NO139563B - Fremgangsmaate til fremstilling av 1-n-(l-(-)-alfa-hydroksy-gamma-aminobutyryl)-xk-62-2 - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

til fremstilling av det hittil ukjente 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyryl7XK-62-2, et halvsyntetisk derivat av antibioti-

kumet XK-62-2, eller syreaddisjonssalter derav.

Fremgangsmåten til fremstilling av og de fysikalsk-kjemiske egenskaper til antibiotikumet XK-62-2, som anvendes som utgangs-materiale ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er beskrevet i detalj i U.S. patent nr. 4.045.298

Kort fortalt fremstilles XK-62-2 lett ved dyrking av aktinomyceter, slik som Micromonospora sagamiensis, Micromonospora echinospora og Micromonospora purpurea ved metoder som vanligvis benyttes til dyrking av aktinomyceter. Nærmere bestemt innpodes stammer av de ovennevnte microorganismer i et flytende medium inneholdende en karbonkilde som mikroorganismen kan utnytte, slik som sukkerstoffer, hydrokarboner, alkoholer, organiske syrer osv.; uorganiske eller organiske nitrogenkilder og dessuten uorganiske salter og vekstfremmende faktorer, og dyrkes ved 25_iJ0oC i 2-12

dager. Isoleringen og rensing av XK-62-2 utføres ved en passende kombinasjon av adsorpsjon og desorpsjon fra ioneutvekslerharpikser og aktivkull og søylekromatografi under anvendelse av cellulose, "Sephadex" og silisiumdioksydgel. På denne måte kan XK-62-2

oppnås i form av sulfatet eller i den frie form.

XK-62-2 er et basisk stoff og oppnås som et hvitt pulver. XK-62-2 har molekylformelen C^H^Nt-O,-, og molekylvekten 463.

Stoffet er lett oppløselig i vann og metanol, tungt oppløselig i

etanol og aceton og uoppløselig i kloroform, benzen, etylacetat og n-heksan.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et

hittil ukjent antibiotikum ved kjemisk modifisering av antibio-

tikum XK-62-2 med formelen:

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved

det i kravets kjennetegnende del anførte.

Beskyttelsen'av aminogruppen bundet til karbonatomet i 2'-stilling kan utføres med et acyleringsmiddel med formelen:

hvor R<1> og R kan være like eller forskjellige og er H, OH, N02, Cl, Br, I, alkyl med 1-5 karbonatomer eller alkoksy med 1-5 karbonatomer, R^ er Cl, Br eller I, og R er H, Cl, Br eller I, med en aminobeskyttende reagens med formelen: , hvor R har den ovenfor angitte betydning, for dannelse av en forbindelse med formelen: 1 2 hvor Y er hydrogen, og Y er: 12 4 i hvor 2R , R og R har den ovenfor angitte betydning, eller Y og Y danner en ftaloylgruppe.

Den resulterende forbindelse acyleres deretter med et acyleringsmiddel med formelen:

3 4 hvor Y er hydrogen, og Y er: 12 4 .. 3 hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning, eller Y og Y 11 danner en ftaloylgruppe, og Z er for dannelse av en forbindelse med formelen: i 2 "5 4 hvor Y-1-, Y , Y og Y har den ovenfor angitte betydning, hvor-12 3 4 etter de beskyttende grupper Y , Y , Y og Y fjernes på kjent måte for dannelse av en forbindelse med formelen:

om ønsket, denne forbindelse ytterligere overføres til et farmasøytisk akseptabelt, ikke-toksisk syreaddisjonssalt på kjent måte.

Det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilte derivat av XK-62-2 har en sterk antibakteriell aktivitet overfor en rekke gram-positive og gram-negative bakterier og har spesielt en særlig sterk antibakteriell aktivitet overfor de bakterier som er resistente overfor de kjente aminoglykosid-antibiotika.

Som en følge av dette er det ifølge oppfinnelsen fremstilte antibiotikum nyttig for rensing og sterilisering av laboratorie-glassutstyr og kirurgiske instrumenter og kan også anvendes i kombinasjon med forskjellige såper til hygieneformål og til rensing og sterilisering av hospitalrom og områder, som benyttes til fremstilling av matvarer. Videre forventes derivatet å være effektivt ved behandling av forskjellige infeksjoner slik som urinveisinfeksjoner og luftveisinfeksjoner fremkalt av forskjellige flogogene bakterier.

På tegningen viser

fig. 1 det infrarøde absorpsjonsspektrum for den ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelse; og

fig. 2 det magnetiske kjerneresonans-spektrum for den ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelse.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-Y-aminobutyryl7-XK-62-2 ved blant de tre frie aminogrupper i XK-62-2 selektivt å acylere den frie aminogruppe bundet til karbonatomet i 1-stillingen med en a-hydroksy-y-amino-butyrylgruppe.

Som nevnt ovenfor beskyttes først den frie aminogruppe bundet til karbonatomet i 2'-stillingen som er den mest reaktive blant de tre frie aminogrupper i XK-62-2, ved utnytt-else av forskjellen i reaktivitet mellom disse frie aminogrupper.

Beskyttelsen av aminogruppen utføres på vanlig måte. Por imidlertid selektivt å beskytte aminogruppen bundet til karbonatomet i 2'-stilling, er det ønskelig å benytte 0,5-1,5

mol, fortrinnsvis 0,7-1,2 mol, beskyttende stoff pr. mol XK-

62-2. Reaksjonstemperaturen er mellom -50 og +50°C, fortrinnsvis mellom -20 og +20°C, i fra 15 minutter til 24 timer, fortrinnsvis 5-15 timer. Hvis det benyttes en forøket mengde, f.eks. 3 mol, av det beskyttende stoff, eller reaksjonen utføres ved en for høy temperatur, f.eks. 100°C, kan reaksjonen foregå, men selektiviteten av den stilling hvori den beskyttende gruppe innføres, nedsettes sterkt. Som en følge av dette, forminskes dannelsesforholdet av forbindelse II i reaksjonsblandingen.

Oppløsningsmidlet for reaksjonen'kan være minst ett oppløsningsmiddel valgt blant tetrahydrofuran, dimetylacetamid, dimetylformamid, lavere alkoholer, dioksan, etylenglykol-dimetyleter, pyridin og vann.

Den således fremstilte forbindelse (II) acyleres deretter med et. acyleringsmiddel med formelen: hvor Y 3 , Y 4og Z har den ovenfor angitte betydning, eller en forbindelse som er funksjonelt ekvivalent med nevnte acyleringsmiddel, for dannelse av en forbindelse med formelen:

hvor Y 1, Y 2 , Y 3 og Y 4har den ovenfor angitte betydning.

Ovennevnte acyleringsreaksjon utføres fortrinnsvis ved anvendelse av et acyleringsmiddel med formelen:

i et oppløsningsmiddel valgt blant tetrahydrofuran, dimetylacetamid, dimetylformamid, lavere alkoholer, dioksan, etylenglykol-dimetyleter, pyridin, vann og blandinger derav, fortrinnsvis i en blanding av etanol og vann i volumforholdet 2:1 ved en temperatur mellom -50 og +50°C, fortrinnsvis mellom -20 og 20°C, i fra 15 minutter til 24 timer, fortrinnsvis 5~15 timer.

I dette tilfellet er det ønskelig å benytte 0,5_1,5 mol, fortrinnsvis 0,7-ls2 mol, acyleringsmiddel pr. mol av forbindelsen (II). Hvis det benyttes en forøket mengde, f.eks. 3 mol, av acyleringsmidlet, eller hvis reaksjonen utføres ved en forhøyet temperatur, f.eks. ved 100°C, kan reaksjonen foregå, men selektiviteten av den stilling hvori den acylerende gruppe innføres, nedsettes sterkt, eller så nedbrytes acyleringsmidlet. Som en følge av dette forminskes dannelsesforholdet av forbindelsen (III) i reaksjonsblandingen.

De beskyttende grupper på forbindelsen (III) fjernes deretter på kjent måte for dannelse av en forbindelse med formelen:

Fjerningen utføres ved konvensjonelle metoder. Hvis

f.eks. de beskyttende grupper danner en ftaloylgruppe, utføres fjerningen med hydrazin; hvis de beskyttende grupper er metoksykarbonyl-grupper eller etoksykarbonylgrupper utføres fjerningen med barium-hydroksyd; hvis de beskyttende grupper er tertiær-butoksykarbonyl-grupper, utføres fjerningen med maursyre eller trifluoreddiksyre;

hvis de beskyttende grupper er tritylgrupper, utføres fjerningen med eddiksyre eller trifluoreddiksyre; hvis de beskyttende grupper er o-nitrofenylsulfenylgrupper, utføres fjerningen med eddiksyre eller saltsyre; og hvis de beskyttende grupper er kloracetylgrupper utføres fjerningen med 3-nitropyridin-2-tion (rapportert av K. Undheim et al: Journal of the Chemical Society, Parkin Transactions, Part I, side 829 (1973)).

I en foretrukken utførelsesform er Y1 og Y^ hydrogen,

2 4

og Y og Y er benzyloksykarbonylgrupper, og fjerningen utføres ved hydrogenolyse i nærvær av en metallkatalysator valgt blant palladium, platina, rhodium og Raney-nikkel, fortrinnsvis palladium på en bærer av aktivkull, i minst ett oppløsningsmiddel valgt blant vann, tetrahydrofuran, dimetylacetamid, dimetylformamid, lavere alkoholer, dioksan og etylenglykol-dimetyleter, fortrinnsvis i en blanding av vann og metanol i volumforholdet 1:1, i nærvær av en liten mengde saltsyre, hydrogenbromidsyre, hydrogenjodidsyre eller fortrinnsvis eddiksyre; ved romtemperatur og atmosfæretrykk.

Om ønsket kan den ovenfor fremstilte forbindelse (IV) overføres til farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske syreaddisjonssalter (mono-, di-, tri-, tetra- eller penta-salter). Ikke-toksiske syrer er f.eks. uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrogenbromidsyre, hydrogenjodidsyre, svovelsyre, fosforsyre, karbonsyre osv., og organiske syrer slik som eddiksyre, fumarsyre, eplesyre, sitron-syre, rnandelsyre, vinsyre, askorbinsyre osv. Fremgangsmåtene til fremstilling av syreaddisjonssaltene er velkjente innen teknikken.

Det halvsyntetiske derivat (IV) av XK-62-2 som fremstilles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har en utmerket antibakteriell aktivitet. Det er spesielt bemerkelsesverdig at derivatet har en sterk antibakteriell aktivitet overfor stammer av Escherichia coli med en R-faktor som viser resistens overfor kjente aminoglykosid-antibiotika.

Tabell 1 viser det antibakterielle spektrum av kanamycin A, gentamicin C, la. XK-62-2 og forbindelsen (IV) overfor forskjellige gram-positive og gram-negative bakterier målt ved agar-fortynningsmetoden ved pH 8,0.

Ut fra en sammenligning av den i tabell 1 anførte minimale inhiberende konsentrasjon er det klart at forbindelsen (IV) har en sterk antibakteriell aktivitet. Karakteristisk utviser forbindelsen en særlig sterk antibakteriell aktivitet overfor Escherichia coli KY 8327 og 8348.

I den ovenfor angitte tabell produserer Escherichia coli KY 8327 og KY 8348 henholdsvis gentamicin-adenyltransferase og gentamicin-acetyltransferase type I intracellulært. Den førstnevnte bakterie inaktiverer kanamycin og gentamiciner ved adenylering, og den sistnevnte inaktiverer gentamiciner ved acetylering.

Videre vises det antibakterielle spektrum av l-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyryl7-XK-62-2 (forbindelse IV) sammenlignet med kanamycin A, gentamicin-kompleks (C^, C^ a og C^) og XK-62-2 målt ved agar-fortynningsmetoden ved pH 7, 2 i nedenstående tabell 2.

1: produserer gentamicin-adenyltransferase

2: produserer gentamicin-adenyltransferase og neomycin-kanamycin-fosfotransferase type II

3: produserer gentamicin-acetyltransferase type I

4: produserer neomycin-kanamycin-fosfotransferase type I

5: produserer kanamycin-acetyltransferase

6: produserer gentamicin-acetyltransferase type I og neomycin-kanamycin-fosfotransferase type I

7: produserer neomycin-kanamycin-fosfotransferase type I og type II

og streptomycin-fosfotransferase

8: produserer muligens kanamycin-acetyltransferase 9: produserer gentamicin-acetyltransferase type II

Fra ovenstående tabell 2 er det klart at den ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelse (IV), 1-N-(L-(-)-a-hydroksy-Y-aminobutyryl)-XK-62-2 har en meget sterk antibakteriell aktivitet overfor forskjellige bakterier med resistens overfor minst ett av gentamicin-antibiotika og XK-62-2, som produserer gentamicin-adenyltransferase og/eller gentamicin-acetyltransf erase type I og type II intracellulært og derved inaktiverer gentamicin-antibiotika og XK-62-2.

Videre er det ved forskjellige forsøk med hensyn til beskyttelsen mot infeksjoner fremkalt av stammer av de førstnevnte resistente bakterier påvist at den ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelse bevarer a-hydroksy-y-aminobutyryl-gruppen in vivo og derfor utviser meget høyere antibakteriell aktivitet enn genetamicin-antibiotika og XK-62-2.

Fra DE-OS 2.234.315 er det kjent en fremgangsmåte for innføring av L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyrylgruppen (i det følg-ende betegnet "HABA") på aminogruppen i 1-stillingen av kanamycin A eller kanamycin B (i det følgende betegnet henholdsvis "KMA" og "KMB") for dannelse av henholdsvis 1-N-HABA-KMA og 1-N-HABA-KMB.

I nedenstående tabell 3 er det angitt data for sammenligning av det antibakterielle spektrum overfor 63 mikroorganisme-stammer for den ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelse (i det følgende betegnet l-N-HABA-XK-62-2) og den kjente forbindelse 1-N-HABA-KMA. Den minimale inhiberende konsentrasjon (i det følgende betegnet "MIC") er målt ved samme metode som angitt i forbindelse med tabell 2 ovenfor.

Fra tabell 3 fremgår det at l-N-HABA-XK-62-2 er vesentlig bedre enn 1-N-HABA-KMA fordi det er mer effektivt overfor 30 stammer og ekvivalent med 1-N-HABA-KMA overfor de andre stammer. Ved bedømmelsen av antibakteriell aktivitet ansees en forskjell på én størrelsesorden (2- eller 1/2-ganger) i MIC, for å være usignifikant og en forskjell på mer enn to størrelses-ordner (4- eller 1/4-ganger) i MIC, ansees for å være signifikant.

Videre har l-N-HABA-XK-62-2 følgende spesielle trekk.

Det er kjent at et aminoglykosid-antibiotikum, som har en primær aminogruppe i 6<1->stillingen, inaktiveres av en mikroorganisme som inneholder acetyltransferase. 1-N-HABA-KMA og 1-N-HABA-KMB har en primær aminogruppe i 6'-stillingen. Det antas derfor at disse antibiotika inaktiveres av en mikroorganisme som inneholder acetyltransferase og at de er ineffektive overfor en slik mikroorganisme. På den annen side, siden aminogruppen i 6'-stillingen av l-N-HABA-XK-62-2 er beskyttet av en metylgruppe, inaktiveres dette antibiotikum ikke av en mikroorganisme som inneholder acetyltransferase, og den er derfor effektiv overfor en en slik mikroorganisme. Dette bevises av at l-N-HABA-XK-62-2

har en høyere antibakteriell aktivitet enn 1-N-HABA-KMA overfor en mikroorganisme som inneholder kanamycinacetyltransferase.

I tabell 3 er Escherichia coli KY Z-3^3, Pseudomonas aeruginosa KY 8510, Pseudomonas aeruginosa KY 8516 og Serratia marcescens POE IO65 mikroorganismer som inneholder kanamycin-acetyltransf erase . Fra de i tabell 3 angitte data for MIC fremgår det at l-N-HABA-XK-62-2 er mer effektive enn 1-N-HABA-KMA overfor disse fire mikroorganismer.

Selv om det ikke er noen forsøksdata i tilfelle av 1-N-HABA-KMB, må det naturligvis forventes at 1-N-HABA-KMB med en primær aminogruppe i 6'-stillingen er mindre effektiv enn l-N-HABA-XK-62-2 overfor de fire ovennevnte mikroorganismer.

Det er også kjent at et aminoglykosid-antibiotikum

som har en hydroksygruppe i 3'-stillingen, inaktiveres av en mikroorganisme som inneholder fosfotransferase. KMA, KMB, 1-N-HABA-KMA og 1-N-HABA-KMB har en hydroksygruppe i 3'-stillingen. Det antas derfor at disse antibiotika fosforeres av en mikroorganisme som inneholder fosfotransferase og at de er ineffektive overfor en slik mikroorganisme. Det angis faktisk i tabell IV i US-patent nr. 3-781.268 at MIC for KMA og BBK-26 (1-N-HABA-KMB) overfor Pseudomonas aeruginosa D113, som inneholder fosforylase, er henholdsvis >50 og 50. De høye MIC-verdier viser at KMA og 1-N-HABA-KMB er ineffektive overfor Ps. aeruginosa D113.

På den annen side antas det at et aminoglykosid-antibiotikum uten en hydroksygruppe i 3'-stillingen, slik som XK-62-2 og l-N-HABA-XK-62-2, ikke fosforeres av en mikroorganisme som inneholder fosforylase og at antibiotikumet er effektivt overfor en slik mikroorganisme. For eksempel er Escherichia coli

KY 8349 og Pseudomonas aeruginosa KY 8512 i tabell 2 mikroorga-

nismer som inneholder noemycin-kanamycin-fosfotransforase type I.

Det er klart at XK-62-2 og l-N-HABA-XK-62-2 er effektive overfor

disse mikroorganismer ettersom MIC for XK-62-2 overfor disse mikroorganismer er henholdsvis 0,4 og 0,78, og MIC av l-N-HABA-XK-62-2 overfor dem er henholdsvis 0,2 og 0,78. På den annen

side er det klart at KMA er ineffektivt overfor disse mikroorganismer ettersom MIC av KMA overfor dem er henholdsvis >100 og 12,5-

Fra de foregående tabeller er det klart at den ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelse utviser en bemerkelsesverdig sterk antibakteriell aktivitet overfor en rekke gram-positive bakterier og gram-negative bakterier, inkludert de som er resistente overfor aminoglykosidantibiotika. Derfor forventes den å.være effektiv ved behandling av forskjellige infeksjoner hos mennesker og dyr fremkalt av slike flogogene bakterier. F.eks. forventes forbindelsen å være effektiv ved behandling av urinveisinfeksjoner og luftveisinfeksjoner fremkalt av Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa og stammer av slekten Proteus.

Ved administrasjon av forbindelsen eller dens syreaddisjonssalter foretrekkes parenteral administrasjon med en effektiv dose på 1,6-6 mg/kg pr. dag.

Den akutte toksisitet (LD^q) til 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyryl7-XK-62-2 hos mus er 250 mg/kg ved intravenøs injeksjon, mens toksisiteten av XK-62-2 og av gentamicin-komplekset (en blanding av C-^, <C>la og C2) er henholdsvis 93 mg/kg og 72 mg/kg.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen illustreres nærmere

ved følgende utførelseseksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av 2'- N- karbobenzoksy- XK- 62- 2 ( forbindelse II)

En prøve av XK-62-2 (2,778 g, 6,0 mmol) oppløses i

30 ml vandig 50% dimetylformamid. Til oppløsningen tilsettes dråpevis en oppløsning av N-(benzyloksykarbonyloksy)-succinimid (2,56 g, 1,03 mmol) i 25 ml dimetylformamid under omrøring, mens temperaturen holdes mellom -10 og 5°C. ^ Tilsetningen fullføres i løpet av 2 timer. Blandingen hensettes ved samme temperatur natten over. Ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (utviklingsmiddel: isopropanol/ konsentrert ammoniakkvann/kloroform i volumforholdet 2:1:1; farge-middel, ninhydrin) bekreftes tilstedeværelsen av ureagert XK-62-2 foruten hovedproduktet II (Rf 0,86). Reaksjonsblandingen fortynnes deretter med 30 ml vann og føres gjennom en søyle (diameter 2,5 cm)

av en ioneutvekslerharpiks "Amberlite <®> CG-50" (ammoniumform, 150 ml). Deretter føres 200 ml vann gjennom søylen etterfulgt av 300 ml

0,05 N vandig ammoniakk, 300 ml 0,10 N vandig ammoniakk og til slutt 0,15 N vandig ammoniakk. Eluatet undersøkes ved tynnsjiktskromatograf: og fraksjonene inneholdende forbindelsen II og den eneste komponent kombineres og inndampes til tørrhet under forminsket trykk. Som resultat oppnås hovedproduktet (forbindelse II) som et fargeløst amorft fast stoff (1,82 g, utbytte 47, 2%). Den således oppnådde prøve kan direkte anvendes som råmateriale for den etterfølgende reaksjon. Imidlertid er det mulig å rense produktet ytterligere ved søylekromatografi under anvendelse av den ovennevnte ioneutveksler-harpiksbehandling.

Analyse av produktet (forbindelse II) viser følgende: Smeltepunkt: 107-H0°C

Optisk dreiing: (a)^<5>= +87,7° (c = 0,10, vann)

Infrarødt absorpsjonsspektrum (KBr) (cm<-1>): 3700-3100, 2930,

1702, 1530, 1451, 1310, 1255, llMl, 1053, 1021, 960, 735, 697, 604. Magnetisk kjerneresonansspektrum (i metanol -d^) 6 (i ppm fra TMS): 1,13 (3H, singlet), 2,42 (3H, singlet), 2,60 (3H, singlet), 2,88

(2H, singlet), 5,33-4,90 (multiplet overlapper signalet fra OH),

7,43 (5H, singlet).

Elementæranalyse:

Beregnet for CggH^NgO. 2H20: C 53,08 - H 8,06 - N 11,06.

Funnet: C 53,19 - H 7,91 - N 10,02.

Fremstilling av 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-karbobenzoksy-aminobutyryl7-21lN=karbobenzokSY-XK-62-2_(forb

2'-N-karbobenzoksy-XK-62-2-dihydrat (643 mg, 1,0 millimol) oppløses i 20 ml vandig 50$ tetrahydrofuran. Til oppløsningen tilsettes dråpevis en oppløsning av N-hydroksysuccinimidesteren av L-(-)-a-hydroksy-Y-karbobenzoksy-aminosmørsyre (fremstillingen av forbindelsen fra L-(-)-a-hydroksy-y-aminosmørsyre er beskrevet i

the Journal of Antibiotics, Vol. XXV, side 695-708 (1972). Fremstillingen av L-(-)-a-hydroksy-Y-aminosmørsyre er beskrevet i Tetrahedron Letters, side 2625-2628 (1971)) (385 mg, 1,1 millimol) i

10 ml tetrahydrofuran under omrøring og avkjøling til mellom 0 og -5°C. Tilsetningen fullføres i løpet av 1 time. Blandingen hensettes deretter natten over. Ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (under de samme betingelser som beskrevet ovenfor påvises tilstedeværelsen av en liten mengde biprodukter og ureagert forbindelse II foruten hovedproduktet III (Rf 0,91). Reaksjonsblandingen konsentreres under forminsket trykk, hvorved det oppnås 1,05 g av en svakt gulaktig rest. Resten inneholder N-hydroksysuccinimid og L-(-)-a-hydroksy-y-karbo-benzoksyaminosmørsyre foruten de ovennevnte komponenter. Imidlertid anvendes resten til den etterfølgende reaksjon uten rensing. Om ønsket kan forbindelsen III isoleres og renses ved ioneutveksler-kromatografi på< samme måte som beskrevet ovenfor.

Fremstilling av l-N-/E-(-)-a-hydroksy-Y-aminobutyryl7-XK-62-2 i£2rbindelse_IV)

Det ovennevnte urene produkt inneholdende forbindelsen III som hovedkomponent, oppløses i 20 ml vandig 20% metanol. Til oppløsningen tilsettes 2 ml eddiksyre, og blandingen underkastes hydrogenolyse i nærvær av 150 mg 5% palladium-på-aktivkull ved romtemperatur og atmosfæretrykk i 6 timer. Ved silisiumdioksydgel-tynnsj iktskromatograf i (under de samme betingelser som beskrevet ovenfor) påvises tilstedeværelsen av forbindelsen IV (Rf 0,40) som hovedkomponent, en liten mengde XK-62-2 (på grunn av ureagert II)

og de stillingsisomere av forbindelsen IV. Katalysatoren fjernes ved. filtrering, og filtratet konsentreres under forminsket trykk. Resten oppløses deretter i 10 ml vann, og oppløsningen underkastes inoeutvekslerkromatografi under anvendelse av "Amberlite<®> CG-50"

(ammoniumform, 80 ml, søylens diameter: 1,5 cm) som beskrevet ovenfor.

Søylen vaskes deretter med 150 ml vann, og 0,2N vandig ammoniakk føres gjennom søylen for utvinning av XK-62-2 (63 mg). Elueringen utføres deretter med 0,4N vandig ammoniakk mens eluatet kontrolleres ved tynnsjiktskromatografi. Eluatet inneholdende forbindelse IV som eneste komponent, opptas som fraksjoner og inndampes til tørrhet under forminsket trykk, hvorved det oppnås et fargeløst ikke-krystallinsk fast stoff (459 mg; utbytte fra forbindelsen II: 6H%) .

Analyse av produktet viser følgende:

Smeltepunkt: 120-124°C.

Optisk dreiing: (ct)p9 = +99,0° (c = 0,10, vann).

Infrarødt absorpsjonsspektrum (KBr, cm<-1>): 3700-3100, 2940, 1610, 1565, 1480, 1385, 1340, 1282, 1111, 1054, 1022, 973, 816, 700-600 (fig. 1).

NMR-spektrum (i deuteriumoksyd) 6 (i ppm fra DSS): 1,20 (3H, singlet), 2,36 (3H, singlet), 2,52 (3H, singlet), 5,14 (1H, dublet, J = 4,0 Hz), 5,22 (1H, dublet, J=4,0 Hz) (fig. 2).

Elementanalyse:

Beregnet for C^H^gN^. 1/2H2C03: C 49,39 - H 8,29 - N 14,11

Funnet: C 48,96 - H 8,37 - N 13,95-Eksempel 2

Fremstilling av 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyryl7-XK-62-2 lf2i:bindelse_IV)

N-hydroksysuccinimid (113 mg; 0,97 millimol) og L-(-)-a-hydroksy-y-ftalimidosmørsyre (forbindelsen er benyttet i The Journal of Antibiotics, Vol. XXV, side 741-742 (1972)) (242 mg; 0,97 millimol) oppløses i 20 ml tetrahydrofuran. Til oppløsningen tilsettes dicykloheksylkarbodiimid (200 mg; 0,97 millimol) under omrøring og isavkjøling. Etter 1 time fjernes det utfelte dicykloheksylurea ved filtrering og filtratet tilsettes til en oppløsning av 2'-N-karbobenzoksy-XK-62-2-dihydrat (482 mg; 0,75 millimol) i 10 ml vandig 50$ tetrahydrofuran. Tilsetningen fullføres i løpet av 30 minutter. Blandingen hensettes natten over. Reaksjonsblandingen konsentreres deretter under forminsket trykk og den utskilte dicykloheksylurea fjernes ved filtrering. Resten oppløses i 10 ml vandig 50% etanol og inneholdende 10% hydrazin, og oppløsningen får lov å reagere ved 60°C i 3 timer for å fjerne ftaloylgruppen. Til

den resulterende reaksjonsblanding tilsettes 5 ml eddiksyre, 10 ml etanol og 200 mg 5% palladium-på-aktivkull, og blandingen underkastes hydrogenolyse ved romtemperatur og atmosfæretrykk for å fjerne karbobenzoksygruppen. Katalysatoren utskilles deretter ved filtrering. Filtratet behandles på samme måte som beskrevet i eksempel 3 og underkastes søylekromatografi under anvendelse av "Amberlite ® CG-50"

(ammoniumform, 200 ml, søylens diameter: 2,5 cm). Elueringen ut-føres mens eluatet kontrolleres ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatograf i . De eluerte fraksjoner inneholdende den ønskede forbindelse IV som den eneste komponent oppsamles og inndampes til tørrhet under forminsket trykk. Som resultat oppnås 226 mg av et fargeløst produkt (utbytte fra forbindelsen II: 42,1$). Produktet

viser en Rf-verdi på 0,40 ved silisiumdioksyd-tynnsjiktskromatografi (under de samme betingelser som i eksempel 1). Rf-verdien stemmer overens med Rf-verdien for forbindelse IV i eksempel 1.

Eksempel 3

Fremstilling av 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-Y-aminobutyryl7-XK-62-2 iforDiDdelse_IV)

En prøve av XK-62-2 (2,778 g; 6,0 millimol) oppløses i

30 ml av en blanding av vann, pyridin og trietylamin i volumforholdet 10:10:1. Til blandingen tilsettes dråpevis en oppløsning av tertiær-butyloksykarbonylazid (1,04 g, 7,2 millimol) i 10 ml vandig 50$ pyridin under omrøring, mens temperaturen holdes mellom -10 og -5°C. Tilsetningen fullføres i løpet av 2 timer. Blandingen får deretter anledning til å reagere natten over ved samme temperatur. Den resulterende reaksjonsblanding konsentreres under forminsket trykk, hvorved det oppnås en svakt gul rest inneholdende 2'-N-tertiær-butyloksykarbonyl-XK-62-2 som hovedkomponent. Resten oppløses i 30 ml vandig 50$ dimetylformamid.

Til oppløsningen tilsettes dråpevis en oppløsning av N-hydroksy-succinimide.steren av L- (-) -a-hydroksy-y-karbobenzoksy-aminosmørsyre (2,52 g, 7,2 millimol ) i 15 ml dimetylformamid under omrøring, mens temperaturen holdes mellom -10 og -5°C. Tilsetningen fullføres i løpet av 1 time. Blandingen får deretter anledning til å reagere natten over. Ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (under de samme betingelser som i eksempel 1) påvises tilstedeværelsen av 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-Y-karbobenzoksyaminobutyryl7-2'-N-tertiær-butyloksykarbonyl-XK-62-2 som hovedkomponent og en

liten mengde av de stillingsisomere og ureagert XK-62-2. Reaksjonsblandingen konsentreres under forminsket trykk. Resten oppløses i en blanding av 5 ml tirfluoreddiksyre og 7 ml metanol. Oppløsningen underkastes deretter hydrogenolyse i nærvær av 160 ml 5$ palladium-på-aktivkull ved romtemperatur og atmosfæretrykk i 3 timer for å fjerne tertiær-butyloksykarbonylgruppen og benzyloksykarbonylgruppen. Ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (under de samme betingelser som i eksempel 1) påvises tilstedeværelsen av forbindelse IV som hovedkomponent, en liten mengde av de stillingsisomere derav og ureagert XK-62-2 (på grunn av det ureagerte XK-62-2

og ureagert 2'-N-tertiær-butyloksy-karbonyl-XK-62-2).

Katalysatoren utskilles ved filtrering og filtratet konsentreres under forminsket trykk. Resten oppløses i 30 ml vann og oppløsningen behandles på samme måte som i eksempel 1, dvs. oppløsningen Underkastes søylekromatografi under anvendelse av "Amberlite ^fp-)CG-50"

(ammoniumform, 150 ml, søylens diameter: 2,5 cm). Elueringen ut-føres deretter mens eluatet kontrolleres ved silisiumdioksydgel-tynnsj iktskromatograf i (under de samme betingelser som i eksempel 1). Eluatet opptas som fraksjoner og fraksjonene inneholdende forbindelse IV som den eneste komponent oppsamles og konsentreres til tørrhet under forminsket trykk. Som resultat oppnås 1,95 g av et fargeløst produkt bestående av forbindelsen IV (utbytte fra forbindelse II: 45,3$).

Det således oppnådde produkt stemmer overens med det i eksempel 1 oppnådde sluttprodukt med hensyn til smeltepunkt, den optiske dreiing, det infrarøde absorpsjonsspektrum, NMR-spekteret og elementanalysen.

Eksempel 4

Fremstilling av sulfatet av 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyryl7-XK-62-2 (forbindelse IV), hvor 1 mol forbindelse IV er kombinert m§2^_?.i§_m2l_ svovelsyre

0,1 mol forbindelse IV oppløses i 200 ml vann. Til oppløsningen tilsettes en oppløsning av 0,25 mol svovelsyre i 50

ml vann under avkjøling. Etter 30 min. tilsettes etanol til opp-løsningen for dannelse av et bunnfall, inntil utfellingen er full-stendig. Bunnfallet fraskilles ved filtrering og tørkes for oppnåelse av et hvitt pulver.

Analyse av pulveret viser følgende:

Smeltepunkt: 242,8°C.

Spesifikk dreiing: (ct)^5 = +95,9° (c = l,0, vann).

Infrarødt absorpsjonsspektrum (KBr) (cm<-1>): 3400, 1625, 1122. NMR-spektrum (i deuteriumoksyd) (i ppm fra DSS): 1,33 (3H, s),

2,77 (3H, s), 2,93 (3H, s), 5,20 (1H, d, J=3,9 Hz), 5,93 (1H, d, J=3,9 Hz).

Elementæranalyse:

Beregnet for C^H^gNgOg • ^SO^-H^: C 34 ,95$, H 7,14$, N 10,04$,

S 9,40$.

Funnet: C 34,82$, H 6,70$, N 10,15$, S 9,68$.

Fra den ovenstående analyse identifiseres pulveret som sulfatet av forbindelse IV med molekylformelen Cg^H^gNgOg-^5280^ .H2O.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av 1-N-/L-(-)-a-hydroksy-y-aminobutyryl7-XK-62-2 med formelen:

   eller farmasøytisk akseptable.syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at en forbindelse med formelen:

   omsettes ved en temperatur på fra -50 til 50°C med en konvensjo-nell aminobeskyttende reagens for innføring av en fjernbar beskyttende gruppe på den frie aminogruppe bundet til karbonatomet i 2'-stilling, hvoretter den frie aminogruppe bundet til karbonatomet i 1-stilling acyleres med et acyleringsmiddel med formelen: 3 4

   hvor Y er hydrogen, og Y er

   hvor R 1 og R 2 kan være like eller forskjellige og betyr H, OH, N02, Cl, Br, I, alkyl med 1-5 karbonatomer eller alkoksy med 1-5 kar-4 Th bonatomer, og R betyr H, Cl, Br eller I, eller Y<J> og Y sammen danner en ftaloylgruppe, og Z betyr

   , Cl, Br, I eller OH, hvoretter de beskyttende grupper Y^ og Y^ og den beskyttende gruppe på aminogruppen bundet til karbonatomet i 2'-stilling fjernes på i og for seg kjent måte, og, om ønsket, omdannelse av den dannede forbindelse til et farmasøytisk akseptablet syreaddisjonssalt derav.