NO179328B - Antistoffer mot retinoblastom-genprodukt, anvedelse derav samt murint hybridom - Google Patents

Abstract

En fremgangsmåte for bestemming av prognosen av en cancerpasient ved bestemming av nærvær eller fravær av retinoblastom-genproduktet i tumorantistoff som spesifikt bindes til den hydrofile c-terminale enden av retinoblastomproteinet er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoff mot proteinet kodet av retinoblastoma-genet (RB1), anvendelse derav og murint hybridom.

Tumorutvikling i visse typer cancer antas å være resultatet av utløsing av et eller flere resessive "tumor-suppressor"-gener ved mutasjon. To barnecancerformer,retinoblastoma og Wilm's tumor, er prototyper av denne cancer-typen. Retinoblastoma er en sjelden okular malignhet som oppstår i en frekvens på omtrent én av 20.000 levende fødte. Retinoblastom oppstår som både en arvet og en sporadisk sykdom, idet rundt 40$ av tilfellene er arvelige. Cytogenetiske studier har identifisert den kromosomale regionen omfattende retinoblastom som 13ql4. Nylig er retinoblastom-genet (RB1) blitt klonet og sekvensert. I minst 40$ av primære retinoblastomer eksisterer det en klar strukturell unormal tilstand i RB1, idet abnormiteten omfatter delesjoner av hele genet, mindre indre delesjoner, translokasjoner og punktmutasjoner.

Klinisk har pasientene som overlever retinoblastom en betraktelig øket risiko for utvikling av andre spesifikke typer av primære tumorer, fortrinnsvis osteosarkomer, men sjeldnere fibrosarkomer og melanomer. I tillegg utvikler upåvirkede familiemedlemmer andre cancerformer oftere enn ventet, og disse cancerformene kan være av forskjellige typer. Analyser av DNA fra "second primaries" fra retino-blastpm-pasienter viser tydelig abnormiteter^i begge alleler av RBl-genet. Videre viser DNA isolert fra fibrosarkomer og osteosarkomer fra pasienter uten retinoblastombakgrunn også delesjon av RBl-genet. Tap av funksjonen RBl-genet kan derfor spille en generell rolle i human onkogenese.

Funksjonstap av RBl-genet er også blitt assosiert med retinoblastomer, osteosarkomer, fibrosarkomer, karsinomer i bryst, ovarie, blære, lunge, cervix og i bløtvevssarkomer. Strukturelle abnormaliteter er også blitt påvist i 13$ av primære små cellelungekarsinomer (SCLC) og i 18% av SCLC-cellelinjene. Det er å bemerke at tap av RB1 mRNA ble oppdaget i b0% av SCLC-linjene. SCLC, som retinoblastomer, er en tumor med neuroendokrin opprinnelse. Hyppig avvik i RBl-genet er også blitt påvist i primær brystkarsinom. Innbefatning av RBl-genet i to tumortyper som utviser fenotyp-iske egenskaper ved neuroendokrin differensiering kan være av betydning. Brystkarcinomer er derimot ikke av neuroendokrin opprinnelse, men de kan vise en sterk familiær trend, idet noen familier utviser en veldig sterk genetisk komponent. Selv om det er mye som tyder på at mødre av barn med osteosarkom og bløt vevsarkom viser høyere grad av brystcancer, er det ingen direkte bevis at det er noen forbindelse mellom brystcancer og retinoblastom.

Strukturen til RBl-genproduktet (RBl-proteinet) er blitt avledet fra sekvenanalyser av RB1 cDNA. Den lengste RB1-leserammen koder for et protein med 928 aminosyrer. Ved anvendelse av antisera mot et tryp E-RB-fusjonsprotein, ble et protein med en tilsynelatende molekylvekt på 110.000 til 114.000 dalton immunopresipitert. RB-fusjonsproteinet er et fosfoprotein. Antisera preparert mot enten syntetiske oligopeptider eller bakterielt uttrykte peptider immunopresi-piterer et protein på omtrent 105 kDalton som antas å være den native formen av RBl-proteinet.

cDNA-sekvens kodende for RBl-proteinet (vist i figur 1) viser nærvær av et område aminosyrer i proteinet ved posisjon 609 til 615 (VRSPKKK), som ligner det nukleære translokasjonssig-nalet "eksisterende i SV40 stort T-antigen og~ i polyoma stort T antigen. Dette viser at RB-proteinet er et nukleært protein. RBl-proteinet er blitt påvist ved immunofarving og ved subcellulær lokalisasjon ved fraksjonering av cellulære komponenter i kjerne og i kjernefraksjon, respektivt.

Påvisning av forandringer i RBl-genet forklart ovenfor er blitt tilveiebragt ved anvendelse av DNA-prober og DNA-hybridisasjonsanalyser. Slike teknikker er generelt kjente for fagmannen og er spesielt beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/312.777, inngitt 31. oktober 1988.

Anvendelse av DNA-hybridisasjonsteknikker for påvisning av genforandringer er begrenset i følsomhet på grunn av at nærvær av individuelle celler redusert i RBl-genet ikke kan bli påvist i DNA-preparatene som blir anvendt for å utføre DNA-hybridisasjonsteknikker. I tillegg er DNA-hybridisasjons-analyser tidkrevende og påvisning av nærvær eller fravær av RBl-genet ved DNA-hybridisasjonsteknikker er ytterligere hindret av tidslengden som er nødvendig for å tilveiebringe resultatene.

En følsom, spesifikk og hurtig metode for påvisning av RB1-gen-avvik i tumorvevprøver har inntil nå ikke vært tilgjengelige. En slik metode er ønskelig for å kunne bekrefte nærvær eller fravær av et funksjonelt RBl-gen, og derved vurdere prognosen til retinoblastom-tumorpasienter, samt for bestemmelse av et behandlingsregime.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig antistoff med spesifikk bindingsaffinitet for RBl-proteinproduktet uttrykt fra retinoblastomgenet i cancerceller, kjennetegnet ved at nevnte antistoff produsert ved immunisering av et vertsdyr med et peptid beliggende ved eller nære den C-terminale enden til RBl-proteinsekvensen, i det nevnte peptid omfatter sekvensen cys-lys-pro-leu-lys-lys-leu-phe-^rg-asp-ile-glu-gly-ser-asp-glu-ala-asp-gly-ser-lys, og nevnte antistoff bindes-spesifikt til RBl-proteinet i cancerceller.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er et murint hybridoma kjennetegnet ved at det produserer et monoklonalt antistoff som angitt ovenfor og at den har deponeringsnummer ATCC HB 10093.

Anvendelse av ovennevnte antistoff i en fremgangsmåte for detektering av fravær av RB1 proteinet i tumorceller, ved at følgende trinn utføres: preparering av vevssnitt fra en tumor; inkubering av ovennevnte antistoff med nevnte preparerte vevssnitt; og detektering av fraværet av spesifikk binding av nevnte antistoff til nevnte vevssnitt.

Det er også beskrevet anvendelse av ovennevnte antistoff i en fremgangsmåte for detektering av subpopulasjoner av celler manglende RBl-protein, ved at følgende trinn utføres: preparering av vevssnitt av tumorer; inkubering av ovennevnte antistoff med nevnte preparerte vevssnitt; og detektering av spesifikk binding av nevnte antistoff til nevnte vevssnitt.

Ifølge oppfinnelsen kan antistoffet også anvendes i en fremgangsmåte for forutbestemmelse av prognosen for cancerpasienter, ved at antall tumorceller som mangler i RP1-proteinet bestemmes.

I en ytterligere utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan antistoffene anvendes i en fremgangsmåte for å bestemme prognosen til cancerpasienter, ved at følgende trinn utføres: preparering av vevssnitt fra tumoren til nevnte pasient; inkubering av ovennevnte antistoff med nevnte preparerte vevssnitt; påvisning av spesifikk binding av nevnte antistoff til nevnte vevssnitt; og bestemming av antall celler som mangler RBl-protein.

Det er også beskrevet anvendelse av antistoff i en fremgangsmåte for diagnoser og prognoser av en cancerpasient, ved at følgende trinn utføres: biopsidannelse av en tumor; preparering av vevssnitt fra nevnte tumorvev; inkubering av ovennevnte antistoff med nevnte preparerte vevssnitt for å danne et antistoff-antigen-kompleks; og detektering av antistoff-antigen-komplekset som blir dannet.

Det er følgelig bestemt kriterier for bestemming av graden og stadiet av forskjellige tumorer som dermed er til hjelp ved vurdering av prognose og senere behandlingsregime for tumorpasienten.

Andre og ytterligere hensikter, trekk og fordeler vil fremkomme av følgende beskrivelse av foretrukne utførelses-former av oppfinnelsen som blir gitt sammen med vedlagte tegninger.

Oppfinnelsen vil fremkomme fra lesning av følgende beskrivelse og med referanse til vedlagte tegninger som utgjør en del derav: Figur 1 viser RB1 cDNA-sekvenser inkludert del av den genomiske sekvensen rett 5' for cDNA. A-residiet i ATG-kodonet er definert som posisjon 1. Aminosyrer av lengste leseramme er vist nedenfor hver av de kodende sekvensene. Figur 2 demonstrerer presipitering av merket RBl-protein ved polyklonalt antiserum RB-AB20 og IgG-fraksjonen renset fra RB-AB20. Figur 3 demonstrerer immunohistokjemiske farving av RB1-positiv cellelinje, (SW613) og en RB1 negativ cellelinje (MDA-MB468) med monoklonalt antistoff RB-MAB20. Figur 4 viser immunohistokjemisk påvisning av RBl-protein i humant brystvev. Alle forstørrelser X250.

Tegningene er ikke nødvendigvis i riktig skala og visse trekk ifølge oppfinnelsen kan være overdrevet i skala eller vist i skjematisk form for å lette forklaringen.

Det er innlysende for fagmannen at forskjellige substitu-sjoner og modifikasjoner kan bli utført i oppfinnelsen beskrevet heri uten å fravike fra rammen av oppfinnelsen. Antigener er forbindelser som kan utløse en immunrespons og påfølgende produksjon av antistoffer som reagerer med og blir bundet til målantigenet med en viss spesifitet. Antistoff-prober spesifikke for antigener så som virus eller spesifikke determinanter derav, peptider og proteiner avledet fra forskjellige kilder, karbohydratdeler og forskjellige biopolymerer er kjent for fagmannen. Generelle fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer er også kjent for fagmannen.

Forklart i korte trekk kan polyklonale antistoffer bli preparert ved immunisering av et vertsdyr med en peptidsekvens kodet av RBl-genet. Anigenet er fortrinnsvis en peptidsekvens beliggende ved, eller nære ved den hydrofile C-terminale enden av RBl-proteinet. Antigenet blir administrert til verten subkutant ukentlig, etterfulgt av en booster-dose én måned etter den siste ukentlige dosen. Deretter blir serumet høstet fra verten og lagret for videre bruk. RBl-polyklonalt antiserum kan bli anvendt direkte i immunohistokjemiske prosedyrer ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan RBl-antistoffer bli presipitert fra serum ved kjente metoder og anvendt i en mere konsentrert form eller RBl-antistoffene kan alternativt bli renset ved affinitetsteknikk og anvendt i denne rensede formen. Antistoffer kan også bli merket på en påvisbar måte ved teknikker kjent for fagmannen og ytterligere diskutert nedenfor.

Fusjon- mellom myelomceller og miltceller -fra immuniserte givere har vist seg å være en vellykket metode for å oppnå homogent antistoff. Kontinuerlige cellelinjer av genetisk stabile hybridomceller som kan produsere store mengder monoklonalt antistoff mot forskjellige antigener er blitt utviklet. Ifølge US-patent nr. 4.172.124 til Koprowski et al., kan antistoffer demonstrerende en spesifisitet for ondartet tumor bli produsert ved somatiske cellehybrider mellom hypoksantin-fosforbosyltransferase-manglende myelomceller og milt- eller lymfeceller tilveiebragt fra et dyr tidligere primet med tumorceller. Også, ifølge US-patent nr. 4.196.265 til Koprovski et al., er kontinuerlige cellelinjer av genetisk stabile fusjonerte cellehybrider med evne til å produsere store mengder monoklonale antistoffer mot spesifikke virus og deres antigene determinanter, blitt utviklet.

Slike cellefusjonsteknikker kan også bli anvendt for å tilveiebringe en pålitelig og standard tilførsel av anti-RBl-antistoffer. Ifølge foreliggende oppfinnelse blir nye kontinuerlige hybridomcellelinjer som uttrykker anti-RBl-antistoff tilveiebragt ved immunisering av et dyr med en peptidsekvens korresponderende med en aminosyresekvens ved eller nære ved den hydrofile c-terminale enden av RB1-genproduktet, fortrinnsvis til en syntetisk sekvens valgt fra gruppen betående av P2, P3, P4 eller P5 RBl-peptider vist i fig. 1, ved dannelse av fusjonerte hybridceller mellom antistof fproduserende celler fra immuniserte dyr og myelomceller, kloning av hybridene og selektering av kloner som uttrykker anti-RBl-antistoff. En mus eller et annet dyr blir injisert med renset RBl-antigen og antistoffproduserende celler fra milten til dyret blir deretter fusjonert med en cancertype av musecelle eller myelomcelle. Eybridcellen dannet på denne måten produserer anti-RBl-antistoffmolekylet av dens miltcelleforeldre og vokser kontinuerlig og deler seg som foreldre-myelomcellen. Klonen av celler som produserer slikt antistoff blir selektert og dyrket som jen kontinuerlig cellelinje som store mengder anti-RBl-antistoff blir høstet fra. En slik klon betegnet RBI-MABP2 er ytterligere beskrevet nedenfor.

I alternativet kan klonale hybride celler bli injisert inn i et histokompatabelt dyr hvor de prolyfirerer, produserer høye nivå av anti-RBl-antistoff som kanbli isolert fra dyrets ascitesvæske.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor i relativ stor skala en pålitelig og standard tilførsel av anti-RBl-antistoff for anvendelse ved immunohistokjemisk påvisning av RBl-proteinekspresjon, eller, i alternativet, fravær av RB1-ekspresjon i en tumorprøve, hvor fraværet av proteinet er assosiert med en spesiell type, kvalitet eller stadiet av tumoren. Monoklonale antistoff preparert slik, kan også bli merket ifølge kjente prosedyrer.

Påvisbare markører kan være et hvilket som helst materiale med en påvisbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike påvisbare markører er blitt utviklet innen feltet immunoan-alyser, og generelt kan nesten et hvilket som helst merke som er nyttig i slike metoder anvendes i foreliggende oppfinnelse. Ennzymatisk aktive grupper, så som enzymer (bl.a. alkalisk fosfatase og peroksidaser) (se Clin.Chem., 22:1243

(1976), enzymsubstrater (se britisk patent 1.548.741), koenzymer (se US-patent nr. 4.230.797 og 4.238.565) og enzyminhibitorer (se US-patent nr. 4.134.792): fluorescenser (se Clin. Chem., 25:353 (1979)); kromoforer; luminiscenser så som kjemiluminiscenser og bioluminisenser (se Clin. Chem., 25:512 (1979)); og radioisotoper. Vanlig anvendte påvisbare radioaktive markører omfatter, men er ikke begrenset til, 32P, 14C, 125I, <3>H og <35>S. Biotinylerte prober blir påvist etter hybridiseringen ved anvendelse av avidin/streptavidin, fluorescens, enzymatiske kollodiale gullkonjugater. Antistoffer kan også bli merket med andre fluorescentforbindelser med immunologisk påvisbare fluorescensderivater eller med biotirranaloger. Indirekte f luorescens-immunocytokjemiske prosedyrer kan også anvendes.

For å påvise dannelsen av antigen-antistoffkomplekser blir en påvisbar markør anvendt. Den påvisbare markøren (eller reportermolekylet) kan bli direkte koblet til anti-RBl-antistof fmolekylet før inkubasjon med målvevet. Alternativt kan umerket RBl-antistoff bli inkubert med målvevet og antigen-antistoffkomplekset påvist ved tilsetning av et annet, påvisbart merket antistoff som bindes til RB1-antistoff kompieksbundet med RBl-vevsantigen.

Nærvær eller fravær av RBl-protein i spesifikke celler i en tumorvevsprøve kan bli bestemt direkte ved anvendelse av et markørmolekyl som kan bli påvist visuelt, eller indirekte ved anvendelse av et markørmolekyl så som en radioaktiv markør å legge over den utviklede autoradiografen på en visuell representasjon av vevsdelen. Man kan deretter telle RB1-positive og negative tumorceller for å bestemme antallet tumorceller som uttrykker RBl-proteinet.

En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse anvender et polyklonalt antistoff som blir bundet til RBl-proteinet. Polyklonale antistoff til RBl-proteinet (RB1-AB20) ble preparert ved immunisering av kaniner med peptidsekvenser korresponderende med en hydrofil del av RBl-proteinet beliggende ved eller nære ved den c-terminale enden av proteinsekvensen avledet fra de humane RB1- cDNA-sekvensene som vist i fig. 1. Det syntetiske peptid (nedenfor betegnet "P5") korresponderende med 23 aminosyreresidier er preparert.

Tre andre peptidsekvenser ble også syntetisert. Aminosyre-sekvenser av syntetiske RBl-peptider er betegnet som følger:

Et cysteinresidie ble satt til den N-terminale enden til hver av peptidene for kobling. Den N-terminale cysteindelen er dermed ikke del av RBl-proteinsekvensen.

Polyklonale og monoklonale antistoff kan "bli anvendt for å påvise nærvær av, eller fravær eller forandring av RBl-proteinet. I en utførelsesform omfatter en fremgangsmåte for påvisning av RBl-protein trinnene omfattende preparering av vevsdeler fra tumorvevsbiopsier, inkubering av monoklonale eller polyklonale antistoff med de preparerte vevsdelene for å danne antistoff-antigenkomplekser og deretter påvisning av dannelsen av antigen-antistoffkomplekset.

I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan subpopulasjoner av celler manglende RBl-protein bli identifisert i tumorvev ved anvendelse av immunhistokjemien beskrevet ovenfor.

På grunn av at tumorceller i langtkommende tilstander av sykdommen viser ytterligere retinoblastomproteindefekter, kan metoden anvendes for diagnostikk av stadiet til tumorcellene samt prognosen for individet inneholdende nevte tumorer.

Eksisterende behandlingsavgjørelser for individer er ofte basert på spesifikke parametere vedrørende prognose. De viktigste prognostiske faktorer for brystkreft omfatter nærvær eller fravær av tumor i aksillærknuter, og nærvær eller fravær av hormonale reseptorer i tumorcellen. Andre prognostiske faktorer som ofte er knyttet til sykdomstil-bakefall og pasientoverlevelse, omfatter størrelsen på den primære skaden, og sykdomsstadiet ved diagnostikk. Slamon har postulert at HER-2/neu-gen-amplifikasjon- hadde høyere prognostisk verdi som en prediktor for både helhetlig overlevelsestid og recidiveringstid i brystkreftpasienter enn en hvilken som helst annet konvensjonelt anvendt kriterie med unntagelse av lymfeknuteinvolvering (Science 235: 177

(1987)).

Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en fremgangsmåte for å vurdere stadiet og grad av forskjellige tumorer. For eksempel er defekten blitt funnet i retinoblastomer, osteosarkomer, fibrosarkomer, karsinomer i bryst, ovarie, blære, lunge, cervix og i bløtvevssarkomer. Alle disse tumorene er defekte i RBl-genet på DNA-nivå, og noen har vist subpopulasjoner av celler som er blitt assosiert med endret eller defekt retinoblastomgen. Fravær av påvisbart RBl-protein kan derfor anvendes som et kriterium for identifisering i disse tumorene. På grunn av at tapsgraden av RBl-proteinekspresjonen øker med økning i grad av tumor som det fremgår av andre konvensjonelle fremgangsmåter i brystkreft, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et ytterligere kriterium for bestemming av størrelse og utviklingstrinn til en slik tumor. Denne fremgangsmåten tilveiebringer et ytterligere kriterium for bestemming av prognosen og fremtidig behandlingsforløp for tumorpasienten.

Oppfinnelsen er nå blitt generelt beskrevet og en mer fullstendig forståelse kan bli tilveiebragt med referanse til følgende spesifikke eksempler. Disse eksemplene illustrerer bare oppfinnelsen, og skal ikke virke begrensende på denne.

EKSEMPEL 1

RB1- antistof fproduks. i on

Polyklonalt antistoff ble preparert ved immunisering av individuelle New Zealand hunnkaniner med -ett av RBl-peptidene, P2, P3, P4 eller P5. Kaninene ble boostet ved intervaller på 2 uker og serumet som ble samlet ble anvendt som en kilde for antistoffene. Et antiserum RB1-AB20, dannet mot peptid P5 ble anvendt for påfølgende immunfargingsprose-dyrer som beskrevet i eksempel 2. RBl-AB20-antistoff er av IgG-subtype. RBl-AB20-antiserum presipiterte RBl-protein fra <32>P-merkede celler som vist i fig. 2, kolonne 1. IgG-fraksjonen av det polyklonale antiserumet, renset ved konvensjonelle teknikker, presipiterte også RBl-proteinet som vist i fig. 2, kolonne 2.

Hybridomer ifølge foreliggende oppfinnelse ble preparert som følger. Balb/c-mus ble direkte injisert i milten med 200 mg av selve peptidet løst opp i PBS. Immuniserte dyr ble ofret tre dager senere og miltcellene ble høstet. Miltceller (10*) ble blandet i 2 min. med musemyelom NS-l-celler (IO<7>) i 0,8 ml 50% polyetylenglykol (PEG 4000). Etter uforstyrret opphold i 1 min., ble cellene resuspendert i 70 ml HAT (hypoksantin-aminopterin-tymidin) medium inneholdende 20% fetalt kalveserum. Cellene ble deretter sådd ut i 96 brønn kulturskåler og inkubert ved 37° C i fuktig COg-atmosfære. Positive hybridomkolonier ble screenet ved ELISA-teknikk ved anvendelse av de immuniserende antigenene for å påvise RB1 antistoffproduserende hybridomceller. ELISA positive kolonier ble sådd ut fortynnet i serier og ELISA-testen ble gjentatt. Etter flere cykluser ble positive hybridomcellelinjer injisert intraperitonealt i Balb/c-mus og dyrket som ascitesvæske. Ascitesvæsken ble anvendt som en kilde for hybridomer. Flere cellelinjer, inkludert en betegnet RB1-MAbP2, ble funnet å produsere RBl-antistoff og være nyttig for immunhistokjemisk farging av tumorvev. Hybridomcellelinjer ble bevart i flytende nitrogen. ;Hybridomcellelinje betegnet RBl-MAbP2 ble deponert til American Type Culture Collection (ATCC), JJockville, Md., U.S.A., aksesjonsnummer HB10093, mars 31, 1989. Deponeringene er tilgjengelige i henhold til patentlover og regler i USA og regler i andre land enn USA hvor tilsvarende søknad er blitt inngitt. Tilgjengeligheten av et depositum utgjør ikke rett til å utøve oppfinnelsen ifølge denne søknaden ved derogasjon av et hvilket som helst patent utstedt derpå, eller ved en eventull deling eller kontinuering av denne søknaden. ;EKSEMPEL 2 ;Immunohistok. iemisk lokalisering av RBl- proteinet ;Sammenhengen mellom nærvær og fravær av RBl-proteinet med nærvær eller fravær av RBl-genet, ble demonstrert ved anvendelse av RBl-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Vevskulturceller, inkludert cellelinjene SW613, en RBl-gen-positiv brystkreftcellelinje, og MDA-MB468, en RB1-gen-negativ brystkreftcellelinje ble dyrket i 48 t i RPMI 1640-medium supplementert med 20$ fetalt kalveserum og 0,1$ pennicillin/Streptomycin-oppløsning. Cellene ble skylt to ganger med kald PBS. Cellene ble fiksert med 5$ eddiksyre i etanol i 6 min. ved 4°C. ;Etter to vask med kald PBS, ble uspesifikk binding blokkert ved inkubering av cellene med PBS inneholdende 1% normalt hesteserum. 3% BSA og 0,2$ Triton x-100. Fikserte celler ble deretter skylt med kald PBS og inkubert med spesifikk RBI-MAB P2 supernatant fortynnet i PBS (1:10) i 1 time ved 37 °C. Cellene ble deretter vasket med kald PBS, PBS inneholdende 1$ Triton x-100 og til slutt PBS. ;Spesifikk binding av RBl-antistoff til cellene ble visuali-sert ved inkubasjon av cellene med biotinylert anti-muse-IgG-antistoff (fortynnet 1:200 i PBS) i 1 time ved 37" C. Etter vask av cellene tre ganger med kald PBS, ble ..cellene inkubert med ABC (avidin:biotin-kompleks) reagens ved 37°C i 30 min., vasketr med kald PBS og deretter inkubert med nylaget DAB-(3,3'-diaminbenzidin-tetrahydroklorid)-oppløsning ved romtemperatur i 4 min. DAB-oppløsningen ble preparert ved oppløsning av 6 mg DAB i 10 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 7,6, inneholdende 0,3$ natriumazid og 0,03$ hydrogenperoksyd. Cellene ble deretter vasket med destillert vann og fargede celler ble analysert ved mikroskopisk undersøkning. Resultatene er vist i fig. 3A og 3B. Polyklonalt antistoff RB1-MAb20 farvet alle cellene fra SW613-cellelinjen kjent for å være positive for RBl-genet (figur 3a). Ingen antigen-antistof f -kompleksdannelse ble påvist i dyrkede celler fra den RB-negative cellelinjen MDA-MB468 (fig. 3B). ;Evnen som RBl-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse har når det gjelder detektering av fravær av ekspresjon av RBl-proteinet i brystkreftvev, ble også undersøkt. Farvings-prosedyren kan anvendes på vevsdeler preparert ved hvilke som helst av et antall konvensjonelle teknikker kjent for fagfolk. Immunofarvingsprosedyrene anvendt for å påvise nærvær eller fravær av RBl-protein i brystvev kan anvendes på paraffinsnitt eller på frosne snitt. Paraffinomgitte vevssnitt ble avparaffinisert og hydrert ved kontakting med xylen i 5 min., to bytt av 100$ etanol i 5 min. hver, 70$ etanol i 5 min. og 50$ etanol. De ble deretter skylt i 5 min. i PBS. Snittene ble deretter inkubert i 30 min. med PBS inneholdende 10$ normalt geiteserum. Snittene ble deretter inkubert overnatt ved 4°C med RBl-antistoff fortynnet 1:80 i PBS. Etter vasking av vevssnittene i 10 minutter i buffer, ble de inkubert i 60 min. med fortynnet biotinylert andre antistoffoppløsning. Det andre antistoffet er et antistoff rettet mot muse-IgG. Anvendelse av den detekterbare markøren på et andre antistoff muliggjør anvendelsen av umerket RBl-antistof f i den histokjemiske prosedyren. Etter at vevssnittene ble vasket i 10 min. i buffer, ble snittene inkubert i 30 min. med ABC-reagens. Etter at vevssnittene ble vasket i 10 min. i PBS, ble snittene inkubert i 10-20 min. i perok-sidasesubstratoppløsning (DAB). Etter vasking av vevssnittene i 5 min. i vann, ble de mot-farvet med Maycr's haemalum og anbragt før mikroskopisk analyse. ;I en foretrukket utførelsesform ble brystvevsbiopsy-frosne snitt (6-8 jjm) kuttet i en kryostat ved -20° C og post-fiksert i aceton i to min. ved romtemperatur etterfulgt av behandling med periodatlysinparaformaldehyd, pH 7,4, i 8 min. ved 4°C. Etter blokkering av uspesifikk binding med ikke-immunt svineserum (1:5 fortynnet i fosfatbuffret saltvann, pH 7,2; PBS) i ti minutter, ble vevssnittene inkubert med RBl-Ab 20 (fortynnet 1:100 i PBS) i 60 min. ved romtemperatur og deretter skyldt. Biotinylert svine-anti-kanin-immunoglobulin -antiserum ble deretter påført, etterfulgt av avidin-biotin-peroksydasekompleks. Peroksidase ble lokalisert ved anvendelse av diaminobenzidin-hydrogenperoksyd-reaksjonen. Kjernen ble forsiktig mot-farvet med Mayer's haemalum. ;Det er tydelig at fikseringsmetodene kan varieres uten å påvirke rammen av foreliggende oppfinnelse. En hvilken som helst fikseringsmetode kan anvendes som er egnet for å bevare RBl-proteinet in situ og tillate innføring av RBl-antistoff til RBl-proteinstedet. Det er også nødvendig at fikserings-prosedyren ikke virker inn på binding av RBl-antistoff til RBl-antigen. ;EKSEMPEL 3 ;Sammenheng mellom brvstkarsinomgrad og stadium ;med redusert deteksjon av RBl- protein ;Et hovedproblem ved å forstå DNA-probe-dataene tilveiebragt ved anvendelse av tumorbiopsier er heterogenisiteten til den anvendte vevsprøven. Det er mulig å oppnå en indikasjon på prosentandel tumorceller i et biopsy ved standard histologisk analyse, men det er vanskelig å anslå andelen tumorceller innenfor prøven som anvendes for preparer-ing av DNA. De fleste prøvene som er studert har mindre enn 50$ tumorceller, og de gjenværende cellene omfatter stromalceller, lymfocytter og andre. En delesjon av et RBl-allel i 50$ av tumorcellene kan derfor bare resultere i en grunnleggende reduksjon i hybridisasjonssignal på 12,5$. Det er derfor mulig at en del av tumorbiopsiene med dette nivået av RBl-tap ikke blir oppdaget ved DNA-probeanalyse på grunn av begrensningene til teknikken. ;Immunohistokjemisk påvisning ved anvendelse av RBl-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse i tumorvevsnitt tilveiebragte en mer sensitiv analyse for nærvær eller fravær av RBl-protein. Farvingen innenfor brystvev, inkludert normale bryst, godartet fibrocystisk bryst og fibroadenomprøver ved anvendelse av antistoff RB1-Ab20 demonstrerte jevn farving av alle epitelcellene innenfor brystet, med hovedsakelig nukleærfarving. Fig. 4a demonstrerer det nukleære og cytoplasmiske farvingsmønsteret av epitelet til normal brystlobul (åpen pil). Myoepiteliske celler og stromalceller er ikke reaktive med RB1-Ab20 og fremkommer som negative (lukket pil). Den nukleære lokalisasjonen av RBl-proteinet er i samsvar med funnene av et område aminosyrer (PKKK eller Pro-Lys-Lys-Lys) karakteristisk for det nukleære lokalisa-sjonssignalet som blir funnet i nukleære proteiner så som SV 40 stort T antigen. Alle brystepitelceller uttrykker normalt RB1 for å tilveiebringe klart detekterbare nivåer av protein. ;Av 77 karcinomprøver undersøkt ved DNA-analyse for RB1-organisasjon ble immunhistokjemisk analyse som beskrevet i eksempel 2 utført på 56. I 40 av disse karcinomprøvene demonstrerte alle tumorcellene nukleær reaktivitet, med en viss variasjon i farvingsintensitet. Fig. Rb demonstrerer et vanlig farvingsmønster til karsinomer hvori hovedsakelig alle tumorcellekjerner reagerer (pil) med mindre variasjoner i farvingsintensitet. Omgivende stromalceller J[S) viser ingen tegn på reaktivitet med RB1-20 antistoffet. I gjenværende 16 karsinomer var det varierende proporsjoner av umerkede tumorceller. Elleve av disse ble vist å ha en alterering i RBl-genet (se tabell 1), idet andelen av farvede tumorceller varierte fra under 5$ i tumorprøver med det mest markerte tapet av RB1 (410Ca, se fig.4c) til rundt 95$ av celler reaktive i et annet tilfelle. I fig. 4c demonstrerer farvingsmønsteret av et tumorsnitt fra pasient 410 at en liten gruppe tumorceller reagerer med RBl-antistoff (pil) mens resten av tumorcellene er negative. Dette var et stort farvingsområde innenfor karsinomet. I de fleste karsinomer var det ikke noe klart forhold mellom proporsjonen av tumorceller som ble farvet og nivå av tap eller rearrangement av RB1. Distribusjonen av ureaktiv kjerne var enten som små grupper eller øyer av tumorceller (dvs. sammenhopning) eller som celler spredt rundt i tumoren. Sistnevnte mønster var i hovedsak i de tumorene som viste minimalt tap av reaktivitet. ;Bare ett karsinom (602Ca) med en klar elterering av RB1 viste ingen tegn på tap av reaktivitet overfor RB1-Ab20. Analyse av DNA fra denne tumoren viste både en delesjon av anvendelse av en RB1 DNA-probe og et rearrangement (ved anvendelse av en annen RB1 DNA-probe). Det er derfor sannsynlig at disse to altereringene derfor omfatter det samme allelet som dermed muliggjør dannelsen av et normalt RBl-protein fra det normale allelet. ;I 5 prøver hvor det ikke var noen påvisbare altereringer i RBl-genet, var det tumorceller i prøven som manglet detekter-bart RBl-protein, dvs. var ufarvede. I 4 av disse tilfellene, 5$ eller mindre av det totale antallet tumorceller innenfor snittet, ufarvet, men i ett tilfelle var 50$ av cellene negative for RBl-protein (se tabell 1). Disse prøvene bringer prosentandel tumorer med minst noen celler negative for RB1-ekspresjon til 29$. Samlet viser dataene tilveiebragt på RBl-ekspresjon i primære brysttumorceller at det ikke bare er detekterbare tap av RB1 DNA i tumorcellene, men også et tap av funksjon målt ved ekspresjon av RBl-protein. I tillegg har anvendelsen av RBl-antistoff for å påvise RBl-protein innenfor vevssnitt vist at deteksjon av tap av RBl-funksjon er hyppigere enn detekterbar genalterering. RBl-antistoff-farving av vevssnitt i denne situasjonen er derfor av stor verdi. ;Ved anvendelse av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ble altereringer i RBl-genet og genfunkjsonen korrelert med den bestemte tumortypen, samt grad og stadium til tumoren. En detekterbar gendelesjon ble bare observert i én grad I-tumor (et tubulært karsinom), og i ingen stadium I-tumorer. Generelt økte frekvensen av genetiske forandringer av RB1 med dårligere differensiering av tumoren, og med spredningsgraden (tabell 2). Tap av RBl-proteinekspresjon i tumorceller var også korrelert med mere langtkomne, mindre godt differensierte tumorer (tab. 2). Til tross for at hverken gen-alterering eller tap av RBl-proteinekspresjon korrelerer med dårlig korttids (mindre enn 24 mndr. ) prognose, på grunn av at alterering eller delesjon av RBl-genet ikke korrelerer med langtkommet sykdom, kan en korrelasjon med sykdomsfritt intervall eller fem års overlevelse gjøres gjeldene når lengere tids oppfølginsdata er tilgjengelige. ;Grad I-tumorer er de mest - og grad III de minst - godt differensierte tumorene. En sykdom er stadium 1 dersom bare en lokalisert tumor blir preparert; stadium 2, dersom en tumor er tilstede og innbefatning av lokale lymfeknuter er påvist. Stadium 3 angir nærvær av en stor tumor med hud-forankring (lokal invasjon) og stadium 4 sykdom, en tumor pluss fjern metastase. ;Data angitt heri, angir at tap av RBl-funksjon er viktig ved progressjon av humant brystkarsinom. Bevis fra retinoblastom, osteosarkom og fibrosarkompasienter angir at—tap av funksjon av genet er av meget stor betydning for genesen av tumoren. ;Fagfolk vil sette pris på foreliggende oppfinnelse, samt kunne utføre hensikten og tilveiebringe de nevnte fordelene. Antistoffene, prosedyrene og teknikkene beskrevet heri, er presentert å representere foretrukne utførelsesformer, eller ment å tjene som eksempler. *

Claims (13)

1. Antistoff med spesifikk bindingsaffinitet for RBl-proteinproduktet uttrykt fra retinoblastomgenet i cancerceller, karakterisert ved at nevnte antistoff produsert ved immunisering av et vertsdyr med et peptid beliggende ved eller nære den C-terminale enden til RB1-proteinsekvensen, i det nevnte peptid omfatter sekvensen cys-lys-pro-leu-lys-lys-leu-phe-arg-asp-ile-glu-gly-ser-asp-glu-ala-asp-gly-ser-lys, og nevnte antistoff bindes spesifikt til RBl-proteinet i cancerceller.

2. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antistoff er et polyklonalt antistoff.

3. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antistoff er et monoklonalt antistoff.

4. Murint hybridom, karakterisert ved at det produserer et monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 og at den har deponeringsnummer ATCC HB 10093.

5 . Anvendelse av antistoffet ifølge krav 1 i en fremgangsmåte for detektering av fravær av RBl-proteinet i tumorceller, ved at følgende trinn utføres: preparering av vevssnitt fra en tumor; inkubering av antistoffet ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, eller 8 med nevnte preparerte vevssnitt; og detektering av fraværet av spesifikk binding av nevnte antistoff til nevnte vevssnitt.

6. Anvendelse av antistoffet ifølge krav 1 i en fremgangsmåte for detektering av subpopulasjoner av celler manglende RBl-protein, ved at følgende trinn utføres: preparering av vevssnitt fra tumorer; inkubering av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, med nevnte preparerte vevssnitt; og detektering av spesifikk binding av nevnte antistoff til nevnte vevssnitt.

7 . Anvendelse av antistoffet ifølge krav 1 i en fremgangsmåte for forutbestemmelse av prognosen for cancerpasienter, ved at antall tumorceller som mangler i RPl-protein bestemmes ifølge krav 6.

8. Anvendelse ifølge krav 7, ved at vevene er fra tumorer valgt fra gruppen bestående av karsinom fra bryst, karsinom fra ovarie, karsinom fra blære, karsinom fra lunge, karsinom fra cervix og bløtvevssarkom.

9. Anvendelse ifølge krav 7, ved at tumorene velges fra gruppen bestående av retinoblastom, osteosarkom eller fibrosarkom.

10. Anvendelse av antistoffer ifølge krav 1 i ^en fremgangsmåte for bestemmelse av prognosen til cancerpasienter, ved at følgende trinn utføres: preparering av vevssnitt fra tumoren til nevnte pasient; inkubering av antistoffet ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, inklusivt, eller krav 4 med nevnte preparerte vevssnitt; påvisning av spesifikk binding av nevnte antistoff til nevnte vevssnitt; og bestemming av antall celler som mangler RBl-protein.

11. Anvendelse ifølge krav 10, ved at vevene er fra tumorer og fra gruppen bestående av karsinom fra bryst, karsinom fra ovarie, karsinom fra blære, karsinom fra lunge, karsinom fra cervix og bløtvevskarsinom.

12. Anvendelse ifølge krav 10, ved at tumorene velges fra gruppen bestående av retinoblastom, osteosarkom eller fibrosarkom.

13. Anvendelse av antistoff ifølge krav 1 i en fremgangsmåte for diagnoser og prognoser av en cancerpasient, ved at følgende trinn utføres: biopsidannelse av en tumor; preparering av vevssnitt fra nevnte tumorvev; inkubering av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, eller 4 med nevnte preparerte vevssnitt for å danne et antistoff-antigen-kompleks; og detektering av antistoff-antigen-komplekset som blir dannet.