NO179410B

NO179410B - Analogous methods for the preparation of therapeutically active monobenzophyrins and their use

Info

Publication number: NO179410B
Application number: NO900731A
Authority: NO
Inventors: Julia G Levy; David Dolphin; Jack K Chow; Ethan Sternberg
Original assignee: Univ British Columbia
Priority date: 1989-07-17
Filing date: 1990-02-15
Publication date: 1996-06-24
Also published as: NO900731L; NO900731D0; NO179410C

Abstract

En gruppe ned hydro-monobenzoporfyrlner "grønne porfyrlner" (Gp) som har abeorbejonsmakslmum 1 området 670-780 nm er nyttig 1 behandlingen av forstyrrelser eller forhold som er utsatt for hematoporfyrlnderlvat-behandllng (HPD) 1 nærvar av lys, eller 1 behandling av virus, celler og vev generelt for å ødelegge uønskede mål. Anvendelsen av Gp fra oppfinnelsen tillater at bestrålingen benytter bølgelengder som er andre enn de som absorberes av blod. Gp fra oppfinnelsen kan ogå være konjugert til ligander som er spesifikke for reseptor eller til spesifikke lmmunoglobullner eller fragmenter derav til målepeslfIkke vev eller celler for strålebehandling. Anvendelse av disse materialene tillater at laver medlkamentnlvåer blir anvendt, og forhindrer således sldereaksjoner som kan ødelegge normalt vev.A group of hydro-monobenzoporphyryls "green porphyrins" (Gp) having an absorption maximum in the range of 670-780 nm is useful in the treatment of disorders or conditions which are subject to hematoporphyrin derivative treatment (HPD) in the presence of light, or in the treatment of viruses. , cells and tissues in general to destroy unwanted targets. The use of Gp from the invention allows the irradiation to use wavelengths other than those absorbed by blood. Gp of the invention may also be conjugated to ligands specific for receptor or to specific immunoglobulins or fragments thereof to metastatic tissue or cells for radiation therapy. The use of these materials allows the use of low-density fabrics, thus preventing slippery reactions that can destroy normal tissue.

Description

Oppfinnelsen vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive monobenzofyriner og anvendelse av lysabsorberende forbindelser, for å formidle destruksjon av uønskede celler eller vev eller andre uønskede materialer ved bestråling. Oppfinnelsen vedrører spesielt anvendelse av hydro-monobenzoporfyrinderivater som har absorbsjonsmaksimum i området 670-780 nm for å formidle bestrålingen av materialet som skal bli nedbrutt, og anvendelsen av disse forbindelsene konjugert til målspesifikke ligander, slike reseptorspesifikke ligander eller immunoglobuliner eller deres immunospesifikke fragmenter, for å fokusere effektene av bestråling på spesielle mål. The invention relates to an analogue method for the production of therapeutically active monobenzophyrins and the use of light-absorbing compounds, to mediate the destruction of unwanted cells or tissues or other unwanted materials by irradiation. The invention relates in particular to the use of hydro-monobenzoporphyrin derivatives which have an absorption maximum in the range 670-780 nm to mediate the irradiation of the material to be degraded, and the use of these compounds conjugated to target-specific ligands, such receptor-specific ligands or immunoglobulins or their immunospecific fragments, in order to focus the effects of irradiation on particular targets.

Anvendelse av hematoporfyrin og dens acetylerte derivatblan-ding hematoporfyrinderivat (HPD) systematisk, kombinert med bestråling for påvising og behandling av ondartede celler har en betydelig historie. HPD er en blanding av porfyriner som innbefatter hematoporfyrin selv, hydroksyetylvinyldeuteropor-fyrin, protoporfyrin og dihematoporfyrinetere. (Se f.eks. "Porphyrin Photosensitization", Kessel, D. , et al., eds. The use of hematoporphyrin and its acetylated derivative mixture hematoporphyrin derivative (HPD) systematically, combined with irradiation for the detection and treatment of malignant cells has a significant history. HPD is a mixture of porphyrins that includes hematoporphyrin itself, hydroxyethylvinyl deuteroporphyrin, protoporphyrin and dihematoporphyrin ethers. (See, e.g., "Porphyrin Photosensitization", Kessel, D., et al., eds.

(1983) Plenum Press.) (1983) Plenum Press.)

HPD synes "naturlig" å ha evnen til lokalisering i ondartede celler. Når den blir bestrålt, har den to egenskaper som gjør den nyttig. For det første, når den blir bestrålt med ultrafiolett eller synlig lys, har den evnen til å fluori-sere, og således er den nyttige i diagnostiske metoder som er knyttet til påvisning av ondartethet (se f.eks. Kessel, et al (supra); Gregory, H.B. Jr., et al., Ann Surg (1968) 167:827-829). Mer betydningsfullt for foreliggende oppfinnelse er kapasiteten til HPD; når den blir bestrålt med synlig lys viser HDD en cytotoksisk effekt på cellene der den er lokalisert (se f.eks. Diamond, I., et al., Lancet (1972) 2:1175-1177; Dougherty, T.J., et al., Cancer Research (1978) 38:2628-2635; Dougherty, T.J., et al., "The Science of Photo Medicine: (1982) J.D. Regan & J.A. Parrish, eds., sidene 625-638; Dougherty, T.J., et al., "Cancer: Priniciples and Practice of Oncology" (1982) V.T. DeVita Jr., et al., eds., sidene 1836-1844). Selv om det ikke definitivt er fastslått, synes effekten av HPD i drepeceller å være forårsaket av dannelse av singlett oksygen ved bestråling (Weishaupt, K.R., et al., Cancer Research (1976) 36:2326-2329). Flere mekanismer for denne effekten er blitt foreslått, og det er nylig blitt vist at den aktive bestanddelen i HPD som formidler den cytotoksiske effekten av synlig lysbestråling er blandingen av hematoporfyrinetere (DHE) (Dougherty, T.J., et al., "Porphyrin Localization and Treatment of Tumors" HPD appears to "naturally" have the ability to localize in malignant cells. When irradiated, it has two properties that make it useful. First, when irradiated with ultraviolet or visible light, it has the ability to fluoresce, and thus is useful in diagnostic methods related to the detection of malignancy (see, e.g., Kessel, et al (supra ); Gregory, H. B. Jr., et al., Ann Surg (1968) 167:827-829). More significant to the present invention is the capacity of the HPD; when irradiated with visible light, HDD exhibits a cytotoxic effect on the cells in which it is localized (see, e.g., Diamond, I., et al., Lancet (1972) 2:1175-1177; Dougherty, T.J., et al. , Cancer Research (1978) 38:2628-2635; Dougherty, T.J., et al., "The Science of Photo Medicine: (1982) J.D. Regan & J.A. Parrish, eds., pages 625-638; Dougherty, T.J., et al. ., "Cancer: Principles and Practice of Oncology" (1982) V.T. DeVita Jr., et al., eds., pages 1836-1844).Although not definitively established, the effect of HPD in killer cells appears to be caused by formation of singlet oxygen upon irradiation (Weishaupt, K.R., et al., Cancer Research (1976) 36:2326-2329). Several mechanisms for this effect have been proposed, and it has recently been shown that the active ingredient in HPD which mediates the cytotoxic effect of visible light irradiation is the mixture of hematoporphyrin ethers (DHE) (Dougherty, T.J., et al., "Porphyrin Localization and Treatment of Tumors"

(1984) sidene 301-314; Dougherty, T.J., CRC Critical Eeviews in Oncology/Hematology (1984) 2:83-116). (1984) pages 301-314; Dougherty, T.J., CRC Critical Eeviews in Oncology/Hematology (1984) 2:83-116).

En renset form av den aktive bestanddel (ene) av HPD blir oppnådd ved justering av pH slik at det forårsaker oppsamling og utvinning av aggregatet som beskrevet i U.S. patent 4,649,151. Den rensede formen som kalles DHE i patentet blir forhandlet under varemerket Photofrin II og har blitt anvendt på en måte som er fullstendig analog til HPD. A purified form of the active ingredient(s) of HPD is obtained by adjusting the pH to cause collection and recovery of the aggregate as described in U.S. Pat. patent 4,649,151. The purified form called DHE in the patent is marketed under the trade name Photofrin II and has been used in a manner completely analogous to HPD.

I tillegg til in vivo-terapeutiske metoder og diagnostiske protokoller for tumorer som beskrevet i det ovenfor siterte patentet, kan porfyriner innbefattet HPD og dens mer rensede derivater bli anvendt i andre in vivo- og in vitro-anvendel-ser. F.eks. er lyssensibilisatorer nyttige i påvisning og behandling av aterosklerotiske plak som beskrevet i U.S. patent nr. 4,512,762 og 4,577,636. U.S. patent nr. 4,500,507 og 4,485,806 beskriver anvendelse av radiomerkede porfyrinforbindelser, innbefattet HPD til tumoravbilding. U.S. patent nr. 4,753,958 til University of California beskriver bruken av topisk anvendelse av porfyrinsensibilisatorer til diagnose og behandling av hudsykdommer. U.S. patent nr. 4,748,120 beskriver anvendelse av lyssensibilisatorer i behandling av fullblod eller blodkomponenter. Fotokjemisk dekontaminasjonsbehandling av blod og komponenter er også beskrevet i U.S. patent nr, 4,727,027 der lyssensibilisator-ene er furukumarin og dens derivater. I tillegg, blir virus inaktivert i terapeutiskk proteinsammensetninger in vitro som beskrevet i U.S. patent nr. 4,268,947. In addition to in vivo therapeutic methods and diagnostic protocols for tumors as described in the above cited patent, porphyrins including HPD and its more purified derivatives can be used in other in vivo and in vitro applications. E.g. are photosensitizers useful in the detection and treatment of atherosclerotic plaques as described in U.S. Pat. Patent Nos. 4,512,762 and 4,577,636. U.S. Patent Nos. 4,500,507 and 4,485,806 describe the use of radiolabeled porphyrin compounds, including HPD, for tumor imaging. U.S. Patent No. 4,753,958 to the University of California describes the use of topical application of porphyrin sensitizers in the diagnosis and treatment of skin diseases. U.S. patent no. 4,748,120 describes the use of photosensitizers in the treatment of whole blood or blood components. Photochemical decontamination treatment of blood and components is also described in U.S. Pat. patent no, 4,727,027 where the photosensitizers are furucoumarin and its derivatives. In addition, viruses are inactivated in therapeutic protein compositions in vitro as described in U.S. Pat. Patent No. 4,268,947.

Selv om behandling av tumorer og andre uønskede mål med HPD hygger på den indre evnen til HPD å lokalisere i ondartede celler, har en betydlig forbedring og forfining i spesifisiteten blitt oppnådd ved konjugering av hematoporfyrin til tumorspesifikke antistoffer. F.eks. når hematoporfyrin ble koblet til monoklonale antistoffer rettet mot en murin myosarcomacellelinje Ml, resulterte administrering av anti-Ml hematoporfyrin-konjugater mot tumorbærende dyr etterfulgt av eksponering til klartskinnende lys, i undertrykking av Ml-vekst (Mew, D., et al., J. Immunol. (1983) 130:1473-1477). I ytterligere arbeid ble hematoporfyrin konjugert til et monoklonalt antistoff som var spesifikt mot et antigen assosiert med en human leukemi (CAMAL) og konjugatene viste seg å formidle strålingsindusert dreping av de leukemiske cellene spesifikt, in vitro (Mew, D., et al., Cancer Research Although treatment of tumors and other unwanted targets with HPD relies on the intrinsic ability of HPD to localize to malignant cells, a significant improvement and refinement in specificity has been achieved by conjugation of hematoporphyrin to tumor-specific antibodies. E.g. when hematoporphyrin was coupled to monoclonal antibodies directed against a murine myosarcoma cell line M1, administration of anti-M1 hematoporphyrin conjugates to tumor-bearing animals followed by exposure to bright light resulted in suppression of M1 growth (Mew, D., et al., J (Immunol. (1983) 130:1473-1477). In further work, hematoporphyrin was conjugated to a monoclonal antibody specific to an antigen associated with a human leukemia (CAMAL) and the conjugates were shown to mediate radiation-induced killing of the leukemic cells specifically, in vitro (Mew, D., et al., Cancer Research

(1985) 45:4380-4386). Konjugering av den beslektede forbindelsen klorin e^ til anti-T-celle Mab har også blitt rapportert (Oseroff, A.R., et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1985) 45:4380-4386). Conjugation of the related compound chlorin e^ to anti-T cell Mab has also been reported (Oseroff, A.R., et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1986) 83:8744-8748). (1986) 83:8744-8748).

Selv om konjugasjonen av hematoporfyrin til immunoglobuliner som er spesifikke for målceller bedrer evnen til hematoporfyrin å finne fram til de ønskede cellene eller vevet, løser dette fremdeles ikke et annet problem som er avhengig av denne generelle terapeutiske tilnærmelsen, nemlig at bølgelengden for stråling som er nødvendig for å aktivere hematoporfyrin eller HPD, som er i området 630 nm, også er en energi som raskt absorberes av porfyriner og andre naturlige kromoforer i blodet og annet vev. Derfor må relativt store mengder hematoporfyrin eller HPD bli administrert og det resulterer ofte i overfølsomhet hos pasienten for lys generelt. Det vil være ønskelig å administrere forbindelser for å formidle effektene av bestråling i en lavere mengde, og således unngå problemene med hypersensitivitet som utvises uspesifikt i den aktuelle organismen. Aktiviteten til visse av de forbindelsene er beskrevet i en artikkel av Richter, A.M., et al., i J. Nati. Cancer Inst. (1987) 79:1327-1332, sendt til utgiverne 19. januar 1988. Although the conjugation of hematoporphyrin to immunoglobulins specific for target cells improves the ability of the hematoporphyrin to locate to the desired cells or tissue, this still does not solve another problem dependent on this general therapeutic approach, namely that the wavelength of radiation required to activate hematoporphyrin or HPD, which is in the 630 nm range, is also an energy that is rapidly absorbed by porphyrins and other natural chromophores in the blood and other tissues. Therefore, relatively large amounts of hematoporphyrin or HPD must be administered and this often results in hypersensitivity of the patient to light in general. It would be desirable to administer compounds to mediate the effects of irradiation in a lower amount, thus avoiding the problems of hypersensitivity exhibited non-specifically in the organism in question. The activity of certain of those compounds is described in an article by Richter, A.M., et al., in J. Nat. Cancer Inst. (1987) 79:1327-1332, sent to the publishers on 19 January 1988.

Oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv monobenzoporfyrin (Gp) med formel The invention relates to an analogue method for the production of therapeutically active monobenzoporphyrin (Gp) with formula

der hver R<1> og R^ uavhengig av hverandre er karbalkoksy (2-6C); en av gruppene R<3> er -CH2CH2COOH eller et salt derav og den andre gruppen R<3> er -CH2CH2COOR der R er alkyl (1-6C) og R<4 >er vinyl, eventuelt konjugert med et antistoff lg der lg er oppnådd fra et preparat av monoklonale antistoffer eller en ligand, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter delvis hydrolysering av en hydromonobenzoporfyrindiester med formel: wherein each R<1> and R^ independently of one another is (2-6C)carbaloxy; one of the groups R<3> is -CH2CH2COOH or a salt thereof and the other group R<3> is -CH2CH2COOR where R is alkyl (1-6C) and R<4> is vinyl, possibly conjugated with an antibody lg where lg is obtained from a preparation of monoclonal antibodies or a ligand, characterized in that the method comprises partial hydrolysis of a hydromonobenzoporphyrin diester of formula:

der R<1>, R^ og R<4> er som definert foran og begge gruppene R<3>' er -CH2CH2COOR der R er alkyl (1-6C). where R<1>, R^ and R<4> are as defined above and both groups R<3>' are -CH2CH2COOR where R is alkyl (1-6C).

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av forbindelsene og/eller konjugatene til en in vitro metode for å påvise, lyssensitere, ødelegge eller svekke fungering av målbiologisk materiale. The invention further relates to the use of the compounds and/or conjugates for an in vitro method for detecting, photosensitizing, destroying or impairing the functioning of target biological material.

Oppfinnelsen frembringer lysabsorberende forbindelser som evnen til å vise lys-formidlet cytotoksiske og diagnotiske effekter. I tillegg til deres in vitro-anvendelse kan disse forbindelsene bli administrert in vivo i relativt lave doser p.g.a. deres evne til å absorbere stråling som har energiom-råde på utsiden av det som normalt absorberes av komponentene som er tilstede i høye konsentrasjoner i blodet og annet vev, særlig porfyrinrester som normalt er assosiert med hemoglobin og myoglobin. Derfor, ved å fremskaffe disse modifiserte porfyrinene til in vitro-behandling ved lavere konsentrasjoner, blir hypersensitivitet til ikke-målrettet vev redusert, og strålebehandlingen kan bli utført ved en bølgelengde som de naturlige kromoforene ikke konkurrerer om fotonene med de aktive forbindelsene, og dette resulter i større inntrengingsdybde for lyset. Lignende fordeler tilfaller in vitro-behandlig av fargede materialer, slik som blodprøver. The invention provides light-absorbing compounds capable of exhibiting light-mediated cytotoxic and diagnostic effects. In addition to their in vitro use, these compounds can be administered in vivo at relatively low doses due to their ability to absorb radiation that has an energy range outside that normally absorbed by the components present in high concentrations in the blood and other tissues, particularly porphyrin residues normally associated with hemoglobin and myoglobin. Therefore, by providing these modified porphyrins for in vitro treatment at lower concentrations, hypersensitivity to non-targeted tissues is reduced and the radiotherapy can be performed at a wavelength at which the natural chromophores do not compete for the photons with the active compounds, resulting in in greater penetration depth for the light. Similar advantages accrue to the in vitro treatment of colored materials, such as blood samples.

Disse lysaktive forbindelsene er modifiserte porfyriner som i kraft av deres derivatisering undergår et skifte i absorbsjonsmaksimum slik at de synes grønne heller enn rød, og det indikerer deres absorbsjon av bølgelengde i det rødorange området. Denne samling av derivater har derfor fått kallenavnet "grønne porfyriner" (Gp) og har vist å gi sensitivitet på målceller ved konsentrasjoner som er mer enn 10 ganger lavere enn de som er nødvendig for hematoporfyrin (Hp) eller HPD. These light-active compounds are modified porphyrins which, by virtue of their derivatization, undergo a shift in absorption maximum so that they appear green rather than red, and this indicates their absorption of wavelengths in the red-orange range. This collection of derivatives has therefore been nicknamed "green porphyrins" (Gp) and has been shown to sensitize target cells at concentrations more than 10 times lower than those required for hematoporphyrin (Hp) or HPD.

Gp blir utvalgt fra en gruppe av porfyrinderivater oppnådd ved å anvende Diels-Alder reaksjoner av acetylenderivater med profoporfyrin under forhold som påvirker en reaksjon ved bare en av de to tilgjengelig konjugerte, ikke-aromatiske dienstrukturer som er tilstede i protoporfyrin-IX ringsys-temet (ring A og B). Formelene vist i fig. 1 representerer grønne porfyriner. Av hensiktsmessige grunner blir også en forkortelse for begrepet hydro-monobenzoporfyrinderivat--"BPD"-- generelt anvendt for å referere til forbindelser med formelene 3 og 4 i fig. 1, ved at disse er foretrukne former av Gp. Gp is selected from a group of porphyrin derivatives obtained by applying Diels-Alder reactions of acetylene derivatives with profoporphyrin under conditions that affect a reaction at only one of the two available conjugated, non-aromatic diene structures present in the protoporphyrin-IX ring system ( call A and B). The formulas shown in fig. 1 represents green porphyrins. For expedient reasons, an abbreviation for the term hydro-monobenzoporphyrin derivative--"BPD"--is also generally used to refer to compounds of formulas 3 and 4 in fig. 1, in that these are preferred forms of Gp.

Videre, kan de dimeriske formene av Gp bli frembragt, og således forsterke evnen til Gp-forbindelsen å absorbere lys på en per mol basis. Dimeriske og multimeriske former av Gp/porfyrinkombinasjoner kan også bli benyttet, og dette frembringer ytterligere absorbsjonsbølgelengder. Furthermore, the dimeric forms of Gp can be produced, thus enhancing the ability of the Gp compound to absorb light on a per mole basis. Dimeric and multimeric forms of Gp/porphyrin combinations can also be used, and this produces additional absorption wavelengths.

I tillegg, kan de modifiserte porfyrinene (referert til som "grønne porfyriner" eller "Gp") fra oppfinnelsen bli konjugert til spesifikke ligander som er reaktive med et mål, slik som reseptorspesifikke ligander eller immunoglobuliner eller immunospesifikke deler av immunoglobuliner, og det tillater at de blir mer konsentrerte i ønsket målvev eller substanser. Denne konjugasjonen tillater ytterligere senking av det nødvendige dosenivå siden materialet ikke blir sløst bort i fordeling i annet vev hvis ødeleggelse, som er meget uønsket, må bli unngått. In addition, the modified porphyrins (referred to as "green porphyrins" or "Gp") of the invention can be conjugated to specific ligands reactive with a target, such as receptor-specific ligands or immunoglobulins or immunospecific portions of immunoglobulins, allowing the they become more concentrated in the desired target tissue or substances. This conjugation allows further lowering of the required dose level since the material is not wasted in distribution in other tissues whose destruction, which is highly undesirable, must be avoided.

Et trekk ved oppfinnelsen vedrører således fremgangsmåter for lokalisering eller utføring av cytotoksisitet, dvs. lysfølsomhet med hensyn på målmaterialer ved å anvende hydro-monobenzoporfyriner fra oppfinnelsen enten alene eller som konjugater. Hydro-monobenzoporfyrinene er grønne porfyriner (Gp) som vist i fig. 1 og er lokalisert spesifikt in vivo til visse målvev, der deres tilstedeværelse kan bli påvist ved fluorescens eller ved andre anordninger når Gp er frembragt med ytterligere eller alternativ merking. Som angitt over, kan spesifisiteten til Gp bli ytterligere økt ved konjugering til ligander som er spesifikke for målet. I tillegg, når Gp blir bestrålt in situ ved å anvende lys i området 670-780 nm, resulterer lysaktiveringen i cytotoksisitet til det omgivende vevet. Celler som Gp normalt er tiltrukket til innbefatter tumorceller og neoplastiske celler generelt, såvelt som bakterier og annet sykelig vev. Figur 1 viser strukturen til grønne porfyrinforbindelser (Gp) som ble anvendt i fremgangsmåtene og konjugatene i oppfinnelsen . Figur 2 viser strukturen av to foretrukne former av hydro-monobenzoporfyrinderivat med formlene 3 og 4 (BPD). Figur 4 viser resultatene av hudfølsomhetsanalyse ved å anvende en BPD-forbindelse. A feature of the invention thus relates to methods for localizing or performing cytotoxicity, i.e. photosensitivity with regard to target materials by using hydro-monobenzoporphyrins from the invention either alone or as conjugates. The hydro-monobenzoporphyrins are green porphyrins (Gp) as shown in fig. 1 and are localized specifically in vivo to certain target tissues, where their presence can be detected by fluorescence or by other devices when Gp is produced with additional or alternative labeling. As indicated above, the specificity of Gp can be further increased by conjugation to ligands specific for the target. Additionally, when Gp is irradiated in situ using light in the 670-780 nm range, the light activation results in cytotoxicity to the surrounding tissue. Cells to which Gp is normally attracted include tumor cells and neoplastic cells in general, as well as bacteria and other diseased tissue. Figure 1 shows the structure of green porphyrin compounds (Gp) which were used in the methods and conjugates of the invention. Figure 2 shows the structure of two preferred forms of hydro-monobenzoporphyrin derivative of formulas 3 and 4 (BPD). Figure 4 shows the results of skin sensitivity analysis using a BPD compound.

Alle forbindelsene som blir fremstilt ifølge oppfinnelsen benytter som lysabsorberende forbindelse et derivat av protoporfyrinringsystemet som har et lysabsorbsjonsmaksimum i området 670-780 nm. All the compounds produced according to the invention use as light-absorbing compound a derivative of the protoporphyrin ring system which has a light absorption maximum in the range 670-780 nm.

Generelt blir dette skiftet oppnådd ved å effektivt mette en av de to rr-bindingene i en, men ikke to, av de fire pyrrol-ringene som utgjør det typiske porfyrinsystemet. I protoporfyrin-IX er to av pyrrolene som inneholder vinylsubstitu-sjoner slik at den eksocykliske n-bindingen er konjugert til en av de to n-bindingene i ringen. En Diels-Alder-reaksjon innbefatter en av disse konjugatsystemene med en acetylende-rivatdienofil og resulterer i en sammensmeltet cykloheksadien - referert til heretter som "hydrobenzo" - sammensmeltet til A-eller B-ringen. Rearrangement av n-systemet i heksadien-ringen resulterer i forbindelsene med formel 3 og 4. Disse forbindelsene frembringer det ønskede skifte i absorbsjonsmaksimum. In general, this shift is achieved by effectively saturating one of the two rr bonds in one, but not two, of the four pyrrole rings that make up the typical porphyrin system. In protoporphyrin-IX, two of the pyrroles contain vinyl substitutions so that the exocyclic n-bond is conjugated to one of the two n-bonds in the ring. A Diels-Alder reaction involves one of these conjugate systems with an acetylene derivative dienophile and results in a fused cyclohexadiene - hereinafter referred to as "hydrobenzo" - fused to the A or B ring. Rearrangement of the n-system in the hexadiene ring results in the compounds of formulas 3 and 4. These compounds produce the desired shift in absorption maximum.

Spesifikk fremstilling av noen forbindelser som er nyttige i oppfinnelsen eller deres forløper er beskrevet av Morgan, A.R., et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1984) sidene 1047-1048; og av Pangka, B.S., et al., J. Organic Chem. (1986) 51:1094. Som beskrevet i disse publikasjonene er det tidligere blitt rapportert at protoporfyrin-IX dimetylester, når den blir reagert med sterk Diels-Alder-dienofilreagenser slik som tetracyanoetylen, blir derivatisert til hydro-dibenzoderivater. Som man kan se fra disse referansene, er det imidlertid klart at når acetylen blir derivatisert med mer svake elektrontiltrekkende grupper og anvent som et Diels-Alder-reagens, blir hydro-monobenzoderivater dannet. Specific preparation of some compounds useful in the invention or their precursors is described by Morgan, A.R., et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1984) pages 1047-1048; and by Pangka, B.S., et al., J. Organic Chem. (1986) 51:1094. As described in these publications, it has previously been reported that protoporphyrin-IX dimethyl ester, when reacted with strong Diels-Alder dienophile reagents such as tetracyanoethylene, is derivatized to hydro-dibenzo derivatives. However, as can be seen from these references, it is clear that when acetylene is derivatized with weaker electron-withdrawing groups and used as a Diels-Alder reagent, hydro-monobenzo derivatives are formed.

De beskrevne substituentene i Morgan- og Pangka-referansene for acetylen-avledede dienofil innbefatter fenylsulfonyl-dvs. SOgPh, enten som en enkel substituent som beskrevet i de foregående referansene (p-fenylsulfonylpropiat) eller, formodentlig, der begge R<1> og R^ er sulfonylderivater. Generelt er R<*> og R^ hver uavhengig av hverandre moderate elektrontiltrekkende substituenter, og er mest vanlig karbalkoksy eller alkyl eller arylsulfonyl, eller en hvilken som helst annen aktiverende substituent som ikke er tilstrekkelig elektron-tiltrekkende til at det resulterer i reaksjon med både A og B-ringene, enn en reaksjon bare med en, slik som cyano eller -CONR^CO- der R^ er aryl eller alkyl. En av R<*> og R^ kan valgfritt være B mens den andre er en elektron-tiltrekkende substituent med tilstrekkelig styrke til å forenkle Diels-Alder-reaksjonen. The substituents described in the Morgan and Pangka references for acetylene-derived dienophiles include phenylsulfonyl—i.e. SOgPh, either as a single substituent as described in the preceding references (p-phenylsulfonyl propiate) or, presumably, where both R<1> and R^ are sulfonyl derivatives. In general, R<*> and R^ are each independently moderate electron-withdrawing substituents, and are most commonly carbolicoxy or alkyl or arylsulfonyl, or any other activating substituent which is not sufficiently electron-withdrawing to result in reaction with both the A and B rings, than a reaction with only one, such as cyano or -CONR^CO- where R^ is aryl or alkyl. One of R<*> and R^ can optionally be B while the other is an electron-withdrawing substituent of sufficient strength to facilitate the Diels-Alder reaction.

Karboksy er, når det blir brukt her, definert på konvensjonell måte, -C00H og karbalkoksy er -C00R, der R er alkyl; karboksyalkyl refererer til substituenten -R'-C00H der R' er alkylen; karbalkoksyalkyl refererer til -R'-C00R der R' og R er hhv. alkylen og alkyl. Alkyl er en mettet rett eller forgrenet kjedehydrokarbyl med 1-6 karbonatomer slik som metyl, n-heksyl, 2-metylfenyl, t-butyl, n-propyl, osv. Alkylen er en alkyl med unntagelse av at gruppen er toverdig. Aryl eller alkylsulfonyldelene har formelen SO2R der R er alkyl som ovenfor definert, eller er aryl, der aryl er fenyl valgfritt substituert med 1-3 substituenter uavhengig av hverandre valgt blant halogener (fluor, klor, brom eller jod), laverealkyl (1-4C) eller laverealkoksy (1-4C). I tillegg, kan en eller begge R<1> og R<2> selv være aryl - dvs. fenyl valgfritt substituert som definert over. Carboxy, as used herein, is conventionally defined as -C00H and caralkyloxy is -C00R, where R is alkyl; carboxyalkyl refers to the substituent -R'-COOH where R' is alkylene; carbalkoxyalkyl refers to -R'-C00R where R' and R are respectively alkylene and alkyl. Alkyl is a saturated straight or branched chain hydrocarbyl with 1-6 carbon atoms such as methyl, n-hexyl, 2-methylphenyl, t-butyl, n-propyl, etc. The alkylene is an alkyl with the exception that the group is divalent. The aryl or alkylsulfonyl parts have the formula SO2R where R is alkyl as defined above, or is aryl, where aryl is phenyl optionally substituted with 1-3 substituents independently of one another selected from halogens (fluorine, chlorine, bromine or iodine), lower alkyl (1-4C ) or lower alkoxy (1-4C). In addition, one or both of R<1> and R<2> may themselves be aryl - ie phenyl optionally substituted as defined above.

R<3> i protoporfyrin-IX er 2-karboksyetyl (-CH2CH2C00H). R<3>'s natur (dersom den ikke inneholder en n-binding konjugert til ring n-bindingen) er ordinært ikke relevant for utviklingen av Diels-Alder-reaksjonen eller til effektiviteten og absorbsjonsspektrumet til det resulterende produktet. R<3> kan således f.eks. være laverealkyl (1-4C), eller o-karboksyalkyl (2-6C) eller estere eller amider av disse. R<3->substituenten kan også være substituert med halogen som definert over, eller med andre ikke-reaktive substituenter. Som hensiktsmessige utgangsmaterialer for Gp-forbindelsene i oppfinnelsen er imidlertid de naturlig forekommende porfyriner og substituenter for R<3> er CH2CH2C00H eller CH2CHR2-COOR, der R er alkyl (1-6C). R<3> in protoporphyrin-IX is 2-carboxyethyl (-CH2CH2C00H). The nature of R<3> (if it does not contain an n-bond conjugated to the ring n-bond) is ordinarily not relevant to the progress of the Diels-Alder reaction or to the efficiency and absorption spectrum of the resulting product. R<3> can thus e.g. be lower alkyl (1-4C), or o-carboxyalkyl (2-6C) or esters or amides thereof. The R<3->substituent can also be substituted with halogen as defined above, or with other non-reactive substituents. Suitable starting materials for the Gp compounds in the invention are, however, the naturally occurring porphyrins and substituents for R<3> are CH2CH2C00H or CH2CHR2-COOR, where R is alkyl (1-6C).

Det må bemerkes at, selv om R<3->substituentens natur ikke ordinært påvirker forløpet av Diels-Alder-reaksjonen ved å endre naturen til diensubstratet, kan derivatisering være nødvendig for å fremme reaksjonen ved å fremskaffe hensiktsmessig oppløslighetskaraktertrekk eller å forhindre forstyrrelse med reaksjonen. Således utnytter Diels-Alder-reaksjonene beskrevet av Morgan et al. og ved Pangka et al. dimetylesteren til protoporfyrin-IX som et substrat for å hindre forstyrrelse med reaksjonen ved den frie karbok-sylgruppen og for å frembringe hensiktsmessige oppløslighets-karaktertrekk. It should be noted that, although the nature of the R<3->substituent does not ordinarily affect the course of the Diels-Alder reaction by changing the nature of the diene substrate, derivatization may be necessary to promote the reaction by providing appropriate solubility characteristics or to prevent interference with the reaction . Thus, utilizing the Diels-Alder reactions described by Morgan et al. and by Pangka et al. the dimethyl ester of protoporphyrin-IX as a substrate to prevent interference with the reaction at the free carboxyl group and to produce appropriate solubility characteristics.

I BPD-forbindelsene i oppfinnelsen har det blitt funnet fordelaktig å hydrolysere eller delvis hydrolysere den forestrede karboksygruppen i -CH2CH2COOR. Hydrolysen forekommer ved mye høyere hastighet enn den til estergruppene i R<1>, R<2>, og oppløslighetskaraktertrekkene til de resulterende forbindelsene er mer ønskelig enn de i uhydrolysert form. Hydrolyse resulterer i dlazid- eller monoazid-produkter (eller deres salter). In the BPD compounds of the invention, it has been found advantageous to hydrolyze or partially hydrolyze the esterified carboxyl group in -CH2CH2COOR. The hydrolysis occurs at a much higher rate than that of the ester groups in R<1>, R<2>, and the solubility characteristics of the resulting compounds are more desirable than those in unhydrolyzed form. Hydrolysis results in dlazide or monoazide products (or their salts).

Hydro-monobenzoporfyriner som direkte resulterer fra Diels-Alder-reaksjonen beskrevet i de siterte referansene, kan også bli isomerisert som beskrevet der (se Morgan et al. og Pangka et al. (over)) til forbindelser med formelene vist som 3 og 4 i figur 1 ved behandling med passende reagenser slik som trietylamin (TEA) i metylenklorid eller 1,5-diazabicyklo-[5,4,0]undek-5-ene (DBU). Stereokjemien til produktet blir bestemt ved valg av reagensmiddel. The hydro-monobenzoporphyrins directly resulting from the Diels-Alder reaction described in the cited references can also be isomerized as described therein (see Morgan et al. and Pangka et al. (above)) to compounds of the formulas shown as 3 and 4 in Figure 1 by treatment with appropriate reagents such as triethylamine (TEA) in methylene chloride or 1,5-diazabicyclo-[5,4,0]undec-5-ene (DBU). The stereochemistry of the product is determined by the choice of reagent.

Skissene av forbindelsene 3 og 4 i figur 1 viser ikke den relative posisjonen til den eksocykliske metylgruppen (ring A i formel 3 og ring B i formel 4). Det har blitt funnet at rearrangement ved å anvende TEA gir cis-geometri for den vinklede metylgruppen og R<2>, mens behandling med DBU resulterer i trans-produktet. Dette cis-produktet ér tydelig kinetisk regulert, siden behandling av cis-produktet med DBU resulterer i et ytterligere rearrangement til transstereo-kjemi. Således viser formelene 3 og 4 i figur 1 de rearrangerte produktene generisk, fra enten TEA- eller DBU-kataly-serte rearrangement i hhv. ring A og B. The sketches of compounds 3 and 4 in Figure 1 do not show the relative position of the exocyclic methyl group (ring A in formula 3 and ring B in formula 4). It has been found that rearrangement using TEA gives cis geometry for the angled methyl group and R<2>, while treatment with DBU results in the trans product. This cis product is clearly kinetically regulated, since treatment of the cis product with DBU results in a further rearrangement to trans stereochemistry. Thus formulas 3 and 4 in Figure 1 show the rearranged products generically, from either TEA- or DBU-catalyzed rearrangement in, respectively. call A and B.

Forbindelsene med formelene 3 og 4 (BPD), og særlig de som har hydrolyserte eller særlig hydrolyserte karbalkoksygrupper i R<3> er mest foretrukket. Forbindelser i oppfinnelsen som inneholder -COOH kan bli fremstilt som den frie syre eller i form av salter med organiske eller uorganiske baser. The compounds with the formulas 3 and 4 (BPD), and in particular those which have hydrolyzed or particularly hydrolyzed carbolic groups in R<3> are most preferred. Compounds in the invention containing -COOH can be prepared as the free acid or in the form of salts with organic or inorganic bases.

Det må bemerkes at forbindelsene i figur 1 inneholder minst et kiralt senter og derfor eksisterer som optiske isomere. Separasjon av blandinger med diastereomere kan bli gjennom-ført på en hvilken som helst konvensjonell måte; blandinger av enantiomere kan bli separert ved vanlige teknikker ved å reagere den med optisk aktive fremstillinger og separere de resulterende diastereomerene. It should be noted that the compounds in Figure 1 contain at least one chiral center and therefore exist as optical isomers. Separation of mixtures with diastereomers can be carried out in any conventional manner; mixtures of enantiomers can be separated by conventional techniques by reacting it with optically active preparations and separating the resulting diastereomers.

Det må videre bemerkes at reaksjonsproduktene kan være useparerte blandinger av A- og B-ringtilsetningen, f.eks. blandinger av formlene 3 og 4. En hver av de separerte formene - dvs. formlene 3 alene eller 4 alene, eller blandinger av et hvilket som helst forhold kan bli benyttet i fremgangsmåten. It must also be noted that the reaction products can be unseparated mixtures of the A and B ring addition, e.g. mixtures of formulas 3 and 4. Either of the separated forms - ie formulas 3 alone or 4 alone, or mixtures of any ratio may be used in the process.

Navnet "dihydro"-monobenzoporfyrin beskriver de direkte og rearrangementsproduktene fra Diels-Alder-reaksjonen av porfyrinringsystemet med R<1>C=C-R<2>. Hydro-monobenzoporfyrin blir anvendt generisk for å innbefatte alle tre klassene med oksyderingstilstand. Monobenzoporfyriner i seg selv er utenfor rekkevidden av oppfinnelsen ved at deres absorbsjonsmaksimum ikke faller innenfor det aktuelle området. The name "dihydro"-monobenzoporphyrin describes the direct and rearrangement products of the Diels-Alder reaction of the porphyrin ring system with R<1>C=C-R<2>. Hydro-monobenzoporphyrin is used generically to include all three oxidation state classes. Monobenzoporphyrins themselves are outside the scope of the invention in that their absorption maxima do not fall within the relevant range.

Figur 2 viser to særlig foretrukne forbindelser av oppfinnelsen som ikke har blitt tidligere beskrevet innenfor fagområdet. Disse forbindelsene er kollektivt betegnet benzoporfyrinderivat (BPD) ved at de er former av Gp som har formelene 3 eller 4. Disse er hydrolyserte eller delvis hydrolyserte former av de rearrangerte produktene med formelene 3 og 4, der en eller begge av de beskyttede karboksylgrupper til R<3> er hydrolysert. Estergruppen ved R<1 >og R<2> hydrolyserer relativt så langsomt at vanndanning til formene, vist i figur 2, er enkelt å gjennomføre. Figure 2 shows two particularly preferred compounds of the invention which have not previously been described in the field. These compounds are collectively termed benzoporphyrin derivative (BPD) in that they are forms of Gp having formulas 3 or 4. These are hydrolyzed or partially hydrolyzed forms of the rearranged products of formulas 3 and 4, where one or both of the protected carboxyl groups of R <3> is hydrolyzed. The ester group at R<1 >and R<2> hydrolyzes relatively so slowly that water formation to the forms, shown in Figure 2, is easy to carry out.

I denne beskrivelsen er R<3> lik -CH2CH2COOR<3>'. I BPD-MA og BPD-MB er R<1> og R<2> karbalkoksy, en R<3>, er E og den andre R<3>, er alkyl (1-6C). Forbindelsene med formlene BPD-MA og BPD-MB kan være homogene der bare C-ringens karbaloksyetyl eller bare D-ringens karbaloksyetyl er hydrolysert, eller blandinger av C- og D-ringsubstituenthydrolysatene. I tillegg kan blandinger av et hvilket som helst av to eller flere BPD-MA, eller -MB, bli benyttet i fremgangsmåten i oppfinnelsen. In this specification, R<3> equals -CH2CH2COOR<3>'. In BPD-MA and BPD-MB, R<1> and R<2> are carbaloxy, one R<3> is E and the other R<3> is alkyl (1-6C). The compounds of the formulas BPD-MA and BPD-MB can be homogeneous in which only the C-ring carbooxyethyl or only the D-ring carbooxyethyl is hydrolysed, or mixtures of the C- and D-ring substituent hydrolysates. In addition, mixtures of any two or more BPD-MA, or -MB, can be used in the method of the invention.

Som brukt her representerer "tetrapyrrol-typekjernen" et fireringsystem med skjelettet: As used herein, the "tetrapyrrole-type core" represents a four-ring system with the skeleton:

og et salt, ester, amid eller acylhydrazon derav, som er konjugert. Den Innbefatter porfyrlnsystemet, som er egentlig et fullstendig konjugert system, klorlnsystemet, som er egentlig en dlhydroform av porfyrin, og det reduserte klorlnsystemet som er en tetrahydroform av det fullstendig konjugerte systemet. Når "porfyrin" er spesifisert, indikerer det det fullstendig konjugerte systemet; Gp er egentlig en dlhydroform av porfyrlnsystemet. and a salt, ester, amide or acylhydrazone thereof, which is conjugated. It includes the porphyrin system, which is essentially a fully conjugated system, the chlorin system, which is essentially a dihydroform of porphyrin, and the reduced chlorin system, which is a tetrahydro form of the fully conjugated system. When "porphyrin" is specified, it indicates the fully conjugated system; Gp is actually a dlhydroform of the porphyrin system.

En gruppe forbindelser fra oppfinnelsen er de der substituenten R<4> innbefatter minst en ytterligere tetrapyrrol-type-kjerne. De resulterende forbindelsene er dimere eller oligomere, der minst en av tetrapyrrol-typeringsystemene er Gp. Bindinger mellom Gp-delen gjennom posisjonen til R<4> til en ytterligere tetrapyrrol-typeringsystem kan være gjennom en eter, amin eller vinylbinding. Ytterligere derivatisering i tilfelle med porfyrinringsystemene som har to tilgjengelige substituentposisjoner (i både A- og B-ringer) som korrespon-derer til R<4> kan også bli dannet, som ytterligere beskrevet under. A group of compounds from the invention are those where the substituent R<4> includes at least one further tetrapyrrole-type nucleus. The resulting compounds are dimers or oligomers, where at least one of the tetrapyrrole typing systems is Gp. Bonds between the Gp moiety through the position of R<4> to an additional tetrapyrrole typing system can be through an ether, amine or vinyl bond. Further derivatization in the case of the porphyrin ring systems having two available substituent positions (in both A and B rings) corresponding to R<4> can also be formed, as further described below.

Målspesifikke komponenter Target-specific components

Den målspesifikke komponenten kan f.eks. være et immunoglobu-lin eller en del av dette, eller en ligand som er spesifikk for reseptor. The target-specific component can e.g. be an immunoglobulin or part thereof, or a ligand specific for receptor.

Immunoglobulinkomponenten kan være en hvilken som helst av en lang rekke materialer. Den kan bli avledet fra polyklonale eller monoklonale antistoffremstillinger og kan inneholde hele antistoffer eller immunologisk reaktive fragmenter av disse antistoffene, slik som F(ab')2» Fab, eller Fab'-fragmenter. Anvendelse av slike immunologisk reaktive fragmenter som erstatter hele antistoffer er kjent innenfor fagområdet. Se f.eks. Spiegelberg, H.L., i "Immunoassays in the Clinical Laboratory" (1978) 3:1-23. The immunoglobulin component can be any of a wide variety of materials. It may be derived from polyclonal or monoclonal antibody preparations and may contain whole antibodies or immunologically reactive fragments of these antibodies, such as F(ab')2" Fab, or Fab' fragments. The use of such immunologically reactive fragments that replace entire antibodies is known within the field. See e.g. Spiegelberg, H.L., in "Immunoassays in the Clinical Laboratory" (1978) 3:1-23.

Polyklonalt anti-sera blir fremstilt på konvensjonelle måter ved å injisere et hensiktsmessig pattedyr med antigen som antistoffet er ønsket, analysere antistoffnivået i blodet mot antigenet, og fremstille antisera når ti terene er høye. Monoklonale antistoffpreparater kan også bli fremstilt konvensjonelt slik som ved fremgangsmåten til Koehler og Milstein ved å anvende perifere blodlymfocyter eller miltceller fra immuniserte dyr og ta livet av disse cellene enten ved viral infeksjon, ved sammensmelting med myelomer, eller ved andre konvensjonelle fremgangsmåter og screene fremstillingen av de ønskede antistoffene ved isolerte kolonier. Dannelse av fragmentene fra enten monoklonale eller polyklonale fremstillinger blir utført ved konvensjonelle anordninger som beskrevet av Spiegelberg, H.L. , ovenfor. Polyclonal antisera are prepared by conventional means by injecting an appropriate mammal with the antigen for which the antibody is desired, analyzing the level of antibody in the blood against the antigen, and preparing antisera when titers are high. Monoclonal antibody preparations can also be produced conventionally such as by the method of Koehler and Milstein by using peripheral blood lymphocytes or spleen cells from immunized animals and killing these cells either by viral infection, by fusion with myeloma, or by other conventional methods and screening the production of the desired antibodies by isolated colonies. Generation of the fragments from either monoclonal or polyclonal preparations is carried out by conventional means as described by Spiegelberg, H.L. , above.

Særlig nyttige antistoffer eksemplifisert her innbefatter monoklonal antistoffremstilling CAMAL-1 som kan bli fremstilt som beskrevet av Malcolm, A., et al., Ex Hematol. (1984) 12:539-547; polyklonale eller monoklonale fremstillinger av anti-Ml antistoff som beskrevet av Mew, D. , et al., J.Immunol. (1983) 130:1473-1477 (over) og B16G antistoff som blir fremstilt som beskrevet av Maier, T., et al., J. Immunol. (1983) 131:1843; Steele, J.K., et al., Cell Immunol. Particularly useful antibodies exemplified herein include monoclonal antibody preparation CAMAL-1 which can be prepared as described by Malcolm, A., et al., Ex Hematol. (1984) 12:539-547; polyclonal or monoclonal preparations of anti-Ml antibody as described by Mew, D., et al., J. Immunol. (1983) 130:1473-1477 (supra) and B16G antibody which is prepared as described by Maier, T., et al., J. Immunol. (1983) 131:1843; Steele, J.K., et al., Cell Immunol.

(1984) 90:303. (1984) 90:303.

Den foregående listen er som eksempler og ikke begrensende; med en gang målvevet er kjent, kan antistoffet som er spesifikt for dette vevet bli fremstilt ved konvensjonelle anordninger. Derfor kan oppfinnelsen anvendes for å gjennomføre toksisitet mot et hvilket som helst ønsket mål. The foregoing list is by way of example and not limiting; once the target tissue is known, the antibody specific for that tissue can be prepared by conventional means. Therefore, the invention can be used to effect toxicity against any desired target.

Liganden som er spesifikk for reseptor Re" refererer til en del som binder en reseptor på celleoverflatene, og således inneholder konturer og ladningsmønstere som er komplementære til de på reseptoren. Liganden som er spesifik for reseptoren er symbolisert i formelene til forbindelsene i oppfinnelsen som Re<**>, der <*> indikerer at delen bundet i forbindelsen i oppfinnelsen ikke er reseptoren selv, men en substans som er komplementær til den. Det er fastslått at en lang rekke celletyper har spesifike reseptorer som er utformet til å binde hormoner, vekstfaktorer eller neurotransmittere. Selv om disse utformingene av ligandene som er spesifikke for reseptorene er kjent og forstått, refererer uttrykket "ligandspesifik for reseptor" brukt her, til en hvilken som helst substans, naturlig eller syntetisk, som binder spesifikt til en reseptor. The receptor-specific ligand Re" refers to a moiety that binds a receptor on cell surfaces, and thus contains contours and charge patterns complementary to those on the receptor. The receptor-specific ligand is symbolized in the formulas of the compounds of the invention as Re< **>, where <*> indicates that the part bound in the compound of the invention is not the receptor itself, but a substance that is complementary to it. It has been established that a wide variety of cell types have specific receptors designed to bind hormones, growth factors or neurotransmitters.While these designs of the ligands specific for the receptors are known and understood, the term "ligand specific for receptor" as used herein refers to any substance, natural or synthetic, that binds specifically to a receptor.

Eksempler på slike ligander innbefatter steroidhormoner, slik som progesteron, estrogener, androgener, og adrenale kortikale hormoner; vekstfaktorer slik som epiclermisk vekstfaktor, nervevekstfaktor, fibroblastvekstfaktor osv.; andre proteinhormoner slik som humant veksthormon, paraty-roidhormon osv.; og neurotransmittere slik som acetylcholin, serotonin og dopamin. En hver analog til disse substansene som lykkes i å binde til reseptoren er også innbefattet. Examples of such ligands include steroid hormones, such as progesterone, estrogens, androgens, and adrenal cortical hormones; growth factors such as epiclermic growth factor, nerve growth factor, fibroblast growth factor, etc.; other protein hormones such as human growth hormone, parathyroid hormone, etc.; and neurotransmitters such as acetylcholine, serotonin and dopamine. Any analog of these substances that succeeds in binding to the receptor is also included.

Binding Binding

Konjugering av den mål-celle-spesifikke komponenten til hydro-monobenzoporfyrin kan bli gjennomført ved en hvilken som helst hensiktsmessig anordning. For proteiner slik som lg og visse Re<*1> kan en direkte kovalent binding mellom disse delene bli utført, f.eks. ved å anvende et dehydratiserende middel slik som karbodiimid og i dette tilfelle representerer L en kovalent binding. En særlig foretrukket fremgangsmåte for kovalent binding av hydro-monobenzoporfyriner til immunoglobulindelen er behandling med l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimid (EDCI) i nærvær av et reaksjonsmedium som består i hovedsak av dimetylsulfoksid (DMSO). En fremstilling som anvender denne foretrukne fremgangsmåten er illustrert i eksempel 3 under. Conjugation of the target cell-specific component to the hydro-monobenzoporphyrin can be accomplished by any convenient means. For proteins such as lg and certain Re<*1>, a direct covalent bond between these parts can be performed, e.g. by using a dehydrating agent such as carbodiimide and in this case L represents a covalent bond. A particularly preferred method for covalently binding hydro-monobenzoporphyrins to the immunoglobulin part is treatment with 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDCI) in the presence of a reaction medium consisting mainly of dimethylsulfoxide (DMSO). A preparation using this preferred method is illustrated in Example 3 below.

Andre dehydratiserende midler slik som dicykloheksylkar-bodiimid eller dietylkarbodiimid kan naturligvis også bli anvendt såvel som konvensjonelle vandige og delvis vandige medier. Other dehydrating agents such as dicyclohexylcarbodiimide or diethylcarbodiimide can of course also be used as well as conventional aqueous and partially aqueous media.

Ikke-proteinreseptorligander kan bli konjugert til Gp ifølge deres relevante funksjonelle grupper ved hjelp av kjent teknikk innenfor fagområdet. Non-protein receptor ligands can be conjugated to Gp according to their relevant functional groups using techniques known in the art.

De aktive delene i konjugatet kan også bli konjugert gjennom linkerforbindelser som er bifunksjonelle, og har evnen til kovalent å binde hver av de to aktive komponentene. En lang rekke av disse linkerne er kommersielt tilgjengelig, og en typisk liste vil inkludere de som er funnet, f.eks. i katalogen til Pierce Chemical Co. Disse linkerne er enten homo- eller heterbifunksjonelie deler og innbefatter funksjonaliteter som har evnen til å danne disulfider, amider, hydrazoner og en lang rekke andre bindinger. The active parts in the conjugate can also be conjugated through linker compounds that are bifunctional, and have the ability to covalently bind each of the two active components. A wide variety of these links are commercially available and a typical list will include those found, e.g. in the catalog of Pierce Chemical Co. These linkers are either homo- or heterobifunctional moieties and include functionalities that have the ability to form disulfides, amides, hydrazones and a wide variety of other bonds.

Andre linkere innbefatter polymerer slik som polyaminer, polyetere, polyaminalkoholer, derivatisert til komponenter ved hjelp av ketoner, syrer, aldehyder, isocyanater eller en lang rekke andre grupper. Other linkers include polymers such as polyamines, polyethers, polyamine alcohols, derivatized to components by means of ketones, acids, aldehydes, isocyanates or a wide variety of other groups.

Teknikkene som blir benyttet i konjugering av de aktive delene i konjugatet innbefatter enhver standardmetode og fremgangsmåte for konjugering og er ikke en del av oppfinnelsen . The techniques used in conjugating the active parts in the conjugate include any standard method and procedure for conjugation and are not part of the invention.

Administrering og anvendelse Administration and application

De forbedrede lysfølsomme forbindelsene i oppfinnelsen er nyttig generelt, på måten som er kjent innenfor fagområdet til hematoporfyrinderivat og for DHE. Disse materialene er nyttige for å sensitere neoplastiske celler eller annet abnormalt vev for nedbrytning ved bestråling ved å anvende synlig lys - ved lysaktivering har forbindelsene ingen direkte effekt, og de er heller ikke inne i enhver biologisk hendelse; imidlertid er energien fra lysaktiveringen antatt å bli overført til endogent oksygen for å omdanne den til singlettoksygen. Dette singlettoksygenet er antatt å være ansvarlig for den cytotoksiske effekten. I tillegg kan de lysaktiverte formene av porfyrinfluorescens som fluorescerer hjelpe til i lokalisering av tumoren. The improved photosensitive compounds of the invention are useful in general, in the manner known in the art for hematoporphyrin derivatives and for DHE. These materials are useful for sensitizing neoplastic cells or other abnormal tissue for degradation by irradiation using visible light - upon light activation, the compounds have no direct effect, nor are they involved in any biological event; however, the energy from the light activation is believed to be transferred to endogenous oxygen to convert it to singlet oxygen. This singlet oxygen is believed to be responsible for the cytotoxic effect. In addition, the light-activated forms of porphyrin fluorescence that fluoresce can aid in localization of the tumor.

Typiske indikasjoner som er kjent innenfor teknikken innbefatter destruksjon av tumorvev i faste tumorer, oppløsning av plaque i blodvæsker (se f.eks. U.S. patent 4,512,762); behandling av topiske forhold slik som akne, føtter hos idrettsmenn, vorter, papilloma og psoriasis og behandling av biologiske produkter (slik som blod til transfusjon) for infeksjonsmidler, siden tilstedeværelse av en membran i slike midler fremmer akkumulering av medikamentet. Typical indications known in the art include destruction of tumor tissue in solid tumors, dissolution of plaque in blood fluids (see, e.g., U.S. Patent 4,512,762); treatment of topical conditions such as acne, athlete's foot, warts, papilloma and psoriasis and treatment of biological products (such as blood for transfusion) for infectious agents, since the presence of a membrane in such agents promotes accumulation of the drug.

Forbindelsene som er fremstilt i fremgangsmåten i oppfinnelsen kan bli anvendt i behandling av materialer in vitro for å ødelegge skadelig virus eller infeksjonsmidler. F.eks. kan blodplasma eller blod som skal bli behandlet i transifusjon eller lagret i bank for fremtidig transfusjon bli behandlet med forbindelser i oppfinnelsen og bestrålt til effektiv sterilisering. I tillegg kan biologiske produkter slik som faktor VIII, som blir fremstilt fra biologiske væsker, bli bestrålt i nærvær av forbindelsene fra oppfinnelsen for å ødelegge kontaminanter. The compounds produced in the method of the invention can be used in the treatment of materials in vitro to destroy harmful viruses or infectious agents. E.g. blood plasma or blood to be transfused or banked for future transfusion may be treated with compounds of the invention and irradiated for effective sterilization. In addition, biological products such as factor VIII, which are prepared from biological fluids, can be irradiated in the presence of the compounds of the invention to destroy contaminants.

Eksempel 1 Example 1

In vltro- evaluerlng av BPD- MA og - MB In vitro evaluation of BPD-MA and -MB

De to forbindelsene vist i figur 2, der R<1> og R<2> er karbometoksy, ble testet in vitro på følgende måte: Målcellen ble vasket tre ganger i serumfritt medium (DME), talt og behandlet til en konsentrasjon på IO<7> celler pr. ml. The two compounds shown in Figure 2, where R<1> and R<2> are carbomethoxy, were tested in vitro as follows: The target cell was washed three times in serum-free medium (DME), counted and processed to a concentration of 10< 7> cells per ml.

Til "affinitets"-analysen i mørke, ble 100 pl med målcelle-suspensjon og 100 jjI av testen eller kontrollforbindelsen blandet. "Merking" fikk anledning til å fortsette i 1 time ved 4'C, og de merkede cellene ble vasket i mørke tre ganger med 3 ml medium hver gang og suspendert på nytt i friskt medium. De resuspenderte cellene ble deretter utsatt for lyseksponering ved 300-750 nm i 30 minutter. For the "affinity" assay in the dark, 100 µl of target cell suspension and 100 µl of the test or control compound were mixed. "Labeling" was allowed to proceed for 1 hour at 4°C, and the labeled cells were washed in the dark three times with 3 ml medium each time and resuspended in fresh medium. The resuspended cells were then subjected to light exposure at 300-750 nm for 30 minutes.

I en "direkte"-analyse ble målcellene bestrålt umiddelbart etter tilsetning av testen eller kontrollforbindelsen. Effekten av bestråling ble bestemt ved å anvende metoder som er hensiktsmessige for målcellene. In a "direct" assay, the target cells were irradiated immediately after addition of the test or control compound. The effect of irradiation was determined using methods appropriate for the target cells.

Når humane erytrocytter (RBCs) ble anvendt som målceller, var hemolysen forårsaket av bestråling på kontrollen (hematoporfyrin, Hp) merket og grønn porfyrin (Gp) merkede celler ble bestemt visuelt. Gp som ble anvendt i dette eksemplet var BPD-Db fra figur 2 der R<1> og R<2> er karboetoksy. Gjentatte tester viste at dette grønne porfyrinet var 20-30 ganger mer aktiv enn Hp i denne analysen. Således var en konsentrasjon på 250 ng/ml Hp nødvendig under forholdene over for å oppnå 50% hemolyse, mens bare 10 ng/ml med grønn porfyrin var nødvendig for å hemolysere 50% av RBCs. When human erythrocytes (RBCs) were used as target cells, the hemolysis caused by irradiation on the control (hematoporphyrin, Hp) was labeled and green porphyrin (Gp) labeled cells were determined visually. The Gp used in this example was BPD-Db from Figure 2 where R<1> and R<2> are carboethoxy. Repeated tests showed that this green porphyrin was 20-30 times more active than Hp in this assay. Thus, a concentration of 250 ng/ml of Hp was required under the conditions above to achieve 50% hemolysis, while only 10 ng/ml of green porphyrin was required to hemolyze 50% of RBCs.

Når den murine mastocytoma-cellelinje P815 ble anvendt ble resultatene bestemt som følger: Cellene ble merket som over, ved å anvende konsentrasjoner på 10-50 ng/ml Hp som kontroll og BPD-DB som testsubstansen. De resuspenderte cellene ble behandlet med 300-750 nm lys i 30 minutter og den resulterende levedyktigheten ble bestemt ved direkte telling ved å anvende eosin-Y eksklusjon, en standardprosedyre for å differensiere mellom levende og døde celler. When the murine mastocytoma cell line P815 was used, the results were determined as follows: The cells were labeled as above, using concentrations of 10-50 ng/ml Hp as the control and BPD-DB as the test substance. The resuspended cells were treated with 300-750 nm light for 30 minutes and the resulting viability was determined by direct counting using eosin-Y exclusion, a standard procedure for differentiating between live and dead cells.

I andre bestemmelser som ble gjennomført som over, ble cellene som var utvunnet fra lyseksponering analysert for levedyktighet ved å inkubere dem i 18 timer i 10 >iCi/ml tritium-merket tymidin ifølge standardprosedyre der inkor-porert tymidin er ekvivalent med levedyktighet. Cellene ble høstet og radioaktivitetopptaket ble målt med en scintilla-sjonsteller. In other assays carried out as above, the cells recovered from light exposure were assayed for viability by incubating them for 18 hours in 10 µCi/ml tritium-labelled thymidine according to standard procedure where incorporated thymidine is equivalent to viability. The cells were harvested and the radioactivity uptake was measured with a scintillation counter.

50# P815 celler ble drept ved 580 ng/ml Hp, men bare 32 ng/ml grønn porfyrin (BPD-DB). 50# P815 cells were killed by 580 ng/ml Hp, but only 32 ng/ml green porphyrin (BPD-DB).

Resultatene fra hver bestemmelse på en lang rekke celler er vist i tabell 1 (LD50 i konsentrasjon av forbindelsen som er nødvendig for å drepe 50$ av cellepopulasjonen). The results of each determination on a wide range of cells are shown in Table 1 (LD 50 in concentration of the compound required to kill 50% of the cell population).

Begge forbindelsene var lyssensitive. Both compounds were light sensitive.

Eksempel 2 Example 2

Blodlstrlbus. lon og nedbryting Blodlstrlbus. lon and degradation

Blodistribusjonsstudier er blitt utført ved å anvende tritiert BPD-MA og BPD-MB. Tabell 5 viser forholdene melom <3>E-BPD-MA konsentrasjonen i tumor og normalt vev bestemt i forskjellige tider etter injeksjon i mus som bærer P815 tumor som gjennomsnitt for 3 mus. Blood distribution studies have been performed using tritiated BPD-MA and BPD-MB. Table 5 shows the relationships between <3>E-BPD-MA concentration in tumor and normal tissue determined at different times after injection in mice bearing P815 tumor as an average for 3 mice.

Tumorhudforhold er mest gunstig 3 timer etter IV-administrering av medikamentet. Tumor skin conditions are most favorable 3 hours after IV administration of the drug.

For å bestemme bionedbrytbarheten ble tritierte BPD-MA injisert IV inn i P815 tumorbærende mus. Musene ble avlivet enten 3 eller 24 timer etter injeksjonen, og tumorer, lever og nyrer ble fjernet. BPD-MA i disse vevene ble ekstrahert og lysaktiviteten ble vurdert i P815 målceller som beskrevet over i eksempel 1 under standard in vitro-forhold. Selv om 100$ PBD-MA i tumor var aktiv i 3 timer, var bare 39$ aktiv ved 24 timer; både lever og nyrer degraderte PBD raskere enn det tumorvevet gjorde. Administrering av tritiert PBD-MB i samme system ga tilsvarende resultater. To determine biodegradability, tritiated BPD-MA was injected IV into P815 tumor-bearing mice. The mice were killed either 3 or 24 hours after the injection, and tumors, liver and kidneys were removed. The BPD-MA in these tissues was extracted and the light activity was assessed in P815 target cells as described above in Example 1 under standard in vitro conditions. Although 100$ PBD-MA in tumor was active for 3 hours, only 39$ was active at 24 hours; both liver and kidney degraded PBD faster than tumor tissue did. Administration of tritiated PBD-MB in the same system gave similar results.

Tilsvarende studier ved å anvende BPD-MA konjugert til en anti-keratin Mab i modellmurinsystemet som bærer KLN squamus tumorcellelinje viste forbedret konsentrasjon av medikamentet i målvevet. Corresponding studies using BPD-MA conjugated to an anti-keratin Mab in the model murine system bearing the KLN squamus tumor cell line showed improved concentration of the drug in the target tissue.

Eksempel 3 Example 3

In vlvo- lvssensitering av BPD In vlvvsensitization of BPD

Studier av potensiell lyssensibilisatorer ble utført ved å anvende M-l rabdomykocerkomasystem i DBA/J2 mus. Sammenset-ningen som ble undersøkt ble fortynnet til en konsentrasjon på 800 pg/ml i PBS fra en lageroppløsning i DMSO ved 8 mg/ml (unntatt Photofrin II, som ble fortynnet direkte fra den kliniske medisinflasken). Dyrene (8 pr. gruppe) mottok 0,1 ml (80 pg) materiale IV 24 timer før eksponering til lys frembragt av en 150W wolframpære, rødt filter (transmissjons-lys >600 nm), varmt speil (reflekterer lys >720 nm) og 2 fiberoptikk ved 567 Jo/cm2 . Studies of potential photosensitizers were performed using the M-1 rhabdomycocercoma system in DBA/J2 mice. The composition under investigation was diluted to a concentration of 800 pg/ml in PBS from a stock solution in DMSO at 8 mg/ml (except Photofrin II, which was diluted directly from the clinical medicine bottle). The animals (8 per group) received 0.1 ml (80 pg) of material IV 24 hours before exposure to light produced by a 150W tungsten bulb, red filter (transmitting light >600 nm), hot mirror (reflecting light >720 nm) and 2 fiber optics at 567 Jo/cm2.

Resultatene som er vist i tabell 6 indikerer at alle BPD-forbindelsene som ble undersøkt ga positive resultater. De yppelige resultatene vist av Photofrin II sammensetningene kan forklares ved observasjonene at begynnende tumorstørrel-ser var mindre (et resultat av endring). The results shown in Table 6 indicate that all the BPD compounds tested gave positive results. The excellent results shown by the Photofrin II compositions can be explained by the observations that initial tumor sizes were smaller (a result of alteration).

Tilsvarende studier, med unntagelse for å anvende en lysdose på 378 To/cm<5> resulterte i det som er vist i tabell 7,. Similar studies, with the exception of using a light dose of 378 To/cm<5> resulted in what is shown in table 7.

De foregående resultatene er foreløpige og analyseprotokol-lene har ennå ikke blitt optimalisert. The preceding results are preliminary and the analysis protocols have not yet been optimized.

Eksempel 4 Example 4

Endring i in vivo- analvse Change in in vivo analvse

Mus som bærer små tumorer ble injisert IV med medikament som skulle bli undersøkt. 3 timer senere ble dyrene tatt livet av og tumorene fjernet. Tumorcellene ble tatt fra hverandre for å danne en enkel cellesuspensjon, og cellene ble plettert ved 10<5>/brønn og eksponert til lys ved en foreskrevet dose. Platene ble inkubert over natten og analysert for levedyktighet ved MTT-analyse. Mice bearing small tumors were injected IV with drug to be investigated. 3 hours later, the animals were killed and the tumors removed. The tumor cells were dissociated to form a single cell suspension, and the cells were plated at 10<5>/well and exposed to light at a prescribed dose. Plates were incubated overnight and assayed for viability by MTT assay.

Resultatene fra en studie er vist i tabell 8. The results from a study are shown in table 8.

Således var BPD-formene som ble undersøkt aktive i denne analysen; det synes at lysintensiteten og medikamentnivåene er utsatt for optimalisering og korrelasjon. Thus, the BPD forms examined were active in this analysis; it appears that light intensity and drug levels are subject to optimization and correlation.

Eksempel 5 Example 5

Sammenligning av BPD til Photofrin II- sammensetninger Mus som hærer P815 tumorer hie barbert og injisert med ekvivalente mengder lyssensibilisator, og eksponert til 72 Jo/cm<2> (80 mw/cm<2->15 min.-fullt spektrum) i forskjellige tidsintervaller. Eudbiopsier ble tatt 24 og 48 timer etter lysbestråling og visuelle evalueringer ble laget blindt. Resultatene av disse evalueringene er vist i fig. 4. BPD-MA og i mindre grad, BPD-MB hadde en hovedlyssensiteringsak-tivitet under disse forhold; dette var bare tilstede når lysbehandlingen ble gitt 3 timer etter medikamentadministre-ring, og det var i overensstemmelse med bionedbrytbarheten til disse forbindelsene. Comparison of BPD to Photofrin II Formulations Mice bearing P815 tumors were shaved and injected with equivalent amounts of photosensitizer, and exposed to 72 Jo/cm<2> (80 mw/cm<2->15 min.-full spectrum) in different time intervals. Biopsies were taken 24 and 48 hours after light irradiation and visual evaluations were made blind. The results of these evaluations are shown in fig. 4. BPD-MA and to a lesser extent, BPD-MB had a major photosensitizing activity under these conditions; this was only present when the light treatment was given 3 hours after drug administration and was consistent with the biodegradability of these compounds.

Eksempel 6 Example 6

Fremstilling av BPD- dimer- vinvlbundet Preparation of BPD-dimer-vinyl-bound

Til en omrørende oppløsning med BPD-DB (der R<1>=R<2=>karbomet-oksy og som er forestret slik at begge R<3> er karbometok-syetyl) (35 mg, 48 pmol) i 5 ml diklormetan avkjølt til tørris/acetontemperatur ble det tilsatt trifluormetansulfon-syre (34 pl, 380 pmol). En olje ble separert ut ved tilsetning av syre. Reaksjonen ble bragt opp til 0°C. Deretter ble 5 ml 5$ natriumbikarbonat tilsatt til reaksjonen for å nøytralisere syre. Produktet ble distribuert i det organiske laget som ble vasket 3 ganger med vann. Oppløs-ningsmidlet ble fjernet og produktet ble tørket azeotropt med acetonitril. To a stirring solution of BPD-DB (where R<1>=R<2=>carbomethoxy and which is esterified so that both R<3> are carbomethoxyethyl) (35 mg, 48 pmol) in 5 mL of dichloromethane cooled to dry ice/acetone temperature, trifluoromethanesulfonic acid (34 µl, 380 pmol) was added. An oil was separated out by the addition of acid. The reaction was brought up to 0°C. Then 5 ml of 5% sodium bicarbonate was added to the reaction to neutralize acid. The product was distributed in the organic layer which was washed 3 times with water. The solvent was removed and the product was azeotropically dried with acetonitrile.

Preparativ tynnsjiktkromatografi på silisiumoksidgel eluert med 10$ etylacetat/diklormetan ga en enkelt fraksjon (28 mg, 80$ utbytte). Opprinnelig ion i massespektrum var 1 464. Det komplekse proton NMR på grunn av antall isomeriske forbindelser hadde det karakteristiske enkle vinylhydrogenet assosiert med en C-binding ved ca. 9,1 ppm. Preparative thin layer chromatography on silica gel eluted with 10% ethyl acetate/dichloromethane gave a single fraction (28 mg, 80% yield). Original ion in mass spectrum was 1,464. The complex proton NMR due to the number of isomeric compounds had the characteristic single vinyl hydrogen associated with a C bond at ca. 9.1 ppm.

Claims

1. Analogous method for the preparation of therapeutically active monobenzoporphyrin (Gp) of formula wherein each R<1> and R<2> are independently (2-6C)carbaloxy; one of the groups R<3> is -CH2CH2COOH or a salt thereof and the other group R<3> is -CH2CH2C00R where R is alkyl (1-6C) and R<4> is vinyl, optionally conjugated with an antibody lg where lg is obtained from a preparation of monoclonal antibodies or a ligand, characterized in that the method comprises partial hydrolysis of a hydromonobenzoporphyrin diester with formula: where R<1>, R<2> and R<4> are as defined above and both groups R<3>' are -CH2CH2C00R where R is alkyl (1-6C).

2. Process according to claim 1 where each of R<1> and R<2> is independently selected from carbomethoxy and carboethoxy, characterized in that one starts from corresponding starting materials.

3. Method according to claim 2 where R<1> and R<2> are carbomethoxy, characterized by starting from corresponding starting materials.

4. Method according to any of the preceding claims where at least one of the groups R in the diester is methyl, characterized in that one starts from corresponding starting materials.

5. Use of the compounds and/or conjugates according to claim 1 for an in vitro method for detecting, photosensitizing, destroying or impairing the functioning of target biological material.

6. Application according to claim 5 where irradiation takes place with light having a wavelength from 670 to 780 nm.

7. Use according to claim 5 where the target biological material is non-solid tumor cells in bone marrow.