NL9400384A - Retrovirus-vaccins, vaccinatie en immunotherapie tegen retrovirale infecties. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Retrovirus-vaccins, vaccinatie en immunotherapie tegen retrovirale infecties

Beschrijving van de uitvinding: De uitvinding is op het gebied van de bestrijding van retrovirussen. Een retrovirus is een virus dat als genetisch materiaal ribonucleinezuur (RNA) heeft, dat wordt overgeschreven tot in het gastheer genoom als provirus geïntegreerd DNA. Voorbeelden van dergelijke virussen zijn HTLV-I, HTLV-II, STLV-I en de virussen uit de lentivirus familie, zoals HIV, visna virus, equine infectious anemia virus, feline immunodeficiency virus and bovine immunodeficiency virus. Een beschrijving ervan is in Science 239:617 (1988) en de daar genoemde referenties te vinden. De uitvinding heeft betrekking op produkten waarmee zoogdieren geïmmuniseerd kunnen worden. Deze zoogdieren kunnen zowel wel als nog niet geïnfecteerd zijn met het retrovirus waartegen geïmmuniseerd wordt. De uitvinding bevat (1) een vaccin, met als kenmerk dat het een levend virus is, dat een niet persisterende infectie veroorzaakt bij zoogdieren. (2) een methode tot vaccinatie, (3) een methode voor immunotherapie, (4) de produkten en varianten verkregen door één of meer van de voorafgaande punten.

Het betreffende vaccin is bij voorkeur een levend retrovirus, dat een niet persisterende infectie veroorzaakt en dat effectief is voor de bestrijding van een retrovirus infectie, bij voorkeur van HIV en voorkomt dan en/of het is dan gericht tegen AIDS of AIDS-geassocieerde ziekten. Deze niet persisterende infectie ontstaat bij voorkeur door één of meer van de vier volgende redenen: (1) Het retrovirus infecteert wel T cellen, maar geen histiocytaire cellen (macrophaag-achtige cellen). Deze zo genaamde T cel trope virussen zijn b.v. HTLV-IIIB, HTLV-IIIMlI, HTLV-IIIRF, HIV-1sf2 (AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog, NIH Publication No. 91-1536, Bethesda, MD, U.S.A.), HIV-I320.2A 1.2 (AIDS Res. and Human Retroviruses 9:669 (1993)). Het bestaan van T cel tropisme en de noodzaak van infectie van histiocytaire cellen voor persisterende infectie wordt beschreven in AIDS Res. and Human Retroviruses 9:669 (1993) en de bijbehorende referenties.

(2) Het retrovirus wordt door het complement systeem geïnactiveerd. Het bestaan van deze vorm van virus inactivatie wordt beschreven in Immunol. 73:377 (1991) en de bijbehorende referenties.

(3) Het retrovirus wordt door natuurlijke antilichamen geïnactiveerd. Het bestaan van deze meestal laag affine, breed neutraliserende natuurlijke antilichamen wordt b.v. beschreven in Immunol. Invest. 17:387 (1988), "Advances in Immunology", Eds. Taliaferro W.H. & Humphrey J.H., Academic Press, New York: Vol. 2; 1962, 245-265 en "Applications of Immunological Methods in Biomedical Sciences", in "Handbook of Experimental Immunology", Ed. Weir D.M., Blackwell Scientific Publ., Oxford: Vol. 4; 1986, 117.4-118.17 en de bijbehorende referenties van deze drie verwijzingen.

(4) Een andere voorkeur is een sterk cytopathogeen retrovirus, dat wil zeggen een virus dat gastheer cellen vlot dood maakt. Over het algemeen zijn dergelijke processen slecht voor de persistentie van het virus, omdat de virus producerende cellen dood gaan.

Er zijn aspecifieke methoden voor immunotherapie voor ziekte door virussen beschreven. Zo'n aspecifieke methode voor immunotherapie wordt beschreven in het patent "Method for treating viral diseases with attenuated virus" U.S.A. 5,215,745 van 1 juni 1993 van Csatary et al. Hierbij wordt beoogd door middel van een aspecifieke virus infectie van avian paramyxovirus en/of avian rotavirus een verhoging van de CD4 positieve cel aantallen te bewerkstelligen. Deze verhoging van het aantal CD4 positieve cellen dient om de ontregelde afweer ten minste enigszins te herstellen. Als toepassing wordt AIDS-therapie van HIV geïnfecteerden genoemd. Echter, een aspecifieke immuun respons van de gastheer kan op zijn best leiden tot uitstel van ziekte. Immers, de nieuw gevormde CD4 positieve cellen zullen even later met HIV worden geïnfecteerd. Deze uitvinding beschrijft echter een vaccin waarmee een specifieke immuunrespons wordt opgewekt tegen het betreffende retrovirus. Er kan derhalve eer. efficiënte uitschakeling van het retrovirus verwacht worden.

Therapieën gericht op een specifieke immuun respons tegen retrovirussen zijn tot nu toe beperkt tot z.g. peptide vaccins, of virus subunit vaccins, of geïnactiveerde virus vaccins. Echter, op dit moment zijn dergelijke vaccins niet effectief tegen een retrovirus infectie, omdat deze de natuurlijke structuur en functie van het virus onvoldoende nabootsen. Als voorbeeld dient het feit dat bij meer eenvoudige virussen, zoals b.v. het mazelen virus, vaccinatie met niet levend virus nog steeds maar matige protectie oplevert. Derhalve zijn de verwachtingen op korte en middellange termijn voor een dergelijk vaccin zeer laag gespannen.

Ook immunotherapie met dergelijke peptide vaccins, of subunit-vaccins, of geïnactiveerd virus is niet op korte of middellange termijn te verwachten. Immers, hoewel de natuurlijke afweer van zoogdieren tegen retrovirussen heel krachtig kan zijn, is deze niet altijd voldoende effectief. Dit moge bij voorbeeld blijken in de asymptomatische fase van een HIV infectie. Hierbij zijn er hoge spiegels van in vitro HIV neutraliserende antilichamen en cellulaire afweer tegen HIV gevonden die niet effectief genoeg waren om voortschrijdende infectie tegen te gaan. Een verklaring hiervoor is bij voobeeld dat de antilichamen protectie van het virus genereren tegen de cellulaire immuniteit. De moeilijkheid een effectieve immuniteit te genereren blijkt bij voorbeeld ook bij het patent "Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein" U.S.A. 5,081,226 van 14 januari 1992 van Berzofsky et al. Er worden hier antilichamen tegen kleine stukjes van het glycoproteine 160/120 complex van HIV opgewekt, die niet beschermend werken tegen infectie. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat slechts tegen een klein aantal natuurlijke epitopen van het virus antilichamen verkregen worden. De kans dat deze beschermend zijn tegen voortschrijdende infectie is uiterst gering, wat moge blijken uit het feit dat er bij voorbeeld tegen AIDS nog geen effectief peptide vaccin gevonden is. Bovendien is bij gebruik van een dergelijk beperkt aantal epitopen de kans op een effectieve cellulaire immuniteit afwezig, of zeer klein en ook nog niet gevonden. Daarentegen, is er bij deze uitvinding een optimale verwachting voor diversiteit van natuurlijke epitopen en inductie van cellulaire immuniteit.

Het idee dat antilichamen tegen de envelop van HIV zelfs protectie en integratie van dit retrovirus in histiocytaire cellen kunnen bevorderen is gebruikt door Salk et al. in het patent "Retroviral antigens" U.S.A. 5,256,767 van 26 October 1993. Hierin is een virus subunit vaccin ontwikkeld tegen HIV zonder envelop. De grondgedachte van dit patent is het feit dat deze interne virus delen toch bij gastheercellen op de buitenkant van de cel tot expressie komen, zodat virus producerende cellen zullen worden geëlimineerd. Een belangrijk eerste bezwaar tegen deze methode is echter dat de interne delen van het virus bij infectie op zijn best in zeer geringe mate op de buitenkant van een cel verwacht worden, hetgeen de kans op effectieve eliminatie van de virus producerende cellen klein maakt. Bovendien is ten tweede de verwachting dat dergelijke vaccins een inferieure presentatie van epitopen aan het immuun systeem opleveren ten opzichte van levend virus. Deze beide argumenten tezamen vormen een plausibele reden waarom dit patent van Salk et al. niet bleek te werken. Bij onze uitvinding daarentegen wordt de natuurlijke situatie optimaal gereproduceerd, zodat hier wel een effectieve immuunrespons verwacht wordt.

Aan het gebruik van vaccins op basis van geïnactiveerd virus kleven ook één of meer van de bovengenoemde bezwaren. Echter, de vaccinatie van pokken is wèl succesvol verlopen dankzij een levend virus vaccin. Ook voor polio is het Sabin vaccin een levend virus vaccin, dat goed voldoet. Mogelijke redenen hiervoor: (1) Er kan een tijdelijk hoge dosis virus antigenen worden bewerkstelligd. (2) Er wordt een krachtige cellulaire respons geïnduceerd. (3) Er kan een immuun respons worden geïnduceerd tegen een breed scala aan verschillende virus antigenen.

In deze gevallen van polio en pokken vaccin betreft het zwakke, voor gezonde mensen niet pathogene, levende virussen die niet persisteren. Echter, retrovirussen zijn wèl in staat te persisteren. Daardoor zijn zij veel beter in staat om het immuunsysteem te ontregelen en ziekte te veroorzaken. Bovendien hebben retrovirussen over het algemeen de potentie om te muteren. De combinatie van het persisteren en de mogelijkheid tot muteren schept voor hun de mogelijkheid om het immuun systeem te ontlopen. Het bijzondere van deze uitvinding is dat er een levend retrovirus is gevonden dat een niet persisterende infectie veroorzaakt. Daardoor is de verwachting dat het virus niet de gelegenheid krijgt het immuun systeem te ontregelen. Bovendien is de verwachting dat het virus niet de gelegenheid krijgt te muteren, om op die manier het immuun systeem te ontlopen.

Deze zelfde bovenstaande problemen gelden ook voor vaccins op basis van verzwakte vormen van retrovirussen. Wat echter voor deze vaccins nog schadelijker is, is de kans op het ontstaan van gevaarlijke varianten. Deze zouden immers alsnog in staat zijn om het immuunsysteem te ontregelen en ziekte te induceren. Het ontstaan van deze gevaarlijke mutanten is bij deze uitvinding uit te sluiten. Immers de virus infectie van deze uitvinding persisteert niet. Daardoor krijgt het ook niet de gelegenheid te muteren. Het voorgestelde vaccin tegen HIV infectie is zelfs de zeer cytopathogene variant HIV-1SF2 (AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog, NIH Publication No. 91-1536, Bethesda, MD, U.S.A.). Dit heeft tot gevolg dat het zijn eigen gastheercellen zeer snel dood.

Met deze uitvinding is het dan ook onder meer de verwachting dat op korte termijn door vaccinatie, infectie van het HIV kan worden bestreden en mogelijk genezing van bestaande infectie kan worden geïnduceerd.

Bovengenoemde beschrijving stelt een vakman op dit terrein in staat om de uitvinding ook toe te passen op andere retrovirussen. Daarom worden andere retrovirus vaccins, die op principes berusten die vergelijkbaar zijn met 1 of meer van de hierboven beschreven principes, ook geacht onder het patent te vallen.

Het is te doen gebruikelijk bij vaccinaties voor retrovirussen niet-infectieus virus te gebruiken, om infectie van het genetisch overdraagbare materiaal te voorkomen. Immers, infectieus retrovirus integreert in het gastheer DNA als provirus. Met name is de overdracht hiervan naar het DNA van de gonadale cellen van de gastheer niet aanvaardbaar. Overdracht van retroviraal DNA naar gonadale cellen zou namelijk resulteren in genetische veranderingen in het nageslacht. Echter, wanneer een individu geïnfecteerd wordt door een retrovirus, hecht het virus specifiek aan een unieke specifieke celreceptor. Bij voorbeeld bij HIV is dit de z.g. CD4-receptor, die slechts op bepaalde cellen aanwezig is. De cellen met een dergelijke receptor vangen het ongebonden virus weg. Daarom zal de concentratie ongebonden virus laag blijven zolang voldoende van deze cellen aanwezig blijven. Bij een vaccinatie met een niet persisterend virus blijven er ook voldoende van deze cellen over. Daarom blijft de ongebonden virus-concentratie laag. Aangezien gonadale cellen geen receptoren hebben voor de bekende retrovirussen zullen ze daarom niet geïnfecteerd worden.

Bij infectie met retrovirussen die wel een persisterende infectie veroorzaken is uitschakeling van en/of verzadiging van virusreceptoren bevattende cellen zeer wel mogelijk, b.v. in het eindstadium van AIDS. Het is zelfs waarschijnlijk dat juist op grote schaal integratie van provirus in het menselijk genetisch materiaal plaats vindt bij retrovirale epidemieën. Gezien de ernst van bij voorbeeld de HIV epidemie is het dan ook verantwoord een levend retroviraal vaccin op de markt te brengen. De voorkeur van onze uitvinding gaat dan ook uit naar de preventie en behandeling van AIDS en AIDS-geassocieerde ziektes.

Voorbeeld 1: Het HIV-1sf2 vaccin kan door een plasma factor geëlimineerd worden.

Het test systeem bestond uit humaan chimere 3 weken oude "severe combined immunodeficient" (SCID) muizen. Het chimerisme werd geproduceerd met conditionering door totale lichaamsbestraling (ΤΒΙ) en transplantatie van humane CB15 cellen in de buikholte (ip) . De dosis van de CB15 cellen was 1.3xl06 cellen/gram ontvanger. Deze monoclonale CB15 cellen worden beschreven in Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3116 (1992). De TBI van de SCID muizen was 2.5 Gy gamma. Vergelijkbare transplantatie procedures worden beschreven in Eur. J. Immunol. 22:197 (1992). De muizen werden dagelijks ip ingespoten met 104 I.U. humane interleukine 2 (Eurocetus, Amstelveen, Benelux). De infectie van de CB15 cellen was met een dosis van lOx de nog juist infectieuze hoeveelheid kweek supernatant in een zo genaamde "infectious centre test" (ICT) van HIV-1SF2 of van HIV-1Q17 (AIDS Res. and Human Retroviruses 9:669 (1993), of in vitro gedurende 1 uur op 37° Celcius, of in vivo ip 1 uur na de transplantatie van de CB15 cellen. De ICT werd in duplo verricht met SUPT1 (AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog, NIH Publication No. 91-1536, Bethesda, MD, U.S.A.) of met CB15 cellen, waarbij 104 cellen per “well" van een 96-wells plaat werden uitgeplaat en waarbij 5-7 dagen later een ELlSA-test werd gedaan op HIV-p24 eiwit met de ELISA techniek (Organon Technica, Oss, Nederland). Op een van te voren vastgestelde dag werden de muizen opgeofferd en de cellen uit de buikholte gespoeld met medium waaraan heparine (Organon Technica, Oss, Nederland) was toegevoegd. De op deze manier verkregen cellen werden in een dosis van 5xl06 toegevoegd aan een identieke hoeveelheid SUPTl of CB15 cellen en gekweekt in de aanwezigheid van 100 I.U. humaan interleukine 2 per ml. kweekmedium. Na 5-7 dagen werd een HIV-p24 eiwit ELISA-test gedaan op het supernatant van het kweekmedium. De resultaten worden vermeld in Tabel 1. Uit Tabel 1 blijkt dat het HIV-1SF2 effectief geneutraliseerd kan worden bij in vivo infectie van de humane CB15 cellen in de SCID muizen. Het HIV-1Q17 werd echter niet effectief geneutraliseerd onder deze omstandigheden. Omdat bestraalde SCID muizen getransplanteerd met CB15 geen enkele vorm van immuniteit hebben, moet er een piasmaf actor zijn die het vrije HIV-1SF2 neutraliseert. Mogelijk is dit complement. Bovendien blijkt dat de HIV-1SF2 infectie niet in vivo geneutraliseerd kan worden, indien de humane CB15 cellen in vitro geïnfecteerd zijn. Omdat vrij HIV-1SF2 door plasma wordt geneutraliseerd volgt hieruit dat HIV-1SF2 transmissie in vivo optreedt door cel-cel contact van CB15 cellen.

Voorbeeld 2: Het HIV-1sf: vaccin kan geïnactiveerd worden door humane periphere bloed cellen

Het test systeem bestond uit humaan chimere 4 weken oude "X-linked immunodeficient" (CBA/N) muizen en SCID muizen zoals in voorbeeld 1 beschreven. Het chimerisme werd geproduceerd met conditionering door totale lichaamsbestraling (TBI) en transplantatie van humane bloedcellen, zo genaamde perifere bloed leukocyten (PBL) in de buikholte (ip) . De TBI van de SCID muizen was 2.5 Gy gamma en van de CBA/N muizen 9 Gy gamma. Deze laatste dieren kregen tevens een bloed ondersteunende behandeling in de vorm van 5x1O5 soort eigen beenmerg cellen intraveneus. De dosis van het PBL transplantaat was 4xl06 lymphocyten/gram ontvanger. Bij enkele CBA/N en SCID muizen werden CB15 cellen getransplanteerd als beschreven in voorbeeld 1 voor de SCID muizen. Vergelijkbare bestralingen, opwerkingen van het menselijke bloed en transplantatie procedure worden beschreven in Eur. J. Immunol. 22:197 (1992) . De muizen werden dagelijks ip ingespoten met 104 I.U. humane interleukine 2. De infectie van de menselijke cellen met HIV was als beschreven in voorbeeld 1.

Op een van te voren vastgestelde dag werden de muizen opgeofferd en de cellen uit de buikholte gespoeld als beschreven in voorbeeld 1. De op deze manier verkregen cellen werden in een dosis van 5x106 toegevoegd aan een identieke hoeveelheid SUPT1 of CB15 cellen en gekweekt in de aanwezigheid van 100 I.U. humaan interleukine 2 per ml. kweekmedium. Na 5-7 dagen werd een HIV-p24 eiwit ELISA-test gedaan op het supernatant van het kweekmedium. Dit alles resulterend in Tabel 2. Uit de Tabel 2 blijkt dat in deze proef opzet een efficiënte HIV infectie optreedt van zowel PBL als CB15 cellen. Bij in vitro infectie van PBL met HIV-1SF2 blijkt het virus tussen 2 en 4 dagen na transplantatie geëlimineerd te worden. Aangezien bij CB15 transplantaten geen eliminatie plaats vond, volgt hieruit dat de eliminatie van het virus en/of virus bevattende cellen bewerkstelligd wordt door de humane PBL. Aangezien het ontstaan van een aangeleerde humorale of cellulaire immuniteit ten minste 6 dagen duurt, moet de snelle afweer van deze humane PBL tegen het HIVSF2 reeds in het transplantaat aanwezig zijn geweest bij transplantatie. Tenslotte blijkt ook uit Tabel 2 dat er geen verschillen zijn in infectie en/of eliminatie van het HIV tussen de CBA/N en SCID muizen. De hier gebruikte CBA/N muizen hebben een vrijwel normaal antilichaam repetoir, met uitzondering van een gebrek aan natuurlijke antilichamen. Dit antilichaam repetoir van de CBA/N muis elimineert HIV-1SF2 dus niet. De oorzaak van de snelle eliminatie van het HIV-1SF2 is dus de reeds aanwezige afweer ertegen van humane PBL. De meest waarschijnlijke verklaring voor de eliminatie van het HIV-1SF2 ligt in de neutralisatie door natuurlijke antilichamen geproduceerd door het PBL transplantaat. Andere systemen zijn echter niet uit te sluiten. Als voorbeelden kunnen genoemd worden de humane "natural killer" cellen en door het PBL transplantaat in de muis geproduceerde andere humane antilichamen.

Toepassingsgebieden:

Uit de voorbeelden volgt dat HIV-1SF2 een veilig vaccin is tegen retrovirus infecties. Bovendien is het mogelijk bruikbaar voor immunotherapie. Het feit dat het slechts twee voorbeelden met één virus betreft wil echter niet zeggen dat de uitvinding daartoe beperkt is. Met behulp van deze uitvinding kan een specialist gemakkelijk toepassingen maken met andere retrovirus stammen en/of retrovirussen en derhalve wordt ook dit geacht onder het toepassingsgebied van de uitvinding te vallen.

Bovendien is een ander toepassingsgebied van de uitvinding de behandeling van kankers bestaande uit cellen die door niet persisterende retrovirussen geïnfecteerd kunnen worden. In de voorbeelden van deze uitvinding kan hierbij gedacht worden aan een CD4 positieve kanker, zoals sommige non-Hodgkin tumoren, en HIV-1sf2 als therapeuticum. De gedachte hierbij is dat het sterk cytopathogene virus de kanker opruimt voordat het zelf wordt opgeruimd.

Met behulp van deze uitvinding kan een specialist gemakkelijk toepassingen maken met andere retrovirus stammen en/of retrovirussen en derhalve wordt ook dit geacht onder het toepassingsgebied van de uitvinding te vallen.

Tabel 1: Het HIV-1SF2 vaccin kan door een plasma factor geëlimineerd worden

* XT = transplantatie procedure

Claims (11)

1. Een vaccin ter bestrijding van retrovirale infecties bij zoogdieren, bij voorkeur mensen, met als kenmerk dat het een retrovirus, een daarvan afgeleid virus, of een daarvan afgeleid produkt bevat, dat een niet persisterende infectie veroorzaakt in de gastheer.

2. Een vaccin als beschreven in conclusie 1 met als kenmerk dat de bestrijding van de retrovirale infectie vaccinatie is ter preventie van een retrovirus infectie.

3. Een vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat de bestrijding van de retrovirale infectie immunotherapie van de retrovirale infectie is.

4. Een vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat het werkzaam is tegen HIV, AIDS of AIDS geassocieerde ziekte.

5. Een vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat dit het aantal CD4 positieve cellen verhoogt.

6. Een vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat het een T cel troop retrovirus is.

7. Een vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat een niet histiocytair troop -, bij voorkeur een niet macrophaag troop virus is.

8. Het vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat het HTLV-IIIB, HTLV-IIIMN, HTLV-IIIRF en of HIV-1sf2 bevat.

9. Een methode ter bestrijding van retrovirale infecties met gebruikmaking van een vaccin als omschreven in één of meer van de vorige conclusies.

10. Een vaccin als beschreven in één of meer van de vorige conclusies met als kenmerk dat het gebruikt wordt ter bestrijding van ermee infecteerbare maligniteiten van zoogdieren, bij voorkeur van mensen.

11. Een methode ter bestrijding van maligniteiten met gebruikmaking van een vaccin als omschreven in één of meer van de vorige conclusies.