidene ble oppløst i DMSO for å komme til en 10 mM konsentrasjon.

Bovint albumin (i det vesentlige fettsyrefritt BSA, Sigma Lot 112F-9390), ble oppløst til 10 mg/ml i 0,1 M natriumbikarbonat og aktivert ved tilsetting pr. ml av 50 ul av en 26 mg/ml oppløsning av N-suksinimidyl-maleinimidopropionat (NSMP, Pierce) i DMSO. Etter 15 minutters omsetning ved romtemperatur ble det aktiverte BSA renset ved gelfiltrering (NAP-10, Pharmacia) i PBS med 0,1 % natriumazid som oppløsningsmiddel. 50 ul NSMP aktivert BSA (6,7 mg/ml) ble fortynnet med 50 ul PBS, 0,1 % natriumazid, og 10 ul peptidoppløsning (1 mM i DMSO) ble tilsatt. Som negativ kontroll ble aktiver BSA narrebehandlet med peptidtilsetning. Etter 4 timer ved romtemperatur ble reaksjonen stanset ved tilsetting av 10 ul 10 mM Cystein. En alikvot av konjugatreaksjonsblandingen ble fortynnet 1:100 med 0,1 M natriumbikarbonatbuffer og ble umiddelbart fylt i brønner på 100 ul av ELISA-plater (Nunc-Immuno-Plate). Etter henstand i 16 timer ved 4 °C, ble 100 ul blokkeringsbuffer (som ovenfor) tilsatt hver brønn og inkubert i ytterligere 30 minutter. Platene ble vasket med 2 x 300 ul/brønn TBST (som ovenfor) og fylt med 100 ul antistoff ved 10 ug/ml eller 2 ug/ml i blokkeringsbuffer. Platene ble holdt i 16 timer ved 4 °C, og vasket med 2 x 300 ul TB ST. 100 ul/brønn HRP-konjugert antihumant lg H+L (Pierce, fortynning 1:1000 med blokkeringsbuffer) ble tilsatt og inkubert i en time ved omgivelsestemperatur. Platene ble vasket med 3 x 300 ul/brønn TBST. Fargefremkalling ble startet ved tilsetting av 100 ul tetrametylbenzidin:hydrogenperoksidreagens. Reaksjonen ble stanset etter 50 minutter ved tilsetting av 100 u l/brønn 1 M svovelsyre og den optiske tetthet målt med en optisk leser (Microplate Reader 3550, BioRad) ved 450 nm. For sammenlikning ble musemonoklonale antistoffer analysert på samme måte, bortsett fra å benytte HRP-merket antimuse-Ig som fremkallingsmiddel i stedet for antihumant lg.

Ved å benytte spesifikke av de ovenfor beskrevne heptapeptider avledet fra Ap, ble spesifikke ELISA-tester som beskrevet her gjennomført. Fortrinnsvis omfatter oppfinnelsens antistoffer slike som viser et forholdssignal:bakgrunn på rundt "10" målt ved optiske tettheter, når deres reaktivitet med et AP-avledet peptid (AEFRHD; aminosyre 2 til 7 av AP) sammenliknes med et ikke-relatert protein/peptid som BSA. Mest foretrukket er forholdet for de optiske tettheter over "5" for en tilsvarende reaksjon med minst én av de følgende tre AP-avledete peptider: (VFFAED; aminosyre 18 til 23 av Ap) eller (FFAEDV; aminosyre 19 til 24 av Ap) eller (LVFFAE; aminosyre

17 til 22 av Ap).

Tilsvarende resultater for oppfinnelsens parentale og/eller maturerte antistoffer er vist i de følgende to tabeller:

Reaktivitet av MS-R Fab'er med BSA-konjugerte Ap-heptapeptider 2-7 (AEFRHD), 17-22 (LVFFAE), 18-23 (VFFAED) og 19-24 (FFAEDV). Forholdene for ELISA-utlesninger (optisk tetthet) oppnådd med peptidkonjugert og ikke-konjugert BSA er gitt. Signalintensitetene som ble oppnådd med 17-22-, 18-23- og 19-24-peptidene er også indikert i forhold til 2-7 peptidene.

Reaktivitet av MS-R IgG'er og musemonoklonale antistoffer BAP-1, BAP-2, 4G8, 6E10, Amy-33 og 6F/3D med BSA-konjugerte Ap-heptapeptider 2-7 (AEFRHD), 17-22 (LVFFAE), 18-23 (VFFAED) og 19-24 (FFAEDV). Forholdene for ELISA-utlesninger (optisk tetthet) oppnådd med peptidkonjugert og ikke-peptidkonjugert BSA er gitt. Signalintensitetene som ble oppnådd med 17-22-, 18-23- og 19-24-peptidene er også indikert i forhold til 2-7 peptidet.

<*>Dette antistoff er spesifikt for sekvens 8-17 og gjenkjenner ikke N-terminalen eller midtepitopsekvenser.

Eksempel 13: Kombinasjon av optimalisert H-CDR2 og L-CDR1 ved krysskloning Den modulære konstruksjon av HuCAL-biblioteket tillater bytting av komplementaritetsbestemmende områder (CDR'er) av to forskjellige Fab-kodende gener i et enkelt kloningstrinn. For en ytterligere forbedring av affinitet ble de uavhengig optimaliserte H-CDR2 og L-CDR1 fra maturerte kloner med den samme H-CDR3 kombinert, fordi det var en stor sannsynlighet for at denne kombinasjon ville føre til en ytterligere gevinst av affinitet (Yang et al., 1995, J. Mol. Biol. 254, 392-403; Schier et al., 1996b, J. Mol. Biol. 263, 551-567; Chen et al., 1999, J. Mol. Biol. 293, 865-881). Hele lettkjeder eller fragmenter derav ble overført fra en L-CDR1 optimalisert donorklon til en H-CDR2 optimalisert reseptorklon. Donor- og reseptorkloner ble kun kombinert dersom begge bar identiske H-CDR3-sekvenser. Alle donor- og reseptorkloner bar Vr3-Vk3 rammeverket.

Dette ble gjennomført ved overføring av hele lettkjeder fra den L-CDR1-optimaliserte donorklonen til den H-CDR2-optimaliserte reseptorklonen. Epitopspesifisitet ble bevart ved kun å kombinere kloner med de samme H-CDR3. Ved lettkjedeutbytting oppnådde en H-CDR2-optimalisert klon kun en optimalisert L-CDR1, dersom utbyttingen opptrådte mellom kloner med den samme L-CDR3. Hvis L-CDR3 fra klonene som skulle kombineres var forskjellige, oppnådde den H-CDR2-optimaliserte klon i tillegg til den optimaliserte L-CDR1, en ytterligere L-CDR3

(L-CDR2 forble HuCAL-konsensussekvensen (Knappik et al., 2000)), og når derivater av MS-Roche nr. 7.12 ble anvendt som donorer av lettkjede L-CDR1, ble 2 og 3 utbyttet med den H-CDR2-optimaliserte akseptorklon. Tre forskjellige kloningsstrategier ble anvendt:

1) Ved anvendelse av restriksjonsendonukleaser ^føl og Sphl ble hele antistofflettkjedefragmentet utskåret fra plasmid 1 (for eksempel pMx9_Fab_MS-Roche #7.11 .H1_FS) og den derved oppnådde vektorryggrad ble så ligert til lettkjedefragmentet av plasmid 2 (for eksempel pMx9_Fab_MS-Roche #7.2.L1_FS) generert ved Xbal og Sphl digestering. Derved ble det skapt et nytt plasmid (nomenklatur: pMx9_Fab_MS-Roche #7.11.Hlx7.2.Ll_FS) som koder L-CDR1,2,3 av parental klon #7.2.L1 og H-CDR1,2,3 av parental klon #7.11.Hl. 2) Ved anvendelse restriksjonsendonukleaser Xbal og Acc65I ble et L-CDR1 kodende fragment fra plasmid 1 skåret ut (for eksempel pMx9_Fab_MS-Roche #7.11.H2FS) og den derved oppnådde vektorryggrad ble så ligert til L-CDR1 fragmentet av plasmid 2 (for eksempel pMx9_Fab_MS-Roche #7.12.L1_FS) generert ved Xbal og Acc65I. Derved ble et nytt plasmid skapt (nomenklatur: pMx9_Fab_MS-Roche #7.11.H2x7.12.Ll(L-CDRl)_FS) som koder L-CDR1 av parental klon #7.12.L1, mens L-CDR2,3 og H-CDR1,2,3 er avledet fra parental klon #7.11.H2. 3) Ved anvendelse restriksjonsendonukleaser Xbal og BamUl ble et L-CDR1- og L-CDR2-kodende fragment skåret ut fra plasmid 1 (for eksempel pMx9_Fab_MS-

Roche #7.11 .H2FS) og den derved oppnådde vektorryggrad ble så ligert til L-CDR1 - og L-CDR2-fragmentet av plasmid 2 (for eksempel pMx9_Fab_MS-Roche #7.12.L1FS) generert ved Xbal- og ifa/nHI-digestering. Derved ble et nytt plasmid skapt (nomenklatur: pMx9_Fab_MS-Roche #7.11.H2x7.12.Ll(L-CDRl+2)_FS) som koder L-CDR1 og L-CDR2 av parental klon #7.12.L1, mens L-CDR3 og H-CDR1,2,3 er avledet fra parental klon #7.11 .H2.

Illustrerende eksempler for de forskjellige kloningsstrategier så vel som for sekvensdonorer og reseptorkloner er gitt i tabell 8.

Etter storskalaekspresjon og rensing ble affinitetene bestemt på AP(l-40) fibere. Videre er KD-verdier for valgte kryssklonete MS-R Fab/antistoffer gitt i den vedlagte tabell 9.

KD-verdier for kryssklonet MS-R Fab-binding til Api-40- og Api-42-fibere som bestemt ved Biacore. Tilberedningen av kryssklonete Fab'er er beskrevet i eksempel 13. Ko-verdiene ble bestemt ved kinetisk kurvetilpasning og korrigert for innholdet av aktivt Fab til stede i hver prøve, som beskrevet i teksten. Noen Fab'ene ble i tillegg renset ved størrelseseksklusjonskromatografi eller preparativ ultrasentrifugering for å fjerne aggregert materiale. (LI), den H-CDR2-maturerte akseptorklon fikk kun L-CDR1 fra den L-CDR1-forbedrete donorklon; (LI+2), den H-CDR2-maturerte reseptorklon fikk L-CDR1+2 fra den L-CDR1-forbedrete donorklon.

Eksempel 14: In vivo amyloid plakkdekorering i en musemodell av Alzheimers sykdom, som avdekket ved konfokal laserskanningsmikroskopi og kolokaliseringsanalyse.

Valgte MS-R IgGl-antistoffer ble testet i APP/PS2 dobbelttransgene mus (referanse: Richards et al., Soc. Neurosci. Abstr., bind 27, program nr. 5467, 2001) på amyloid plakkdekorering in vivo. Antistoffene (1 mg/mus) ble tilført intravenøst og etter 3 dager ble hjernene perfusert ved saltoppløsning og preparert for kryosnitt. I en annen studie ble musene eksponert til høyere konsentrasjoner av antistoffene, dvs. 2 mg injisert intravenøst dag 0, 3 og 6, og dyrene ble avlivet dag 9. Nærværet av antistoffer bundet til amyloide plakk ble bedømt på ikke-fikserte kryostatsnitt ved dobbeltmerket, indirekte immunfluorescens ved anvendelse av geiteantihumant IgG (H+L) konjugert til Cy3 (#109-165-003, Jackson Immuno Research) fulgt av BAP-2-Alexa488 immunkonjugat. Avbildning ble gjort ved konfokal lasermikroskopi og bildeprosessering for kvantitativ påvisning av kolokaliseringer ved IMARIS- og COLOCALIZATION-program (Bitplane, Sveits). Typiske eksempler er gitt i figurene 10-14. Alle av de testete MS-R antistoffer ble funnet positive ved immundekorering av amyloide plakk in vivo, selv om en viss variabilitet ble bemerket.

Eksempel 15: Undersøkelse av binding av forskjellige monoklonale antistoffer til amyloid forløperprotein (APP) på overflaten av HEK293-celler.

APP er utstrakt uttrykt i det sentrale nervesystem. Binding av antistoff til celleoverflate APP kan føre til komplementaktivering og celledestruering i sunne hjerneområder. Derfor er det avgjørende for terapeutiske AP-antistoffer å være fri for reaktivitet mot APP. Høyaffinitetsantistoffer mot N-terminalt doméne av AP (for eksempel BAP-1, BAP-2) gjenkjenner den respektive epitop også i rammeverket av APP. I motsetning til dette er antistoffene mot midtepitopen (for eksempel 4G8), og antistoffene ifølge oppfinnelsen, overraskende ikke i stand til å gjenkjenne celleoverflate-APP. Således er antistoffene ifølge oppfinnelsen som dekorerer AP, men ikke APP in vivo, overlegene ikke-selektive antistoffer.

Fremgangsmåten som omfatter cytometri er velkjent i teknikken. Relative enheter for fluorescens (FL1-H) målt ved strømningscytometri, antyder celleoverflatebinding av det respektive antistoff. Et fluorescensskift på APP-transfekterte HEK293, sammenliknet med ikke-transfekterte HEK293-celler, antyder den uønskete reaksjon med celleoverflate-APP. Som eksempel viser antistoffene BAP-1 og BAP-2 mot N-terminalt doméne, et betydelig skift av FL-1-signal i HEK293/APP (tykk linje), sammenliknet med ikke-transfekterte HEK293-celler (stiplet linje). 4G8-antistoffet (spesifikt for midtre AP-epitopen) og alle antistoffene ifølge oppfinnelsen (spesifikke for N-terminale- og midt-AP-epitoper) viser intet betydelig skift i fluorescens. Differanser i basal fluorescens mellom HE293/APP- og HEK293-celler skyldes forskjellig cellestørrelse. Et FACScan-instrument ble anvendt i kombinasjon med Cellquest Pro programpakken (begge Becton Dickinson).

Eksempel 16: Liste av identifiserte SEKV. ID numre relatert til oppfinnelsens antistoffmolekyler.

Tabell 10 angår sekvenser som definert her for visse spesifikke antistoffmolekyler ifølge oppfinnelsen.

Claims

1. Antistoffmolekyl i stand til spesifikt å gjenkjenne to områder av P-A4 peptid/AP4,karakterisert vedat det første området omfatter aminosyresekvensen AEFRHDSGY som vist SEKV. ID nr. 1 eller et fragment derav, og der det andre området omfatter aminosyresekvensen VHHQKLVFFAEDVG som vist i SEKV. ID nr.

2 eller et fragment derav, hvori nevnte antistoff molekyl omfatter a) en variabel VL- region omfattende komplementære bestemmende regioner, L-CDR1, L-CDR2 og LCDR3, hvor i) L-CDR1 omfatter SEKV ID nr. 143; ii) L-CDR2 omfatter SEKV ID nr. 144 og iii) L-CDR3 omfatter SEKV ID nr. 95 og b) en variabel VH-region omfattende komplementære bestemmende regioner, H-CDR1, H-CDR2 og H-CDR3 der i) H-CDR1 omfatter SEKV ID nr. 146; ii) H-CDR2 omfatter SEKV ID nr. 192 og iii) H-CDR3 omfatter SEKV ID nr. 93.

2. Antistoffmolekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffmolekylet gjenkjenner minst to konsekutive aminosyrer innen de to områdene av P-A4.

3. Antistoffmolekyl ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat antistoffmolekylet gjenkjenner i det første område en aminosyresekvens omfattende: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD eller HDSG og i det andre området en aminosyresekvens omfattende: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED eller VFFA, FFAEDV.

4. Antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisertved at antistoffmolekylet omfatter et variabelt VH-område som vist i SEKV. ID nr.

89 og et variabelt VL-område som vist i SEKV. ID nr. 91.

5. Antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisertved at antistoffmolekylet omfatter et variabelt VH-område som kodet av et nukleinsyremolekyl som vist i et SEKV. JD nr. 88 et variabelt VL-område kodet for av et nukleinsyremolekyl som vist i SEKV JD nr. 90.

6. Antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisertved at antistoffmolekylet er et fullstendig antistoff (immunoglobelin), et F(ab)-fragment, et F(ab)2-fragment, et enkelt kjede antistoff, et kimært antistoff, et CDR-podet antistoff, en bivalent antistoff-kontruksjon, et syntetisk antistoff eller et kryssklonet antistoff.

7. Antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisertved at minst to områder av P-A4 danner et konformasjonsepitop eller et diskontinuerlig epitop.

8. Nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det koder et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

9. Vektor,karakterisert vedat den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 8.

10. Vertscelle,karakterisert vedat den omfatter vektoren ifølge krav 9.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7,karakterisert vedat den omfatter dyrking av vertscellen ifølge krav 10 under betingelser som tillater syntese av antistoffmolekylet, og gjenvinning av antistoffmolekylet fra kulturen.

12. Preparat,karakterisert vedat det omfatter et antistoffmolekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1-7 eller et antistoff molekyl produsert ved fremgangsmåten i følge krav 11.

13. Preparat i følge krav 12,karakterisert vedat det er et farmasøytisk eller diagnostisk preparat.

14. Anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11, eller et nukleinsyremolekyl ifølge krav 8, eller en vektor ifølge krav 9, eller en vert ifølge krav 10 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for forebygging og/eller behandling av en sykdom assosiert med amyloidogenese og/eller amyloid plakkdannelse.

15. Farmasøytiskpreparat,karakterisert vedat det omfatter et antistoffmolekyl i følge et hvilket som helst av kraven 1-7 eller et antistoff molekyl produsert ved fremgangsmåten i følge krav 11, eller et nukleinsyremolekyl ifølge krav 8, eller en vektor ifølge krav 9, eller en vert ifølge krav 10 for anvendelse i forebygging og/eller behandling av en sykdom assosiert med amyloidogenese og/eller amyloid plakkdannelse.

16. Anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11 for fremstilling av et diagnostisk preparat for påvisning av en sykdom assosiert med amyloidogenese og/eller amyloid plakkdannelse.

17. Diagnostisk preparat,karakterisert vedat det omfatter et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11, for anvendelse i deteksjon av en sykdom assosiert med amyloidogenese og/eller amyloid plakkdannelse.

18. Anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for disintegrasjon av 0- amyloide plakk.

19. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11 for anvendelse i disintegrasjonen av P-amyloide plakk.

20. Anvendelse av et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for passiv immunisering mot P-amyloide plakk dannelse.

21. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter et antistoffmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et antistoffmolekyl fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11 for anvendelse i passiv immunisering mot P-amyloide plakk dannelse.

22. Anvendelse av et hvilket som helst av kravene 14, 16, 18 eller 20, eller det farmasøytiske preparatet i følge krav 15 eller 16, eller det diagnostiske preparatet i følge krav 17, hvori nevnte sykdom er demens, Alzheimers sykdom, motor neuropati, Downs syndrom, Creutzfeld Jacobs sykdom, arvelig cerebral hemorrhage med amyloidosis nederlandsk type, Parkinsons sykdom, HIV relatert demens, ALS eller neuronal forstyrrelse relatert til alder.