NO160526B

NO160526B - Fremgangsmaate for fremstilling av en forbindelse som omfatter en 1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dienring.

Info

Publication number: NO160526B
Application number: NO823326A
Authority: NO
Inventors: Stephen Colin Taylor
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1981-10-06
Filing date: 1982-10-04
Publication date: 1989-01-16
Also published as: AU8913182A; JPH0542417B2; DK164071B; ES516275A0; ZA827333B; AU562987B2; IL67003A0; ES8400143A1; DK164071C; NO823326L; GR76993B; US4508822A; DE3268971D1; JPS5871891A; EP0076606B1; DK443282A; US5036009A; AU591936B2; IL67003A; IE822345L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av cykliske dihydroksyforbindelser ved en biokjemisk fremgangsmåte, nærmere bestemt forbindelser som omfatter en 1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dienring.

Fremstillingen av cykliske dihydroksyforbindelser ved å tilføre aromatiske forbindelser til mutantstammer av Pseudomomas-arter, Alkaligenes-arter og Beirjerinckia-arter, som i sin naturlige form kan utnytte bestemte aromatiske forbindelser som karbonkilder for sin vekst, er kjent. Konsentra-sjonene av cykliske dihydroksyforbindelser fremstilt av slike mikroorganismer er lave, vanligvis mindre enn 2 gram pr. liter fermenteringsvæske. Dertil må enzymene for fremstillingen av cykliske dihydroksyforbindelser induseres i cellene før deres anvendelse ved å eksponere dem mot aromatiske forbindelser.

Vi har nå funnet at når celler av bestemte mutantstammer av Pseudomonas putida tilføres aromatiske forbindelser, oppnås høyere konsentrasjoner av cykliske dihydroksyforbindelser enn man hittil har oppnådd, og at en større variasjonsbredde av aromatiske forbindelser kan omdannes til cykliske dihydroksyforbindelser. De cykliske dihydroksyforbindelser fremstilt av de ovenfor nevnte mutanter er nyttige mellomprodukter ved fremstilling av ringholdige polymerer som er mer fullstendig beskrevet i vår britiske patentsøknad nr. 8130114.

Representative kulturer av Pseudomonas putida som er egnet for mutasjon for å danne mutantstammene som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse, er deponert ved National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, Aberdeen, Scotland, hvor de er tildelt betegnelsen NCIB 11680

og NCIB 11767.

Vi har fremstilt første-mutantstammer av Pseudomonas putida NCIB 11680 og Pseudomonas putida NCIB 11767 som ikke lenger er i stand til å vokse på benzen eller toluen og som produserer cykliske dihydroksyforbindelser fra bestemte aromatiske forbindelser. Vi har også fremstilt fra første-mutantstammen av Pseudomonas putida NCIB 11767 ytterligere mutantstammer som er konstitutive for et enzym som omdanner bestem-

te aromatiske forbindelser til cykliske dihydroksyforbindel-

ser (heretter referert til som "konstitutiv stamme" for

enkelhets skyld). Den konstitutive stamme gir den fordel at det ikke er nødvendig med et induksjonstrinn for enzym før mikro-organismens produksjon av cykliske dihydroksyforbindelser kan skje.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er karakterisert ved at man: (1) dyrker en mutantstamme i et dyrkningsmedium som inneholder en egnet karbonkilde, idet mutantstammen (a) omfatter et enzym for fremstilling av en cyklisk dihydroksyforbindelse fra benzen eller toluen, (b) ikke har evne til å vokse på benzen eller toluen, og (c) er avledet fra en stamme av Pseudomonas putida som har evne til å vokse på benzen

eller toluen;

(2) tilfører, etter vekstperioden, en benzenforbindelse, naftalen eller bifenyl og en energikilde til mutantstammen i et medium som i liten eller ingen grad understøtter

veksten av mutantstammen; og

(3) lar mutantstammen omdanne den aromatiske forbindelse til en 1,2-dihydroksycykloheksa-3,5-dien-ring-forbindelse.

Den aromatiske forbindelse som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis monocyklisk,

men den kan også omfatte flere cykliske ringer, nemlig naftalen eller bifenyl.

Når det anvendes en substituert aromatisk forbindelse ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan den ha en eller flere substituenter som kan være hydrokarbylgrupper med 1-4 karbonatomer, f.eks. metyl, etyl eller vinyl og/eller heteroatomer eller hetero-grupper, f.eks. halogen.

De ovenfor nevnte førstemutantstammer av Pseudomonas putida som kan brukes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og hvor et enzym som omdanner aromatiske forbindelser til cykliske dihydroksyforbindelser, er induserbart, kan fremstilles ved å behandle Pseudomonas putida NCIB 11680 eller fortrinnsvis Pseudomonas putioda NCIB 11767 under mutasjonsbetingelser for disse, hvorved man får mutantstammer som ikke lenger er i stand til å utnytte toluen eller benzen som en eneste karbonkilde for vekst, og som når de dyrkes i et flytende medium som inneholder pyrodruesyre som eneste karbonkilde, i nærvær av toluen, utskiller et stoff som har en UV-absorbanstopp ved 265 nanometer. Den ovenfor nevnte mutasjon kan iverksettes ved kjemiske og/eller fysiske midler. Kjemisk mutasjon kan iverksettes ved å behandle mikroorganismen med N-metyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin, en behandling som passende kan utføres som beskrevet av Oraston, Journal of Biological Chemistry, 1966, vol. 241, s.3800-3810. Fysisk mutasjon kan iverksettes ved elektromagnetisk stråling, f.eks. UV-lys.

Den ovenfor nevnte konstitutive stamme som kan anvendes

ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles ved å behandle førstemutantstammen av Pseudomonas putida NCIB 11767 under mutasjonsbetingelser som beskrevet ovenfor, hvorved man får stammer som etter vekst i fravær av en aromatisk forbindelse, har evnen til å produsere cykliske dihydroksyforbindelser fra aromatiske forbindelser. Valg av passende konstitutive stammer fra produktet av mutasjonsbe-handlingen kan lettes ved å dyrke cellene etter mutasjon på

et fast agarmedium som inneholder pyrodruesyre eller glukose som karbonkilde. Etter dyrking kan koloniene på agarplatene oversprøytes med en oppløsning av katechol i vann, idet kolonier av celler som hurtig blir gulgrønne er konstitutive med hensyn til et enzym som omdanner katechol til 2-hydroksymucon-semialdehyd (Nozaki, Topics in Current Chemistry (English Review) 1979, vol. 78, s.145-186). Dette enzym katalyserer

et av trinnene „i den oksydative nedbryting av benzen i Pseudomonas putida NCIB 11680 og Pseudomonas putida NCIB 11767, og vi har funnet at det i sin ekspresjon er knyttet til enzymet som omdanner benzen til den cykliske dihydroksyforbindelse. De celler som blir grønne etter eksponering mot katechol, er derfor den ønskede konstitutive stamme.

Den konstitutive stamme kan være følsom for katabolitt-undertrykkelse av karbonkilder slik som glukose og kasaminosyrer. Forbedrede konstitutive stammer som ikke er følsomme for slik katabolittundertrykkelse, kan erholdes ved mutasjon av de konstitutive stammene ved behandlinger som beskrevet ovenfor. De forbedrede konstitutive stammer kan spores opp ved å dyrke kolonier av de konstitutive stammene som har vært utsatt for en mutasjonsbehandling, på et agarmedium som inneholder en blanding av glukose og kasaminosyrer som karbonkilder, idet de koloniene som blir gulgrønne etter eksponering mot katechol, omfatter den forbedrede konstitutive stamme.

Celler av mutantstammene for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan dyrkes i vanlig brukte vekstmedier ved en kontinuerlig teknikk, satsvis teknikk eller satsvis teknikk ved tilførsel av næringsstoffer. Når første-mutantstammene anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelsen, dyrkes de fortrinnsvis ved en satsvis teknikk

under tilførsel av næringsstoffer, idet en aromatisk forbindelse tilsettes kulturen mens det tilføres friskt medium.

Dyrkingsmediet hvori mutantstammer for anvendelse ved den foreliggende oppfinnelse kan dyrkes, omfatter en vandig oppløsning av mineralsalter og en passende karbonkilde. Karbonkilden kan f.eks. være eddiksyre, glukose eller etanol. Konsentrasjonen av karbonkilden kan variere over et stort om-råde, men er vanligvis mellom 1 % (vekt/vol.) og 5 % (vekt/ vol.). Oksygen eller en oksygenholdig gass må være til stede under dyrkingsperioden. Temperaturen i mediet under dyrkingsperioden kan variere betraktelig, men vil normalt være i omr-dået 25-35°C. pH i mediet holdes innenfor området 5,5-8,0 under dyrkingen og fortrinnsvis ved 6,5-7,5. Størrelsen av kulturen kan variere betraktelig, f.eks. mellom 1,5 og 500 liter.

Etter dyrkingsperioden anvendes cellene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Cellene kan høstes, f.eks. ved sentrifugering eller flokkulering, eller de kan anvendes di-rekte i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Når cellene høstes, resuspenderes de i en oppløsning av mineralsalter som ikke gir signifikant cellevekst, f.eks. fosfat eller tri(hydroksymetyl)aminometan-pufferoppløsninger eller vanlig brukt dyrkingsmedium som imidlertid mangler eller inneholder lite av en eller flere essensielle bestanddeler. Vanligvis er konsentrasjonen av de resuspenderte cellene 1-30 g tørrvekt pr. liter. Cellene holdes ved en temperatur på 20-40°C og pH-verdien holdes mellom 7,5 og 8,5. Oksygen eller en oksygenholdig gass tilsettes til cellesuspensjonen slik at oksygenspenningen holdes større enn 1 % av metning. En passende energikilde tilsettes, fortrinnsvis som en kontinuerlig tilførsel, til cellesuspensjonen, slik at konsentrasjonen av energikilden holdes ved en passende konsentrasjon, fortrinnsvis mellom 0,05 og 0,5 % (vekt/volum). Eksempler på egnede energikilder omfatter bl.a. alkoholer, f.eks. etanol, karboksylsyrer, f.eks. eddiksyre, og karbohydrater f.eks. glukose. Energikilden er fortrinnsvis etanol eller eddiksyre.

Det aromatiske hydrokarbon, f.eks. benzen, klorbenzen, toluen, kan tilsettes til cellesuspensjonen som en gass i strømmen av oksygen eller oksygenholdig gass, men fortrinnsvis tilsettes det som en væske når det er en væske.

Tilsetningshastigheten av det aromatiske hydrokarbon

til kulturen av en mutantstamme ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er vanligvis ca. 0,5-10 gram pr. gram tørrvekt av celler pr. time. Tilsetningshastigheten for energikilden kan variere under omdannelsen, men er vanligvis i området 0,1-2,0 gram pr. gram tørrvekt av celler pr. time.

Den produktive levetid for cellesuspensjonen er vanligvis mellom 5 og 50 timer. Etter denne periode fjernes cellene ved sentrifugering og/eller flokkulering. Friske celler kan tilsettes til supernatantvæsken og fremgangsmåten gjentas. Ved avslutningen av fremgangsmåten inneholder supernatantvæsken vanligvis mellom 10 og 50 gram pr. liter av en cis-1,2-dihyd-roksy-cykloheksa-3,5-dien eller en homolog eller analog derav.

De cykliske dihydroksyproduktene fra fremgangsmåten iføl-ge foreliggende oppfinnelsen ekstraheres fortrinnsvis fra den vandige reaksjonsblanding ved oppløsningsmiddelekstraksjon med et egnet polart oppløsningsmiddel. Eksempler på polare opp-løsningsmidler som kan anvendes omfatter bl.a. etylacetat, dietyleter og metylenklorid. Mer foretrukket er det å anven-de kontinuerlige ekstraksjonsfremgangsmåter. Vi utelukker imidlertid ikke muligheten av at f.eks. det vandige mediet, etter fraseparering av cellene, inndampes og resten oppløses i et egnet oppløsningsmiddel, f.eks. metanol, etanol eller metylenklorid.

Dihydroksyforbindelsene fremstilt ved fremgqangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan omdannes til derivater derav, f.eks. acetat, benzoat, pivalat, karbonat. Slike derivater kan ofte omdannes til polymerer og kopolymerer, som mer fullstendig beskrevet i vår britiske patentsøknad nr. 8130114.

Forskjellige aspekter ved foreliggende oppfinnelse beskrives i de følgende eksempler.

Dyrkningsmedier

Medium A

Konsentrert fosforsyre (0,7 g/liter), MgS04-7H20 (1,6 g/ liter), K2HP04.3H20 (0,9 g/liter), ammoniumsulfat (1,5 g/liter, jern(II)sulfat (0,025 g/liter), CuS04-5H20 (0,001 g/liter), MnS04-4H20 (0,005 g/liter), ZnS04.7H20 (0,005 g/liter) og kal-siumkarbonat (0,065. g/liter) ; pH-verdien ble justert til 7 med.natriumhydroksyd.

Medium B

Medium A inneholdende 1 % vekt/volum pyrodruesyre og 0,5 % vekt/volum eddiksyre.

Medium C

Medium A uten ammoniumsulfatet.

Medium D

Medium A inneholdende 1 % vekt/volum pyrodruesyre.

Medium E

Konsentrert fosforsyre (2,2 g/liter), MgS04.7H20 (0,8 g/ liter), K2 S04 (0,45 g/liter), (NH4)2S04 (5 g/liter), Fe S04. 7H20 (0,04. g/liter), CuS04-5H20 (mg/liter), MnS04.4H20 (5 mg/ liter), CaCO^ (65 mg/liter), og glukose (15 g/liter); pH-verdien ble justert til 7,5 med natriumhydroksydoppløsning.

Medium F

Bauschop og Elsdons medium som beskrevet i Journal of General Microbiology, 1960, vol. 23, s,457-479.

Medium G

Luria-væskemedium som beskrevet i "Experiments in Molecular Genetics" av J H Miller, publisert av Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1972.

Fremstilling av en mutantstamme av Pseudomonas putida NCIB 11680 for anvendelse i foreliggende oppfinnelse

Pseudomonas putida NCIB 11680 ble dyrket frem til tidlig eksponensiell vekst i et mineralsaltmedium som inneholdt 0,2 % vekt/volum natriumacetat som karbonkilde. Cellene ble høstet ved sentrifugering og suspendert på nytt ved en konsentrasjon av 0,2 gram tørr cellevekt pr. liter i 20 ml 25 millimolar sitronsyre-natriumcitratpuffer ved pH-verdi 5,5 som inneholdt 1 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Suspensjonen ble inkubert i 40 minutter ved 30°C hvoretter cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket tre ganger med 25 millimolar cit-rat-puffer ved pH 5,5. Cellene ble dyrket over natten i 0,2 % (vekt/volum) natriumacetat-mineralsaltmedium, og etter seriefortynning ble de platet ut på 0,4 millimolar natrium-acetatmineralsaltagar. Platene (100) ble inkubert i malte beholdere (kapasitet 2,5 liter) som hver inneholdt en glass-skål med 10 ml 10 % (vekt/volum) toluen i vann. Etter 3 da-gers inkubering ved 30°C, ble 30 eventuelle mutanter, dvs. kolonier med diameter mindre enn 0,5 mm, plukket ut og dyrket på nytt på en 0,2 % (vekt/volum) natriumpyruvatmineralsaltagar.

Hver mutant ble dyrket i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe under rysting i et vannbad ved 30°C, idet kolben inneholdt 50 ml 0,2 % (vekt/volum) natriumpyruvatmineralsaltoppløsning med toluen tilført i gassfasen som ifølge fremgangsmåten beskrevet av Gibson, Hensley, Yoshioka, og.-Mabry, i Biochemistry, 1970, vol. 9, sidene 1626-1630. Etter 20 timers dyrking ble prøver på 1 ml sentrifugert og UV-spektret for de klare super-natantene ble undersøkt mellom 300 og 220 nanometer. To mu-tanger produserte supernatantvæsker som inneholdt en forbindelse med en maksimum absorbans ved 26 5 nanometer på henholdsvis 72 og 65. Mutanten som hadde absorbansmaksimum på 72, refereres heretter til som mutantstamme A.

Fremstilling av mutantstammer av Pseudomonas putida NCIB

11767 for anvendelse i foreliggende oppfinnelse

Pseudomonas putida NCIB 1176 7 ble dyrket frem til tidlig eksponensiell vekstfase i medium G. Cellene ble høstet ved sentrifugering og resuspendert ved en konsentrasjon på 0,2 g tørr cellevekt pr. liter i 20 ml 25 millimolar sitronsyre-natriumcitrat-puffer, pH 5,5 som inneholdt 1 mg N-methyl-N'-.nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) . Etter 45 minutter ved 30°C ble cellene høstet ved sentrifugering, vasket to ganger med medium F <p>g deretter dyrket over natten i medium F som inneholdt 0,3 % (vekt/volum) natriumpyruvat ved 30°C. Etter seriefortynning ble cellene platet ut på en medium F agar som inneholdt 0,3 millimolar natriumpyruvat og inkubert i 1 liters malte beholdere som hver inneholdt 0,5 ml benzen i et glass-skål. Etter 3 dager ved 30°C ble det plukket ut 144 eventuelle mutanter, dvs. kolonier med mindre enn 0,5 mm diameter, og dyrket på nytt på en 0,2 % vekt/volum natriumpyruvat, medium F agar. 90 av disse mutantene ble undersøkt med' hensyn på produksjon fra benzen av en forbindelse som absorberte ved 260 nanometer som beskrevet ovenfor. En mutant som gav en supernatant væske med en maksimum absorbans ved 260 nanometer på 37, refereres heretter til som mutant-stamme B. Fremstilling av konstitutive stammer fra mutant B Fremgangsmåten som ble anvendt for mutering, var som beskrevet ovenfor. Etter behandling med NTG ble de vaskede, fortynnede cellene platet ut på medium F agar pluss 10 millimolar natriumpyruvat. Etter to dager ved 30°C ble koloniene oversprøytet med en oppløsning av katechol i vann (0,5 molar) og. de som hadde.skiftet over til en gulgrønn farve etter 5 minutter, ble valgt ut. Fra en total mengde på 1,8 x 10^ undersøkte kolonier ble det valgt ut 35 gulgrønne kolonier. Hver av disse, ble dyrket over natten i 16 ml av medium F pluss 0,3 % (vekt/volum) pyruvat. Celler ble høstet og resuspendert i 10 ml 25mM kaliumfosfatpuffer, pH 7,8, som in-. neholdt 0,4 voluml etanol. Hver av disse kulturene ble inkubert natten over i 250 ml koniske flasker i nærvær av 0,5 ml toluen som beskrevet ovenfor. Deretter ble supernatanter undersøkt med hensyn på forbindelser som absorberer ved 26 5 nanometer. En konstitutiv mutant som gav en absorbans ved 265 nanometer på 250, ble valgt ut og refereres heretter til som mutant-stamme C.

Mutantstamme C ble dyrket ved 30°C i 20 ml medium G

frem til tidlig eksponensiell vekstfase og deretter høstet, cellene ble resuspendert i 40 ml 0,1 molar MgS04.7H20. En 5 ml 5 ml alikvot ble UV-bestrålt i en Petri-skål av glass i 45 sekunder ved en dose på 1,6 MW/cm 2 x 100. Cellene ble deretter dyrket i mørket i fem 20 ml alikvoter av medium F pluss

10 millimolar natriumpyruvat.

Etter"2 dager ved 30°C ble kulturene seriefortynnet og platet ut på medium F pluss 75 millimolar glukose og 1 % (vekt/ volum) vitaminfrie kasaminosyrer og inkubert i ytterligere 2 dager ved 30°C.

Kolonier ble deretter oversprøytet med katechol som beskrevet

ovenfor, og det ble valgt ut gulgrønne kolonier. Av en total mengde på 4 x 10^ undersøkte kolonier ble 10 valgt ut og dyrket natten over i 10 ml medium F pluss 75 millimolar glukose og 1 % (vekt/volum) kasaminosyrer ved 30°C. Celler ble høstet og

resuspendert som beskrevet ovenfor i fosfatpuffer pluss etanol og bestrålt ved 70°C i nærvær av 0,5 ml toluen som beskrevet tidligere. Det ble valgt ut en konstitutiv mutant, som var mindre påvirket av katabolitt-undertrykkelse enn mutant C, og som ga en absorbans ved 26 5 nanometer på 61,2. (Mutant-stamme C ga under identiske betingelser en absorbans på 15,6). Denne mutanten refereres heretter til som mutantstamme D.

Eksempel 1

Dette eksempel viser fremstillingen av cis-1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dien ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

I en dyrkingsbeholder med omrøring ble 40 liter medium

B inokulert med mutantstamme A til en utgangscelletetthet på ca. 0,2 g celletørrvekt pr. liter medium. Etter 8 timers dyrking, ble en ytterligere porsjon av medium B tilsatt til kulturen i en hastighet på 2 liter pr, time i 4 timer. Deretter ble toluen tilsatt til kulturen i 10,5 timer i en tilsetningshastighet på 16,5 g pr. time. Cellene ble deretter høstet ved en celletetthet på 5,5 gram celletørrvekt pr. liter.

En porsjon av cellene ble resuspendert i 5,0 liter av medium C til en celletetthet på 25 gram celletørrvekt pr. liter. Etanol ble kontinuerlig, tilsatt til cellesuspensjonen i en hastighet på 6 gram pr. time. Benzen i gassform ble tilsatt til cellesuspensjonen i luftstrømmen i en hastighet på 20 gram pr. time. Temperaturen ble holdt ved 30°C og pH ble holdt ved 7,5. Luft ble tilsatt til den omrørte cellesuspensjonen i en hastighet på 1,5 liter pr. minutt. Etter 18 timer ble eksperimentet avsluttet når konsentrasjonen av cis-1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dien i supernatantoppløsningen' var 13 gram pr. liter.

Supernatantoppløsningen ble konsentrert ved rotasjonsfordamping ved 60°C til et volum på 1 liter. Den cykliske di-hydroksyforbindelsen ble kontinuerlig ekstrahert med 500 ml metylenklorid i 24 timer. Metylenkloridoppløsningen ble konsentrert ved rotasjonsfordamping ved 30°C, tilsats av pentan til konsentratet ga krystaller (30 gram) som ved hjelp av smeltepunktet, nmr., massespektroskopi og u.v. ble påvist å være cis-1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dien.

Eksempel 2

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble gjentatt med unntak av at etter at cellene var blitt resuspendert i medium C,

ble etanol tilsatt inntil en konsentrasjon på 0,3 % vekt/volum, og benzen og etanol ble tilsatt som en blanding (70:30) istedenfor separat, i en hastighet på 23 gram blanding pr. time.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av cis-1,2-di-hydroksy-3-klor-cyklo-heksa-3,5-dien ved fremgangsmåten iføl-ge foreliggende oppfinnelse.

Mutantstamme A ble dyrket som en satsvis kultur i medium A med 1 % (vekt/volum) pyrodruesyre som karbonkilde. Ved en celletetthet på 1 gram celletørrvekt pr. liter (etter 4 timers dyrking), ble toluen tilsatt til kulturen i luftstrømmen (tilsetningshastighet for toluen på 3 gram pr. time) og fer-menteringen ble fortsatt i ytterligere 16 timer. Celler ble høstet ved en tørrvekt på 1,5 gram pr. liter.

Celler ble resuspendert i 3,0 liter av Medium C til en celletetthet på 10 gram celletørrvekt pr. liter. Etanol

(15 gram) ble tilsatt til cellesuspensjonen. Klorbenzen ble

tilsatt til cellesuspensjonen i gassform i luftstrømmen (1,2 liter pr. minutt) i en hastighet på 4 gram pr. time.

pH i suspensjonen ble holdt ved 7,5 og temperaturen i suspensjonen ble holdt ved 30°C. Etter 24 timer ble cellene fjernet og reaksjonsblandingen ble konsentrert ved rotasjonsfordamp-ning ved 60°C under redusert trykk til et volum på ca. 400 ml. Konsentratet ble kontinuerlig ekstrahert med eter (250 ml) i 16 timer hvoretter eteroppløsningen ble tørket over vannfri MgSO^. Fordamping av oppløsningsmidlet fra en filtrert alikvot (50 ml) av denne oppløsning ga et rått fast stoff (1,92 g)

som ble rekrystallisert fra toluen/pentan hvorved man fikk cis-1,2-dihydroksy-3-klorcykloheksa-3,5-dien som farveløse krystaller (1,7Q g), smp. 95-96°C; proton-magnetisk resonans spektrum (100 MHz) i deuteriumkloroform ved 29°C ga signaler ved 62,5 (2H, singlet, forsvinner etter rysting av oppløsnin-gen med D20) 64 ,2 (1H, J1 2 6,4 Hz, J1 gH,4 Hz, H-l) ,

64,5 (1H, dublett, J2 x6,4 Hz, H-2), 65,8-6,2 (3H, multiplett, H-4, H-5 og H-6); infrarødt spektrum (KBr-skive) hadde topper ved 3280, 1640, 1580, 1380, 1340, 1310, 1280, 1170, 1090, 1040, 1000, 990, 930, 880, 835, 795, 670, 590 og 390 cm<1.>

Eksempel 4

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av cis-1,2-dihydroksy-3-metyl-cykloheksa-3,5-dien ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåten ifølge eksempel 3 ble gjentatt med unntak av at toluen ble brukt istedenfor klorbenzen.

Konsentrasjonen av cis-1,2-dihydroksy-3-metyl-cyklo-'heksa-3,5-dien i den fermenterende væske var 16 gram pr. liter, Den ble ekstrahert kontinuerlig med dietyleter. Tilsats av pentan til eteroppløsningen ga krystaller (28 gram) som ved hjelp av smeltepunktet, n.m.r., i.r. og massespekter ble påvist å være cis-1,2-dihydroksy-3-metyl-cykloheksa-3,5-dien.

Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer anvendelsen av en konstitutiv mutant i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Mutantstamme D ble inokulert i 20 liter av medium E til en utgangscelletetthet på 0,2 gram tørrvekt av celler pr. liter. Temperaturen ble holdt ved 30°C og pH ved 7,2. Dyrk-ingsbeholderen ble omrørt ved 500 opm. og luft ble tilsatt i en hastighet på 6 liter pr. minutt. Etter 16 timer ble cellene høstet ved sentrifugering ved en celletetthet på 4 gram celletørrvekt pr. liter.

En porsjon av cellene ble resuspendert i 3 liter av 25 nM kaliumfosfatpuffer, pH 7,6, og som inneholdt 1 gram FeS04-7H20 og 12 ml etanol. Celletettheten var 9 gram tørrvekt pr. liter. Temepraturen ble holdt ved 30°C og pH ved 7,6 med natrium-hydroksydoppløsning. En luft/oksygen-blanding ble tilsatt (1,0 liter/minutt) hvorved man fikk en oksygenspenning på 10% metning. Reaktoren ble omrørt ved 1400 omdr. pr. min. Benzen ble i væskeform tilsatt til reaktoren i en hastighet på 20 g pr. time og ytterligere 18 ml etanol ble tilsatt i tre alikvoter ved 2 timers intervaller. Etter 7 timer ble cellene fjernet ved sentrifugering hvorved man fikk 3 liter supernatant som inneholdt 29 gram/liter av cis-1,2-dihydroksycykloheksa-3,5-dien.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer anvendelsen av en konstitutiv mutant for å fremstille høye konsentrasjoner av cis-1,2-di-hydroksycykloheksa-3,5-dien ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Mutant-stamme C ble dyrket i 16 timer Bom en 20 liters satsvis kultur ved 30°C, pH 7,0 i medium D. Cellene ble høs-tet ved en tørrvekt på 3 gram/liter, og resuspendert i 5 liter 25 nM kaliumfosfat-puffer, pH 7,8, inneholdende 0,5 g FeSO^.

7H20. Luft ble tilsatt i en hastighet på 1 liter pr. minutt, reaksjonsblandingen ble omrørt med 800 omdr.pr. min. og temperaturen ble holdt ved 30°C. Benzen ble tilsatt i gassform i luftstrømmen i en hastighet på 20 gram pr. time i 20 timer og i alt 40 gram etanol ble tilsatt som alikvoter. Etter 20 timer inneholdt supernatantvæsken i alt 123 gram cis-1,2-dihydroksycykloheksa-3,5-dien i en konsentrasjon av 24,6 gram pr. liter.

Mutant-stamme D ble dyrket i 16 timer som en 20 liters satsvis kultur i medium E ved 30°C og pH 7,0. Etter høsting ble en porsjon av cellene resuspendert i 4 liter av mediet beskrevet i eksempel 6 inntil en celletetthet på 5 gram tørr-vekt pr. liter. Det ble tilsatt benzen, i væskeform , (12 g pr. time) og en kontinuerlig etanoltilførsél (2,5 g pr. time) til kulturen. Etter 8 timer ble cellene fjernet hvorved man fikk en supernatant væske som inneholdt cis-1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dien i en konsentrasjon, basert på den kjente ekstLnksjonskoeffisienten for denne forbindelse (Nakajima et al, Chemische Berichte, 1959, vol. 92, s.163) på 15 gram/liter.

Til supernatantvæsken ble en ytterligere porsjon av cellene tilsatt inntil en celletetthet på 8 gram celletørrvekt pr. liter og eksperimentet fortsatt. Etter ytterligere 16 timer inneholdt supernatantvæsken cis-1,2-dihydroksycyklo-heksa-3,5-dien i en konsentrasjon på 40 gram/liter.

Eksempel 8

Fremgangsmåten ifølge eksempel 6 ble gjentatt med unntak av at naftalen ble brukt istedenfor benzen. Naftalenet ble tilsatt ved starten av eksperimentet for å gi en konsentrasjon på 1,5 % vekt/volum cis-1,2-dihydroksy-l,2-dihydronaftalen var erholdt (20 gram).

Eksempel 9 til 11

Fremgangsmåten ifølge eksempel 7 ble gjentatt med unnta-gelse av at henholdsvis fluorbenzen, benzylalkohol og bifenyl ble brukt istedenfor benzen. Bifenyl ble tilsatt ved starten av eksperimentet inntil en konsentrasjon på 2 % vekt/volum.

Det ble erholdt henholdsvis cis-1,2-dihydroksy-3-fluor-cykloheksa-3,5-dien , cis-1,2-dihydroksy-3-fenylcykloheksa-SjS-dien og cis-1,2-dihydroksy-3-hydroksymetyl-cykloheksa-3,5-dien.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse som omfatter en 1,2-dihydroksy-cykloheksa-3,5-dienring, karakterisert ved at man: (1) dyrker en mutantstamme i et dyrkningsmedium som inneholder en egnet karbonkilde, idet mutantstammen (a) omfatter et enzym for fremstilling av en cyklisk dihydroksyforbindelse fra benzen eller toluen, (b) ikke har evne til å vokse på benzen eller toluen, og (c) er avledet fra en stamme av Pseudomonas putida som har evne til å vokse på benzen eller toluen; (2) tilfører, etter vekstperioden, en benzenforbindelse, naftalen eller bifenyl og en energikilde til mutantstammen i et medium som i liten eller ingen grad understøtter veksten av mutantstammen; og (3) lar mutantstammen omdanne den aromatiske forbindelse til en 1,2-dihydroksycykloheksa-3,5-dien-ring-forbindelse.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme av arten Pseudomonas putida anvendes stammen NCIB 11767.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymet som katalyserer omdannelsen, er et konstitu-tivt enzym.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som energikilde anvendes etanol.