NO147820B - Fremgangsmaate for isolering og utvinning av proteinhormoner som stammer fra humant hypofysevev - Google Patents
Fremgangsmaate for isolering og utvinning av proteinhormoner som stammer fra humant hypofysevev Download PDFInfo
- Publication number
- NO147820B NO147820B NO772697A NO772697A NO147820B NO 147820 B NO147820 B NO 147820B NO 772697 A NO772697 A NO 772697A NO 772697 A NO772697 A NO 772697A NO 147820 B NO147820 B NO 147820B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- growth hormone
- human
- extraction
- tissue
- hormones
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims description 13
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 9
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 title description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 18
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 18
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 7
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 4
- 101100120663 Drosophila melanogaster fs(1)h gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 25
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 25
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 229940113125 polyethylene glycol 3000 Drugs 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 2
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
- C07K14/615—Extraction from natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/854—Glands
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til
isolering og utvinning av proteinhormoner som stammer fra humant hypofysevev, hvorved en vandig ekstrakt inneholdende proteinhormonene underkastes en fraksjonert felning med et felningsmiddel.
Oppfinnelsen har til formål å tilveiebringe en fremgangsmåte for isolering av veksthormonet og andre proteinhormoner fra ekstrakter av hypofysevev, hvorved veksthormonet kan isoleres selektivt fra andre proteinhormoner og urenheter og derved oppnås i særlig ren tilstand og i høyt utbytte.
Det er kjent å isolere veksthormon ved ekstraksjon av hypofysevev og utfeining av veksthormonet fra ekstrakten ved hjelp av et felningsmiddel.
Som eksempler på litteratur hvor prosesser til utvinning
av humant veksthormon er beskrevet, skal nevnes:
1) Biochemica et Biophysica Acta 1963, 74, s. 525-531,
og
2) Acta Endocrinologica 1971, 66, s. 478-490.
En metode til adskillelse av blandinger av hypofyse-
hormoner er omtalt i sveitsisk patentskrift nr. 230.807.
Fra US-patenter 3.415.804 og 3.652.530 er det kjent fremgangs-måter til fraksjonering av proteinstoffer under anvendelse av polyetylenglykol. Anvendelse av visse blokk-kopolymerer er kjent fra US-patent 3.850.903.
Ved de kjente prosesser for utvinning av humant vekst-
hormon oppnås de største utbytter med dypfrosne hypofyser som utgangsmateriale, og ved anvendelse av skånsomme ekstraksjons-og felningsbetingelser. Typisk går man frem på følgende måte: 1) dypfrosne hypofyser ekstraheres med en nøytral eller basisk buffer, 2) ekstrakten felles med et felningsmiddel og/eller ved innstilling av pH-verdien til 4,8,
3) bunnfallet ekstraheres med en nøytral eller sur buffer,
4) ekstrakten renses ytterligere ved gjentagne feininger og/eller kolonnekromatografi, f.eks. gelfiltrering på
"Sephadex G100" (fornettet polydekstran).
Som felningsmidler i ovennevnte trinn 2 er tidligere anvendt dels ammoniumsulfat som imidlertid gir et urent slutt-produkt, dels aceton som denaturerer proteinene i en slik grad at de blir vanskelig oppløselig ved de etterfølgende ekstraksjoner, hvilket resulterer i et lavt utbytte.
Kvaliteten av veksthormonet undersøkes ved anvendelse
av bl.a. følgende metoder:
Biologisk aktivitet (Tibia- test):
Greenspan, F.S. et al.: "Bioassay of hypophyseal growth hormone: the tibia test", Endocrinology 45_ (1949), s. 455-463.
Immunologisk aktivitet:
Radial immunodiffusjon:
Mancini, G. et al.: "Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion", Immunochemistry 2
(1965), s. 235-254.
Radioimmunoassay:
Hanssen, K.F.: "Radioimmunoassay of growth hormone in human plasma", Acta Endocrinologica 71 (1972), s. 649-664.
Gelfiltrering:
Schleyer, M. et al.: "Comparative Investigation of Different Human Growth Hormone Preparations", Hormone and Metabolic Research 2 (1970), s. 174-180.
Elektroforese i polyakrylamidgel (PAGE):
Ornstein, L., Ann. N.Y. Acad. Sei. 121 (1964), s. 321 ff, Davis, B. J., Ann. N.Y. Acad. Sei. 121 (1964), s. 404 ff. Den biologiske aktivitet bestemmes ved Tibiatesten i forhold til WH0's 1. internasjonale standard for oksens veksthormon, hvis aktivitet er definert som 1 int. enh./mg;
den immunologiske aktivitet bestemmes ved radioimmunoassay i forhold til NBSB's 1. internasjonale referansepreparat av menneskets veksthormon, hvor aktiviteten av hver ampulle pr. definisjon er 0,350 internasjonale enheter. Det har vist seg at de to aktivitetsbestemmelser stemmer utmerket overens, og det tales derfor i de følgende eksempler bare om "enheter". Et rent veksthormon er karakterisert ved 1) en aktivitet på mer enn 2 internasjonale enheter pr. mg protein, 2) mer enn 90% finnes i monomer form, 3) ved PAGE av 100 ug kan efter proteinfarvning kun påvises bånd svarende til veksthormon eller veksthormon og 1-2 deamiderte former derav.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved
at den vandige ekstrakt iblandes polyetylenglykol med en molekylvekt på 3000-6000 til en konsentrasjon på 10-17 vekt%, idet oppløsningen før eller efter iblandingen innstilles på en pH-verdi på 4-6, fortrinnsvis 4,5-5,0, og det utfelte humane veksthormon, HGH, isoleres og, om ønsket, underkastes ytterligere rensning, hvorefter modervæsken eventuelt tilsettes ytterligere polyetylenglykol til en konsentrasjon på over 20 vekt%, og de utfelte hormoner, follikkelstimulerende hormon, FSH, og luteiniserende hormon, LH, isoleres.
Ved å gjennomføre feiningen på denne måte oppnås et
rent produkt i høyt utbytte. Således virker polyetylenglykol (PEG) mer selektivt som felningsmiddel enn ammoniumsulfat, hvorved man får veksthormonet i renere tilstand. Videre unngås den denaturering som aceton forårsaker.
Den overraskende effekt av oppfinnelsen ligger i at
det allerede i første trinn oppnås et stort utbytte av forholds-vis rent veksthormon, som herefter enkelt og uten vesentlig tap kan opparbeides til meget rent veksthormon. Sammenlignet med andre felningsmetoder er PEG-metoden ifølge oppfinnelsen enkel, selektiv og høyt-ytende. Det er ikke tidligere beskrevet metoder for fremstilling av veksthormon som fører til så
stort utbytte av så rent veksthormon.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ikke begrenset
til anvendelse av primære hypofyseekstrakter, men er også anvendelig ved isolering av peptid- og protein-hormoner fra dyrkningsmedier fra vevkulturer av hypofyser.
Som utgangsmateriale ved foreliggende fremgangsmåte
kan benyttes en vilkårlig kjent ekstrakt av humant hypofysevev eller humane vevkulturer som inneholder hypofysehormoner. Ekstrakten kan være fremstilt på i og for seg kjent måte,
så som ved formaling, hakking eller på annen måte findeling av hypofyser, og ekstraksjon med vandige bufferoppløsninger.
Et egnet ekstraksjonsmiddel er en vandig fosfatbuffer med
en pH-verdi på 8-9, så som 8,7. I stedet kan anvendes andre buffere ved høyere eller lavere pH-verdi.
Det er hensiktsmessig å tilsette PEG til den filtrerte ekstrakt ved en pH-verdi på 8-9, hvorefter pH-verdien bringes ned til 4,5-5,0, f.eks. 4,8 ved tilsetning av en syre så
som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre eller eddiksyre. Det er imidlertid også mulig først å innstille pH-verdien på
4,5-5,0, og derefter tilsette PEG. Eventuelt kan pH-innstillingen skje samtidig med PEG-tilsetningen.
De utfelte fraksjoner opparbeides på i og for seg kjent måte. Således kan bunnfallet isoleres ved sentrifugering, hvorefter det gjenoppløses i en buffer, så som ved pH 6,5-8, f.eks. pH 7,0. Derefter felles med mettet ammoniumsulfat-oppløsning. Det resulterende bunnfall frasentrifugeres og gjenoppløses i en buffer som kromatograferes på en kolonne inneholdende en molekylsikt eller en sur eller basisk ionebytter-harpiks. Ved kromatograferingen isoleres fraksjonene inneholdende de rene hypofysehormoner, så som veksthormonet.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal i det følgende illustreres nærmere ved hjelp av noen eksempler. Det skal bemerkes at innstillingen av pH-verdien i eksempel 3 skjer forut for tilsetningen av PEG, hvorved det på kjent måte ved det isoelektriske punkt utfelles en mengde rent vekst-
hormon som opparbeides for seg; ca. halvdelen av veksthormon-mengden finnes imidlertid stadig i oppløst tilstand og utvinnes i stort utbytte og i udenaturert form ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Eksempel 1
2 4 dypfrosne humane hypofyser homogeniseres under tilsetning av 100 ml av en buffer (I) med følgende sammensetning: 1,8% dinatriumhydrogenfosfat i vann, tilsatt IN natriumhydroksyd til pH 8,7. Blandingen sentrifugeres. Til 90 ml av den overliggende væske settes 24 ml av en vandig oppløsning av 12 g polyetylenglykol 6000 slik at konsentrasjonen er ialt 10,5 vekt/vol.% PEG. Efter omrøring i 30 minutter sentrifugeres, og bunnfallet som består av en komplisert blanding av ballaststoffer, kastes. pH-verdien av den overliggende væsken innstilles på 4,8 med IN saltsyre. Efter sentrifugering ekstraheres bunnfallet med 60 ml av en buffer (II) med følgende sammensetning: 1,4% dinatriumhydrogenfosfat, 4,9% mononatrium-dihydrogenfosfat, tilsatt IN natriumhydroksyd til pH 7,0.
Efter 1 times omrøring sentrifugeres, og den overliggende væsken tilsettes 60 ml mettet ammoniumsulfatoppløsning. Det sentrifugeres påny, og bunnfallet oppløses i 25 ml av en oppløsning (III) med følgende sammensetning: 2% aminoeddiksyre og 0,25% natriumhydrogenkarbonat. Oppløsningen påføres på
en kolonne, 7 9 cm lang og 2,5 cm i diameter, inneholdende "Sephadex" G100, ekvilibrert med oppløsning III. Kolonnen elueres med oppløsning III, fraksjonen svarende til eluerings-volum 2 60-320 ml oppsamles. De oppsamlede fraksjoner inneholder 260 enheter humant veksthormon, med en spesifikk aktivitet på 2,2 enheter pr. mg protein. Elektroforese på polyakrylamidgel av 100 ug protein viser kun 3 bånd, svarende til veksthormon og de deamiderte former.
Eksempel 2
250 dypfrosne humane hypofyser ekstraheres som angitt
i eksempel 1 med 1500 ml av buffer I. Til den overliggende væske settes 460 ml av en oppløsning bestående av 2 30 g polyetylenglykol 3000 og 270 ml vann, slik at konsentrasjonen er ialt 12 vekt/vol% PEG. Efter omrøring i 20 minutter og frasentrifugering av ballaststoffer, innstilles pH-verdien av den overliggende væsken på 4,9 med IN saltsyre. Efter omrøring i 20 minutter og sentrifugering, ekstraheres bunnfallet som angitt i eksempel 1 med 1000 ml av buffer II.
Efter omrøring natten over og sentrifugering settes 1000 ml mettet ammoniumsulfatoppløsning til den overliggende væsken. Det sentrifugeres påny og bunnfallet oppløses i 300 ml av
en oppløsning av 12 6 g urinstoff i 207 ml buffer III (se eksempel 1). Oppløsningen påføres på en kolonne, 100 cm lang og 11,4 cm i diameter, inneholdende "Sephadex" GlOO, ekvilibrert med buffer III. Kolonnen elueres med buffer III. Fraksjoner svarende til elueringsvolumet for veksthormon oppsamles. De samlede fraksjoner inneholder 2 900 enheter humant veksthormon, med en spesifikk aktivitet på 2,6 enheter pr. mg protein. Elektroforese på polyakrylamidgel av 100 [ ig viser kun 2 bånd, svarende til veksthormon og en deamidert form.
Eksempel 3
500 dypfrosne humane hypofyser ekstraheres som angitt
i eksempel 1 med 2000 ml buffer I. Efter sentrifugering innstilles pH-verdien på 4,8. Det sentrifugeres, hvorefter bunnfallet opparbeides som angitt under punkt a), mens den overliggende væsken opparbeides som angitt under punkt b).
a) Bunnfallet opparbeides til rent veksthormon ved ekstraksjon med buffer II, derefter feining med ammoniumsulfat og
gjenoppløsning i buffer III og kolonnekromatografering, alt som angitt i eksempel 2. Det oppnås herved 3400 enheter veksthormon med en spesifikk aktivitet på 2,7 enheter pr.
mg protein.
b) Den overliggende væsken på 19 50 ml tilsettes 650 ml oppløsning bestående av 325 g polyetylenglykol 3000 og
380 ml vann, slik at konsentrasjonen er ialt 12,5 vekt/vol% PEG. Det sentrifugeres. Bunnfallet underkastes ekstraksjon med buffer II, felning med ammoniumsulfat, gjenoppløsning i buffer III og kolonnekromatografering, alt som angitt i eksempel 2. Det oppnås herved 4230 enheter veksthormon med en spesifikk aktivitet på 2,6 enheter pr. mg protein.
Totalutbyttet av veksthormon fra 500 hypofyser har således vært 7 630 enheter.
Den ovenfor under punkt b) resulterende overliggende væske på 2550 ml tilsettes 650 ml oppløsning bestående av 325 g polyetylenglykol 3000 og 380 ml vann (til ialt 20 vekt/vol.% PEG). pH-verdien er uendret innstilt på 4,8.
Det sentrifugeres, og bunnfallet som består av ballaststoffer, kastes. Til 2000 ml av den overliggende væske settes 1000 ml oppløsning bestående av 500 g polyetylenglykol 3000 og 585 ml vann (til ialt 30 vekt/vol.% PEG). Efter omrøring i 1 time sentrifugeres, og det herav resulterende bunnfall inneholder follikelstimulerende hormon, FSH og luteiniseringshormon, LH.
Eksempel 4
100 ml dyrkningsmedium fra vevkultur av hypofyseforlapp, inneholdende 5 enheter veksthormon konsentreres ved ultra-filtrering til 1 ml. Det tilsettes 0,5 ml av en vandig opp-løsning, inneholdende 0,5 g polyetylenglykol 6000 pr. ml
slik at konsentrasjonen er ialt 16,6 vekt/vol% PEG. Oppløsningens pH-verdi innstilles på 4,8. Utfelningen fra-skilles, oppløses i 0,5 ml vann og påføres på en kolonne, 63 cm lang og 0,9 cm i diameter, inneholdende "Sephadex" G100,
ekvilibrert med buffer III. Det elueres med buffer III. Fraksjonene inneholdende veksthormon oppsamles. De samlede fraksjoner inneholder 1,0 enheter humant veksthormon med en spesifikk aktivitet på 2,0 enheter pr. mg protein.
Claims (1)
- Fremgangsmåte til isolering av proteinhormoner som stammer fra humant hypofysevev, ved hvilken en vandig ekstrakt inneholdende proteinhormonene underkastes en fraksjonert felning med et felningsmiddel, karakterisert ved at den vandige ekstrakt iblandes polyetylenglykol med en molekylvekt på 3000-6000 til en konsentrasjon på 10-17 vekt%, idet oppløsningen før eller efter iblandingen innstilles på en pH-verdi på 4-6, fortrinnsvis 4,5-5,0, og det utfelte humane veksthormon, HGH, isoleres og, om ønsket, underkastes ytterligere rensning, hvorefter modervæsken eventuelt tilsettes ytterligere polyetylenglykol til en konsentrasjon på over 20 vekt%, og de utfelte hormoner, follikkelstimulerende hormon, FSH, og luteiniserende hormon, LH, isoleres.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK346876A DK144731C (da) | 1976-07-30 | 1976-07-30 | Fremgangsmaade til isolering af proteinhormoner stammende fra humant hypofysevaev |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO772697L NO772697L (no) | 1978-01-31 |
| NO147820B true NO147820B (no) | 1983-03-14 |
| NO147820C NO147820C (no) | 1983-06-22 |
Family
ID=8123219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO772697A NO147820C (no) | 1976-07-30 | 1977-07-29 | Fremgangsmaate for isolering og utvinning av proteinhormoner som stammer fra humant hypofysevev |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4115375A (no) |
| JP (1) | JPS5338611A (no) |
| AR (1) | AR213530A1 (no) |
| AU (1) | AU507547B2 (no) |
| BE (1) | BE857327A (no) |
| CA (1) | CA1077839A (no) |
| DD (1) | DD131375A5 (no) |
| DE (1) | DE2733565A1 (no) |
| DK (1) | DK144731C (no) |
| ES (1) | ES461179A1 (no) |
| FI (1) | FI57669C (no) |
| FR (1) | FR2359852A1 (no) |
| GB (1) | GB1537795A (no) |
| HU (1) | HU175512B (no) |
| IL (1) | IL52610A (no) |
| IT (1) | IT1086345B (no) |
| NL (1) | NL7708426A (no) |
| NO (1) | NO147820C (no) |
| SE (1) | SE7708678L (no) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1156766B (it) * | 1977-05-25 | 1987-02-04 | Anvar | Polipeptidi dotati di attivita' timica o antagonista e procedimento per la loro sintesi |
| JPS5630925A (en) * | 1979-08-21 | 1981-03-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | Purification of human growth hormone |
| IT1197570B (it) * | 1983-02-11 | 1988-12-06 | Serono Ist Farm | Miscele di fsh e lh da ipofisi porcine in rapporto definito |
| JPS6255087A (ja) * | 1985-03-25 | 1987-03-10 | シタス オンコロジー コーポレイション | 融合蛋白質をコ−ドする組換ｄｎａ配列 |
| US4612367A (en) * | 1985-04-08 | 1986-09-16 | Eli Lilly And Company | Process for purifying growth hormone-like materials |
| HU198626B (en) * | 1986-05-27 | 1989-11-28 | Sandoz Ag | Process for producing pharmaceutical compositions comprising somatostatin analogues as active ingredient |
| HU203367B (en) * | 1987-01-30 | 1991-07-29 | Int Minerals & Chem Corp | Process for obtaining somatotpropins from weak aqueous solution |
| US5525519A (en) * | 1992-01-07 | 1996-06-11 | Middlesex Sciences, Inc. | Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers |
| US6162905A (en) * | 1996-11-07 | 2000-12-19 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | FSH and LH separation and purification process |
| US6437101B1 (en) | 1999-05-07 | 2002-08-20 | Akzo Nobel N.V. | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction |
| US6437102B1 (en) * | 1999-11-24 | 2002-08-20 | Bayer Corporation | Method of separating prions from biological materials |
| EP2121057A4 (en) * | 2007-02-06 | 2012-10-10 | Incept Llc | POLYMERIZATION WITH PRECIPITATION OF PROTEINS FOR ELUTION IN A PHYSIOLOGICAL SOLUTION |
| RU2492177C2 (ru) * | 2011-12-15 | 2013-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА, СЕКРЕТИРУЕМОГО ДРОЖЖАМИ Saccharomyces cerevisiae |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL286954A (no) * | 1962-01-03 | |||
| US3763135A (en) * | 1971-11-08 | 1973-10-02 | Baxter Laboratories Inc | Gamma globulin production from cohn fraction iii using polyethylene glycol |
| US3808189A (en) * | 1973-03-15 | 1974-04-30 | American Cyanamid Co | Isolation of gamma globulin preparations enriched in iga and igm using polyethylene glycol |
-
1976
- 1976-07-30 DK DK346876A patent/DK144731C/da not_active IP Right Cessation
-
1977
- 1977-07-25 US US05/819,019 patent/US4115375A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-07-26 DE DE19772733565 patent/DE2733565A1/de not_active Withdrawn
- 1977-07-27 FI FI772297A patent/FI57669C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-07-27 GB GB31488/77A patent/GB1537795A/en not_active Expired
- 1977-07-27 AR AR268583A patent/AR213530A1/es active
- 1977-07-27 IL IL52610A patent/IL52610A/xx unknown
- 1977-07-28 HU HU77NO220A patent/HU175512B/hu unknown
- 1977-07-28 SE SE7708678A patent/SE7708678L/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-07-28 AU AU27387/77A patent/AU507547B2/en not_active Expired
- 1977-07-28 IT IT26257/77A patent/IT1086345B/it active
- 1977-07-29 BE BE179787A patent/BE857327A/xx unknown
- 1977-07-29 FR FR7723464A patent/FR2359852A1/fr active Granted
- 1977-07-29 ES ES461179A patent/ES461179A1/es not_active Expired
- 1977-07-29 NL NL7708426A patent/NL7708426A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-07-29 NO NO772697A patent/NO147820C/no unknown
- 1977-07-29 CA CA283,798A patent/CA1077839A/en not_active Expired
- 1977-07-30 JP JP9096377A patent/JPS5338611A/ja active Pending
- 1977-08-01 DD DD7700200373A patent/DD131375A5/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE7708678L (sv) | 1978-01-31 |
| DK144731B (da) | 1982-05-24 |
| IL52610A0 (en) | 1977-10-31 |
| ES461179A1 (es) | 1978-05-16 |
| BE857327A (fr) | 1978-01-30 |
| NL7708426A (nl) | 1978-02-01 |
| FR2359852B1 (no) | 1983-01-28 |
| NO147820C (no) | 1983-06-22 |
| CA1077839A (en) | 1980-05-20 |
| IL52610A (en) | 1980-10-26 |
| NO772697L (no) | 1978-01-31 |
| FI57669B (fi) | 1980-05-30 |
| FR2359852A1 (fr) | 1978-02-24 |
| HU175512B (hu) | 1980-08-28 |
| AU2738777A (en) | 1979-02-01 |
| DD131375A5 (de) | 1978-06-21 |
| FI57669C (fi) | 1980-09-10 |
| DK346876A (da) | 1978-01-31 |
| JPS5338611A (en) | 1978-04-08 |
| US4115375A (en) | 1978-09-19 |
| AU507547B2 (en) | 1980-02-21 |
| DK144731C (da) | 1982-10-18 |
| FI772297A (no) | 1978-01-31 |
| DE2733565A1 (de) | 1978-02-02 |
| IT1086345B (it) | 1985-05-28 |
| AR213530A1 (es) | 1979-02-15 |
| GB1537795A (en) | 1979-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rasmussen et al. | On the complexity of calf thymus histone | |
| Skeggs Jr et al. | The purification and partial characterization of several forms of hog renin substrate | |
| NO147820B (no) | Fremgangsmaate for isolering og utvinning av proteinhormoner som stammer fra humant hypofysevev | |
| Reichert Jr | [30] Purification of anterior pituitary hormones (ovine, bovine, rat, rabbit) | |
| Kleinholz | Separation and purification of crustacean eyestalk hormones | |
| US2793203A (en) | Process of preparing stable, highly purified gamma globulin preparations | |
| Porter et al. | Human hepatocuprein: Isolation of a copper protein from the subcellular soluble fraction of adult human liver | |
| US4348316A (en) | New protein PP15, a process for its preparation and its use | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| BR122012018280B1 (pt) | Composição farmacêutica compreendendo hormônio luteinizante humano e sacarose | |
| NO163959B (no) | Fremgangsm te for utvinning og rensing av et polype | |
| US4977246A (en) | High recovery process for antihemophilic factor | |
| US4128637A (en) | Process for producing thymosin | |
| CN111060696B (zh) | 一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法 | |
| US2520076A (en) | Process for separating and recovering globulins from blood plasmas | |
| Derechin | Purification of human plasminogen | |
| US3003918A (en) | Production of ceruloplasmin in a purified state from blood plasma fractions | |
| Trygstad et al. | Preparation of purified human growth hormone and a crude human pituitary gonadotrophin | |
| US3674865A (en) | Procedure for obtaining pituitary gonadotropic hormones from urine | |
| US3472831A (en) | Process for purifying mistletoe proteins by ultracentrifugation | |
| EP3110839B1 (en) | Extraction process to obtain hcg having a high biological activity | |
| McShan et al. | A Simplified Procedure for Obtaining Follicle-Stimulating Hormone from Sheep Pituitary Glands. | |
| Zittle et al. | Purification of human red cell acetylcholinesterase by electrophoresis, ultracentrifugation and gradient extraction | |
| Baumgarten et al. | The isolation and purification of pancreatic deoxyribonuclease | |
| US2974088A (en) | Method of preparing growth hormone |