NL8700089A - Therapeutische toepassing van dideoxythymidine en dideoxythymidineen. - Google Patents

Description

4

Br/ar/18-Rega

Therapeutische toepassing van dideoxythymidine en dideoxy- * thymidineen.

De uitvinding betreft een nieuw therapeutisch middel voor het behandelen van AIDS en verwante ziekten, en ook op de bereiding en toepassing daarvan.

AIDS of verworven immunodeficientiesyndroom is een 5 pandemische ziekte gekenmerkt door een grote gevoeligheid voor ongebruikelijke maligniteiten en verzwakking van het immuunsysteem, gepaard gaande met levensgevaarlijke infecties. De veroorzaker van AIDS is geïdentificeerd als een retrovirus, genaamd HTLV-III/LAV oftewel "human T-cell lym-10 photropic virus type Ill/lymphademopathy-associated virus".

In de huidige beschrijving zal dit retrovirus HIV of humaan immunodeficientievirus worden genoemd, zoals voorgesteld in Science, 232, 1486 (1986). Onlangs zijn ook enkele andere virussen beschreven, die verwant zijn aan HIV en die aan AIDS 15 verwante ziekten of ziektetoestanden veroorzaken.

Het is reeds bekend dat 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine (azidothymidine,AZT,N3ddThd) een krachtige inhibitor van de HIV-replicatie in lymfocyt-culturen is en dat het de cellen tegen het cytopathogene effect van dat virus zal 2ü beschermen bij een concentratie van 5-10 yuM (Mitsuya et al,

Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 82, 7096-7100 (1985). Verder is het bekend dat 2r,3'-dideoxyribosyl-derivaten van purinen (adenine, guanine, hypoxantine) en pyrimidinen (thymine en cytosine) de door HIV opgewekte cytopathogeniciteit in vitro 25 significant onderdrukken. Het meest krachtige derivaat van deze reeks is 21,3'-dideoxycytidine dat reeds een volledige antivirale bescherming zal leveren bij een lage concentratie van 0,5-1,0/jM (Mitsuya et al., Proc. Natl. Acad.

Sci.,U.S.A., 82, 1911-1915 (1986). Bovendien is onlangs ge-30 vonden dat een onverzadigd derivaat van 2',3'-dideoxycytidine, namelijk 21,3'-didehydro-2',3'-dideoxycytidine of 2',3'-dideoxycytidineen, evenals 2',3'-dideoxycytidine zelf een krachtige en selectieve inhibitor van HIV in vitro is (Balzarini et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., T4Q, 35 735-742, (1986)).

Ê70ÖO8 9 * - 2 -

Naast deze békende materie bestaat behoefte aan andere stoffen die als potentiële HIV-inhibitoren werken. De uitvinding heeft dan ook als primair oogmerk zulke inhibi-toren te leveren, evenals therapeutische preparaten die deze 5 inhibitoren bevatten.

In overeenstemming met de uitvinding is nu gevonden, dat 21,3'-dideoxythymidine en een onverzadigd derivaat daarvan namelijk 2',3'-dideoxythymidineen, eveneens krachtige en selectieve anti-HIV-middelen zijn. Hun selectiviteit en 10 potentie is vergelijkbaar met die van 21,3'-dideoxycytidine en daardoor kunnen zij met voordeel worden gebruikt in farmaceutische preparaten die bestemd zijn voor het behandelen van AIDS-patiënten. Een potentiëel gebruik tegen ziekten, veroorzaakt door aan HIV verwante virussen valt eveneens binnen het 15 kader van de uitvinding.

21,3'-dideoxythymidine (ddThd) en 2',3'-dideoxythymidineen (ddeThd) kunnen worden weergegeven door de volgende chemische formules I en II: 22 o o <rNr (tNk

HO —I a HO—, A

xy ddThd ddeThd

I II

Λ i - 3 -

Beide stoffen werden reeds in de jaren 1960 door Horwitz et al. gesynthetiseerd (vergl. J. Org. Chem., 32, 817-818 (1967) en Tetrahedron Letters, 1964, 2725-2727 en 1966, 1343-1346). Daarom vormen de verbindingen als zodanig 5 en hun chemische synthese geen deel van de huidige uitvinding.

In hun werking als anti-HIV middelen vertonen 2*,3'-dideoxythymidine en 2',3'-dideoxythymidineen een selectiviteit en een potentie die vergelijkbaar zijn met die van 10 2',3'-dideoxycytidine. Beide stoffen zijn echter minder krachtige HlV-inhibitoren dan azidothymidine. Bij onderlinge vergelijking blijkt 2*,3'-dideoxythymidineen een krachtiger werking en 2',3'-dideoxythymidine een meer selectieve werking te hebben. De selectieve werking van 21,3'-dideoxythymidine 15 is zelfs vrijwel gelijk aan die van azidothymidine.

Het onverzadigde derivaat, 2',3'-dideoxythymidineen is giftiger voor niet-geïnfecteerde gastheercellen dan het verzadigde derivaat 21,3'-dideoxythymidine. Niettemin bleek bij parallelle proeven dat de selectiviteitsindex van 2',3'-20 dideoxythymidineen slechts weinig minder was dan die van 2',3'-dideoxycytidine.

Opgemerkt wordt dat de anti-HIV werking van 2',3'-dideoxythymidine reeds eerder is getest zonder dat daaruit een krachtige werking bleek (vergl. Mitsuya et al., Proc.

25 Natl. Acad. Sci., ü.S.A. 83_, 1911-1915 (1986)). Volgens deze publicatie werd de cytopathogene werking van HIV in ATH8-cellen volledig door 2',3'-dideoxycytidine en 2',3'-dideoxythymidine geremd bij een concentratie van respectievelijk 0,fjuM en 20QuM. Daarentegen bleek bij proeven die tot de 30 huidige uitvinding leidden, dat dezelfde stoffen in MT-4 cellen een volledige bescherming tegen HIV leveren bij een concentratie van respectievelijk 0,2,juM en 1/iM. In tegenstelling tot de genoemde literatuur blijkt 2',3'-dideoxythymidine derhalve wel goede vooruitzichten als anti-HIV-middel te bie-35 den.

Therapeutische preparaten die 2',3'-dideoxythymidine of 2',3'-dideoxythymidineen als werkzaam bestand- ' - ' a' o v £? *

V

- 4 - deel voor het behandelen van AIDS in de humane praktijk bevatten, kunnen de vorm hebben van poeders, suspensies, oplossingen, sprays, emulsies, zalven of crèmes en kunnen worden gebruikt voor locale toediening, voor intranasale, rectale, 5 vaginale en ook voor orale of parenterale (intraveneuse, intradermale, intramusculaire, intrathecale etc.) toediening. Dergelijke preparaten kunnen worden bereid door de actieve stof van formule (I) of (II) te combineren (bijvoorbeeld door mengen, oplossen etc.) met farmaceutisch aanvaard-10 bare excipiëntia van neutrale aard (zoals waterige of niet-waterige oplosmiddelen, stabilisatoren, emulgatoren, deter-gentia, additieven), en verder desgewenst met kleur- en geur-stoffen. De concentratie van het actieve bestanddeel in het therapeutische preparaat kan sterk variëren tussen 0,1% en 15 100%, afhankelijk van de wijze van toediening. Verder kan de dosis van het toe te dienen actieve bestanddeel variëren tussen 0,1 mg en 100 mg per kg. lichaamsgewicht.

De anti-HIV-eigenschappen van 2',3'-dideoxy-thymidine en 2 1 ,3'-dideoxythymidineen worden gedocumenteerd 20 door de volgende voorbeelden die niet in beperkende zin dienen te worden gelezen. Diverse andere 21,3'-dideoxynucleosiden en hun 21,3'-onverzadigde derivaten worden daarin voor vergelijkingsdoeleinden gebruikt.

In de voorbeelden wordt herhaaldelijk verwezen naar 25 de bijgaande tekeningen, waarin: fig. 1 een grafische voorstelling is van de testresultaten over de remming van het cytopathogene effect van HIV in MT-4 cellen door diverse 2',3'-dideoxynucleosiden en hun 2',3'-onverzadigde derivaten, 30 fig. 2 een grafische voorstelling is van de test resultaten over de remming van de virusantigeen-expressie in door HIV geïnfecteerde MT-4 cellen door dezelfde reeks 2',3'-dideoxynucleosiden en hun 2',31-onverzadigde derivaten.

In de voorbeelden en de tekeningen worden de vol-35 gende afkortingen gebruikt: > " '· O fi * - ·' 'v* ï? φ £> - 5 - HIV - humaan immunodeficiëntie virus, zoals oorspronkelijk afgeleid uit een "pool" van AIDS-patienten; ddAdo - 2',3'-dideoxyadenosine; ddThd - 2',3'-dideoxythymidine; 5 ddCyd - 2',3'-dideoxycytidine; ddürd - 2 *,3'-dideoxyuridine; ddeAdo- 21,3’-dideoxyadenosineen; ddeThd- 2',3’-dideoxythymidineen; ddeCyd- 21,3'-dideoxycytidineen; 10 ddeürd- 2 *,31-dideoxyuridineen; MT-4 cellen - cellen van een humane T4~lymfocyten cellijn die HTLV-I draagt (vergl. Harada et al, Science, 229, 563-566 (1985)); HTLV-I - Type 1 van het humane T-cel lymfotroop virus; 15 rpmi-140 - een kweekmedium voor celculturen ontwikkeld in het Roswell Park Memorial Institution en geleverd door Gibco, Grand Island, N.Y., CJ.S.A.

Het bevat anorganische zouten (NaCl,NaHC03,-Na2HP04r etc.), glucose, diverse aminozuren en 20 diverse vitaminen; CCID50 ~ <3e virusdosis voldoende om 50% van de cel- cultuur te infecteren.

Wat de chemische verbindingen betreft, werden ddCyd 25 en ddürd verkregen van Pharmacia, en werden ddAdo en ddThd verkregen van Calbiochem-Behring. De onverzadigde derivaten werden gesynthetiseerd door een 2'-deoxy-31,51-epoxy-nucleo-side te laten reageren met kalium t-butanolaat in dimethyl-sulfoxide volgens de methode van Horwitz et al. (J. Org.

30 Chem., 32, 817-818 (1967)). De spectraaldata waren consistent met die welke eerder werden gepubliceerd.

Het HIV werd verkregen van het National Cancer Institute, Bethesda, Md, U.S.A., waar het werd geoogst uit de cultuurvloeistof van HIV-producerende H9 cellen, zoals be-35 schreven door Popovic et al. in Science 224, 497-500 (1984).

Dit virus werd bewaard bij -70°C, totdat het gebruikt werd.

De titer van het virus, uitgedrukt in CCID50, was vooraf bepaald.

f ‘ · Λ A

v f .. v ··.· ς. cf - 6 -

De MT-4 cellen waren verkregen bij het Institut Pasteur te Parijs, Frankrijk.

Voorbeeld 1

Remming van het cytopathogene effect van HIV.

5 Een viertal 21,3'-dideoxynucleosiden en hun 2',3'- onverzadigde derivaten werden met elkaar vergeleken aangaande hun remmende werking op het cytopathogene effect van HIV in MT-4 cellen. De methode is beschreven door Mitsuya et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7076-7100 (1985).

10 De MT-4 cellen werden ingesteld op een concentratie van 5 x 105 cellen/ml. met behulp van RPMI-1640 medium, ge-suplementeerd met 10% foetaal kalverserum en antibiotica, waarna porties van 2 ml. van de celsuspensie werden geïnfecteerd met 20tyul van de virusvloeistof (titer: 10^» 8 CCID50/ 15 ml; eindtiter: 300 CCIDso/holte). Voor de controleproeven werden MT-4 cellen quasi-geïnfecteerd met 20Qftl celkweek-medium. De cellen werden bij 37°C geïncubeerd. Na 90 minuten incubatie werd 1,8 ml kweekmedium aan elke portie van de celsuspensie toegevoegd. In de holtes van een microtiterplaat 20 van kunststof werden vooraf diverse verdunningen (telkens 100yUl) van de te beproeven verbindingen in celkweekmedium bereid. Daarna werd 100ml van de met HIV geïnfecteerde of de quasi-geïnfecteerde celsuspensie aan elke holte toegevoegd en werden de celculturen bij 37eC geïncubeerd. Na 5 dagen werd 25 de levensvatbaarheid van de cellen microscopisch vastgesteld in een hernatocytometer met behulp van de trypanblauw-exclusiemethode.

De resultaten van de proef met MT-4 cellen zijn weergegeven in fig. 1 van de tekening, waarin het aantal 30 levensvatbare cellen na 5 dagen is uitgezet tegen de concentratie van de te beproeven verbindingen. De zwarte kolommen hebben betrekking op proeven met door HIV geïnfecteerde cellen, terwijl de witte kolommen betrekking hebben op proeven met quasi-geïnfecteerde cellen.

35 Uit fig. 1 blijkt dat ddeThd het meest krachtig was bij het beschermen van de cellen tegen vernietiging door het f. ~ a η o β δ

** V W*· V

- 7 - ' virus. Bij 0r04 μΜ beschermde ddeThd de MT-4 cellen volledig, terwijl de op één na krachtigste verbinding, ddCyd een concentratie van 0,2 /iM nodig had om een volledige bescherming te geven. De stof ddeThd leverde circa 45% bescherming bij 5 0,008 yuM, bij welke concentratie ddCyd totaal geen remmende werking had.

MetddThd werd een volledige bescherming tegen de cytopathogene werking van HIV bereikt bij een concentratie van 1 /»M. De stof ddeCyd beschermde de cellen eveneens tegen 10 HIV bij een concentratie van 1 /M. De andere verbindingen waren minder krachtig in hun anti-HIV werking, aangezien ddAöo een volledige bescherming pas leverde bij 25 /iM, en ddürd een bescherming van 80% leverde bij 125 en 250terwijl cideAdo en ddeürd practisch geen beschermende werking 15 vertoonden.

Uit fig. 1 (de witte kolommen) blijkt verder dat de testverbindingen bij hogere concentratie cytotoxisch gaan werken en dat de verbindingen in dit opzicht grote verschillen vertonen. Zo remde ddeThd het aantal levensvatbare cellen 20 met 45% bij een concentratie van 1/uM, terwijl ddCyd het aantal levensvatbare cellen met 25% verminderde bij een concentratie van 5 /iM.

De waarden van ED50 (de 50%’s antiviraal werkzame dosis) en van TD50 (de 50%'s cytotoxische dosis) voor de 25 testverbindingen zijn weergegeven in Tabel 1. Tevens vindt men daarin de waarden van de selectiviteitsindex (SI), dat wil zeggen de verhouding van TD50 tot EDso* weergegeven.

Tabel 1 30

Verbinding ED50 (uM) TD50 (uM) SI

ddAdo 2,5 >250 >100 ddeAdo >125 9,5 <0,08 35 ddThd 0,20 >125 >625 ddeThd 0,010 1,2 120 ddCyd 0,046 9,1 198 ddeCyd 0,13 7,9 61 ddürd 48 >250 >5,2 ddeürd_>125_27_<0,22 > ' ί·089 \ - 8 -

Uit Tabel 1 blijkt dat ddThd de hoogste selectivi-teitsindex vertoonde. Deze verbinding was niet giftig bij concentraties van maximaal 125 uM. Daarop volgden de stoffen ddeThd, ddCyd en ddeCyd, die echter betrekkelijk giftig 5 waren, alsmede ddAdo en ddürd, waar de ED50 betrekkelijk laag was. De resterende stoffen ddeAdo en ddeürd hadden een negatieve waarde voor de selectiviteitsindex.

Voorbeeld 2 1 0 Remming van de virusantigeen-expressie.

Dezelfde verbindingen als in Voorbeeld 1 werden ook met elkaar vergeleken, wat betreft hun remmende werking op de expressie van virusantigenen in met HIV geïnfecteerde MT-4 cellen. Dit effect werd bepaald door indirecte immunofluores-15 centie en laserstroom cytofluorografie, waarbij polyklonale antilichamen van een AlDS-patiënt als sonde werden gebruikt. De resultaten zijn weergegeven in fig. 2 van de tekening, waarin het percentage fluorescente cellen (dat wil zeggen het percentage antigeen-positieve cellen) is uitgezet tegen de 20 concentratie van de testverbindingen. De gebruikte symbolen hebben de volgende betekenis: Φ ddAdo O ddeAdo ddThd tir ddeThd I ddCyd Q ddeCyd 25 A ddürd ddeürd

Het gemiddelde percentage aan fluorescente cellen in afwezigheid van enige testverbinding (positieve controle) was 60 + 5%, terwijl het gemiddelde percentage fluorescente 30 cellen in de quasi-geïnfecteerde cellen (negatieve controle) 1,0% was.

Uit fig. 2 blijkt dat de stof ddeThd een volledige remming van de virusantigeen-expressie veroorzaakte bij een concentratie van 0,04 uM. Deze concentratie was gelijk aan 35 die welke benodigd was voor volledige bescherming tegen de cytopathogene werking van HIV. Op dezelfde wijze onderdrukte ddCyd de expressie van het virusantigeen volledig bij 0,2 uM, € 7 0 0 0 8 9 - 9 - bij welke concentratie het ook een volledige bescherming tegen de cytopathogene werking van het virus leverde. Als regel bestond een duidelijke correlatie tussen de remmende werking van de verbindingen op de BIV-antigeenproduktie en de 5 remmende werking op het cytopathogene effect van HIV.

***** £ ‘ 8 9

Claims (3)

1. Therapeutisch middel ten gebruike bij de behandeling van AIDS en verwante ziektes, welk middel 2 ',3 1 — dideoxythymidine of 2',3'-dideoxythymidineen als werkzaam bestanddeel bevat.

2. Werkwijze voor het behandelen van AIDS en ver wante ziekten, gekenmerkt doordat men 2',3'-dideoxythymidine of 2',3'-dideoxythymidineen toedient aan een patiënt die aan AIDS of een verwante ziekte lijdt.

3. Toepassing van 2',3'-dideoxythymidine of 2',3'-10 dideoxythymidineen voor het bereiden van een therapeutisch middel met werking tegen AIDS en verwante ziekten. ****** «7ÖC0&9