NL9100989A - Bovine herpesvirus type 1 deletiemutanten, daarop gebaseerde vaccins, diagnostische kits voor detectie van bovine herpesvirus type 1. - Google Patents

Description

Titel: Bovine herpesvirus type 1 deletiemutanten, daarop gebaseerde vaccins, diagnostische kits voor detectie van bovine herpesvirus type 1

GEBIED VAN DE UITVINDING

De uitvinding ligt op de gebieden van vaccinatie en diagnostiek in verband met ziekten die door pathogenen worden veroorzaakt, waarbij zowel de klassieke methoden om tot een levend geattenueerd vaccin te komen als de moderne methoden gebaseerd op de DNA recombinant technologie worden aangewend.

Meer in concreto heeft de uitvinding betrekking op levende geattenueerde vaccins om dieren, vooral runderen, te kunnen beschermen tegen bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), waarbij deze vaccins zodanig zijn ontworpen dat ze niet alleen veilig en effectief zijn, maar ook de mogelijkheid creëren om in een gevaccineerde populatie besmette van niet-besmette dieren te onderscheiden.

Diagnostische kits die voor zo’n onderzoek ter x onderscheiding van besmette gevaccineerde en niet-besmette gevaccineerde dieren kunnen worden gebruikt, zijn eveneens een aspect van de onderhavige uitvinding.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Het BHV-1, waaronder begrepen het infectieuze bovine rhinotracheitis virus (IBRV) en het infectieuze pustuleuze vulvovaginitis virus (IPW), speelt een grote rol bij het ontstaan van luchtwegziekten en vruchtbaarheidsstoornissen bij runderen. Na een acute infectie blijft BHV-1 veelal in een latente vorm in de gastheer aanwezig. Latent virus kan onder invloed van o.a. stress - al dan niet gepaard gaande met klinische verschijnselen - worden gereactiveerd en vervolgens worden uitgescheiden. Dientengevolge moeten geïnfecteerde runderen als levenslange potentiële verspreiders van BHV-1 worden beschouwd. Op de meeste Nederlandse rundveebedrijven, naar schatting zo'n 75%, komt BHV-1 endemisch voor. Vooral oudere runderen zijn serologisch positief.

Er zijn een aantal geïnactiveerde ("dode") vaccins en een aantal geattenueerde ("levende") vaccins voor enting tegen BHV-1 infecties beschikbaar. Geïnactiveerde vaccins worden bereid door het BHV-1 virus te doden door bijv. hitte behandeling, bestraling of behandeling met ethanol of formaline. Ze geven echter vaak onvoldoende bescherming. Geattenueerde vaccins worden bereid door een groot aantal passages op homologe (bovine) of op heterologe cellen zoals bijvoorbeeld varkens- of honde-cellen. Soms worden virussen daarbij ook fysisch of chemisch behandeld. Op deze wijze ontstaan onbekende mutaties/deleties in het virusgenoom, die de ziekteverwekkende eigenschappen van het virus dikwijls aantasten. Geattenueerde levende vaccins geven betere bescherming dan geïnactiveerde vaccins, ónder andere omdat ze meer virale antigenen aan het immuunapparaat van de gastheer presenteren. Een ander belangrijk voordeel van levende vaccins is dat ze intranasaal kunnen worden toegediend, dat wil zeggen op de plaats waar het rund de meeste bescherming nodig heeft. Toch zijn levende vaccins voor verbetering vatbaar. Sommige levende vaccins lijken hun abortogeen vermogen nog te bezitten, wat met name tot uiting komt na intramusculaire toediening. Bovendien blijven waarschijnlijk alle levende vaccins latent in het gevaccineerde rund aanwezig. Ook bestaat er de kans, als het vaccin maar weinig van het wild type virus verschilt, dat er reversie naar virulentie optreedt. Maar een van de grootste problemen is dat de BHV-1 vaccins infectie met wild type virussen niet kunnen voorkomen. Het gevolg is dat ook gevaccineerde runderen wild type BHV-1 kunnen verspreiden.

Voor een goed BHV-1 bestrijdingsprogramma is nodig te beschikken over een werkzaam, veilig en van wild type virus onderscheidbaar vaccin. Immers toepassing van een werkzaam vaccin kan de circulatie van BHV-1 aanzienlijk reduceren en een test die onderscheid kan maken tussen een vaccin en een wild type virus maakt het mogelijk om besmette runderen in een gevaccineerde populatie op te sporen.

Inmiddels zijn er BHV-1 vaccins ontwikkeld die zowel veiliger als van wild type virus onderscheidbaar zijn. Er is een thymidine kinase deletiemutant geïsoleerd die verminderd abortogeen is, minder frequent latent wordt en niet reactiveerbaar is. Bovendien is er een BHV-1 vaccin geconstrueerd met behulp van recombinant DNA technieken dat een deletie heeft in het gen voor glycoproteïne gill, waardoor dit vaccin door middel van serologische technieken van wild type BHV-1 onderscheidbaar is. Tegen deze vaccins bestaan echter nog enige bezwaren. Enerzijds is het thymidine kinase gen betrokken bij de virale replicatie en kan minder replicatie tot minder bescherming leiden. Anderzijds is het glycoproteïne gill belangrijk voor het opwekken van beschermende antilichamen, wat een gill deletie vaccin minder effectief maakt. Een praktisch probleem is dat intranasale toediening, die over het algemeen de beste bescherming geeft, met recombinant vaccins in sommige landen niet is toegestaan. Er is daarom behoefte aan een vaccin dat wel veilig, wel effectief en toch onderscheidbaar van wild type BHV-1 is, waarbij het gewenst is dat ten minste één van dergelijke vaccins op een langs conventionele weg geattenueerd virus in plaats van een door recombinant DNA technieken geconstrueerd virus is gebaseerd.

Via passages in celculturen is nu een BHV-1 stam bereid die het gen voor glycoproteïne gE mist. De eerste onderzoeksresultaten wijzen uit dat dit gen goed bruikbaar is om serologisch onderscheid te maken met wild type BHV-1. Bovendien rechtvaardigen onderzoeksgegevens van vergelijkbare deletiemutanten van andere herpesvirussen de verwachting dat deletie van het gE-gen tot een belangrijke afname van de virulentie zal leiden, hetgeen de veiligheid ten goede komt en mogelijk het gebruik van thymidine kinase deleties overbodig maakt. Het glycoproteïne gE lijkt minder belangrijk te zijn voor inductie van bescherming dan het glycoproteïne gin. Een conventioneel geattenueerde BHV-1 stam die serologisch onderscheidbaar is van wild type virus is uniek. Lokatie en DNA sequentie van het gE-gen waren niet eerder bekend, evenmin als daaruit afleidbare oligonucleotiden, polypeptiden en oligopeptiden. Ook een test om serologisch onderscheid te maken op basis van het gE-gen is uniek.

Een belangrijk voordeel van deze conventionele gE deletiemutant is dat hij intranasaal toegediend zal kunnen worden in landen waar dit voor recombinant vaccins verboden is. Inspelend op de verschillende opvattingen over veiligheid zijn echter naast dit conventionele gE deletievaccin ook goed gedefinieerde recombinant versies geconstrueerd. Deze recombinant vaccins hebben ook een gE deletie, al dan niet naast een deletie in het thymidine kinase gen, en kunnen ook als vector gebruikt worden voor de expressie van heterologe genen. Al deze recombinant vaccins kunnen met dezelfde gE-specifieke test van wild type virus worden onderscheiden. Het gebruik van een standaardtest voor een set van verschillende vaccins kan een groot voordeel zijn bij de bestrijding van BHV-1 in internationaal verband. Een dergelijke benadering is binnen het BHV-1 vaccin gebied niet eerder beschreven.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding verschaft op de eerste plaats een deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gevormd door een deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een door een attenuatie procedure veroorzaakte deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft, zoals de nog nader te beschrijven deletiemutant Difivac-1.

Andere voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding bestaan uit een deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een door recombinant DNA technieken geconstrueerde deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft, zoals de nog nader te beschrijven deletiemutanten 1B7 of 1B8.

In verband met een maximale veiligheid heeft voorts volgens de uitvinding voorkeur, een deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen en een deletie in het thymidine kinase gen heeft.

De uitvinding verschaft een vaccinpreparaat voor een vaccinatie van dieren, in het bijzonder zoogdieren, meer in het bijzonder runderen, om ze te beschermen tegen bovine herpesvirus type 1, omvattende een deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 zoals hierboven gedefinieerd, en een geschikte drager of adjuvans.

De uitvinding wordt verder belichaamd in een mutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft en een door recombinant DNA technieken ingebracht heteroloog gen bevat. Bij voorkeur gaat het daarbij om een mutant van bovine herpesvirus type 1 welke op de plaats van het glycoproteïne gE-gen een door recombinant DNA technieken ingebracht heteroloog gen bevat, dat onder controle van regulatoire sequenties van het gE-gen staat en eventueel aangesloten is op het gedeelte van het gE-gen dat voor een signaalpeptide codeert. Het ingebrachte heterologe gen codeert bij voorkeur voor een immunogeen eiwit of peptide van een ander pathogeen.

Ook verschaft de uitvinding een vaccinpreparaat voor een vaccinatie van dieren, in het bijzonder zoogdieren, meer in het bijzonder runderen, om ze te beschermen tegen een (ander) pathogeen, omvattende een mutant van bovine herpesvirus type 1 met daarin een heteroloog gen coderend voor een immunogeen eiwit of peptide van dat andere pathogeen, en een geschikte drager of adjuvans.

Verder heeft de uitvinding betrekking op een samenstelling, omvattende een recombinant nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE-gen, of een van dit glycoproteïne gE-gen afgeleide nucleotidensequentie omvat. Deze samenstelling kan een klonerings- of expressievector bevatten met daarin een insertie van een recombinant nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE-gen, of een van dit glycoproteïne gE-gen afgeleide nucleotiden-sequentie omvat.

Een samenstelling, omvattende glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide; en een samenstelling, omvattende een antilichaam dat specifiek is voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide; worden eveneens door de uitvinding omvat. Met "antilichaam" wordt zowel een polyclonaal antilichaampreparaat als een voor de meeste toepassingen geprefereerd monoclonaal antilichaam bedoeld.

Tevens betreft de uitvinding een diagnostische kit voor het detecteren van nucleinezuur van bovine herpesvirus type 1 in een monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum, of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, afkomstig van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, omvattende een nucleinezuur probe of primer met een nucleotidensequentie afgeleid van het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1, en een voor een nucleinezuur detectie assay geschikt detectiemiddel.

Voorts betreft de uitvinding een diagnostische kit voor het detecteren van antilichamen, die specifiek zijn voor bovine herpesvirus type 1, in een monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, speeksel, sputum, lichaamsvocht zoals traanvocht, longspoelsel, neusspoelsel, melk, of weefsel, afkomstig van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, omvattende glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide, en een voor een antilichamen detectie assay geschikt detectiemiddel. Zo'n diagnostische kit kan tevens een of meer antilichamen bevatten die specifiek zijn voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1.

De uitvinding betreft ook een diagnostische kit voor het detecteren van proteïne van bovine herpesvirus type 1 in een monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, afkomstig van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, omvattende een antilichaam dat specifiek is voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, en een voor een proteïne detectie assay geschikt detectiemiddel.

De uitvinding verschaft voorts een werkwijze voor het vaststellen van besmetting van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, met bovine herpesvirus type 1, omvattende het onderzoeken van een van het dier afkomstig monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum, lichaamsvocht zoals traanvocht, longspoelsel, neusspoelsel, melk, of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, op de aanwezigheid van nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1 omvat, dan wel de aanwezigheid van het glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, dan wel de aanwezigheid van antilichamen die specifiek zijn voor het glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1.

Het te onderzoeken monster kan afkomstig zijn van een niet eerder met een vaccinpreparaat volgens de uitvinding gevaccineerd dier, of van een wel eerder met een vaccinpreparaat volgens de uitvinding gevaccineerd dier.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

De uitvinding heeft betrekking op een set bovine herpesvirus type 1 vaccins die gemeen hebben dat zij het glycoproteïne gE-gen geheel of gedeeltelijk missen. Deze set omvat zowel een natuurlijke gE deletie mutant als ook geconstrueerde gE deletiemutanten die al dan niet tevens een deletie van het thymidine kinase gen hebben, en geconstrueerde gE deletie mutanten die als vector gebruikt worden voor heterologe genen. Tevens heeft de uitvinding betrekking op nucleotidensequenties die coderen voor het BHV-1 glycoproteïne gE-gen, oligonucleotiden afgeleid van deze sequenties, het glycoproteïne gE zelf, peptiden die hiervan afgeleid zijn en (monoclonale of polyclonale) antilichamen die tegen het gE glycoproteïne en daarvan afgeleide peptiden gericht zijn.

Deze materialen volgens de uitvinding zijn te gebruiken voor: 1) de vaccinatie van runderen tegen ziektes veroorzaakt door het BHV-1, zodanig dat onderscheid gemaakt kan worden tussen BHV-1 geïnfecteerde dieren en gevaccineerde dieren, waarbij het natuurlijke en het geconstrueerde vaccin naast elkaar gebruikt kunnen worden; 2) de vaccinatie van runderen tegen zowel BHV-1 ziekten als tegen aandoeningen veroorzaakt door andere pathogenen waarvan coderende sequenties voor beschermende antigenen in de BHV-1 deletiemutanten kunnen worden ingebouwd; 3) het testen van bloed of serum van runderen om langs serologische weg of door middel van nucleïnezuur detectie technieken (bijv. PCR) vast te stellen of deze door een wild type BHV-1 geïnfecteerd zijn of met een gE deletie-mutant gevaccineerd zijn.

Synthese van oligopeptiden, polypeptiden en glycoproteïnen afgeleid van de coderende sequentie van glycoproteïne gE-gen van BHV-1

De resultaten van de in de voorbeelden beschreven DNA-sequentieanalyse van het glycoproteïne gE-gen (Fig.3A) en de geïsoleerde DNA fragmenten die voor dit gen coderen, maken het mogelijk om met behulp van standaard moleculair biologische procedures zowel peptiden van het gE eiwit te synthetiseren (oligo- of polypeptiden) als het gE eiwit in z'n geheel of in grote delen langs prokaryote weg (in bacteriën) of langs eukaryote weg (in bijv. muizecellen) tot expressie te brengen. Langs deze wegen kan gE-specifiek antigeen worden verkregen dat bijvoorbeeld kan dienen voor het opwekken van gE-specifieke monoclonale antilichamen (MCA's). Bovendien kan gE-specifiek antigeen (evenals gE-specifieke MCA’s) gebruikt worden in serologische tests om onderscheid te kunnen maken tussen dieren die gevaccineerd zijn met BHV-1 gE deletievaccin en dieren die met wild-type BHV-1 virus zijn geïnfecteerd.

gE specifieke peptiden

Aan de hand van een bekende eiwitcoderende sequentie kunnen met behulp van een automatische synthesizer poly-peptiden van wel 40 a 50 aminozuren worden gemaakt. Nu de eiwitcoderende sequentie van het gE glycoproteïne van BHV-1 stam Lam is ontrafeld (Fig.3A), kunnen polypeptiden van dit BHV-1 gE glycoproteïne worden gesynthetiseerd. Met dergelijke polypeptiden kunnen volgens standaardmethoden proefdieren zoals bijvoorbeeld muizen of konijnen worden geïmmuniseerd om gE specifieke antilichamen op te wekken. Bovendien kunnen met behulp van deze gE-specifieke peptiden de plaatsen waar anti-gE antilichamen met het gE eiwit reageren (de epitopen) nader worden bepaald, bijvoorbeeld met de PEPSCAN methode (Geysen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002). Ook kunnen gE-specifieke oligopeptiden hun toepassing vinden in serologische tests die anti-gE antilichamen aantonen.

Prokaryote expressie van gE

Voor de synthese van het gE eiwit in bacteriën (i.e. de prokaryote expressie van gE) dienen DNA fragmenten die voor het glycoproteïne gE of voor delen daarvan coderen, in prokaryote expressievectoren gedoneerd te worden. Prokaryote expressievectoren zijn circulaire DNA moleculen die zich in een bacterie als afzonderlijk replicerend molecuul (plasmide) kunnen handhaven. Deze expressievectoren bevatten een of meerdere marker genen die coderen voor een antibioticum resistentie en zo de selectie voor bacteriën met de expressievector mogelijk maken. Bovendien bevatten expressievectoren een (vaak reguleerbaar) promotergebied, waarachter DNA fragmenten geligeerd kunnen worden, die dan onder invloed van de promoter tot expressie worden gebracht. In veel gangbare prokaryote expressie-vectoren wordt het gewenste eiwit gefuseerd aan een zogenaamd carrier eiwit tot expressie gebracht. Hiertoe bevindt zich in de vector achter de promoter de coderende sequentie voor het carrier eiwit waar meteen aansluitend het gewenste DNA fragment geligeerd kan worden. Fusie-eiwitten zijn vaak stabieler en gemakkelijker te herkennen en/of te isoleren. Het steady-state niveau dat een bepaald fusie-eiwit in een bepaalde bacteriestam kan bereiken, verschilt van fusie tot fusie en van stam to stam. Het is gebruikelijk verschillende combinaties te proberen.

Eukaryote expressie van het glycoproteïne gE-gen

Hoewel prokaryote expressie van eiwitten enige voordelen biedt, missen de eiwitten de modificaties,zoals glycosylering en dergelijke, die in eukaryote cellen wel worden aangebracht. Hierdoor is eukaryoot tot expressie gebracht eiwit vaak een geschikter antigeen. Voor de heterologe expressie van eiwitten in eukaryote cellen, zoals bijvoorbeeld muizecellen, wordt gebruik gemaakt van eukaryote expressievectoren. Deze vectoren zijn plasmiden die niet alleen in E. coli cellen kunnen worden vermenigvuldigd maar ook stabiel in eukaryote cellen kunnen voortbestaan. Ze bevatten naast een prokaryote selectie marker ook een eukaryote selectie marker. Analoog aan de prokaryote expressievectoren bevatten eukaryote expressievectoren een promoter gebied waarachter gewenste genen geligeerd kunnen worden. De promoter sequenties in eukaryote vectoren zijn echter specifiek voor eukaryote cellen. Bovendien wordt er in eukaryote vectoren maar zelden gebruik gemaakt van fusie aan carrier eiwitten. Deze vectoren worden door middel van een standaard transfectie methode (F.L. Graham en A.J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467) in de eukaryote cellen gebracht. Naast de eukaryote plasmide vectoren zijn er ook virale vectoren, waarbij het heterologe gen in het genoom van een virus wordt gebracht (e. g. retrovirussen, herpesvirussen en vaccinia virus). Eukaryote cellen kunnen vervolgens met recombinante virussen geïnfecteerd worden.

Over het algemeen is niet voorspelbaar welke vector en celtype voor een bepaald genproduct het meest geschikt zijn. Meestal worden verscheidene combinaties geprobeerd.

Serologische tests

Serologische methoden voor het maken van een onderscheid tussen met Difivac-1 gevaccineerde runderen en runderen geïnfecteerd met wild-type BHV-1 op basis van antilichamen tegen gE kunnen zijn gebaseerd op het gebruik van monoclonale antilichamen gericht tegen gE. Deze kunnen op de volgende wijzen worden toegepast: a) Volgens het principe beschreven door van Oirschot et al. (Journal of Virological Methods 22, 191-206, 1988) . In deze ELISA ter detectie van gl antilichamen tegen het virus van de ziekte van Aujeszky worden antilichamen aangetoond door hun blokkerend effect op de reactie van twee MCA’s met twee verschillende epitopen op gl. De test wordt als volgt uitgevoerd. Microtiterplaten worden gecoat met MCA 1, overnacht bij 37°C, waarna ze worden opgeslagen bij 4°C.

Het te onderzoeken serum wordt met antigeen gepreïncubeerd in separate ongecoate microtiterplaten, gedurende 2 uur bij 37°C. De met MCA 1 gecoate platen worden 5 maal gewassen, waarna MCA 2 gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRPO) aan deze platen wordt toegevoegd. Daarna worden de gepreïncubeerde serum-antigeen mengsels overgebracht naar de platen waarin zich de beide MCA’s bevinden, waarna een incubatie van 1 uur bij 37°C volgt. De platen worden gewassen en aan elk cupje wordt substraat toegevoegd. Na 2 uur bij kamertemperatuur worden de platen spectrofoto-metrisch afgelezen. Vier negatieve controlesera en vier seriële verdunningen van een positief serum worden op elke plaat meegenomen. Het serum dat een optical density (OD) waarde heeft van minder dan 50% van de gemiddelde OD waarde van de 4 negatieve controle sera die op dezelfde plaat zijn onderzocht, wordt als positief beschouwd.

b) Volgens het Indirect Double Antibody Sandwich (IDAS) principe. Hierbij worden microtiterplaten gecoat met een MCA of een polyclonaal serum gericht tegen het gE eiwit.

Een incubatie met een gE-antigeen preparaat resulteert in binding van gE aan de coating. Specifiek tegen gE gerichte antilichamen in het te onderzoeken runderserum binden vervolgens aan het gE. Deze gebonden antilichamen worden herkend door een anti-runder immunoglobuline-conjugaat. De antilichamen in dit conjugaat zijn covalent gebonden aan peroxidase enzym. Tenslotte wordt het gebonden conjugaat zichtbaar gemaakt door toevoeging van een chromogeen substraat. De specificiteit van de reactie wordt gecontroleerd door dezelfde procedure uit te voeren met een gE-negatief controle-preparaat in plaats van een gE-antigeen preparaat. Op elke microtiterplaat worden positieve en negatieve controlesera meegenomen. De test is valide als het positieve serum in een bepaalde verdunning positief scoort. Een serum is positief als het een OD scoort die 0,2 hoger is dan het standaard negatieve controle serum.

c) Volgens het IDAS principe zoals beschreven onder 2, maar na incubatie van het te onderzoeken serum wordt als conjugaat in plaats van anti-rund immunoglobuline een anti-gE MCA/HRPO gebruikt. De platen worden gewassen en aan elk cupje wordt een chromogeen substraat toegevoegd. Na 2 uur bij kamertemperatuur worden de platen speetrofotometrisch afgelezen. Vier negatieve controlesera en vier seriële verdunningen van een positief serum worden op elke plaat meegenomen. Het serum dat een OD waarde heeft van minder dan 50% van de gemiddelde OD waarde van de 4 negatieve controle sera die op dezelfde plaat zijn onderzocht, wordt als positief beschouwd.

d) Volgens het principe van een blocking ELISA, waarbij al dan niet gezuiverd virusantigeen overnacht aan het microtiterplaatje wordt gecoat. In deze plaatjes wordt het te onderzoeken serum gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd. Na een wasprocedure wordt een anti-gE MCA aan de plaatjes toegevoegd, waarna een incubatie volgt gedurende 1 uur bij 37°C. De platen worden gewassen en aan elk cupje wordt een chromogeen substraat toegevoegd. Na 2 uur bij kamertemperatuur worden de platen spectrofotometrisch afgelezen. Vier negatieve controlesera en vier seriële verdunningen van een positief serum worden op elke plaat meegenomen. Het serum dat een OD waarde heeft van minder dan 50% van de gemiddelde OD waarde van de 4 negatieve controle sera die op dezelfde plaat zijn onderzocht, wordt als positief beschouwd.

In al de bovenstaande opstellingen kan conventioneel gekweekt virusantigeen dat gE bevat, worden gebruikt, maar ook gE-antigeen dat via prokaryoten of eukaryoten tot expressie wordt gebracht. Ook oligopeptiden, gebaseerd op de BHV-1 gE sequentie, zouden in bovenstaande diagnostische testen kunnen worden gebruikt in plaats van conventioneel antigeen. Daarnaast zouden dergelijke oligopeptiden gebruikt kunnen worden voor de ontwikkeling van een zgn. "cow-side" test volgens het principe beschreven in een artikel van Kemp et al., Science 241, 1352-1354, 1988. Een dergelijke test zou dan gebaseerd zijn op een binding van de antigene sequentie van het oligopeptide door in geïnfecteerde dieren aanwezige antilichamen tegen gE. Het oligopeptide zou voor zo'n test gekoppeld moeten worden aan een MCA gericht tegen rundererythrocyten.

Nucleïnezuur analyse met behulp van de polymerase ketting reactie

Oligonucleotiden (probes en primers) kunnen bijv. in de polymerase kettingreactie worden gebruikt om onderscheid te maken tussen gevaccineerde en geïnfecteerde dieren. De polymerase kettingreactie (PCR) is een techniek waarbij in korte tijd nucleïnezuren van een pathogeen miljarden malen vermenigvuldigd kunnen worden (De polymerase kettingreactie, P.F. Hilderink, J.A. Wagenaar, J.W.B. van der Giessen en B.A.M. van der Zeijst, 1990, Tijdschrift voor Diergeneeskunde deel 115, 1111-1117). De gE oligonucleotiden kunnen zo gekozen worden dat er bij een gE positief genoom een ander produkt ontstaat dan bij een gE negatief genoom. Dit heeft tot voordeel dat ook een dier gevaccineerd met een gE deletie vaccin in een PCR test een positief signaal geeft. Deze benadering is echter afhankelijk van de aanwezigheid van nucleïnezuren van het virus in een van het te testen dier afkomstig monster, bijvoorbeeld het bloed.

Na een acute BHV-1 infectie is de kans groot dat BHV-1 specifieke nucleïnezuren in het bloed aangetoond kunnen worden, maar of tijdens latentie ook BHV-1 nucleïnezuren in het bloed zijn aan te tonen is nog niet vastgesteld.

Het gebruik van BHV-1 als vector

Voor het tot expressie brengen van heterologe genen in het BHV-1 genoom is het noodzakelijk om over nauwkeurige informatie te beschikken over het gebied waar het heterologe gen geïnsereerd wordt. Er mogen geen essentiële sequenties worden verstoord en voor de expressie van het heterologe gen moeten regulatoire sequenties voorhanden zijn. In principe is het glycoproteïne gE-gen een geschikte plaats om heterologe genen tot expressie te brengen. Het gE-gen is niet essentieel waardoor het geen bezwaar is als het heterologe gen het gE-gen vervangt. Hierdoor kan het heterologe gen zodanig worden geplaatst dat het onder invloed van de regulatoire sequenties van het gE-gen komt. Ook kan het heterologe gen aan het (export)signaalpeptide van het gE-gen worden geligeerd waardoor de uitscheiding van het heterologe gen-product kan worden beïnvloed. Het is duidelijk dat de gedetailleerde kennis van het gE-gen en het gE-eiwit de mogelijkheid creëert om BHV-1 op zeer afgepaste wijze als vector te gebruiken. De ontstane vectoren kunnen bovendien serologisch van wild type worden onderscheiden. De constructie van BHV-1 mutanten die heterologe genen tot expressie brengen, kan op dezelfde wijze worden uitgevoerd als de in de voorbeelden getoonde constructie van gE-deletiemutanten. Het deletiefragment dient dan echter te worden vervangen door een fragment waarop zich op de plaats van de deletie een heteroloog gen bevindt.

VOORBEELDEN

1) Isolatie en identificatie van een natuurlijke gE deletie mutant.

a) Isolatie van een natuurlijke mutant

Van een aantal conventioneel geattenueerde vaccins is genomisch DNA geïsoleerd volgens standaard methodes en met behulp van restrictie enzymen geanalyseerd. Er is met name gezocht naar genoomafwijkingen die geschikt zouden zijn om onderscheid met het wild type BHV-1 virus mogelijk te maken.

Hierbij is de aandacht vooral gericht op het Us gebied van het BHV-1 genoom, omdat in dat gebied - naar analogie met het herpes simplex virus - waarschijnlijk een aantal genen coderend voor niet essentiële glycoproteïnen liggen [Identification of a herpes simplex virus 1 glycoprotein gene within a gene cluster dispensable for growth in cell culture, R. Longnecker, S. Chatterjee, R. J. Whitley and B. Roizman (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4303-4307] .

Een batch van een BHV-1 vaccin afkomstig van de universiteit van Zagreb, Joegoslavië (Lugovic et al., 1985) bleek na een groot aantal passages op bovine embryonale niercellen en embryonale bovine trachea-cellen (Ebtr) naast een normaal Us gebied ook een afwijkend Us gebied te hebben. Bovendien bleek dit vaccin op Ebtr cellen zowel grote als kleine plaques te vormen. Uit deze mengpopulatie is door drie limiting dilution stappen, waarbij telkens gekozen is voor kleine plaques, een virus geïsoleerd met een afwijkend Us gebied. Het langs deze weg geïsoleerde virus is nader onderzocht, en is Difivac-1 genoemd.

b) Identificatie van de deletie in het gE-gen in Difivac-1

Voor nadere analyse van deze afwijking in het Us gebied is genomisch DNA van Difivac-1 geïsoleerd volgens standaard methoden en onderworpen aan Southern blot (fig.IA). Hybridisatie van deze blot met een 32P gelabeld wild type HindlII K fragment bevestigde dat dit fragment, dat centraal in het U$ gebied gelegen is, in Difivac-1 zo'n 1,2 kilobasen (kb) korter is. Bovendien kon door deze analyse de positie van het ontbrekende deel worden benaderd (fig.lB). Voor verdere analyse van deze deletie is het U$ gebied van de wild type BHV-1 stam Lam geïsoleerd en gedoneerd in prokaryote vectoren. Hiertoe is volgens standaardmethoden genomisch DNA van de Lam stam (fig.2A) geïsoleerd en in de vectoren pUC18, pACYC en pBR322 gedoneerd (fig.2B) . Van het gebied rond de vermoedelijke positie van de deletie is een fysische kaart samengesteld (fig.2C). Uitgaande van deze fysische kaart zijn voor de bepaling van de nucleotidensequentie van deze regio geschikte subclones geconstrueerd in de vectoren pKUN19 en pUC18 (fig.2D). Met behulp van deze subclones is van het gehele gebied (aangegeven in fig.2C) met behulp van de Sanger methode van beide strengen de nucleotidensequentie vastgesteld. Deze nucleotidesequentie (SEQ ID N0:1) is met behulp van het PC/Gene programma geanalyseerd. Uit de conceptuele vertaling bleek dat nucleotiden (nt) 164 tot en met nt 1888 coderen voor een open leesraam van 575 aminozuren (fig.3A). Nadere analyse toonde aan dat deze aminozuurvolgorde de karakteristieken heeft van een transmembraan glycoproteïne zoals is weergegeven in fig.3B. De eerste 26 aminozuren (aa) worden namelijk herkend als een typisch eukaryoot exportsignaal en het gebied tussen aa 423 en aa 450 wordt herkend als een transmembraan regio. Daarnaast komen er in de sequentie drie potentiële N-gebonden glycosyleringsplaatsen voor. Deze voorspelde aminozuursequentie vertoont duidelijke overeenkomsten met het glycoproteïne gE-gen van het herpes simplex virus (HSV); zie figuren 4A en 4B. Deze en andere overeenkomsten rechtvaardigen de conclusie dat het gevonden gen het gE homoloog van BHV-1 is. Om deze reden wordt het gen gE genoemd. Om na te gaan in hoeverre dit BHV-1 gE-gen in Difivac-1 ontbreekt is het p318 fragment geïsoleerd. Het p318 fragment start op de Alul site 55 nt voor het gepostuleerde BHV-1 gE open leesraam en eindigt 133 nt erachter. Genomisch Difivac-1 DNA is met dit p318 fragment met behulp van Southern blot hybridisatie geanalyseerd. Hieruit bleek dat Difivac-1 geen p318 detecteerbare sequenties bevat (fig.5). Dit experiment bevestigde dat Difivac-1 een deletie bevat en toont duidelijk aan dat deze deletie zich over het gehele gE-gen uitstrekt.

2) Constructie van recombinant gE deletiemutanten van BHV-1

Om te kunnen beschikken over differentieerbare BHV-rl vaccins die moleculair beter gedefinieerd zijn dan Difivac-1 en die desgewenst naast een deletie in het gE-gen tevens een deletie in bijvoorbeeld het thymidine kinase gen bevatten, zijn - naast Difivac-1 - ook recombinante gE deletiemutanten geconstrueerd. Uitgaande van de vastgestelde positie van het glycoproteïne gE-gen en gebruikmakend van de gedoneerde DNA fragmenten die het gE-gen flankeren, kon een gE deletiefragment geconstrueerd worden. Dit deletiefragment kon met behulp van een standaardtechniek (F. L. Graham en A. J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467) in het genoom van een wild type BHV-1 stam gerecombineerd worden waardoor een gE deletiemutant ontstaat.

a) De constructie van het gE deletiefragment

Voor de constructie van het gE deletiefragment is gestreefd naar een fragment dat enerzijds de gehele gE sequentie mist en anderzijds voldoende flankerende sequentie bevat om recombinatie met het wild type genoom te laten plaatsvinden. Aan de 5’ (stroomopwaarts) gelegen zijde is gekozen voor het 1,2 kb Pstl-AsuII fragment dat 18 nt voor het startcodon van het gE-gen eindigt. Voor het 3’ (stroomafwaarts) gelegen fragment is gekozen voor het 1,2 kb EcoNI-Dral fragment dat 2 nt voor het stopcodon van het gE-gen start (fig.6).

Voor de constructie van het gE deletiefragment is het uit het 8,4 kb HindlII K fragment van BHV-1 stam Lam afkomstige 1,4 kb - 5’ van het gE-gen gelegen - Pstl-Smal fragment gesubcloneerd in de Smal en PstI site van plasmide pUC18. Deze clone is p515 genoemd. In de unieke AsuII site van p515 is het 3' van gE gelegen EcoNI-Smal fragment gedoneerd dat afkomstig is van de 4,1 kb HindlII-EcoRl clone. Hiermee was de constructie van het gE deletie-fragment voltooid en de aldus geconstrueerde clone is p519 genoemd. Hoewel in principe de gehele Pstl-Smal insert van p519 als gE deletiefragment gebruikt zou kunnen worden, is het niet raadzaam. Het Pstl-Smal reikt namelijk ca. 100-150 baseparen (bp) in de repeat sequentie die het Us gebied flankeert. Dit stukje van 100-150 bp zou kunnen recombineren met de repeat sequentie aan de andere zijde van het Ug gebied waar het gE-gen niet gelegen is en zou zo ongewenste recombinatieproducten kunnen opleveren. Daarom is voor het recombinatie experiment gekozen voor het Pstl-Dral fragment, waardoor 100 bp van de repeat worden verwijderd.

b) Recombinatie van het gE deletiefragment met het genoom van wild type BHV-1

Om de recombinatie tussen het geconstrueerde gE deletiefragment en het genoom van wild type BHV-1 te bewerkstelligen, worden microgram hoeveelheden van beide DNA moleculen gecotransfecteerd naar Embryonale bovine trachea (Ebtr) cellen volgens de standaard methode van F.L. Graham en A.J. van der Eb (1973, Virology 52, 456-467). Cellulaire recombinatiemechanismen leiden ertoe dat een klein percentage van de DNA moleculen (2 a 4%), die door de cellen zijn opgenomen, wordt gerecombineerd. Voor de selectie van de gerecombineerde gE deletiemutanten wordt het virusmengsel dat na transfectie ontstaat op een nieuwe Ebtr cel-cultuur uitgezaaid. De afzonderlijke viruspopulaties die daardoor ontstaan (plaques), zijn in de meeste gevallen afkomstig van één virus. Voor de isolatie van gE-deletiemutanten van BHV-1 stam Lam zijn 230 van deze plaques geïsoleerd en volgens standaard immunologisch methoden onderzocht met BHV-1 specifieke monoclonale antilichamen (MCA's) die niet reageren met Difivac-1 geïnfecteerde cellen. Deze MCA's zijn tegen het glyco-proteïne gE gericht. Vijf van de 230 plaques reageerden niet met deze MCA's. Het DNA van deze 5 plaques is nader onderzocht.

c) DNA analyse van de geconstrueerde gE-deletiemutanten van BHV-1 stam Lam DNA preparaten van 3 (1B7, 1B8 en 2H10) van de bovengenoemde 5 kandidaat gE-deletiemutanten zijn met behulp van de standaard Southern blot analyse techniek (Sambrook et al. 1989) nader onderzocht. Dubbeldigesties van deze DNA preparaten met PstI en Dral, gevolgd door gelelectroforese en Southern blot hybridisatie met het 2,3 kb Pstl-Dral deletiefragment als probe toont aan dat het gE-gen uit het genoom van viruspopulaties 1B7 en 1B8 exact op de gewenste wijze is verwijderd; zie figuren 7A en 7B. Populatie 2H10 heeft een afwijkend Pstl-Dral fragment. Southern blot hybridisaties met een gE-specifieke probe tonen aan dat zich in geen van de drie DNA preparaten gE sequenties bevinden (resultaten niet getoond). BHV-1 viruspopulaties 1B7 en 1B8 zijn beoogde recombinant gE deletiemutanten. Eén van deze populaties zal op vaccin eigenschappen worden getest.

d) Constructie van thymidine kinase/gE dubbel-deletie-mutanten

Omdat BHV-1 recombinant deletiemutanten met een deletie in slechts één gen mogelijk niet voldoende verminderd virulent zijn, zijn ook deleties aangebracht in het thymidine kinase (TK) gen van de BHV-1 stammen Lam en Harberink. Deze mutanten zijn op analoge wijze geconstrueerd als de hierboven genoemde gE-deletiemutanten (resultaten niet getoond). Deze TK-deletiemutanten zullen worden gebruikt om TK/gE dubbel-deletiemutanten te construeren.

3) Prokaryote expressie van gE

Voor de prokaryote expressie van het BHV-1 glycoproteïne gE-gen is tot nu toe gebruik gemaakt van pGEX expressievectoren (D. B. Smith and K. S. Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). pGEX vectoren coderen voor het carrier eiwit glutathione S-transferase (GST) uit Schistosoma japonicum dat onder invloed staat van de tac promoter die door Isopropylthiogalactoside (IPTG) tot expressie geïnduceerd kan worden. Een voorbeeld van een GST-gE fusie eiwit is het product van construct pGEX-2T600s3. In dit construct is met behulp van standaard moleculair biologische technieken (Sambrook et al. 1989) een 600 bp Smal fragment, dat codeert voor een N-terminaal gebied van 200 aminozuren van het gE eiwit, geligeerd achter het GST gen. Dit construct is in drievoud uitgevoerd waarbij er telkens een ander leesraam van het 600 bp fragment aan het GST geligeerd is. Alle drie de contructen zijn in Escherichia coli stam DH5a gebracht, geïnduceerd met IPTG en de gevormde eiwitten zijn na polyacrylamine gel-electroforese d.m.v. western blotting op nitrocellulose overgebracht. Immunologische detectie met anti-GST antilichamen toonde aan dat alleen het juiste leesraam (no.3) dat codeert voor het gE eiwit gebied leidt tot de expressie van een prominent fusie eiwit van de voorspelde grootte van 27k (GST) + 20k (gE) = 47k.

Met het oog op het ontwikkelen van serologische tests om onderscheid te kunnen maken tussen dieren die met een BHV-1 gE deletievaccin gevaccineerd zijn en dieren die met een BHV-1 wild type stam geïnfecteerd zijn, zijn mono-clonale antilichamen opgewekt tegen wild type BHV-1 stam Lam. Enkele van deze MCA's reageren in immunologische tests wel met Ebtr cellen die met wild-type BHV-1 stammen geïnfecteerd zijn maar niet met Difivac-1 geïnfecteerde Ebtr cellen. Deze differentiërende MCA's zijn tegen het glycoproteïne gE gericht. Eén van deze MCA's (no.81) herkent het 47k GST-gE fusie-eiwit op een western blot; zie fig.8B. Deze waarneming bewijst dat MCA 81 een epitoop op het gE eiwit herkent en is daarom een goede kandidaat om in een serologische test anti-gE antilichamen aan te tonen. Bovendien blijkt dit 47k GST-gE fusie-eiwit geschikt te zijn voor immunisatie van proefdieren om gE-specifieke antilichamen op te wekken. Getracht zal worden om langs deze prokaryote weg of langs eukaryote weg ook van de andere genoemde differentiërende MCA’s aan te tonen dat ze tegen het gE eiwit gericht zijn.

4) Eukaryote expressie van het glycoproteïne gE-gen

Voor de eukaryote expressie van het glycoproteïne gE-gen is totnogtoe onder andere gekozen voor de vector pEVHis. De pEVHis vector heeft als eukaryote marker het HisD gen dat codeert voor het histidinol dehydrogenase [EC 1.1.1.23] (C. Hartmann en R. Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8047-8051) dat cellen de toxische concentratie van 2,5 mM histidinol doet overleven. De vector bevat bovendien het promoter gebied van het immediate early gen van het Humane Cytomegalo Virus (HCMV), met daarachter unieke restictie enzym sites. Voor de constructie van een pEVHis/gE expressievector is gebruik gemaakt van een fragment dat de gehele coderende gebied van het glycoproteïne gE-gen omvat. Het start op de Alul site 55 bp vóór het gepostuleerde open leesraam van gE en eindigt 133 bp erachter. Dit gebied is gedoneerd achter de HCMV promoter van de pEVHis vector, waardoor het construct pEVhis/gE ontstond; zie fig. 9. Het pEVHis/gE is in E.coli DH5a cellen geamplificeerd en door middel van een cesium-chloride gradient gezuiverd (Sambrook et al., 1989). Dit gezuiverde DNA is volgens de methode van Graham en van der Eb naar Balb/C-3T3 cellen getransfecteerd. Getransformeerde cellen zijn met histidinol geselecteerd, waarna een twintigtal histidinol resistente kolonies konden worden geïsoleerd. Deze kolonies zijn door middel van een Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) met MCA 81 onderzocht. Vier kolonies bleken het gE eiwit tot expressie te brengen.

5) Detectie van BHV-1 nucleïnezuren door middel van de Polymerase Ketting Reactie (PCR) procedure met behulp van BHV-1 gE-specifieke primers.

Uitgaande van de vastgestelde nucleotide sequentie van het BHV-1 gE-gen is met behulp van het primer selectie programma van Lowe et al. (T. Lowe, J. Sharefkin, S. Qi Yang en C.W. Dieffenbach, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 1757-1761) een voor de PCR geschikt primerpaar uitgekozen. Deze primers zijn P3 en P4 genoemd en zijn in figuur 10 aangegeven. De primers liggen 159 nt uit elkaar en leiden tot de amplificatie van een fragment van 200 nt. Gebruikmakend van primers P3 en P4 en geïsoleerd BHV-1 DNA zijn de condities voor de PCR procedure geoptimaliseerd. Hierbij zijn vooral de MgCl2 concentratie, de glycerol concentratie en de cycling condities gevarieerd. De gevonden optimale buffer voor het gebruik van P3 en P4 voor de amplificatie van BHV-1 DNA is 10 mM Tris pH 8,0, 50 mM KC1, 0,01% gelatine, 2,6 mM MgCl2 en 20% glycerol. De gevonden optimale cycling condities (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler) zijn voor cycli 1-5:1 min. 98°C, 30 sec. 55°C en 45 sec. 72°C en voor de cycli 6 - 35: 30 sec. 96°C, 30 sec. 55°C en 45 sec. 72°C. Na de PCR amplificatie is het 200 nt DNA fragment volgens standaard procedures ( Sambrook et al., 1989) op een 2% agarose gel geëlectroforeerd, geblot op nitrocellulose en vervolgens aan een Southern blot analyse onderworpen. De voor de Southern blot analyse gebruikte 32P dCTP gelabelde probe is het 137 bp Taql fragment dat tussen de primer binding sites is gelegen (fig.10). Na autoradiografie van de gehybridiseerde filters kan een 200 bp band worden waargenomen. Langs deze weg leidt amplificatie van slechts 10 BHV-1 genomen (ca 1,5 x 10"15 μg DNA) nog tot een goed detecteerbaar signaal (resultaat niet getoond). Op vergelijkbare wijze is een PCR procedure ontwikkeld met behulp van primers die gebaseerd zijn op de coderende sequentie van het BHV-1 glycoproteïne gill (D.R. Fitzpatrick, L.A. Babiuk en T. Zamb, 1989, Virology 173, 46-57). Om onderscheid te kunnen maken tussen wild type BHV-1 DNA en een gE deletiemutant vaccin zijn DNA monsters zowel aan de gE-specifieke PCR als aan glll-specifieke PCR analyse onderworpen. In een dergelijke test is een Difivac-1 DNA preparaat gill positief en gE negatief bevonden.

Omdat de detectie van BHV-1 DNA in het sperma van runderen een belangrijke toepassing van de BHV-1 specifieke PRC procedure zal zijn, is getracht om de gE-specifieke PCR

uit te voeren op rundersperma dat met BHV-1 is besmet. Onbekende componenten in het sperma hebben echter een sterk remmende werking op de polymerase ketting reactie. Daarom is een protocol ontwikkeld om het BHV-1 DNA uit rundersperma te isoleren. Het rundersperma wordt allereerst 1 min. met 13000 g gecentrifugeerd om de spermatozoïden van de spermavloeistof te scheiden. Vervolgens wordt het BHV-1 DNA uit de spermavloeistof geïsoleerd door een protease K behandeling: 60 min incubatie bij 55°C in 10 mM Tris, 50 mM KC1, 2,5mM MgCl2, 100 μg/ml protease K en 0,5% Tween 20, gevolgd door 10 min. inactivatie bij 95°C. Hierna volgen een standaard fenolextractie en ethanolprecipitatie. Het zo geïsoleerde DNA remt de polymerase ketting reactie niet.

FIGUURBESPREKING

figuur 1

Southern blot analyse van BHV-1 stammen Difivac-1 en Iowa. A. Autoradiogram van een Southern blot van Difivac-1 en Iowa genomisch DNA. In de laantjes 1 en 3 is Difivac-1 DNA opgebracht na restrictie-enzym digestie met resp. HindlII en Pstl. In de laantjes 2 en 4 is Iowa DNA opgebracht na restrictie-enzym digestie met respectievelijk HindlII en Pstl. De grootte van de fragmenten is in kilobasen (kb) aangeduid. Links, de foto; rechts, een tekening daarvan. Viraal DNA is geïsoleerd door het kweekmedium (70ml/rolfles van ca. 450 cm2) met virus geïnfecteerde Ebtr cellen 2 uur door een 25% (w/w) sucrose kussen, in 10 mM Tris pH 7,4, 150mM NaCl en 1 mM EDTA te centrifugeren bij 20 krpm in de SW27 rotor van de Beekman L5-65 ultracentrifuge, üit het zo verkregen viruspellet is volgens standaardmethoden DNA geïsoleerd (J. Sambrook, E.F. Fritsch en T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Op dit DNA zijn restrictie-enzym digesties uitgevoerd met enzymen van Boehringer Mannheim in de door de fabrikant bijgeleverde SuRE/cut buffers. Na scheiding op een 0,7% agarose gel voor horizontale electroforese en blotting op een nitrocellulose filter (Schleicher & Schuell, Inc.) is het filter 6 uur geprehybridiseerd bij 42°C in 50% formamide, 3 x SSC (1 x SSC = 0,15M NaCI en 0,015 M Na-citraat, pH 7,4), 50μ1 gedenatureerd zalm sperma DNA (Sigma)/ml en 0,02% bovine serum albumine, 0,02% polyvinylpyrrolidone en 0,02% ficoll en 0,1% Na-dodecylsulfaat (SDS). Hierop is de hybridisatie uitgevoerd door aan dezelfde oplossing het 32P dCTP (Amersham) gelabelde HindlII K fragment toe te voegen (De keuze van het HindlII K fragment is gebaseerd op: Cloning and cleavage site mapping of DNA from bovine herpesvirus 1 (Cooper strain), John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell and David A. Reed, Journal of Virology (1983) 259-264). Na 12-14 uur hybridisatie is het filter 2 uur gewassen in 0,1% SDS en 0,1 x SSC bij 60°C.

Het HindiII K fragment is volgens standaard cloning procedures (J. Sambrook, E.F. Fritsch en T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) in de pUC18 vector gedoneerd. Na HindlII digestie van de pUC/8,4HindIIIK clone is door electroforese op een 0,7% Low Melting Point Agarose (BRL, Life Technologies, Inc.) gel de pUC18 vector weer van het 8,4 kb HindlII K fragment gescheiden en door standaard fenolextractie en ethanolprecipitatie uit de agarose geïsoleerd. Het geïsoleerde HindlII K fragment is gelabeld met de Random Primed DNA labeling Kit 1004.760 van Boehringer Mannheim. Autoradiografie van de gehybridiseerde filters is uitgevoerd door 36 uur expositie van een Kodak XAR film bij -70°C, waarbij een reflecterend scherm is gebruikt.

B. Fysische kaarten van het 8,4 kb HindlII K fragment van Iowa en van het 7,2 kb HindlII fragment van Difivac-1. Gezien de comigratie van de 6 kb PstI fragmenten en de afwezigheid van het 1,8 kb PstI fragment in Difivac-1 is de deletie in het gearceerde gebied gepostuleerd.

figuur 2

Subclonering van wild-type BHV-1 fragmenten rond het gebied dat in Difivac-1 ontbreekt.

In A zijn de componenten weergegeven van het BHV-1 genoom: Het Unique Long (Ul) gebied; het Unique Short (Us) gebied en de twee repeats (Ir en Tr). Deze kaart is gebaseerd op de gepubliceerde analyse van de Cooper strain (John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell and David A. Reed, Journal of Virology (1983) 259-264) .

In B zijn de fragmenten aangegeven uit het Ug gebied, die in prokaryote vectoren gedoneerd zijn: Een 15,2 kb EcoRI fragment in pACYC, een 8,4 kb HindlII fragment in pUC18 en een 2,7 kb en een 4,1 kb EcoRI-HindlII fragment in pBR322. De isolatie van de virale DNA fragmenten is uitgevoerd volgens de procedures die in de legenda van figuur IA zijn vermeld. De clonering van deze fragmenten in de diverse vectoren is uitgevoerd volgens standaard procedures (J. Sambrook, E.F. Fritsch en T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

In C is een fysische kaart weergegeven van het gebied waar de deletie in Difivac-1 gelokaliseerd is.

In D zijn enige subclones van dit gebied aangegeven, die voor verdere analyse zijn gebruikt. De twee PstI fragmenten zijn in pKUN19 gedoneerd en de overige fragmenten in pUC18.

figuur 3 A: Nucleotide sequentie van 2027 nucleotiden uit het Ug gebied van BHV-1 stam Lam rond de plaats die in Difivac-1 gedeleteerd is, zoals aangegeven in figuur 2C [van de Alul herkenningsplaats uiterst links tot de Hindi herkennings-plaats uiterst rechts]. De nucleotidensequentie is bepaald door van de beide strengen te analyseren met de dideoxy sequentie methode van Sanger et al. (F. Sanger, S. Nicklen en A.R. Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) van de inserts van de subclones aangegeven in figuur 2D. Hiertoe is de T7 sequentie kit gebruikt van Pharmacia volgens de door de fabrikant aangegeven procedure. Voor de radioactieve labeling is [35S] dATP (Amersham) gebruikt. De sequentie analyse van GC rijke gebieden met compressie artefacten is herhaald met de 7-deaza-dGTP variant van de Pharmacia kit. Boven de nucleotidesequentie is in de drie-letter code de aminozuur (aa) volgorde weergegeven van het open leesraam van 575 residuen dat na conceptuele vertaling van de nucleotidensequentie is gevonden. Deze vertaling is gebaseerd op de universele code en is met behulp van het PC/gene computerprogramma vastgesteld ( PC/gene versie 1.03, nov. 1987). Dit open leesraam van 575 aa start met de methionine op nucleotide 168 en eindigt met het stopcodon op nucleotide 1893.

Structurele analyse van het 575 aminozuren lange open leesraam is eveneens uitgevoerd met het PC/gene computer programma. De eerste 26 aa vormen een eukaryoot export signaal in de figuur aangegeven met "signaalpeptide". Met een score van 6,2 wordt de klieving van deze signaal-sequentie voorspeld tussen aa 26 en aa 27. De 575 aa lange sequentie heeft 3 mogelijke N-gebonden glycosylerings-plaatsen (NXT/S) aangegeven met een streepje onder de aminozuurresiduen. Volgens de methode van Rao en Argos ligt er een transmembraan gebied tussen aa 423 en aa 450 in de figuur aangegeven met "transmembraan helix". Herkennings-sequenties (sites) voor de restrictie enzymen AsuII, Smal, HindlII en EcoNI zijn onderstreept. Het berekende molecuulgewicht van dit polypeptide is 61212.

B: Schematische weergave van de in A genoemde structurele karakteristieken van het 575 aa open leesraam.

figuur 4

Aminozuurvergelijking van de aminozuursequentie van het BHV-1 gE-gen met de aminozuursequentie van het herpes simplexvirus (HSV) gE-gen en andere gE homologe genen [pseudorabies virus (PRV) gl en varicella-zoster (VZV) gpl]. De voor deze vergelijking gebruikte sequenties zijn afkomstig uit de volgende publikaties; HSV: Sequence determination and genetic content of the short unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. D.J. McGeoch, A. Dolan, S. Donald and F.J. Rixon (1985) Journal Mol. Biol. 181, 1 -13. VZV: DNA sequence of the Ug component of the varicella-zoster virus genome. A.J. Davidson (1983), EMBO Journal 2, 2203-2209. PRV: Use of Igtll to isolate genes for two pseudorabies virus glycoproteins with homology to herpes simplex virus and varicella-zoster virus glycoproteins. E.A. Petrovskis, J.G. Timmins and L.E. Post (1986) Journal of Virology 60, 185-193]. Deze sequenties zijn vergeleken met behulp van het sequentie analyse programma Multalin (F. Corpet, 1988,

Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890).

In A is een diagram weergegeven waarin alle vier de amino-zuursequenties schematisch zijn weergegeven. Hierbij zijn de voorspelde transmembraan gedeelten (TM) onder elkaar gezet. Naast de voorspelde export-signaalsequenties (SP) en de mogelijke N-gebonden glycosyleringsplaatsen (I) zijn twee geconserveerde gebieden weergegeven, waarin de relatieve positie van de cysteïneresiduen vaak onveranderd is (C C C) .

In B is het resultaat weergegeven van de Multalin vergelijking van het centraal gelegen cysteine rijke gebied van de vier gE versies. Hierbij geven sterretjes identieke aminozuren aan en dubbele punten analoge aminozuren.

figuur 5

Southern blot analyse van Difivac-1 en Iowa. Boven, de foto's; onder, een tekening daarvan.

Panel A: Genomisch DNA van Difivac-1 en Iowa restrictie enzym digesties met BstI (1,2), EcoRI (3,4) en HindlII (5,6) gescheiden op een 0,7% agarose gel, geblot op nitrocellulose en gehybridiseerd met 32P gelabeld HindlII K fragment van BHV-1 stam Lam volgens de procedures vermeld in de legenda van figuur IA.

Panel B: Nitrocellulose blot van dezelfde gel als in A gehybridiseerd met de BHV-1 gE specifieke probe p318. Deze probe omvat het gehele AluI-HincII gebied aangegeven in figuur 2C.

figuur 6

Constructie van gE deletiefragment BHV-1.

In A is de positie van het gE-gen en de gebruikte clones weergegeven. De componenten van het BHV-1 genoom zijn: Het Unique Long (Ul) gebied; het Unique Short (Us) gebied en de twee repeats (Ir en Tr). Voor het aan de 5' zijde van het gE-gen gelegen gebied is het 1,4 kb Pstl-Smal fragment uit het 8,4 kb HindlII K fragment van BHV-1 stam Lam gesub-cloneerd in de Smal en PstI site van plasmide pUC18. Deze clone is p515 genoemd en is weergegeven in B. In de unieke AsuII site van p515 is het 3' van gE gelegen EcoNI-Smal fragment gedoneerd dat afkomstig is van de 4,1 kb HindlII-EcoRI clone. Om de ligatie van de EcoNI rest aan de AsuII rest mogelijk te maken is clone p515 gedigereerd met AsuII, vervolgens met Klenow enzym (Boehringer Mannheim) en dCTP behandeld om in de AsuII rest één cytosine residue aan te brengen volgens standaardmethoden (Sambrook et al., 1989). Deze extra cytosine is aangegeven met een sterretje in D. Hierop is p515 ook gedigereerd met het Smal enzym waarna het EcoNI fragment in deze vector geligeerd kon worden. De aldus geconstrueerde clone is p519 genoemd.

figuur 7 A. Southern blot analyse van DNA preparaten van 1B7, 1B8 en 2H10. DNA isolatie, restrictie-enzym digesties, blotting en hybridisatie zijn uitgevoerd volgens de procedures beschreven in de legenda van figuur IA. Na Pstl-Dral dubbeldigestie van de DNA preparaten 1B7, 1B8 en 2H10 zijn de fragmenten gescheiden op een 0,7% agarose gel en vervolgens geblot op een nitrocellulose filter. Dit filter is gehybridiseerd met het 32P dCTP gelabelde 2,3 kb Pstl-Dral deletiefragment als probe. In laantjes 1 tot 3 zijn respectievelijk de monsters 1B7, 1B8 en 2H10 gescheiden. In laantje 4 is wild type BHV-1 DNA van de Lam stam opgebracht en in laantje 5 het 2,3 kb deletiefragment. Boven, de foto; onder, een tekening daarvan.

B. Fysische kaart van het 15,2 kb EcoRI fragment van BHV-1 stam Lam. De kaart toont de positie van de PstI, Dral en HindlII herkenningsplaatsen en de positie van de in 7A genoemde hybridisatie probe.

figuur 8

Prokaryote expressie van BHV-1 gE.

Voor de prokaryote expressie van BHV-1 gE is het 600bp Smal fragment van het gE-gen in drie leesramen gefuseerd aan het coderende gebied van het glutathione-S-transferase gen uit Schistosoma japonicum in de vector pGEX-2T (D.B. Smith and K.S. Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). Recombinant moleculen met de juiste (syn) oriëntatie van het Smal fragment zijn geïdentificeerd d.m.v. restrictie enzym analyse met behulp van standaard methoden. E. coli DH5a clones met dit fusie-construct zijn pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 en pGEX-2T600s3 genoemd.

A. Diagram van een van de pGEX-2T600s constructen. Aan de NH2 zijde van het gebied dat codeert voor GST-gE fusie-product bevindt zich het Isopropylthiogalactoside (IPTG) induceerbare tac promoter gebied.

B. Western blot analyse van totaal eiwit preparaten van DH5a cellen getransformeerd met pGex-2T600s. Overnacht culturen van DH5a cellen getransfecteerd met de constructen pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 en pGEX-2T600s3 zijn 1/10 in Luria-Bertani (LB) medium met 50μg/ml ampicilline doorgezet en na 1 uur groei 5 uur lang met IPTG geïnduceerd. Deze geïnduceerde culturen zijn 5 minuten 6000 g afgedraaid en opgenomen in 1 x layermix (2% SDS, 10% Glycerol, 5% mercaptoethanol en 0,01% bromophenolblauw) [1,5 ml cultuur is opgenomen in 500 μΐ layermix] en 5 minuten op 95°C verhit. Vervolgens is 50 μΐ per laantje gescheiden op een vertikale 12,5% polyacrylamide gel volgens standaard procedures en vervolgens Semi-dry geblot naar een nitrocellulose filter met behulp van het LKB-multiphor II Nova Blot systeem onder door de fabrikant aangegeven condities.

In de laantjes M is prestained marker eiwit opgebracht (BRL Life Technologies, Inc. 236k, 112k, 71k, 44k, 28k, 18k en 15k) en in de laantjes 1, 2 en 3 de totaal-eiwit preparaten van DH5oc cellen get rans feet eerd met de drie resp. frames: GEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 en pGEX-2T600s3.

In panel A is het resultaat te zien van de westernblot analyse met anti-GST serum. Hiertoe is het filter geïncubeerd volgens standaard procedures (E. Harlow en D. Lane, 1988, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) in blocking buffer (PBS + 2% melkpoeder en 0,05% Tween 20) en vervolgens met polyclonaal anti-GST konijne serum. Hierop is het filter gewassen en geïncubeerd met horse radish peroxidase (HRPO) geconjugeerd geit-anti-konijn immuunglobuline serum. Hierop zijn de gebonden geite antilichamen immunochemisch gedetecteerd met chromogeen (diaminobenzidine, chloronaphtol en H2O2). Het GST fusieprodukt dat met een pijl is aangegeven heeft alleen in frame 3 de voorspelde grootte van ca. 47 k.

In panel B is het resultaat te zien van de western blot analyse met monoclonaal antilichaam MCA 81, dat het gE eiwit herkent. Hiertoe is een duplo filter als in panel A geblokt, geïncubeerd met MCA, gewassen, en geïncubeerd met HRPO geconjugeerd konijn-anti-muis serum. Hierop zijn de gebonden konijne antilichamen immunochemisch gedetecteerd met chromogeen. De band die zichtbaar is in laantje 3 (frame 3) is 47k groot en met een pijl aangegeven.

Boven, de foto's; onder, een tekening daarvan.

figuur 9

Constructie van het pEVHisgE plasmide voor de eukaryote expressie van het BHV-1 gE-gen.

Voor de eukaryote expressie van het gE-gen is de gehele gE coderende regio in de juiste oriëntatie achter het HCMV promoter gebied gedoneerd van de expressie vector pEVHis met behulp van standaard procedures (Sambrook et al. 1989). Hiertoe is het 394 bp Alul fragment dat 55 bp voor het het open leesraam van het gE start gedoneerd in pUC18 en is p201 genoemd. Vervolgens is na Hindi digestie van p201 het 1740 bp Hindi fragment, dat het grootste deel van het gE-gen omvat, in p201 gedoneerd. Hierdoor ontstond plasmide p318 dat in de polylinker van pUC18 het gehele gE coderende gebied bevat van de Alul site 55 bp voor het startcodon van gE tot de Hindi site 133 bp achter het stopcodon van gE. Dit fragment is, gebruikmakend van de restrictie-enzym sites in de polylinker van de vector, met de enzymen BamHI en SphI uit p318 gedigereerd. Allereerst is p318 met SphI gedigereerd en vervolgens is de SphI site ingevuld met behulp van Klenow polymerase en dNTP * s. Na de digestie met BamHI is de 1,9 kb insert van de pUC18 vector gescheiden in Low Melting Point Agarose en geligeerd in de pEVHis vector die hiertoe met BamHI en EcoRV gedigereerd was. Het zo gevormde plasmide is pEVHis/gE genoemd.

figuur 10

Positie van de gE-specifieke primers en probe voor de PCR procedure om BHV-1 DNA te detecteren. In de figuur is de nuclexnezuursequentie weergegeven van het BHV-1 glyco-proteïne gE gen van nucleotide 1272 tot 2027 [de sequentie is overgenomen uit figuur 3]. De voor de gE-specifieke PCR procedure gebruikte primers zijn P3 en P4 genoemd. De primer binding plaatsen voor P3 en P4 zijn onderlijnd.

De nucleotidensequentie van P3 is 5'-ACG-TGG-TGG-TGC-CAG-TTA-GC-3' (SEQ ID NO:2). De nucleotidensequentie van P4 is (complementair aan de hier boven gegeven primer binding sequentie) 5'-ACC-AAA-CTT-TGA-ACC-CAG-AGC-G-3· (SEQ ID NO:3). De probe die voor de Southern blot hybridisatie voor de detectie van het PCR geamplificeerde DNA gebruikt is, is het tussen de primerbindingsplaatsen gelegen 137 bp Taql fragment waarvan de uiteinden zijn aangegeven. Ter vergelijking met figuur 3 zijn ook de HindlII en de EcoNI site aangegeven.

SEQUENCE LISTING SEQ ID NO :1 LENGTH: 2027 nucleotides, 575 amino acids TYPE: nucleotide and amino acid STRANDEDNESS: single CAGGAGCTCG TGGAGGCGGA CCGTTGAGCG GCCCGACCGC CGCCGGGTTG TTAAATGGGT 60 CTCGCGCGGC TCGTGGTTCC AGCGCGACGT TCGCTGCGTG TGTCCCGCGA GCTGCGTTCC 120

AsuII

GGGGAACGGC GCACGCGAGA GGGTTCGAAA AGGGCATTTG GCAATGC 167 ATG CAA CCC ACC GCG CCG CCC CGG CGG CGG TTG CTG CCG CTG CTG CTG 215

Met Gin Pro Thr Ala Pro Pro Arg Arg Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu 15 10 15 ============================ SIGNAAL PEPTIDE ================ CCG CAG TTA TTG CTT TTC GGG CTG ATG GCC GAG GCC AAG CCC GCG ACC 263

Pro Gin Leu Leu Leu Phe Gly Leu Met Ala Glu Ala Lys Pro Ala Thr 20 25 30

Smal GAA ACC CCG GGC TCG GCT TCG GTC GAC ACG GTC TTC ACG GCG CGC GCT 311

Glu Thr Pro Gly Ser Ala Ser Val Asp Thr Val Phe Thr Ala Arg Ala 35 40 45 GGC GCG CCC GTC TTT CTC CCA GGG CCC GCG GCG CGC CCG GAC GTG CGC 359

Gly Ala Pro Val Phe Leu Pro Gly Pro Ala Ala Arg Pro Asp Val Arg 50 55 60 GCC GTT CGC GGC TGG AGC GTC CTC GCG GGC GCC TGC TCG CCG CCC GTG 407

Ala Val Arg Gly Tip Ser Val Leu Ala Gly Ala Cys Ser Pro Pro Val 65 70 75 80 CCG GAG CCC GTC TGC CTC GAC GAC CGC GAG TGC TTC ACC GAC GTG GCC 455

Pro Glu Pro Val Cys Leu Asp Asp Arg Glu Cys Phe Thr Asp Val Ala 85 90 95 CTG GAC GCG GCC TGC CTG CGA ACC GCC CGC GTG GCC CCG CTG GCC ATC 503

Leu Asp Ala Ala Cys Leu Arg Thr Ala Arg Val Ala Pro Leu Ala lie 100 105 110 GCG GAG CTC GCC GAG CGG CCC GAC TCA ACG GGC GAC AAA GAG TTT GTT 551

Ala Glu Leu Ala Glu Arg Pro Asp Ser Thr Gly Asp Lys Glu Phe Val 115 120 125

PvuII * CTC GCC GAC CCG CAC GTC TCG GCG CAG CTG GGT CGC AAC GCG ACC GGG 599

Leu Ala Asp Pro His Val Ser Ala Gin Leu Gly Arg Asn Ala Thr Gly 130 135 140 GTG CTG ATC GCG GCC GCA GCC GAG GAG GAC GGC GGC GTG TAC TTC CTG 647

Val Leu lie Ala Ala Ala Ala Glu Glu Asp Gly Gly Val Tyr Phe Leu 145 150 155 160 TAC GAC CGG CTC ATC GGC GAC GCC GGC GAC GAG GAG ACG CAG TTG GCG 695

Tyr Asp Arg Leu Ile Gly Asp Ala Gly Asp Glu Glu Thr Gin Leu Ala 165 170 175 CTG ACG CTG CAG GTC GCG ACG GCC GGC GCG CAG GGC GCC GCG CGG GAC 743

Leu Thr Leu Gin Val Ala Thr Ala Gly Ala Gin Gly Ala Ala Arg Asp 180 , 185 190 GAG GAG AGG GAA CCA GCG ACC GGG CCC ACC CCC GGC CCG CCG CCC CAC 791

Glu Glu Arg Glu Pro Ala Thr Gly Pro Thr Pro Gly Pro Pro Pro His 195 200 205 CGC ACG ACG ACA CGC GCG CCC CCG CGG CGG CAC GGC GCG CGC TTC CGC 839

Arg Thr Thr Thr Arg Ala Pro Pro Arg Arg His Gly Ala Arg Phe Arg 210 215 220

Smal GTG CTG CCG TAC CAC TCC CAC GTA TAC ACC CCG GGC GAT TCC TTT CTG 887

Val Leu Pro Tyr His Ser His Val Tyr Thr Pro Gly Asp Ser Phe Leu 225 230 235 240 CTA TCG GTG CGT CTG CAG TCT GAG TTT TTC GAC GAG GCT CCC TTC TCG 935

Leu Ser Val Arg Leu Gin Ser Glu Phe Phe Asp Glu Ala Pro Phe Ser 245 250 255 GCC AGC ATC GAC TGG TAC TTC CTG CGG ACG GCC GGC GAC TGC GCG CTC 983

Ala Ser Ile Asp Trp Tyr Phe Leu Arg Thr Ala Gly Asp Cys Ala Leu 260 265 270 ATC CGC ATA TAC GAG ACG TGC ATC TTC CAC CCC GAG GCA CCG GCC TGC 1031 lie Arg lie Tyr Glu Thr Cys lie Phe His Pro Glu Ala Pro Ala Cys 275 280 285 CTG CAC CCC GCC GAC GCG CAG TGC AGC TTC GCG TCG CCG TAC CGC TCC 1079

Leu His Pro Ala Asp Ala Gin Cys Ser Phe Ala Ser Pro Tyr Arg Ser 290 295 300 GAG ACC GTG TAC AGC CGG CTG TAC GAG CAG TGC CGC CCG GAC CCT GCC 1127

Glu Thr Val Tyr Ser Arg Leu Tyr Glu Gin Cys Arg Pro Asp Pro Ala 305 310 315 320 GGT CGC TGG CCG CAC GAG TGC GAG GGC GCC GCG TAC GCG GCG CCC GTT 1175

Gly Arg Trp Pro His Glu Cys Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Pro Val 325 330 335 GCG CAC CTG CGT CCC GCC AAT AAC AGC GTA GAC CTG GTC TTT GAC GAC 1223

Ala His Leu Arg Pro Ala Asn Asn Ser Val Asp Leu Val Phe Asp Asp 340 345 350 GCG CCG GCT GCG GCC TCC GGG CTT TAC GTC TTT GTG CTG CAG TAC AAC 1271

Ala Pro Ala Ala Ala Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Leu Gin Tyr Asn 355 360 365

HindiII

GGC CAC GTG GAA GCT TGG GAC TAC AGC CTA GTC GTT ACT TCG GAC CGT 1319

Gly His Val Glu Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Val Val Thr Ser Asp Arg 370 375 380 TTG GTG CGC GCG GTC ACC GAC CAC ACG CGC CCC GAG GCC GCA GCC GCC 1367

Leu Val Arg Ala Val Thr Asp His Thr Arg Pro Glu Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 GAC GCT CCC GAG CCA GGC CCA CCG CTC ACC AGC GAG CCG GCG GGC GCG 1415

Asp Ala Pro Glu Pro Gly Pro Pro Leu Thr Ser Glu Pro Ala Gly Ala 405 410 415 CCC ACC GGG CCC GCG CCC TGG CTT GTG GTG CTG GTG GGC GCG CTT GGA 1463

Pro Thr Gly Pro Ala Pro Trp Leu Val Val Leu Val Gly Ala Leu Gly 420 425 430 =================== TRANSMEMBRAAN HELIX ====== CTC GCG GGA CTG GTG GGC ATC GCA GCC CTC GCC GTT CGG GTG TGC GCG 1511

Leu Ala Gly Leu Val Gly lie Ala Ala Leu Ala Val Arg Val Cys Ala 435 440 445 CGC CGC GCA AGC CAG AAG CGC ACC TAC GAC ATC CTC AAC CCC TTC GGG 1559

Arg Arg Ala Ser Gin Lys Arg Thr Tyr Asp lie Leu Asn Pro Phe Gly 450 455 460 CCC GTA TAC ACC AGC TTG CCG ACC AAC GAG CCG CTC GAC GTG GTG GTG 1607

Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro Thr Asn Glu Pro Leu Asp Val Val Val 465 470 475 480 CCA GTT AGC GAC GAC GAA TTT TCC CTC GAC GAA GAC TCT TTT GCG GAT 1655

Pro Val Ser Asp Asp Glu Phe Ser Leu Asp Glu Asp Ser Phe Ala Asp 485 490 495 GAC GAC AGC GAC GAT GAC GGG CCC GCT AGC AAC CCC CCT GCG GAT GCC 1703

Asp Asp Ser Asp Asp Asp Gly Pro Ala Ser Asn Pro Pro Ala Asp Ala 500 505 510 TAC GAC CTC GCC GGC GCC CCA GAG CCA ACT AGC GGG TTT GCG CGA GCC 1751

Tyr Asp Leu Ala Gly Ala Pro Glu Pro Thr Ser Gly Phe Ala Arg Ala 515 520 525 CCC GCC AAC GGC ACG CGC TCG AGT CGC TCT GGG TTC AAA GTT TGG TTT 1799

Pro Ala Asn Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ser Gly Phe Lys Val Trp Phe 530 535 540 AGG GAC CCG CTT GAA GAC GAT GCC GCG CCA GCG CGG ACC CCG GCC GCA 1847

Arg Asp Pro Leu Glu Asp Asp Ala Ala Pro Ala Arg Thr Pro Ala Ala 545 550 555 560 *

EcoNI

CCA GAT TAC ACC GTG GTA GCA GCG CGA CTC AAG TCC ATC CTC CGC TAG 1895

Pro Asp Tyr Thr Val Val Ala Ala Arg Leu Lys Ser Ile Leu Arg * 565 570 575 fiCGCCCCCCC CCCCCCGCGC GCTGTGCCGT CTGACGGAAA GCACCCGCGT GTAGGGCTGC 1955 ATATAAATGG AGCGCTCACA CAAAGCCTCG TGCGGCTGCT TCGAAGGCAT GGAGAGTCCA 2015 CGCAGCGTCG TC 2027 SEQ ID NO:2 LENGTH: 20 nucleotides TYPE: nucleotide STRANDEDNESS: single ACGTGGTGGT GCCAGTTAGC 20 SEQ ID NO:3 LENGTH: 22 nucleotides TYPE: nucleotide STRANDEDNESS: single ACCAAACTTT GAACCCAGAG CG 22

Claims (23)

1. Deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft.

2. Deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een door een attenuatie procedure veroorzaakte deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft.

3. Deletiemutant Difivac-1 van bovine herpesvirus type 1 welke een door een attenuatie procedure veroorzaakte deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft.

4. Deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een door recombinant DNA technieken geconstrueerde deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft.

5. Deletiemutant 1B7 of 1B8 van bovine herpesvirus type 1 welke een door recombinant DNA technieken geconstrueerde deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft.

6. Deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen en een deletie in het thymidine kinase gen heeft.

7. Mutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft en een door recombinant DNA technieken ingebracht heteroloog gen bevat.

8. Mutant van bovine herpesvirus type 1 welke op de plaats van het glycoproteïne gE-gen een door recombinant DNA technieken ingebracht heteroloog gen bevat, dat onder controle van regulatoire sequenties van het gE-gen staat en eventueel aangesloten is op het gedeelte van het gE-gen dat voor een signaalpeptide codeert.

9. Mutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft en een door recombinant DNA technieken ingebracht heteroloog gen coderend voor een immunogeen eiwit of peptide van een ander pathogeen bevat.

10. Samenstelling, omvattende een recombinant nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE-gen, of een van dit glycoproteïne gE-gen afgeleide nucleotidensequentie omvat.

11. Samenstelling, omvattende een klonerings- of expressievector met erin een insertie van een recombinant nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE-gen, of een van dit glycoproteïne gE-gen afgeleide nucleotiden-sequentie omvat.

12. Samenstelling, omvattende glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide.

13. Samenstelling, omvattende een antilichaam dat specifiek is voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide.

14. Samenstelling, omvattende een monoclonaal antilichaam dat specifiek is voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide.

15. Samenstelling, omvattende een polyclonaal antilichaam dat specifiek is voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide.

16. Vaccinpreparaat voor een vaccinatie van dieren, in het bijzonder zoogdieren, meer in het bijzonder runderen, om ze te beschermen tegen bovine herpesvirus type 1, omvattende een deletiemutant van bovine herpesvirus type 1 volgens een van de conclusies 1-6, en een geschikte drager of adjuvans.

17. Vaccinpreparaat voor een vaccinatie van dieren, in het bijzonder zoogdieren, meer in het bijzonder runderen, om ze te beschermen tegen een pathogeen, omvattende een mutant van bovine herpesvirus type 1 welke een deletie in het glycoproteïne gE-gen heeft en een door recombinant DNA technieken ingebracht heteroloog gen coderend voor een immunogeen eiwit of peptide van het pathogeen bevat, en een geschikte drager of adjuvans.

18. Diagnostische kit voor het detecteren van nucleinezuur van bovine herpesvirus type 1 in een monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, afkomstig van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, omvattende een nucleinezuur probe of primer met een nucleotidensequentie afgeleid van het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1, en een voor een nucleinezuur detectie assay geschikt detectie-middel.

19. Diagnostische kit voor het detecteren van antilichamen, die specifiek zijn voor bovine herpesvirus type 1, in een monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, speeksel, sputum, lichaamsvocht zoals traanvocht, longspoelsel, neusspoelsel, melk, of weefsel, afkomstig van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, omvattende glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, een deel van dit glycoproteïne gE, of een van dit glycoproteïne gE afgeleid peptide, en een voor een antilichamen detectie assay geschikt detectiemiddel.

20. Diagnostische kit volgens conclusie 19, welke tevens een of meer antilichamen bevat die specifiek zijn voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1.

21. Diagnostische kit voor het detecteren van proteïne van bovine herpesvirus type 1 in een monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, afkomstig van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, omvattende een antilichaam dat specifiek is voor glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, en een voor een proteïne detectie assay geschikt detectiemiddel.

22. Werkwijze voor het vaststellen van besmetting van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, met bovine herpesvirus type 1, omvattende het onderzoeken van een van het dier afkomstig monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum, lichaamsvocht zoals traanvocht, longspoelsel, neusspoelsel, melk, of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, op de aanwezigheid van nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1 omvat, dan wel de aanwezigheid van het glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, dan wel de aanwezigheid van antilichamen die specifiek zijn voor het glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1.

23. Werkwijze voor het vaststellen van besmetting van een dier, in het bijzonder zoogdier, meer in het bijzonder rund, met bovine herpesvirus type 1, omvattende het onderzoeken van een van het dier afkomstig monster, in het bijzonder een biologisch monster zoals bloed of bloedserum, bloedcellen, sperma, in het bijzonder spermavloeistof, speeksel, sputum, lichaamsvocht zoals traanvocht, long-spoelsel, neusspoelsel, melk, of weefsel, in het bijzonder zenuwweefsel, op de aanwezigheid van nucleinezuur dat het glycoproteïne gE-gen van bovine herpesvirus type 1 omvat, dan wel de aanwezigheid van het glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, dan wel de aanwezigheid van antilichamen die specifiek zijn voor het glycoproteïne gE van bovine herpesvirus type 1, waarbij het te onderzoeken monster afkomstig is van een dier dat gevaccineerd is met een vaccinpreparaat volgens conclusie 16.