NO328377B1 - Humanisert, monoklonalt antistoff som binder ErbB2/HER2, farmasoytisk formulering, immunkonjugat, isolert nukleinsyre, vektor, vertscelle og fremgangsmate for fremstilling av antistoff. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse angår humanisert, monoklonalt antistoff som binder ErbB2/HER2, farmasøytisk formulering, immunkonjugat, isolert nukleinsyre, vektor, vertscelle og fremgangsmåte for fremstilling av antistoff.

Bakgrunn for oppfinnelsen

ErbB-familien av respeptortyrosinkinaser er viktige mediatorer for cellevekst, differensiering og overlevelse. Reseptorfamilien inkluderer fire forskjellige medlemmer inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR eller ErbBl), HER2 (ErbB2 eller pl85<neu>), HER3 (ErbB3) og HER4 (ErbB4 eller tyro2).

EGFR kodet for av erbBl-genet har blitt antydet å være årsaken til human malignitet. Spesielt har økt ekspresjon av EGFR blitt observert i bryst-, blære-, lunge-, hode-, nakke- og magekreft så vel som i glioblastomer. Økt EGFR-reseptorekspresjon er ofte assosiert med økt produksjon av EGFR-liganden transformerende vekstfaktor alfa (TGF-cc), av de samme kreftcellene hvilket resulterer i reseptoraktivering ved hjelp av en <autoknn> stimuierende reaksjonsvei. Baselga og Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154

(1994). Monoklonale antistoffer rettet mot EGFR eller dens ligand, TGF-a og EGF har blitt evaluert som terapeutiske midler i behandlingen av slike maligniteter. Se f.eks. Baselga og Mendelsohn, supra; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007 (1984); og Wu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995).

Det andre medlemmet av ErbB-familien, pl85<neu>, ble opprinnelig identifisert som produktet av det transformerende genet fra neuroblastomer fra kjemisk behandlede rotter. Den aktiverte fonnen av «ew-protoonkogenet er et resultat av en punktmutasjon (valin til glutaminsyre) i den transmembrane regionen av det kodede proteiner. Amplifikasjon av den humane homologen av neu er observert i bryst- og eggstokkreft, og er forbundet med en dårlig prognose (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science 244:707-712 (1989); og US patent nr. 4968603). Til dags dato er det ikke blitt rapportert om punktmutasjonsanaloger som det i «ew-protoonkogenet for humane tumorer. Overekspresjon av ErbB2 (ofte, men ikke alltid som følge av genamplifikasjon) har også blitt observert i andre karsinomer inkludert karsinomer i magen, endometrium, spyttkjertler, lunger, nyrer, kolon, tyroid, pankreas og blæren. Se blant annet King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:3364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57: 358-363 (1988); Williams et al, Pathiobiology 59:46-52 (1991); og McCann et al. Cancer 65:88-92 (1990). ErbB2 kan være overuttrykt i prostatakreft (Gu et al. Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al. Cancer 79:2162-70 (1997) og Sadisivan et al, J.Urol. 150:126-31 (1993)).

Antistoffer rettet mot pl85neu fra rotte og humant ErbB2-proteinprodukter har blitt beskrevet. Drebin og medarbeidere har utviklet antistoffer mot «ei*-genproduktet, pl85<neu>, fra rotte. Se for eksempel Drebin et al, Cell 41:695-706 (1985); Myers et al, Meth. Enzym. 198:277-290 (1991) og WO 94/22478. Drebin et al. Oncogene 2:273-277

(1988) rapporterer at blandingen av antistoffer reaktive med to forskjellige regioner fra pl85<neu> resulterer i synergistisk antitumorvirkning av «ew-transformerte NIH-3T3-celler implantert inn i nakne mus. Se også US patent 5824311 utstedt 20. oktober 1998.

Hudziak et al. Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) beskriver generasjonen av et panel av anti-ErbB2-antistoffer som ble karakterisert ved anvendelse av den humane brysttumorcellelinjen SK-BR-3. Relativ celleproliferering av SK-BR-3-celler etter eksponering for antistoffene ble bestemt ved hjelp av krystallfiolett-farging av monolagene etter 72 timer. Ved anvendelse av denne analysen ble maksimal inhibering oppnådd med antistoffet kalt 4D5 som inhiberte cellulær proliferering med 56%. Andre antistoffer i panelet reduserte cellulær proliferering i en mindre grad i denne analysen. Antistoffet 4D5 ble videre funnet å sensibilisere ErbB2-overekspresjon i brysttumor-cellelinjer for den cytotoksiske virkningen av TNF-ct. Se også US patent nr. 5677171 utstedt 14. oktober 1997. Anti-ErbB2-antistoffene beskrevet i Hudziak et al er videre karakterisert i Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al, Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al, J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother, 37:255-263 (1993); Pietras et al, Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vietta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al, J. Biol. Chem, 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al, J. Biol. Chem. 266:14300-5

(1991); D'souza et al. Proe. Nati. Acad. Sei. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996) og Schaefer et al, Oncogene 15:1385-1394 (1997).

En rekombinant humanisert versjon av det murine anti-ErbB2-antistoffet 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAbHER2 eller HERCEPTIN; US patent nr. 5821337) er klinisk aktivt i pasienter med metastatisk brystkreft som overuttrykker ErbB2 og som tidligere har mottatt omfattende antikreftterapi (Baselga et al, J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). HERCEPTIN fikk markedsføringstillatelse fra "Food and Drug Administration" 25. september 1998 for behandling av pasienter med metastatisk brystkreft hvis tumorer overuttrykte ErbB2-proteinet.

Andre anti-ErbB2-antistoffer med ulike egenskaper har blitt beskrevet i Tagliabue et al, Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al, Oncogene 4:543-548

(1989) ; Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al,Molecular

Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al, Int. J. Cancer 53:401-408

(1993); WO 95/400136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al, Cancer res, 51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al, J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); US patent nr. 5793186 og Klapper et al, Oncogene 14:2099-2109 (1997).

Homologianalyse har resultert i identifiseringen av to andre ErbB-reseptor-familiemedlemmer; ErbB3 (US patent nr.: 5183884 og 5480968, så vel som Kraus et al, PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) og ErbB4 (EP patentsøknad nr. 599274; Plowman et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993) og Plowman et al. Nature, 366: 473-475 (1993)). Begge disse resptorene viser økt ekspresjon i det minste i enkelte bryst-kreftcellelinjer.

ErbB-reseptorene er vanligvis funnet i ulike kombinasjoner i celler og heterodim-erisering er antatt å øke mangfoldet av cellulære responser mot et mangfold ErbB-ligander (Earp et al, Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). EGFR binder til 6 forskjellige ligander; epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor alfa (TGF-a), amfiregulin, heparinbindende epidermal vekstfaktor (HB_EGF), betacellulin og epiregulin (Groenen et al, Growth Factors 11:235-257 (1994)). En familie heregulinproteiner som er et resultat av alternativ spleising av et enkelt gen er ligander for ErbB3 og ErbB4. Heregulinfamilien inkluderer alfa-, beta- og gamma-hereguliner (Holmes et al. Science, 256:1205-1210 (1992); US patent nr. 5641869 og Schaefer et al, Oncogene 15:1385-1394 (1997)); «ew-differensieringsfaktorer (NDFer), glialvekstfaktorer (GGFer); acetylkolinreseptorinduserende aktivitet (ARIA); og sensorisk og motorisk neuronderivert faktor (SMDF). For en oversikt se Groenen et al, Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262

(1996) og Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Nylig ble tre ytterligere ErbB-ligander identifisert; neuregulin-2 (NRG-2) som er rapportert å binde enten ErbB3 eller ErbB4 (Chang et al. Nature 387:509-512 (1997) og Carraway et al. Nature 387:512-516

(1997) ); neuregulin-3 som binder ErbB4 (Zhang et al, PNAS (USA) 94(18):9562-7

(1997)); og neuregulin-4 som binder ErbB4 (Harari et al, Onogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacellulin og epiregulin binder også til ErbB4.

Mens EGF og TGFa ikke binder til ErbB2, stimulerer EGF EGFR og ErbB2 til å danne en heterodimer som aktiverer EGFR og resulterer i transfosforylering av ErbB2 i heterodimeren. Dimerisering og/eller transfosforylering synes å aktivere ErbB2-tyrosin-kinasen. Se Earp et al, supra. På samme måte, når ErbB3 uttrykkes sammen med ErbB2, dannes et aktivt signalkompleks og antistoffer rettet mot ErbB2 er istand til å ødelegge dette komplekset (Sliwkowski et al, J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994)). Affiniteten til ErbB3 for heregulin (HRG) er i tillegg økt til et høyere affinitetsstadie når ErbB3 uttrykkes sammen med ErbB2. Se også Levi et al. Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:1431-1435 (1995); og Lewis et al. Cancer Res, 56:1457-1465 (1996) med hensyn til ErbB2-ErbB3-proteinkomplekset. ErbB4, slik som ErbB3, danner et aktivt signalkompleks med ErbB2 (Carraway and Cantley, Cell 78:5,8 (1994)).

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter også et humanisert, monoklonalt antistoff som binder ErbB2/HER2, kjennetegnet ved at det omfatter det variable, tunge domene (VH) med aminosyresekvens som angitt i SEKV. ID. NR.: 4 og det variable, lette domene (VL) med aminosyresekvens som angitt i SEKV. ID. NR.: 3.

Oppfinnelse omfatter også en farmasøytisk formulering, kjennetegnet ved at den omfatter antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Også omfattet av oppfinnelsen er et immunokonjugat, kjennetegnet ved at det omfatter antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse, konjugert med et cytotoksisk middel.

Oppfinnelsen omfatter også en isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at koder for antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen en vektor, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter vektoren ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av en vertscelle omfattende nukleinsyren som koder for antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse, slik at nukleinsyren uttrykkes, og antistoffet produseres.

Ulike fordeler ved anvendelse av et antistoff som binder til ErbB2 for behandling av slik kreft, som motsatt til EGFR-målrettede medikamenter er omfattet heri. Spesielt er EGFR sterkt uttrykt i lever og hud, og dette tilveiebringer en enorm forsinkelse for aktive medikamenter der hvor medikamentet binder til EGFR. I tillegg har hudtoksisitet blitt observert for andre EGFR-målrettede medikamenter, slik som det kimere anti-EGFR-antistoffet C225 og det mindre molekylmedikamentet ZD1839 som binder EGFR. Antistoffer som binder ErbB2 er antatt å ha en bedre sikkerhetsprofil enn slike medikamenter.

Der hvor antistoffet anvendt for terapi heri blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor og/eller har biologiske egenskaper slik som monoklonalt antistoff 2C4 oppnås ytterligere fordeler. Mens EGFR-målrettede medikamenter kun påvirker EGFR, vil f.eks. antistoffene av spesiell interesser heri (f.eks. 2C4, inkludert humaniserte og/eller affinitetsmodnede varianter derav) påvirke EGFR/ErbB2-, ErbB3/ErbB4- og ErbB2/ErbB3-heterodimerer. I tillegg vil antistoffene heri, som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor, være komplementære til EGFR-målrettede medikamenter, hvor EGFR-målrettede medikamenter ikke er komplementære til hverandre.

I ytterligere utførelsesformer tilveiebringes industrielle produkter for anvendelse (blant andre ting) i den ovenfor nevnte fremgangsmåten. For eksempel tilveiebringes et industrielt produkt omfattende en beholder og et preparat innehold deri, hvori preparatet omfatter et anstistoff som binder ErbB2 og videre omfatter et pakkeinnlegg som indikerer at preparatet kan anvendes for behandling av kreft som overutrykker epidermal vektsfaktorreseptor (EGFR).

Oppfinnelsen beskriver også et industrielt produkt omfattende en behaolder og et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor og videre omfatter et pakkeinnlegg som indikterer at preparatet kan anvendes for behandling av kreft, hvori krefent ikke er karakterisert ved overekspresjon av ErbB2-reseptoren.

Oppfinnelsen angår også et industrielt produkt omfattende en beholder og et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB2-reseptor og videre omfatter et pakkeinnlegg som indikerer at preparatet kan anvendes ved behandling av hormonuavhenging kreft.

I ytterligere utførelsesformer beskrives et industrielt produkt omfattende

(a) en første beholder med et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et første antistoff som binder ErbB2 og hemmer vekst av kreftceller som overuttrykker ErbB2; og (b) en andre beholder med et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et andre antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor.

Et ytterligere industrifremstilt produkt beskrives som omfatter en beholder og et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor, og videre omfatter et pakkeinnlegg som indikerer at preparatet kan anvendes for behandling av en kreft valgt fra gruppen bestående av kolon-, rektal- og kolorektal kreft.

Oppfinnelsen beskriver i tillegg: et humanisert antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor; et preparat omfattende det humaniserte antistoffet og en farmasøytisk akseptabel bærer; og et immunokonjugat omfattende det humaniserte antistoffet konjugert med et cytotoksisk middel.

Videre beskriver oppfinnelsen isolerte nukleinsyrer kodende for det humanisert antistoffet; en vektor omfattende nukleinsyren; en vertcelle omfattende nukleinsyren eller vektoren; så vel som en fremgangsmåte for å fremstille det humaniserte antistoffet omfattende å dyrke en vertcelle omfattende nukleinsyren slik at nukleinsyren uttrykkes og eventuelt omfatter utvinning av det humaniserte antistoffet fra vertcellekulturen (f.eks. fra vertcellekulturmedie).

Oppfinnelsen beskriver videre et immunokonjugat omfattende et antistoff som binder ErbB2 konjugert til en eller flere kalicheamisinmolekyler og anvendelsen av slike konjugater for behandling av ErbB2-uttrykkende kreft, f.eks. ErbB2-overuttrykkende kreft i et menneske. Fortrinnsvis er antistoffet i konjugatet monoklonalt antistoff 4D5, f.eks. humanisert 4D5 (og fortrinnsvis huMAb4D5-8 (HERCEPTIN); eller monoklonalt antistoff 2C4, f.eks. humanisert 2C4. Antistoffet i immunokonjugatet kan være et intakt antistoff (f.eks. et intakt IgGi-antistoff) eller et antistoffragment (f.eks. et Fab, F(ab)2, diastoff osv.).

Fendly BM et al. (1990) Cancer Research 50: 1550-1558 beskriver det murine, monoklonale antistoffet 2C4.

US 521337 omfatter en detaljert fremgangsmåte for å humanisere et antistoff.

Kort beskrivelse av tegningene

Figurene IA og IB viser epitopkart av restene 22-645 inne i ekstracellulære domenet (ECD) av ErbB2 (aminosyresekvens, inkludert signalsekvens vist i figur IA; SEKV. ID. NR: 13) som bestemt ved hjelp av trunkeringsmutantanalyse og seterettet mutagenese (Nakamura et al, J. Of Virology 67(10):6179-6191 (1993); og Renx et al, J. Cell Biol. 125(6):1395-1406 (1994)). De utlike ErbB2-ECD-trunkeringene eller punkt-mutasjonene ble fremstilt fra cDNA ved anvendelse av polymerasekjedereaksjons-teknologi. ErbB2-mutantene ble uttrykt som gD-fusjonsproteiner i et pattedyrekspre-sjonsplasmid. Dette ekspresjonsplasmidet anvender cytomegalo viruspromoteren/"enhanceren" med SV40-terminerings- og polyadenyleringssignalene lokalisert nedstrøms for det innskutte cDNA. Plasmid-DNA ble transfektert inn i 293-celler. En dag etter transfeksjon ble cellene metabolsk merket over natt i metionin- og cystein-fritt, lav glukose DMEM inneholdende 1 % dialysert fetalt bovint serum og 25 u,Ci hver av S-metionin og <35>S-cystein. Supernatanter ble høstet og de anti-ErbB2-monoklonale antistoffene eller kontrollantistoffene ble tilsatt til supernatanten og inkubert i 2-4 timer ved 4°C. Kompleksene ble utfelt, påført på en 10-20% tricin SDS-gradientgel og utsatt for elektroforese ved 100 V. Gelen ble elektroblottet på en membran og analysert ved hjelp av auto-radiografi. Som vist i Figur IB, binder anti-ErbB2-antistoffene 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 og 3H4 ulike ErbB2-ECD-epitoper. Figurene 2A og 2B viser virkningen av de anti-ErbB2-monoklonale antistoffene 2C4 og 7F3 på rHRGpi-aktivering av MCF7-celler. Figur 2A viser doseresponskurver for 2C4- eller 7F3-inhibering av HRG-stimulering av tyrosinfosforylering. Figur 2B viser

nr

doseresponskurvene for inhiberingen av I-merket rHRG(31177.244-binding til MCF7-celler ved hjelp av 2C4 eller 7F3.

Figur 3 viser inhiberingen av spesifikk I-merket rHRG(31177.244 som binder til et panel av humane tumorcellelinjer ved hjelp av de anti-ErbB2-monoklonale antistoffene 2C4 eller 7F3. Monoklonale antistoffkontroller et isotyptilpassede murine monoklonale antistoffer som ikke blokkerer rHRG-binding. Ikke-spesifikke 125I-merket rHRGpi177.244-binding ble bestemt fra parallelle inkuberinger utført i nærvær av 100 nM rHRGpi. Verdier for ikke-spesifikk 1<25>I-merket rHRGpi 177.244-binding var mindre enn 1% av totalen for alle de testede cellelinjene.

Figurene 4A og 4B viser virkningen av de monoklonale antistoffene 2C4 og 4D5 på proliferering av MDA-MB-175 (Figur 4A) og SK-BR-3 (Figur 4B)-celler. MDA-MB-175 og SK-BR-3-celler ble sådd ut i 96-brønners plater og tillatt å festes i 2 timer. Eksperimentet ble utført i et medium inneholdende 1% serum. Anti-ErbB2-antistoffer eller medium alene ble tilsatt og cellene ble inkubert i 2 timer ved 37°C. Deretter ble rHRG(31 (1 nM) eller medium alene tilsatt og cellene ble inkubert i 4 dager. Monolag ble vasket og farget/fiksert med 0,5% krystallfiolett. For å bestemme celleproliferering ble absorbansen målt ved 540 nm. Figurene 5A og 5B viser virkningen av monoklonale antistoffer 2C4, HERCEPTIN-antistoff og et ani-EGFR-antistoff på heregulin (HRG)-avhengig assoiasjon av ErbB2 med ErbB3 i MCF7-celler som uttrykker lave/normale nivåer av ErbB2 (Figur 5A) og SK-BR-3-celler som uttrykker høye nivåer av ErbB2 (Figur 5B); se eksepmel 2 nedenfor. Figurene 6A og 6B sammenligner aktivitetene til det intakte murine monoklonale antistoffet 2C4 (mu 2C4) og et kimært 2C4-Fab-fragment. Figur 6A viser inhibering av <125>I-HRG-binding til MCF7-celler ved hjelp av kimerisk 2C4-Fab eller det intakte murine monoklonale antistoffet 2C4. MCF7-celler ble sådd ut i 24-brønns plater (1 x 10<5 >celler/brønn) og dyrket til omtrent 85% konfluens i 2 dager. Bindingseksperimentet ble utført som beskrevet i Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996). Figur 6B viser inhibering av rHRGpi-aktivering av pl80-tyrosinfosforyleringen i MCF7-celler utført som beskrevet i Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996). Figurene 7A og 7B viser aminosyresekvensene til det variable lette (VL) (Figur 7A) og variable tunge (VH) (Figur 7B) domenene til murine monoklonale antistoffer 2C4 (henholdsvis SEKV. ID. NR. 1 og 2); VL- og Vn-domenene til humanisert 2C4-versjon 574 (henholdsvis SEKV. ID. NR. 3 og 4), og human VL- og VH-konsensus sekvens (hum k1, lett kappa undergruppe 1; humlll, tung undergruppe III) (henholdsvis SEKV. ID. NR. 5 og 6). Stjerner identifiserer forskjeller mellom humanisert 2C4-versjon 574 og murint monoklonalt antistoff 2C4, eller mellom humanisert 2C4-versjon 574 og den humane konsensussekvensen. Kompelemtaritets bestemmende regioner (CDRer) er satt i parenteser. Figurene 8A til C viser binding av kimere Fab 2C4 (Fab.vl) og ulike humaniserte 2C4-varianter til ErbB2-ekstracellulært domene (ECD) som bestemt ved hjelp av ELISA i eksempel 3. Figur 9 er et diagram av VL- og VH-domenene til monoklonalt antistoff 2C4 hvor CDR-ryggraden er merket hvitt (LI, L2, L3, Hl, H2, H3). VH-sidekjedene, vurdert ved hjelp av mutagenese i løpet av humaniseringen (se eksempel 3, Tabell 2), er også vist. Figur 10 viser virkningen av monoklonalt antistoff 2C4 eller HERCEPTIN på EGF, TGF-a eller HRG-mediert aktivering av mitogenaktivert proteinkinase (MAPK). Figur 11 er et søylediagram som viser virkningen av anti-ErbB2-antistoffer (alene eller i kombinasjoner) på Calu3 lungeadenokarcinomxenografter (3 + ErbB2-overekspresjon). NB: Behandlingen ble stoppet på dag 24. Figur 12 viser virkningen av rekombinant humanisert monoklonalt antistoff 2C4 (rhuMAb 2C4) eller HERCEPTIN på veksten av MDA-175-celler som vurdert i en "Almar" - blå analyse.

Figur 13 viser virkningen av rhuMAb 2C4 mot MCF7-xenografter.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

1. DEFINISJONER

En "ErbB-reseptor" er en reseptorproteintyrosinkinase som tilhører ErbB-reseptorfamilien og inkluderer EGFR, ErbB2-, ErbB3- og ErbB4-reseptorer og andre medlemmer av denne familien som kan identifiseres i fremtiden. ErbB-reseptoren vil vanligvis omfatte et ekstracellulært domene som kan binde en ErbB-ligand; et lipofilt transmembrant domene; et konservert intracellulært tyrosinkinasedomene; og et karbok-sylende signaliserende domene som inneholder flere tyrosinrester som kan fosforyleres. ErbB-reseptoren kan være en "nativ sekvens" ErbB-reseptor eller en "aminosyresekvensvariant" derav. Fortrinnsvis er ErbB-reseptoren en nativ human ErbB-reseptorsekvens.

Uttrykkene "ErbBl", "epidermal vekstfaktorreseptor" og "EGFR" anvendes om hverandre heri og henviser til EGFR som beskrevet f.eks. i Carpenter et al, Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), inkludert naturlig forekommende mutante former derav (f.eks. en delesjonsmutant av EGFR som i Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211

(1990)). erbBl henviser til genet kodende for EGFR-proteinproduktet.

Uttrykkene "ErbB2" og "HER2" anvendes om hverandre heri og henviser til humant HER2-protein beskrevet f.eks. i Semba et al, PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) og Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Genbak aksessjonsnummer X03363). Uttrykket '" erbBl" henviser til genet som koder for humant ErbB2 og " neu" henviser til genet som koder for rotte pl85<neu.> Fortrinnsvis er ErbB2 nativ human ErbB2-sekvens.

"ErbB3" og "HER3" henviser til reseptorpolypeptidet som beskrevet f.eks. i US patent nr. 5183884 og 5480968, så vel som i Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197

(1989).

Uttrykkene "ErbB4" og "HER4" heri henviser til reseptorpolypeptidet som beskrevet f.eks. i EP patentsøknad nr. 599274; Plowman et al. Proe. Nati. Acad.Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); og Plowman et al. Nature, 366:473-475 (1993), inkludert isoformer derav, f.eks. som beskrevet i WO 99/19488, utstedt 22. april 1999.

Med "ErbB-ligand" menes et polypeptid som binder til og/eller aktiverer en ErbB-reseptor. ErbB-liganden av spesiell interesse heri er en nativ sekvens av human ErbB-ligand slik som epidermal vekstfaktor (EGF) (Savage et al, J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); transformerende vekstfaktor alfa (TGF-a) (Marquardt et al. Science 223:1079-1082 (1984)); amfiregulin også kjent som schwanoma- eller keratin-ocyttautokrin vekstfaktor (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990); og Cook et al. Mol. Cell Biol, 11:2547-2557 (1991)); betacellulin (Shing et al. Science 259:1604-1607 (1993); og Sasada et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); heparin-bindende epidermal vekstfaktor (HB-EGF) (Higashiyama et al. Science 251:936-939 (1991)); epiregulin (Toyoda et al, J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); og Komurasaki et al, Oncogene 15:2841-2848

(1997)); et heregulin (se nedenfor); neuregulin-2 (NRG-2) (Carraway et al. Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 (NRG-3) (Zhang et al. Proe. Nati. Acard. Sei. 94:9562-9567 (1997)); neuregulin-4 (NRG-4) (Harari et al, Oncogene 18:2681-89

(1999)) eller "cripto" (CR-1) (Kannan et al, J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). ErbB-ligander som binder EGFR inkluderer EGF, TGF-a, amfiregulin, betacellulin, HBEGF og epiregulin. ErbB-ligander som binder ErbB3 inkluderer hereguliner. ErbB-ligander i stand til å binde ErbB-4 inkluderer betacellulin, epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 og hereguliner. "Heregulin" (HRG) når anvendt heri, henviser til et polypeptid som kodes for av heregulingenproduktet som beskrevet i US patent nr. 5641869 eller Marchionni et al. Nature, 362:312-318 (1993). Eksempler på hereguliner inkluder heregulin-ct, heregulin-pi, heregulin-p2 og heregulin-p3 (Holmes et al. Science, 256:1205-1210 (1992); og US patentnr. 5641869); «ew-differensieringsfaktor (NDF) (Peles et al, Cell 69:205-216

(1992) ); acetylcholinreseptorinduserende aktivitet (ARIA) (Falls et al, Cell 72:801-815

(1993) ); gliale vekstfaktorer (GGFer) (Marchionni et al. Nature, 362:312-318 (1993)); sensorisk og motorisk neuronutledet faktor (SMDF) (Ho et al, J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); y-heregulin (Schaefer et al, Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Uttrykket inkluderer biologisk aktive fragmenter og/eller aminosyresekvensvarianter av en nativ sekvens av HRG-polypeptider, slik som et EGF-lignende fragmentdomene derav (f.eks. HRGP 1,77.244).

En "ErbB-hetero-oligomer" heri er en ikke-kovalent assosiert oligomer omfattende i det minste to forskjellige ErbB-reseptorer. Slike komplekser kan dannes når en celle, som uttrykker to eller flere ErbB-reseptorer utsettes for en ErbB-ligand, og kan isoleres ved hjelp av immunpresipitering og analyseres ved hjelp av SDS-PAGE, f.eks. beskrevet i Sliwkowski et al, J. Biol. Chem. 269(29): 14661-14665 (1994). Eksempler på slike ErbB-hetero-oligomerer inkluderer EGFR-ErbB2-, ErbB2-ErbB3- og ErbB3-ErbB4-komplekser. Videre kan ErbB-heterooligomeren omfatte to eller flere ErbB2-reseptorer kombinert med en ulik ErbB-reseptor, slik som ErbB3, ErbB4 eller EGFR. Andre proteiner slik som en cytokinreseptorsubenhet (f.eks. gp 130) kan inkluderes i heterooligomeren.

Med "ligandaktivering av en ErbB-reseptor" menes signaloverføring (f.eks. forårsaket av et intracellulært kinasedomene til en ErbB-reseptorfosforylerende tyrosin-rest i ErbB-reseptoren eller et substrat polypeptid) formidlet av ErbB-ligandbinding til en ErbB-hetero-oligomer omfattende ErbB-reseptoren av interesse. Vanligvis vil dette involvere binding av en ErbB-ligand til en ErbB-hetero-oligomer som aktiverer et kinasedomene til en eller flere ErbB-reseptorer i hetero-oligomeren og derved resulterer i fosforylering av tyrosinresten i en eller flere av ErbB-reseptorene og/eller fosforylering av tyrosinresten i de ytterligere substrat polypeptider. ErbB-reseptoraktivering kan kvantifiseres ved anvendelse av ulike tyrosinfosforyleringsanalyser.

Et "nativ sekvens"-polypeptid er et som har den samme aminosyresekvensen som et polypeptid (f.eks. ErbB-reseptor eller ErbB-ligand) utledet fra nature. Slike native sekvens polypeptider kan isoleres fra naturen eller kan fremstilles ved hjelp av rekombinante eller syntetiske midler. Et nativt sekvenspolypeptid kan derfor ha aminosyresekvensen til naturlig forekommende humane polypeptider, murine polypeptider eller polypeptider fra hvilke som helst andre pattedyrarter.

Uttrykket "aminosyresekvensvariant" henviser til polypeptider som har aminosyresekvenser som er forskjellige i noen grad fra et nativt sekvenspolypeptid. Vanligvis vil aminosyresekvensvarianter utøve i det minste omtrent 70% homologi med i det minste et reseptorbindende domene til en nativ ErbB-ligand eller med i det minste et ligand-bindende domene av en nativ ErbB-reseptor, og fortrinnsvis vil de være i det minste omtrent 80%, mer foretrukket i det minste omtrent 90% homologe med slike reseptor- eller ligandbindingsdomener. Aminosyresekvensvariantene har substitusjoner, delesjoner og/eller insersjoner ved bestemte posisjoner inne i aminosyresekvensen til den native aminosyresekvensen. "Homologi" defineres som prosent rester i aminosyresekvensvarianten som er identiske etter sammenstilling med sekvensen og, om nødvendig, introdusere "gaps", for å oppnå den maksimale prosent homologi. Fremgangsmåter og datamaskinprogrammer for sammenstilling er velkjent innenfor området. Et slikt datamaskinprogram er "Align 2", laget av Genetech, Inc, som ble innlevert med brukerdokumentasjon til de Forente Staters Copyright Office, Washington DC 20559, 10. desember 1991.

Uttrykket "antistoff heri anvendes i den bredeste betydning og omfatter spesielt intakte monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer (f.eks. bispesifikke antistoffer) dannet fra i det minste to intakte antistoffer og antistofffrag-menter, så lenge som de utøver den ønskede biologiske aktivitet.

Uttrykket "monoklonalt antistoff som anvendt heri henviser til et antistoff oppnådd fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, dvs. at de individuelle antistoffene som er omfattet i populasjonen er identiske, bortsett fra mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan være tilstede i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke siden de er rettet mot et enkelt antigent sete. I kontrast til polyklonale antistoffpreparater som inkluderer forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), er videre hvert monoklonalt antistoff rettet mot en enkel determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet er de monoklonale antistoffene fordelaktige idet at de kan syntetiseres uten å bli forurenset av andre antistoffer. Uttrykket "monoklonal" indikerer at antistoffet er oppnådd fra en vesentlig homogen populasjon av antistoffer, og skal ikke tolkes slik at det kreves antistoff-fremstilling ved hjelp av en spesiell fremgangsmåte. De monoklonale antistoffene som skal anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan f.eks. lages ved hjelp av hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler et al. Nature, 256:495 (1975), eller kan lages ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter (se f.eks. US patent nr. 4816567). De "monoklonale antistoffene" kan også isoleres fra fag-antistoff-bibliotek ved anvendelse av teknikker beskrevet i f.eks. Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) og Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

De monoklonale antistoffene heri inkluderer spesielt "kimere" antistoffer, hvori en del av den tunge- og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog til korresponderende sekvens i antistoffer utledet fra en spesiell art eller tilhørende til en spesiell antistoffklasse eller underklasse, mens den gjenværende delen av kjeden/kjedene er identisk med, eller homolog til korresponderende sekvens i antistoffer utledet fra andre arter eller tilhørende andre antistoffklasser eller underklasser, så vel som fragmenter av slike antistoffer så lengde som de utøver den ønskede biologiske aktivitet (US patent nr. 481567; og Morrison et al, PNAS, USA, 81:6851-6855 (1984)). Kimære antistoffer av interesse heri inkluderer "primatiserte" antistoffer omfattende variable domene antigen-bindende sekvens utledet fra en ikke-human primat (f.eks. Old World Monkey, ape osv.) og humane konstantregionsekvenser. "Antistoffragmenter" omfatter en del av et intakt antistoff, fortrinnsvis omfattende den antigen-bindende- eller variable region derav. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab, Fab', F(ab')2, og Fv-fragmenter; diastoffer; lineære antistoffer; enkeltkjede antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoffer dannet fra et antistoffragment/antistoffragmenter.

Et "intakt" antistoff er et som omfatter en antigenbindings variabelregion så vel som et lett kjedekonstant domene (CL) og et tungt kjedekonstant domene, CH1, CH2 og CH3. De konstante domenene kan være native sekvenskonstant domener (f.eks. nativ human sekvenskontant domene) eller aminosyresekvensvarianter derav. Fortrinnsvis har det intakte antistoffet en eller flere effektorfunksjoner.

Antistoff "effektorfunksjoner" henviser til de biologiske aktiviteter som kan tilskrives Fc-regionen (en nativ sekvens Fc-region eller aminosyresekvensvarianter av Fc-regionen) av et antistoff. Eksempler på antistoffeffektorfunksjoner inkluderer Clq-binding; komplementavhengig cytotoksisitet; Fc-reseptorbinding; antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC); fagocytose; nedregulering av celleoverflate-reseptorer (f.eks. B-celle reseptorer; BCR), osv.

Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante domenet av deres tunge kjeder, kan intakte antistoffer tildeles forskjellige "klasser". Det er fem hovedklasser intakte antistoffer: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan videre deles inn i "underklasser" (isotyper), f.eks. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA og IgA2. De tunge kjedekonstante domenene som samsvarer til de ulike klassene av antistoffer kalles henholdsvis a, 8, 8, y og u,. Subenhets-strukturene og de tredimensjonale konfigura-sjonene av ulike klasser immunoglobuliner er velkjent. "Antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet" og "ADCC" henviser til en cellemediert reaksjon hvori ikke-spesifikke cytotoksiske celler som uttrykker Fc-reseptorer (FcRer) (f.eks. natrulig dreperceller (NK), neutrofiler og makrofager) gjenkjenner bundne antistoffer på en målcelle og deretter forårsaker lysering av målcellene. De primære celler for formidling av ADCC, NK-celler, uttrykker kun FcyRIII, mens monocytter uttrykker FcyRI, FcyRII og FcyRIII. FcR-ekspresjon på hematopoetiske celler er sammenfattet i Tabell 3 på s. 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92

(1991). For å vurdere ADCC-aktiviteten til et molekyl av interesse, kan en in vitro ADCC-analyse, slik som den beskrevet i US patent nr. 5500362 eller 5821337 utføres. Anvendelige effektorceller for slike analyser inkluderer perifere mononukleære blodceller (PBMC) og naturlig dreperceller (NK). Alternativt eller i tillegg til, kan ADCC-aktiviteten til molekylet av interesse vurderes in vivo, for eksempel i en dyremodell slik som den beskrevet i Clynes et al, PNAS (USA) 95:652-656 (1998). "Humane effektorceller" er leukocytter som uttrykker en eller flere FcRer og utfører effektorfunksjoner. Fortrinnsvis uttrykker cellene i det minste FcyRIII og utfører ADCC-effektorfunksjon. Eksempler på humane leukocytter som formidler ADCC inkluderer perifere mononukleære blodceller (PMBC), naturlig drepercellr (NK), monocytter, cytotoksiske T-celler og neutrofiler; hvor PBMCer og NK-celler er foretrukket. Effektorcellene kan isoleres fra en naturlig kilde derav, f.eks. fra blod eller PBMCer som beskrevet heri.

Uttrykkene "Fc-reseptor" eller "FcR" anvendes for å beskrive en reseptor som binder til Fc-regionen av et antistoff. Den foretrukne FcR er en human nativ FcR-sekvens. Videre er en foretrukket FcR en som binder et IgG-antistoff (en gammareseptor) og inkluderer reseptorer av FcyRI-, FcyRII- og FcyRIII-underklassene, inkludert alleliske varianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. FcyRII-reseptorene inkluderer FcyRIIA (en "aktiverende reseptor") og FcyRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har lignende aminosyresekvens som primært er forskjellig i det cytoplasmatiske domenet derav. Aktiverende reseptor FcyRIIA inneholder en immunoreseptor tyrosinbasert aktiverings motiv (ITAM) i dets cytoplasmatiske domene. Inhiberende reseptor FcyRIIB inneholder en immunoreseptor tyrosinbasert inhiberende motiv (ITIM) i dets cytoplasmatiske domene. (Se oversikt av M. i Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRer er gjennomgått i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); og de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41

(1995). Andre Feer, inkludert de som identifiseres i fremtiden, er omfattet av uttrykket "FcR" heri. Uttrykket omfatter også neonatale reseptorer, FcRn, som er ansvarlig for overføringen av IgGer fra moren til fosteret (Guyer et al, J. Immunol, 117:587 (1976) og Kim et al, J. Immunol. 24:249 (1994)). "Komplementavhengig cytotoksisitet" eller "CDC" henviser til den evne et molekyl har til å lysere et mål i nærvær av komplement. Komplement aktiveringsreak-sjonsveien initieres ved bindingen av den første komponenten i komplementsystemet (Clq) til et molekyl (f.eks. et antistoff) kompleksbundet med et beslektet antistoff. For å vurdere komplementaktivering kan en CDC-analyse utføres, f.eks. som beskrevet i Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

"Native antistoffer" er vanligvis heterotetramereglykoproteiner på omtrent

150000 daltons bestående av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lett kjede er bundet til en tung kjede ved hjelp av en kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer blant de tunge kjedene av forskjellige immunoglobulin isotyper. Hver tung og lett kjede har også intrakjededisulfidbroer med regelmessig avstand. Hver tung kjede har i den ene enden et variabelt domene (VH) fulgt av et antall konstante domener. Hver lett kjede har et variabelt domene i en ende (VL) og et konstant domene i den andre enden. Det konstante domenet i den lette kjeden er rettet inn aksielt med det første konstante domene til den tunge kjeden, og det lett-kjedevariable domenet er rettet inn aksielt med det variable domenet til den tunge kjeden. Spesielle aminosyrerester er antatt å danne mellomrommet mellom det variable domene i den lette og tunge kjeden.

Uttrykket "variabel" henviser til det faktum at bestemte deler av de variable

domenene i stor grad har forskjellig sekvens blant antistoffer og anvendes i bindingen og spesifisteten av hvert bestemte antistoff for dets spesifikke antigen. Imidlertid er variabil-iteten ikke jevnt fordelt gjennom de variable domenene til antistoffene. De er konsentrert i 3 segmenter kalt hypervariable regioner både i de variable domenene til den lette kjeden og den tunge kjeden. De i større grad mer konserverte delene av variable domener kalles rammeverksregioner ("framework regions", FRer). De variable domenene av native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FRer, som i stor grad inntar (3-platekonfigurasjon, bundet ved hjelp av tre hypervariable regioner som danner løkker ("loops") som forbinder, og i enkelte tilfeller, danner deler av P-platestrukturen. De hypervariable regionene i hver kjede holdes sammen i umiddelbar nærhet av FRene og med de hypervariable regionene fra den andre kjeden, hvilket bidrar til dannelsen av det antigenbindende setet til antistoffene (se Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological

Interest, 5. utg. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD

(1991)). De konstante domenene er ikke involvert direkte i bindingen av et antistoff til et antigen, men utøver ulike effektorfunksjoner, slik som antistoffets deltagelse i antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC).

Uttrykket "hypervariabel region" som anvendt heri, henviser til aminosyreresten

i et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Den hypervariable regionen omfatter vanligvis aminosyrerester fra en "komplementaritetsbestemmende region" eller "CDR"

(f.eks. restene 24-34 (11), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i det lette kjedevarible domenet og 31-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i det tunge kjedevarible domenet; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)) og/eller de restene fra en "hypervariabel sløyfe" (f.eks. restene 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i det den lette kjedens variable domene og 26-32 (Hl), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i den tunge kjedens variable domene; Chothia og Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Rammeverksregion" eller "FR"-rester er de variable domenerester andre enn de hypervariable regionrestene som definert heri.

Papainfordøying av antistoffer gir to identiske antigenbindende fragmenter kalt "Fab"-fragmenter, hver med et enkelt antigenbindende sete, og et "Fc"-fragmentrest, hvis navn reflekterer dets lette krystalliseringsevne. Pepsinbehandling gir et F(ab')2-fragment som har to antigenbindende seter og fortsatt er i stand til å kryssbinde antigen.

"Fv" er det minimale antistoffragment som inneholder et fullstendig antigengjen-kjennende og antigenbindende sete. Denne regionen består av en dimer av et tungkjede-og et lettkjedevariabelt domene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. Det er i denne konfig-urasjonen at de tre hypervariable regionene av hver variabelt domene sammen definerer et antigenbindende sete på overflaten av VH-VL-dimeren. Sammen gir de seks hypervariable regionene antistoffets antigenbindingsspesifistet. Imidlertid kan selv et enkelt variabelt domene (eller halvparten av en Fv omfattende kun tre hypervariable regioner spesifikke for et antigen) ha evnen til å gjenkjenne og binde antigen, skjønt ved en lavere affinitet enn det totale bindingssetet.

Fab-fragmentet inneholder også det konstante domenet til det lettkjede- og det første konstante domenet (CH1) av den tunge kjeden. Fab'-fragmenter skiller seg fra Fab-fragmenter ved tillegget av noen få rester ved karboksy-enden til det tungekjede CH1-domenet inkludert en eller flere cysteiner fra antistoff hengselregionen. Fab'-SH er angivelsen heri for Fab', hvori cysteinresten/restene av de konstante domenene bærer i det minste en fri tiolgruppe. F(ab'^-antistoffragmenter ble opprinnelig fremstilt som deler av Fab'-fragmenter som hadde hengsels-cysteiner mellom dem. Andre kjemiske koblinger av antistoffragmenter er også kjent.

De "lette kjedene" av antistoffer fra en hvilken som helst virveldyrart kan være en av to klart forskjellige typer, kalt kappa (k) og lambda ( k) basert på aminosyresekvensen til deres konstante domener.

"Enkeltkjede Fv" eller "scFV"-antistoffragmenter omfatter VH- og VL-domenene til antistoffet, hvori disse domenene er tilstede i en enkel polypeptidkjede. Fortrinnsvis omfatter Fv-polypeptidet videre en polypeptidlinker mellom VH- og VL-domenene som gjør scFV i stand til å danne den ønskede struktur for antigenbinding. For en oversikt over scFv - se Pluckthun i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg og Moore red. Springer-Verlag, New York, s. 269-315 (1994). Anti-ErbB2-antistoff scFv-fragmenter er beskrevet i WO 93/16185; US patent nr. 5571894; og US patent nr. 5587458.

Uttrykket "diastoffer (diabodies)" henviser til små antistoffragmenter med to antigenbindingsseter, hvis fragmenter omfatter et variabelt tungt domene (VH) bundet til et variabelt lett domene (VL) i den samme polypeptidkjeden (VH-VL). Ved anvendelse av en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på den samme kjeden, tvinges domenene til å parre med de komplementære domenene av andre kjeder og danne to antigenbindingsseter. Diastoffer er beskrevet mer fullstendig i f.eks. EP 404097; WO 93/11161; og Hollinger et al, PNAS, USA 90:6444-6448 (1993).

"Humaniserte" former av ikke-humane antistoffer (f.eks. gnager) er kimere antistoffer som inneholder ytterst liten sekvens utledet fra ikke-humant immunoglobulin. I de fleste tilfeller er humaniserte antistoffer immunoglobuliner (mottakerantistoffer), hvori restene fra en hypervariabel region fra mottakeren er erstattet med rester fra en hypervariabel region fra en ikke-human art (donorantistoff) slik som mus, rotte, kanin eller ikke-human primat med den ønskede spesifisitet, affinitet og kapasitet. I enkelte tilfeller erstattet rammeverksregionrester (FR) av det humane immunoglobulin med korresponderende ikke-humane rester. Humaniserte antistoffer kan videre omfatte rester som ikke finnes i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene dannes for videre å foredle antistoffets ytelse. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte vesentlig alle av i det minste en, og typisk to, variable domener, hvori alle eller vesentlig alle hypervariable løkker samsvarer med de i et ikke-humant immunoglobulin, og alle eller vesentlig alle FRene er de fra en human immunoglobulinsekvens. De humaniserte antistoffene omfatter også eventuelt i det minste en del av en immunoglobulin konstantregion (Fc), vanligvis det fra et humant immunoglobulin. For videre detaljer, se Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Humanisert anti-ErbB2-antistoffer inkluderer huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 og huMAb4D5-8 (HERCEPTIN) som beskrevet i Tabell 3 i US patent nr. 5821337; humanisert 520C9 (WO 93/21319) og humanisert 2C4-antistoffer som beskrevet heri nedenfor.

Et "isolert" antistoff er et som har blitt identifisert og separert og/eller utvunnet fra en komponent fra dets naturlige miljø. Kontaminerende komponenter fra dets naturlige miljø er materialer som ville påvirke diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av antistoffet og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteinaktige eller ikke-proteinaktige løsninger. I foretrukne utførelsesformer renses antistoffet: (1) til større enn 95% vekt% av antistoffet som bestemt ved hjelp av Lowry-fremgangsmåten, og mest foretrukket mer enn 99 vekt%, (2) til en grad tilstrekkelig for å oppnå i det minste 15 rester av N-enden eller interne aminosyresekvenser ved hjelp av en "spinning cup"-sekvensator, eller (3) til homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av Coomassieblått eller fortrinnsvis sølvfarging.

Isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ inne i rekombinante celler, siden i det minste en komponent av antistoffets naturlige miljø ikke vil være tilstede. Vanligvis vil imidlertid isolert antistoff fremstilles ved hjelp av i det minste et rensetrinn.

Et antistoff "som binder" et antigen av interesse, f.eks. ErbB2-antigen, er et som er i stand til å binde det antigenet med tilstrekkelig affinitet slik at antistoffet er anvendelig som et terapeutisk middel i utpeking a ven celle som uttrykker antigenet. Når antistoffet er et som binder ErbB2, vil det vanligvis, fortrinnsvis, binde ErbB2 i motsetning til andre ErbB-reseptorer og kan være et som ikke signifikant kryssreagerer med andre proteiner slik som EGFR, ErbB3 eller ErbB4.1 slike utførelsesformer er bindingsgraden av antistoffet til disse ikke-ErbB-2-proteiner (f.eks. celleoverflatebinding til endogene reseptorer) mindre enn 10% som bestemt ved hjelp av fluorescensaktivert cellesorterings-analyse (FACS) eller radioimmunopresipitering (RIA). Noen ganger vil anti-ErbB2-antistoffet ikke signifikant kryssreagere med rotte «ew-protein, f.eks. som beskrevet i Schecter et al. Nature 312:513 (1984) og Drebin et al. Nature 312:545-548 (1984).

Et antistoff som "blokkerer" ligandaktivering av en ErbB-reseptor er en som reduserer eller forhindrer slik aktivering som definert heri ovenfor, hvori antistoffet er istand til å blokkere ligandaktivering av ErbB-reseptoren vesentlig mer effektivt enn det monoklonale antistoffet 4D5, f.eks. omtrent så effektivt som monoklonalt antistoff 7F3 eller 2C4 eller Fab-fragmenter derav, og fortrinnsvis omtrent så effektivt som monoklonalt antistoff 2C4 eller et Fab-fragment derav. Antistoffet som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor kan f.eks. være en som er omtrent 50-100% mer effektiv enn 4D5 til å blokkere dannelsen av en ErbB-hetero-oligomer. Blokkering av ligandaktivering av en ErbB-reseptor som oppnås på en hvilken som helst måte, f.eks. ved å interferere med: ligandbinding til en ErbB-reseptor, ErbB-kompleksdannelse, tyrosin-kinaseaktivitet av en ErbB-reseptor i et ErbB-kompleks og/eller fosforylering av (1) tyrosinkinaserest/rester i eller ved en ErbB-reseptor. Eksempler på antistoffer som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor inkluderer de monoklonale antistoffene 2C4 og 7F3 (som blokkerer HRG-aktivering av ErbB2/ErbB3- og ErbB2/ErbB4-heterooligo-merer; og EGF, TGF-a, amfiregulin, HB-EGF og/eller epiregulinaktivering av en EGFR/ ErbB2-hetero-oligomer); og L26-, L96- og L288-antistoffer (Klapper et al, Oncogene 14:2099-2109 (1997)), som blokkerer EGF- og NDF-binding til T47D-celler som uttrykker EGFR, ErbB2, ErbB3 og ErbB4.

Et antistoff med en "biologisk egenskap" til et angitt antistoff slik som de monoklonale antistoffet angitt 2C4 er et som utøver en eller flere av de biologiske egenskapene til det antistoffet som skiller det fra andre antistoffer som binder til det samme antigenet (f.eks. ErbB2). Et antistoff med en biologisk egenskap som 2C4 kan for eksempel blokkere HRG-aktivering av en ErbB-hetero-oligomer omfattende ErbB2 og ErbB3 eller ErbB4; blokkere EGF, TGF-a, HB-EGF, epiregulin og/eller amfiregulinaktivering av en ErbB-reseptor omfattende EGFR og ErbB2; blokkere EGF-, TGF-a- og/eller HRG-formidlet aktivering av MAPK; og/eller binde den samme epitopen i det ekstracellulære domenet av ErbB2, som det bundet ved hjelp av 2C4 (f.eks. som blokkerer bindingen av monoklonalt antistoff 2C4 til ErbB2).

Med mindre noe annet indikeres henviser ekspresjonen av "monoklonalt antistoff 2C4" til et antistoff som har antigenbindingsrester som, eller utledet fra, det murine 2C4-antistoffet fra eksemplene nedenfor. Det monoklonale antistoffet 2C4 kan for eksempel være muring monoklonalt antistoff 2C4 eller en variant derav, slik som humanisert 2C4-antistoff, som utøver antigenbindende aminosyrerester fra murint monoklonalt antistoff 2C4. Eksempler på humaniserte 2C4-antistoffer et tilveiebrakt i eksempel 3 nedenfor. Med mindre det er angitt på annen måte henviser ekspresjon av "rhuMAb2C4" som anvendt her til et antistoff omfattende den variable lette (VL)- og variable tunge (VH)-sekvensen av henholdsvis SEKV.ID.NR. 3 og 4, fusert til human lett- og tung IgGl (ikke-A-allotype)-konstant regionsekvens eventuelt uttrykt ved hjelp av en CHO-celle.

Med mindre det er angitt på annen måte henviser uttrykket "monoklonalt antistoff 4D5" til et antistoff som har antigenbindingsrester som, eller derivert fra, det murine 4D5-antistoffet (ATCC CRL 10463). Det monoklonale antistoffet 4D5 kan for eksempel være murint monoklonalt antistoff 4D5 eller en variant derav, slik som et humanisert 4D5 som har antigenbindingsrester som murint monoklonalt antistoff 4D5. Eksempler på humaniserte 4D5-antistoffer inkluderer huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 og huMAb4D5-8 (HERCEPTIN) som i US patent nr. 5821337 med huMAb4D5-8 (HERCEPTIN) som det foretrukne humaniserte 4D5-antistoff.

Et "vekstinhibitorisk middel" når anvendt heri, henviser til en forbindelse eller preparat som hemmer veksten av en celle, spesielt en ErbB-uttrykkende kreftcelle enten in vitro eller in vivo. Det vekstinhibitoriske middelet kan derfor være et som signifikant reduserer prosenten av ErbB-uttrykkende celler i S-fase. Eksempler på vekstinhibitoriske midler inkluderer midler som blokkerer cellesyklusprogresjon (ved et tidspunkt andre enn S-fase), slik som midler som induserer Gl-stans og M-fasestans. Klassiske M-faseblok-kere inkluderer vinkas (vinkristin og vinblastin), teksaner og topo II-inhibitorer, slik som doksorubisin, epirubisin, daunorubisin, etopisid og bleomysin. Slike midler som bevirker Gl-stans går også over i S-fasestans, for eksempel DNA-alkylerende midler slik som tamoksifen, prednison, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorurasil og ara-C. Ytterligere informasjon kan finnes i The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn og Israel, red. kap. 1, tittel "Cell Cycle Regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" av Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), særlig s. 13.

Eksempler på "vekstinhibitoriske" antistoffer er de som binder til ErbB2 og hemmer veksten av kreftceller som overuttrykker ErbB2. Foretrukne vekstinhibitoriske anti-ErbB2-antistoffer hemmer veksten av SK-BR-3 brystkreftceller i cellekultur med mer enn 20%, og fortrinnsvis mer enn 50% (f.eks. fra omtrent til 50 til omtrent 100%) ved en antistoffkonsentrasjon på omtrent 0,5 til 30 ug/ml, hvor vekstinhiberingen bestemmes 6 dager etter eksponering av antistoffet for SK-BR-3-cellene (se US patent nr. 5677171 utstedt 14. oktober 1997). SK-BR-3-cellevekstinhiberende analyse er beskrevet i mer detalj i det patentet og nedenfor heri. Det foretrukne vekstinhibitoriske antistoffet er monoklonalt antistoff 4D5, f.eks. humanisert 4D5.

Et antistoff som "induserer celledød" er et som forårsaker at en levedyktig celle blir ikke-levedyktig. Cellen er vanligvis en som uttrykker ErbB2-reseptor, spesielt når cellen overuttrykker ErbB2-reseptoren. Fortrinnsvis er cellen en kreftcelle, f.eks. en bryst-, eggstokk-, mage-, endometrial-, spyttkjertel-, lunge-, nyre-, kolon-, tyroid-, bukspyttkjertel- eller blæreceller. In vitro kan cellen være en SK-BR-3-, BT474-, Calu 3-, MDA-MB-453-, MDA-MB-361- eller SKOV3-celle. Celledød in vitro kan bestemmes i fraværet av komplement og immuneffektorceller for å skille celledød indusert ved hjelp av antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). Celledødsanalysen kan derfor utføres ved anvendelse av varmeinaktivert serum (dvs. i fravær av komplement) og i fravær av immuneffektorceller. For å bestemme hvorvidt antistoffet er i stand til å indusere celledød, tap av membranintegritet som bestemt ved opptak av propidium jodid (PI), trypan blått (se Moore et al, Cytotech-nology, 17:1-11 (1995)) eller 7AAD kan vurderes relativt på ubehandlede celler. Foretrukne celledødsinduserende antistoffer er de som induserer PI-opptak i PI-opptaksanalysen i BT474-celler (se nedenfor).

Et antistoff som "induserer apoptose" er et som induserer programmert celledød som bestemt ved hjelp av binding av anneksin V, fragmentering av DNA, cellekrymping, utvidelse av endoplasmatisk retikulum, cellefragmentering og/eller dannelse av mem-branvesikler (kalt apoptotiske legemer). Cellen er vanligvis en som overuttrykker ErbB2-reseptoren. Fortrinnsvis er cellen en tumorcelle, f.eks. en bryst-, eggstokk-, mage-, endo-metrie-, spyttkjertel-, lunge-, nyre-, kolon-, tyroid-, bukspyttkjertel- eller nyrecelle. In vitro kan cellen være en SK-BR-3-, BT474-, Calu 3-, MDA-MB-453-, MDA-MB-361-eller SK0V3-celle. Ulike fremgangsmåter er tilgjengelig for vurdering av de cellulære hendelsene assosiert med apoptose. For eksempel kan fosfatidylserin (PS)-translokasjon måles ved hjelp av anneksin-binding; DNA-fragmentering kan vurderes gjennom DNA-"laddering"; og nukleær/kromatinkondensering sammen med DNA-fragmentering kan vurderes ved hjelp av en hvilken som helst økning i hypodiploide celler. Fortrinnsvis er antistoffet som induserer apoptose et som resulterer i omtrent 2 til 50 ganger, fortrinnsvis omtrent 5 til 50 ganger, og mest foretrukket omtrent 10 til 50 ganger induksjon av anneksinbinding i forhold til ubehandlede celler i et anneksinbindings analysesett ved anvendelse av BT474-celler (se nedenfor). Noen ganger vil det pro-apoptotiske antistoffet være et som videre blokkerer ErbB-ligandaktivering av en ErbB-reseptor (f.eks. 7F3-antistoff); dvs. antistoffet deler en biologisk egenskap med det monoklonale antistoffet 2C4.1 andre situasjoner er antistoffet et som ikke signifikant blokkerer ErbB-ligandaktivering av en ErbB-reseptor (f.eks. 7C2). Videre kan antistoffet være en som 7C2 som, mens det induserer apoptose, ikke induserer en større reduksjon i prosent celler i S-fase (f.eks. et som kun induserer omtrent 0-10% reduksjon i prosent av disse cellene i forhold til kontrollen).

"Epitope 2C4" er regionen i det ekstracellulære domene av ErbB2, hvortil antistoffet 2C4 binder. For å søke etter antistoffer som binder til 2C4-epitopen, kan et rutinemessig kryssblokkerings assay, slik som det beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988), anvendes. Alternativt kan epitopekartlegging (epitope mapping) utføres for å vurdere hvorvidt antistoffet binder til 2C4-epitopen av ErbB2 (f.eks. inklusiv en eller flere rester i regionen fra omtrent rest 22 til omtrent rest 584 i ErbB2; se figurene 1 A-B).

"Epitope 4D5" er regionen i det ekstracellulære domenet av ErbB2, hvortil antistoffet 4D5 (ATCC CRL 10463) binder. Denne epitopen er nær til det transmembrane domenet i ErbB2. For å analysere etter antistoffer som binder til 4D5-epitopen, kan en rutinemessig kryssblokkeringsanalyse, slik som den beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988), utføres. Alternativt kan epitopekartlegging (epitope mapping) utføres for å vurdere hvorvidt antistoffet binder til 4D5-epitopen i ErbB2 (f.eks. inklusiv en eller flere rester i regionen fra omtrent rest 529 til omtrent rest 625; se figurene 1 A-B).

"Epitope 3H4" er regionen i det ekstracellulære domenet av ErbB2, hvortil antistoffet 3H4 binder. Denne epitopen inkluderer restene fra omtrent 541 til og med omtrent 599 i aminosyresekvensen til det ekstracellulære domenet i ErbB2; se figurene 1A-B.

"Epitope 7C2/7F3" er regionen av den N-terminale ekstracellulære domenet i ErbB2, hvortil 7C2 og/eller 7F3-antistoffene binder (hvert deponert som ATCC, se nedenfor). For å søke etter antistoffer som binder til 7C2/7F3- epitopen, kan en rutinemessig kryssblokkeringsanalyse, slik som den beskrevet i Antibodies, A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988) utføres. Alternativt kan epitopekartlegging utføres for å etablere hvorvidt antistoffet binder til 7C2/7F3-epitopen på ErbB2 (f.eks. en eller flere rester i regionen fra omtrent 22 til og med omtrent rest 53 i ErbB2; se figur 1A-B).

"Behandling" henviser til både terapeutisk behandling og for profylaktiske og forebyggende formål. De som trenger behandling inkluderer de som allerede har sykdommen, så vel som de hvori sykdommen skal forhindres. Pattedyret som skal behandles heri kan derfor være diagnostisert for sykdommen eller kan være mottakelig eller dispon-ert for sykdommen.

"Pattedyr" for behandlingsformål henviser til et hvilket som helst dyr klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, husdyr og livdyr, og dyrehage-, sport- eller kjæle-dyr slik som hunder, hester, katter, kuer osv. Fortrinnsvis er pattedyret et menneske.

En "sykdom" er en hvilken som helst tilstand som vil ha fordel av behandling med anti-ErbB2-antistoffet. Dette inkluderer kroniske og akutte sykdommer eller tilstander inkludert i patologiske tilstander som gjør pattedyret mottagelig for den aktuelle sykdommen. Ikke-begrensende eksempler på sykdommer som kan behandles heri omfatter godartet og ondartede tumorer; leukemier og lymfoid maligniteter; neuron-, glia-, astrocytt-, hypotalmiske- og andre kjertelsykdommer, makrofag-, epitel-, stroma- og blastocoeliske sykdommer; og inflammatoriske, angiogene og immunologiske sykdommer.

Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" henviser til en mengde av et medikament som er effektiv for behandling av en sykdom eller en tilstand i et pattedyr. I tilfellet av kreft kan den terapeutiske effektive mengde av medikamenter redusere antallet kreftceller; redusere tumorstørrelsen; hemme (dvs. senke til en viss grad, eller fortrinnsvis stoppe) kreftcelleinfiltrering i perifere organer; hemme (dvs. senke til en viss grad og fortrinnsvis stoppe) tumormetastase; hemme til en viss grad tumorvekst; og/eller til en viss grad lindre en eller flere av symptomene assosisert med kreften. I den grad medikamentet kan forebygge vekst og/eller drepe eksisterende kreftceller, kan det være cyto-statisk og/eller cytotoksisk. For kreftterapi kan effekt f.eks. måles ved å vurdere sykdomsprogresjonstiden (TTP) og/eller bestemme responshastigheten (RR).

Uttrykkene "kreft" og "kreftaktig" henviser til, eller beskriver den fysiologiske tilstanden i pattedyr som typisk karakteriseres ved uregulert cellevekst. Eksempelet på kreft inkluderer, men er ikke begrenset til karsinom, lymfom, balstom, sarkom og leukemi eller lymfoide maligniteter. Nærmere bestemt inkluderer eksempler på slik kreft skjelettcellekreft (f.eks. epitelskjelettcellekreft), lungekreft inkludert småcellelungekreft, ikke-småcellelungekreft, adenokarsinom av lungen og skjelettkarsinom av lungen, peri-toneumkreft, heptaocellulær kreft, mage- eller tarmkreft inkludert gastrointestinal kreft, bukspyttkjertel kreft, glioblastom, halskreft, eggstokk-kreft, leverkreft, blærekreft, heptatom, brystkreft, kolonkreft, rektalkreft, kolorektalkreft, endometrialt karsinom eller uterint karsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, prostatakreft, vulvalkreft, tyroidkreft, heptatisk karsinom, anal karsinom, peniskreft så vel som hode- og nakkekreft.

En "ErbB-overuttrykkende kreft" er en som omfatter celler som har ErbB-protein til stede å deres celleoverflate. En "ErbB2-overuttrykkende kreft" er en som produserer tilstrekkelige nivåer av ErbB2 på overflaten av cellen derav, slik at et anti-ErbB2-antistoff kan binde dertil å ha en terapeutisk virkning med hensyn til kreften.

En kreft "karakterisert ved overdreven aktivering" av en ErbB-reseptor er en hvori graden av ErbB-reseptoraktivering i kreftceller signifikant overskrider nivåer av aktivering av den reseptoren i ikke-kreftceller av den samme vevstypen. Slik overdreven aktivering kan være et resultat av overuttrykking av ErbB-reseptoren og/eller større enn normale nivåer av en ErbB-ligand tilgjengelig for aktivering av ErbB-reseptoren i kreftcellene. Slik overdreven aktivering kan forårsake og/eller være forårsaket av den maligne tilstanden til en kreftcelle. I noen utførelsesformer vil kreftcellen utsettes for en diagnostisk- eller prognostisk analyse for å bestemme hvorvidt amplifikasjon og/eller overekspresjon av en ErbB-reseptor skjer og som resulterer i slik overdreven aktivering av ErbB-reseptoren. Alternativt eller i tillegg til kan kreften utsettes for en diagnostisk eller prognostisk analyse for å bestemme hvorvidt amplifikasjonen og/eller overekspresjonen av en ErbB-ligand skjer i kreften som medvirker til overdreven aktivering av reseptoren. I en del av slike krefttyper kan overdreven aktivering av reseptoren være et resultat av en autokrin stimmulerende reaksjonsvei.

I en "autokrin" stimulerende reaksjonsvei skjer selv-stimulering i kraft av at kreftcellen produserer både en ErbB-ligand og dets beslektede ErbB-reseptor. For eksempel kan kreften uttrykke eller overuttrykke EGFR og også uttrykke eller overuttrykke en EGFR-ligand (f.eks. EGF, TGF-a eller HB-EGF). I en annen utførelsesform kan kreften uttrykke eller overuttrykke ErbB2, og også uttrykke eller overuttrykke en heregulin (f.eks y-HRG).

En kreft som "overuttrykker" en ErbB-reseptor, er en som har signifikant høyere nivå av en ErbB-reseptor, slik som ErbB2 på celleoverflaten derav, sammenlignet med en ikke-kreftcelle av den samme vevstypen. Slik overekspresjon kan være forårsaket av genamplifikasjon eller ved økt transkripsjon eller translasjon. ErbB-reseptoroverekspresjon kan bestemmes i en diagnostisk eller prognostisk analyse ved evaluering av økte nivåer av ErbB-protein tilstede på overflaten av en celle (f.eks. via en immunohisto-kjemisk analyse; IHC). Alternativt, eller i tillegg til kan man måle nivåer av ErbB-kodende nukleinsyre i cellen, f.eks. via fluorescens in situ hybridisering (FISH; se WO 98/45479 publisert oktober 1998), "southern blotting" eller polymerasekjedereaksjon (PCR)-teknikker, slik som "real time"-kvantitativt PCR (RT-PCR). En kan også studere ErbB-reseptoroverekspresjon ved å måle skult antigen (f.eks. ErbB-ekstracellulært domene) i en biologisk væske slik som serum (se f.eks. US patent nr. 4933294 utstedt 12. juni 1990; WO 91/05264 publisert 18. april 1991; US patent 5401638 utstedt 28. mars, 1995; og Sias et al, J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Ved siden av de ovenfor angitte analyser er ulike in vzvø-analyser tilgjengelig for fagmannen på området. For eksempel kan man eksponere celler inne i pasientens kropp for et antistoff som eventuelt er merket med en detekterbar markør, f.eks. en radioaktiv isotop, hvoretter binding av antistoffet til celler i pasienten kan evalueres, f.eks. ved hjelp av ekstern skanning etter radioaktivitet eller ved hjelp av biopsianalyse tatt fra en pasient som nylig er blitt eksponert for antistoffet.

Omvent er en kreftcelle som "ikke er karakterisert ved overekspresjon av ErbB2-reseptoren" en som i en diagnostisk analyse ikke uttrykker høyere nivåer enn normalt av ErbB2-reseptoren sammenlignet med en kreftcelle av den samme vevstypen.

En reft som "overuttrykker" en ErbB-ligand er en som produserer signifikant høyere nivåer av den liganden sammenlignet med en ikke-kreftcelle av den samme vevstypen. Slik overekspresjon kan være forårsaket av genamplifikasjon eller ved hjelp av økt transkripsjon eller translasjon. Overekspresjon av ErbB-liganden kan bestemmes diagnostisk ved hjelp av evaluering av ligandnivåer (eller nukleinsyre kodende for denne) i pasienten, f.eks. i en tumorbiopsi eller ved hjelp av ulike diagnostiske analyser slik som IHC, FISH, "southern blotting", PCR eller in vzvø-analyser som beskrevet ovenfor.

En "hormonuavhengig" kreft er en hvis proliferering ikke avhenger av nærværet av et hormon som binder til en reseptor uttrykt av cellen i kreften. Slike krefttyper gjennomgår ikke klinisk regresjon ved administrering av farmakologiske eller kirurgiske strategier som reduserer hormonkonsentrasjonen i eller nær tumoren. Eksempler på hormonuavhengige krefttyper inkluderer androgen uavhengig prostatakreft, østrogen uavhengig brystkreft, endometrial kreft og eggstokk kreft. Slike krefttyper kan begynne som hormonavhengige tumorer og utvikle seg fra et hormonsensitivt stadie til en hormonmotstandsdyktig tumor etter anti-hormonell terapi.

Uttrykket "cytotoksisk middel" som anvendt heri henviser til en forbindelse som hemmer eller forebygger cellenes funksjon og/eller forårsaker ødeleggelse av celler. Uttrykket er ment å inkludere radioaktive isotoper (f.eks. At<21>1,1131,1<125>, Y9<0>, Re<186>, Re188, Sm153, Bi212, P<32> og radioaktive isotoper av Lu), kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som små toksinmolekyler eller enzymatisk aktive toksiner fra bakterier, sopp, planter eller animalsk opprinnelse, inkludert fragmenter og/eller varianter derav.

Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse anvendelig ved behandling av kreft. Eksempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer alkylerende midler slik som tiotepa og syklofosfamid (CYTOXAN); alkylsulfonater slik som busul-fan, improsulfan og piposulfan; aziridiner slik som benzodopa, karboquon, meturedopa og uredopa; etyleniminer og metylamelaminer inkludert altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylentiofosforamid og trietylolmelamin; nitrogenholdige senneps-forbindelser slik som klorambucil, klornafazin, klorfosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretaminoksidhydroklorid, melfalan, novembichin, fenesterin, predinimustin, trofosfamid, uracilsennepsforbindelser; nitrosurer slik som carmustin, klorzotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotika slik som aclacino-mysiner, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomyciner, cactinomycin, calcheamicin, carabicin, carrminomycin, carzinofilin, kromomyciner, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleusin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomyciner, mycofenolsyre, nogalamycin, olivomyciner, pelomycin, potfiromycin, puromycin, quelamyin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolitter slik som metotreksat og 5-fluoruracil (5-FU); folinsyreanaloger slik som denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinanaloger slik som fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanidin; pyrimidin-analoger slik som ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, cytarabin, dideoksyuridin, doksifluridin, enocitabin, foksuridin, 5-FU; androgener slik som calusteron, dromostan-olonpropionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenaler slik som aminoglutet-imid, mitotan, trilostan; folinsyrefornyer slik som frolinsyre; aceglaton; aldofosfamid-glykosid; aminolevulinsyre; amsarkrin; bestrabucil; bisantren; edatraaksat; defofamin; demedolcin; diaziquon; elfornitin; elliptinumacetat; etoglukid; galliumpirat; hydroksy-urea; lentinan; lonidamin; mtoguazon; mitokantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenarnet; pirarubicin; podophyllinsyre; 2-etylhydrazid; prokarbazin; PSK; razoksan; sizo-firan; spirogermanium; tenuazonsyre; triaziquon; 2, 2',2"-triklortrietylamin; uretan; vindesin; dekarbazin; mannomustin; mitobronito; mitolaktol; pipobroman; gacytosin; arabinosid ("Ara-C"); syklofosfamid; tiotepa; taksaner, f.eks. paclitazel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) og docetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); klorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; meotreksat; platinumanaloger slik som cisplatin og karboplatin; vinblastin; platinum; etoposid (VP-16); infosfamid; mitomycin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novatron; teniposid; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronat; CPT-11; topoiso-meraseinhibitor RFS 2000; difluormetylornitin (DMFO); retinsyre; seperamidiner; cape-citabin og farmasøytisk akseptable salter, syrer og derivater av hvilke som helst av de ovenfor nevnte midler. Også inkludert i denne definisjonen av antihormonelle midler som regulerer eller inhiberer hormonvirkningen på tumorer slik som anti-østrogener inkluder, for eksempel tamoksifen, raloksifen, aromastaseinhiberende 4(5)-imidazoler, 4-hydroksy-tamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston og toremifen (Fareston); og antiandrogener slik som flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid og goserelin; og farmasøytisk akseptable salter, syrer og derivater av hvilke som helst av de ovenfor nevnte midler.

Som anvendt heri, henviser uttrykker "EGFR-målrettet medikament" til et terapeutisk middel som binder til EGFR og eventuelt hemmer EGFR-aktivering. Eksempler på slike midler inkluderer antistoffer og små molekyler som binder til EGFR. Eksempler på antistoffer som binder til EGFR inkluderer (Mab 579 (ATCC CRL HB 8506), Mab 455 (ATCC CRL HB 8507), Mab 225 (ATCC CRL 8508), Mab 528 (ATCC CRL 8509) (se US patent nr. 4943533, Mendelsohn et al.) og varianter derav, slik som kimerisert 225 (C225) og omformet humant 225 (H225) (se WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); antistoffer som binder type II mutant EGFR (US patent nr. 5212290); humanisert og kimere antistoffer som binder EGFR som beskrevet i US patent nr. 5891996; og humane antistoffer som binder EGFR (se WO 98/50433, Abgenix). Anti-EGFR-antistoffet kan konjugeres med et cytotoksisk middel, og på den måten danne et immunokonjugat (se f.eks. EP 659439A2, Merck Patent GmbH). Eksempler på små molekyler som binder til EGFR inkluderer ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSI/ Pfizer) og AG1478.

Et "anti-angiogent middel" henviser til en forbindelse som blokkerer eller påvirker i en viss grad utviklingen av blodårer. Den anti-angiogene faktoren kan for eksempel være et lite molekyl eller antistoff som binder til en vekstfaktor eller vekstfaktor-reseptor involvert i aktiveringen av angiogenese. Den foretrukne antiangiogene faktoren heri er et antistoff som binder til vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF).

Uttrykket "cytokin" er et felles uttrykk for proteiner frigjort av en cellepopula-sjon som virker på andre celler som intracellulære mediatorer. Eksempler på slike cytokiner er lyfokiner, monokiner og tradisjonelle polypeptidhormoner. Omfattet blant cyto-kinene er veksthormoner slik som humant veksthormon, N-metionyl humant veksthormon og bovint veksthormon; paratyroid hormon; tyroksin; insulin; proinsulin; relak-sin; prorelaksin; glykoproteinhormoner slik follikelstimulerende hormon (FSH), tyroid-stimulerende hormon (TSH) og luteiniserende hormon (LH); hepatisk vekstfaktor; fibro-blastvekstfaktor; prolaktin; placenta laktogen; tumornekrosefaktor-ct og -(3; mulleria-inhiberende forbindelser; gonadotropinassosiert peptid fra mus; inhibin; aktivin; vaskulær endotel vekstfaktor; integrin; trombopoietin (TPO); nervevekstfaktorer slik som NGF-P, platelet vekstfaktor; transformerende vekstfaktor (TGFer) slik som TFG-ct og TGF-P; insulinlignende vekstfaktor-I og -II; erytropoietin (EPO); osteoinduserende faktorer; interferoner slik som interferon-oc, -P og -y; kolonistimulerende faktorer (DSFer) slik som makrofag-CSF (M-CSF); granulocytmakrofag-CSF (GM-CSF) og granulocyt-CSF (G-CSF); interleukiner (Iler) slik som IL-1, IL-lam IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, en tumornektrosefaktor slik som TNF-a eller TNF-P; og andre polypeptidfaktorer inkludert LIF og analysesett-ligander (KL). Som anvendt heri, inkluderer uttrykket cytokin proteiner fra naturlige kilder eller fra rekombinante cellekulturer og biologisk aktive ekvivalenter av de native cytokinsekvensene.

Uttrykket "forløpermedikament" som anvendt i denne patentsøknaden henviser til en forløper eller derivatform av en farmasøytisk aktiv forbindelse som er mindre cytotoksisk for tumorcellen sammenlignet med foreldremedikamentet og er i stand til å bli enzymatisk aktivert eller omdannet til den mer aktive foreldreformen. Se f.eks. Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, s. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) og Stella et al, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al, (red.), s. 247-267, Humana Press (1985). Forløpermedikamentene ifølge denne oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til fosfat-inneholdende forløpermedikamenter, tiofosfatinnehold-ende forløpermedikamenter, sulfat-inneholdende forløpermedikamenter, peptidinneholdende forløpermedikamenter, D-aminsyremodifiserte forløpermedikamenter, glykosylerte forløpermedikamenter, pMaktam-inneholdende forløpermedikamenter, eventuelt substit-uerte fenoksyacetmaid-inneholdende forløpermedikamenter er eventuelt substituert fenyl-acetamid-inneholdende forløpermedikamenter, 5-fluorcytosin og andre 5-fluoruridinfor-løpermedikamenter som kan omdannes til de mer aktive cytotoksiske frie medikamentene. Eksempler på cytotoksiske medikamenter som kan derivatiseres til en forløpermed-ikamentform for anvendelse i denne oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til de kjemoterapeutiske midlene som er beskrevet ovenfor.

Et "liposom" er en liten bærer bestående av ulike typer lipider, fosfolipider og/ eller overflateaktive midler som er anvendelig for avlevering av et medikament (slik som anti-ErbB2-antistoffer beskrevet heri, og eventuelt et kjemoterapeutisk middel) til et pattedyr. Liposomkomponentene er vanligvis arrangert på en 2-sjiktsform lignende lipidarrangementet av biologiske membraner.

Uttrykket "pakkeinnlegg" som anvendt heri, henviser til brukerinstruksjoner inkludert i en kommersiell pakning med terapeutiske produkter som inneholder innforma-sjon om indikasjonene, anvendelsen, dosen, administreringen, kontraindikasjoner og/eller advarsler angående anvendelsen av slike terapeutiske produkter.

Et "hjertebeskyttende middel" er en forbindelse eller et preparat som forebygger eller reduserer hjertemuskel dysfunksjoner (dvs. kardiomyopati og/eller kognitiv hjerte-feil) assosiert med administrering av et medikament slik som et antracyklinantibiotika og/ eller et anti-ErbB2-antistoff til en pasient. Det hjertebeskyttende middelet kan for eksempel blokkere eller redusere en fri radikalmediert kardiotoksisk virkning og/eller forebygge eller redusere skade fra oksidativt stress. Eksempler på hjertebeskyttende midler omfattet av den foreliggende definisjon inkluderer det jern-chelaterende middelet deksrazoksan (ICRF-187) (Seifert et al. The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072

(1994)); et lipidsenkende middel og/eller anti-oksidant slik som probucol (Singal et al, J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)); amofistin (aminotiol 2-[(3-aminopropyl)amin]-etantioldihyrogenfosfatester, også kalt WR-2721, og den defosforlyerte cellulære opp-taksformen derav kalt WR-1065) og S-3-(3-metylaminopropylamin)propylfosfotiosyre (WR-151327), se Green et al. Cancer Research 54:738-741 (1994); digoksin (Bristow, M.R. In: Bristow MR, ed, Drug-Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994); og Shaddy et al. Am. Heart J. 129:197-9 (1995)); vitamin E,; askorbinsyre (vitamin C); frie radikalrensere slik som oleanolsyre, ursolsyre og N-acetylcystein (NAC); "spin trapping"-forbindelser slik som alfa-fenyl-terlbutylnitron (PBN); (Paracchini et al. Anticancer Res. 13:1607-1612

(1993)); organiske selenforbindelser slik som P251 (Elbesen); og lignende.

Et "isolert" nukleinsyremolekyl er et nukleinsyremolkeyl som er identifisert og separert fra i det minste et kontaminerende nukleinsyremolekyl som det vanligvis er assosiert med i den naturlige kilden til antistoffnukleinsyren. Et isolert nukleinsyremolekyl er et annet enn i den form eller "setting" som det finnes i i naturen. Isolerte nukleinsyremolekyler derav skjelnes fra nukleinsyremolekylet slik som det eksisterer i naturlige celler. Et isolert nukleinsyremolekyl inkluderer imidlertid et nukleinsyremolekyl inneholdt i celler som vanligvis uttrykker antistoffet hvor for eksempel nukleinsyremolekylet er i en kromosomal lokalisert som er forskjellig fra den i naturlige celler.

"Ekspresjonskontrollsekvenser" henviser til DNA-sekvenser som er nødvendig for ekspresjon av en operabelt bundet kodende sekvens i en spesifikk vertsorganisme. Kontrollsekvensen som er egnet for prokaryoter inkluderer for eksempel en promoter, eventuelt en operator sekvens og et ribosom bindingssete. Eukaryote celler er kjent for å utnytte promotere, polyadenyleringssignaler og "enhancere".

Nukleinsyre er "operabelt bundet" når det er plassert inn i en funksjonell sam-menheng med andre nukleinsyresekvenser. DNA for en forløper eller sekresjonssignalsekvens er operabelt bundet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som et pre-protein som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller "enhancer" operabelt bundet til en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det fremmer translasjon. Vanligvis betyr "operabelt bundet" at DNA-sekvensen som er bundet er tilstøtende til, og i tilfellet av en sekresjonssignalsekvens, tilstøtende og i leseramme. "Enhancere" trenger imidlertid ikke å være tilstøtende. Binding utføres ved hjelp av ligering ved passende restriksjonsseter. Dersom slike seter ikke eksisterer anvendes syntetiske oligonukleotid adaptere eller linkere i henhold til konvensjonell teknikk.

Som anvendt heri, anvendes uttrykker "celle", "cellelinje" og "cellekultur" om hverandre, og alle slike uttrykk inkluderer etterkommere. På denne måten inkluderer ordene "transformanter" og "transformerte celler" de første cellene og kulturene utledet derfra uten hensyn til antallet overføringer. Det skal også forstås at alle etterkommere ikke trenger å være nøyaktig identiske i DNA-innhold, som følge av tilsiktede eller ikke-tilsiktede mutasjoner. Mutante etterkommere som har de samme funksjoner eller biologiske aktiviterer som vist for de orginalt transformerte cellene er inkludert. Når særskilte betegnelser er tilsiktet, vil disse være tydelige ut i fra sammenhengen.

II. Produksjon av anti-ErbB2-antistoffer

Herved følger en beskrivelse for å eksemplifisere teknikker for fremstilling av antistoffene anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelse. ErbB2-antigenet som anvendes for fremstilling av antistoffer kan for eksempel være en løselig form av det

ekstracellulære domenet av ErbB2 eller en del derav, inneholdende den ønskede epitope. Alternativt kan celler som uttrykker ErbB2 på deres celleoverflate (f.eks. NIH-3T3-celler transformert slik at de overuttrykker ErbB2; eller en karsinomcellelinje slik som SK-BR-3-celler, se Stancovski et al, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) anvendes for å danne antistoffer. Andre former av ErbB2, anvendelig for dannelse av antistoffer, vil være tydelig for fagmannen på området.

( i) Polyklonale antistoffer

Polyklonale antistoffer fremstilles fortrinnsvis i dyr ved hjelp av multiple sub-kutane (sc) eller intraperitonale (ip) injeksjoner av det relevante antigenet og en adjuvans. Det kan være anvendelig å konjugere det relevante antigenet til et protein som er immuo-gent i arten som immuniseres, for eksempel "keyhole limpet hemocyanin", serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønn trypsininhibitor ved anvendelse av et bifunk-sjonelt eller derivatiserende middel, for eksempel maleimidobenzoylsulfosuksinimidester (konjugering gjennom cysteinresiduer), N_hydroksysuksinimid (gjennom lysinresiduer), glutaraldehydr, ravsyreanhydrid, SOCl2 eller R<1>N=C=NR, hvor R og R<1> er forskjellige alkylgrupper.

Dyr immuniseres mot antigenet, immunogene konjugater eller derivater ved kombinering av for eksempel 100 ^g eller 5 [ig protein eller konjugat (for henholdsvis kaniner eller mus) med 3 volumer Freuds komplette adjuvans og løsningen injiseres intradermalt ved multiple seter. En måned senere gis dyrene 1/5 til 1/10 av den originale mengden peptid eller konjugat i Freuds komplette adjuvans ved hjelp av subkutan injeksjon ved multiple seter. 7 til 14 dager senere tappes blod fra dyrene og serum analyseres for antistofftiter. Dyr gis peptid inntil titerplatå nås. Fortrinnsvis gis dyret konjugatet av det samme antigenet, men konjugert til et annet protein og/eller gjennom et annet kryss-bindingsmiddel. Konjugatet kan også dannes i rekombinante cellekulturer som protein-fusjoner. Aggregeringsmidler slik som alum er også egnet for anvendelse for å øke immunresponsen.

( li) Monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer oppnås fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, dvs. de individuelle antistoffene omfattende populasjonen er identiske bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i mindre mengder. Endringsordet "monoklonal" indikerer derfor den egenskap at antistoffet ikke er en blanding av adskilte antistoffer.

For eksempel kan de monoklonale antistoffer fremstilles ved anvendelse av hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler et al. Nature, 256:495

(1975) eller de kan dannes ved hjelp av rekombinant DNA-teknikk (US patent nr. 4816567).

I hybridomfremgangsmåten immuniseres en mus eller andre passende vertsdyr som beskrevet heri ovenfor for å fremkalle lymfocytter som fremstiller eller er i stand til å fremstille antistoffer som spesifikt vil binde til proteinet anvendt for inmunisering. Alternativt kan lymfocytter immuniseres in vitro. Lymfocytter fuseres deretter med myolomceller ved anvendelse av egnede fusjonsmidler, slik som polyetylenglykol for å danne en hybridomcelle (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Hybridomcellene som er fremstilt på denne måten sås ut og dyrkes i et egnet kulturmedium som fortrinnsvis inneholder en eller flere forbindelser som hemmer veksten eller overlevelsen av de ikke-fuserte foreldrecellene. Dersom foreldremyelom-cellene mangler enzymet hypoksantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), vil for eksempel kulturmediet for hybridomene vanligvis inkludere hypoksantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium), hvis forbindelser forhinderer veksten av HGPRT-manglende celler.

Foretrukne myelomceller er de som fuserer effektivt, støtter stabil høynivåprod-uksjon av antistoff ved hjelp av selekterte antistoffproduserende celler og er sensitive for et medium slik som HAT-medium. Blant disse er foretrukne myelomcellelinjer murine myelomcellelinjer, slik som de utledet fra MOPC-21 og MPC-11 musetumorer tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA og SP-2 eller X63-Ag8-653-celler tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humane myelom-, og musehumane heteromyelomcellelinjer har også blitt beskrevet for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); og Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. New York, 1987)).

Kulturmediet som hybridomcellene dyrkes i analyseres for produksjon av monoklonale antistoffer rettet mot antigenet. Fortrinnsvis bestemmes bindingsspesifi-siteten til monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av hybridomceller ved hjelp av immunpresipitering eller ved hjelp av en in v/Yro-bindingsanalyse, slik som radioim-munoanalyse (RIA) eller enzymbundet immunoabsorberende analyse (ELISA).

Bindingsaffiniteten til det monoklonale antistoffet kan f.eks. bestemmes ved hjelp av "Scatchard-analysen" av Minson et al. Anal, Biochem, 107:220 (1980).

Etter at hybridomceller som fremstiller antistoffer med den ønskede spesifisitet, affinitet og/eller aktivitet er identifisert, kan klonene subklones ved hjelp av begrensende fortynningsfremgangsmåter og dyrkes ved hjelp av standard fremgangsmåter (Goding, Monoclonal Antibodies: Priciples and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)). Egnede kulturmedia for dette formålet inkluderer for eksempel D-MEM eller RPMI-1640 medium. I tillegg kan hybridomceller dyrkes in vivo som ascitestumorer i et dyr.

Det monoklonale antistoffet som utskilles av subklonen separeres fortrinnsvis fra kulturmediet, ascitesvæske eller serum ved hjelp av konvensjonelle antistoffrensefrem-gangsmåter slik som for eksempel protein A-Sefarose, hydroksylapatit-kromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

DNA kodende for det monoklonale antistoffet isoleres lett og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (for eksempel ved anvendelse av oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til genet kodende for den tunge og lette kjeden av murine antistoffer). Hybridomcellene tjener som en foretrukket kilde for slikt DNA. Når DNA er isolert kan det settes inn i ekspresjonsvektorer som deretter trasfekteres inn i vertceller slik som E. coli-celler, COS-celler fra ape, eggstokkceller fra kinesiske hamstere (CHO), eller myelomceller som ellers ikke fremstiller antistoffprotein for å oppnå syntese av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertcellene. Oversikts-artikler omhandlende rekombinant ekspresjon av DNA kodende for antistoffet i bakterier inkluderer Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) og Pluckthun, Immunol. Revs, 130:151-188 (1992).

I en ytterligere utførelsesform kan monoklonale antistoffer og antistoffragmenter isoleres fra antistoff fagbibliotek dannet ved anvendelse av teknikker beskrevet i McCafferty et al, nature, 348:552-554 (1990. Clackson et al. Nature, 32:624-628 (1991) og Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) beskriver isoleringen av henholdsvis murine og humane antistoffer ved anvendelse av fag-biblioteker. Senere publikasjoner beskriver fremstillingen av høyaffinitets (nM område) humane antistoffer ved hjelp av kjede "shuffling" (Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), så vel som kombinatorisk infeksjon og in v/vø-rekombinasjon som en strategi for konstatering av svært store fagbiblioteker (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res, 21:2265-2266 (1993)). Disse teknikkene der derfor mulige alternativer til tradisjonell monoklonal hybridomteknikker for isolering av monoklonale antistoffer.

DNA kan også modifiseres for eksempel ved å erstatte den kodende sekvensen for humane tungkjede- og lettkjede konstante domener med de homologe, murine sekvenser (US patent nr. 4816567; og Morrison et al, PNAS, USA, 81:6851 (1984)), eller ved kovalent binding til hele eller deler av den kodende sekvensen for et ikke-immunoglobulin polypeptid til den immunoglobulinkodende sekvensen.

Vanligvis erstattes slike ikke-immunoglobulin polypeptider det konstante domenet til et antistoff eller de erstatter de variable domener til et antigen kombinerende sete i et antistoff for å danne et kimært bivalent antistoff omfattende et antigenkomb-inerende sete med spesifisitet for et antigen og et annet antigen kombinerende sete med spesifisitet for et annet forskjellig antigen.

( iii) Humaniserte antistoffer

Fremgangsmåter for humanisering av ikke-humane antistoffer beskrives i den kjente teknikk. Fortrinnsvis har et humanisert antistoff en eller flere aminosyrerester som er introdusert inn i antistoffet fra en kilde som ikke er human. Disse ikke-humane amino-syrerestene henvises ofte til som "importerte" rester som vanligvis tas fra et importert variabelt domene. Humanisering kan utføres vesentlig ved å følge fremgangsmåten til Winter og medarbeidere (Jones et al. Nature , 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-327 (1988); Verhoyen et al. Science, 239:1534-1536 (1988)), ved å erstatte hypervariable regionsekvenser med den korresponderende sekvensen fra et humant antistoff. Slike "humaniserte" antistoffer er følgelig kimere antistoffer (US patent nr. 4816567) hvori vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt domene har blitt erstattet med den korresponderende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis er humaniserte antistoffer vanligvis humane antistoffer, hvori noen hypervariable regionrester, og muligens er noen FR-rester erstattet med rester fra analoge seter i gnageranti-stoffer.

Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som skal anvendes i dannelsen av humaniserte antistoffer er veldig viktig for å redusere antigenisitet. I henhold til såkalte "best-fit"-fremgangsmåten, skreenes sekvensen av det variable domenet til et gnager-antistoff mot det totale bibliotek av kjente human variable domenesekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest til gnager-sekvensen aksepteres deretter som den humane rammeverksregionen (FR) for det humaniserte antistoff (Sims et al, J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). En annen fremgangsmåte anvender en spesifikk rammeverksregion utledet fra konsensus sekvensen til alle humane antistoffer av en spesiell undergruppe av lette eller tunge kjeder. Den samme strukturen kan anvendes for flere forskjellige humaniserte antistoffer (Carter et al, PNAS, USA, 89:4285 (1992); Presta et al, J. Immunol, 151:2623 (1993)).

Det er videre viktig at antistoffene humaniseres med bibeholdelse av høy affinitet for antigenet og andre fordelaktige biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet i følge til en foretrukken fremgangsmåte, fremstilles humaniserte antistoffer ved hjelp av en analysefremgangsmåte av foreldresekvensen og ulike formede humaniserte produkter ved anvendelse av tre-dimensjonelle modeller av foreldre- og den humaniserte sekvensen. Tre-dimensjonelle immunoglobulinmodeller er ålment tilgjengelig og er kjente for fagmannen på området. Dataprogrammer er tilgjengelig som illustrerer og viser mulige tre-dimensjonelle konformasjonsstrukturer av valgte kandidat immunoglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse avbildningene tillater analyse av restenes sannsynlige rolle i fungeringen av kandidat immunoglobulinsekvense, dvs. analysen av restene som påvirker kandidat immunoglobulinenens evne til å binde dets antigen. På denne måten kan FR-rester velges og kombineres fra mottakeren og importsekvensen slik at de ønskede anti-stoffegenskaper, slik som økt affinitet for målantigenet/antigenene oppnås. Vanligvis er de hypervariable regionrestene direkte og mest vesentlig involvert i påvirkningen av antigenbinding.

Eksempel 3 nedenfor beskriver fremstilling av eksempler på humaniserte anti-ErbB2-antistoffer som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor. Det humaniserte antistoffet av spesiell interesse heri, blokkerer EGF, TGF-a og/eller HRG-mediert aktivering av MAPK vesentlig like effektivt som murint monoklonalt antistoff 2C4 (eller et Fab-fragment derav) og/eller binder ErbB2 vesentlig like effektivt som murint monoklonalt antistoff 2C4 (eller et Fab-fragment derav). Det humaniserte antistoffet heri kan for eksempel omfatte ikke-humane hypervariable regionrester inkorporert inn i et humant variabelt tungt domene, og kan videre omfatte en rammeverksregion (FR)-erstatning ved en posisjon valgt fra gruppen bestående av 69H, 71H og 73H ved å utnytte det variable domene nummereringssystemet angitt i Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunilogical Interest, 5. utg. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). I en utførelsesform omfatter det humaniserte antistoffet FR-substitusjoner ved to eller alle posisjonene 69H, 71H og 73H.

Et eksempel på humanisert antistoff av interesse heri omfatter de komplementaritetsbestemmende restene GFTGTDYTMX fra variabelt tungt domene, hvor X fortrinnsvis er D eller S (SEKV. ID. NR. 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEKV. ID. NR.: 8); og/eller NLGPSFYFDY (SEKV. ID. NR.: 9), eventuelt omfattende aminosyremodifikasjoner av disse CDR-restene, for eksempel hvor modifikasjonene vesentlig opprettholder eller forbedrer affiniteten til antistoffet. For eksempel kan antistoffvarianten av interesse ha fra omtrent 1 til omtrent 7 eller omtrent 5 aminosyresubstitusjoner i den ovenfor angitte variable tunge CDR-sekvensen. Slike antistoffvarianter kan fremstilles ved hjelp av affinitetsmodning, for eksempel som beskrevet nedenfor. De mest foretrukne humaniserte antistoffene omfatter den variable tung kjededomene aminosyresekvensen SEKV. ID NR: 4.

De humaniserte antistoffene kan omfatte komplentaritets bestemmende rester KASQDVSIGVA (SEKV. ID. NR.: 10); SASYX'X<2>X<3> fra variabelt lett domene, hvor X<1 >fortrinnsvis er R eller L, X<2> fortrinnsvis er Y eller E og X<3> fortrinnsvis er T eller S (SEKV. ID. NR.: 11); og/eller QQYYIYPYT (SEKV. ID. NR.: 12), for eksempel i tillegg til de variable tunge domenene-CDR-restene i det foregående avsnitt. Slike humaniserte antistoffer omfatter eventuelt aminosyremodifikasjoner av de ovenfor angitte CDR-restene, for eksempel hvor modifikasjonene vesentlig opprettholder eller forbedrer affiniteten til antistoffet. For eksempel kan antistoffvariaten av interesse ha fra omtrent 1 til omtrent 7, eller omtrent 5 aminosyresubstitusjoner i den ovenfor nevnte variable lelte-CDR-sekvensen. Slike antistoffvarianter kan fremstilles ved hjelp av affinitetsmodning, for eksempel som beskrevet nedenfor. Det mest foretrukne humaniserte antistoffet omfatter den variable lette domene aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR: 3.

Den foreliggende søknad omfatter også affinitetsmodnede antistoffer som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor. Foreldreantistoffet kan være et humant antistoff eller et humanisert antistoff, for eksempel et som omfatter henholdsvis den variable lette og/eller tunge sekvensen til SEKV. ID. NR: 3 og 4 (dvs. variant 574). Det affinitetsmodnede antistoffet binder fortrinnsvis til ErbB2-reseptor med en affinitet som overgår den til murin 2C4 eller variant 574 (for eksempel med fra omtrent 2 til omtrent 4 ganger, til omtrent 100 ganger eller omtrent 1000 ganger forbedret affinitet, for eksempel som analysert ved anvendelse av et ErbB2-ekstracellulært domene (ECD) ELISA). Eksempler på variable tunge CDR-rester for substitusjon inkluderer H28, H30, H34, H35; H64, H96, H99 eller kombinasjoner av 2 eller flere (for eksempel to, tre, fire, fem, seks eller syv av disse restene). Eksempler på variable lette CDR-rester for endring inkluderer L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 eller kombinasjoner av to eller flere (for eksempel to til tre, fire, fem eller opp til omtrent 10 av disse restene).

Ulike former av det humaniserte antistoffet eller affinitetsmodnede antistoffet er omfattet. For eksempel kan det humaniserte antistoffet eller affinitetsmodnede antistoffet være et antistoffragment, slik som et Fab som eventuelt er konjugert med en eller flere cytotoksiske midler for å danne et immunkonjugat. Alternativt kan det humaniserte antistoffet eller affinitetsmodnede antistoffet være et intakt antistoff slik som et intakt IgGl-antistoff.

( iv) Humane antistoffer

Som et alternativ til humanisering kan humane antistoffer fremstilles. For eksempel er det nå mulig å fremstille transgene dyr (for eksempel mus) som er i stand til ved immunisering å produsere et fult reportoar av humane antistoffer i fraværet av endogen immunoglobulinproduksjon. For eksempel er det blitt beskrevet at den homo-cygote fjerning av den antistoff tungkjede-linkerregionen (JH)-genet i kimere og kim-linjemutante mus resulterer i fullstendig inhibering av endogen antistoffproduksjon. Overføring av det humane kimlinje immunoglobulingenoppstillingen i slike kimlinje-mutante mus, vil resultere i fremstillingen av humane antistoffer ved antigen utfordring. Se for eksempel Jakobovits et al, PNAS, USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al. Year in Immuno, 7:33 (1993) og US patent nr. 5591669, 5589369 og 5545807.

Alternativt kan "fagdisplay"-teknologi (McCafferty et al. Nature 348:552-553

(1990)) anvendes for å fremstille humane antistoffer og antistoffragmenter in vitro fra immunoglobulinvariable (V) domene genreportoaret fra ikke-immunoserte donorer. I henhold til denne teknikken klones antistoff-V-domen genene i ramme med enten et større eller mindre kappe proteingen til en filament bakteriofag, slik som Ml3 eller fd og uttrykkes som funksjonelle antistoffragmenter på overflaten av fag-partikkelen. Fordi filamentpartikkelen inneholder en enkeltkjede-DNA-kopi av fag-genomet, resulterer seleksjon basert på de funksjonelle egenskapene til antistoffet også i seleksjon av genet kodende for antistoffet med disse egenskaper. Fagen etterligner på denne måten noen av egenskapene til B-cellen. Fagavbildning kan utføres i et mangfold formater; for deres oversikt se for eksempel Johnson, Kevin S og Chiswell, David J, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan anvendes for fagavbildning. Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) isolerte en mangfoldig samling antioksazolon antistoffer fra et lite tilfeldig kombinatorisk bibliotek av V-gener, utledet fra milten til immunoserte mus. Et repertoir av V-gener fra ikke-immuniserte humane donorer kan fremstilles og antistoffer til en mangfoldig samling av antigener (inkludert selv-antigener) kan isoleres vesentlig ved å følge teknikkene beskrevet av Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) eller Griffith et al, EMBO J. 12:725-734

(1993). Se også US patent nr. 5565332 og 55739005.

Som diskutert ovenfor kan humane antistoffer også dannes ved hjelp av in vitro-aktiverte B-celler (se US patent nr. 5567610 og 5229275).

Humane anti-ErbB2-antistoffer er beskrevet i US patent nr. 5772997 utstedt 30. juni 1998 og WO 97/00271 publisert 3. januar 1997.

( v) Antistoffragmenter

Ulike teknikker har blitt utviklet for fremstilling av antistoffragmenter. Tradisjonelt utledes disse fragmenter via proteolyttisk fordøying av intakte antistoffer (se f.eks. Morimoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117

(1992); og Brennan et al. Science, 229:81 (1985)). Disse fragmenter kan nå imidlertid fremstilles direkte ved hjelp av rekombinante vertceller. For eksempel kan antistoffragmenter isoleres fra antistoff-fag-biblioteker som diskutert ovenfor. Alternativt kan Fab'-SH-fragmenter gjenvinnes direkte fra E. coli og kjemisk kobles for å danne F(ab')2-fragmenter (Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). I henhold til andre tilnærminger kan F(ab')2-fragmenter isoleres direkte fra rekombinante vertcellekulturer. Andre teknikker for produksjon av antistoffragmenter vil være tydelig for fagmannen på området. I en annen utførelsesform er det valgte antistoffet et enkeltkjede Fv-fragment (scFv). Se WO 93/16185; US patent nr. 5571894; og US patent nr. 5587458. Antistof-fragmentet kan også være et "lineært antistoff, f.eks. som beskrevet i US patent nr. 5641870. Slike lineære antistoffragmenter kan være monospesifikke eller bispesifikke.

( vi) Bispesifikke antistoffer

Bispesifikke antistoffer er antistoffer som har bindingsspesifisiteter for i det minste 2 forskjellige epitoper. For eksempel kan bispesifikke antistoffer binde til to forskjellige epitoper av ErbB2-proteinet. Andre slike antistoffer kan kombinere et ErbB2-bindingssete med bindingsseter for EGFR, ErbB3 og/eller ErbB4. Alternativt kan en anti-ErbB2-arm kombineres med en arm som binder til et utløsende molekyl på en leukocytt slik som et T-cellereseptormolekyl (for eksempel CD2 eller CD3), eller Fc-reseptorer for IgG (FcyR), slik som FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) og FcyRIII (CD 16) for å fokusere cellulære forsvarsmekanismer mot den ErbB2-uttrykkende celle. De spesifikke antistoffer kan også anvendes for å lokalisere cytotoksiske midler til celler som uttrykker ErbB2. Disse antistoffene har en ErbB2-bindingsarm og en arm som binder det cytotoksiske middelet (f.eks. saporin, anti-interferon-a, vinka alkaloid, ricin A-kjede, metotreksat eller hapten med radioaktivt isotop). Bispesifikke antistoffer kan fremstilles som full-lengde antistoffer eller antistoffragmenter (f.eks. F(ab')2-bispesifikke antistoffer).

WO 96/16673 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti- FcyRIII-antistoff og US patent nr. 5837234 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti- FcyRI-antistoff. Et bispesifikt anti-ErbB2/Fca-antistoff er vist i WO 98/02463. US patent nr. 5821337 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-CD3-antistoff.

Fremgangsmåter for å lage bispesifikke antistoffer er kjent innenfor teknikkens stand. Tradisjonell produksjon av full-lengde bispesifikke antistoffer er basert på koeks-presjon av to immunoglobulin tungkjede- lettkjede-par, hvor de to kjedene har forskjellige spesifisteter (Millstein et al. Nature, 305:537-539 (1983)). Fordi det tilfeldige ut-valget av tunge og lette immunoglobulinkjeder gir disse hybridomer (kvadromer) en potensiell blanding av 10 forskjellige antistoffmolekyler, hvorav kun en har den korrekte bispesifikke struktur. Rensing av det korrekte molekylet, hvilket vanligvis utføres ved hjelp av affinitetskromatografitrinn er heller tungvint og produktutbytte er lavt. Lignende fremgangsmåter er beskrevet i WO 93/08829 og i Traunecker et al, EMBO J, 10:3655-3659(1991).

I henhold til en ulik tilnærming fuseres antistoffvariable domener med den ønskede bindingsspesifisitet (antistoff-antigen kombinerende seter) til immunoglobulin konstant domenesekvenser. Fusjonen er fortrinnsvis med et immunoglobulin tungt kjedekonstant domene omfattende i det minste en del av hengselen CH2- og CH3-regioner. Det er foretrukket å ha den første tung-kjedekonstantregionen (CH1) inneholdende sete som er nødvendig for lettkjedebinding tilstede i det minste i en av fusjonene. DNA kodende for immunoglobulin tungkjedefusjoner og, om ønskelig, immunoglobulin lett-kjeder settes inn i separate ekspresjonsvektorer og kotransfekteres inn i egnede vertceller. Dette tilveiebringer større fleksibilitet i justering av de gjensidige delene av de tre poly-peptidfragmentene i utførelsesformen når like forhold av de tre polypeptidkjedene anvendt i konstruksjonen tilveiebringer de optimale utbytter. Det er imidlertid mulig å sette inn den kodende sekvensen for to eller alle tre polypeptidkj edene i en ekspresjons-vektor når ekspresjonen av i det minste to polypeptidkj eder i likt forhold resulterer i høye utbytter, eller når forholdet ikke er spesielt signifikant.

I en foretrukket utførelsesform av denne tilnærmingen er de bispesifikke antistoffene sammensatt av en hybrid immunoglobulin tungkjede med en første bindingsspesifisitet i en arm og et hybrid immunoglobulin tungkjede-lettkjedepar (som tilveiebringer et andre bindingsspesifisitet) i den andre armen. Det ble funnet at denne asymetriske strukturen letter separeringen av den ønskede bispesifikke forbindelsen fra uønskede immunoglobulinkjedekombinasjoner da nærværet av en immunoglobulin lettkjede i kun halvdelen av det bispesifikke molekylet tilveiebringer en enkel separer-ingsmåte. Denne tilnærmingen er beskrevet i WO 94/04690. For ytterligere detaljer for dannelse av bispesifikke antistoffer se for eksempel Suresh et al, Methods in Enzym-ology, 121:210(1986).

I henhold til en annen tilnærming beskrevet i US patent nr. 5731168 kan mellomrommet mellom et par av antistoffmolekyler konstrueres for å maksimere prosenten av heterodimerer som gjenvinnes fra rekombinante cellekulturer. Det foretrukne mellomrommet omfatter i det minste en del av CH3-domenet til et antistoff konstantdomene. I denne fremgangsmåten erstattes en eller flere små aminosyre sidekjeder fra mellomrommet i det første antistoffmolekylet med større sidekjeder (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Kompensasjons "hulrom" med identisk eller lignende størrelse med de store sidekjedene dannes på den motstående siden av det andre antistoffmolekylet ved å erstatte store aminosyre sidekjeder med små aminosyre sidekjeder (for eksempel alanin eller treonin). Dette tilveiebringer en mekanisme for å øke utbyttet av heterodimerer ovenfor andre uønskede endeprodukter slik som homodimerer.

Bispesifikke antistoffer inkluderer kryss-bundne eller "heterokonjugerte" antistoffer. For eksempel kan et av antistoffene i heterokonjugatet kobles til avidin og det andre til biotin. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått og målrette immun-systemceller mot uønskede celler (US patent nr. 4676980) og for behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360, WO 92/200373 og EP 03089). Heterokonjugatantistoffer kan dannes ved anvendelse av hvilken som helst passende kryssbindings fremgangsmåter. Egnede krysbindingsmidler er velkjente innenfor teknikkens stand og er beskrevet i US patent nr. 4676980, sammen med et antall kryssbindingsteknikker.

Teknikker for å danne bispesifikke antistoffer fra antistoffragmenter har blitt beskrevet i litteraturen. For eksempel kan bispesifikke antistoffer fremstilles ved anvendelse av kjemisk binding. Brennan et al. Science, 229:81 (1985) beskriver en fremgangsmåte hvori intakte antistoffer splates proteolyttisk for å danne F(ab')2-fragmenter. Disse fragmentene reduseres i nærvær av ditiol-kompleksdannende middel natriumarsenit for å stabilisere vicinalditioler og forhindrer intramolekylær disulfid-dannelse. Fab'-fragmentene som fremstilles, omdannes deretter tionitrobenzoat (TNB)-derivater. Et av Fab'-TNB-derivatene omdannes deretter til Fab'-tiolet ved hjelp av reduksjon med merkaptoetylamin og blandes med like mengder av andre FabTNB-derivater for å danne de bispesifikke antistoff. De bispesifikke antistoffene som fremstilles kan anvendes som midler for selektiv immobilisering av enzymer.

Nylige fremskritt har lettet den direkte gjenvinningen av Fab'-SH-fragmenter fra E. coli som kan kobles kjemisk for å danne bispesifikke antistoffer. Shalaby et al, J. Exp. Med, 175:217-225 (1992) beskriver fremstillingen av et fullstendig humanisert bispesifikt antistoff F(ab')2-molekyl. Hvert Fab'-fragment ble separat utskilt fra E. coli og utsatt for direkte kjemisk kobling in vitro for å danne det bispesifikke antistoffet. Det bispesifikke antistoffet dannet på denne måten var i stand til å binde til celler som overuttrykte ErbB2-reseptoren og normale humane T-celler, så vel som å utlyse den lytiske aktiviteten til humane cytotoksiske lymfocytter mot humane bryst-tumormål.

Ulike teknikker for å danne og isolere bispesifikke antistoffragmenter direkte fra rekombinante cellekulturer har også blitt beskrevet. For eksempel har bispesifikke antistoffer blitt fremstilt ved anvendelse av "leucin-zippers". Kosteny et al, J. Immunol, 148 (5): 1547-1553 (1992)."Leucin-zipper"-peptider fra Fos- og Jun-proteiner ble bundet til Fab'-porsjonen av to forskjellige antistoffer ved hjelp av genfusjon. Antistoffhomodi-merene ble redusert ved hengselsregionen for å danne monomerer og deretter reoksidert for å danne antistoff heterodimerer. Denne fremgangsmåten kan også anvendes for fremstilling av antistoff homodimerer. "Diastoff-teknologien beskrevet av Hollinger et al, PNAS, USA, 90:6444-6448 (1993) tilveiebrakte en alternativ mekanisme for å danne bispesifikke antistoffragmenter. Fragmentene omfatter et tungt kjedevariabelt domene (VH), bundet til et lett kjedevariabelt domene (VL) ved hjelp av en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på den samme kjeden. Følgelig er VH- og VL-domenene til et fragment tvunget til å parre med de komplementære VL- og VH-domenene til et annet fragment, for derved å danne to antigenbindende seter. En annen strategi for å danne bispesifikke antistoffragmenter ved anvendelse av enkeltkjede Fv (sFv)-di-merer er også blitt rapportert. Se Gruber et al, J. Immunol. 152:5368 (1994).

Antistoffer med mer enn 2 valenser er omfattet. For eksempel kan trispesifikke antistoffer fremstilles. Tutt et al, J. Immunol. 147:60 (1991).

( vii) Andre aminosyresekvensmodifikasjoner

Aminosyresekvensmodifikasjoner av anti-ErbB2-antistoffer beskrevet heri er omfattet. For eksempel kan det være ønskelig å forbedre bindingsaffiniteten og/eller andre biologiske egenskaper til antistoffet. Aminosyresekvensvarianter av anti-ErbB2-antistoffet fremstilles ved hjelp av introduksjon av passende nukleotidforandringer i anti-ErbB2-antistoff nukleinsyren, eller ved hjelp av peptidsyntese. Slike modifikasjoner inkluderer for eksempel fjerning av og/eller innsetting av og/eller substitusjoner av rester inne i aminosyresekvensen til anti-ErbB2-antistoffet. En hvilken som helst kombinasjon av fjerning, innsetting og substitusjon gjøres for å oppnå det endelige konstruktet, forutsatt at det endelige konstruktet innehar de ønskede karakteristika. Aminosyreendringer kan også endre den post-translasjonelle prosesseringen av anti-ErbB2-antistoffet slik som endringer av antallet eller posisjonen av glykosyleringsseter.

En anvendelig fremgangsmåte for å identifisere enkelte rester eller regioner i anti-ErbB2-antistoffet som er foretrukne seter for mutagenese kalles "alaninskannings-mutagenese" som beskrevet av Cunningham og Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Her identifiseres en rest eller en gruppe målrester (f.eks. ladede rester slik som arg, asp, his, lys og glu) og erstattes av en nøytral eller negativ ladet aminosyre (mest foretrukket alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrer i ErbB2-antigenet. Disse aminosyreposisjonene som er funksjonelt sensitive for substitusjoner forbedres deretter ved å introdusere ytterligere eller andre varianter ved eller i stedet for substi-tusjons-setene. På denne måten trenger ikke mutasjonens natur per se å være forhåndsbestemt, selv om setet for introdusering av en aminosyresekvensvariasjon er forhåndsbestemt. For å analysere responsen på en mutasjon ved et gitt sete, kan for eksempel ala-skanning eller tilfeldig mutagenese utføres på målkodonet eller regionen, og de uttrykte anti-ErbB2-antistoffvarianten analyseres for den ønskede aktivitet.

Aminosyresekvensinnsetting inkluderer amino- og/eller karboksyl-endefusjoner som i lengde strekker seg fra en rest til polypeptider inneholdende 100 eller flere rester så vel som internt sekvensinnsetninger av enkle eller flere aminosyrerester. Eksempler på påhekting i enden inkluderer et anti-ErbB2-antistoff med en N-terminal metionylrest eller antistoffet fusert til et cytotoksisk polypeptid. Andre insettingsvarianter av anti-ErbB2-antistoffmolekylet inkluderer fusjon av den N- eller C-terminale enden av anti-ErbB2-antistoffet til et enzym (f.eks. ADEPT) eller et polypeptid som økerserumhalveringstiden til antistoffet.

En annen varianttype er en aminosyre substitusjonsvariant. Disse variantene har i det minste en aminosyrerest i anti-ErbB2-antistoffmolekylet som er erstattet med en annen rest. Det mest interessante setet for substitusjonsmutagenese inkluderer de hypervariable regioner, men FR-endringer er også omfattet. Konservative substitusjoner er vist i Tabell 1 under overskriften "Foretrukne substitusjoner". Dersom slike substitusjoner medfører en endring i biologisk aktivitet, kan deretter mer vesentlige endringer introduseres, angitt som "eksempel på substitusjoner" i Tabell 1, eller som ytterligere beskrevet nedenfor i referansen til aminosyreklasser, og produktene kan analyseres.

Vesentlige endringer i de biologiske egenskapene til antistoffet oppnås ved å velge substitusjoner som har vesentlig forskjellig virkning på opprettholdelsen av (a) polypeptidets ryggradstruktur i substitusjonsområdet, f.eks. som en plate eller helisk konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet ved målsetet, eller (c) sidekjedens volum.

Naturlig forekommende rester deles inn i grupper basert på kjente sidekjede-egenskaper: (1) hydrofobe: norleusin, met, ala, val, leu, ile; (2) nøytral hydrofil: cys, ser, thr; (3) sure: asp, glu; (4) basiske: asn, gin, his, lys, arg;

(5) rester som påvirker kjedeorientering: gly, pro; og

(6) aromatiske: trp, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil medføre bytting av et medlem av en av disse klassene med en annen klasse.

En hvilken som helst cysteinrest som ikke er involvert i opprettholdelsen av den riktige konformasjonen til anti-ErbB2-antistoffet kan også substitueres, vanligvis med serin for å forbedre molekylets oksidative stabilitet og forhindre uønsket kryssbinding. Omvent kan cysteinbindinger tilføres antistoffet for å forbedre dets stabilitet (spesielt når antistoffet er et antistoffragment slik som et Fv-fragment).

En spesielt foretrukket substitusjonsvarianttype invorlverer substituering av en eller flere hypervariable regionrester av et foreldreantistoff (f.eks. et humanisert eller humant antistoff). Vanligvis vil de resulterende varianter valgt for ytterligere utvikling ha forbedrede biologiske egenskaper i forhold til foreldreantistoffet, hvorfra det er dannet. En passende måte å danne slike substitusjonsvarianter involverer affinitetsmutasjon ved anvendelse av "fag-display". Kort fortalt muteres flere hypervariable regionseter (f.eks. 6-7 seter) for å danne alle mulige aminosubstitusjoner ved hvert sete. AntistoffVariantene som er dannet på denne måten presenteres på en monovalent måte fra filamentfagpar-tikler som fusjoner til gen III-produktet av Ml 3 pakket inn i hver partikkel. "Fag-display"-variantene analyseres deretter med hensyn til deres biologiske aktivitet (for eksempel bindingsaffinitet) som beskrevet heri. For å kunne identifisere hypervariable regionsetekandidater for modifikasjon, kan alanin-skanning utføres for å identifisere hypervariable regionrester som vesentlig bidrar til antigenbindingen. Alternativt eller i tillegg, kan det være fordelaktig å analysere en krystallstruktur av antigenantistoffkom-plekset for å identifisere kontaktpunkter mellom antistoffet og humant ErbB2. Slike kontaktrester og naborester er kandidater for substitusjon i henhold til teknikkene utarbeidet heri. Med en gang slike varianter er dannet, utsettes panelet av varianter for analysering som beskrevet heri og antistoffene med overlegne egenskaper i en eller flere relevante analyser kan velges for ytterligere utvikling.

En annen type aminosyrevariant av antistoffet endrer det orginale glykosylerings-mønsteret til antistoffet. Med endring menes fjerning av en eller flere karbohydratenheter som finnes i antistoffet og/eller å legge til en eller flere glykosyleringsseter som ikke er tilstede i antistoffet.

Antistoff glykosyolering er vanligvis enten N-bundet eller O-bundet. N-bundet henviser til bindingen av karbohydratenheten til sidekjeden av en asparaginrest. Tripep-tidsekvensen asparagin-X-serin og asparagin-X-threonin, hvor X er en hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjennelsessekvensen for enzymatisk binding av karbohydratenheten til asparaginsidekjeden. Nærværet av enhver av disse tripeptid-sekvensene i et polypeptid danner derfor et potensielt glykosyleringssete. O-bundet glykosylering henviser til bindingen av en av sukkerene N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, vanligvis serin eller threonin, selv om 5-hydroksy-prolin eller 5-hydroksylysin også kan anvendes.

Tilføring av glykosyleringsseter til antistoffet utføres vanligvis ved å endre aminosyresekvensen slik at den inneholder en eller flere av de ovenfor nevnte tripeptid-sekvenser (for N-bundet glykosyleringsseter). Endringen kan også utføres ved tilføring av eller substitusjon av en eller flere serin- eller threoninrester til den opprinnelige antistoff-sekvensen (for O-bundet glykosyleringsete).

Nukleinsyremolekyler kodende for aminosyresekvensvarianter av anti-ErbB2-antistoffet fremstilles ved hjelp av mangfoldige fremgangsmåter kjent innenfor teknikk-kens stand. Disse fremgangsmåtene inkluderer, men er ikke begrenset til isolering fra en naturlig kilde (i tilfellet av naturlig forekommende aminosyresekvensvarianter) eller fremstilling ved hjelp av oligonukleotidmediert (eller seterettet) mutagenese, PCR-mutagenese og kassett-mutagenese av en tidligere fremstilt variant, eller en ikke-variantversjon av anti-ErbB2-antistoffet.

Det kan være ønskelig å modifisere oppfinnelsens antistoff med hensyn til effektorfunksjon, for eksempel for å øke antistoffets antigenavhengig celle-medierte cytotoksisitet (ADCC) og/eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). Dette kan oppnås ved å introdusere en eller flere aminosyresubustitusjoner i en Fc-region av antistoffet. Alternativt eller i tillegg kan cysteinrester introduseres i Fc-regionen of å den måten å tillate interne disulfidbindingsdannelser i denne regionen. Homodimere antistoffer som er dannet på denne måten kan ha forbedrede internaliseringskapasitet og/eller økt komplementmediert celledreping og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Se Caron et al, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) og Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Homodimere antistoffer med økt anti-tumoraktivitet kan også fremstilles ved anvendelse av heterobifunksjonelle kryssbindinger som beskrevet i Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativt kan et antistoff konstrueres som har doble Fc-regioner og kan på denne måten ha økt komplementlysering og ADCC-kapasi-teter. Se Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

For å øke serumhalveringstiden til antistoffet kan man innkorporere en bergings-reseptorbindingsepitope i antistoffet (spesielt et antistoffragment) som for eksempel beskrevet i US patent 5739277. Som anvendt heri henviser uttrykket "bergningsreseptor-bindingsepitope" til en epitope av Fc-regionen til et IgG-molekyl (for eksempel IgGi, IgG2, IgG3 eller IgG4) som er ansvarlig for å øke in v/vø-serumhalveringstiden til IgG-molekylet.

( viii) Analysering av antistoffer med onskede egenskaper

Teknikker for å danne antistoffer har blitt beskrevet ovenfor. Man kan ytterligere velge antistoffer med visse ønskede biologiske egenskaper.

For å identifisere et antistoff som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor, kan antistoffets evne til å blokkere ErbB-ligandbinding til celler som uttrykker ErbB-reseptoren (for eksempel i konjugasjon med andre ErbB-reseptorer, hvormed ErbB-reseptoren av interesse danner en ErbB-hetero-oligomer) bestemmes. For eksempel kan celler som naturlig uttrykker eller er transfektert til å uttrykke ErbB-reseptorer av ErbB-hetero-oligomeren inkuberes med antistoffet og deretter eksponeres for merket ErbB-ligand. Anti-ErbB2-antistoffets evne til å blokkere ligandbinding til ErbB-reseptoren i ErbB-hetero-oligomeren kan deretter vurderes.

For eksempel kan inhibering av ERG-binding til MCF7-brystkreftcellelinjer ved hjelp av anti-ErbB2-antistoffer utføres ved anvendelse av monolag MCF7-kulturer på is i en 24-brønners plateformat, vesentlig som beskrevet i Eksempel 1 nedenfor. Anti-ErbB2-monoklonale antistoffer kan tilsettes til hver brønn og inkuberes i 30 minutter. <125>I-merket rHRG(31177.224 (25 pm) kan deretter tilsettes og inkuberingen kan fortsette i 4 til 16 timer. Doseresponskurver kan fremstilles og en IC5o-verdi kan beregnes for antistoffet av interesse. I en utførelsesform har antistoffet som blokkerer ligandaktivering av ErbB-reseptor en IC50 for hemming av HRG-binding til MCF7-celler i denne analysen på omtrent 50 nM eller mindre, mer foretrukket 10 nM eller mindre. Når antistoffet er et antistoffragment slik som et Fab-fragment, er IC50 for inhibering av HRG-binding til MCF7-celler i denne analysen, for eksempel omtrent 100 nM eller mindre, mer foretrukket 50 nM eller mindre.

Alternativt eller i tillegg kan anti-ErbB2-antistoffets evne til å blokkere ErbB-ligandstimulert tyrosinfosforylering av en ErbB-reseptor tilstede i en ErbB-heterooligo-mer bedømmes. For eksempel kan celler som endogent uttrykker ErbB-reseptorene eller er transfektert for å uttrykke dem, inkuberes med antistoffet og deretter vurderes for ErbB-ligandavhengig tyrosinfosforyleringsaktivitet ved anvendelse av et anti-fosfotyr-osinmonoklonalt antistoff (som eventuelt er konjugert med en detekterbar markør). Kinasereseptoraktiveringsanalysen beskrevet i US patent nr. 5766863 er også tilgjengelig for bestemming av ErbB-reseptoraktivering og blokkering av aktiviteten ved hjelp av et antistoff.

I en utførelsesform kan man søke etter et antistoff som inhiberer HRG-stimulering av pl80-tyrosinfosforylering i MCF7-celler vesentlig som beskrevet i Eksempel 1 nedenfor. For eksempel kan MCF7-celler såes ut i 24-brønners plater og monoklonale antistoffer mot ErbB2 kan tilsettes til hver brønn og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur; deretter kan rHRGpi 177.244 tilsettes til hver brønn til en endelig konsentrasjon på 0,2 nM, og inkuberingen kan fortsette i 8 minutter. Media kan trekkes ut fra hver brønn og reaksjonen kan stoppes ved tilsetting av 100 uJ SDS prøvebuffer (5% SDS, 25 med mer DTT og 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Elektroforese av hver prøve (25 ul) på en 4-12% gradientgel (Novex) kan utføres og deretter ved hjelp av elektroforese overføres til en polyvinyliden difluoridmembran. Antifosfotyrosin (ved 1 u.g/ml)-immunoblott kan utvikles og intensiteten av de dominerende reaktive bånd ved Mr -180.000 kan kvantifiseres ved hjelp av reflektans densitometri. Det valgte antistoffet vil fortrinnsvis signifikant inhibere HRG-stimulering av pl80 tyrosinfosforyleringen med omtrent 0-35% i forhold til denne analysens kontroll. En doseresponskurve for inhibering av HRG-stimulering av pl80 tyrosinfosforylering som bestemt ved hjelp av reflektant densitometri kan utarbeides og en IC50 for antistoffet av interesse kan beregnes. I en utførelsesform har antistoffet som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor en IC50 for hemming av HRG-stimulering av pl80 tyrosinfosforylering i denne analysen på omtrent 50 nM eller mindre, mer foretrukket 10 nM eller mindre. Når antistoffet er et antistoffragment slik som et Fab-fragment, kan IC50 for inhibering av HRG-stimulering av pl80-tyrosinfosforyleringen i denne analysen være for eksempel omtrent 100 nM eller mindre, mer foretrukket 50 nM eller mindre.

Man kan også vurdere vekstinhibitoriske virkninger av antistoffet på MDA-MB-175-celler, for eksempel vesentlig som beskrevet i Schaefer et al, Oncogene 15:1385-1394 (1997). I henhold til denne analysen kan MDA-MB-175-celler behandles med anti-ErbB2-monoklonalt antistoff (10 jig/ml) i 4 dager og farges med krystallfiolett. Inkubering med et anti-ErbB2-antistoff kan vise en vekstinhibitorisk virkning på denne cellelinjen på samme måte som den vist ved hjelp av monoklonalt antistoff 2C4.1 en ytterligere utførelsesform vil eksogent HRG ikke vesentlig reversere denne inhiberingen. Fortrinnsvis vil antistoffet være i stand til å hemme celleproliferering av MDA-MB-175-celler i en større grad enn monoklonalt antistoff 4D5 (og eventuelt til en større grad enn monoklonalt antistoff 7F3), begge i nærvær eller fravær av eksogent HRG.

I en utførelsesform kan anti-ErbB2-antistoff av interesse blokkere heregulinavhengig assosiasjon av ErbB2 med ErbB3 i både MCF7- og SK-BR-3-celler som bestemt i et ko-immunopresipiteringsforsøk slik som det beskrevet i Eksempel 2 vesentlig mer effektivt enn monoklonalt antistoff 4D5, og fortrinnsvis vesentlig mer effektivt enn monoklonalt antistoff 7F3.

For å identifisere vekstinhibitoriske anti-ErbB2-antistoffer kan man søke etter antistoffer som hemmer veksten av kreftceller som overuttrykker ErbB2.1 en utførelses-form er det valgte vekstinhibitoriske antistoffet i stand til å hemme veksten av SK-BR-3-celler i cellekultur med omtrent 20-100%, og fortrinnsvis med omtrent 50-100% ved en antistoffkonsentrasjon på omtrent 0,5 til 30 u.g/ml. For å identifisere slike antistoffer kan SK-BR-3-analysen beskrevet i US patent nr. 5677171 utføres. I henhold til denne analysen dyrkes SK-BR-3-celler i en 1:1 blanding av F12 og DMEM-medium supplementert med 10% fetalt bovint serum, glutamin og penicillin steptomycin. SK-BR-3-cellene såes ut ved 20.000 celler i en 35 mm cellekulturplate (2 ml/35 mm plate). 0,5 til 30 p.g/ml av anti-ErbB2-antistoffet tilsettes per plate. Etter 6 dager telles antallet celler sammenlignet med ubehandlede celler ved anvendelse av en elektronisk "COULTER"-celleteller. Disse antistoffene som hemmer veksten av SK-BR-3-cellene med omtrent 20-100% eller omtrent 50-100% kan velges som vekstinhibitoriske antistoffer.

For å velge antistoffer som induserer celledød, tap av membranintegritet som indikert ved hjelp av for eksempel PI, tryptanblått eller 7AAD-opptak, kan vurderes i forhold til kontroll. Den foretrukne analysen er PI-opptaksanalysen som anvender BT474-celler. I henhold til denne analysen dyrkes BT474-celler (som kan oppnås fra American Type Culture Collection (Rockville, MD)) i Dulbeccos Modifiserte Eagle-medium (D-MEM):Hams F-12 (50:50) supplementert med 10% varmeinaktivert FBS (Hyclone) og 2 mM L-glutamin. (Analysen utføres derfor i fravær av komplement og immuneffektorceller). BT474-cellene såes ut ved en tetthet på 3 x IO<6> per plate i 100 x 20 mm plater og tillates å festes over natt. Mediet fjernes deretter og erstattes med frisk medium alene eller medium inneholdende 10 [ig/ml av det passende monoklonale antistoffet. Cellene inkuberes i en 3 dagers tidsperiode. Etter hver behandling vaskes monolagene med PBS og løsnes ved hjelp av trypsinering. Cellene sentrifugeres deretter ved 12.000 rpm i 5 minutter ved 4°C, pelleten løses igjen i 3 ml iskald Ca<2+->bindingsbuffer (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) og fordeles i 35 mM fargelukket 12 x 75 rør (1 ml per rør, 3 rør per behandlingsgrupe) for å fjerne celleklumper. Rørene mottar deretter PI (10 |ig/ml). Prøvene kan analyseres ved anvendelse av et FACSCAN - "flowcytometer" og FACSCONVERT-CellQuest-programvare (Becton Dickinson). De antistoffene som induserer statistisk signifikante nivåer av celledød som bestemt ved hjelp av PI-opptak kan velges som celle-døds induserende antistoffer.

For å velge antistoffer som induserer apoptose er en anneksinbindingsanalyse som anvender BT474-celler tilgjengelig. BT474-cellene dyrkes og såes ut i plater som beskrevet i det foregående avsnittet. Mediet fjernes deretter og erstattes med friskt medium alene eller medium inneholdende 10 |!g/ml monoklonalt antistoff. Etter en 3-dagers inkuberingsperiode vaskes monolagene med PBS og løsnes ved hjelp av trypsinering. Cellene sentrifugeres deretter, løses i Ca<2+->bindingsbuffer og fordeles på rør som beskrevet ovenfor for celledøds-analysen. Rørene mottar deretter merket anneksin (for eksempel anneksin V-FTIC) (1 u,g/ml). Prøvene kan analyseres ved anvendelse av et "FACSCAN-flow"-cytometer og FACSONVERT-CellQuest-programvare (Becton Dickinson). De antistoffer som induserer statistisk signifikante nivåer av anneksinbinding i forhold til kontrollen, velges som apoptoseinduserende antistoffer.

I tillegg til anneksinbindingsanalysen er en DNA-fargingsanalyse som anvender BT474-celler tilgjengelig. For å utføre denne analylsen, inkuberes BT474-celler som har blitt behandlet med antistoffet av interesse som beskrevet i de foregående to avsnitt med 9 ug/ml HOECHST 33342 i 2 timer ved 37°C, analyseres deretter på en EPICS ELITE-flow-cytometer (Coulter Corporation) ved anvendelse av MODFITLT-programvare (Verity Software House). Antistoffer som induserer en endring i prosenten av apoptotiske celler som er to ganger eller større (fortrinnsvis 3 ganger eller større) enn ubehandlede celler (opp til 100% apoptotiske celler) kan velges som apoptoseinduserende antistoffer ved anvendelse av denne analysen.

For å søke etter antistoffer som binder til en epitope på ErbB2 bundet ved hjelp av et antistoff av interesse, kan en rutinekryssblokkeringsanalyse slik som beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow og David Lane (1988) utføres. Alternativt eller i tillegg kan epitopekartlegging utføres ved hjelp av kjente fremgangsmåter innenfor teknikkens stand (se for eksempel figurene IA og IB heri).

( ix) Immunokonjugater

Oppfinnelsen angår også immunokonjugater omfattende et antistoff konjugert til et cytotoksisk middel slik som et kjemoterapeutisk middel, toksin (for eksempel et lite toksinmolekyle eller et enzymatisk aktivt toksin fra bakteriell, sopp, plante eller dyreopp-rinnelse, inkludert fragmenter og/eller varianter derav), eller en radioaktiv isotop (dvs. et radiokonjugat).

Kjemoterapteutiske midler anvendelige ved dannelsen av slike immunokonjugater har blitt beskrevet ovenfor. Konjugater av et antistoff og et eller flere små toksinmolekyler, slik som et kalikjeamicin, et maytansin (US patent nr. 5208020), trikoten og CC 1065 er også omfattet heri.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er antistoffet konjugert til en eller flere maytansinmolekyler (for eksempel omtrent 1 til omtrent 10 maytansinmolekyler per antistoffmolekyl). Maytansin kan for eksempel bli omdannet til May-SS-Me som kan reduseres til May-SH3 og omsettes med modifisert antistoff (Chari et al. Cancer Resarch 52: 127-131 (1992)) for å danne et maytansinoid-antistoff immunokonjugat.

Andre immunokonjugater av interesse omfatter et anti-ErbB2-antistoff konjugert til en eller flere kalskjeamicinmolekyler. Kalskjeamicinfamilien av antibiotika er i stand til å danne dobbelttrådede DNA-brudd med under-pikomolare konsentrasjoner. Struktur-elle analoger av kalskjeamicin som kan anvendes inkluderer, men er ikke begrenset til Yi<1>, a2\ a3\ N-acetyl-y,<1>, PSAG og ø\ (Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342

(1993) og Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)). Se også US patent nr. 5714586; 5712374; 5264586 og 5773001 som uttrykkelig er inkorporert heri ved refer-anse.

Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav som kan anvendes inkluderer difteria A-kjede, ikke-bindeaktive fragmenter av difteriatoksin, ekotoksin-A-kjeden (fra Pseudomonas aeruginosa), ricin-A-kjeden, abrin-A-kjeden, modeccin A-kjeden, alfa-sarcin, Aleurites fordii- proteiner, diantinproteiner, Phytolaca americana- prottiner (PAP1, PAII og PAP-S), momordica charantia-inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalisin-hibitor, gelonin, metogelliin, restrictocin, fenomycin, enomycin og tricotecener. Se for eksempel WO 93/21232, publisert 28. oktober, 1993.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter videre et immunokonjugat dannet mellom et antistoff og en forbindelse med nukleolyttisk aktivitet (f.eks. en ribonuklease eller en DNA-endonuklease slik som en deoksyribonuklease; Dnase).

Mangfoldige radioaktive isotoper er tilgjengelig for fremstilling av radiokon-jugerte anti-ErbB2-antistoffer. Eksempler inkluderer At211,1131,1125, Y90, Re<186>, Re188, Sm1<53>, Bi<212>, P<32> og radioaktive isotoper av Lu.

Konjugater av antistoffet og det cytotoksiske middel kan dannes ved anvendelse av mangfoldige bifunksjonelle proteinkoblingsmidler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyri-dylditiol)-propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-sykloheksan-1 -karb-oksylat, iminotiolan (IT), bifunsjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipi-midat-HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutar-aldehyd), bis-azido-forbindelser (slik som bis-(p-azidobenzoyl)-heksandiamin), bisdia-zoniumderivater (slik som bis(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som tolyen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). For eksempel kan et ricinimmunotoksin fremstilles som beskrevet i Vitetta et al. Science 238:1098 (1987). Karbon- 14-merket l-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylentriaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på chelaterende middel for konjugering av radionukleotider til antistoffet. Se WO 94/11026. Linkeren kan være en "spaltbar linker" som letter frigivningen av det cytotoksiske medikamentet i cellen. For eksempel kan syrelabil linker, peptidasesensitiv linker, dimetyl linker eller disulfid-inneholdende linker anvendes (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

Alternativt kan et fusjonsprotein omfattende anti-ErbB2-antistoffet og det cytotoksiske middelet dannes for eksempel ved hjelp av rekombinante teknikker eller peptidsyntese.

I ytterligere en annen utførelsesform kan antistoffet konjugeres til en "reseptor"

(slik som streptavidin) for anvendelse i tumorutpeking hvori antistoff-reseplorkonjugatet administreres til pasienten etterfulgt av fjerning av ubundet konjugat fra sirkulasjonen ved anvendelse av et rensemiddel og deretter administrering av en "ligand" (for eksempel avidin) som konjugeres til et cytotoksisk middel (for eksempel et radionukleotid).

( x) Antistoffavhengig enzym- mediert forlopermedikament terapi ( ADEPT)

Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i ADEPT ved hjelp av konjugering av antistoffet til et forløpermedikament aktiverende enzym som omdanner et forløpermedikament (for eksempel et pepdityl kjemoterapeutisk middel, se WO 81/01145) til et aktivt antikreftmedikament. Se for eksempel WO 88/07378 og US patent nr. 4975278.

Enzymkomponenten i immunokonjugatet som er anvendelig for ADEPT inkluderer et hvilket som helst enzym i stand til å virke på et forløpermedikament på en slik måte at forløpermedikamentet omdannes til dets mer aktive cytotoksiske form.

Enzymer som er anvendelige i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til alkalinsk fosfatase anvendelig for omdanning av fosfatinneholdende forløpermedikamenter til frie medikamenter; arylsulfatase anvendelig for omdanning av sulfatinholdende forløpermedikamenter til frie medikamenter; cytosin deaminase anvendelig for omdanning av ikke-toksisk 5-fluorcytosin til antikreft-medikamentet 5-fluoruracil; proteaser slik som serratiaprotease, termolysin, subtilisn, karboksypeptidase og katepsiner (slik som katepsin B og L), som er anvendelig for omdanning av peptidinneholdende forløpermedikamenter til frie medikamenter; D-ala-nylkarboksypeptidaser anvendelig for omdanning av forløpermedikamenter som inneholder D-aminosyresubstituenter; karbohydratspaltende enzymer slik som (3-galaktosidase og neuroamidase anvendelig for omdanning av glykosylerte forløpermedikamenter til frie medikamenter; P-laktamase anvendelig for omdanning av medikamenter derivat-isert med P-laktamer til frie medikamenter; og penicillinamidaser slik som penicillin-V-amidase eller pencillin-G-amidase anvendelig for omdanning av medikamenter derivat-isert ved deres aminnitrogener med henholdsvis fenoksyacetyl- eller fenylacetylgrupper til frie medikamenter. Alternativt kan antistoffer med enzymatisk aktivitet også innen teknikkens stand som "abzymer", anvendes for å omdanne forløpermedikamenter ifølge den foreliggende oppfinnelse til frie aktive medikamenter (se for eksempel Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Antistoff-abzymkonjugater kan fremstilles som beskrevet heri for levering av abzymet til en tumorcellepopulasjon.

Enzymet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være kovalent bundet til anti-ErbB2-antistoffet ved hjelp av teknikker velkjent for fagmannen slik som anvendelse av heterobifuksjonelle kryssbindingsreagenser som diskutert ovenfor. Alternativt kan fusjonsproteiner inneholdende i det minste antigenbindingsregionen til et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse, bindes til i det minste en funksjonell aktiv del av et enzym ifølge den foreliggende oppfinnelse, konstrueres ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker velkjent for fagmannen på området (se for eksempel Nauberger et al, Nature, 312:604-608 (1984).

( xi) Andre anlistoffmodifikasjoner

Andre modifikasjoner av antistoffet er omfattet heri. For eksempel kan antistoffet være bundet til en av flere ikke-proteinaktige polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polypropylenglykol, polyoksyalkylener eller kopolymerer av polyetylenglykol og polypropylenglykol. Antistoffet kan også være innkapslet i mikrokapsler fremstilt for eksempel ved hjelp av opphopningsteknikker eller ved hjelp av kontaktflatepolymerisering (for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatin-mikrokapsler og poly-(metylmetacylat)-mikrokapsler), i kolloidal medikamentleveringssystemer (for eksempel liposomer, albu-minmikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utg. Oslo., A. Ed. (1980).

Anti-ErbB2-antistoffene beskrevet heri kan også formuleres som immunolipo-somer. Liposomer inneholdende antistoffene fremstilles ved hjelp av fremgangsmåter kjent for fagmannen på området slik som beskrevet i Epstein et al, PNAS, USA, 82:3688

(1985); Hwang et al, PNAS, USA, 77:4030 (1980); US patent nr. 4485045 og 4544545 og WO 97/38731 publisert 23. oktober 1997. Liposomer med økt sirkulasjonstid er beskrevet i US patent nr. 5013556.

Spesielt anvendelige liposomer kan dannes ved hjelp av reversfase fordamp-ningsmetoder med et lipidpreparat omfattende fosfatidylcholin, kolesterol og PEG-derivatiserte fosfatidyletaonlaminer (PEG-PE). Liposomer ekstruderes gjennom filteret med definert porestørrelse og gir liposomer med den ønskede diameter. Fab'-fragmenter av antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan konjugeres til liposomene som beskrevet i Martin et al, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) via en disulfidbindings-reaksjon. Et kjemoterapeutisk middel er eventuelt inneholdt i liposomer. Se Gabizon et al, J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989).

III. VEKTORER, VERTCELLER OG REKOMBINANTE FREMGANGSMÅTER

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte nukleinsyrer kodende for det humaniserte anti-ErbB2-antistoffet, vektorer og vertceller inneholdende nukleinsyren og rekombinante teknikker for fremstilling av antistoffet.

For rekombinant fremstilling av antistoffet isoleres nukleinsyren kodende for antistoffet og nukleinsyren settes inn i en replikasjons vektor for videre kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. DNA kodende for det monoklonale antistoffet isoleres lett og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (for eksempel ved anvendelse av oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til genene kodende for den tunge og lette kjeden av antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelig. Vektorkomponentene inkluderer vanligvis, men er ikke begrenset til en eller flere av de følgende: en signalsekvens, et replikasjons origo, en eller flere markørgener, et "enhancer"-element, en promoter og en transkripsjons stoppsekvens.

( i) Signalsekvenskomponent

Anti-ErbB2-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles rekombinant, ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid som fortrinnsvis er en signalsekvens eller andre polypeptider med et spesifikt spaltesete ved N-terminalen av det modne proteinet eller polypeptidet. Den valgte heterologe signalsekvensen er fortrinnsvis en som gjenkjennes og prosesseres (dvs. kuttes ved hjelp av en signalpeptidase) av vertcellen. For prokaryote vertceller som ikke gjenkjenner og prosesserer det native anti-ErbB2-antistoffsignalsekvensen erstattes signalsekvensen med en prokaryot signalsekvens valg for eksempel fra gruppen alkalinsk fosfatase, peni-cillinase, lpp, eller varmestabil enterotoksin II-signalsekvens. For sekresjon i gjær erstattes den native signalsekvensen med for eksempel signalsekvensen fra gjærinvertase, a-faktorsignalsekvensen (inkludert Saccharomyces og Kluyveromyces ct-faktorsignalsek-vens) eller sur fosfatase signalsekvens, C. Albicans glukoamylase signalsekvens, eller signalsekvensen beskrevet i WO 90/13646.1 pattedyr celleekspresjon er pattedyrsignal-sekvenser, så vel som virale sekresjonssekvenser, for eksempel herpes simpleks gD-signalsekvensen tilgjengelig.

DNAet for slike forløperregioner ligeres i leseramme med DNA kodende for anti-ErbB2-antistoffet.

( ii) Replikasjonsorigokomponent

Både ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder en nukleinsyresekvens som gjør vektoren i stand til å replikere i en eller flere valgte vertceller. I kloningsvektorer er vanligvis denne sekvensen en som gjør vektoren i stand til å replikere uavhengig av vertens kromosomale DNA og inkluderer replikasjonsorigo eller autonome replikasjons-sekvenser. Slike sekvenser er velkjente fra mangfoldige bakterier, gjær og virus. Replikasjonsorigo fra plasmidet pBR322 er egnet for de fleste Gram-negative bakterier, replika-sjonsorigoet fra 2Li-plasmidet er egnede i gjær og ulike virale replikasjonsorigo (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er anvendelig for kloningsvektorer i pattedyrceller. Replikasjonsorigo komponenten er vanligvis ikke nødvendig for ekspresjonsvektorer fra pattedyr (SV40s replikasjonsorigo kan typisk anvendes kun fordi det inneholder den tidlige promoter).

( Hi) Markorgenkomponent

Ekspresjons- og kloningsvektorer kan inneholde et markørgen, også angitt som en seleksjonsmarkør. Typiske markørgener koder for proteiner som (a) gir resistens mot antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampicillin, neomycin, methotrexat eller tetracyclin,

(b) komplementerer auxotrofe mangler, eller

(c) tilfører kritiske næringsstoffer som ikke er tilgjengelig fra komplekst medium, for eksempel genet kodende for D-alanin racemase fra Bacilli.

Et eksempel på et seleksjonsskjema utnytter et medikament for å stoppe veksten av en vertcelle. De cellene som er blitt transformert med et heterologt gen fremstiller et protein som gir medikamentresistens og som derfor overlever seleksjonsregimet. Eksempler på slik dominant seleksjon er anvendelsen av medikamentene neomycin, mykofenol-syre og hygromycin.

Andre eksempler på egnede seleksjonsmarkører for pattedyrceller er de som muliggjør identifiseringen av celler som kan ta opp anti-ErbB2-antistoffnukleinsyren, slik som DHFR, tymidinkinase, metallotionin-I og -II, fortrinnsvis primatmetallotioningener, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase osv.

Celler transformert med DHFR-seleksjonsgenet, identifiseres for eksempel først ved hjelp av å dyrke alle transformantene i et kulturmedium som inneholder metotreksat (Mtx), en kompetitiv antagonist av DHFR. En passende vertcelle, når vildtype-DHFR anvendes, er den kinesiske hamster eggstokkcellelinjen (CHO) som mangler DHFR-aktivitet.

Alternativt kan vertceller (spesielt vildtypeverter som inneholder endogent DHFR) transformeres eller kotransformeres med DNA-sekvenser kodende for anti-ErbB2-antistoff, vildtype DHFR-protein og andre seleksjonsmarkører slik som amino-glykosid-3'-fosfotransferase (APH) selekteres ved hjelp av cellevekst i medium inneholdende et seleksjonsmiddel for seleksjonsmarkøren slik som et aminoglykosid-antibiotika, for eksempel kanamycin, neomycin eller G418. Se US patent nr. 4965199.

Et egnet seleksjonsgen for anvendelse i gjær er trp I-genet tilstede i gjærplas-midet Yrp7 (Stinchcomb et al, Nature, 282:39 (1979)). Trp I-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Nærværet av trp 1-lesjonen i gjærvertcellens genom tilveiebringer deretter et effektivt miljø for å detektere transformasjon ved hjelp av vekst i fravær av tryptofan. På lignende måte komplementeres leu2-manglende gjærstammer (ATCC 20.622 eller 38.626) ved hjelp av kjente plasmider som bærer Leu2-genet.

I tillegg kan vektorer utledet fra det 1,6 u.m-sirkulære plasmidet pKDl anvendes for transformering av Kluyveromyces- gjær. Alternativt ble et ekspresjonssystem for stor-skalaproduksjon av rekombinant kalvekymosin beskrevet for K. Lactis. Van der Berg, Bio/Technology, 8:135 (1900). Stabile multikopi ekspresjonsvektorer for sekresjon av modent rekombinant humant serumalbumin ved hjelp av industristammer av Kluyveromyces har også blitt beskrevet. Fleer et al, Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

( iv) Promoter komponent

Ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promoter som gjenkjennes av vertsorganismen og er operabelt bundet til anti-ErbB2-antistoff nukleinsyren. Promotere egnede for anvendelse med prokaryote verter inkluderer phoA-promoteren, P-laktamase- og laktosepromotorsystemet, alkalinfosfatase, et tryptofan (trp)-promoter-system og hybridpromotere slik som tac-promoter. Andre kjente bakterielle promotere er imidlertid egnet. Promotere for anvendelse i bakterielle systemer kan også inneholde en Shine-Dalgarno (S.D.)-sekvens operabelt bundet til DNA kodende for anti-ErbB2-antistoffer.

Promotersekvenser er kjent for eukaryoter. Så å si alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert tilnærmet 25 til 30 baser oppstrøms for setet hvor transkripsjonen initieres. En annen sekvens funnet 70 til 80 basert oppstrøms for transkripsjons-start av mange gener er en CNCAAT-region hvor N kan være et hvilket som helst nukleotid. Ved 3'-enden av de fleste eukaryote gener, finnes en AATAAA-sekvens, som kan være signalet for påhekting av poly A-hale til 3'-enden av den kodende sekvensen. Alle disse sekvensene settes passende inn i eukaryote ekspresjonsvektorer.

Eksempler på egnede promotersekvenser for anvendelse i gjærverter inkluderer promotere for 3-fosfoglyseratkinase eller andre glykolyttiske enzymer, slik som enolase, glyseraldehyd -3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvat, dekarboksylase, fosfofruk-tokinase, glykose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase.

Andre gjærpromotere som er induserbare promotere med den ytterligere fordel at transkripsjonen kontrolleres ved hjelp av vekstbetingelser, er promoterregionene for alkoholdehydrogenase-2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer assosiert med nitrogenmetabolismen, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer ansvarlig for maltose- og galaktoseutnyttelse. Egnede vektorer og promotere for anvendelse i gjærekspresjon er videre beskrevet i EP 73657. Det er også fordelaktig å anvende gjær-"enhancere" med gjærpromotere.

Anti-ErbB2-antistofftranskripsjon fra vektorer i pattedyrvertceller kontrolleres for eksempel ved hjelp av promotere oppnådd fra virusgenomer slik som polyomavirus, hønse koppevirus, adenovirus (slik som Adenovirus 2), bovin papillomavirus, sarkoma-virus fra ape, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og mest foretrukket Simian virus 40 (SV40), fra heterologe pattedyrpromotere, for eksempel aktinpromoteren eller en immunoglobulinpromoter, fra varmesjokk promotere, forutsatt at slike promotere er kom-patible med vertcellesystemet.

De tidlige og sene promotere av SV40-viruset oppnås passende som et SV40-restriksjonsfragment som også inneholder SV40-viralt replikasjonsorigo. Den umiddel-bart tidligere promoter fra det humane cytomegalovirus oppnås passende som et Hindlll E-restriksjonsfragment. Et system for ekspresjon av DNA i pattedyrverter ved anvendelse av bovint papilloma virus som en vektor er beskrevet i US patent nr. 4419446. En modifi-sering av dette systemet er beskrevet i US patent nr. 4601978. SE også Reyes et al. Nature 297:598-601 (1982) om ekspresjon av humant P-interferon cDNA i museceller under kontroll av en tymidinkinasepromoter fra herpes simplex virus. Alternativt kan "rous sarvoma virus" lang-terminal gjentagelse anvendes som promoter.

( v) " Enhancer"- elementkomponent

Transkripsjon av en DNA kodende for anti-ErbB2-antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse ved hjelp av høyere eukaryoter, økes ofte ved hjelp av innsetting av "en enhancer"-sekvens i vektoren. Mange "enhancer"-sekvenser er nå kjent fra pattedyr-gener (globin, elastase, albumin, a-fetoprotein og insulin). Imidlertid vil man vanligvis anvende en "enhancer" fra en eukaryot celle-virus. Eksempler inkluderer SV40-"enhancer" på den sene siden av replikasjonsorigo (bp 100-270), cytomegalovirus tidlig "pro-moterenhancer", "polyomaenhanceren" på den sene siden av replikasjonsorigo og "adenovirusenhancere". Se også Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) omforsterkende elem-enter for aktivering av eukaryote promotere. "Enhanceren" kan spleises inn i vektoren ved en posisjon 5- eller 3' til anti-ErbB2-antistoff-kodende sekvens, men er fortrinnsvis lokalisert ved et sete 5' fra promoteren.

( vi) Transkripsjonsstoppkomponent

Ekspresjonsvektorer anvendt i eukaryote vertceller (gjær-, sopp-, insekt-, plante-, dyre-, humane eller nukleære celler fra andre multicellulære organismer) vil også inneholde sekvenser nødvendig for å stanse transkripsjonen og for å stabilisere mRNA. Slike sekvenser er vanligvis tilgjengelige fra 5'- og noen ganger 3'- utranslaterte regioner av eukaryote eller virale DNAer eller cDNAer. Disse regioner inneholder nukleotid-segmenter transkribert som polyadenyleringsfragmenter i den utranslaterte delen av mRNA kodende for anti-ErbB2-antistoff. En anvendelig transkripsjonsstoppkomponent er den bovine vekst hormon polyadenyleringsregionen. Se WO 94/11026 og ekspresjons-vektoren beskrevet deri.

( vii) Seleksjon og transformasjon av vertceller

Egnede vertceller for kloning og ekspresjon av DNA i vektorene heri er prokaryote, gjær eller høyere eukaryote celler beskrevet ovenfor. Egnede prokaryoter for dette formålet inkluderer eubakteria, slik som gram-negative eller gram-positive organismer, for eksempel Enterobakteriaceae slik som Escherichia, for eksempel E. coli, Entero-bacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella ryhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans og Shigella, så vel som Bacilli slik som B. subtilis og B licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41P beskrevet i DD 266710, publisert 12. april 1989). Pseudomonas slik som P. Aeruginosa og Streptomyces. En foretrukket E. cø/z'-kloningsvert erE. coli 294 (ATCC 31446), selv om andre stammer slik som E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537 og E. coli W3110 (ATCC 27325) er egnede. Disse eksempler er illustrerende heller enn begrensende.

I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober slik som trådformet sopp eller gjær egnede klonings- eller ekspresjonsverter for anti-ErbB2-antistoffkodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakegjær er vanligvis den mest anvendte blant lavere eukaryote verts mikroorganismer. Imidlertid er et antall andre slekter, arter og stammer vanligvis tilgjengelig og anvendelig heri, slik som Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-\ erter slik som f.eks. K. Lactis, K. Fragilis (ATCC 12424), K. Thermoto-lerans og K. Marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces slik som Schwanniomyces occidentalis; og trådformet sopp slik som f.eks. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium og Aspergillus- verter slik som A. nidulans og A. niger.

Egnede vertceller for ekspresjon av glykosylerte anti-ErbB2-antistoff utledes fra flercellede organismer. Eksempler på virvelløse celler inkluderer plante- og insektceller. Mange baculovirale stammer og varianter og tilsvarende valgfrie insekts vertceller fra verter slik som Spodoptera frugiperda (larve), Åedes eagypti (moskito), Aeedes albo-pictus (moskito), Krosophila melanogaster (fruktflue) og Bombyx mori har blitt identifisert. Mangfoldige virale stammer for transfeksjon er ålment tilgjengelig, f.eks. L-l-vari-anten av Autographa californica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV, og slike virus kan anvendes som viruset heri i henhold til den foreliggende oppfinnelse, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda- ceWer.

Plantecellekulturer av bomull, mais, potet, soyabønner, petunia, tomat og tobakk kan også anvendes som verter.

Interessen har imidlertid vært størst for virveldyrceller og utbredelse av verte-bratceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutineprosedyre. Eksempler på anvendelige pattedyr vertcellelinjer er apenyre cellelinjen CV1 transformert med SV40 (COS7, ATCC CRL 1651); human nyrecellelinje fra embryo (293 eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskultur, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); babyhamster nyreceller (BHK, ATCC CCL 10); eggstokkceller fra kinesiske hamstere/-DHFR (CHO, Urlaub et al, PNAS, USA, 77:4216 (1980)); sertoliceller fra mus &/TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); apenyreceller (DV1 ATCC CCL 70); nyreceller fra afrikansk grønn-ape (VERO-76, ATCC CRL 1587); humane halskarsinomceller (HELA, ATCC CCL 2); kanin nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); buffalorotte leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); brysttumorceller fra mus (MMT 060562, ATCC CL 51); TRI-celler (Mather et al. Annals N.Y. Acard. Sei. 383:44-68 (1982)); MRC 5-celler; FS4-celler og en human heptomlinje (Hep G2).

Vertceller transformeres med de ovenfor beskrevne ekspresjons- eller kloningsvektorer for anti-ErbB2-antistoff-fremstilling og dyrkes i konvensjonelle næringsmedier som hensiktsmessig er modifisert for indusering av promotere, selektering av transformanter eller amplifisering av genet kodende for den ønskede sekvensen.

( viii) Dyrking av vertcellene

Vertcellene som anvendes for å fremstille anti-ErbB2-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan dyrkes i mangfoldige medier. Kommersielt tilgjengelige medier slik som Hams F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) og Dulbeccos Modifiserte Eagels medium (DMEM, Sigma) er egnede for dyrking av vertcellene. I tillegg kan hvilken som helst av mediene beskrevet i Ham et al, Meth, Enz 58:44 (1979), Barnes et al. Anal. Biochem. 102:255 (1980); US patent nr. 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 eller 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195 eller US patent re. 30985 anvendes som dyrkningsmedium for vertcellene. Et hvilket som helst av disse mediene kan om nødvendig suppleres med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (slik som insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleo-tider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (slik som GENTAMYCIN-medikament), sporelementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis er tilstede i endelige mikromolare konsentrasjoner), og glukose eller en ekvivalent energikilde. Hvilke som helst andre nødvendige supplementer kan også være omfattet ved passende konsentrasjoner som er kjent for fagmannen på området. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH o.l. er de som tidligere er anvendt for vertcellen valgt for ekspresjon og vil være tydelig for fagmannen på området.

( ix) Rensing av anti- ErbB2- antistoff

Når det anvendes rekombinante teknikker kan antistoffet fremstilles intracellulært i det periplasmatiske rom eller direkte skilles ut i mediet. Dersom antistoffet fremstilles intracellulært, fjernes som et første trinn de spesifikke rester, enten vertceller eller lyserte fragmenter, f.eks. ved hjelp av sentrifugering eller ultrafiltrering. Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992) beskriver en fremgangsmåte for isolering av antistoffer som er utskilt i det periplasmatiske rom i E. coli. Kort fortalt løses cellepasta opp i nærværet av natriumacetat (pH 3,5), EDTA og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i løpet av 30 minutter. Celledebris kan fjernes ved hjelp av sentrifugering. Når antistoffet utskilles i mediet konsentreres vanligvis først supernatantene fra slike ekspresjonssystemer ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentreringsfilter, f.eks. et Amicon eller Millipore Pellicon utltrafiiteringsenhet. En proteaseinhibitor slik som PMSF kan være omfattet i hvilken som helst av de foregående trinnene for å hemme proteolyse og antibiotika kan være omfattet for å forhindre vekst av ufordelaktige kontaminanter.

Antistoffpreparatet fremstilt fra cellene kan renses ved anvendelse av f.eks. hydroksylapatit kromatografi, gelelektroforese, dialyse og affinitets kromatografi, hvor affinitets kromatografi er den mest foretrukne renseteknikken. I hvilken grad protein A er egnet som en affinitetsligand avhenger av arten og isotypen av ethvert immunoglobulin Fc-domene som er tilstede i antistoffet. Protein A kan anvendes for å rense antistoffer som er basert på humane y<1->, y<2-> eller y<4->tunge kjeder (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein G er anbefalt for alle museisotyper av humane y3 (Guss et al, EMBO J. 5:15671575 (1986)). Den matriksen som affinitetsliganden som oftest er bundet til er agarose, men andre matriksen er tilgjengelige. Mekanisk stabile matrikser slik som kontrollert poreglass eller poly(styrendivinyl)benzen tillater raskere gjennomstrømnings-hastigheter og kortere gjennomføringstid enn det som kan oppnås med agaraose. Når antistoffet omfatter et CH3-domene, er "Bakerbond ABX-resin" (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) anvendelig for rensing. Andre teknikker for proteinrensning slik som fraksjonering på en ionebyttekolonne, etanolutfelling, reversfase HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparin seffarose, kromatografi på en anion- eller kationbytte resin (slik som en polyaspartinsyrekolonne), kromatofoksuering, SDS-PAGE og ammoniumsulfatutfel-ling er også tilgjengelig avhengig av antistoffet som skal gjenvinnes.

Etter ethvert innledende rensetrinn, kan blandingen omfattende antistoffet av interesse og komtaminanter utsettes for lav pH-hydrofob interaksjonskromatografi ved anvendelse av en elueringsbuffer med en pH mellom 2,5-4,5, fortrinnsvis utført ved lave saltkonsetrasjoner (f.eks. fra omtrent 0-0,25M salt).

IV. FARMASØYTISKE PREPARATER

Terapeutiske preparater av antistoffene anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelse fremstilles for lagring ved hjelp av blanding av et antistoff med den ønskede renhetsgrad med eventuelle farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. utg, Osol, A. Ed. (1980)), i form av lyofiliserte preparater eller vanndige løsninger. Akseptable bærerere, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottageren ved doseringene og konsentrasjonene som anvendes, og inkluderer buffere slik som fosfat, citrat og andre organiske syrer; antioksi-danter inkludert askorbinsyre og metionin; konserveringsmidler (slik som oktadecyldi-metylbenzylammoniumklorid; heksametionumklorid; benzalkoniumklorid, benzetonium-klorid; fenol, butyl- eller benzylalkohol; alkylparabener slik som metyl- eller propylpara-ben; katekol; resorcinol; sykloheksanol; 3-pentanol og m-cresol); polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn omtrent 10 rester); proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer slik som glysin, glytamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin; monosakkarider, disak-karider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner; chelaterende midler slik som EDTA; sukkere slik som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol; salt-dannende motioner slik som natrium; metallkomplekser (f.eks. Zn-proteinkomplekser); og/eller ikke-ioniske overflateaktive midler slik som TWEEN, PLURONICS eller polyetylenglykol (PEG). Foretrukne lyofiliserte anti-ErbB2-antistoffprepater er beskrevet i WO 97/04801.

Preparatet heri kan også inneholde mer enn en aktiv forbindelse om nødvendig for den spesifikke indikasjonen som behandles, fortrinnsvis de med komplementære virkninger som ikke negativt motvirker hverandre. For eksempel kan det være ønskelig å videre tilveiebringe antistoffer som binder til EGFR, ErbB2 (f.eks. et antistoff som binder til ulike epitoper på ErbB2), ErbB3, ErbB4 eller vaskulær endotelial faktor (VEGF) i et preparat. Alternativt eller i tillegg kan preparatet videre omfatte et kjemoterapeutisk middel, cytotoksisk middel, cytokin, vekstihibitorisk middel, antihormonelt middel, EGFR-målrettet medikament, anti-angiogent middel og/eller et hjertebeskyttende middel. Slike molekyler er passende til stede i kombinasjoner i mengder som er effektive for det tiltenkte formål.

De aktive ingredienser kan også være innkapslet i mikrokapsler fremstilt f.eks. ved hjelp av opphopningsteknikker eller ved hjelp av grensesnitt polymerisering, f.eks. henholdsvis hydroksymetylcellulose eller gelatin-mikrokapsler og poly(metylmetacylat)-mikrokapsler, i koloidale medikamentleveringssystemer (f.eks. liposomer, albuminmikro-sfærer, mikroemulsjoner, nano-partikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington's Farmaceutical Sciences 16. utg, Osol, A. Ed.

(1980).

Preparater for forsinket frigjøring kan fremstilles. Egnede eksmpler på preparater for forsinket frigjøring omfatter semipermeable matrikser av faste hydrofobe polymerer inneholdende antistoffet hvor matriksen er i form av formede artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Eksempler på matrikser for forsinket frigjøring inkluderer polyestere, hydrogeler (f.eks. poly(2-hydroksyetyI-metakrylat), eller poly(vinylalkohol)), polylak-tider (US patent nr. 3773919), kopolymerer av L-glutaminsyre og y-etyl-L-glutamat, ikke-degraderbar etylenvinylacetat, degraderbar melkesyre-glykolsyrekopolymerer slik som LUPRON DEPOT (injiserbare mikrosfærer betående av melkesyreglykolsyreko-polymerer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hyroksybutyrsyre.

Preparatene som anvendes for in v/vø-administrering må være sterile. Dette oppnås lett ved hjelp av filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner.

V. BEHANDLING MED ANTI-ErbB2-ANTISTOFFER

Det skal forstås at ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anti-ErbB2-antistoffer anvendes for å behandle ulike sykdommer eller tilstander. Eksempler på tilstander eller sykdommer inkluderer godartet eller ondartede tumorer; leukemier og lymfoide maligniteter; andre sykdommer slik som nerve-, gliavev-, astrocyttvev-, hytotalmiske-, kjertel-, makrofag-, epitel-, stomavev-, blastocoelis-, inflammatoriske-, angiogene- og immunologiske sykdommer.

Vanligvis er sykdommen eller tilstanden som skal behandles kreft. Eksempel på krefttyper som behandles heri omfatter, men er ikke begrenset til karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi og lymfoide maligniteter. Nærmere bestemt inkluderer eksempler på slike krefttyper squamous cellekreft (f.eks. epitelsquamouscellekreft), lungekreft inkludert småcelle lungekreft, ikke-småcelle lungekreft, adenokarsinom av lungen og squamouskarsinom av lungen, kreft i bukhinnen, hepatocellulær kreft, gastrisk eller magekreft inkludert gastrointestinal kreft, bukspyttkjertelkreft, glioblastom, cervikalkreft, eggstokk-kreft, leverkreft, blærekreft, hepatom, brystkreft, tykktarmskraft, endetarmskreft, kolorektalkreft, endometrium- eller livmorkreft, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, prostatakreft, vulvakreft, tyroidkreft, hapatisk karsinom, analkarsinom, peniskarsinom så vel som hode- og nakkekreft.

Kreften vil vanligvis omfatte ErbB2-uttrykkende celler slik at anti-ErbB2-antistoffet heri er istand til å binde kreften. Mens kreften kan karakteriseres ved hjelp av overekspresjon av ErbB2-reseptoren, tilveiebringer den foreliggende søknad videre en fremgangsmåte for behandling av kreft som ikke er antatt å være en ErbB2-overuttrykkende kreft. For å bestemme ErbB2-ekspresjon i kreften, er ulike diagnostiske/prognost-iske analyser tilgjengelig. I en utførelsesform kan ErbB2-overekspresjon analyseres ved hjelp av IHC, f.eks. ved anvendelse av HERCEPTEST (Dako). Parfininnstøpt vevsdeler fra en tumorbiopsi kan utsettes for IHC-analysen og svarer til en ErbB2-proteinfargein-tensitetskriterie som følger:

0 poeng:

ingen farging observert eller membranfarging observert i mindre enn 10% av tumorcellene.

1+ poeng:

en svak/knapt merkbar membranfarging registreres i mer enn 10% av tormor-cellene. Cellene er kun farget i deler av membranen.

2 + poeng

en svak til moderat fullstendig membranfarging observeres i mer enn 10% av tumorcellene.

3 + poeng:

en moderat til sterk fullstendig membranfarging observeres i mer enn 10% av tumorcellene.

Tumorer med 0 til 1 + poeng for ErbB2-overekspresjonsbedømming kan sies å ikke overuttrykke ErbB2, mens de tumorer med 2+ eller 3+ poeng, kan sies å overuttrykke ErbB2.

Alternativt eller i tillegg til kan FISH-analyser slik som INFORM (solgt av Ven-tana, Arizona) eller PATHVISION (Vysis, Illinois) utføres på formalinfiksert, parafininn-støpt tumorvev for å bestemme graden (om noen) av ErbB2-overekspresjon i tumoren.

I en utførelsesform er kreften en som uttrykker (og kan overuttrykke) EGFR. Eksempler på kreft som kan uttrykke/overuttrykke EGFR omfatter squamous cellekreft (f.eks. epitelsquamous cellekreft), lungekreft inkludert småcelle lungekreft, ikke-småcelle lungekreft, adenokarsinom av lungen og squamouskarsinom av lungen, kreft i bukhinnen, hepatocellulær kreft, gastrisk eller magekreft inkludert gastrointestinal kreft, bukspyttkjertelkreft, glioblastom, cervikalkreft, eggstokk-kreft, leverkreft, blærekreft, hepatom, brystkreft, tykktarmskreft, endetarmskreft, kolorektalkreft, endometrium- eller livmorkreft, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, prostatakreft, vulvakreft, tyroidkreft, hepatisk karsinom, analkarsinom, peniskarsinom så vel som hode- og nakkekreft.

Kreften som skal behandles heri kan være en som er karakterisert ved overdreven aktivering av en ErbB-reseptor, f.eks. EGFR. Slik overdreven aktivering kan skyldes

overekspresjon eller økt produksjon av ErbB-reseptoren, eller en ErbB-ligand. I en utfør-elsesform av den foreliggende oppfinnelse vil en diagnostisk eller prognostisk analyse ut-føres for å bestemme hvorvidt pasientens kreft er karakterisert ved overdreven aktivering av en ErbB-reseptor. For eksempel kan ErbB-genamplifikasjon og/eller overekspresjon av en ErbB-reseptor i kreften bestemmes. Ulike analyser for å bestemme slik amplifisering /overekspresjon er tilgjengelig i teknikkens stand og inkluderer IHC, FISH og "shed-antigen"-analyse beskrevet ovenfor. Alternativt eller i tillegg kan nivåer av en ErbB-ligand, slik som TGF-a, i eller assosiert med tumoren bestemmes i henhold til kjente fremgangsmåter. Slike analyser kan påvise protein og/eller nukleinsyre kodende for proteinet i prøven som testes. I en utførelsesform kan ErbB-ligandnivåene i tumoren bestemmes ved anvendelse av immunohistokjemiske metoder (IHC); se f.eks. Scher et al, Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995). Alternativt eller i tillegg, kan man vurdere nivåer av ErbB-ligand-kodende nukleinsyre i prøven som analyseres; f.eks. via FISH, "southern blotting" eller PCR-teknikker.

Videre kan ErbB-reseptor- eller ErbB-ligandoverekspresjon eller - amplifikasjon vurderes ved anvendelse av in v/vø-diagnostiske analyser, f.eks. ved hjelp av administrering av et molekyl (slik som et antistoff), som binder til molekylet som skal påvises og merke dette med en detekterbar markør (f.eks. en radioaktiv isotop) og eksternt skanne pasienten for lokalisering av markøren.

Når kreften som skal behandles er homonuavhengig kreft, kan ekspresjon av hormonet (f.eks. androgen) og/eller dets tilhørende reseptor i tumoren vurderes ved anvendelse av en hvilken som helst av de mange analysene som er tilgjengelig, f.eks. som beskrevet ovenfor. Alternativt eller i tillegg kan pasienten være diagnostisert med en hormonuavhengig kreft, idet at de ikke lenger svarer på antiandrogen terapi.

I bestemte utførelsesformer administreres et immunokonjugat omfattende anti-ErbB2-antistoffet konjugert med et cytotoksisk middel til pasienten. Fortrinnsvis resulterer immunokonjugatet og/eller ErbB2-proteinet hvortil de er bundet/internalisert ved hjelp av cellen, og resulterer i at immunokonjugatets terapeutiske effekt ved dreping av kreftcellen som det binder til øker. I en foretrukket utførelsesform finner eller påvirker det cytotoksiske middelet nukleinsyren i kreftcellen. Eksempler på slike cytotoksiske midler inkluderer maytansinoider, kaliskjemisiner, ribonukleaser og DNA-endonukleaser.

Anti-ErbB2-antistoffene eller immunokonjugatene administreres til en human pasient i henhold til kjente fremgangsmåter, slik som intravenøs administrering, for eksempel som en stor dose eller ved kontinuerlig innføring over et tidsrom, ved hjelp av intramuskulær, intraperitoneal, intracerebrospinal, subkutan, intraartikulær, intrasynovial, intratekal, oral, topisk eller inhaleringsruter. Intravenøs eller subkutan administrering av antistoffet er foretrukket.

Andre terapeutiske regimer kan kombineres med administreringen av anti-ErbB2-antistoffet. Den kombinerte administreringen omfatter koadministrering ved anvendelse av separate preparater eller et enkelt farmasøytisk preparat, og etterfølgende administrering i hvilken som helst rekkefølge, hvori det fortrinnsvis er et tidsrom hvor begge (eller alle) aktive midler utøver deres biologiske virkning samtidig.

I en foretrukket utførelsesform behandles pasienten med to ulike anti-ErbB2-antistoffer. For eksempel kan pasienten behandles med et første anti-ErbB2-antistoff som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor eller et antistoff med en biologisk egenskap tilsvarende monoklonanlt antistoff 2C4 så vel som et andre anti-ErbB2-antistoff som er vekstinhibitorisk (HERCEPTIN) eller et anti-ErbB2-antistoff som induserer apoptose av en ErbB2-overuttrykkende celle (f.eks. 7C2, 7F3 eller humaniserte varianter derav). Fortrinnsvis resulterer en slik kombinert terapi i en synergistisk terapeutisk virkning. Man kan for eksempel behandle pasienten med HERCEPTIN og deretter behandle med rhuMAb2C4, f.eks. når pasienten ikke reagerer på HERCEPTIN-terapi. I en annen utfør-elsesform kan pasienten først behandles med rhuMAb2C4, og deretter motta HERCEP-TINterapi. I ytterligere en annen utførelsesform kan pasienten behandles med både rhuMAb2C4 og HERCEPTIN samtidig.

Det kan også være ønskelig å kombinere administreringen av anti-ErbB2-antistoffet eller antistoffene med administrering av et antistoff rettet mot et annet tumorassosiert antigen. I dette tilfellet kan det andre antistoffet for eksempel binde til EGFR, ErbB3, ErbB4 eller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF).

I en utførelsesform involverer behandlingen ifølge den foreliggende oppfinnelse den kombinerte administreringen av et anti-ErbB2-antistoff (eller antistoffer) og en eller flere kjemoterapeutiske midler eller vekstinhibitoriske midler inkludert koadministrering av coctailer av forskjellige kjemoterapeutiske midler. Foretrukne kjemoterapeutiske midler omfatter teksaner (slik som paklitaksel og dekotaksel) og/eller antracyklinantibiotika. Preparater og doseringsskjemaer for slike kjemoterapeutiske midler kan anvendes i henhold til fabrikantens instruksjoner eller som bestemt empirisk ved hjelp av en lege. Preparater og doseringsskjemaer for slik kjemoterapi er også beskrevet i Chemotherapy Service Ed, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Antistoffet kan kombineres med en anti-hormonforbindelse; f.eks. en antiøstro-genforbindelse slik som tamoksifen; et antiprogesteron slik som onapriston (se EP 616812); eller et anti-androgen slik som flutamid, i doseringer kjent for slike molekyler. Når kreften som skal behandles er hormonuavhengig kreft kan pasienten tidligere ha blitt utsatt for antihormonell terapi, og etter at kreften har blitt hormonuavhengig, kan anti-ErbB2-antistoffet (og eventuelt andre midler som beskrevet heri) administreres til pasienten.

Noen ganger kan der være fordelaktig å også samtidig administrere et hjertebeskyttende middel (for å forhindre eller redusere myokardiell dysfunksjon assosiert med terapien) eller en eller flere cytokiner til pasienten. Man kan også samtidig administrere et EGFR-målrettet medikament eller et anti-angiogent middel. I tillegg til de ovenfor nevnte terapeutiske regimer, kan pasienten utsettes for kirurgisk fjerning av kreftcellene og/eller stråleterapi.

Ant-ErbB2-antistoffene heri kan også kombineres med et EGFR-målrettet medikament slik som de beskrevet ovenfor i definisjonsavsnittet, hvilket resulterer i en komplementær og muligens synergistisk terapeutisk virkning.

Egnede doseringer for enhver av de ovenfor nevnte koadministrerte midlene er de som for tiden anvendes og kan være lavere som følge av kombinert virkning (synergi) av middelet og anti-ErbB2-antistoffet.

For å forhindre eller behandle sykdom vil en passende dose antistoff avhenge av den type sykdom som skal behandles, som definert ovenfor, alvorlighetsgraden og syk-domsforløpet, uavhengig av om antistoffet administreres for prevantive eller terapeutiske formål, tidligere terapi, pasientens kliniske historie og responsen på antistoffet og legens skjønn. Antistoffet administreres passende til pasienten en gang eller i løpet av en serie med behandlinger. Avhengig av typen og alvorlighetsgraden av sykdommen er en innledende kandidatdosering av antistoffet for administrering til pasienten omtrent 1 Hg/kg til 15 mg/kg (f.eks. 0,1-20 mg/kg) uavhengig av om administreringen skjer for eksempel ved en eller flere separate administreringer eller ved en kontinuerlig tilførsel. En typisk daglig dosering kan være i området fra omtrent 1 u.g/kg til 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene nevnt ovenfor. For repeterende administreringer over flere dager eller lenger, avhengig av tilstanden, fortsetter behandlingen inntil en ønsket under-trykking av sykdomssymptomene oppnås. Den foretrukne dosering av antistoffet vil være i området fra omtrent 0,05 mg/kg til omtrent 10 mg/kg. På denne måten kan en eller flere doser av omtrent 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg eller 10 mg/kg (eller en kombinasjon derav) administreres til pasienten. Slike doser kan administreres periodisk, f.eks. hver uke eller hver tredje uke (f.eks. slik at pasienten mottar fra omtrent 2 til omtrent 20, f.eks. omtrent 6 doser av anti-ErbB2-antistoffet). En innledende høyere dose, fulgt av en eller flere lavere doser kan administreres. Et eksempel på doseringsregime omfatter administrering av en innledende dose på omtrent 4 mg/kg, fulgt av en ukentlig opprettholdelses-dose på omtrent 2 mg/kg av anti-ErbB2-antistoffet. Imidlertid kan andre doseringsreg-imer være anvendelige. Utviklingen av denne terapien monitoreres lett ved konvensjonelle teknikker og analyser.

Ved siden av å omfatte administrering av antistoff-proteinet til pasienten, omfatter den foreliggende søknad administrering av antistoffer ved hjelp av genterapi. Slik administrering av nukleinsyrer kodende for antistoffet omfatter uttrykket "administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff. Se f.eks. WO 96/07321 publisert 14. mars 1996 vedrørende anvendelse av genterapi for å danne intracellulære antistoffer.

Det er to viktige tilnærminger for å få nukleinsyrer (eventuelt innhold i en vektor) inn i pasientens celler; in vivo og ex vivo. For in vivo-levering injiseres nukleinsyren direkte i pasienten vanligvis ved et sete hvor antistoffet kreves. For ex vivo-behandling, fjernes pasientens celler og nukleinsyren introduseres inn i de isolerte cellene og de modifiserte cellene administreres til pasienten, enten direkte eller f.eks. innkapslet i poremembraner som implanteres inn i pasienten (se f.eks. US patent nr. 4892538 og 5283187). Det finnes mangfoldige teknikker tilgjengelige for å introdusere nukleinsyrer inn i levende celler. Teknikkene varierer avhengig av hvorvidt nukleinsyren overføres i dyrkede celler in vitro eller in vivo i celler i den tiltenkte verten. Teknikker egnet for overføring av nukleinsyrer inn i mammalske celler in vitro inkluderer anvendelse av liposomer, elektroporering, mikroinjeksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfat utfellingsmetoden osv. En vanlig anvendt vektor for ex vivo-levering av genet er et retrovirus.

Den for tiden foretrukne in vivo-nuklinsyreoverføringsteknikken omfatter transfeksjon med virale vektorer (slik som adenovirus, Herpes simplex I virus eller adenoassosierte virus) og lipidbaserte systemer (anvendelige lipider for lipidmediert overføring av genet er f.eks. DOTMA, DOPE og DC-Chol). I enkelte situasjoner er det ønskelig å tilveiebringe nukleinsyrekilden med et middel som treffer målcellene, slik som et antistoff spesifikt for et celleoverflatemembranprotein eller treffer cellen, en ligand for en reseptor på målcellen osv. Når liposomer anvendes kan proteiner som binder til et celleoverflatemembranprotein assosiert med endocytose anvendes for å treffe og/eller lette opptaket, f.eks. kapsidprotein eller fragmenter derav, trofisk for en spesiell celle-type, antistoffer for proteiner som gjennomgår internalisering i syklus og proteiner som fester seg til intracellulær lokalisering og øker intracellulær halveringstid. Teknikker for reseptormediert endocytose er beskrevet for eksempel av Wu et al, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); og Wagner et al, PNAS, USA 87:3410-3414 (1990). For en oversikt av de for tiden kjente genmarkeringer og genterapiprotokoller, se Anderson et al. Science 256:808-813 (1992). Se også WO 93/25673 og referansene sitert heri.

VI. INDUSTRIELT PRODUKT

I en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et industrielt produkt inneholdende materialer anvendelig for behandling av sykdommene beskrevet ovenfor. Industriproduktet omfatter en beholder og et pakkeinnlegg på eller assosiert med beholderen. Egnede beholdere inkluderer f.eks. flasker, rør, sprøyter osv. Beholderne kan dannes av mangfoldig materialer slik som glass eller plastikk. Beholderne inneholder et preparat som er effektivt ved behandling av tilstanden og kan ha en steril tilgangsport (f.eks. kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør med en propp som en hypoderm injeksjonsnål kan føres igjennom). I det minste er et aktivt middel i preparatet et anti-ErbB2-antistoff. Pakkeinnlegget indikerer at preparatet anvendes for behandling av den valgte tilstanden, slik som kreft. I en utførelsesform indikerer pakkeinnlegget at preparatet omfattende antistoffet som binder ErbB2 kan anvendes for å behandle kreft som uttrykker en ErbB-reseptor valgt fra gruppen bestående av epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), ErbB3 og ErbB4, fortrinnsvis EGFR. I tillegg indikerer pakkeinnlegget at pasienten som skal behandles er en som har kreft karakterisert ved overdreven aktivering av ErbB-reseptor valgt fra EGFR, ErbB3 eller ErbB4. For eksempel kan kreften være en som overuttrykker en av disse reseptorene og/eller som overuttrykker en ErbB-ligand (slik som TGF-D). Pakkeinnlegget kan også indikere at preparatet kan anvendes for å behandle kreft, hvori kreften ikke er karakterisert ved overekspresjon av ErbB2-reseptoren. Mens det foreliggende pakkeinnlegget for HERCEPTIN indikerer at antistoffet anvendes for å behandler pasienter med metastatisk brystkreft hvis tumorer overuttrykker ErbB2-proteinet, kan for eksempel pakkeinnlegget heri indikere at antistoffet eller preparatet anvendes for å behandle kreft uavhengig av graden av ErbB2-overekspresjon. I en annen utførelsesform kan pakkeinnlegget indikerer at antistoffet eller preparatet kan anvendes for å behandle brystkreft (f.eks. metastatisk brystkreft); hormonuavhengig kreft; prostatakreft (f.eks. androgen uavhengig prostatakreft); lungekreft (f.eks. ikke-småcelle lungekreft); tykktarms-, endetarms- eller kolorektal kreft; eller enhver av de andre sykdommene eller tilstandene beskrevet heri. Videre kan det industrille produktet omfatte: (a) en første beholder med et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et første antistoff som binder ErbB2 og hemmer veksten av kreftceller som overuttrykker ErbB-2; og (b) en andre beholder med et preparat inneholdt deri, hvori preparatet omfatter et annet antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor.

Industriproduktet i denne utførelsen ifølge den foreligggende oppfinnelse kan videre omfatte et pakkeinnlegg som indikerer at det første og det andre antistoffpreparatet kan anvendes for å behandle kreft. Videre kan pakkeinnlegget instruere brukeren av preparatet (omfattende et antistoff som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor) og kombinere terapi med antistoffet og enhver av de supplerende terapier beskrevet i de foregående avsnitt (f.eks. et kjemoterapeutisk middel, et EGFR-målrettet medikament, et antiangiogent middel, en antihormonell forbindelse, et hjertebeskyttende middel og/eller et cytokin). Alternativt eller i tillegg kan idustriproduktet videre omfatte et andre (eller tredje) beholder omfattende en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som bakteriostatisk vann for injeksjon (BWFI), fosfatbuffret saltoppløsning, Ringers løsning og dekstroseløsning. Det kan videre omfatte andre materialer ønsket fra et kommersielt eller brukerstandpunkt, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtere, nåler og spøyter.

VII. IKKE-TERAPEUTISK ANVENDELSE AV ANTI-ErbB2-ANTISTOFFET

Antistoffene (f.eks. de humaniserte anti-ErbB2-antistoffene) ifølge den foreliggende oppfinnelse har ytterligere ikke-terapeutiske anvendelser.

For eksempel kan antistoffene anvendes som affinitetsrensemidler. I denne fremgangsmåten immobiliseres antistoffene på en fastfase slik som Sephadex resin eller filter-papir ved anvendelse av velkjente metoder innenfor teknikkens stand. De immobiliserte antistoffene bringes i kontakt med en prøve inneholdende ErbB2-proteinet (eller et fragment derav) som skal renses, og deretter vaskes støtten med et egnet løsningsmiddel som vil fjerne vesentlig alt materialet i prøven, bortsett fra ErbB2-proteinet som er bundet til det immobiliserte antistoffet. Til slutt vaskes støtten med et annet egnet løsningsmiddel slik som glysinbuffer, pH 5,0, som vil frigi ErbB2-proteinet fra antistoffet.

Anti-ErbB2-antistoffer kan også anvendes i diagnostiske analyser for ErbB2-protein, f.eks. ved påvisning av dets ekspresjon i spesifikke celler, vev eller serum.

For diagnostiske anvendelser vil antistoffet vanligvis være merket med en detekterbar enhet. Mange markører er tilgjengelig som vanligvis kan grupperes inn i følgende kategorier:

(a) Radioisotoper slik som <3>5S, 14C, 12<5>1,<3>H og ,<3>II. Antistoffet kan merkes med de radioaktive isotopene ved anvendelser av teknikker beskrevet i for eksempel Current Protocols in Immunology, Vol. 1 og 2, Coligen et al. Ed. Wiley-Interscience, New York, pub. (1991) og radioaktivitet kan måles ved anvendelse av scintillasjonstelling. (b) Fluorescensmarkører slik som skjeldne jordchelater (europiumchelater) eller flurescein og dets derivater, rodamin og dets derivater, dansyl, Lissamin, fykoerytrin og Texasrød er tilgjengelig. Fluorescensmarkører kan konjugeres til antistoffet ved anvendelse av teknikker beskrevet i for eksempel Current Protocols in Immunology, supra. Fluorescens kan kvantifiseres ved anvendelse av et fluorimeter. (c) Ulike enzymsubstratmarkører er tilgjengelige og US patent nr. 4275149 tilveiebringer en oversikt over noen av disse. Enzymet katalyserer vanligvis en kjemisk endring av det kromogene substratet som kan måles ved anvendelse av ulike teknikker. For eksempel kan enzymet katalysere en fargeendring i et substrat som kan måles spektrofotometrisk. Alternativt kan enzymet endre fluorescens eller chemiluminisens av substratet. Teknikker for kvantifisering av en fluorescensendring er beskrevet ovenfor. Chemiluminisenssubstratet blir elektronisk eksitert ved hjelp av en kjemisk reaksjon og kan deretter avgi lys som kan måles (ved anvendelse av for eksempel et chemilumino-meter) eller gi energi til en fluorescensakseptor. Eksempler på enzymatiske markører inkluderer luciferase (for eksempel ildflue luciferase og bakteriell luciferase; US patent nr. 4737456), luciferin, 2,3-dihydroftalazinedioner, malatdehydrogenase, urease, peroksi-dase slik som pepperrot perioksidase (HRPO), alkalinsk fosfatase, P-galaktosidase, glukomylase, lysozymsakkaridoksidaser (f.eks. glukoseoksidase, galaktoseoksidase og glukose-6-forfatdehydrogenase), heterosykliske oksidaser (slik som urikase og xantin-oksidase), laktoperoksidase, mikroperoksidase og lignende. Teknikker for konjugering av enzymer til antistoffer er beskrevet i 0'SulIivan et al, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjufates for use in Enzyme Immunoassay", i Methods in Enzym, (red. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).

Eksempler på enzymsubstratkombinasjoner omfatter f.eks.:

(i) Pepperrotperoksidase (HRPO) med hydrogenperoksidase som et substrat, hvori hydrogenperoksidasen oksiderer en fargeforløper (f.eks. ortofenyldiamin (OPD) eller 3,3',5,5'-tetrametylbenzidinhydroklorid (TMB)); (ii) alkalinsk fosfatase (AP) med paranitrofenylfosfat som kromogent substrat; og; (iii) P-D-galaktosidase (D-D-Gal) med et kromogent substrat (f.eks. p-nitro-fenyl-P-D-galaktosidase) eller fluorogent substrat 4-metylumbelliferyl-P-D-galaktosidase.

Flere enzymsubstratkombinasjoner er tilgjengelig for fagmannen på området. For en generell oversikt over disse, se US patent nr. 4275149 og 4318980.

Noen ganger er markøren indirekte konjugert med antistoffet. Fagmannen på området vil være klart over ulike teknikker for å oppnå disse. For eksempel kan antistoffet være konjugert med biotin og ethvert av de tre brede kategorier av markører nevnt ovenfor kan konjugeres med avidin eller omvent. Biotin binder selektivt til avidin og på den måten kan markøren konjugeres med antistoffet på denne indirekte måten. For å oppnå indirekte konjugering av markøren med antistoffet, kan alternativt antistoffet konjugeres med et lite hapten (f.eks. digoksin) og en av de ulike typene markører nevnt ovenfor konjugeres med et anti-hapten-antistoff (f.eks. anti-digoksin-antistoff). På denne måten kan indirekte konjugering av markøren med antistoffet oppnås.

I en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse trenger anti-ErbB2-antistoffet ikke å være merket og nærværet av dette kan påvises ved anvendelse av et merket antistoff som binder til ErbB2-antistoffet.

Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes i enhver kjent analysefremgangsmåte slik som konkurrerende bindingsanalyser, direkte eller indirekte "sandwich"-analyser og immunopresipiteringsanalyser. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, s. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

For immunohistokjemi kan tumorprøven være fersk eller frossen, eller den kan være innstøpt i parafin og fiksert med et konserveringsmiddel slik som for eksempel formalin.

Antistoffene kan også anvendes for in vivo-diagnostiske analyser. Vanligvis er antistoffet merket med et radionuklid (slik som 11'ln, <99>Tc, 14C, 1<31>I, 1251,<3>H,3<2> P eller <35>S) slik at tumoren kan lokaliseres ved anvendelse av immunoscintiografi. For letthets skyld kan antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse være tilveiebrakt i et analysesett, dvs. en pakket kombinasjon av reagenser i på forhånd bestemte mengder med instruksjoner for utføring av den diagnostiske analysen. Når antistoffet er merket med et enzym, inkluderer analysesettet substrater og kofaktorer som kreves av enzymet (f.eks. en sub-stratforløper som tilveiebringer den detekterbare kromoforen eller fluoroforen). I tillegg kan andre additiver være inkludert slik som stabilisatorer, buffere (f.eks. en blokkerings-buffer eller lysisbuffer) og lignende. De relative mengder av de ulike reagenser kan variere vidt for å tilveiebringe de konsentrasjoner i løsning av reagenser som vesentlig optimaliserer analysens sensitivitet. Spesielt kan reagensene tilveiebringes som tørre pulvere, vanligvis lyofiliserte inkludert eksipienser som ved oppløsning vil tilveiebringe en reagensløsning med passende konsentrasjon.

VIII. DEPONERING AV MATERIALER

De følgende hybridomcellelinjer er blitt deponert hos "the American Type Culture Collection", 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-22009, USA

(ATCC):

Ytterligere detaljer ifølge den foreliggende oppfinnelse er illustrert ved de følgende ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling og karakterisering av monoklonalt antistoff 2C4

Det monoklonale antistoffet 2C4, 7F3 og 4D5 fra mus, som spesifikt binder det ekstracellulære domenet til ErbB2 ble fremstilt som beskrevet av Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990). Kort fortalt med NIH 3T3/HER2-3400-celler (som uttrykker tilnærmet 1 x 105 ErbB2-molekyler /celle) fremstilt som beskrevet i Hudziak et al, PNAS, USA, 84:7158-7163 (1987) høstet med fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) inneholdende 25 mM EDTA og anvendt for å immunisere BALB/c-mus. Musen ble gitt intraperitoneale injeksjoner inneholdende 107-celler i 0,5 ml PBS ved 0, 2, 5 og 7 uke. Mus med antisera som immunpresipiterte 32P-merket ErbB2 ble gitt intraperitoneale injeksjoner av en hvetekimagglutinin-Sepharose (WGA)-renset ErbB2-membranekstrakt ved uke 9 og 13. Dette ble etterfulgt ved i.v. injeksjoner av 0,1 ml ErbB2-preparatet og splenocyttene ble fusert med musemyelomcellelinjen X63-Ag8.653.

Hybridomsupernatantene ble analysert for ErbB2-binding ved hjelp av ELISA og radioimmunopresipitering.

ErbB2-epitopene bundet ved hjelp av monoklonale antistoffer 4D5, 7F3 og 2C4 ble bestemt ved konkurrerende bindingsanalyse (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)). Kryssbindingsstudier ble utført på antistoffer ved direkte fluorescens på intakte celler ved anvendelse av "PANDEX"-Screen Machine for å kvantitere fluorescens. Hvert monoklonalt antistoff ble konjugert med fluoresceinisotiocynat (FITC) ved anvendelse av etablerte fremgangsmåter (Wofsy et al, Selected Methods in Cellular Immunology, s. 287, Mishel og Schiigi (red.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Sammenflytende monolag av NIH 3T3/HER2-3400-celler ble trypsinert, vasket en gang og resuspendert ved 1,75 x 106-celler/ml i kald PBS inneholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% NaN3. En endelig konsentrasjon på 1% latekspartikler (IDC, Portland, OR) ble tilsatt for å redusere tilstopping av PANDES-platemembranene. Celler i suspensjon, 20 ul og 20 ul rensede monoklonale antistoffer (100 u.g/ml til 0,1 ug/ml) ble tilsatt til PANDEX-platebrønnene og inkubert på is i 30 minutter. En forhåndsbestemt fortynning av FITC-merkede monoklonale antistoffer i 20 u.1 ble tilsatt til hver brønn, inkubert i 30 minutter, vasket og fluorescensen ble kvantitert ved hjelp av PANDEX. Monoklonale antistoffer ble antatt å dele en epitop dersom hver blokkerte binding av den andre med 50% eller mer, sammenlignet med et irrelevant monoklonalt antistoffkontroll. I dette forsøket ble de monoklonale antistoffene 4D5, 7F3 og 2C4 tildelt henholdsvis epitopene I, G/F og F.

De vekstinhibitoriske egenskapene til de monoklonale antistoffene 2C4, 7F3 og 4D5 ble vurdert ved anvendelse av brystkreft cellelinjen (SK-BR-3 (se Hudziak et al, Molec. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)). Kort fortalt ble SK-BR-3-celler løsnet ved anvendelse av 0,25% (volum/volum) trypsin og løst i komplett medium ved en tetthet på 4 x 105-celler pr. ml. Prøver av 100 (31 (4 x 104-celler) ble sådd ut i 96-brønners mikro-fortynningsplater, cellene ble tillatt å feste og 100 pi medium alene eller medium inneholdende monoklonalt antistoff (endelig konsentrasjon på 5 ug/ml) ble deretter tilsatt. Etter 72 timer ble platene vasket 2 ganger med PBS (pH 7,5), farget med krystallfiolett (0,5% i metanol) og analysert for relativ celleproliferering som beskrevet i Sugarman et al. Science 230:943:945 (1985). De monoklonale antistoffene 2C4 og 7F3, hemmet relativ celleproliferering av SK-BR-3 med omtrent henholdvis 20% og omtrent 38% sammenlignet med omtrent 56% inhibering oppnådd med det monoklonale antistoffet 4D5.

DE monoklonale antistoffene 2C4,4D5 og 7F3 ble vurdert for deres evne til å hemme HRG-stimulert tyrosinfosforylering av proteiner i området Mr 180.000 fra helcellelysater av MCF7-celler (Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). MCF7-celler er rapportert å uttrykke alle kjente ErbB-reseptorer, men ved relativt lave nivåer. Siden ErbB2, ErbB3 og ErbB4 har tilnærmet identisk molekylstørrelse er det ikke mulig å kunne skille hvilke protein som har blitt tyrosinfosforylert når helcellelysater vurderes ved hjelp av "Western blot"-analyse.

Imidlertid er disse cellene ideelle for HRG-tyrosinfosforyleringsanalyser fordi de under de anvendte analysebetingelser, og i fravær av eksogent tilsatt HRG, utøver lave til ikke-detekterbare nivåer av tyrosinfosforyleringsproteiner i Mr 180.000-området.

MCF7-celler ble sådd ut i 24-brønns plater og monoklonale antistoffer mot ErbB2 ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble rHRGpi 177-244 tilsatt til hver brønn til en endelig konsentrasjon på 0,2 nM og inkuberingen fortsatte i 8 minutter. Medium ble forsiktig fjernet fra hver brønn og reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av 100 pl SDS-prøvebuffer (5% SDS, 25 mM DTT og 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Hver prøve (25 pi) ble fordelt på en 4-12% gradientgel elektroforese (Novex) og deretter elektroforetisk overført til polyvinylidendifluoridmembran. Antifosfotyrosin (4G10 fra UBI, anvendt ved 1 u,g/ml)-immunoblot ble utviklet og intensiteten av de på forhånd reaktive båndene ved Mr ~180.000 ble kvantifisert ved reflektansdensi-tometri som beskrevet tidligere (Holmes et al. Science 256:1205-1210 (1992); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269:14661-14665(1994).

De monoklonale antistoffene 2C4, 7F3 og 4D5 hemmet signifikant dannelsen av et HRG-indusert tyrosinfosforyleringssignal ved Mr 180.000.1 fravær av HRG var ingen av disse antistoffene istand til å stimulere tyrosinfosforylering av proteiner i Mr 180.000-området. Disse antistoffene kryssreagerer heller ikke med EGFR (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)), ErbB3 eller ErbB4. Antistoffene 2C4 og 7F3 hemmet signifikant HRG-stimulering av pl80-tyrosinfosforylering med <25% av kontrollen. Det monoklonale antistoffet 4D5 var i stand til å blokkere HRG-stimulering av tyrosinfosforyleringen med -50%. Figur 2A viser doseresponskurven for 2C4- eller 7F3-inhibering av HRG-stimuerling av pl80 tyrosinfosforylering som bestemt ved hjelp av refektansden-sitometri. Vurdering av disse inhiberingskurvene ved anvendelse av en 4-parametertil-pasning ga en IC50 på 2,8 + 0,7 nM og 29,0 + 4,1 nM for henholdsvis 2C4 og 7F3.

Inhibering av HRG-binding til MCF7-brystkreftcellelinjer ved hjelp av anti-ErbB2-antistoffer ble utført med monolagkulturer på is i et 24-brønnsplateformat (Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). Anti-ErbB2-monoklonale antistoffer ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 30 minutter. 1251-merket rHRGD 1177-224 (25 pm) ble tilsatt, og inkuberingen ble fortsatt i 4 til 16 timer. Figur 2B tilveiebringer doseresponskurver for 2C4- eller 7F3-inhibering av HRG-binding til MCF7-celler. Ulike konsentrasjoner av 2C4 eller 7F3 ble inkubert med MCF7-celler i nærvær av I-merket rHRGpi, og inhiber i ngskurven er som vist i Figur 2B. Analyse av disse dataene gir en IC50 på 2,4 + 0,3 nM og 19,0 + 7,3 nM for henholdsvis 2C4 og 7F3. En maksimal inhibering på tilnærmet 75% for 2C4 og 7F3 var i samsvar med tyrosinfosforyleringsdataene.

For å bestemme hvorvidt virkningen av anti-ErbB2-antistoffene observert på MCF7-cellene var et generelt fenomen, ble humane kreftcellelinjer inkubert med 2C4 eller 7F3 og graden av spesifikk 1251-merket rHRGpi-binding ble bestemt. (Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). Resultatene fra denne studien er vist i Figur 3. Binding av <121>I-merket rHRGpi kunne signifikant hemmes med både 2C4 eller 7F3 i alle cellelinjene, bortsett fra brystkreftcellelinjen MDA-MB-468, som har blitt rapportert å uttrykke lite eller intet ErbB2. De gjenværende cellelinjene er rapportert å uttrykke ErbB2, hvor nivået av ErbB2-ekspresjon varierer vidt blant disse cellelinjene. Faktisk varierer ErbB2-ekspresjonen i de testede cellelinjene med en mengde som er to ganger større. For eksempel uttrykker BT-20, MCF7 og Caov3 -104 ErbB2-reseptorer/celle, mens BT-474 og SK-BR-3 uttrykker-106 ErbB2-reseptorer/celle. Gitt det vide området av ErbB2-ekspresjon i disse cellene og de ovenfor angitte data, ble det konkludert at interaksjonen mellom ErbB2 og ErbB3 eller ErbB4 i seg selv var en høyaffinitetsinter-aksjon som fant sted på overflaten av plasmamembranen.

De vekstinhibitoriske virkningene av de monoklonale antistoffene 2C4 og 4D5 på MDA-MB-175 og SK-BR-3-celler i nærvær eller fravær av eksogent rHRGpi ble bestemt (Schaefer et al, Oncogene 15:1385-1394 (1997)). ErbB2-nivåer i MDA-MB-175-celler er 4-6 ganger høyere enn nivåene funnet i normale brystepitelceller og ErbB2-, ErbB4-reseptoren er konstitutivt tyrosinfosforylert i MDA-MB-175-celler. MDA-MB-175-celler ble behandlet med et anti-ErbB2-monoklonalt antistoff 2C4 og 4D5 (10 ug/ml) i 4 dager. I en krystallfiolett fargingsanalyse viste inkubering med 2C4 en sterk veksthemmende virkning på denne cellelinjen (Figur 4A). Eksogent HRG reverserte ikke signifikant denne hemmingen. På den annen side viste 2C4 ingen inhibitorisk virkning på den ErbB2-overuttrykkende cellelinjen SK-BR-3 (Figur 4B). Det monoklonale antistoffet 2C4 var i stand til å hemme celleproliferering av MDA-MB-175-celler i en større grad enn det monoklonale antistoffet 4D5, både i nærvær og fravær av eksogent HRG. Inhibering av celleproliferering med 4D5 er avhengig av ErbB2-ekspresjonsnivået (Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother, 37:255-263 (1993)). En maksimum hemming på 66% i SK-BR-3-celler kunne påvises (Figur 4B). Imidlertid kunne denne effekten ikke overgås med eksogent HRG.

EKSEMPEL 2

HRG-avhengig assosiasjon av ErbB2 med ErbB3 blir blokkert av monoklonalt antistoff 2C4

ErbB3s evne til å assosierer med ErbB2 ble testet i et koimmunopresipiterings-forsøk. 1,0 x 106 MCF7- eller SK-BR-3-celler ble sådd ut i 6 brønner vevskulturplater i 50:50 DMEM/Hams F12-medium inneholdende 10% fetalt bovint serum (FBS) og 10 mM HEPES, pH 7,2 (vekstmedium) og ble tillatt å feste over natt. Cellene ble sultet i 2 timer i vekstmedium uten serum forutfor start av forsøket.

Cellene ble vasket raskt med fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) og deretter inkubert med enten 100 nM av det angitte antistoffet fortynnet i 0,2% w/v bovint serumalbumin (BSA), RPMI-medium med 10 mM HEPES, pH 7,2 (bindingsbuffer) eller med bindingsbuffer alene (kontroll). Etter en time ved romtemperatur ble HRG tilsatt til en endelig konsentrasjon på 5 nM til halvparten av brønnene (+). Et tilsvarende volum bindingsbuffer ble tilsatt til de andre brønnene (-). Inkuberingen fortsatte i tilnærmet 10 minutter.

Supernatantene ble fjernet ved aspirasjon og cellene ble ly sert i RPMI, 10 mM HEPES, pH 7,2, 1% w/v TRITON X-100, 1,0% w/v CHAPS (lysisbuffer) inneholdende 0,2 mM PMSF, 10 ug/ml leupeptin og 10 TU/ml aprotinin. Lysatene ble renset for utløselig materiale ved hjelp av sentrifugering.

ErbB2 ble immunopresipitert ved anvendelse av et monoklonalt antistoff kovalent koblet til en affinitetsgel (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Dette antistoffet (Ab-3, Oncogene Sciences) gjenkjente et cytoplasmatisk epitopedomene. Immunopresipitering ble utført ved tilsetting av 10 ul gelvelling inneholdende tilnærmet 8,5 ug immobilisert antistoff til hvert lysat og prøvene ble tillatt blandet ved romtemperatur i 2 timer. Gelene ble deretter samlet ved hjelp av sentrifugering. Gelene ble vasket prøvevis tre ganger med lyseringsbuffer for å fjerne ubundet materiale. SDS-prøvebuffer ble deretter tilsatt og prøvene ble varmet kort i et kokende vannbad.

Supernatantene ble kjørt på 4-12% polyakrylamidgeler og overført ved elektro-blotting til nitrocellulosemembraner. Nærværet av ErbB3 ble påvist ved å tilsette blottene et polyklonalt antistoff mot et cytoplasmatisk epitopedomene derav (c-17, Santa Cruz, Biotech). Blottene ble visualisert ved anvendelse av kjemiluminisens substrat (ECL, Amersham).

Som vist i kontrollsporene i figurene 5A og 5B for henholdsvis MCF7 og SK-BR-3-celler, var ErbB3 tilstede i et ErbB2-immunopresipitat kun når cellene var stimulert med HRG. Dersom cellene først var inkubert med monoklonalt antistoff 2C4, var ErbB3-signalet opphevet i MCF7-celler (Figur 5A, spor 2C4+) eller vesentlig redusert i SK-BR-3-celler (Figur 5B, spor 2C4+). Som vist i Figurene 5A-B blokkerer det monoklonale antistoffet 2C4 heregulinavhengig assosiasjon av ErbB3 med ErbB2 i både MCF7- og SK-BR-3-celler vesentlig mer effektivt enn HERCEPTIN. Preinkubering med HERCEPTIN minket ErbB3-signalet i MCF7-lysater, men hadde liten eller ingen effekt på mengden ErbB3-kopresipitat fra SK-BR-3-lysater. Preinkubering med et antistoff mot EGF-reseptoren (Ab-1, Oncogene Sciences) hadde ingen effekt på ErbB3s evne til å koim-munopresipitere med ErbB2 i noen av cellelinjene.

EKSEMPEL 3

Humanisert 2C4-antistoffer

De ulike domenene av monoklonalt antistoff 2C4 fra mus ble først klonet inn i en vektor som tillot fremstilling av et mus/humant kimert Fab-fragment. Total-RNA ble isolert fra hybridomcellene ved anvendelse av Stratagene RNA-ekstraksjonsanalysesett ved å følge forhandlerens protokoller. De ulike domenene ble amplifisert ved hjelp av RT-PCR, gelrensing og satt inn i et derivat av et pUCl 19-basert plasmid inneholdende et humant kappakonstant domene og humant CH1 -domene, som tidligere beskrevet (Carter et al., PNAS, USA 89:4285 (1992); og US patent nr. 5821337). Det resulterende plasmid ble transformert inn i E. coli- stammen 16C9 for ekspresjon av Fab-fragmentet. Dyrking av kulturer, induksjon av proteinekspresjon og rensing av Fab-fragment ble utført som tidligere beskrevet (Werther et al, J. Immunol. 157:4986-4995 (1996); Presta et al. Cancer Research 57:4593-4599 (1997)).

Renset kimert 2C4-Fab-fragment ble sammenlignet med det murine foreldreantistoffet 2C4 med hensyn til dets evne til å hemme 1251-HRG-binding til MCF7-celler og hemme rHRG-aktivering av pl80-tyrosinfosforylering i MCF7-celler. Som vist i Figur 6A er det kimere 2C4-Fab-fragmentet svært effektivt i avbrytelsen av dannelsen av den høyaffinitets ErbB2-ErbB3-bindingssete på den humane brystkreft cellelinjen MCF7. Den relative IC50-verdien beregnet for intakt muse 2C4 er 4, 0 + 0,4 nM, mens verdien for Fab-fragmentet er 7,7 + 1,1 nM. Som illustrert i Figur 6B er det monovalente kimere 2C4-Fab-fragmentet svært effektivt i å avbryte HRG-avhengig ErbB2-ErbB3-aktivering. IC5o-verdien beregnet for intakt murint monoklonalt antistoff 2C4, er 6,0 + 2 nM, imens verdien for Fab-fragmentet er 15,0 + 2 nM.

DNA-sekvensen for den kimere klonen tillot identifisering av CDR-rester (Kabat et al, Swquences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (Figurene 7 og B). Ved anvendelse av oligonukleotid seterettet mutagenese ble alle seks CDR-regionenen introdusert inn i et fullstendig humant rammeverk (VL-kappaundergruppe I og VH-undergruppe III) inneholdt i plasmidet VX4 som tidligere beskrevet (Presta et al. Cancer Research 57:4593-4599 (1997)). Protein fra det resulterende "CDR-swap" ble uttrykt og renset som ovenfor. Bindingsstudiet ble utført for å sammenligne de to versjonene. Kort fortalt ble NUNC MAXISORP-plate dakket med 1 ug/ml ErbB2-ekstracellulært domene (ECD; fremstilt som beskrevet i WO 90/14357) i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6 over natt ved 4oC og deretter blokkert med ELISA-fortynningsmiddel (0,5% BSA, 0,05% polysorbat 20, PBS) ved romtemperatur i 1 time. Seriefortynninger av prøvene i ELISA-fortynningsmiddel ble inkubert på platene i 2 timer. Etter vasking ble bundet Fab-fragment påvist med biotiny-lert murint anti-humant kappa antistoff (ICN 634771) etterfulgt av streptavidinkonjugert pepperrotperioksidase (Sigma) og ved anvendelse av 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (Kirke-gaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) som substrat. Absorbansen ble lest ved 450 nm. Som vist i Figur 8A var all binding tapt på konstruksjon av "CDR-swap"-humant Fab-fragment.

For å gjenopprette binding av det humaniserte Fab, ble mutanter konstruert ved anvendelse av DNA fra "CDR-swap" som templat. Ved anvendelse av en datamaskindannet modell (Figur 9), ble disse mutasjonene dannet for å endre de humane ramme-verksregionrestene til deres musegjenpart ved posisjoner hvor endring kan påvirke CDR-konformasjon eller antistoff-antigen grenseflaten. Mutantene er vist i Tabell 2.

Bindingskurvene for de ulike mutantene er vist i Figurene 8A-C. Humaniserte Fab-versjon 574, med endringen ArgH71Val, AspH73Arg og IleH69Leu synes å ha gjen-opprettet binding tilsvarende den til det originale kimere 2C4-Fab-fragmentet. I tillegg kan FR og/eller CDR-rester, slik som L2, L54, L55, L56, H35 og/eller H48 modifiseres (for eksempel substitueres som følger-IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser og ValH48Ile) for ytterliger og bedre eller endre bindingen av det humaniserte antistoffet. Alternativt eller i tillegg kan det humaniserte antistoffet affinitets-modnes (se ovenfor) for videre å forbedre eller foredle dets affinitet og/eller andre biologiske aktiviteter.

Humanisert 2C4-versjon 574 ble affinitetsmodnet ved anvendelse av en "fag-display"-fremgangsmåte. Kort fortalt ble humanisert 2C4.574 Fab klonet inn i en "fag-display"-vektor som en genlll-fusjon. Når fag-partiklene induseres ved hjelp av infeksjon med MK13K07 hjelpefag tillater denne fusjonen at Fab uttrykkes ved den N-terminale halefiberfagproteinet genlll (Baca et al, J. Biol. Chem. 272:10678 (1997)).

Individuelle biblioteker ble konstruert for hver av de 6 CDRene identifisert ovenfor. I disse bibliotekene ble de aminosyrer i CDRene som var identifisert til å være potensielt signifikante i bindingen til ErbB2 ved anvendelse av en datamaskindannet modell (Figur 9) ved anvendelse av oligonukleotider inneholdende "NNS" som deres kodon. Bibliotekene ble deretter sjekket mot ErbB2 ECD festet på NUNC MAXISORP-plater med 3% tørrmelk i PBS med 0,2% Tween 20 (MPBST) som ble anvendt isteden for alle blokkeringsløsninger. For å velge et fag med affiniteter høyere enn den for 2C4.574, ble løselig ErbB2 ECD eller løselig Fab 2C4.574 tilsatt i løpet av vasketrinnet som konkurrent i den 3, 4. og 5. runden. Vasketiden ble utvidet til 1 time ved romtemperatur.

Etter 5 runder ble individuelle kloner igjen analysert ved hjelp av fag-ELISA. Individuelle kloner ble dyrket i Costar 96-brønners U-bunns vevskulturplater og fag ble inkubert ved tilsetning av hjelpefag. Etter overnatt dyrking ble E. coli-celler pelletert og de fag-inneholdende supernatantene ble overført til 96-brønns plater hvor fagen ble blokkert med MPBST i 1 time ved romtemperatur. NUNC MAXISORP-plater dekket med ErbB2-ECD ble også blokkert med MPBST som ovenfor. Blokkert fag ble inkubert på platene i 2 timer. Etter vasking ble bundet fag påvist ved anvendelse av pepperrot peroksidasekonjugert anti-M13 monoklonalt antistoff (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01) fortynnet 1:5000 i MPBST, etterfulgt av 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin som substrat. Absorbansen ble lest ved 450 nm.

48 kloner fra hvert bibliotek som ga de høyeste signalene ble DNA-sekvensert. De klonene som hadde sekvenser som forekom flest ganger ble subklonet inn i vektorer som beskrevet ovenfor, hvilket tillot ekspresjon av løselig Faber. Disse Fabene ble inkubert, proteinrenset og de rensede Fabene ble analysert for binding ved hjelp av

ELISA som beskrevet ovenfor, og bindingen ble sammenlignet med humanisert 2C4.574 utgangs versjon.

Etter at interessante mutasjoner i individuelle CDRer ble identifisert ble ytterligere mutanter som var ulike kombinasjoner av disse konstruert og testet som ovenfor. Mutanter som ga forbedret binding i forhold til 574 er beskrevet i Tabell 3.

De følgende mutanter har også blitt konstruert og er for tiden under evaluering:

De følgende mutanter, foreslått ved hjelp av homologiundersøkelse, konstrueres for øyeblikket:

Den foretrukne aminosyre ved H34 vil være metionin. En endring til leusin kan dannes dersom det blir funnet å være oksidering ved denne posisjonen.

AsnH52 og asnH53 ble funnet å være sterkt foretrukket for binding. Endring av disse rester til alanin eller aspartinsyre senket bindingen dramatisk.

Et intakt antistoff omfattende det variable lette- og tunge domenet av humanisert versjon 574 med en human IgG-tungkjede konstantregion har blitt fremstilt (se US patent nr. 5821337). Det intakte antistoffet fremstilles ved hjelp av kinesisk hamster eggstokkceller (CIIO). Det molekylet er angitt rhuMAb 2C4 heri.

EKSEMPEL 4

Monoklonalt antistoff 2C4 blokkerer EGF, TGF-a eller HRG-mediert aktivering av

MAPK

Mange vekstfaktorreseptorer signaliserer gjennom den mitogenaktiverte proteinkinase (MAPK)-reaksjonsveien. Disse kinasene med dobbel spesifistet er en av nøkkel-endepunktene i signaloverførings reaksjonsveien som til sist stimulerer deling av kreftceller. Det monoklonale antistoffet 2C4 eller HERCEPTTNS evne til å hemme EGF, TGF-a eller HRG-aktivering av MAPK ble bestemt på den følgende måte.

MCF7-celler (10<5->celler/brønn) ble sådd ut i seruminneholdende medium i 12-brønns cellekulturplater. Den neste dagen ble cellemedium fjernet og friskt medium inneholdende 0,1% serum ble tilsatt til hver brønn. Denne fremgangsmåten ble repetert den følgende dagen og forut for analyse ble medium erstattet med serumfri bindingsbuffer (Jones et al, J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998); og Schaefer et al, J. Biol. Chem. 274:859-66 (1999)). Celler ble tillatt ekvilibert til romtemperatur og ble deretter inkubert i 30 minutter med 0,5 ml 200 nM HERCEPTIN eller monoklonalt antistoff 2C4. Celler ble deretter behandlet med lnM EGF, 1 nM TGF-a eller 0,2 nM HRG i 15 minutter. Reaksjonen ble stanset ved aspirering av cellemediet og deretter ble 0,2 ml SDS-PAGE-prøvebuffer inneholdende 1% DDT tilsatt. MAPK-aktivering ble påvist ved hjelp av "Western blotting" ved anvendelse av en anti-aktiv MAPK-antistoff (Promega) som beskrevet tidligere (Jones et al, J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998)).

Som vist i figur 10 blokkerer monoklonalt antistoff 2C4 signifikant EGF-, TGF-a- og HRG-mediert aktivering av MAPK i en større grad enn HERCEPTIN. Disse resultatene antyder at monoklonalt antistoff 2C4 binder til en overflate av ErbB2 som anvendes for dets assosiasjon med enten EGFR eller ErbB3, og dermed forhindres dannelsen av signalreseptorkomplekset.

Monoklonalt antistoff 2C4 ble også vist å hemme heregulin (HRG)-avhengig aktivering. Aktivering av PI3-kinasesignaloverføringsveien er viktig for celleoverlevelse (Carraway et al, J. Bil. Chem. 270:7111-6 (1995)). I tumorceller kan PI3-kinaseaktiver-ing spille en rolle i invasive phenotyper (Tan et al. Cancer Resarch 59:1620-1625

(1999)). Overlevelses reaksjonsveien er primært mediert av serin/treoninkinasen AKT (Bos et al. Trends Biochem Sei. 20: 441-442 (1995). Komplekser dannet mellom ErbB2 og enten ErbB3 eller EGFR kan innlede disse reaksjonsveiene som svar på henholdsvis heregulin eller EGF (Olayioye et al. Mol. & Cell. Biol. 18:5042-51 (1998); Karunagaran et al. EMBO Journal, 15:254-264 (1996); og Krymskaya et al. Am. J. Physiol. 276:L246-55 (1999)). Inkubering av MCF7 brystkreftceller med 2C4 hemmer heregulinmediert AKT-aktivering. Videre reduseres grunn-nivået av AKT-aktiveringen som er tilstede i fraværet av heregulintilsetningen ytterligere ved tilsetting av 2C4. Disse dataene antyder at 2C4 kan hemme ErbB-ligandaktivering av PI3-kinase, og at denne inhiberingen kan medføre apoptose. Den økte sensitiviteten for apoptose kan medføre at tumorcellene blir mer sensitive ovenfor de toksisike effektene ved kjemoterapi.

På denne måten hemmer det monoklonale antistoffet 2C4 ligandinitiert ErbB-signalisering gjennom to viktige signaloverføringsreaksjonsveier-MAP Kinase (en viktig proliferativ reaksjonsvei) og PI3-kinase (en viktig overlevelses/antiapoptotisk reaksjonsvei).

EKSEMPEL 5

Kombinasjon av monoklonalt antistoff 2C4 og HERCETPTIN in vivo

En xenograftmodell som anvender lungeadenokarsinomcellelinjen Calu-3, ble anvendt for å påvise virkningen av anti-HER2-monoklonale antistoffer, enten alene eller i kombinasjon for å undertrykke tumorvekst. NCR nakne hunnmus ble innokulert subkutant med 20 x 10<6->celler i 0,1 ml. Tumormålinger ble tatt to ganger per uke og når tumorknuter nådde et volum på 100 mm ble dyrene randomisert i 7 behandlingsgrupper. Behandlingsgruppene var: (a) monoklonal antistoffkontroll, Mab 1766; (b) HERCEPTIN, 10 mg/kg; (c) monoklonalt antistoff 7C2, 10 mg/kg; (d) monoklonalt antistoff 2Cf, 10 mg/kg; (e) HERCEPTIN og 7C2, hver ved 10 mg/kg; (f) HERCEPTIN og 2C4, hver ved 10 mg/kg;

(g) monoklonale antistoffer 2C4 og 7C2, hver ved 10 mg/kg.

Dyrene ble behandlet 2 ganger per uke inntil dag 24. Tumorvolumene ble målt 2 ganger per uke inntil dag 38.

Som vist i søylediagrammet i Figur 11, inhiberte behandling av Calu-3-tumor-bærende mus med 2C4 eller HERCEPTIN signifikant veksten av tumorene. Kombina-sjonen av HERCEPTIN og 2C4 eller HERCEPTIN og 2C2 var overlegne i forhold til hvert av de monoklonale antistoffene administrert alene.

EKSEMPEL 6

Behandling av kolorektal kreft med det monoklonale antistoffet 2C4

Humane kolorektale cellelinjer slik som HCA-7, LS174T og CaCo-2 ble implantert subkutant i atymiske nakne mus som beskrevet i Sheng et al, J. Clin. Invest. 99:2254-2259 (1997). Med en gang tumoren var etablert og var omtrent 100 mm<3> i volum, ble dyregruppene behandlet med 10-50 mg/kg monoklonalt antistoff 2C4 administrert 2 ganger per uke ved hjelp av injeksjon i det intraperitoneale hulrom. Monoklonalt antistoff 2C4 undertrykte veksten av kolorektale xenografter in vivo.

EKSEMPEL 7

Behandling av brystkreft med humanisert 2C4

Virkningen av rhuMAb 2C4 eller HERCEPTIN på brystkreftceller som ikke overuttrykte ErbB2, ble påvist i en 3 dagers Alamar blå analyse (Aahmed, SA, J. Immunol. Methods 170:211-224 (1994); og Page et al, Int. J. Oncol. 3:473-476 (1994)). De anvendte cellene i denne analysen var MDA-175 human brystkreftcellelinje som uttrykte ErbB2 med et nivå på 1+. Som vist i Figr 12, ble veksten av brystkreftcellelinjen MDA-175 signifikant hemmet på en doseavhengig måte med tilsetting av rhuMAb 2C4 sammenlignet med HERCEPTIN-behandling.

Virkningen av rhuMAb 2C4 mot MCF7-xenografter som var østrogenreseptor-positive (ER+) og uttrykte lave nivåer av ErbB2, ble påvist. Hunnmus supplementert med østrogen ble anvendt. RhuMAb 2C4 ble administrert ved en dose på 30 mg/kg hver uke. Som vist i Figur 13 var rhuMAb 2C4 effektivt ved hemming av brystkreft tumorvekst in vivo, hvor brystkreften ikke var karakterisert ved overekspresjon av ErbB2.

EKSEMPEL 8

Farmakokinetikk, metabolisme og toksikologi for 2C4

rhuMAb 2C4 var stabilt i humant serum. Det ble ikke observert noen bevis eller aggregater av kompleksdannelse i biologiske matrikser. I mus ble rhuMAb 2C4 klarert raskere enn HERCEPTIN. Farmakokinetikkstudier antydet at ukentlig administrering av omtrent 2-6 mg/kg rhuMAb 2C4 ville resultere i serumkonsetrasjoner tilsvarende de for øyeblikket doserte HERCEPTIN. Resulterende serum, 2C4-eksponering, burde i stor grad overgå IC5o bestemt in vitro.

En toksikologisk studie ble utført på cynomolgus aper (2 hanner og 2 hunner per gruppe). RhuMAb 2C4 ble administrert intravenøst ved 0, 10, 50 eller 100 mg/kg to ganger per uke i 4 uker. Toksikologistudiemålingene inkluderte kroppsvekt (-2, -1 uker og ukentlig deretter); matinntak (kvalitativt, daglig); fysisk undersøkelse med påvisning av blodtrykk, elektrokardiogram (ECG) og kroppstemperatur (-2, -1 uker og uke 2 og 4, 4 timer etter dosering etter den andre uken med dosering); ultralydsvurdering av hjertet (etter den første doseringsuken 1 og ved slutten av studien, uke 4); klinisk patologi (grunnlinje og ved slutten av uke 2 og 4); urinanalyse (grunnlinjen og ved slutten av uke 2 og 4); antistoffanalyseprøver (grunnlinjen og ved slutten av uke 2 og 4); så vel som nekroskopi og histopatologiske analyser.

Alle dyrene i alle gruppene overlevde ved slutten av studien. Det ble ikke bemerket noen signifikante kliniske observasjoner eller forskjeller blant gruppene. Nekroskopiresultatene viste ingen signifikant abnormaliter i organer fra noe dyr. Ingen signifikante mikroskopiske abnormaliteter ble observert i vev fra noen av dyrene. Ingen signifikant endring i ECG ble rapportert fra initieringen til slutten av studien. I tillegg ble ingen forskjell blant gruppene sett.

EKSEMPEL 9

Doseopptrapping

Kreftpasienter administreres en første dose av rhuMAb 2C4 ved en av fem doseringsnivåer (0,05, 0,5, 2,0, 4,0 eller 10 mg/kg; 6 individer per doseringsnivå) etterfulgt av en 4-ukers utvasking. Uke 5-pasienter gis den samme dosen ukentlig 4 ganger fulgt av ytterligere 4 uker utvasking. Pasienter med fullstendig respons, delvis respons og stabil sykdom er kvalifisert for utvidede studier.

EKSEMPEL 10

Terapi av tilbakefallende eller motstandsdyktig metastatisk prostatakreft RhuMAb 2C4 er et full-lengde, humanisert monoklonalt antistoff (produsert i CHO-celler) rettet mot ErbB2. RhuMAb 2C4 blokkerer assosiasjonen av ErbB2 med andre ErbB-familiemedlemmer og hemmer derved intracellulær signalisering gjennom ErbB-reaksjonsveien. I kontrast til HERCEPTIN, hemmer ikke rhuMAb 2C4 kun veksten av ErbB2-overuttrykkende tumorer, men blokkerer også veksten av tumorer som krever ErbB-ligandavhengig signalisering.

RhuMAb 2C4 er ment som et enkelt middel for behandling av hormongjenstridig (androgenuavhengig) prostatakreft pasienter. Primære effektivitetsendepunkter inkluderer samlet overlevelse sammenlignet med den beste tilgjengelige omsorg (Mitoxantron/Prednison) når anvendt som et enkelt middel og sikkerhet. Sekundære effektivitetsendepunkter inkluderer: tid for sykdomsutvikling, responshastighet, livskvalitet, smerte og/eller varighet av responsen. RhuMAb 2C4 ble administrert intravenøst ukentlig eller hver tredje uke ved henholdsvis 2 eller 4 mg/kg inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som en flytende multidoseringsformulering (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

RhuMAb 2C4 er også indikert i kombinasjon med kjemoterapi for behandling av hormongjenstridig (androgenuavhengig) prostatakreft pasienter. Primære effektivitets punkter omfatter samlet overlevelse sammenlignet med kjemoterapi og sikkerhet. Sekundære effektivitetsendepunkter omfatter: tid for sykdomsutvikling, responshastighet, livskvalitet, smerte og/eller varighet av responsen. RhuMAb 2C4 ble administrert intravenøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke ved henholdsvis 2 eller 4 mg/kg inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som et flytende multidoseringspreparat (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

Eksempler på medikamenter som kan kombineres med anti-ErbB2-antistoffet (som blokkerer ligandaktivering av en ErbB2-reseptor) for behandling av prostatakreft (for eksempel androgen uavhengig prostatakreft) omfatter en farnesyltransferase inhibitor; et anti-antiogent middel (f.eks. et anti-VEGF-antistoff); et EGFR-målrettet medikament (f.eks. C225 eller ZD 1839); et annet anti-ErbB2-antistoff (f.eks. et vekstinhibitorisk anti-ErbB2-antistoff slik som HERCEPTIN eller et anti-ErbB2-antistoff som induserer apoptose slik som 7C2 eller 7F3, inkludert humaniserte og/eller affinitetsmodnede varianter derav); et cytokin (f.eks. IL-2, IL-12, G-CSF eller GM-CSF); et antiandrogen (slik som flutamid eller cyproteronacetat); leuprolid, suramin, et kjemoterapeutisk middel slik som vinblastin, estramustin, mitoksantron, liarozol (et retinsyre metabolisme-blokkerende middel), syklofosfamid, antracyklin antibiotika slik som doksorubisin. et taksan (f.eks. paclitaksel eller docetaksel) eller metrotreksat eller en hvilken som helst kombinasjon av de foregående, slik som vinblastin, estramustin eller syklofosfamid/ doksorubicin/metotreksat; prednison; hydrokortison eller kombinasjoner derav. Standard doseringer for de ulike medikamentene kan administreres, f.eks. 40 mg/m /uke docetaksel (TAXOTERE); 6 (AUC) karboplatin og 200 mg/m<2> paclitaksel (TAXOL).

EKSEMPEL 11

Metastatisk brystkrefterapi

RhuMAb 2C4 er indikert som et enkelt middel for behandling av metastatisk brystkreftpasienter, hvis tumorer ikke overuttrykker ErbB2. Primære effektivitetsendepunkter omfatter responshastighet og sikkerhet. Sekundære effektivitetsendepunkter omfatter: samlet overlevelse, tid for syksomsutvikling, livskvalitet og/eller responsvarighet. RhuMAb 2C4 ble administrert intravenøst (IV) ukentlig eller over tre uker med henholdsvis 2 eller 4 mg/kg inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som et flytende multidoseringspreparat (20 ml fylt med en kosentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

Eksempler på medikamenter som kan kombineres med anti-ErbB2-antistoffet (som blokkerer ligandaktivering av en ErbB2-reseptor) for å behandle brystkreft (f.eks. metastatisk brystkreft som ikke er karakterisert ved ErbB2-overekspresjon), omfatter kjemoterapeutiske midler slik som antrasyklin antibiotika (f.eks. doksorubisin), syklofos-fomid, et taksan (f.eks. paclitaksel eller docetaksel), navelbin, xeloda, mitomycin C, en platinumforbindelse, okaliiplatin, gemcitabin eller kombinasjoner av to eller flere av disse sliok som doksorubicin/syklofosfomid; et annet anti-ErbB2-antistoff (f.eks. et vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff slik som HERCEPTIN eller et anti-ErbB2-antistoff som induserer apoptose slik som 7C2 eller 7F3, inkludert humaniserte eller affinitets-modnende varianter derav); et anti-strogen (f.eks. tamoksifen); et farnesyltransferaseinhibitor, et anti-angiogent middel (f.eks. anti-VEGF-antistoff); EGFR-målrettet medikament (f.eks. C225 eller ZD1839); et cytokin (f.eks. IL-2, IL-12, G-CSF eller GM-CSF) eller kombinasjoner av de foregående. Standard doseringer for slike ytterligere medikamenter kan anvendes.

RhuMAb 2C4 er ytterligere indikert i kombinasjon med HERCEPTIN for behandling av metastatisk brystkreft pasienter hvis tumorer overuttrykker ErbB2. Primære effektivitetsendepunkter omfatter responshastighet og sikkerhet. Sekundære effektivitetsendepunkter inkluderer: tid for sykdomsutvikling, samlet overlevelse sammenlignet med HERCEPTIN alene, livskvalitet og/eller responsvarighet. RhuMAb 2C4 administreres intravenøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke ved henholdvis 2 eller 4 mg/kg inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som en flytende multidoseringsformulering (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjoner). HERCEPTIN administrerer IV som en innledende dosering på 4 mg/kg, fulgt av ukentlig opprettholdelesesdoser på 2 mg/kg. HERCEPTIN tilføres som et lyofilisert pulver. Hvert rør med HERCEPTIN inneholder 440 mg HERCEPTIN, 9,9 mg L-histidin HCl, 6,4 mg L-histidin, 400 mg ct-a-trehalosedihydrat og 1,8 mg polysorbat 20.

Rekonstruksjon med 20 ml bakteriostatisk vann for injeksjon (BWFI) inneholder 1,1% benzylalkohol som et konserveringsmiddel, hvilket gir 21 ml av en multidoserings-løsning inneholdende 21 mg/ml HERCEPTIN ved en pH på tilnæmet 6,0.

EKSEMPEL 12

Lungekrefterapi

RhuMAb 2C4 er indikert som et enkelt middel for behandling av stadie Illb eller IV av ikke-liten celle lungekreft (NSCLC). Primære effektivitets endepunkter omfatter responshastighet og sikkerhet. Sekundære effektivitets endepunkter inkluderer: samlet overlevelse, tid for utvikling av sykdommen, livskvalitet og/eller responsvarighet. RhuMAb 2C4 administreres intravenøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke ved henholdsvis 2 eller 4 mg/kg, inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som et flytende multidoseringspreparat (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

RhuMAb 2C4 er også indikert i kombinasjon med kjemoterapi for behandling av metastatisk ikke-liten celle lungekreft pasienter. Primære effektivitets endepunkter

inkluderer samlet overlevelse sammenlignet med standardterapi og sikkerhet. Sekundære effektivitets endepunkter inkluderer: tid for utviklingen av sykdommen, responshastighet, livskvalitet og/eller responsvarighet. RhuMAb 2C4 administreres intravenøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke ved henholdsvis 2 eller 4 mg/kg inntil utvikling av sykdommen.

Antistoffet tilføres som en flytende mutlidoseringsformulering (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

Eksempler på ytterligere medikamenter som kan kombineres med antistoffet (som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor) for behandling av lungekreft inkluderer kjemoterapeutiske midler slik som karboplatin, et taksan (f.eks. paclitaksel eller docetaksel), gemicitabin, navelbin, cisplatin, oksaliplatin eller kombinasjoner av hvilke som helst av disse slik som karboplatin/docetaksel; et annet anti-ErbB2-antistoff (f.eks. et vekstinhibitorisk anti-ErbB2-antistoff slik som HERCEPTIN eller et anti-ErbB2-antistoff som induserer apoptose slik som 7C2 eller 7F3, inkludert humaniserte eller affinitetsonende varianter derav); en farnesyltransferaseinhibitor; et anti-angiogent middel (f.eks. et anti-VEGF-antistoff); et EGFR-målrettet medikament (f.eks. C225 eller ZD1839); et cytokin (f.eks. IL-2, IL-12, G-CSF eller GM-CSF) eller kombinasjoner av de foregående.

EKSEMPEL 13

Behandling av kolorektal kreft

RhuMAb 2C4 er indikert som et enkelt middel for behandling av metastatisk kolorektal kreft. Primære effektivitetspunkter inkluderer responshastighet og sikkerhet. Sekundære effektivitets endepunkter inkluderer: samlet overlevelse, tid for utvikling av sykdommen, livskvalitet og/eller responsvarighet. RhuMAb 2C4 administreres intra-venøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke ved henholdsvis 2 eller 4 mg/kg, inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som et flytende multidoseringspreparat (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

RhuMAb 2C4 er også indikert i kombinasjon med kjemoterapi for behandling av metastatisk kolorektal kreftpasienter. Primære effektivitets endepunkter inkluderer samlet overlevelse sammenlignet med standardterapi og sikkerhet. Sekundære effektivitetsendepunkter inkluderer: tid for utviklingen av sykdommen, responshastighet, livskvalitet og/ eller responsvarighet. RhuMAb 2C4 administreres intravenøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke ved henholdsvis 2 eller 4 mg/kg inntil utvikling av sykdommen. Antistoffet tilføres som en flytende mutlidoseringspreparat (20 ml fylt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon).

Eksempler på kjemoterapeutiske midler anvendt for behandling av kolorektalkreft som kan kombineres med antistoffet som binder ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor inkluderer 5-fluoruracil (5-FU), leucovorin (LV), CPT-11, levamisol eller kombinasjoner av hvilken som helst av to eller flere av disse, f.eks. 5-FU/LV/CPT-11. Standdoseringer av slike kjemoterapeutiske midler kan administreres. Andre medikamenter som kan kombineres med anti-ErbB2-antistoffet for for behandling av kolorektalkreft inkluderer en farnesyltransferaseinhibitor; et anti-angiogent middel (f.eks. et anti-VEGF-antistoff); et EGFR-målrettet medikament (f.eks. C225 eller ZD1839); et cytokin (f.eks. IL-2, IL-12, G-CSF eller GM-CSF); andre anti-ErbB2-antistoff (f.eks. et vekstinhibitorisk anti-ErbB2-antistoff slik som HERCEPTIN eller et anti-ErbB2-antistoff som induserer apoptose slik som 7C2 eller 7F3 inkludert humaniserte eller affinitetsmodnede varianter derav) eller kombinasjoner av de foregående.

Claims (18)

1. Humanisert, monoklonalt antistoff som binder ErbB2/HER2, karakterisert ved at det omfatter det variable, tunge domene (VH) med aminosyresekvens som angitt i SEKV. ID. NR.: 4 og det variable, lette domene (VL) med aminosyresekvens som angitt i SEKV. ID. NR.: 3.

2. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter et intakt IgGl -antistoff.

3. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter et antistoff-fragment.

4. Antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at det er et Fab-fragment.

5. Farmasøytisk formulering, karakterisert ved at den omfatter antistoffet ifølge ethvert av kravene 1 til 4 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk formulering ifølge krav 5, karakterisert ved at den er en vandig oppløsning.

7. Farmasøytisk formulering ifølge krav 5, karakterisert ved at den er lyofilisert.

8. Immunokonjugat, karakterisert ved at det omfatter antistoffet ifølge ethvert av kravene 1 til 4, konjugert med et cytotoksisk middel.

9. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for antistoffet ifølge ethvert av kravene 1 til 4.

10. Vektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyren ifølge krav 9.

11. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter vektoren ifølge krav 10.

12. Vertscelle ifølge krav 11, karakterisert ved at den er en pattedyrcelle.

13. Vertscelle ifølge krav 12, karakterisert ved at den er kinesisk hamsterovarie (CHO)-celle.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en vertscelle omfattende nukleinsyren som koder for antistoffet ifølge ethvert av kravene 1 til 4, slik at nukleinsyren uttrykkes, og antistoffet produseres.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den videre omfatter utvinning av antistoffet fra vertscellekulturen.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at antistoffet utvinnes fra vertscellekulturmediet.

17. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 14 til 16, karakterisert ved at vertcellen er en kinesisk hamsterovarie (CHO)-celle.

18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 14 til 17, karakterisert ved at den videre omfatter blanding av det utvunnede antistoff med en farmasøytisk akseptabel bærer, eksipiens eller stabilisator for å fremstille en farmasøytisk formulering omfattende antistoffet.