NO139590B - Tannpleiemiddel for aa hindre dannelse av tannbelegg - Google Patents

Abstract

Tannpleiemiddel for å hindre dannelse av tannbelegg.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår tannpleiemidler inneholdende enzymer som aktiv bestanddel, for å hindre dannelse av tannbelegg.

Det er vel kjent at menneskelig tannbelegg spiller en viktig rolle ved utvikling av caries, tannsten og tannsykdommer, som er vesentlige sunnhetsproblemer som bør forhindres ved riktig oral . hygiene.

Tannbelegg kleber til tennene og tannkjøttvev og opprett-holdes, i det minste delvis, av polysaccharider og proteiner. Et av disse polysaccharider, et glucan, er tidligere erkjent som dextran som er utsatt for enzymatisk hydrolyse av dextranaser. Inkorporeringen av dextranaser i orale hygieneprodukter har vært foreslått i U.S. patent nr. 3 686 393. På lignende måte har anvendelsen av tannbelegg-dispergerende proteaser for oral hygiene vært foreslått av Mollé i J. So. Calif. Dent. Assn., 35, 391

(1967) og av Shaver et al. i J. Periodontology, 41, 33 (1970).

Det har vist seg at tannbelegg inneholder et annet spesielt glucan i mengder omtrent like med dextran, og som motstår den hydrolytiske virkning av dextranase, og som har fått navnet "cariogenan", som er et rettkjedet glucan med a-(1 —>3)-bindinger og a-(1—*2)-bindinger i forholdet ca. 1:3.

Det har nu vist seg at tidligere ukjente enzymer er i stane til enzymatisk å nedbryte cariogenan-bestanddelen av tannbelegg. Disse enzymer er blitt betegnet som "cariogenanaser", og deres systematiske navn er a-^^-glucanohydrolase.

På grunn av cariogenanasenes evne til å nedbryte cariogenan, som er et av klebemidlene i tannbelegg, finner de anvendelse som en bestanddel i tannpleiemidler som tannpastaer og munnvann,

eller i tyggegummi eller i høyhastighets-stråler av vann, som et nyttig hjelpemiddel sammen med dextranase.

Foreliggende oppfinnelse angår et tannpleiemiddel for å hindre dannelse av tannbelegg, hvilket middel inneholder dextranase og eventuelt protease, og kjsnnetegnes ved at det dessuten inneholder cariogenanase, som enzymatisk spalter i tannbelegg tilstedeværende cariogenan (dvs. rettkjedet glucan med a-(l->3)-bindinger og a-(l—>2)-bindinger i forholdet ca. 3 = 1) > i er» mengde på 5 - 20.000 enheter pr. 1 g eller 1 ml middel, hvilken cariogenanases systematiske navn er a~ -glucan-3-glucanohydrolase og som er et endo-enzym som innvirker på andre enn endebindingene av polysaccharidkjeden, slik at spaltningsproduktene er hovedsakelig di-, tri- og andre oligosaccharider, og som kjennetegnes ved a) spesifisitet til en slik a-(l—>3)-glucosidbinding, i hvis nærhet der finnes en a-(1—>2)-glucosidbinding,

b) et isoelektrisk punkt på 5,1, og

c) en optimalaktivitet, som dekker et vidt' pH-område, med

toppaktivitet ved 6,0.

Tannpleiemidlet bør være sammensatt slik at en enkelt be-handling vil utsette munnen for 10 - 20.000 enheter av cariogenanase og lOO - 200.000 enheter dextranase, og én eller flere an-vendelser pr. dag er ønskelig.

Menneskelig tannbelegg ble isolert fra en rekke forsøks-personer ved fysikalsk skrapning av tennene og viste seg å inne-holde på tørrvektsbasis fra 0,6 til 2,5% av dextranasebestandig polysaccharid.

Det samme polysaccharid, sammen med dextran, ble vist å dannes, in vitro, av Streptococcus mutans SL-1 (NRRL nr. B-5304)

ved dyrkning i et medium inneholdende sucrose som carbohydratkilde, og også når en cellefri Streptococcus mut ans-buljong inneholdende ekstracellulære enzymer ble inkubert med en sucrose-oppløsning.

I hvert tilfelle ble cariogenan skilt fra det ledsagende dextran ved inkubering med dextranase.. Cariogenanet ble renset ytterligere ved deproteinisering ved standardmetoder.

Strukturen av cariogenan ble bestemt ved standardmetoder som innbefatter delvis syrehydrolyse fulgt av kvalitativ og kvantita-tiv analyse av de oligosaccharide fraksjoner erholdt derved, og ved metaperjodatoxydasjons- og borhydridreduksjonsstudier. Strukturen ble således bestemt til å være et uforgrenet glucan med a-(l—>3)- og a-(l->2)-bindinger i et forhold på ca. 3:1.

Mikrobielle organismer som er i stand til enzymatisk å hydrolysere cariogenan, isoleres fra luftbårne bakterier ved å utsette agarplater inneholdende et passende næringsmedium innbe-fattende cariogenan som en carbohydratkilde og inkubere de erholdte kulturer ved en passende temperatur, vanligvis 28 - 37°C

i inntil ca. IO dager. Organismer funnet å være aktive dyrkes videre på lignende agarplater for å isolere dem.

Det ekstracellulære enzym, cariogenanase, fremstilles i isolerbare mengder ved å inkubere en kultur av en cariogenanase-oppbyggende mikroorganisme ved en passende temperatur, vanligvis 28 - 37°C, i et næringsmedium i rystekolber inntil en passende grad av cariogenanase-aktivitet er oppnådd, vanligvis fra 72 til 96 timer. I alminnelighet krever ikke mikroorganismene cariogenan som en carbohydratkilde i næringsmediet for oppbygning av cariogenanase. En av organismene, Bacillus sp. MB-2665 (NRRL nr. B-5300), anvendt for å eksemplifisere oppfinnelsen, krevet im-idlex tid cariogenan som et næringsstoff. Ved konvensjonelle muterings-metoder kan imidlertid en konstitutiv mutant frembringes som ikke krever cariogenan i mediet.

Enzymet isoleres fra dyrkningsmediet ved å klare det for celleavfall og andre uoppløselige stoffer ved sentrifugering eller filtrering, konsentrere sentrifugatet 5-15 ganger, fortrinnsvis ca. IO ganger i vakuum, og felle proteinet ved standardmetoder som med et organisk oppløsningsmiddel, ved kompieksdannelse med metall, eller ved metning med et salt som ammoniumsulfat eller lignende. Det foretrekkes å anvende flere feininger med mellom-liggende oppløsninger av'bunnfallet i en pufferoppløsning og klar ing av de erholdte oppløsninger ved filtrering eller sent rif uger in.. Sluttbunnfallet i vandig oppløsning dialyseres så og oppbevares enten som en kold oppløsning eller i lyofilisert form.

Det således dannede enzym var karakterisert ved at det var spesifikt for en a-( l-»3) -glucosidbinding med en nabo a-(l—>2)-glucosidbinding. Det har et isoelektrisk fokuseringspunkt på 5,1. Det har et bredt pH-optimum med toppaktivitet ved pH 6,0. Disse egenskaper skiller cariogenanase klart fra enhver kjent type av polysaccharase.

En fremgangsmåte ved fremstilling av enzymet cariogenanase er beskrevet og beskyttet i norsk patent nr. 138'4H-Sammenligningsforsøk

In vitro belegg på bunnen og veggene av 5 små tarerte dyrkningskolber ble dannet ved dyrkning av Streptococcus mutans. Disse belegg ble behandlet hver for seg med: (1) vann, (2) cariogenanase (250 enheter/ml), (3) dextranase (250 enheter/ml), (4) cariogenanase + dextranase (250 + 250 enheter/ml) og (5) cariogenanase + dextranase (250 + 250 enheter/ml) kokt .

Efter 3 timers inkubering under forsiktig svingende rysting, ble den overstående inkuberingsvæske fradekantert. Følgende resultater ble erholdt:

Det vil sees at (4), blandingen av enzymer, har en større virkning enn hver enkelt av de to enzymer eller summen av deres separate virkninger. Den kokte enzymblanding hvor enzymene var denaturert, er sammenlignbar i aktivitet med vannet.

Eksempel 1

Eksempel 2 Eksempel 3

Eksempel 4

Claims (1)

1. Tannpleiemiddel for å hindre dannelse av tannbelegg, hvilket middel inneholder dextranase og eventuelt protease, karakterisert ved at det dessuten inneholder cariogenanase, som enzymatisk spalter i tannbelegg tilstedeværende cariogenan (dvs. rettkje'det glucan med a-(1—*3) -bindinger og a-(l—£2)-bindinger i forholdet ca. 3;1), i en mengde på 5 - 20.000 enheter pr. 1 g eller 1 ml middel, hvilken cariogenanases systematiske navn er ~9lucan~3~glucanohydrolase og som er et endo-enzym som innvirker på andre enn endebindingene av polysaccharidkjeden,

   slik at spaltningsproduktene er hovedsakelig di-, tri- og andre oligosaccharider, og som kjennetegnes ved a) spesifisitet til en slik a-(l—>3) -glucosidbinding, i hvis nærhet der finnes en a-(1—42)-glucosidbinding, b) et isoelektrisk punkt på 5,1, og "c) en optimalaktivitet, som dekker et vidt pH-omrade, med toppaktivitet ved 6,0.