[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

NL8401572A - ANTIBIOTICS. - Google Patents

ANTIBIOTICS. Download PDF

Info

Publication number
NL8401572A
NL8401572A NL8401572A NL8401572A NL8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
bbm
methanol
strain
silica gel
atcc
Prior art date
Application number
NL8401572A
Other languages
Dutch (nl)
Original Assignee
Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Co filed Critical Bristol Myers Co
Publication of NL8401572A publication Critical patent/NL8401572A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

t 4 %t 4%

^ VO 631U^ VO 631U

Antibiotisch anti-tumorcomplex, BBM-1675, bereiding en winning daarvanAntibiotic anti-tumor complex, BBM-1675, preparation and recovery thereof

...........;....................iJ...........; .................... iJ

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe antibiotische anti-tumor-stoffen en op de bereiding en winning daarvan.The invention relates to new antibiotic anti-tumor substances and to the preparation and recovery thereof.

De structuur van de antibiotische anti-tumorverbindingen van de onderhavige uitvinding is nog niet geïdentificeerd. Met het oog op hun unie-5 ke, fysische, chemische en biologische eigenschappen is aanvrager evenwel van mening dat de BBM-1675 antibiotica nieuwe stoffen zijn.The structure of the antibiotic anti-tumor compounds of the present invention has not yet been identified. However, in view of their unique, physical, chemical and biological properties, the applicant considers that the BBM-1675 antibiotics are new substances.

De Europese octrooipublicatie nr. 9515A1 beschrijft de fermentatie van Actinomadura pulveraceus sp. nov. nr. 60U9 (ATCC 319100) ter vorming van anti-tumor-antibiotica, aangeduid als WS 60U9-A en WS 6ok9-B.European Patent Publication No. 9515A1 describes the fermentation of Actinomadura pulveraceus sp. nov. No. 60U9 (ATCC 319100) to form anti-tumor antibiotics, designated WS 60U9-A and WS 6ok9-B.

10 De structuren van de WS 60*+9-antibiotica zijn nog niet opgehelderd, maar de karakteristieke eigenschappen van de antibiotica wijzen erop dat WS 60^9-A en WS 60^9-B wat structuur betreft verwant kunnen zijn aan de BBM-1675 antibiotica van de uitvinding. Spectrale gegevens tonen evenwel aan, dat noch WS 60*+9-A noch WS 60H9-B identiek is aan de BBM-1675-compo-15 nenten van aanvrager. Bovendien kan het in de Europese octrooipublicatie nr. 9515UA1 beschreven produktie-organisme wat de kleur van zijn lucht-myceliüm op ISP medium nrs. 2, 3 en U, zijn positieve melkpeptonisering en positieve verbruik van D-fructose, D-mannitol, trehalose en cellulose betreft, duidelijk worden onderscheiden van het in de onderhavige uitvinding 20 toegepaste Actinomadura verrucosospora.10 The structures of the WS 60 * + 9 antibiotics have not yet been elucidated, but the characteristic properties of the antibiotics indicate that WS 60 ^ 9-A and WS 60 ^ 9-B may be structurally related to the BBM- 1675 antibiotics of the invention. Spectral data, however, show that neither WS 60 * + 9-A nor WS 60H9-B is identical to applicant's BBM-1675 components. In addition, the production organism described in European Patent Publication No. 9515UA1 may indicate the color of its air mycelium on ISP medium Nos. 2, 3 and U, positive milk peptonization and positive consumption of D-fructose, D-mannitol, trehalose and cellulose are clearly distinguished from the Actinomadura verrucosospora used in the present invention.

De onderhavige uitvinding voorziet in een nieuw antibiotisch anti-tumorcomplex, hierin aangegeven als BBM-1675, dat wordt bereid door een in waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden een BBM-1675-producerende stam 25 Actinomadura verrucosospora, met de meeste voorkeur Actinomadura verrucoeospora stam H96h-92 (ATCC 3933*0 of Actinomadura verrucocospora stam A1327I (ATCC 39638) of een mutant daarvan te kweken tot door genoemd organisme in genoemd kweekmedium een aanzienlijke hoeveelheid van genoemd BBM-1675-complex is gevormd, waarbij naar keuze het complex uit het cul-30 tuurmedium wordt gewonnen. De uitvinding voorziet tevens in twee bioactie-ve hoofdcomponenten van het BBM-1675-complex, aangeduid als BBM-1675-A^ en A^ en vier ondergeschikte bioactieve componenten van genoemd complex aangeduid als BBM-I675-A2, A^, B.j en Bg. De componenten kunnen via gebruikelijke 8401572 Ί ' ί ' \ \ ]-2- chromatografische procedures worden geïsoleerd en gezuiverd. Het BBM-1675-complex en de bioactieve componenten daarvan vertonen zowel anti-micro-biële als anti-tumor-activiteit.The present invention provides a novel antibiotic anti-tumor complex, designated herein as BBM-1675, which is prepared by an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, under submerse aerobic conditions, a BBM-1675 producing strain Actinomadura verrucosospora most preferably, to cultivate Actinomadura verrucoeospora strain H96h-92 (ATCC 3933 * 0 or Actinomadura verrucocospora strain A1327I (ATCC 39638) or a mutant thereof until a significant amount of said BBM-1675 complex has been formed by said organism in said culture medium. optionally recovering the complex from the culture medium The invention also provides two bioactive major components of the BBM-1675 complex, designated BBM-1675-A and A and four minor bioactive components of said complex referred to as BBM-I675-A2, A ^, Bj and Bg. The components can be used by conventional 8401572 Ί 'ί' \ \] -2 chromatographic procedure hours are isolated and purified. The BBM-1675 complex and its bioactive components exhibit both anti-microbial and anti-tumor activity.

Beschrijving van de tekeningen 5 Fig. 1 toont het infraroodabsorptiespectrum. van gedeeltelijk gezui verd BBM-I675 A (KBr tablet), fig. 2 toont het infrarood absorptiespectrum van gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 A2 (KBr tablet), fig. 3 toont het infraroodabsorptiespectrum van BBM-1675 (KBr 10 tablet), fig. k toont het infraroodabsorptiespectrum BBM-1675 A^ (KBr tablet), fig. 5 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 A^ in CDCl^ (60 MHz), fig. 6 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gedeel-15 telijk gezuiverd BBM-1675 A^ in CDCl^ (60 MHz), fig. 7 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van BBM-1675 A3 in CDC13 (60 MHz), fig. 8 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van BBM-1675 A^ in CDC13 (60 MHz), 20 fig. 9 toont het infraroodabsorptiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A.j (KBr tablet), fig. 10 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A1 in CDCl^ (360 MHz), fig. 1 toont het magnetisch C-resonantiespectrum van gezuiverd 25 BBM-1675 A1 in CDC13 (90,3 MHz), fig. 12 toont het· infraroodabsorptiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A2 (KBr tablet), fig. 13 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A in CDC1 (360 MHz), o 13 30 fig. 1^ toont het magnetisch ^C-resonantiespectrum.van gezuiverd BBM-1675 A2 in CDC13 (90,3 MHz).Description of the drawings FIG. 1 shows the infrared absorption spectrum. of partially purified BBM-1675 A (KBr tablet), FIG. 2 shows the infrared absorption spectrum of partially purified BBM-1675 A2 (KBr tablet), FIG. 3 shows the infrared absorption spectrum of BBM-1675 (KBr 10 tablet), FIG. k shows the infrared absorption spectrum BBM-1675 A ^ (KBr tablet), Fig. 5 shows the magnetic proton core resonance spectrum of partially purified BBM-1675 A ^ in CDCl ^ (60 MHz), Fig. 6 shows the magnetic proton core resonance spectrum of partially purified BBM-1675 A ^ in CDCl ^ (60 MHz), Fig. 7 shows the magnetic proton core resonance spectrum of BBM-1675 A3 in CDC13 (60 MHz), Fig. 8 shows the magnetic proton core resonance spectrum of BBM-1675 A ^ in CDC13 (60 MHz). Fig. 9 shows the infrared absorption spectrum of purified BBM-1675 Aj (KBr tablet), Fig. 10 shows the magnetic proton core resonance spectrum of purified BBM-1675 A1 in CDCl 3 (360 MHz), Fig. 1 shows the magnetic C resonance spectrum of purified 25 BBM-1675 A1 in CDCl 3 (90.3 MH z), Fig. 12 shows the infrared absorption spectrum of purified BBM-1675 A2 (KBr tablet), Fig. 13 shows the magnetic proton core resonance spectrum of purified BBM-1675 A in CDC1 (360 MHz), Fig. 13 shows magnetic C resonance spectrum of purified BBM-1675 A2 in CDCl 3 (90.3 MHz).

De onderhavige, uitvinding heeft betrekking op een nieuwe antibiotisch anti-tumorcomplex, hierin aangeduid als BBM-1675 en op de bereiding daarvan door fermentatie van bepaalde stammen van Actinomadura verrucocospora 35 in het bij zonder de Actinomadura verrucocospora stam H96U—92 en een mutant daarvan aangeduid als de Actinomadura verrucocospora stam A1327Y. De voor- 8401572 > \ -3- noemde hoofdstam werd geïsoleerd uit een grondmonster, verzameld hij PTO Esperanza, Misiones, Argentinië. Een biologisch zuivere kweek van het organisme is gedeponeerd hij de American Type Culture Collection, Washington, D.C. en aan zijn permanente collectie van micro-organismen toegevoegd als 5 ATCC-3933^·. Aansluitend werd de mutantstam A1327Y verkregen door een gebrui kelijke nitrosoguanidine (NTG) behandeling van de stam H96U-92 en bij de American Type Culture Collection gedeponeerd als ATCC-39638,The present invention relates to a novel antibiotic anti-tumor complex, referred to herein as BBM-1675 and to its preparation by fermentation of certain strains of Actinomadura verrucocospora 35, in particular the Actinomadura verrucocospora strain H96U-92 and a mutant thereof. as the Actinomadura verrucocospora strain A1327Y. The foregoing main strain was isolated from a soil sample, he collected PTO Esperanza, Misiones, Argentina. A biologically pure culture of the organism has been deposited in the American Type Culture Collection, Washington, D.C. and added to its permanent collection of microorganisms as 5 ATCC-3933 ^. Subsequently, the mutant strain A1327Y was obtained by a conventional nitrosoguanidine (NTG) treatment of the strain H96U-92 and deposited with the American Type Culture Collection as ATCC-39638,

Zoals bij vele antibiotica-vormende cultures het geval is, leidt de fermentatie van de Actinomadura verrucocospora stam H96U-92 of A1327Y tot 10 de bereiding van een mengsel of complex van componentstoffen. Twee belangrijke bioactieve componenten, BBM-1675 A^ en Ag» en vier minder actieve componenten, BBM-1675 A^, A^, B^ en B^ zijn uit het tijdens de fermentatie-werkwijze gevormde BBM-1675-complex geïsoleerd.As is the case with many antibiotic-forming cultures, the fermentation of the Actinomadura verrucocospora strain H96U-92 or A1327Y results in the preparation of a mixture or complex of component substances. Two major bioactive components, BBM-1675 A ^ and Ag »and four less active components, BBM-1675 A ^, A ^, B ^ and B ^ have been isolated from the BBM-1675 complex formed during the fermentation process.

BBM-1675 en de componenten daarvan BBM-1675 , A^, Ag, A^, B.] en 15 vertonen een antimicrobiële activiteit ten opzichte van een breed spectrum van micro-organismen, in het bijzonder gram-positieve bacteriën. Het BBM-1675-complex en de geïsoleerde bioactieve componenten daarvan vertonen tevens faag-inducerende eigenschappen en lysogene bacteriën. Twee van de componenten, BBM-1675 A.j en A^, zijn in vivo onderzocht tegen verschillende 20 muizetumorsystemen en vertonen een remmende activiteit ten opzichte van L-1210 leukemie, P-388 leukemie, B16 melanoma en Lewis-longcarcinoom. Aangetoond is dat BBM-1675 Ag en A^ actief zijn tegen P-388 muizeleukemie. Het complex en de bioactieve componenten daarvan kunnen derhalve als antimicrobiële middelen of als anti-tumormiddelen voor het remmen van tumoren 25 bij warmbloedigen worden toegepast.BBM-1675 and its components BBM-1675, A ^, Ag, A ^, B.] and 15 exhibit antimicrobial activity against a broad spectrum of microorganisms, especially gram-positive bacteria. The BBM-1675 complex and its isolated bioactive components also exhibit phage-inducing properties and lysogenic bacteria. Two of the components, BBM-1675 A.j and A ^, have been tested in vivo against different mouse tumor systems and show inhibitory activity against L-1210 leukemia, P-388 leukemia, B16 melanoma and Lewis lung carcinoma. BBM-1675 Ag and A ^ have been shown to be active against P-388 mouse leukemia. The complex and its bioactive components can therefore be used as antimicrobial agents or as anti-tumor agents for inhibiting tumors in warm blooded animals.

De actinoceet stam nr. H96i+-92 werd uit een grondmonster geïsoleerd en via gebruikelijke procedures als biologisch zuivere culture voor typering bereid. De stam H96^-92 vormt op het luchtmycelium korte sporen-ketens, die een rechte, kronkelige of haakvorm vertonen. De sporen zijn bolvormig 30 of ovaalvormig en hebben een wratachtig oppervlak. Op de meeste media wordt slechts weinig luchtmycelium gevormd. De luchtmassakleur is wit, die later roseachtig wordt of in sommige agarmedia verder in een blauwachtige tint verandert. De kleur van substraatmycelium is neutraal of licht-rose.The actinocytic strain No. H96i + -92 was isolated from a soil sample and prepared for typing using conventional procedures as biologically pure culture. The strain H96 ^ -92 forms short spore chains on the aerial mycelium, which have a straight, tortuous or hook shape. The spores are spherical or oval-shaped and have a wart-like surface. On most media, only little air mycelium is formed. The air mass color is white, which later becomes rosy or further changes to a bluish hue in some agar media. The color of substrate mycelium is neutral or light pink.

De groeitemperatuur varieert van 15 tot k3°C. De aminozuursamenstelling van 35 de celwand en hydrolysaatsuikereomponenten van de gehele cel tonen aan, dat de stam R96U-92 tot het celwandtype III behoort. Het menachion werd ge-identificeerd als MK-9 (Hg)’MK-9 (Hg).The growing temperature varies from 15 to k3 ° C. The amino acid composition of the cell wall and whole cell hydrolyzate sugar components demonstrate that the strain R96U-92 belongs to cell wall type III. The menachion was identified as MK-9 (Hg), MK-9 (Hg).

8401572 i -1+-8401572 i -1 + -

Gebaseerd op de morfologische, kweek en fysiologische hoofdeigenschappen, tezamen met de eigenschappen van de chemische celwandsamenstel-ling kan de stam H961+-92 worden ingedeeld in het genus Actinomadura.Based on the morphological, culture and main physiological properties, together with the properties of the chemical cell wall composition, the strain H961 + -92 can be classified in the genus Actinomadura.

Hoewel de oorspronkelijke stam H961+-92 slechts een matige groei ver-5 toonde met nauwelijks luchtmycelia, werd een variant, die goede groei en verbeterde vorming van luchtmycelium vertoonde, verkregen door H961+-92 met NTG (nitrosoguanidine) te behandelen. De variant, aangeduid als stam A1327Ï} vergemakkelijkte verder taxonomisch onderzoek en werd aansluitend geïdentificeerd als Actinomadura, verrucocospora.Although the original strain H961 + -92 showed only moderate growth with hardly any aerial mycelia, a variant showing good growth and improved formation of air mycelium was obtained by treating H961 + -92 with NTG (nitrosoguanidine). The variant, designated strain A1327II}, further facilitated taxonomic research and was subsequently identified as Actinomadura, verrucocospora.

10 De media en procedures, toegepast voor het onderzoeken van de kweek- eigenschappen en koolhydraatverbruik waren die, aanbevolen door het International Streptomyces Project (inti. J. Syst. Bacteriol. j6_: 313-31+0, 1966). Tevens werden media toegepast beschreven door: S.A. Waksman (The Actinomycetesm bd 2) en G.M. Lvedemann (Inti. J. Syst. Bacteriol. 21: 15 21+0-21+7, 1971)· De aminozuursamenstelling van de celwand en de suikercom-ponenten van gehele celhydrolysaat werden geanalyseerd volgens de methoden beschreven door: Becker et al. in Appl. Microbiol. 13: 236-21+3, 1965 en door Lechevalier en Lechevalier in The Actinomycetes, Uitg. H. Prauser,The media and procedures used to examine culture properties and carbohydrate consumption were those recommended by the International Streptomyces Project (inti. J. Syst. Bacteriol. J6: 313-31 + 0, 1966). Media used were also described by: S.A. Waksman (The Actinomycetesm bd 2) and GM Lvedemann (Inti. J. Syst. Bacteriol. 21: 15 21 + 0-21 + 7, 1971) · The amino acid composition of the cell wall and the sugar components of whole cell hydrolyzate were analyzed according to the methods described by: Becker et al. in Appl. Microbiol. 13: 236-21 + 3, 1965 and by Lechevalier and Lechevalier in The Actinomycetes, Ed. H. Prauser,

Jena, Gustav Fischer Verlag, blzn. 393-1+05, 1970. Het menachinon werd ge-20 identificeerd door massaspectra-analyse volgens de procedures van Collins et al, in J. Gen. Microbiol. 100: 221-230, 19779 en de menachinonsamenstel-ling werd voorgesteld gebaseerd op het systeem beschreven door Yamada et al, in J. Gen. Appl. Microbiol. 23: 331-335} 1977·Jena, Gustav Fischer Verlag, p. 393-1 + 05, 1970. The menaquinone was identified by mass spectra analysis according to the procedures of Collins et al, in J. Gen. Microbiol. 100: 221-230, 19779 and the menaquinone composition was proposed based on the system described by Yamada et al, in J. Gen. Appl. Microbiol. 23: 331-335} 1977

Morfologie 25 Stam H961+-92 vormt zowel substraat als luchtmycelia. Het substraat- mycelium is lang, vertakt en niet in korte draden gesplitst. In het lucht-mycelium worden korte sporenketens monopodiaal of aan de top van de schim-meldraad gevormd. Nabij de schimmeldraad top worden tevens kransachtige vertakkingen van sporenrrketens waargenomen. Deze sporen-ketens bevatten 2-10 30 sporen per keten en hebben een rechte, kronkelige of haakvorm. De sporen hebben een wratachtig oppervlak en een ronde tot elliptische (0,5-0,6 x 0,6-1,!+ yum)-vorm met afgeronde of puntige uiteinden. Na het rijpen wordt elke spoor dikwijls met een ledige schede geïsoleerd. Bij geen van de onderzochte media werden mobiele sporen, sporanchiën of sclerotische granulaten 35 waargenomen.Morphology 25 Strain H961 + -92 forms both substrate and aerial mycelia. The substrate mycelium is long, branched and not split into short strands. In the air mycelium, short spore chains are formed monopodially or at the top of the shadow reporter wire. Wreath-like branches of spore chains are also observed near the fungal filament. These spore chains contain 2-10 30 spores per chain and have a straight, serpentine or hook shape. The spores have a wart-like surface and a round to elliptical (0.5-0.6 x 0.6-1,! + Yum) shape with rounded or pointed tips. After ripening, each track is often insulated with an empty sheath. No mobile spores, sporanches or sclerotic granules were observed in any of the media examined.

8401572 -5- »8401572 -5- »

Kweek- en fysiologische eigenschappenBreeding and physiological properties

In zowel chemisch gedefinieerde media als natuurlijke organische media is de groei van de stam H96U-92 gering. De vorming van luchtmycelium is in het algemeen gering maar matig in havermoutagar (ISP nr. 3 medium), 5 anorganische zouten - zetmeelagar (ISP nr. ^ medium) en Bennet's agar. Spontane varianten zonder luchtmycelium komen veelvuldig voor. De kleur van luchtmycelium is wit, die later licht-rose wordt in havermout-agar, anorganische zouten-zetmeelagar en glycerol-asparagine-agar (ISP nr. 5 medium) . De kleur van de luchtmassa verandert verder na lang incuberen (5 10 maanden) in havermout-agar, glycerol-asparagine-agar en tyrosine-agar in een blauwachtige tint. De kleur van substraatmycelium is neutraal tot geelachtig in Czapek's-agar, tyrosine-agar, gistextract-moutèxtract-agar (ISP nr. 2 medium), pepton-gistextract-ijzeragar (ISP nr. 6 medium) en Bennet's-agar en roseachtig in glucose-asparagine-agar en glycerol-asparagine-agar.In both chemically defined media and natural organic media, the growth of the strain H96U-92 is low. Air mycelium formation is generally low but moderate in oatmeal agar (ISP No. 3 medium), inorganic salts - starch agar (ISP No. 3 medium) and Bennet's agar. Spontaneous variants without air mycelium are common. The color of air mycelium is white, which later turns pale pink in oatmeal agar, inorganic salt starch agar, and glycerol asparagine agar (ISP No. 5 medium). The color of the air mass further changes after long incubation (5-10 months) in oatmeal agar, glycerol asparagine agar and tyrosine agar to a bluish hue. The substrate mycelium color is neutral to yellowish in Czapek's agar, tyrosine agar, yeast extract malt extract agar (ISP No. 2 medium), peptone yeast extract iron agar (ISP No. 6 medium), and Bennet's agar and rosy in glucose asparagine agar and glycerol asparagine agar.

15 Er worden geen melanoide en andere diffundeerbare pigmenten gevormd.No melanoid and other diffusible pigments are formed.

Een variant nr. A1327Y, die werd verkregen uit de oorspronkelijke stam, vormt overwegend lichtblauw luchtmycelium en draagt een overvloed van luchtsporenmassa.A variant No. A1327Y, which was obtained from the original strain, predominantly forms light blue air mycelium and carries an abundance of airborne mass.

De stam H964-92 groeit bij 15°C, 28°C, 37°C en U3°C, maar niet bij 20 10°C of bij Vf0C. Hij is gevoelig voor NaCl bij 7% en resistent ten opzichte van lysozym bij 0,01$.The strain H964-92 grows at 15 ° C, 28 ° C, 37 ° C and U3 ° C, but not at 10 ° C or at Vf0C. It is sensitive to NaCl at 7% and resistant to lysozyme at $ 0.01.

De kweek en fysiologische eigenschappen van de producerende stam worden resp. in tabellen A en B getoond. Het verbruik van koolbronnen wordt aangegeven in tabel C.The culture and physiological properties of the producing strain are resp. shown in Tables A and B. The consumption of coal resources is shown in Table C.

84015728401572

Aa

-6--6-

TABEL ATABLE A

Kweekeigenschappen van stam H96U-92 (oorspronkelijke stam ATCC-3933^· en variant A1327Y)Growing properties of strain H96U-92 (original strain ATCC-3933 ^ and variant A1327Y)

Stam nr. E96U-92Strain No. E96U-92

Oorspronkelijke Variant Actinomadura stam (ATCC 3933^) nr. 132TY verrucocospora _ _ KCC A-0lVr .Original Variant Actinomadura strain (ATCC 3933 ^) No. 132TY verrucocospora _ _ KCC A-0lVr.

Trypton-gist- G: overvloedig, matig, floc- matig, floccose, extractagar floccose, gesedi- cose, gese- gesedimenteerd (ISP No. 1) menteerd en niet- dimenteerd en niet-gepig- gepigmenteerd en niet-ge- menteerd pigmenteerdTrypton yeast- G: abundant, moderate, flocculent, floccose, extract agar floccose, sedicose, sedimented (ISP No. 1) mented and non-dimented and non-pigmented and unmentioned pigmented

Saccarose-nitraat- G: matig gering gering agar (Czapek's R: neutraal neutraal- neutraal agar) A: gering; licht- geen of wei- geen of weinig; grijs (26U), tot nig; rose- lichtblauw lichtrose (7) achtig-wit (185) (9) geen D: geen geen geenSaccarose nitrate- G: moderately low low agar (Czapek's R: neutral neutral-neutral agar) A: low; light- little or little or little; gray (26U), up to nig; rose-light blue light pink (7) ish-white (185) (9) none D: none none none

Glucose-asparagine- G: matig gering gering agar R: wit (263) tot diep kleurloos kleurloos geel-rose (27) A: geen of zeer wei- geen of zeer geen of zeer nig; licht- weinig; weinig; rose (7) wit wit D: geen geen geenGlucose asparagine- G: moderately low, low agar R: white (263) to deep colorless, colorless yellow-pink (27) A: none or very little or very little or very nig; light-little; little; rose (7) white white D: none none none

Glycerol-aspara- G: weinig tot matig matig licht licht geelachtig gine-agar R: neutraal tot licht geelachtig rose (28) tot (ISP- Nr. 5) geelachtig rose rose (28) diep geelachtig (28) rose (27) A: gering; licht matig; wit gematigd; wit geelachtig rose tot licht- tot fel-rose (28), na 5 maanden rose (U) (2) li cht-blauwacht i g grijs (190) D: geen geen geenGlycerol Aspara- G: Little to moderate moderate light slightly yellowish gine agar R: neutral to slightly yellowish rose (28) to (ISP No. 5) yellowish rose rose (28) deep yellowish (28) rose (27) A : slight; slightly moderate; white temperate; white yellowish pink to light to bright pink (28), after 5 months rose (U) (2) light blueish gray (190) D: none none none

Anorganische zouten- G: overvloedig matig matig zetmeelagar R: geelachtig wit licht geel- licht geelachtig (ISP nr. U) (92) achtig rose rose (28) A: overvloedig; licht-(28) overvloedig; rose (1*) tot rose- matig; licht lichtblauw achtig grijs (10) blauwachtig (185) grijs (190) D: geen geen geenInorganic salts- G: abundant moderate moderate starch agar R: yellowish white light yellowish yellowish (ISP No. U) (92) like rose rose (28) A: abundant; light (28) abundant; rose (1 *) to rosy; light light blue-like gray (10) bluish (185) gray (190) D: none none none

Tyrosine-agar G: matig matig matig (ISP Nr. 7) R: geelachtig wit fel geel- fel geelachtig (92) achtig rose rose (26) (26) 8401572 -7- TABEL A (vervolg) A: gering; licht- matig; wit matig; wit tot geelachti rose tot licht- licht-rose ' (28), veel later rose (U) {k) (5 maanden) gedeeltelijk licht blauwachtig grijs (190) D: geen geen geenTyrosine Agar G: Moderate Moderate Moderate (ISP No. 7) R: Yellowish White Bright Yellow-Bright Yellowish (92) Like Rose Rose (26) (26) 8401572 -7- TABLE A (continued) A: Low; slightly; white moderate; white to yellowish pink to light-light pink '(28), much later rose (U) {k) (5 months) partly light bluish gray (190) D: none none none

Voedingsagar G: gering tot matig gering gering R: lichtgeel (89) kleurloos kleurloos tot tot licht- lichtrose (7) rose (7) A: geen geen geen D: geen geen geenFood agar G: low to moderate low low R: pale yellow (89) colorless colorless to up to pale light pink (7) pink (7) A: none none none D: none none none

Gistextract-mout- G: overvloedig overvloedig overvloedig extract-agar R: lichtgeel (89) fel geel- fel geelachtig (ISP nr. 2) achtig rose (26) rose (26) A: gering; wit (263) - gering; wit gering; wit tot licht- tot lichtrose (7) rose (7) D: geen geen geenYeast extract malt G: abundant abundant abundant extract agar R: pale yellow (89) bright yellow-bright yellowish (ISP No. 2) like rose (26) rose (26) A: slight; white (263) - small; white small; white to light to light pink (7) pink (7) D: none none none

Havermeelagar G: matig gering gering (ISP nr. 3) R: kleurloos tot licht geel- licht geelach- lichtrose (7) achtig tig rose (31) rose (31) A: gering; rose- zeer weinig; _ zeer weinig; achtig-wit (9) helder licht- helder licht- tot lichtblauw- blauw (18U) blauw (18U) achtig grijs (190) D: geen geen geenOatmeal agar G: Moderately low Slight (ISP No. 3) R: Colorless to light yellow-light yellow-light pink (7) like tig rose (31) rose (31) A: low; rose- very little; _ very few; like-white (9) clear light-bright light-to light blue-blue (18U) blue (18U) like gray (190) D: none none none

Bennet's agar G: overvloedig overvloedig overvloedig R: grijsachtig fel geel- fel geelachtig geel (90) achtig ro- rose (26) se (26) A: matig; wit (2β3) matig; licht geen tot geelachtig geelachtig wit (92) rose (31) en blauwachtig wit (189) D: geen geen geenBennet's agar G: abundant abundant abundant R: greyish bright yellow-bright yellowish yellow (90) ish pink (26) se (26) A: moderate; white (2β3) moderate; light none to yellowish yellowish white (92) rose (31) and bluish white (189) D: none none none

Peptongistextract- G: matig overvloedig overvloedig ijzeragar (ISP nr.6) , . , . , _ R: neutraal neutraal neutraal A: geen geen geen D: geen geen geen 55 waargenomen na incubatie bij 37°C gedurende 3 weken 5=3 afkorting: G = groei 8401572 -8- R = kleurachterkant; A = luchtmycelium D = diffundeerbaar pigment sss kleur en getal tussen haakjes volgens de kleur standaard in "Kelly, K.L. & B.D. Judd; ISCC-NBS kleurnaamkaarten geïllustreerd met Centroid Colors. U.S. Dept. of Cornm. Cir. 553, Washington, D.C.,Peptongist extract- G: moderately abundant abundant iron agar (ISP No. 6),. ,. , _ R: neutral neutral neutral A: none none none D: none none none 55 observed after incubation at 37 ° C for 3 weeks 5 = 3 abbreviation: G = growth 8401572 -8- R = color back; A = aerial mycelium D = diffusible pigment sss color and number in brackets according to the color standard in "Kelly, K.L. & B.D. Judd; ISCC-NBS color nameplates illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept. or Cornm. Cir. 553, Washington, D.C.,

Nov., 1975hNov., 1975h

TABEL BTABLE B

Fysiologische eigenschappen van stam Η96ί-92Physiological properties of strain Η96ί-92

Proef_ Respons_ _Methode en mediumSample_ Response_ _ Method and medium

Temperatuur voor groei Maximale groei bij Bennet's agar 28-37°C.Temperature for growth Maximum growth with Bennet's agar 28-37 ° C.

Middelmatig bij 20 en U30C. Geen groei bij 10°C en U7°C.Medium at 20 and U30C. No growth at 10 ° C and U7 ° C.

Vloeibaarmaking gelatine Vloeibaar gemaakt Glucose-pepton-gelatine- mediumGelatin liquefaction Liquefied Glucose-peptone gelatin medium

Zetmeelhydrolyse Gehydrolyseerd ZetmeelagarplaatjesStarch hydrolysis Hydrolysed Starch agar plates

Reacties in tapte melk Niet-gecoaguleerd Difco-tapte melk en volledig gepep-toniseerdReactions in skimmed milk Non-coagulated Difco-skimmed milk and fully peponized

Vorming van melanoide Niet geproduceerd Tyrosine-agar, pepton- pigment gist-ijzeragar en trypton- gistextractvloeistofMelanoid Formation Not Produced Tyrosine Agar, Peptone Pigment Yeast Iron Agar and Tryptone Yeast Extract Liquid

Nitraatreductie Niet gereduceerd Czapek’s-glucose-nitraat- sap en glucose-gist-extract-nitraatsapNitrate reduction Not reduced Czapek's Glucose Nitrate Juice and Glucose Yeast Extract Nitrate Juice

Resistent tegen NaCl Groei bij 5% of Trypton-gistextractagar minder. Geen groei bij 1%Resistant to NaCl Growth at 5% or Trypton yeast extract agar less. No growth at 1%

Lysozym Resistent. Groei bij Trypton-gistextractagar 0,01$ of minder.Lysozyme Resistant. For Trypton yeast extract agar, grow 0.01 $ or less.

Geen groei bij 0,1$ pH Groei in 5,0 tot 9,5· Trypton-gistextractagarNo growth at 0.1 $ pH. Growth in 5.0 to 9.5 · Trypton yeast extract agar

Geen groei bij ^,5 en 10,0 8401572 > -9-No growth at ^, 5 and 10.0 8401572> -9-

TABEL CTABLE C

Verbruik van koolstofbronnen_ _ Stam nr. H964-92 ActinomaduraCarbon Sources Consumption _ Strain No. H964-92 Actinomadura

Originele Variant ver rucosospora stam No. A1327Y KCC A-0147Original Variant ver rucosospora strain No. A1327Y KCC A-0147

Glycerol + + + D(-)-Arabinose - L(+)-Arabinose + + + D-Xylose + + + D-Ribose + “ “ L-Rhamnose + « + + D-Glucose + + + D-Galactose - D-Fructose + + + D-Mannose - L (-)-Sorbose -Glycerol + + + D (-) - Arabinose - L (+) - Arabinose + + + D-Xylose + + + D-Ribose + ““ L-Rhamnose + «+ + D-Glucose + + + D-Galactose - D -Fructose + + + D-Mannose - L (-) - Sorbose -

Saccharose + + +Saccharose + + +

Lactose -Lactose -

Cellobiose + + +Cellobiose + + +

MelibioseMelibiosis

Trehalose · + + *Trehalose + + *

Raffinose - D(+)-Melezitose -Raffinose - D (+) - Melezitose -

Oplosbaar zetmeel + + +Soluble starch + + +

Cellulose + + +Cellulose + + +

Dulcitol -Dulcitol -

Inositol + D-Manhitol + + + D-Sorbitol ' Salie in eInositol + D-Manhitol + + + D-Sorbitol 'Sage in e

Waargenomen gedurende 3 weken incubatie bij 28°C Basaal medium: Pridham-Gottlieb anorganisch medium 8401572 ; -10-Observed for 3 weeks incubation at 28 ° C Basal medium: Pridham-Gottlieb inorganic medium 8401572; -10-

Celwandsamenstelling en suikercomponenten van de gehele celCell wall composition and whole cell sugar components

Gezuiverde celwand van de stam H96U-92 bevat mesodiaininopimeline-zuur maar geen glycine. Het gehele celhydrolysaat vertoont de aanwezigheid van madurose (3-o-methyl-D-galactose), glucose, en ribose. Het celwand-5 aminozuur en de gehele celsuikercomponenten geven aan, dat de stam H96l·-92 zich in het celwandtype III bevindt. Twee hoofdcomponenten van menachinonPurified cell wall of strain H96U-92 contains mesodiaininopimelin acid but no glycine. The whole cell hydrolyzate shows the presence of madurose (3-o-methyl-D-galactose), glucose, and ribose. The cell wall-5 amino acid and the whole cell sugar components indicate that the H961 -92 strain is in cell wall type III. Two main components of mena quinone

BB

werden geïdentificeerd als MK-9 (Hg) en MK-9 (Hg).were identified as MK-9 (Hg) and MK-9 (Hg).

Taxonomische positie van stam H96*4~92Taxonomic position of strain H96 * 4 ~ 92

Stam H9ÖU-92 heeft de volgende hoofdeigenschappen: 10 (1) luchtsporehketens: kort, recht, kronkelig of haakvormig, (2) sporen: wratachtig oppervlak, (3) luchtmycelium: roseachtige of blauwachtige kleur, (!+) substraat mycelium: roseachtig in sommige media, (5) diffundeerbaar pigment: geen, 15 (6) mesofiel, (7) celwandtype III^, (8) menachinonsysteem: MK-9(Hg) en MK-9(Hg).Strain H9ÖU-92 has the following main properties: 10 (1) air spore chains: short, straight, serpentine or hook-shaped, (2) spores: warty surface, (3) air mycelium: rosy or bluish color, (! +) Substrate mycelium: rosy in some media, (5) diffusible pigment: none, 15 (6) mesophilic, (7) cell wall type III ^, (8) menaquinone system: MK-9 (Hg) and MK-9 (Hg).

Deze hoofdeigenschappen geven aan, dat stam B.9Sk-92 zich in het ge-nus Actinoma-dura bevindt. De vroegere soorten van het genus Actinomadura 20 werden uit zoogdieren geïsoleerd. Sommige stammen werden tevens uit planten-materialen verkregen. Vele van de recent voorgestelde nieuwe soorten werden evenwel uit grond geïsoleerd. Volgens de numerieke taxonomie en het overzicht van de Actinomadura en verwante actinomyceten door Goodfellow et al. in J, Gen. Microbiol. 112: 95-222 (1979) zijn de meeste uit grond afkomstige 25 Actinomadura soorten onder de 14 beschreven clusters onder cluster nr. 7 geklassificeerd. Stam nr. H96b~92 is het meest verwant met de soort van cluster J. Nonomura en Ohara in J. Ferment. Technol. j+£: 90^-912 (1971) vermelden vijf saprofytische soorten van het genus Actinomadura en Nonomura [J. Ferment. Technol. 52: 71-77 (197*0 en Preobrazhenskaya et al.These main properties indicate that strain B.9Sk-92 is in the genus Actinoma dura. The earlier species of the genus Actinomadura 20 were isolated from mammals. Some strains were also obtained from plant materials. However, many of the recently proposed new species have been isolated from soil. According to the numerical taxonomy and the overview of the Actinomadura and related actinomycetes by Goodfellow et al. In J, Gen. Microbiol. 112: 95-222 (1979), most soil-derived Actinomadura species among the 14 clusters described are classified under cluster No. 7. Strain No. H96b ~ 92 is most closely related to the species of cluster J. Nonomura and Ohara in J. Ferment. Technol. j + £: 90 ^ -912 (1971) mention five saprophytic species of the genus Actinomadura and Nonomura [J. Ferment. Technol. 52: 71-77 (197 * 0 and Preobrazhenskaya et al.

30 [Actinomycetes and Helated Organisms 12: 30-38 (1977)] publiceerden de sleutels voor het identificeren en classificeren van de Actinomadura-soor-ten. Als resultaat van een vergelijking met beschrijvingen van 30 soorten met inbegrip van in octrooischriften beschreven organismen, blijkt de stam H96k-92 de meeste verwantschap te hebben met Actinomadura coerulea beschre-35 ven door Preobrazhenskaya et al. als bovengenoemd en met Actinomadura 8401572 -11- verrucocospora als "beschreven in de Nonomura referenties als hoven vermeld.30 [Actinomycetes and Helated Organisms 12: 30-38 (1977)] published the keys for identifying and classifying the Actinomadura species. As a result of a comparison with descriptions of 30 species, including organisms described in patents, the strain H96k-92 appears to have the most relationship with Actinomadura coerulea described by Preobrazhenskaya et al. Above and with Actinomadura 8401572-11- verrucocospora as "described in the Nonomura references as courts mentioned.

De stam Nr. H96U—92 werd direkt vergeleken met de A. verrucosospora stam KCC A-01*+7 en bleek ten aan zien van de morfologische, kweek- en fysiologische eigenschappen nauw verwant te zijn met A. verrucosospora. Aldus 5 is stam H96*+-92 als een nieuwe stam van Actinomadura verrucosospora ge-. klassificeerd.The strain No. H96U-92 was directly compared to the A. verrucosospora strain KCC A-01 * + 7 and was found to be closely related to A. verrucosospora in terms of morphological, culture and physiological properties. Thus, strain H96 * + - 92 has been used as a new strain of Actinomadura verrucosospora. classified.

Opgemerkt wordt dat voor de bereiding van BBM-1Ö75 de onderhavige uitvinding, hoewel in bijzonderheden beschreven met betrekking tot de bepaalde stam Actinomadura verrucosospora H96*+-92 (ATCC 3933*0 en de mutant-10 stam daarvan, aangegeven als de stam A1327Y (ATCC 39638) niet tot deze mi-cro-organismen of door de hierin aan de hand van de kweekeigenschappen volledig beschreven micro-organismen is beperkt. Hèt wordt in het bijzonder beoogd dat de uitvinding de stam H96*+-92 en alle natuurlijke en kunstmatige BBM-l675-producerende varianten en mutanten daarvan omvat.It is noted that for the preparation of BBM-1075, the present invention, although described in detail with respect to the particular strain Actinomadura verrucosospora H96 * + - 92 (ATCC 3933 * 0 and its mutant-10 strain, is referred to as strain A1327Y ( ATCC 39638) is not limited to these microorganisms or by the microorganisms fully described herein by reference to the cultivation properties, It is particularly contemplated that the invention be to strain H96 * + - 92 and all natural and artificial BBM-1675 producing variants and mutants thereof.

15 De BBM-l675-antibiotica van de onderhavige uitvinding kunnen worden bereid door een BBM-1675-producerende stam van Actinomadura verrucosospora, bij voorkeur een stam van Actinomadura verrucosospora met de identificatie-eigenschappen van ATCC 3933*+ of ATCC 39638, of een mutant daarvan, in een gebruikelijk waterig voedingsmedium te kweken. Het organisme wordt ge-20 kweekt in een voedingsmedium dat .bekende voedingsbronnen voor actinomyceten bevat, d.w.z. assimileerbare bronnen van koolstof en stikstof plus naar keuze anorganische zouten en andere bekende groeifactoren. Voor de bereiding van grote hoeveelheden antibioticum worden bij voorkeur submerse aerobe omstandigheden toegepast, hoewel voor de bereiding van beperkte hoeveelheden 25 tevens oppervlaktecultures en kolven kunnen worden gebruikt. Algemene procedures, toegepast voor het kweken van andere actinomyceten, zijn tevens van toepassing op de onderhavige uitvinding.The BBM-1675 antibiotics of the present invention can be prepared by a BBM-1675 producing strain of Actinomadura verrucosospora, preferably a strain of Actinomadura verrucosospora with the identification properties of ATCC 3933 * + or ATCC 39638, or a mutant thereof, in a conventional aqueous nutrient medium. The organism is grown in a nutrient medium containing known dietary sources of actinomycetes, that is, assimilable sources of carbon and nitrogen plus optionally inorganic salts and other known growth factors. Submerged aerobic conditions are preferably used for the preparation of large quantities of antibiotics, although surface cultures and flasks can also be used for the preparation of limited quantities. General procedures used for culturing other actinomycetes also apply to the present invention.

Het voedingsmedium moet een geschikte assimileerbare koolstofbron bevatten, zoals glycerol, L(+)-arabinose, D-xylose, D-ribose, L-ramnose, 30 D-glucose, D-fructose, saccharose, cellobiose, oplosbaar zetmeel, D-manni-tol of inositol. Als stikstofbron kunnen ammoniumchloride, ammoniumsulfaat, ureum, ammoniumnitraat, natriumnitraat, enz. of afzonderlijk of in combinatie met organische stikstofbronnen, zoals pepton, vleesextract, gist-extract, maisweeksap, sojapoeder, katoenzaadmeel, enz. worden toegepast.The nutrient medium should contain a suitable assimilable carbon source, such as glycerol, L (+) - arabinose, D-xylose, D-ribose, L-ramnose, D-glucose, D-fructose, sucrose, cellobiose, soluble starch, D-manni -toll or inositol. As the nitrogen source, ammonium chloride, ammonium sulfate, urea, ammonium nitrate, sodium nitrate, etc. can be used individually or in combination with organic nitrogen sources, such as peptone, meat extract, yeast extract, corn juice, soy powder, cottonseed meal, etc.

35 Tevens kunnen zonodig anorganische voedingszouten, waaruit bronnen van natrium, kalium, calcium, ammonium, fosfaat, sulfaat, chloride, bromide, car-bonaat, zink, magnesium, mangaan, kobalt, ijzer, enz. worden verkregen, 8401572 -12- worden toegepast.Inorganic food salts, from which sources of sodium, potassium, calcium, ammonium, phosphate, sulfate, chloride, bromide, carbonate, zinc, magnesium, manganese, cobalt, iron, etc., can also be obtained, if necessary, 8401572 -12- applied.

De "bereiding van de BBM-1675-antibiotica kan· worden uitgevoerd "bij elke temperatuur die leidt tot een geschikte groei van het producerende organisme "bijvoorbeeld 15-^5°C, en wordt doelmatig uitgevoerd bij een tem-5 peratuur rond 27-32°C. In het algemeen wordt een optimale produktie verkregen na incubatieperioden van ongeveer 68—180 uur, afhankelijk van het type fermentatie, zoals in een schudkolf, roerfles of tank, dat wordt toegepast. Voor het uitvoeren van de fermentatie in een tank is het gewenst een vegetatief inoculum in een voedingsvloeistof te bereiden door de kweek-10 vloeistof met een schuine kweek of grondkweek of een gelyofiliseerde kweek van het producerende organisme te inoculeren. Nadat op deze wijze een actief inoculum is verkregen, wordt dit aseptisch in het fermentatietankme-dium overgebracht. Het bewaken van de produktie van het antibioticum kan geschieden via de papierschijf-agardiffusie-analyse met Staphylococcus 15 aureus 209P als proeforganisme.The "preparation of the BBM-1675 antibiotics can be carried out" at any temperature that leads to appropriate growth of the producing organism "for example 15-5 ° C, and is conveniently carried out at a temperature around 27- 32 ° C. Generally, optimum production is obtained after incubation periods of about 68-180 hours, depending on the type of fermentation, such as in a shake flask, stirring bottle, or tank being used. it is desired to prepare a vegetative inoculum in a nutrient liquid by inoculating the culture liquid with an oblique culture or soil culture or a lyophilized culture of the producing organism After an active inoculum is obtained in this manner, it is aseptically introduced into the fermentation tank The production of the antibiotic can be monitored by the paper disc agar diffusion analysis using Staphylococcus aureus 209P as a test organism.

Wanneer de fermentatie is voltooid kan het BBM-1675-complex door middel van gebruikelijke isolatieprocedures, bij voorbeeld oplosmiddelextrac-tie, uit de vloeistof worden verkregen. Bij voorbeeld kan de gehele vloeistof door middel van filtratie of centrifugeren in myceliumkoek en boven-20 staande vloeistoflaag worden gescheiden. Het antibioticum in de myceliumkoek kan worden gewonnen door de koek in methanol te suspenderen, onoplosbare materialen af te filtreren en het methanolische extract te concentreren. De actieve stof in de bovenstaande vloeistofkan worden gewonnen door extractie met n-butanol. De bovengenoemde n-butanol- en -methanolextracten 25 kunnen dan worden gecombineerd en azeotropisch ingedampt tot een waterige oplossing, waaruit de grootste hoeveelheid van het actieve antibioticum als olieachtige vaste stof wordt neergeslagen. De vaste stof kan dan in methanol worden opgelost en de oplossing gefiltreerd. Het filtraat wordt geconcentreerd en aan een mengsel van ethylacetaat en water toegevoegd. Het 30 verkregen organische extract bevat het ruwe BBM-1675-complex, dat uit de oplossing kan worden neergeslagen door toevoeging van een anti-oplosmiddel, zoals n-hexaan.When the fermentation is complete, the BBM-1675 complex can be obtained from the liquid by conventional isolation procedures, for example, solvent extraction. For example, the entire liquid can be separated by filtration or centrifugation in mycelium cake and the above liquid layer. The antibiotic in the mycelium cake can be recovered by suspending the cake in methanol, filtering out insolubles and concentrating the methanolic extract. The active substance in the supernatant can be recovered by extraction with n-butanol. The above n-butanol and methanol extracts can then be combined and azeotropically evaporated to an aqueous solution, from which most of the active antibiotic is precipitated as an oily solid. The solid can then be dissolved in methanol and the solution filtered. The filtrate is concentrated and added to a mixture of ethyl acetate and water. The organic extract obtained contains the crude BBM-1675 complex, which can be precipitated from the solution by adding an anti-solvent, such as n-hexane.

Het ruwe BBM-1675-complex is een mengsel van verscheidene componenten met inbegrip van twee bioactieve hoofdcomponenten, BBM-1675 en 35 en vier ondergeschikte bioactieve componenten, BBM-1675 A^, A^, B^ en Deze bioactieve componenten kunnen via gebruikelijke chromatografische procedures worden gescheiden en gezuiverd. Volgens een procedure wordt het 8401572 -13- ruwe BBM-1675 eerst in methanol opgelost en gezuiverd door Sephadex LH-20-kolomchromatografie onder toepassing van methanol als eluent. Dit gedeeltelijk gezuiverde complex kan dan over een silicagelkolom worden gechroma-tografeerd en trapsgewijze met chloroform plus een toenemende concentratie 5 van methanol geëlueerd, onder vorming van BBM-1675 A^, een mengsel van BBM-1675 A^, A^ en A^ en een mengsel van BBM-1675 en Bg. De A^-component kan verder worden gezuiverd via kolomchromatografie over Sephadex KL-20 met methanol als eluent. Het mengsel van Ag, Ag en A^ kan door chro-matografie over een kolom van Bondapak (Water Associates, Ine.) wor-10 den gescheiden met toenemende concentraties van waterig acetonitril als eluent. Het mengsel van B^- en Bg-componenten kan worden gescheiden door silicagelkolomchromatografie onder toepassing van een mengsel van chloroform en methanol als eluent. Verdere bijzonderheden van de voorkeurschroma-tografische scheidingsprocedures worden vermeld in de hierna volgende voor-15 beelden.The crude BBM-1675 complex is a mixture of several components including two main bioactive components, BBM-1675 and 35 and four minor bioactive components, BBM-1675 A ^, A ^, B ^ and. procedures are separated and purified. According to a procedure, the 8401572-13 crude BBM-1675 is first dissolved in methanol and purified by Sephadex LH-20 column chromatography using methanol as an eluent. This partially purified complex can then be chromatographed on a silica gel column and eluted stepwise with chloroform plus an increasing concentration of methanol to form BBM-1675 A ^, a mixture of BBM-1675 A ^, A ^ and A ^ and a mixture of BBM-1675 and Bg. The A 2 component can be further purified by column chromatography on Sephadex KL-20 with methanol as the eluent. The mixture of Ag, Ag and Al can be separated by chromatography on a column of Bondapak (Water Associates, Ine.) With increasing concentrations of aqueous acetonitrile as eluent. The mixture of B ^ and Bg components can be separated by silica gel column chromatography using a mixture of chloroform and methanol as eluent. Further details of the preferred chromatographic separation procedures are set forth in the examples below.

De zes bioactieve componenten van het BBM-1675-complex worden van elkaar onderscheiden door twee TLC-systemen zoals vermeld in de volgende tabel.The six bioactive components of the BBM-1675 complex are distinguished from each other by two TLC systems as listed in the following table.

TABEL ETABLE E

TLC wi BBM-1675 ComponentenTLC wi BBM-1675 Components

Rf waardenRF values

SiO * 2 GesilanizeerdSiO * 2 Silanized

Component CHC13-CH30H(5:1 v/v) CH3CN-H?Q(75;25 v/v) BBM-1675 Αχ 0,74 0,18 BBM-1675 A2 0,71 0,21 BBM-1675 A3 0,72 0,28 BBM-1675 A4 0,71 0,78 BBM-1675 Βχ 0,63 0,23 BBM-1675 B2 0,60 0,16 C 8 omgekeerde fase silicagel 8401572 _ll+_Component CHC13-CH30H (5: 1 v / v) CH3CN-H? Q (75; 25 v / v) BBM-1675 Αχ 0.74 0.18 BBM-1675 A2 0.71 0.21 BBM-1675 A3 0 .72 0.28 BBM-1675 A4 0.71 0.78 BBM-1675 Βχ 0.63 0.23 BBM-1675 B2 0.60 0.16 C 8 reverse phase silica gel 8401572 _ll + _

De scheiding van BBM-1675 Ag, A^ en was moeilijk via gebruikelijke TLC-fasesystemen, maar kon door middel van een omgekeerde fase TLC worden bereikt.The separation of BBM-1675 Ag, Al 2 was difficult via conventional TLC phase systems, but could be achieved by reverse phase TLC.

De afzonderlijke BBM-1675-componenten vertonen oplosbaarheid en 5 kleurreacties, die aan elkaar gelijk zijn. Ze zijn bij voorbeeld oplosbaar in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetra-chloride. Zij geven positieve reacties met ferrichloride. Ehrlich- en Tollens-reagentia, maar negatieve responsies in Sakaguchi, ninhydrine en 10 anthronproeven.The individual BBM-1675 components show solubility and 5 color reactions that are equal to each other. For example, they are soluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in benzene and water, and insoluble in n-hexane and carbon tetrachloride. They give positive reactions with ferric chloride. Ehrlich and Tollens reagents, but negative responses in Sakaguchi, ninhydrin and 10 anthron experiments.

Karakteristieke fysisch-chemische eigenschappen van BBM-l675-compo-nenten worden vermeld in tabel E.Characteristic physicochemical properties of BBM-1675 components are listed in Table E.

TABEL ETABLE E

Fysisch-chemische eigenschappen van BBM-1675 componenten BBM-1675 Α.χ Aj A3 A4 Βχ BjPhysico-chemical properties of BBM-1675 components BBM-1675 Α.χ Aj A3 A4 Βχ Bj

Smeltpunt (ontl.). i$e . isa°c 147 - i49»c 12s - 127-c 123 - I2e*c 159 - i6i»c 156 - i59»c [a]p7 (e 0.5, CHCIO : -191* -179.4» -161* -176» -171» -122»Melting point (dec.). i $ e. isa ° c 147 - i49 »c 12s - 127-c 123 - I2e * c 159 - i6i» c 156 - i59 »c [a] p7 (e 0.5, CHCIO: -191 * -179.4» -161 * -176 » -171 »-122»

Anal, gevonden w c.· 51,52 53,81 55,00 53,67 H: 5,81 6,31 6,52 6,35 N: 4,02 3,82 3,57 3,45 (door verschil) O: 38,65 36,06 34,91 36,53 in C330H s 253 (325) 253 (281) 253 (286) 253 (257) 253 (225) 248 (212) 282 (195) 282 (172) 282 (158) 282 (153) 282 (140) 279 (141) 320 (143) 320 (128) 320 (122) 320 (117) 320 (104) 318 (103) in 0.01N BCl-CH3OH : 253 (323) 253 (276) 253 (287) 253 (258) 253 (225) 248 (210) 282 (192) 282 (167) 282 (160) 282 (155) 282 (140) 279 (140) 320 (144) 320 (128) 320 (126) 320 (118) 320 (105) 318 (103) in 0.01N HaOH-CH3OH ·. 252 (325) 252 (289) 252 (280) 252 (266) 252 (236) 248 (233) 283 (172) 283 (171) 283 (162) 283 (160) 282 (141) 278 (ISO) 318 (136) 318 (122) 318 (120) 318 (118) 318 (105) 318 (110) moi. gew.Anal, found w c. 51.52 53.81 55.00 53.67 H: 5.81 6.31 6.52 6.35 N: 4.02 3.82 3.57 3.45 (due to difference ) O: 38.65 36.06 34.91 36.53 in C330H s 253 (325) 253 (281) 253 (286) 253 (257) 253 (225) 248 (212) 282 (195) 282 (172) 282 (158) 282 (153) 282 (140) 279 (141) 320 (143) 320 (128) 320 (122) 320 (117) 320 (104) 318 (103) in 0.01N BCl-CH3OH: 253 (323 ) 253 (276) 253 (287) 253 (258) 253 (225) 248 (210) 282 (192) 282 (167) 282 (160) 282 (155) 282 (140) 279 (140) 320 (144) 320 (128) 320 (126) 320 (118) 320 (105) 318 (103) in 0.01N HaOH-CH3OH. (252) (325) 252 (289) 252 (280) 252 (266) 252 (236) 248 (233) 283 (172) 283 (171) 283 (162) 283 (160) 282 (141) 278 (ISO) 318 ( 136) 122 (318) 120 (318) 118 (118) 105 (318) 110 (318) moi. wt.

(benaderde waarde)* l*3oo ΐ,ιοο ι,ιοο 1*400 (Gel HPLC, FinepaJ? GEI.-101)(approximate value) * l * 3oo ΐ, ιοο ι, ιοο 1 * 400 (Gel HPLC, FinepaJ? GEI.-101)

De UV absorptiemaxima van BBM-1675 componenten werden bij 253, 282 en 320 nm waargenomen, die zich niet verplaatsen in zure of alkalische oplossing. De IR- en PMR-spectra van BBM-1675 A^, Ag, en A^ worden weergegeven in resp. fig. 1-1) en fig. 5-8. De 360 MHz PMR van BBM-1675 A1 toonde 8401572 -15- éên acetyl (i:2,11 dpm), een N-CH3 (2,52 dpm), vier OCH3 (3,^2, 3,80, 388 en 3,98 dpm) en één exomethyleen (U,57 en 5S^8 dpm) groepen, tezamen met twee aromatische (7950 en 8,59 dpm) en één NH (11,79 dpm) protonen.The UV absorption maxima of BBM-1675 components were observed at 253, 282 and 320 nm, which do not move in acidic or alkaline solution. The IR and PMR spectra of BBM-1675 A ^, Ag, and A ^ are shown in resp. fig. 1-1) and fig. 5-8. The 360 MHz PMR of BBM-1675 A1 showed 8401572 -15 one acetyl (i: 2.11 ppm), one N-CH3 (2.52 ppm), four OCH3 (3, ^ 2, 3.80, 388 and 3.98 ppm) and one exomethylene (U, 57 and 5S (8 ppm) groups, together with two aromatic (7950 and 8.59 ppm) and one NH (11.79 ppm) protons.

Het CMR-spectrum van ΒΒΜ-ΐβ75Α^ vertoonde 55 koolstofsignalen met inbe-5 grip van een triple intensiteitssignaal (δ :5^,0 dpm, 0CH3). De moleculaire formule van BBM-1Ó75A1 wordt afgeleid als 32 gebaseerd op proton en 13C NMR-spectra, micro-analyse en molecuulgewichtsbepaling door HPLC en SIMS (secondaire ionen massaspectrometrie).The CMR spectrum of ΒΒΜ-ΐβ75Α ^ showed 55 carbon signals including a triple intensity signal (δ: 5 ^, 0 ppm, 0CH3). The molecular formula of BBM-1075A1 is derived as 32 based on proton and 13 C NMR spectra, microanalysis and molecular weight determination by HPLC and SIMS (secondary ion mass spectrometry).

Onderzoek structuur van BBM-1675 A^ 10 Na behandeling met 0,5N HC1 CHjOH bij kamertemperatuur zal BBM-1675 A zijn bioactiviteit verliezen en een lipofiele chromofore substantie (verbinding I) geven tezamen met verscheidene, niet-geïdentificeerde fragmenten. Verbinding I vertoont UV-absorptie gelijk aan die van het hoofd-anti-bioticum, waardoor wordt gesuggereerd dat verbinding I de chromofore struc-15 tuur van BBM-1675 A^ behoudt. Twee andere chromofore fragmenten, die aan verbinding I verwant zijn, worden verkregen door alkalische hydrolyse van BBM-1675 A^: hydrolyse met 0,05iT KOH-CH OH bij 55°C gedurende één uur geeft verbinding II met UV-absorptiemaxima bij 252, 2dh, 297 (schouder) en 322 nm, terwijl de reactie met 1N KOH-CH^OH een zure chromofore substantie geeft, 20 aangeduid als verbinding II. De fysisch-chemische eigenschappen van verbindingen I, II en III worden samengevat in tabel F.Examine structure of BBM-1675 A ^ 10 After treatment with 0.5N HCl CH3OH at room temperature, BBM-1675 A will lose its bioactivity and yield a lipophilic chromophoric substance (compound I) along with several unidentified fragments. Compound I exhibits UV absorption similar to that of the main anti-biotic, suggesting that Compound I retains the chromophoric structure of BBM-1675 A. Two other chromophoric fragments related to compound I are obtained by alkaline hydrolysis of BBM-1675 A: hydrolysis with 0.05i KOH-CH OH at 55 ° C for one hour gives compound II with UV absorption maxima at 252, 2dh, 297 (shoulder) and 322 nm, while the reaction with 1N KOH-CH 2 OH gives an acidic chromophoric substance, designated compound II. The physicochemical properties of compounds I, II and III are summarized in Table F.

840157? -16-840157? -16-

TABEL FTABLE F

Eigenschapen van verbindingen I, II en IIIProperties of compounds I, II and III

Verbinding I Verbinding - II Verbinding IIICompound I Compound - II Compound III

Smp. : 82 - 83*C 133* 253 - 255*CMp. : 82 - 83 * C 133 * 253 - 255 * C

[a]*9(c 0.2 CHClj) : -100* 0 0[a] * 9 (c 0.2 CHCl 3): -100 * 0 0

Moleculaire formule : c2iH3iNOio ci4Hi7N06 c13h15noó ον 1^3011 nm (ε) : 244 (21,850) 252 (26,600) 248 (26,900) aaX 276 (9,400) 283 (11,200) 295 (14,400) 318 (6,300) 297(sh8,800) 310 (13,500) 322 (11,700) MS Bi/S : 457 (M+) 295 (M+) 281 (H+) 425 280 263 341 263 236 281 251 222 264 248 218Molecular formula: c2iH3iNOio ci4Hi7N06 c13h15noó ον 1 ^ 3011 nm (ε): 244 (21,850) 252 (26,600) 248 (26,900) aaX 276 (9,400) 283 (11,200) 295 (14,400) 318 (6,300) 297 (sh800) 310 (13,500) 322 (11,700) MS Bi / S: 457 (M +) 295 (M +) 281 (H +) 425 280 263 341 263 236 281 251 222 264 248 218

TICTIC

(Xyleen-*1®*"^08-’*5*! ▼/▼) : Rf 0.58 0.66 0.13 * MEK mathyl^ethyl'keton(Xylene- * 1® * "^ 08 -" * 5 *! ▼ / ▼): Rf 0.58 0.66 0.13 * MEK mathyl ^ ethyl'ketone

Structuurinformatie omtrent verbindingen II en III werd verkregen 13 via de volgende spectrale gegevens en chemische omzetting. Het C- en pro-ton-NMR gaf de aanwezigheid van vier OCH^, één = CHg, zeven yC=, twee sC=0 en één ^NH-groep(en) in verbinding II aan. Het NMR-spectrum van ver-5 binding III was gelijk aan dat van II, met alleen het verschil, dat êén van de vier OCH^-groepen, waargenomen voor verbinding II, afwezig was. Dit verschil, tezamen met het zure karakter van verbinding III, suggereerde, dat verbinding II een methylester van de verbinding III is. Bij verhitting onder terugloop met 1N methanolisch Κ0Η, werd verbinding II kwantitatief in 10 verbinding III omgezet, terwijl verbinding III in verbinding II werd omgezet door behandeling met diazomethaan. De behandeling van verbinding II met ïïaBH^ in C^H^-OH gaf een reductieprodukt (verbinding IV, M+: m/z 267), dat in het NMR een -CH^OH-groep toonde in plaats van de -COOCH^-groep van verbinding II. Na hydrogenering over palladium-op-kool leverde verbinding II 15 een dihydroderivaat (verbinding V, M+: m/z 297). Het NMR-protonspectrum van verbinding V toonde een nieuw methyldoubletsignaal en de afwezigheid van de oxomethyleengroep, aanwezig in verbinding II. Verder verscheen één van de OCH^-groepen bij een hoger veld (f:3,5 dpm) in verbinding V. Deze re- 8401572 -17- sultaten wijzen op de aanwezigheid van een -OCH- I 2 och3 groep in verbinding II, die door hydrogenering werd gereduceerd tot -CH-CH, I 3 och3 5 groep in verbinding V, Verbinding II werd met 1,5N methanolisch waterstof-chloride gedurende 3 uur bij 80°C verhit en het hydrolysaat gechromatogra-feerd over een silicagelkolom, waarbij een zwak-zure verbinding werd verkregen (verbinding VI, M+:m/z 211). Het IR-spectrum en de fysisch-chemische eigenschappen gaven aan dat verbinding VI een NH^-groep bevatte. Verbin-10 ding VI werd geïdentificeerd als methyl-U,5-dimetho2cy-antranilaat door vergelijkende IR- en NMR-studies met een authentiek monster. Aldus werden de structuren van verbindingen II, III, IV, V en V0 bepaald als aangegeven in het reactieschema A van het formuleblad.Structure information on compounds II and III was obtained via the following spectral data and chemical conversion. The C and pro-ton NMR indicated the presence of four OCH2, seven yC =, two sC = 0, and one ^ NH group (s) in compound II. The NMR spectrum of compound III was the same as that of II, except that one of the four OCH 2 groups observed for compound II was absent. This difference, together with the acidic nature of compound III, suggested that compound II is a methyl ester of compound III. When heated under reflux with 1N methanolic Η0Η, compound II was quantitatively converted to compound III, while compound III was converted to compound II by treatment with diazomethane. The treatment of compound II with 25BH 4 in C 2 H -OH gave a reduction product (compound IV, M +: m / z 267), which showed a -CH 2 OH group in the NMR instead of the -COOCH 2 - group of compound II. After hydrogenation over palladium-on-carbon, compound II 15 gave a dihydro derivative (compound V, M +: m / z 297). The NMR proton spectrum of Compound V showed a new methyl double signal and the absence of the oxomethylene group present in Compound II. Furthermore, one of the OCH 2 groups appeared at a higher field (f: 3.5 ppm) in compound V. These results indicate the presence of an -OCH-I 2 och 3 group in compound II, which was reduced by hydrogenation to -CH-CH, I 3 och 3 group in compound V, Compound II was heated with 1.5N methanolic hydrogen chloride at 80 ° C for 3 hours and the hydrolyzate was chromatographed on a silica gel column. a weakly acidic compound was obtained (compound VI, M +: m / z 211). The IR spectrum and physicochemical properties indicated that compound VI contained an NH4 group. Compound VI was identified as methyl-U, 5-dimetho 2 cyanthranilate by comparative IR and NMR studies with an authentic sample. Thus, the structures of compounds II, III, IV, V and V0 were determined as indicated in the reaction scheme A of the formula sheet.

Na behandeling met 0,05N KOH-CH OH bij 55°C werd verbinding I ge-15 splitst in een nieuw chromofoor fragment (verbinding VII), Ο^Η^^ΝΟ^., M :m/z 327) en een suiker (verbinding VIII). Het NMR-spectrum van VII vertoonde één singlet C-CH3 en twee hoogveld-OCH^groepen, behalve drie laagveld 0CH3-groepen en twee aromatische protonen normaal waargenomen voor verbinding II, V en VI. Verdere hydrolyse van VII met 1,5N methanolisch waterstofchloride 20 gaf verbinding VI, die identiek was aan de eerder uit II verkregen verbinding. Na verwijdering van VI, werd het hydrolysaat met 2,U-dinitrofenylhy-drazine behandeld en werd een gele vaste stof neergeslagen, die werd geïdentificeerd als 2,i+-dinitrofenylhydrazon van pyrodruivezuur. Aldus is verbinding VII methyl-i,5-dimethoxy-N-(2',2’-dimethoxypropionyl)antranilaat. Ver-25 binding VIII vertoonde niet de moleculaire ionenpiek, maar wel de M-OCH^-piek bij m/z 131 in het massaspectra overeenkomend met de moleculaire formule van C^H-i^O^. Het NMR-spectrum gaf een 2,6-dideoxyhexopyranosestruc-tuur voor verbinding VIII aan. Deze identificatie werd ondersteund door het 13 C-NMR van verbinding I dat één C-CH^, één -CH^, drie 0-CH·^ en één anomerisch 30 koolstofatoom aantoonde, behalve li koolstofsignalen toe te schrijven aan 8401572 -18- de verbinding VII. Het C^-proton van de suiker verscheen bij het lage veld (5:5,39 dpm, octet), aanduidende dat C^-OH van de suiker door de carboxyl-groep van VII was veresterd. De boven beschreven resultaten met de structuren van verbindingen I, VII en VIII worden samengevat in reactieschema B 5 van het formuleblad.After treatment with 0.05N KOH-CH OH at 55 ° C, compound I was split into a new chromophore fragment (compound VII),) ^ Η ^^ ΝΟ ^., M: m / z 327) and a sugar (compound VIII). The NMR spectrum of VII showed one singlet C-CH3 and two high field OCH3 groups, except three low field OCH3 groups and two aromatic protons normally observed for compounds II, V and VI. Further hydrolysis of VII with 1.5N methanolic hydrogen chloride gave compound VI, which was identical to the compound previously obtained from II. After removal of VI, the hydrolyzate was treated with 2,1 U-dinitrophenyl hydrazine and a yellow solid was precipitated, which was identified as 2,1 + Dinitrophenyl hydrazone of pyruvic acid. Thus compound VII is methyl 1,5-dimethoxy-N- (2 ', 2'-dimethoxypropionyl) antranilate. Compound VIII did not show the molecular ion peak, but did show the M-OCH 2 peak at m / z 131 in the mass spectra corresponding to the molecular formula of C 2 H-1 O 2. The NMR spectrum indicated a 2,6-dideoxyhexopyranose structure for compound VIII. This identification was supported by the 13 C-NMR of compound I which showed one C-CH2, one -CH2, three O-CH2, and one anomeric carbon atom, except 1 carbon signals due to 8401572-18 compound VII. The C 1 proton of the sugar appeared in the low field (5: 5.39 ppm, octet), indicating that C 1 -OH of the sugar had been esterified by the carboxyl group of VII. The results described above with the structures of compounds I, VII and VIII are summarized in reaction scheme B 5 of the formula sheet.

Het molecuulgewicht van verbinding I (^57) betreft ongeveer eenderde deel van. het gehele molecuul van BBM-1675 A^ (voorgesteld door de formule berekend molgewicht = 1321+). Aangenomen wordt dat de deelstructuur van BBM-1675 A^ wordt aangegeven door formule I’ van het for-10 muleblad.The molecular weight of compound I (^ 57) is about one third of. the whole molecule of BBM-1675 A ^ (represented by the formula calculated molecular weight = 1321+). The partial structure of BBM-1675 A is believed to be indicated by formula I of the formula 10 sheet.

Na de indieningsdatum van de Amerikaanse hoofdaanvrage nr. U95.231, werd gevonden dat de boven beschreven en volgens het onderstaande voorbeeld II geproduceerde componenten BBM-1675 A^ en k^ in feite niet geheel zuiver waren en dat sommige van de karakteriserende eigenschappen toege-15 past voor het definiëren van dergelijke verbindingen onjuist waren. Na verdere chromatografische zuiveringsprocedure, zoals nader in voorbeelden III en VI toegelicht, werden BBM-1675 A^ en Ain meer gezuiverde vorm geïsoleerd en volledig gekarakteriseerd, zoals hierna beschreven. Tevens werden de elementairanalysegegevens voor componenten A^ en A^ herzien, waarbij de 20 aanwezigheid van zwavel in deze verbindingen werd aangetoond en vervolgens werden voor deze twee verbindingen de HPLC-retentietijden berekend. Hierna worden de herziene fysisch-chemische eigenschappen van de BBM-1675-com-ponenten samengevat.After filing date of U.S. Patent Application No. U95,231, it was found that the components described above and produced according to Example II below were in fact not completely pure and that some of the characterizing properties were added. 15 fit to define such connections were incorrect. After further chromatographic purification procedure, as further explained in Examples III and VI, BBM-1675 A and Ain more purified form were isolated and fully characterized as described below. Also, the elemental analysis data for components A ^ and A ^ were revised, demonstrating the presence of sulfur in these compounds, and then HPLC retention times were calculated for these two compounds. The revised physicochemical properties of the BBM-1675 components are summarized below.

BBM-1675 A1 25 Beschrijving: wit tot lichtgele kristallen; smeltpunt 156-1580 (ontl.)BBM-1675 A1 25 Description: White to pale yellow crystals; melting point 156-1580 (dec.)

ElementairanalyseElemental analysis

Analyse- 1 Analyse.. 2 Gemiddeld C: 51,60% C: 52,74% C; 52,17 H: 6,31% H: 5,99 H: 6,15 N; 5,31% N: 3,94% N; 4,63% S; 8,47% S: 9,71% S: 9,09% 0 (door verschil):28,31% 0 (door verschil):27,62% 0 (door verschil):27,96% 8401572 -19-Analysis 1 Analysis .. 2 Average C: 51.60% C: 52.74% C; 52.17 H: 6.31% H: 5.99 H: 6.15 N; 5.31% N: 3.94% N; 4.63% S; 8.47% S: 9.71% S: 9.09% 0 (due to difference): 28.31% 0 (due to difference): 27.62% 0 (due to difference): 27.96% 8401 572 -19-

Ultraviolet ahsorptiespectrum: Instrument-Varian UV, Cary 219Ultraviolet Absorption Spectrum: Instrument-Varian UV, Cary 219

Oplosmiddel - methanolSolvent - methanol

Concentratie - 0.01356 g/1 \ ,(nm) absorDties max_ _*- 320 12,4 280 Sh (schouder) 253 25,1 210 25,5 8401572 -20- G-een significante waardering'met zuur of-"baseConcentration - 0.01356 g / l, (nm) absorbances max_ _ * - 320 12.4 280 Sh (shoulder) 253 25.1 210 25.5 8401572 -20-G-a significant appreciation with acid or base

Optische rotatie: Oplosmiddel - CÏÏCl^ [a]^4 = -207° (C=0.0351)Optical Rotation: Solvent - CICl ^ [a] ^ 4 = -207 ° (C = 0.0351)

Een tweede analyse toonde de volgende optische rotatie: [«,f = -191° (C=0.5/ CHC13).A second analysis showed the following optical rotation: [,, f = -191 ° (C = 0.5 / CHCl 3).

Infrarood absorptie spectrum: Zie FIG. 9Infrared absorption spectrum: See FIG. 9

Belangrijkste absorptietanden (KBr): 985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440, cm"1Main absorption teeth (KBr): 985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440, cm "1

Massaspectra: Instrument - VG-ZAB-2FMass Spectra: Instrument - VG-ZAB-2F

'FAB-MS-thioglycerolFAB-MS-thioglycerol

Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1249, 1357, 1463;met toevoeging van NaCl (m/z): 1271, 1379, 1485, 1597.Molecular mass range of ions (m / z): 1249, 1357, 1463; with addition of NaCl (m / z): 1271, 1379, 1485, 1597.

FAB-MS-MB (MB:matrix, m.w. 154); Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1249, 1283, 1403, 15 55; met toevoeging van NaCl (m/z): 12 49, 1271, 1303, 1425, 1483, 1577. FAB-MS-glycerol-DMSO: Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1215, 1247, 1279, 1293, 1325, 1353; met toevoeging van Na Cl (m/z): 1215, 1237, 1247, 1269, 1325, 1347, 1375. Instrument: Kratos MS-50 FAB-MS-thioglycerol; Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1357, 1463.FAB-MS-MB (MB: matrix, i.e. 154); Molecular mass range ions (m / z): 1249, 1283, 1403, 55; with addition of NaCl (m / z): 12 49, 1271, 1303, 1425, 1483, 1577. FAB-MS-glycerol-DMSO: Molecular mass range ions (m / z): 1215, 1247, 1279, 1293, 1325 , 1353; with addition of NaCl (m / z): 1215, 1237, 1247, 1269, 1325, 1347, 1375. Instrument: Kratos MS-50 FAB-MS-thioglycerol; Molecular mass range ions (m / z): 1357, 1463.

Molecuulgewi cht (gebaseerd op bovenbeschreven Molecuulgewicht kennelijk 12U8 mas s aspe ct raalgegevens): 8401572 -21-Molecular weight (based on Molecular weight apparently 12U8 mass aspe ct ral data described above): 8401572 -21-

Magnetisch kernresonantiespectrs: Instrument - WM3éO Brucker Oplosmiddel: CDCl^ 1NMR: 360 MHz δ(ρρΐη): 11.75 (1H, s); 8.55 (1H, s); 7.45 (1H, s); 6.61 (1H, m); 6.23 (1H, brs) ; 6.17 (1H, brs); 5.93 (1H, d, J=9.3); 5.82 (1H, d, J-9.3); 5.7 (1H, brs); 5.49 (1H, m); 5.45 (1H, d, J=2.3); 5.38 (1H, brs); 4.95 (1H, d, J*10.2); 4.64 (2H, m); 4.54 (1H, d, J=2.3); 4.2 (1H, s); 4.15-3.35 (26-28H) [4.10 (1H, m); 4.02 (1H, brs); 3.95 (3H, s); 3.85 (3H, s)r 3.79 (3H, s); 3.46 v (1H, m); 3.40 (3H, s)]; 2.82-2.70 (3H, brm); 2.50 C3H, s), 2.47 (1H, m); 2.38-2.22 (5H); 2.12 (1H, m); 2.11 (3H, s); 1.60-1.05 (22H) [1.39 (3H, d, J=6.3); 6.31 (3H, d, J-6.3); 1.29 (3H, d, J=6.3)/ 1.08 (6H)]Magnetic nuclear resonance spectrs: Instrument - WM3éO Brucker Solvent: CDCl ^ 1NMR: 360 MHz δ (ρρΐη): 11.75 (1H, s); 8.55 (1H, s); 7.45 (1H, s); 6.61 (1H, m); 6.23 (1H, brs); 6.17 (1H, brs); 5.93 (1H, d, J = 9.3); 5.82 (1H, d, J-9.3); 5.7 (1H, brs); 5.49 (1H, m); 5.45 (1H, d, J = 2.3); 5.38 (1H, brs); 4.95 (1H, d, J * 10.2); 4.64 (2H, m); 4.54 (1H, d, J = 2.3); 4.2 (1H, s); 4.15-3.35 (26-28H) [4.10 (1H, m); 4.02 (1H, brs); 3.95 (3H, s); 3.85 (3H, s) r 3.79 (3H, s); 3.46 v (1H, m); 3.40 (3H, s)]; 2.82-2.70 (3H, brm); 2.50 C3H, s), 2.47 (1H, m); 2.38-2.22 (5H); 2.12 (1H, m); 2.11 (3H, s); 1.60-1.05 (22H) [1.39 (3H, d, J = 6.3); 6.31 (3H, d, J-6.3); 1.29 (3H, d, J = 6.3) / 1.08 (6H)]

Zie PIG. 10 13C NMR: 90.3 MHzSee PIG. 10 13 C NMR: 90.3 MHz

Zie PIG. 11 13See PIG. 11 13

In een afzonderlijke proef werd het C-NMR-spectrum van gezuiverd Bbm-1675 vastgesteld voor een monster, opgelost in CDCl^ (80 MHz).In a separate experiment, the C-NMR spectrum of purified Bbm-1675 was determined for a sample dissolved in CDCl 4 (80 MHz).

De hoofdpieken worden hierna aangegeven.The main peaks are indicated below.

8401572 -22- CMRvan BBM-1675A^ (80 MHz in CDCL^) R\8401572 -22- CMR of BBM-1675A ^ (80 MHz in CDCL ^) R \

Chemische verschuiving in dpm (Multipliciteit ) BBM-löTSAj^ 13.7(q) 16.6(q) 17.5(q) 19.8(q) 22.2(q) 22.6(g) 23.4(q) 29.0(b) 34.0(t) 35.1(b) 39.5(b) 47.2(d) 52.5(g) 55.6(u) 56.0(q) 57.1(d) 62.4(b) 64.5(d) 67.7(d) 63.2(d) 68.8(b) 69.2(d) 69.6(b) 70.2(d) 71.9(d) 76.0(d) 76.6(d) 77.1(u) 77.3(d) 83.4(S) ' 86.6(d) 88.4(s) 90.5(b) 97.2(d) 98.3(s) 99.0(d) 99.6(d) 103.8(d) 107.6(s) 112.5(d) 123.1(d) 124.9(d) 130.1(d) 131.5(s) 134.9(s) 136.7(s) 144.0(s) 147.2(e) 153.8(e) 154.4{s) 155.0(s) 160.7(s) 166.4(s) 191.8(s) * Multipliciteit- q = quartet; d = doublet; U = onbepaald t = triplet; s * singlet BBM-1675A2Chemical shift in ppm (Multiplicity) BBM-löTSAj ^ 13.7 (q) 16.6 (q) 17.5 (q) 19.8 (q) 22.2 (q) 22.6 (g) 23.4 (q) 29.0 (b) 34.0 (t) 35.1 (b ) 39.5 (b) 47.2 (d) 52.5 (g) 55.6 (u) 56.0 (q) 57.1 (d) 62.4 (b) 64.5 (d) 67.7 (d) 63.2 (d) 68.8 (b) 69.2 (d) 69.6 (b) 70.2 (d) 71.9 (d) 76.0 (d) 76.6 (d) 77.1 (u) 77.3 (d) 83.4 (S) '86.6 (d) 88.4 (s) 90.5 (b) 97.2 (d) 98.3 ( s) 99.0 (d) 99.6 (d) 103.8 (d) 107.6 (s) 112.5 (d) 123.1 (d) 124.9 (d) 130.1 (d) 131.5 (s) 134.9 (s) 136.7 (s) 144.0 (s) 147.2 (e) 153.8 (e) 154.4 {s) 155.0 (s) 160.7 (s) 166.4 (s) 191.8 (s) * Multiplicity q = quartet; d = doublet; U = indefinite t = triplet; s * singlet BBM-1675A2

Beschrijving: witte kristallen; smp. 1^7-1^9°CDescription: white crystals; mp. 1 ^ 7-1 ^ 9 ° C

Elementair analyse C: 52,71% H: 5,94% N: 3,94% S: 9,39% O(door verschil): 28,01% 8401572 -23-Elemental analysis C: 52.71% H: 5.94% N: 3.94% S: 9.39% O (by difference): 28.01% 8401572 -23-

Ultraviolet absorptie spectra: Instrument - Varian UV, Cary 219Ultraviolet absorption spectra: Instrument - Varian UV, Cary 219

Oplosmiddel: methanolSolvent: methanol

Concentratie : 0.02052 g/1 λ (nm) absorpties .Concentration: 0.02052 g / 1 λ (nm) absorbances.

max_ __ 320 12,2 282 16,3.max_ __ 320 12.2 282 16.3.

252 26,2 214 25,8252 26.2 214 25.8

Geen significante verandering met zuur of base.No significant change with acid or base.

Optische rotatie: [α]^ = -179Λ0 (c 0>5, CHCl^)Optical rotation: [α] ^ = -179Λ0 (c 0> 5, CHCl ^)

Infraroodspectra: Zie fig. 12Infrared spectra: See fig. 12

Instrument: Beckman IR Model U2U0Instrument: Beckman IR Model U2U0

Hoofd absorptie banden (KBr): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, .Main absorption bands (KBr): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735,.

2940, 2980, 3440, cm1.2940, 2980, 3440, cm1.

MassaSpectra: Instrument: VG-ZAB-2FMass Spectra: Instrument: VG-ZAB-2F

FAB-MS-thioglycerolFAB-MS-thioglycerol

Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1569; met toevoeging van -NaCl (m/z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593 FAB-MS-MB (MB: matrix, m.w. 154); Moleculaire massa bereik ionen (m/2): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587; met toevoeging van NaCl (m/z): 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577.Molecular mass range ions (m / z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1569; with addition of -NaCl (m / z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593 FAB-MS-MB (MB: matrix, i.e. 154); Molecular mass range ions (m / 2): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587; with addition of NaCl (m / z): 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577.

FAB-MS-glycerol-DMSO ; Moleculaire massa bereik ö Δ 0 1 K “7 Q ionen (m/z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, O 4 U I 0 / £ 1293f 1309/ 1325, 1326, 1341, 1353, 1369.FAB-MS-glycerol-DMSO; Molecular mass range ö Δ 0 1 K “7 Q ions (m / z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, O 4 U I 0 / £ 1293f 1309/1325, 1326, 1341, 1353, 1369.

-2b--2b-

Molecuulgewicht : Schijnbaar MW = 1248 ( gebaseerd op bovenbeschreven .Molecular weight: Apparent MW = 1248 (based on above described.

massa spectraal gegevens)mass spectral data)

Mafnetische kern- : 'Zie PIG. 13Mafnetic core: "See PIG. 13

Resonantie spectraResonance spectra

Instrument: WM 360 BruckerInstrument: WM 360 Brucker

Oplosmiddel ·: CDC1 ^ 1H'NMR 360 MHz δ(ρρπΐ): 11.91 (1H, s); 8.62 (1H, s); 7.58 (1H, s); 6.56 (1H, m); 6.22 (1H, s); 6.15 (1H, brs); 5.91 (1H, d, J=9.6); 5.83 (1H, d, J=9.6); 5.70 (1H, m); 5.45 (1H, d, J-2.2); 5.44 (1H, s), 5.34 (1H, brs); 4.95 (1H, d, J-10.2); 4.75 (1H, m); 4.65 (1H, d, J-6.8); 4.54 (1H, d, J=2.2); 4.47 (1H, m); 4.18 (1H, s); 4.10 (1H, brs), 4.05-3.50 (20-24H); [3.96 (3H, s); 3.87 (3H, s); 3.77 (3H, s)]; 3.46 (1H, m); 3.39 (3H, s); 2.79 (1H, m); 2.73 (2H, m); 2.50 (3H, s); 2.50 (1H, m); 2.38-2.22 (3H); 2.14 (1H, m); 2.10 (3H, s); 1.98 (2H, m) ; 1.65-1.45 (6-8H); 1.38 (3H, d, J-6.0); 1.34 (3H, d, J-6.0); 1.22 (3H, d, J-6.8)? 1.10 (6H).Solvent ·: CDC1 ^ 1H'NMR 360 MHz δ (ρρπΐ): 11.91 (1H, s); 8.62 (1H, s); 7.58 (1H, s); 6.56 (1H, m); 6.22 (1H, s); 6.15 (1H, brs); 5.91 (1H, d, J = 9.6); 5.83 (1H, d, J = 9.6); 5.70 (1H, m); 5.45 (1H, d, J-2.2); 5.44 (1H, s), 5.34 (1H, brs); 4.95 (1H, d, J-10.2); 4.75 (1H, m); 4.65 (1H, d, J-6.8); 4.54 (1H, d, J = 2.2); 4.47 (1H, m); 4.18 (1H, s); 4.10 (1H, brs), 4.05-3.50 (20-24H); [3.96 (3H, s); 3.87 (3H, s); 3.77 (3H, s)]; 3.46 (1H, m); 3.39 (3H, s); 2.79 (1H, m); 2.73 (2H, m); 2.50 (3H, s); 2.50 (1H, m); 2.38-2.22 (3H); 2.14 (1H, m); 2.10 (3H, s); 1.98 (2H, m); 1.65-1.45 (6-8H); 1.38 (3H, d, J-6.0); 1.34 (3H, d, J-6.0); 1.22 (3H, d, J-6.8)? 1.10 (6H).

13C NMR 90.3 MHz13C NMR 90.3 MHz

Zie FIG. 14 13See FIG. 14 13

In een afzonderlijke proef werd C-NMR-spectrum van gezuiverde BBM-1675 bepaald voor een monster, opgelost in CDCl^ (80 MHz). De belangrijkste pieken worden hierna aangegeven.In a separate run, C-NMR spectrum of purified BBM-1675 was determined for a sample dissolved in CDCl 4 (80 MHz). The main peaks are indicated below.

8401572 -25- BBM-1675A2 13.7 16.9 17.5 19.8 22.3 22.7 23.4 33.1 34,1 35.1 39.3 47.6 52.6 55.7 56.0 56.1 57.6 62.4 64.5 64.9 65.9 68.3 69.2 69.7 71.9 73.6 75.8 76.1 77.1 77.7 78.1 78.3 83.3 86.2 88.4 90.4 97.2 98.3 99.1 99.5 99.6 103.8 107.1 112.4 123.2 124.8 129.9 137.3 144.1 154.2 154.5 160.9 167.9 192.2 TABEL g8401572 -25- BBM-1675A2 13.7 16.9 17.5 19.8 22.3 22.7 23.4 33.1 34.1 35.1 39.3 47.6 52.6 55.7 56.0 56.1 57.6 62.4 64.5 64.9 65.9 68.3 69.2 69.7 71.9 73.6 75.8 76.1 77.1 77.7 78.1 78.3 83.3 86.2 88.4 90.4 97.2 98.3 99.1 99.5 99.6 103.8 107.1 112.4 123.2 124.8 129.9 137.3 144.1 154.2 154.5 160.9 167.9 192.2 TABLE g

Fysisch-chemisehe eigenschappen van BBM-1675 Ao, Aij; B-|, B2 _ A4_ B1 . B2Physical chemical properties of BBM-1675 Ao, Aij; B- |, B2 _ A4_ B1. B2

Smeltpunt (ontl.) 12s - i27*c 123 - i26*c 159 - I6i*c 156 - I59*cMelting point (dec.) 12s - i27 * c 123 - i26 * c 159 - I6i * c 156 - I59 * c

[a]*7 (c 0.5, CHCI3): -161«C -176“C -171’C -122*C[a] * 7 (c 0.5, CHCI3): -161 «C -176“ C -171’C -122 * C

Analfievonden : C: 54.55 54.65 Ξ: 6.46 6.29 N: 3.73 3.51 S: 7.49 3.07 m nn (E*^) s 253 (286) 253 (257) 2S3 (225) 248 (212) in MeOH 282 (153) 282 (153) 282 (140) 279 (141) 320 (122) 320 (117) 320 (104) 318 (103) in 0.01N HCl-MeOH : 253 (287) 253 (2S8) 253 (225) 248 (210) 282 (160) 282 (1S5) 282 (140) 279 (140) 320 (126) 320 (118) 320 (105) 318 (103) in 0.01H NaOH-MeOH s 252 (280) 252 (266) 252 (236) 248 (233) 283 (162) 283 (160) 283 (141) 278 (150) 318 (120) 318 (118) 318 (105) 318 (110)Analysis evenings: C: 54.55 54.65 Ξ: 6.46 6.29 N: 3.73 3.51 S: 7.49 3.07 m nn (E * ^) s 253 (286) 253 (257) 2S3 (225) 248 (212) in MeOH 282 (153) 282 ( 153) 282 (140) 279 (141) 320 (122) 320 (117) 320 (104) 318 (103) in 0.01N HCl-MeOH: 253 (287) 253 (2S8) 253 (225) 248 (210) 282 (160) 282 (1S5) 282 (140) 279 (140) 320 (126) 320 (118) 320 (105) 318 (103) in 0.01H NaOH-MeOHs 252 (280) 252 (266) 252 (236) (233) (283) (162) 283 (160) 283 (141) (278) (150) 318 (120) 318 (118) 318 (105) 318 (110)

Dunnelaagchromatografie (TLC) en hoge capaciteit vloeistof chromatografie (HPLC) gegevens betreffende BBM-1675 componenten_ A._Studie Nr. 1 - Samenvatting 8401572 -26-Thin layer chromatography (TLC) and high capacity liquid chromatography (HPLC) data concerning BBM-1675 components_ A._Studie Nr. 1 - Summary 8401572 -26-

Tabel H TLC en HPLC van BBM-1675 componenten _TLC (Rf)_ HPLC ( retentietijd, in minuten)__Table H TLC and HPLC of BBM-1675 components _TLC (Rf) _ HPLC (retention time, in minutes) __

SiO^ ^Gesilanizeerd Lichtosorb RP-18 CHCl3-MeOH CH3CN-H20 CH3CN-MeOH-0.1M CH3COONH4 (5:1 v/v) (75:25 v/v) (5:2:3 v/v) BBM-1675A1 0.74 0.18 13.3 3BM-16 7'5A2 0.71 0.21 17.3 BBM-1675A3 0.72 0.28 8.0 BBM-16 75A. 0.71 0.78 5.1 4 BBM-1675B1 0.63 0.23 BBM-1675B2 0.60 0.16 * C^g omgekeerde fase silicagel B. Studie nr. 2 - TLC en HPLC voor gezuiverde A^- en Ag-componenten TLC-chromatografieSiO ^ ^ Silanized Lichtosorb RP-18 CHCl3-MeOH CH3CN-H20 CH3CN-MeOH-0.1M CH3COONH4 (5: 1 v / v) (75:25 v / v) (5: 2: 3 v / v) BBM-1675A1 0.74 0.18 13.3 3BM-16 7'5A2 0.71 0.21 17.3 BBM-1675A3 0.72 0.28 8.0 BBM-16 75A. 0.71 0.78 5.1 4 BBM-1675B1 0.63 0.23 BBM-1675B2 0.60 0.16 * C ^ g reverse phase silica gel B. Study No. 2 - TLC and HPLC for purified A ^ and Ag components TLC chromatography

Voor alle normale fasechromatografie werden Analtech GHLF silicagel uniplaten toegepast. De platen met een afmeting van 2,5 x 10 cm werden 5 voor ééndimensionaal TLC gebruikt. Zij werden ontwikkeld in glazen cilinders met afmetingen van 6,1+ cm (buitendiameter) x 12 cm en bevatten 10 ml eluent. Platen met afmetingen van 7,5 x 10 cm werden voor twee dimensionaal TLC toegepast. Het monster werd op de onderste linkerhoek 1 cm van de ran-ij den aangebracht. De plaat werd eerst in een tank (breedte 12,7 cm, diep- 10 te 8,6 cm, hoogte 30 cm) die 50 ml van de eerste eluent bevatte ontwikkeld.Analtech GHLF silica gel uniplates were used for all normal phase chromatography. The 2.5 x 10 cm plates were used for one-dimensional TLC. They were developed in glass cylinders with dimensions of 6.1+ cm (outer diameter) x 12 cm and containing 10 ml of eluent. Plates measuring 7.5 x 10 cm were used for two dimensional TLC. The sample was applied to the bottom left corner 1 cm from the edges. The plate was first developed in a tank (width 12.7 cm, depth 8.6 cm, height 30 cm) containing 50 ml of the first eluent.

8401572 -27-8401572 -27-

De plaat werd daarna aan de lucht gedroogd, 90° tegen de klok in gedraaid, en in een tweede houder die 50 ml van de tweede eluent bevatte, ontwikkeld.The plate was then air dried, rotated 90 ° counterclockwise, and developed in a second container containing 50 ml of the second eluent.

Whatman-analytische voorbeklede C-18-silicagel-platen werden voor alle omgekeerde fase-chromatografie toegepast. Platen met afïnetingen van 5 2,5 cm x 7,6 cm werden in glazen cilinders met 10 ml eluent ontwikkeld.Whatman analytical pre-coated C-18 silica gel plates were used for all reverse phase chromatography. Plates with dimensions of 2.5 cm x 7.6 cm were developed in glass cylinders with 10 ml of eluent.

Eerst werden normale platen onder 25^ nm UV-licht bekeken. De platen werden vervolgens in een glazen cilinder (6,U cm buitendiameter x 12 cm) gebracht en na ongeveer 2 minuten opnieuw onderzocht. Omgekeerde faseplaten werden alleen onder 25^ nm UV-licht bekeken. Zones werden gede-10 tecteerd door te letten op uitdoving van de fluirescentie van een geïmpregneerde kleurstof.Normal plates were first viewed under 25 µm UV light. The plates were then placed in a glass cylinder (6.1 cm outside diameter x 12 cm) and re-examined after about 2 minutes. Inverted phase plates were only viewed under 25 µm UV light. Zones were detected by watching for quenching of the fluorescence of an impregnated dye.

Analytisch HPLCAnalytical HPLC

De volgende componenten werden toegepast om een analytisch HPLC-systeem te construeren: Waters Associates Model 6000A oplosmiddel afgifte-15 systeempomp: Varian Varichrom Model WV-10 uv/vis Detector ingesteld op 25^ nm 0,1 buitendiameter; Fisher Recordal Series 5000 Recorder; Waters Associates Model 660 oplosmiddel Programmer; Waters Associates Model UÖK injector; Alltechj^m-Bondapak C^g (10 ^,um) kolom (U,6 mm inwendige diameter x 25 cm) met een Whatman Co. Pell 0DS (0,03-0,038 mm) waakkolom 20 {k,6 mm inwendige diameter x 5 cm). De componenten werden verbonden met 316 roestvrij stalen buizen (1,6 mm buitendiameter - 0,23 mm binnendiame-ter). Voor alle analyses werd de eluent met 2 ml per minuut ingepompt.The following components were used to construct an analytical HPLC system: Waters Associates Model 6000A Solvent Release-15 System Pump: Varian Varichrom Model WV-10 uv / fish Detector set at 25 µm 0.1 outer diameter; Fisher Recordal Series 5000 Recorder; Waters Associates Model 660 Solvent Programmer; Waters Associates Model UÖK injector; Alltechj ^ m-Bondapak C ^ g (10 ^ um) column (U, 6 mm internal diameter x 25 cm) with a Whatman Co. Pell 0DS (0.03-0.038 mm) guard column 20 (k, 6 mm internal diameter x 5 cm). The components were connected with 316 stainless steel tubes (1.6mm outside diameter - 0.23mm inside diameter). For all analyzes, the eluent was pumped in at 2 ml per minute.

Preparatieve HPLCPreparative HPLC

De volgende componenten werden toegepast om een mediumdruk vloei-25 stof chromatografiesysteem te construeren: Fluid Metering, Inc. Model RP-SY 2CSC FMI Lab Pump; Fluid Metering, Inc. Model PD-60LF FMI pulsdemper; een 15 ml monsterlus gemaakt van polypropeen buizen (3,0 mm buitendiameter x 1,5 mm binnendiameter) gewikkeld om een kartonnen buis (8,65 cm buitendiameter); Glenco Series 3500 Universal LC kolommen; Instrument 30 Specialties Co. Model UA-5 absorptie/fluorescentie Monitor met een Type 6 optische eenheid; Instrumentation Specialties Co. Model 590 stroomonder-brekerklep; en een Instrumentation Specialties 'Co. Model 328 fractiever-zamelaar. De componenten werden verbonden met polypropeen en Teflon-buizen (3,0 buitendiameter x 1,5 mm binnendiameter) en Glenco Multifit Connectors 35 en kleppen in de vermelde volgorde.The following components were used to construct a medium pressure liquid chromatography system: Fluid Metering, Inc. Model RP-SY 2CSC FMI Lab Pump; Fluid Metering, Inc. Model PD-60LF FMI pulse damper; a 15 ml sample loop made of polypropylene tubes (3.0 mm outer diameter x 1.5 mm inner diameter) wrapped around a cardboard tube (8.65 cm outer diameter); Glenco Series 3500 Universal LC columns; Instrument 30 Specialties Co. Model UA-5 Absorption / Fluorescence Monitor with a Type 6 Optical Unit; Instrumentation Specialties Co. Model 590 circuit breaker valve; and an Instrumentation Specialties' Co. Model 328 fraction collector. The components were joined with polypropylene and Teflon tubes (3.0 outside diameter x 1.5mm inside diameter) and Glenco Multifit Connectors 35 and valves in the order listed.

8401572 -28-8401572 -28-

De Glencoserie 3500 Universal LC-kolommen werd met het gedefinieerde ahsorptiemiddel onder toepassing van standaardtechnieken in het aangegeven oplosmiddel gesuspendeerd. De ledige ruimte tussen het vaste bed en de bovenkant van de buis werd met standaard Ottawa-zand gevuld. De eluent 5 werd verpompt met een maximale snelheid waarbij een 60 psi terugdruk (ongeveer 20 ml/minuut) niet zou worden overschreden.The Glencoserie 3500 Universal LC columns were suspended with the defined absorbent using standard techniques in the indicated solvent. The void between the fixed bed and the top of the tube was filled with standard Ottawa sand. The eluent 5 was pumped at a maximum rate at which a 60 psi back pressure (about 20 ml / minute) would not be exceeded.

GradiëntelutieGradient elution

Voor alle gradiënteluties werd een Glenco-gradiënt-elutie-inrich-ting, bestaande uit twee kamers van gelijke diameter, hoogte en volume die 10 in tanden met een Reflonklep was verbonden, toegepast. Een kamer diende als mengkamer en één als een statisch reservoir. Het minder polaire oplosmiddel werd aanvankelijk in de mengkamer bewaard. Het meer polaire oplosmiddel werd in de statische kamer bewaard. In beide kamers werden met Teflon beklede magnetische roerstaven (1,0 x 3,7 cm) aangebracht, die door 15 middel van Thomas-Model 15 mange-matic roerders werden aangedreven. De eluent werd via polypropeenbuizen (1,5 mm inwendige diameter x 3,0 mm uitwendige diameter) uit de mengkamer naar het mediumdruk HPL-systeem gepompt. Naarmate eluent uit de mengkamer werd verwijderd, kon dit zonder belemmering door het oplosmiddel uit het statisch reservoir worden vervangen, waar-20 door een lineaire gradiënt van de eluent werd verkregen.For all gradient elutions, a Glenco gradient elution device consisting of two chambers of equal diameter, height and volume connected in teeth with a Reflon valve was used. One chamber served as a mixing chamber and one as a static reservoir. The less polar solvent was initially stored in the mixing chamber. The more polar solvent was stored in the static chamber. Both chambers were fitted with Teflon-coated magnetic stirrers (1.0 x 3.7 cm), which were driven by Thomas-Model 15 manematic stirrers. The eluent was pumped from the mixing chamber to the medium pressure HPL system via polypropylene tubes (1.5 mm inner diameter x 3.0 mm outer diameter). As eluent was removed from the mixing chamber, it could be replaced without hindrance by the solvent from the static reservoir, whereby a linear gradient of the eluent was obtained.

TLC-analyse van BM-1675 A.j en AgTLC analysis of BM-1675 A.j and Ag

Samengevat in tabel I zijn de waargenomen FL-waarden voor BBM-1675 Γ A.| en A2 op normale faseplaten, De wordt berekend door de gemeten afstand van het centrum van een zone vanaf het punt waarop het monster is aan-25 gebracht door de gemeten afstand van het oplosmiddelfront vanaf het punt van monsteraanbrenging te delen.Summarized in Table I, the observed FL values for BBM-1675 are Γ A. | and A2 on normal phase plates, The is calculated by dividing the measured distance from the center of a zone from the point at which the sample is applied by dividing the measured distance from the solvent front from the point of sample application.

TABEL ITABLE I

Rf BBM-1675A. BBM-1675A2RF BBM-1675A. BBM-1675A2

Systeem/verbinding 1 4% methanol in chloroform 0,33 0,30 5% methanol in diethylsether 0,39 50% aceton in Skellysolve B 0,38 0,31 8401572 -29-System / compound 1 4% methanol in chloroform 0.33 0.30 5% methanol in diethyl ether 0.39 50% acetone in Skellysolve B 0.38 0.31 8401572 -29-

Samengevat in tabel J zijn de waargenomen R -waarden van BBM-16T5 en Ag op normale faseplaten, die in twee dimensies zijn ontwikkeld.Summarized in Table J are the observed R values of BBM-16T5 and Ag on normal phase plates developed in two dimensions.

De plaats van de vlekken wordt uitgedrukt in Cartesiaanse coördinaten.The location of the spots is expressed in Cartesian coordinates.

De X-coördinaat- is de R^-waarde van het tweede vermelde oplosmiddelsysteem.The X coordinate is the R ^ value of the second solvent system mentioned.

5 De Y-coördinaat betreft de R^-waarden van het eerste vermelde oplosmiddel-systeem.5 The Y coordinate refers to the R ^ values of the first solvent system mentioned.

TABEL JTABLE J

RfRf

Systeem/verbinding ' BBH-1675A1 BBM-1675A2 4% methanol in chloroform vs 5% methanol in diethyls ether (0,34/ 0,33) (0,28, 0,23) 4% methanol in chloroform vs 50% aceton in Skellysolve B (0,33, 0,29)System / compound 'BBH-1675A1 BBM-1675A2 4% methanol in chloroform vs 5% methanol in diethyl ether (0.34 / 0.33) (0.28, 0.23) 4% methanol in chloroform vs 50% acetone in Skellysolve B (0.33, 0.29)

Samengevat in tabel K zijn de waargenomen R -waarden voor BBM-16T5 Γ A1 en Ag op C—18 omgekeerde fase TLC-platen, in binaire eluenten ontwikkeld.Summarized in Table K, the observed R values for BBM-16T5 Γ A1 and Ag on C-18 reverse phase TLC plates were developed in binary eluents.

TABEL ,KTABLE, K

si 0 ^ . B3M-1675A. BBM-1675A-si 0 ^. B3M-1675A. BBM-1675A-

Systeem/verbinding . 1 2 25% 0.5 M NaCl in acetonitril 0,18 0,21 25% water in acetonitril 0,00 0,00System / connection. 1 2 25% 0.5 M NaCl in acetonitrile 0.18 0.21 25% water in acetonitrile 0.00 0.00

Samengevat in tabel L zijn de waargenomen R -waarden van BBM-1Ö75 J? A.j en Ag op C-18 omgekeerde fase TLC-platen, ontwikkeld met ternaire eluen- 8401572 -30- ten .Summarized in Table L are the observed R values of BBM-1Ö75 J? A.j and Ag on C-18 reverse phase TLC plates developed with ternary eluents 8401572-30.

TABEL LTABLE L

RfRf

Systeem/verbinding B3M-1675A^ BBM-1675A2System / connection B3M-1675A ^ BBM-1675A2

Acetonitril : Methanol : 0.5M NaCl 80% : 10% : 10% 1,00 1,00 60% : 10% : 30% 0,57 0,50 40% : 30% : 30% 0,32 0,22 30% : 50% : 20% 0,44 0,33 50% : 30% : 20% 0,62 0,54 40% : 40% : 20% 0,60 0,49 50% : 20% : 20% 0,42 0,34 60% : 20% : 20% 0,74 0,69Acetonitrile: Methanol: 0.5M NaCl 80%: 10%: 10% 1.00 1.00 60%: 10%: 30% 0.57 0.50 40%: 30%: 30% 0.32 0.22 30 %: 50%: 20% 0.44 0.33 50%: 30%: 20% 0.62 0.54 40%: 40%: 20% 0.60 0.49 50%: 20%: 20% 0 .42 0.34 60%: 20%: 20% 0.74 0.69

Acetonitril : Methanol : water 40% : 30% : 30% 0,00 0,00Acetonitrile: Methanol: Water 40%: 30%: 30% 0.00 0.00

Acetonitril : Methanol : 0.1M NH^OAc 40% : 30% : 30% 0,32 0,22Acetonitrile: Methanol: 0.1M NH 4 OAc 40%: 30%: 30% 0.32 0.22

Acetonitril : Methanol : 0.1M NaHjPO^ 40% : 30% : 30% 0,00 0,00 HPLC-analyse van BBM-1675 A^ en A^ BBM-1675 A^ en BBM-1Ö75 A^ werden onder toepassing van enkelvoudige, binaire en ternaire eluenten op C—18 omgekeerde fase-silicagelkolom geanalyseerd. Samengevat in tabellen Μ, N en 0 zijn de waargenomen K’-waarden voor deze verbindingen. De K’ werd berekend via de volgende formule K' = TR-To To waarin TR de retentietijd is, gemeten vanaf de injectietijd tot de top van 8401572 -31- de piek terwijl TO de lege volumetijd is.Acetonitrile: Methanol: 0.1M NaHjPO ^ 40%: 30%: 30% 0.00 0.00 HPLC analysis of BBM-1675 A ^ and A ^ BBM-1675 A ^ and BBM-1075 A ^ were used using single , binary and ternary eluents on C-18 reverse phase silica gel column analyzed. Summarized in Tables Μ, N and 0 are the observed K values for these compounds. The K 'was calculated using the following formula K' = TR-To To where TR is the retention time measured from the injection time to the peak of 8401572 -31- the peak while TO is the void volume time.

IAB.EL MIAB.EL M

ILIL

BBM-1675A, BBM-1675A-BBM-1675A, BBM-1675A-

Systeem/verbinding 1 cSystem / connection 1 c

Acetonitril a aAcetonitrile a a

Tetrahydrofuran a aTetrahydrofuran a a

Methanol 0,00 0,00 a = de verbinding werd niet uit de kolom geëlueerd.Methanol 0.00 0.00 a = the compound was not eluted from the column.

K/_K / _

Systeem/verbinding B3M-1675A1 B3M-1675A2 25% water in acetonitril a a 25% methanol in water 1,25 1,25 a = verbinding werd niet uit de kolom geëlueerd.System / compound B3M-1675A1 B3M-1675A2 25% water in acetonitrile a a 25% methanol in water 1.25 1.25 a = compound was not eluted from the column.

84 0 1 5 72 * -32- TABEL O Ternaire eluenten κι84 0 1 5 72 * -32- TABLE O Ternary eluents κι

Systeem/vertin ding 3BM-1675A^ BBM-1675A2System / Tinning 3BM-1675A ^ BBM-1675A2

Acetonitril : Methanol : water 40% : 30% : 30%. a aAcetonitrile: Methanol: Water 40%: 30%: 30%. a a

Acetonitril : Methanol : 0.1M NH^OAc 40% : 30% : 30% 1,7 3,0 50% : 20% : 30% 3,8 6,5 43,3% 23,3% : 33,3% 6,1 b 42,5% : 22,5% : 35,0% 7,8 b 41,5% : 21,5% : 37,0% 9,7 b a= werd. niet geëlueerd b= tiet bepaaldAcetonitrile: Methanol: 0.1M NH ^ OAc 40%: 30%: 30% 1.7 3.0 50%: 20%: 30% 3.8 6.5 43.3% 23.3%: 33.3% 6.1 b 42.5%: 22.5%: 35.0% 7.8 b 41.5%: 21.5%: 37.0% 9.7 ba =. not eluted b = tit determined

Biologische eigenschappen van BBM-l675-componentenBiological properties of BBM-1675 components

De anti-microhiële activiteit van de BBM-1675-componenten werd voor een verscheidenheid van bacteriën (grampositieve, gramnegatieve en zuur-vaste) en schimmels bepaald via de tweevoudige agar-verdunningsmethode.The anti-microhial activity of the BBM-1675 components was determined for a variety of bacteria (gram-positive, gram-negative and acid-solid) and fungi by the two-fold agar dilution method.

5 Een voedingsagarmedium werd toegepast voor grampositieve en gramnegatieve bacteriën en nr. 1001 medium (3%'s glycerol, 0,3% natrium L-glutamine, 0,2% pepton, 0,31% NagHPO^, 0,1% KHgPO^, 0,005% ammoniumcitraat, 0,001% MgSO^ en 1,5% agar) voor zuurvaste organismen. Voor schimmels werd Sabouraud agarmedium toegepast. Zoala aangetoond in tabel P gaf elke van 10 zes BBM-1675 componenten (A^, Ag, A^, A^, B^, Bg) een breed spectrum van antimicrobiële activiteit te zien. Met name BBM-1675 A^, Ag, A^ en A^ waren bijzonder actief tegen grampositieve bacteriën.5 A nutrient agar medium was used for gram-positive and gram-negative bacteria and No. 1001 medium (3% glycerol, 0.3% sodium L-glutamine, 0.2% peptone, 0.31% NagHPO4, 0.1% KHgPO4 0.005% ammonium citrate, 0.001% MgSO4 and 1.5% agar) for acid-fast organisms. Sabouraud agar medium was used for fungi. As shown in Table P, each of six BBM-1675 components (A ^, Ag, A ^, A ^, B ^, Bg) showed a broad spectrum of antimicrobial activity. In particular BBM-1675 A ^, Ag, A ^ and A ^ were particularly active against gram-positive bacteria.

6401572 -33-6401572 -33-

TABEL FTABLE F

Antimicrobiële activiteit van BBH-1675 componenten MIC in mca/mlAntimicrobial activity of BBH-1675 components MIC in mca / ml

Stam BBM-167S Ax Aj , Aj A4 _ B2 S. aureus 209P <0.0008 0.0063 0.0063 0.0125 0.012 0.0063 S. aureus Smith <0.0008 0.0031 0.0063 0.0125 0.012 0.012Stam BBM-167S Ax Aj, Aj A4 _ B2 S. aureus 209P <0.0008 0.0063 0.0063 0.0125 0.012 0.0063 S. aureus Smith <0.0008 0.0031 0.0063 0.0125 0.012 0.012

Bj_ subtilis PCI 219 <0.0008 0.05 0.0125 0.0125 0.05 0.05 M. lateus 1001 0.0016 0.0063 0.0125 0.0125 0.1 0.1 M, flavus <0.0008 0.0016 0.0063 0.0125 0.025 0.025Bj_ subtilis PCI 219 <0.0008 0.05 0.0125 0.0125 0.05 0.05 M. lateus 1001 0.0016 0.0063 0.0125 0.0125 0.1 0.1 M, flavus <0.0008 0.0016 0.0063 0.0125 0.025 0.025

Mycobacterium 607 0.05 0.1 NT NT 0.05 0.025 E. colt NIHJ 0.1 0.8 1.6 3.1’ 0.8 3.1 K. pneumoniae Dll 0.4 0.8 1.6 3.1 0.8 0.8 P. aeruginosa D15 0.8 1.6 1.6 3.1 3.1 3.1 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 1.6 6.3 3.1 1.6 C. neoformans 1.6 3.1 1.6 6.3 6.3 12.5Mycobacterium 607 0.05 0.1 NT NT 0.05 0.025 E. colt NIHJ 0.1 0.8 1.6 3.1 '0.8 3.1 K. pneumoniae Dll 0.4 0.8 1.6 3.1 0.8 0.8 P. aeruginosa D15 0.8 1.6 1.6 3.1 3.1 3.1 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 1.6 6.3 3.1 1.6 C. neoformans 1.6 3.1 1.6 6.3 6.3 12.5

Een tweede antimicrobiële proef werd uitgevoerd aan gezuiverd en Ag (als bereid in voorbeeld III) en aan de componenten A^ en A^. De gegevens worden hierna samengevat.A second antimicrobial test was performed on purified and Ag (as prepared in Example III) and on components A 2 and A 2. The data is summarized below.

MIC door ADT (mcg/ml)_.MIC by ADT (mcg / ml).

Stam BBM-1675 Αχ A2 Α3 λ4_ S. aureus 209P <0.0008 0.0063 0.0063 0.012 S. aureus Smith <0.0008 0.0031 0.0063 0.012Strain BBM-1675 Αχ A2 Α3 λ4_ S. aureus 209P <0.0008 0.0063 0.0063 0.012 S. aureus Smith <0.0008 0.0031 0.0063 0.012

Bj, subtiiis PCI 219 <0.0008 0.05 0.012 0.025 H. luteus 1001 0.0016 0*0063 0.012 0.05 M. flavus <0.0008 0.0016 0.0063 0.012Bj, subtiiis PCI 219 <0.0008 0.05 0.012 0.025 H. luteus 1001 0.0016 0 * 0063 0.012 0.05 M. flavus <0.0008 0.0016 0.0063 0.012

Mycobacterium 607 0.05 0.1 0.16 0.16 E. coli NIHJ 0.1 0*8 1*6 3.1 K. pneumoniae Dll 0.4 0.8 1.6 3.1 P. aeruginosa DIS 0.8 1.6 3.1 3;1 B. fragills A20928 0.2 1.6 0.2 0.4 C. difficile A21675 0.4 0.8 0.05 0.4 C. perfringens A9635 0.05 0.8 0.4 0.4 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 1.6 6.3 C. neoformans . 1.6 3.1 1.6 6.3Mycobacterium 607 0.05 0.1 0.16 0.16 E. coli NIHJ 0.1 0 * 8 1 * 6 3.1 K. pneumoniae Dll 0.4 0.8 1.6 3.1 P. aeruginosa DIS 0.8 1.6 3.1 3; 1 B. fragills A20928 0.2 1.6 0.2 0.4 C. difficile A21675 0.4 0.8 0.05 0.4 C. perfringens A9635 0.05 0.8 0.4 0.4 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 1.6 6.3 C. neoformans. 1.6 3.1 1.6 6.3

De activiteit van profaag inductie in lysogene bacteriën E. coli W 1709 ()\) werd bepaald voor BBM-1675-componenten volgens de methode van Lein et al in Nature 196: 783-78^· (1962). De plaque-telling werd uitgevoerd op agarplaten, die plaatmateriaal (T) en controleplaat (c) bevatten.The activity of propage induction in lysogenic bacteria E. coli W 1709 () \) was determined for BBM-1675 components according to the method of Lein et al in Nature 196: 783-78 ^ (1962). Plaque counting was performed on agar plates containing plate material (T) and control plate (c).

Een T/C-verhouding van de plaque-tellingen groter dan 3,0 werd als significant beschouwd en de lysogene inductie-activiteit (iLB-activiteit) werd uitgedrukt als de minimale induceerbare concentratie van de proefverbinding.A T / C ratio of the plaque counts greater than 3.0 was considered significant and the lysogenic induction activity (iLB activity) was expressed as the minimum inducible concentration of the test compound.

8401572 -3^-8401572 -3 ^ -

Zoals aangetoond in tabel Q, waren BBM-1675-componenten bijzonder ILB-ac-tief tegen de lysogene bacteriën, waardoor er aanwijzing is, dat zij anti-tumor-activiteit bezitten.As shown in Table Q, BBM-1675 components were particularly ILB active against the lysogenic bacteria, indicating that they have anti-tumor activity.

'tabel qTable q

Lysogene inductie activiteit van BBM-1675 componenten_Lysogenic induction activity of BBM-1675 components_

Antibioticum MIC* (mcg/inl) BBM-1675 h1 0,0063 BBM-1675 A2 0,0125 BBM-1675 A3 °>05 BBM-1675 A4 °>10· BBM-1675 B1 °»10 BBM-1675 B2 °/20 * minimale induceerbare concentratieAntibiotic MIC * (mcg / inl) BBM-1675 h1 0.0063 BBM-1675 A2 0.0125 BBM-1675 A3 °> 05 BBM-1675 A4 °> 10 · BBM-1675 B1 ° »10 BBM-1675 B2 ° / 20 * minimum inducible concentration

De anti-tumoractiviteit van BBM-1675 A^ en Ag werd in verschillende 5 muizetumorsystemen bepaald. Lymfocytische leukemie P-388, lymfoide leukemie L-1210, melanotisch melanoma B-16 en Lewis-longcarcinoom werden intra-peritoneaal bij mannetjes BDF -muizen geïmplanteerd bij een inoculum hoe-veelheid van resp. 10 , 10 , 5 x ΙΟ'5 en 10° cellen/muis. Gegradeerde doses van de proefverbindingen werden 2k uur na inoculeren van de tumor intraperi-10 toneaal aan de muizen toegediend. De behandelingen werden eenmaal op alleen de eerste dag, op dag 1, h en 7 (q3d x 3), eenmaal per dag gedurende 9 dagen (qd.1 —? 9) of 11 dagen (qd 1 —> 11) gegeven. De componenten A^ en A^ werden door gebrek aan materiaal alleen getest tegen P-388 leukemie op een q3d x 3 schema.The anti-tumor activity of BBM-1675 A and Ag was determined in different mouse tumor systems. Lymphocytic leukemia P-388, lymphoid leukemia L-1210, melanotic melanoma B-16 and Lewis lung carcinoma were implanted intraperitoneally in male BDF mice at an inoculum amount of resp. 10, 10, 5 x ΙΟ'5 and 10 ° cells / mouse. Graded doses of the test compounds were administered intraperitoneally to the mice 2 hours after inoculation of the tumor. The treatments were given once on the first day only, on days 1, h and 7 (q3d x 3), once a day for 9 days (qd.1 -? 9) or 11 days (qd 1 -> 11). Components A ^ and A ^ were only tested against P-388 leukemia on a q3d x 3 schedule due to lack of material.

15 BBM-1675 A1, Ag, A^ en A^ werden opgelost in 0,9^’s pekel, die 10% dimethylsulfoxyde bevatte en de als referentie toegepaste verbinding chromycine A^ (Tomycine Takeda) werd in 0,9%'s pekel opgelost. Afsterving of overleving van de behandelde en niet-behandelde muizen werd dagelijks geregistreerd, en de gemiddelde overlevingstijd (MST) voor elke tests (T) 20 en controle (C)-groepen berekend. Een T/C-waarde gelijk aan of niet groter dan 125% betekent, dat een significant anti-tumoreffekt werd bereikt.BBM-1675 A1, Ag, A ^ and A ^ were dissolved in 0.9 ^ brine containing 10% dimethyl sulfoxide and the reference compound chromycin A ^ (Tomycin Takeda) was dissolved in 0.9% brine dissolved. Dying or survival of the treated and untreated mice was recorded daily, and the mean survival time (MST) for each tests (T) and control (C) groups. A T / C value equal to or no greater than 125% means that a significant anti-tumor effect was achieved.

8401572 -35- ' De resultaten worden vermeld in de tabellen R, S, T, U, V enW, BBM-1675 A^ en A2 vertoonden een buitengewoon krachtige anti-tumor-activiteit tegen P-388 leukemie met een maximum T/C-waarde van 160$. Zij zijn uitgedrukt als minimum-effektieve dosis ongeveer 100-3000 x meer ac-5 tief dan chromycine A^. BBM-1675 A^ en waren evenwel minder actief dan de componenten A^ of Ag tegen P-388 leukemie (tabel S). BBM-1675 A^ en A^ waren eveneens actief tegen L—1210 leukemie (tabel U, B—16 melanoma (tabel V) en Lewis longcarcinoom (tabel W). De giftigheid van BBM-1675 A^ en Ag werd bepaald in mannetjes DDY-muizen door intraperitoneale of intrave-10 neuze toediening; hierbij bleek dat BBM-1675 A^ ongeveer 10 x giftiger was dan BBM-1675 Ag (tabel X). De therapeutische indices van BBM-1675 A en Ag waren ten opzichte van het P-388 leukemie-systeem (tabel Y) resp. U-8 en 8-20 x beter dan die van chromycine A^. Tweede proeven werden uitgevoerd door intraveneuze toediening van BBM-1675-componenten tegen P-388 en L- . . 5 ï+ 15 1210 leukemie, die intraveneus m een hoeveelheid van resp. 5 x 10 en 10 cellen per muis werden geinoculeerd. In deze proeven werd adrimycine als re- ferentiemiddel toegepast, dat werd opgelost in 0,9%'s pekel en toegediend op de dagen 1, !+ en 7. De resultaten worden vermeld in de tabellen Z en AA.8401572 -35- 'The results reported in Tables R, S, T, U, V and W, BBM-1675 A and A2 showed extremely potent anti-tumor activity against P-388 leukemia with maximum T / C - value of 160 $. They are expressed as a minimum effective dose about 100-3000 times more active than chromycin A ^. BBM-1675 A ^ and, however, were less active than the components A ^ or Ag against P-388 leukemia (Table S). BBM-1675 A ^ and A ^ were also active against L-1210 leukemia (Table U, B-16 melanoma (Table V) and Lewis lung carcinoma (Table W). The toxicity of BBM-1675 A ^ and Ag was determined in males DDY mice by intraperitoneal or intravenous-10 administration, found that BBM-1675 A ^ was approximately 10 times more toxic than BBM-1675 Ag (Table X) .The therapeutic indices of BBM-1675 A and Ag were compared to P-388 leukemia system (Table Y), U-8 and 8-20x better than that of chromycin A, respectively. Second experiments were performed by intravenous administration of BBM-1675 components against P-388 and L-. 5 + 15 1210 leukemia, which were inoculated intravenously in an amount of 5 x 10 and 10 cells per mouse, respectively. In these experiments, adrimycin was used as the reference agent, which was dissolved in 0.9% brine and administered on days 1,! + and 7. The results are shown in Tables Z and AA.

Beide componenten A^ en A^ waren beter dan adrimycine uitgedrukt in de ma- 20 ximum-T/C-waarde, de minimale effectieve dosis en het activiteitstraject.Both components A ^ and A ^ were better than adrimycin expressed in the maximum T / C value, the minimum effective dose and the activity range.

84015728401572

TABEL RTABLE R

Effect van bbm-1675 componenten op P-388 Leukemie (Dag 1 behandeling) -36-Effect of bbm-1675 components on P-388 Leukemia (Day 1 treatment) -36-

Gem. gew. Overlevenden Dosis ip <BT T/c wardering op (mqAq/dag1) (dagen) (%) dag 5 (<?) dag_5_ daS 45 BBM-1675 A1 0-03 19.0 (152) -2.6 5/5 0/5 0.01 19.0 (Ï5?) -1.0 5/5 0/5 0.003 18.0 ÓAA) -1.0 5/5 0/5 0.001 20.0 (l6Ö) -1.4 5/5 0/5 0.0003 16.0 (Hip 0.0 5/5 0/5 .Avg. wt. Survivors Dose ip <BT T / c rating at (mqAq / day1) (days) (%) day 5 (<?) Day_5_ daS 45 BBM-1675 A1 0-03 19.0 (152) -2.6 5/5 0/5 0.01 19.0 (Ï5?) -1.0 5/5 0/5 0.003 18.0 ÓAA) -1.0 5/5 0/5 0.001 20.0 (l6Ö) -1.4 5/5 0/5 0.0003 16.0 (Hip 0.0 5/5 0/5.

0.0001 15.0 120 -0.2 5/5 0/5 0.00003 14.0 112 -0.2 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0.3' 6.0 48 -3.8 3/5 0/5 0.1 20.0 ClsÖ) -1.8 5/5 0/5 0.03 18.0 (I4p -1.4 5/5 0/5 0.01 17.0 -0.6 5/5 0/5 0.003 17.0 (XÏÏ) -0.4 5/5 0/5 0.001 16.0 (ΐϊζ) 0.0 5/5 0/5 0.0003 15.0 120 0.0 5/5 0/5 0.0001 14.0 112 0.0 5/5 0/50.0001 15.0 120 -0.2 5/5 0/5 0.00003 14.0 112 -0.2 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0.3 '6.0 48 -3.8 3/5 0/5 0.1 20.0 ClsÖ) -1.8 5/5 0/5 0.03 18.0 (I4p -1.4 5/5 0/5 0.01 17.0 -0.6 5/5 0/5 0.003 17.0 (XII) -0.4 5/5 0/5 0.001 16.0 (ΐϊζ) 0.0 5/5 0/5 0.0003 15.0 120 0.0 5/5 0/5 0.0001 14.0 112 0.0 5/5 0/5

ChromomycineA^ 1 1910 (152) -0.2 4/5 0/5 0.3 17.0 (Uë) +0.6 5/5 0/5 0.1 16.0 (128) +0.8 5/5 0/5 0.03 14.0 112 0.0 5/5 0/5 0.01 14.0 112 -0.2 5/5 0/5ChromomycinA ^ 1 1910 (152) -0.2 4/5 0/5 0.3 17.0 (Uë) +0.6 5/5 0/5 0.1 16.0 (128) +0.8 5/5 0/5 0.03 14.0 112 0.0 5/5 0 / 5 0.01 14.0 112 -0.2 5/5 0/5

Drager - 12.5 - +0.1 10/10 0/10 8401572 dag 1, i.p.Carrier - 12.5 - +0.1 10/10 0/10 8401572 day 1, i.p.

Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

Effectvan B3M-167S componenten op P-388-Leukemie (Dagen l, 4 and 7 behandelingen)Effect of B3M-167S components on P-388 Leukemia (Days 1, 4 and 7 treatments)

T ABEL ST ABEL S

-37--37-

Gem. gew. Overleven-Avg. wt. Survive-

Dosig ip hst t/c verandering op den op (rwAg/dag*) (dagen) (%> dag5 (g) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.03 7.0 56 -2.8 5/5 0/5 0.01 19.0 , 1?D -1.0 5/5 0/5 0.003 19.0 ίίίΌ -0.6 5/5 0/5 0.001 16.0 (128) -0.6 5/5 0/5 0.0003 17.0 (lis) -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 /128) -0.2 5/5 0/5 0.00003 14.0 112 +0.4 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0.3 tox. - - 2/5 0/5 0.1 11.0 88 -1.0 5/5 0/5 0.03 18.0 . /f44) -1.2 5/5 0/5 0.01 18.0 ÓJO -0.4 5/5 0/5 0.003 18.0 CuO -0.4 5/5 0/5 0.001 17.0 ' (Up -0.4 5/5 0/5 0.0003 16.0 /128) -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 (12jp -0.2 5/5 0/5 0.00003 15.0 120 -0.4 5/5 0/5 BBM-1675 A3 0.01 17.5 (140) +0.2 4/4 0/4 0.001 15.0 120 +0.6 4/4 0/4 0.0001 13.5 108 +0.6 4/4 0/4 BBM-1675 A4 0.01 16.5 /13?) +0.2 4/4 0/4 0.001 14.0 112 +0.4 4/4 0/4 0.0001 12.5 100 +0.6 4/4 0/4Dose ip hst t / c change on den on (rwAg / day *) (days) (%> day5 (g) day 5 day 45 BBM-1675 Αχ 0.03 7.0 56 -2.8 5/5 0/5 0.01 19.0, 1? D -1.0 5/5 0/5 0.003 19.0 ίίίΌΌ -0.6 5/5 0/5 0.001 16.0 (128) -0.6 5/5 0/5 0.0003 17.0 (lis) -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 / 128 ) -0.2 5/5 0/5 0.00003 14.0 112 +0.4 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0.3 tox. - - 2/5 0/5 0.1 11.0 88 -1.0 5/5 0/5 0.03 18.0. / f44) -1.2 5/5 0/5 0.01 18.0 ÓJO -0.4 5/5 0/5 0.003 18.0 CuO -0.4 5/5 0/5 0.001 17.0 '(Up -0.4 5/5 0/5 0.0003 16.0 / 128 ) -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 (12jp -0.2 5/5 0/5 0.00003 15.0 120 -0.4 5/5 0/5 BBM-1675 A3 0.01 17.5 (140) +0.2 4/4 0/4 0.001 15.0 120 +0.6 4/4 0/4 0.0001 13.5 108 +0.6 4/4 0/4 BBM-1675 A4 0.01 16.5 / 13?) +0.2 4/4 0/4 0.001 14.0 112 +0.4 4/4 0/4 0.0001 12.5 100 +0.6 4/4 0/4

Chromoraycire A^ 0.3 18.0 /lTj) +0.6 5/5 1/5 0.1 18.0 (144) +0.6 5/5 0/5 0.03 17.0 (Ojp -0.2 5/5 0/5 0.01 14.0 112 0.0 5/5 0/5Chromoraycire A ^ 0.3 18.0 / lTj) +0.6 5/5 1/5 0.1 18.0 (144) +0.6 5/5 0/5 0.03 17.0 (Ojp -0.2 5/5 0/5 0.01 14.0 112 0.0 5/5 0 / 5

Drager - 12.5 - +0.4 10/10 0/10 *Dagen 1, 4 en 7, i.p.Carrier - 12.5 - +0.4 10/10 0/10 * Days 1, 4 and 7, i.p.

Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

84015728401572

Effect van bbm-1675 componenten op P-388 Leukemie (cd 1—9 Behandelingen) -38-Effect of BBM-1675 components on P-388 Leukemia (CD 1—9 Treatments) -38-

T A B E L TT A B E L T

Gem. gew. Overleven- t, . . verandering den opAvg. wt. Survivor,. . change den on

Dosis, ip mst T/C op ö (mq/kq/dag1) (dags) (%) dag 5 (q) dag 5_ dag 45 BBM-1675 Αχ 0.01 7.0 56 -1. 8 5/5 0/5 0.003 13.0 104 -1.0 5/5 0/5 0.001 19.0 </l52) -1.2 5/5 0/5 0.0003 19.0 (Up -0.8 5/5 0/5 0.0001 18.0 (ΐΰ) 0.0 5/5 0/5 0.00003 16.0 (128) +0.2 5/5 0/5 1 0.00001 16.0 (128) -0.2 5/5 0/5 Β3Μ-1675 Α2 0.1 6.0 48 -2.2 4/5 0/5 0.03 13.0 104 -1.4 5/5 0/5 0.01 18.0 /144) -1.0 5/5 0/5 0.003 18.0 (Up -0.6 5/5 0/5 0.001 18.0 (144) -0.8 5/5 0/5 0.0003 17.0 (HP -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 (Op -0.4 5/5 0/5 0.00003 15.0 120 -0.6 5/5 0/5.Dose, ip mst T / C at ö (mq / kq / day1) (day) (%) day 5 (q) day 5_ day 45 BBM-1675 Αχ 0.01 7.0 56 -1. 8 5/5 0/5 0.003 13.0 104 -1.0 5/5 0/5 0.001 19.0 </ l52) -1.2 5/5 0/5 0.0003 19.0 (Up -0.8 5/5 0/5 0.0001 18.0 (ΐΰ) 0.0 5/5 0/5 0.00003 16.0 (128) +0.2 5/5 0/5 1 0.00001 16.0 (128) -0.2 5/5 0/5 Β3Μ-1675 Α2 0.1 6.0 48 -2.2 4/5 0/5 0.03 13.0 104 -1.4 5/5 0/5 0.01 18.0 / 144) -1.0 5/5 0/5 0.003 18.0 (Up -0.6 5/5 0/5 0.001 18.0 (144) -0.8 5/5 0/5 0.0003 17.0 ( HP -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 (At -0.4 5/5 0/5 0.00003 15.0 120 -0.6 5/5 0/5.

0.00001 15.0 120 +0.4 5/5 . 0/50.00001 15.0 120 +0.4 5/5. 0/5

Chromomyciie A^ 0.3 9.0 72 -2.0 5/5 0/5 0.1 18.0 ./144) +0.4 5/5 0/5 0.03 18.0 (HP O-Ο 5/5 0/5 0.01 15.0 120 -0.2 5/5 0/5 0.003 13.0 104 -0.2 5/5 0/5Chromomycia A ^ 0.3 9.0 72 -2.0 5/5 0/5 0.1 18.0 ./144) +0.4 5/5 0/5 0.03 18.0 (HP O-Ο 5/5 0/5 0.01 15.0 120 -0.2 5/5 0 / 5 0.003 13.0 104 -0.2 5/5 0/5

Drager - 12.5 - +0.4 10/10 0/10 8401572 qd i.p.Carrier - 12.5 - +0.4 10/10 0/10 8401572 qd i.p.

Cirkel geeft een significante antitumoractiviteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

TABEL UTABLE U

-39- sffectvan bbh-1675 componenten op L-121Q Leukemie-39- Effect of BBH-1675 components on L-121Q Leukemia

Gem. gew. Overleven- M._ . verandering den opAvg. wt. Survive- M._. change den on

Dosis 1451 T/c op (mq/kq/dag*) (dagen) (%) dag 5 (q) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.003 14.5 (βζ) -1.7 6/6 0/6 0.001 12.0 (l2fp -0.5 6/6 1/6 0.0003 12.0 (Πδ) +0.3 6/6 0/6 0.0001 11.0 116 +1.0 6/5 0/6 BBM-1675 A2 , 0.03 10.5 111 -1.5 6/6 ' 0/6 0.01 13.5 (142) -1.2 6/6 0/6 0.003 13.0 (lij) -0.2 6/6 0/6 0.001 11.0 116 +1.3 6/6 0/6 0.0003 10.5 111 +1.0 6/6 0/6Dose 1451 T / c on (mq / kq / day *) (days) (%) day 5 (q) day 5 day 45 BBM-1675 Αχ 0.003 14.5 (βζ) -1.7 6/6 0/6 0.001 12.0 (l2fp -0.5 6/6 1/6 0.0003 12.0 (Πδ) +0.3 6/6 0/6 0.0001 11.0 116 +1.0 6/5 0/6 BBM-1675 A2, 0.03 10.5 111 -1.5 6/6 '0/6 0.01 13.5 (142) -1.2 6/6 0/6 0.003 13.0 (lij) -0.2 6/6 0/6 0.001 11.0 116 +1.3 6/6 0/6 0.0003 10.5 111 +1.0 6/6 0/6

Chromomvcire A^ 0.3 8.5 89 -1.2 6/6 0/6 0.1 11.5 121 +1.2 6/6 0/6 0.03 11.0 116 +1.2 ' 6/6 0/6 0.01 11.0 116 +1.3 6/6 0/6 0.003 10.0 105 +1.5 6/6 0/6Chromomvcire A ^ 0.3 8.5 89 -1.2 6/6 0/6 0.1 11.5 121 +1.2 6/6 0/6 0.03 11.0 116 +1.2 '6/6 0/6 0.01 11.0 116 +1.3 6/6 0/6 0.003 10.0 105 +1.5 6/6 0/6

Drager - 9.5 - +1.4 12/12 0/12 * qd l-*-9, i.p.Carrier - 9.5 - +1.4 12/12 0/12 * qd l - * - 9, i.p.

Cirkel geeft een significante antitumoractiviteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

84015728401572

Effect vaflBBM-1675 componenten op BI6 Melanoma -1+0-Effect of vBlBBM-1675 components on BI6 Melanoma -1 + 0-

TAB E L VTAB E L V

Gem. gev. Overleven- ' Dosis «ST t/c ^rendering dan op (mq/kq/dag*) . (dagen) (%) dag 5 (q) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.003 10.0 61 -0.7 6/6 0/6 0.001 31.5 (ÜT? 0.0 ' 6/6 0/6 0.0003 40.5 (2 Al) +0.3 6/6 0/6 0.0001 27.0 (164? +0.8 6/6 0/6 0.00003 22.0 (Uj) +1.8 6/6 0/6 0.00001 18.0 109 +2.2 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.03 11.0 67 -0.8 6/6 0/6 0.01 26.5 (m? +0.3 6/6 0/6 0.003 29.5 (179? +0.2 6/6 0/6 0.001 26.0 (158? +0.8 6/6 0/6 0.0003 22.0 (ffP +0.2 6/6 0/6 0.0001 18.0 109 +0.2 6/6 0/6 0.00003 17.0 103 +1.7 6/6 0/6Avg. found. Survive- 'Dose «ST t / c ^ rendering then on (mq / kq / day *). (days) (%) day 5 (q) day 5 day 45 BBM-1675 Αχ 0.003 10.0 61 -0.7 6/6 0/6 0.001 31.5 (ÜT? 0.0 '6/6 0/6 0.0003 40.5 (2 Al) + 0.3 6/6 0/6 0.0001 27.0 (164? +0.8 6/6 0/6 0.00003 22.0 (Uj) +1.8 6/6 0/6 0.00001 18.0 109 +2.2 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.03 11.0 67 -0.8 6/6 0/6 0.01 26.5 (m? +0.3 6/6 0/6 0.003 29.5 (179? +0.2 6/6 0/6 0.001 26.0 (158? +0.8 6/6 0/6 0.0003 22.0 (ffP +0.2 6/6 0/6 0.0001 18.0 109 +0.2 6/6 0/6 0.00003 17.0 103 +1.7 6/6 0/6

Chromomyciffi A^ 0.1 25.5 +2.3 6/6 0/6 0.03 23.0 (139? +2.2 6/6 0/6 0.01 21.0 (L27? +2.3 6/6 0/6 0.003 18.0 109 +2.2 6/6 0/6Chromomyciffi A ^ 0.1 25.5 +2.3 6/6 0/6 0.03 23.0 (139? +2.2 6/6 0/6 0.01 21.0 (L27? +2.3 6/6 0/6 0.003 18.0 109 +2.2 6/6 0/6

Drager - 16.5 - +2.1 12/12 0/12 * qd l-*-9, i.p.Carrier - 16.5 - +2.1 12/12 0/12 * qd l - * - 9, i.p.

Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

8401572 -Ui-8401572 -Ui-

TABEL WTABLE W

Effect "van bbm-1675 componenten op Lewis long CarcinoomEffect "of bbm-1675 components on Lewis lung Carcinoma

Gem. gew. Overleven- t. . m verandering den opAvg. wt. Survivor t. . m change up

Dosis MST T/C & * (inq/kq/dag*) .(dagen) (%) lag 5 (g) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.003 10.0 91 -1.7 5/6 0/6 0.001 31.5 (286) -0.7 6/6 1/6 0.0003 21.5 (I9p -0.7 6/6 0/6 0.0001 21.0 (Ï9Ï) +1.0 6/6 0/6 0.00003 13.0 118 +1.0 6/6 0/6 0.00001 11.5 105 +1.0 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.03 10.0 91 -1.8 6/6 0/6 0.01 25.5 /132) -1.7 6/6 0/6 0.003 28.5 (Up 0.0 6/6 1/6 0.001 17.0 (155) -0.3 6/6 0/6 0.0003 15.0 (136) +1.2 6/6 0/6 0.0001 10.5 95 +0.5 6/6 0/6 0.00003 11.0 100 +0.8 6/6 0/6Dose MST T / C & * (inq / kq / day *). (Days) (%) lag 5 (g) day 5 day 45 BBM-1675 Αχ 0.003 10.0 91 -1.7 5/6 0/6 0.001 31.5 (286 ) -0.7 6/6 1/6 0.0003 21.5 (I9p -0.7 6/6 0/6 0.0001 21.0 (Ï9Ï) +1.0 6/6 0/6 0.00003 13.0 118 +1.0 6/6 0/6 0.00001 11.5 105 +1.0 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.03 10.0 91 -1.8 6/6 0/6 0.01 25.5 / 132) -1.7 6/6 0/6 0.003 28.5 (Up 0.0 6/6 1/6 0.001 17.0 (155) -0.3 6/6 0/6 0.0003 15.0 (136) +1.2 6/6 0/6 0.0001 10.5 95 +0.5 6/6 0/6 0.00003 11.0 100 +0.8 6/6 0/6

Chromomyciie A^ 0.1 21.5 /lip +1.2 6/6 1/6 0.03 17.0 (lip +1.7 5/5 0/5 0.01 17.0 (lip +1.5 6/6 0/6 0.003 11.5 105 +1.7 6/6 0/6Chromomycia A ^ 0.1 21.5 / lip +1.2 6/6 1/6 0.03 17.0 (lip +1.7 5/5 0/5 0.01 17.0 (lip +1.5 6/6 0/6 0.003 11.5 105 +1.7 6/6 0/6

Drager - 1112/12 1/12 * qd 1-11, i.p.Carrier - 1112/12 1/12 * qd 1-11, i.p.

Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

8401572 _i|2-8401572 _i | 2-

TABEL XTABLE X

Giftighgid - van BBM-1675 componenten - LD50 (mg/kg/dag)Toxic Guide - from BBM-1675 components - LD50 (mg / kg / day)

Multiple dosisMultiple dose

Enkele dosis (qd 1*9) i.p. ' i.v ' ' i.p.___ BBM-1675 Αχ 0.019 0.010 0.00046 BBM-1675 A2 0.18 0.10 0.0072Single dose (qd 1 * 9) i.p. 'i.v' 'i.p .___ BBM-1675 Αχ 0.019 0.010 0.00046 BBM-1675 A2 0.18 0.10 0.0072

ChromomycineA^ 0.81 0.41 0.23 TABEL Y Therapeutische indices ld50/med* P-388ChromomycinA ^ 0.81 0.41 0.23 TABLE Y Therapeutic indices ld50 / med * P-388

Enkel . qd l-*9 L1210 B16 LLOnly . qd l- * 9 L1210 B16 LL

BBM-1675 Αχ 63 >46 2 15 5 BBM-1675 A2 180 12 2 24 24BBM-1675 Αχ 63> 46 2 15 5 BBM-1675 A2 180 12 2 24 24

Chromomycine A2 8 8 inactief 23 23 * minimale effectieve dosis 8401572 * _1ι3- TABEL- ΖChromomycin A2 8 8 inactive 23 23 * minimum effective dose 8401572 * _1ι3- TABLE- Ζ

Effect van ΒΒΜ-1675 componenten op Intraveneus geïmplanteerde P-383 LeukemieEffect of ΒΒΜ-1675 Components on Intravenous Implanted P-383 Leukemia

Gem. gew. Overlevenden Dose mst T/C verandering op (mq/kq/dag*) (dagen) (%) ¾a,g 5 (g) da?· 5 dag- 45 BBM-1675 Αχ . 0.01 9.5 106 -1.7 6/6 0/6 0.003 14.0 fiFêD -0.3 6/6 0/6 0.001 11.5 (I2jp +0.3 6/6 0/6 0.0003 9.0 100 +0.3 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.1 7.0 78 -3.7 6/6 0/6 0.03 15.0 (lip -1.0 6/5 0/6 0.01 12.0 (ΐ||) -0.5 6/6 0/6 0.003 9.0 100 +1.0 6/6 0/6Avg. wt. Survivors Dose mst T / C change on (mq / kq / day *) (days) (%) ¾a, g 5 (g) da? 5 days- 45 BBM-1675 Αχ. 0.01 9.5 106 -1.7 6/6 0/6 0.003 14.0 fiFêD -0.3 6/6 0/6 0.001 11.5 (I2jp +0.3 6/6 0/6 0.0003 9.0 100 +0.3 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.1 7.0 78 -3.7 6/6 0/6 0.03 15.0 (lip -1.0 6/5 0/6 0.01 12.0 (ΐ ||) -0.5 6/6 0/6 0.003 9.0 100 +1.0 6/6 0/6

Adriamycine 30 tox. - - 0/6 0/6 10 9.0 100 -1.5 6/6 0/6 3 12.0 (lij) +0.7 6/6 0/6 1 9.0 100 +1.7 6/6 0/6Adriamycin 30 tox. - - 0/6 0/6 10 9.0 100 -1.5 6/6 0/6 3 12.0 (lij) +0.7 6/6 0/6 1 9.0 100 +1.7 6/6 0/6

Drager - 9·0 - +1-7 12/12 0/12 sCarrier - 9 · 0 - + 1-7 12/12 0/12 s

Dagen 1, 4 en 7, i.v.Days 1, 4 and 7, i.v.

Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

8401572 *8401572 *

-ΗΤΑ B E L AA-ΗΤΑ B E L AA

Effectv811 BBM-1675 componenten op intraveneus geïmplanteerde L-1210 LeukemieEffectv811 BBM-1675 components on intravenously implanted L-1210 Leukemia

Gem. gew. Overleven- . . „ST T/c verandering den opAvg. wt. Survive- . . "ST T / c change on

Dosis , > op , „ a fmo/kq/dag*) (dagen) (%) dag 5 (g) _ dag 5 dag 43 BBM-1675 A, 0.008 9.5 119 -2.0 4/6 0/6 1 0.004 14.0 (VIS) -0.2 6/6 0/6 0.002 13.0 +0.2 6/6 0/6 0.001 9-5 · 119 +0.8 6/6 0/6 0.0005 · 9.0 113 +0.8 6/6 0/6 BBM-1675 A_ 0.063 11.0 ^3j) -1.8 6/6 0/6 2 0.032 14.0 (Ï7p +0.2 6/6 0/6 0.016 10. S (lip +0.8 6/6 0/6 0.008 8.0 100 +1.2 6/6 0/6 0.004 8.0 100 +0.8 6/6 0/6 ,. . . . 1fi tox - - 2/6 0/6Dose,> on, „a fmo / kq / day *) (days) (%) day 5 (g) _ day 5 day 43 BBM-1675 A, 0.008 9.5 119 -2.0 4/6 0/6 1 0.004 14.0 ( VIS) -0.2 6/6 0/6 0.002 13.0 +0.2 6/6 0/6 0.001 9-5 119 +0.8 6/6 0/6 0.0005 9.0 113 +0.8 6/6 0/6 BBM-1675 A_ 0.063 11.0 ^ 3j) -1.8 6/6 0/6 2 0.032 14.0 (Ï7p +0.2 6/6 0/6 0.016 10. S (lip +0.8 6/6 0/6 0.008 8.0 100 +1.2 6/6 0 / 6 0.004 8.0 100 +0.8 6/6 0/6, ... 1fi tox - - 2/6 0/6

Adriamycme 15 ._ 8 12.0 Oio)· +0.2 6/6 0/6 4 9.0 113 +1.5 6/6 °/5 2 8.0 100 +1.7 6/6 0/6 n . 8.0 - +1.4 12/12 0/12Adriamycme 15 ._ 8 12.0 Oio) +0.2 6/6 0/6 4 9.0 113 +1.5 6/6 ° / 5 2 8.0 100 +1.7 6/6 0/6 n. 8.0 - +1.4 12/12 0/12

Drager °Carrier °

Sdagen 1» 4 en 7» i.v.Says 1 »4 and 7» i.v.

Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.Circle indicates significant anti-tumor activity.

De anti-tumoractiviteit van de componenten BM-1Ö75 A^ en werd tevens bepaald door een tweede proef tegen P-388 leukemie, L-1210 leukemie en B—16 melanoma bij muizen. De resultaten van deze proeven worden vermeld in tabellen BB, CC en DD. Bijzonderheden van de in deze proeven toegepaste methoden zijn beschreven in Cancer Chemother. Rep. 3: 1-87 (deel 3), 1972.The anti-tumor activity of the components BM-1075 A ^ was also determined by a second test against P-388 leukemia, L-1210 leukemia and B-16 melanoma in mice. The results of these tests are reported in Tables BB, CC and DD. Details of the methods used in these experiments are described in Cancer Chemother. Rep. 3: 1-87 (part 3), 1972.

8401572 » -^5-8401572 »- ^ 5-

T A B E JL, BBT A B E JL, BB

Effekt'van BBM-1675 Αχβη AjOp P-388 LeukemieEffect of BBM-1675 Αχβη AjOp P-388 Leukemia

Behande- Effect awc, Over-Treat Effect awc, Over-

Mate- lings- Dosis, ip mst mst ga levenden .riaal_schema._uqAg/dgr_dagen_\ t/c_dj_d.5 (30) * NSC 33270 qdl-9 <00 13.0 163 -0.6 6/6 200 11.0 138 -0.9 6/6 SBK-1675A1 d.1 51.2 20.0 2S0 -2.1 4/6 DMSO-pekel 25.6 18.0 225 -1.8 6/6 12.8 16.5 206 -1.1 6/6 6.4 13.0 163 +0.1 6/6 3.2 12.0 150 -0.3 5/6 1.6 11.0 138 -0.3 6/6 0.8 10.5 131 0 6/6 0.4 10.0 125 +0.4 6/6 0.2 10.0 125 +0.3 6/6 0.1 10.0 125 0 6/6 d.1, 5 t 9 25.6 8.0 100 -1.8 6/6 12.8 13.5 169 -1.5 6/6 6.4 16.5 206 -0.8 6/6 3.2 16.0 200 -0.8 6/6 1.6 15.5 194 +0.3 6/6 0.8 12.5 156 +0.3 6/6 0.4 12.0 150 -0.1 6/6 0.2 11.5 144 +0.2 6/6 0.1 12.0 150 +0.8 6/6 0.05 10.0 125 +0.8 6/6 qdl-9 „ 12.8 TOX TOX TOX 1/6 6*4 6-0 7!S -1.5 4/6 3·2 13.0 163 -1.2 6/6 l·6 14.5 181 -1.6 6/6 °·8 16.5 206 -2.3 6/6 0.4 16.0 200 -0.9 6/6 0*2 15.0 138 -0.8 5/5 0*1 13.0 163 -0.4 6/6 0.05 12.0 150 +0.1 6/6 0.025 12.0 150 -0.7 6/6 8401572 * ‘ -h6- T .A B E L BB (vervolg) EBM-1675A2 d. 1 256 TOX TOX TOX 0/6 DMSO-pekel 128 12.5 156 -3.5 4/6 64 27.0 338 -1.9 .6/6 32 26.0 325 -2.0 6/6 16 16.0 200 -1.8 6/6 8 15.5 194 -1.9 6/6 4 15.0 188 -0.7 6/6 2 12.0 ISO -0.5 6/6 1 12.0 150 0 6/6 0.5 10.0 125 +0.2 6/6 d.1, 5 S 9 128 TOX TOX TOX 0/6 64 TOX TOX TOX 0/6 32 TOX TOX -1.3 2/6 16 24.5 306 -1.3 5/5 8 17.5 219 -1.1 6/6 4 15.0 188 0 6/6 2 15.0 188 +0.1 6/6 1 12.5 156 -0.4 6/6 0.5 12.0 ISO -0.4 6/6 3BM-1675 A2' DMSO-pekel 0.25 , 11.0 . 138 -0.4 6/6 qdl"*9 64 TOX ' TOX TOX 1/6 32 6.0 7!S -2.9 4/6 16 . 8.0 100 -J..9 6/6 8 IS.S 194 -1.3 6/5 4 17.0 213 -1.8 6/6 2 ' 15.0 188 -1.1 6/6 1 14.0 175 -0.5 6/6 0.5 14.0 175 -0.6 6/6 0.25 12.0 150 -0-1 6/6 0.12S 12,0 150 +0.1 6/s controle pekel 8-0 ~ 10/10Measure Dose, ip mst mst go alive .riaal_schema._uqAg / dgr_dagen_ \ t / c_dj_d.5 (30) * NSC 33270 qdl-9 <00 13.0 163 -0.6 6/6 200 11.0 138 -0.9 6/6 SBK -1675A1 d.1 51.2 20.0 2S0 -2.1 4/6 DMSO brine 25.6 18.0 225 -1.8 6/6 12.8 16.5 206 -1.1 6/6 6.4 13.0 163 +0.1 6/6 3.2 12.0 150 -0.3 5/6 1.6 11.0 138 -0.3 6/6 0.8 10.5 131 0 6/6 0.4 10.0 125 +0.4 6/6 0.2 10.0 125 +0.3 6/6 0.1 10.0 125 0 6/6 d.1, 5 t 9 25.6 8.0 100 -1.8 6 / 6 12.8 13.5 169 -1.5 6/6 6.4 16.5 206 -0.8 6/6 3.2 16.0 200 -0.8 6/6 1.6 15.5 194 +0.3 6/6 0.8 12.5 156 +0.3 6/6 0.4 12.0 150 -0.1 6/6 0.2 11.5 144 +0.2 6/6 0.1 12.0 150 +0.8 6/6 0.05 10.0 125 +0.8 6/6 qdl-9 „12.8 TOX TOX TOX 1/6 6 * 4 6-0 7! S -1.5 4/6 3 · 2 13.0 163 -1.2 6/6 l6 14.5 181 -1.6 6/6 ° 8 16.5 206 -2.3 6/6 0.4 16.0 200 -0.9 6/6 0 * 2 15.0 138 -0.8 5/5 0 * 1 13.0 163 -0.4 6/6 0.05 12.0 150 +0.1 6/6 0.025 12.0 150 -0.7 6/6 8401572 * '-h6- T .ABEL BB (continued) EBM-1675A2 d. 1 256 TOX TOX TOX 0/6 DMSO brine 128 12.5 156 -3.5 4/6 64 27.0 338 -1.9 .6 / 6 32 26.0 325 -2.0 6/6 16 16.0 200 -1.8 6/6 8 15.5 194 -1.9 6 / 6 4 15.0 188 -0.7 6/6 2 12.0 ISO -0.5 6/6 1 12.0 150 0 6/6 0.5 10.0 125 +0.2 6/6 d.1, 5 S 9 128 TOX TOX TOX 0/6 64 TOX TOX TOX 0/6 32 TOX TOX -1.3 2/6 16 24.5 306 -1.3 5/5 8 17.5 219 -1.1 6/6 4 15.0 188 0 6/6 2 15.0 188 +0.1 6/6 1 12.5 156 -0.4 6 / 6 0.5 12.0 ISO -0.4 6/6 3BM-1675 A2 'DMSO brine 0.25, 11.0. 138 -0.4 6/6 qdl "* 9 64 TOX 'TOX TOX 1/6 32 6.0 7! S -2.9 4/6 16. 8.0 100 -J..9 6/6 8 IS.S 194 -1.3 6/5 4 17.0 213 -1.8 6/6 2 '15.0 188 -1.1 6/6 1 14.0 175 -0.5 6/6 0.5 14.0 175 -0.6 6/6 0.25 12.0 150 -0-1 6/6 0.12S 12.0 150 + 0.1 6 / s brine control 8-0 ~ 10/10

Tumor inoculum: 10^ ascites cellen geïmplanteerd i.p.Tumor inoculum: 10 ^ ascites cells implanted i.p.

Gastheer : CDF^ ? muizenHost: CDF ^? mice

Tox. : <£l+/6 muizen levend op dag 5Tox. : <£ 1 + / 6 mice alive on day 5

Evaluatie : MST = gem. overlevingstijdEvaluation: MST = avg. survival time

Effekt : % T/C = (MST behandeld/MST controle) x 100Effect:% T / C = (MST treated / MST control) x 100

Criteria : % T/C >125 beschouwd als significante antitumoractiviteitCriteria:% T / C> 125 considered significant anti-tumor activity

^ÏÏSC 38270 = olivomycine A^ 38270 = olivomycin A

8401572 -^7-8401572 - ^ 7-

TABEL. CCTABLE. CC

Effect YanBBM-1675 A^ en A^ op L-1210 LeukemieEffect YanBBM-1675 A ^ and A ^ on L-1210 Leukemia

Behande— Effect awc,Treated— Effect awc,

Mate- lings- Dosis., xp mst mst gm Overlevenden ~,riaal-_sgjlêga ._ug/kg/ini_dagen % τ/c d.s_a.s oo)_ BSM-1675 Aj_ d. 1 51.2 12.0 171 -1.1 5/6 25.6 7.0 100 -2.3 6/6 12.8 9.0 129 -1.1 5/6 6.4 9.5 136 -0.5 6/6 3.2 6.0 86 -1.7 6/6 1.6 7.0 100 -0.8 6/6 0.8 8.0 114 -0.4 6/6 0.4 7.0 100 +0.3 6/6 0.2 7.0 100 -0.5- 5/6 0.1 7.0 100 +0.8 5/6 d.1, 5 S 9 25.6 TOX TOX TOX 1/6 12.8 9.0 129 -1.8 6/6 6.4 9.0 129 -0.8 6/6 3.2 8.0 114 -1.9 6/6 1.6 8.S 121 0 6/6 0.8 8.0 114 -0.4 6/6 0.4 7.5 107 -1.3 6/6 0.2 3.0 114 0 5/6 0.1 8.0 114 +0.4 5/6 0.05 7.0 100 +0.3 6/6 <Jd 1-9 12.8 TOX TOX -2.4 3/6 6.4 8.0 114 -1.6 6/6 3.2 8.0 114 -1.7 6/6 1.6 9.0 129 -2.1 6/6 0.8 8.5 121 -1.6 6/6 0.4 8.0 114 -1.0 6/6 0.2 8.0 114 -0.5 5/6 0.1 7.0 . 100 +0.3 6/6 0.05 7.0 100 +0.3 6/6 0.025 6.0 86 -0.6 6/6 B3M-1675 A2 d.1 256 . TOX TOX TOX 0/6 128 7.0 100 -1.8 5/6 64 7.5 107 -1.3 4/6 32 8.0 114 -2.2 5/6 16 7.0 100 -2.3 6/6 8 9.5 136 -1.4 6/6 4 8.5 121 -1.1 5/6 2 8.0 114 -0.8 6/6 1 8.0 114 0 6/6 0.5 8.0 114 -0.1 6/6 8401572 ♦ -1+8-Mate Dose., Xp mst mst gm Survivors ~, rial-_sgjlêga ._ug / kg / ini_days% τ / c d.s_a.s oo) _ BSM-1675 Aj_ d. 1 51.2 12.0 171 -1.1 5/6 25.6 7.0 100 -2.3 6/6 12.8 9.0 129 -1.1 5/6 6.4 9.5 136 -0.5 6/6 3.2 6.0 86 -1.7 6/6 1.6 7.0 100 -0.8 6/6 0.8 8.0 114 -0.4 6/6 0.4 7.0 100 +0.3 6/6 0.2 7.0 100 -0.5- 5/6 0.1 7.0 100 +0.8 5/6 d.1, 5 S 9 25.6 TOX TOX TOX 1/6 12.8 9.0 129 - 1.8 6/6 6.4 9.0 129 -0.8 6/6 3.2 8.0 114 -1.9 6/6 1.6 8.S 121 0 6/6 0.8 8.0 114 -0.4 6/6 0.4 7.5 107 -1.3 6/6 0.2 3.0 114 0 5 / 6 0.1 8.0 114 +0.4 5/6 0.05 7.0 100 +0.3 6/6 <Jd 1-9 12.8 TOX TOX -2.4 3/6 6.4 8.0 114 -1.6 6/6 3.2 8.0 114 -1.7 6/6 1.6 9.0 129 -2.1 6/6 0.8 8.5 121 -1.6 6/6 0.4 8.0 114 -1.0 6/6 0.2 8.0 114 -0.5 5/6 0.1 7.0. 100 +0.3 6/6 0.05 7.0 100 +0.3 6/6 0.025 6.0 86 -0.6 6/6 B3M-1675 A2 d.1 256. TOX TOX TOX 0/6 128 7.0 100 -1.8 5/6 64 7.5 107 -1.3 4/6 32 8.0 114 -2.2 5/6 16 7.0 100 -2.3 6/6 8 9.5 136 -1.4 6/6 4 8.5 121 - 1.1 5/6 2 8.0 114 -0.8 6/6 1 8.0 114 0 6/6 0.5 8.0 114 -0.1 6/6 8401 572 ♦ -1 + 8-

TABEL PDTABLE PD

Effect van 3BM-16 7 5 A, en . a, op B16 Melanoma . - * ....... * - .............. - «kEffect of 3BM-16 7 5 A, and. a, on B16 Melanoma. - * ....... * - .............. - «k

Effect AWCEffect AWC

Mate- Dosis, IP MST MST cp Overlevenden ; r^aal_pg (m) of mgAq/ini ' dagen_% T/C_dji_d.10 (61) BBM-1675 Αχ 3.2M TOX TOX -1.8 2/10 1.6 16.0 64 -1.8 10/10 0.8 34.5 168 -1.8 10/10.Mate-Dose, IP MST MST cp Survivors; r ^ aal_pg (m) or mgAq / ini 'days_% T / C_dji_d. 10 (61) BBM-1675 Αχ 3.2M TOX TOX -1.8 2/10 1.6 16.0 64 -1.8 10/10 0.8 34.5 168 -1.8 10/10 .

0.4 56.5 226 -0.9 10/10(2)fa 0.2 47.0 188 -0.7 10/10 0.1 37.0 148 -0.4 10/10 BBM-1675 A2 16M 13.0 52 -2.1 10/10 8 29.5 118 -2.0 10/10 4 43.5 174 -1.1 10/10 2 50.5 202 -2.1 10/10(3)b 1 0.5 140 -1.0 10/10 0.5 38.0 152 -1.1 10/100.4 56.5 226 -0.9 10/10 (2) fa 0.2 47.0 188 -0.7 10/10 0.1 37.0 148 -0.4 10/10 BBM-1675 A2 16M 13.0 52 -2.1 10/10 8 29.5 118 -2.0 10/10 4 43.5 174 -1.1 10/10 2 50.5 202 -2.1 10/10 (3) b 1 0.5 140 -1.0 10/10 0.5 38.0 152 -1.1 10/10

Controle pekel 25.0 - -0.1 10/10 9»Brine control 25.0 - -0.1 10/10 9 »

Slechts éin zonder tumor; MST d.m.o. = 55>0 (220l)Only one without a tumor; MST d.m.o. = 55> 0 (220l)

Twee zonder tumor; MST d.m.o. = 16,0 (181$)Two without a tumor; MST d.m.o. = 16.0 (181 $)

Tumor inoculum: 0,5 ml van de 10$ brei, ipTumor inoculum: 0.5 ml of the 10 $ knit, ip

Gastheer : BDF„ ? muizenHost: BDF „? mice

Behandeling : qd 1—> 9Treatment: qd 1—> 9

Tox : ^7/10 muizen levend op dag 10Tox: ^ 7/10 mice alive on day 10

Evaluatie : MST = gemiddelde overlevingstijdEvaluation: MST = mean survival time

Effekt : % T/C = (MST behandeld/MST controle) x 100Effect:% T / C = (MST treated / MST control) x 100

Criteria : % T/C > 125 beschouwd als significante antitumoractiviteitCriteria:% T / C> 125 considered significant anti-tumor activity

Na verdere zuivering van BBM-1675 A^ volgens voorbeeld VI, werden monsters van de gezuiverde verbinding beproefd tegen L—1210 leukemie, P-388 leukemie en B—16 melanoma bij muizen. De resultaten van deze proeven worden in de volgende tabellen vermeld.After further purification of BBM-1675 A ^ according to Example VI, samples of the purified compound were tested against L-1210 leukemia, P-388 leukemia and B-16 melanoma in mice. The results of these tests are reported in the following tables.

84015728401572

TABEL EETABLE EE

-ί+9--ί + 9-

Effekt van gezuiverd ΒΒΜ-ΐ675Αχοί P388 Leukemie (Dag 1 behan deling) Gem.gew.^ Overle-Effect of purified ΒΒΜ-ΐ675Αχοί P388 Leukemia (Day 1 treatment) Avg.

Verbin- Dosis MST T/c verandering venden ding (mgAa/dosis Route. schema dagen (%) op dag 5 dag 5_ BBM-1675A^ 0.1024 i.p., qd x 1 TOX TOX 0/6 0.0512 17.5 159 -1.8 4/6 0.0256 16.5 150 -2.6 6/6 0.0128 17.5 159 -1.4 6/6 0.0064 15.5 141 -2.2 6/6 0.0032 15.5 141 -2.5 6/6 0.0016 16.5 150 -1.0 6/6 0.0008 15.0 136 -1.2 6/6 0.0004 15.0 136 -2.0 6/6 0.0256 i.p., q4d x 3; TOX TOX -1.5‘ 1/6 0.0128 10.0 91 -2.5 5/6 0.0064 17.5 159 -1.9 6/6 0.0032 17.0 155 -0.8 6/6 0.0016 17.0 155 -2.0 6/6 0.0008 1S.0 136 -1.7 6/6 0.0004 15.0 136 -0.4 6/6 0.0002 13.0 118 -0.8 6/6 0.0001 13.0 118 -1.3 6/6 0.00005 13.5 123 -1.0 6/6 0.0128 i.p., qd x 5; TOX TOX 0/6 0.0064 TOX TOX ---3.6 3/6 0-0032 17.5 155 -2.2 5/6 0.0016 14.5 132 -2.0 6/6 0.0008 15.5 141 -2.2 6/6 0.0004 16.0 145 -2.8 6/6 0.0002 17.0 155 -1.3 6/6 0.0001 14.0 127 -1.6 5/6 0.00005 15.0 136 -1.6 6/6 0.000025 15.0 136 -1.0 6/6Compound Dose MST T / c change rate (mgAa / dose Route. Schedule days (%) on day 5 day 5_ BBM-1675A ^ 0.1024 ip, qd x 1 TOX TOX 0/6 0.0512 17.5 159 -1.8 4/6 0.0256 16.5 150 -2.6 6/6 0.0128 17.5 159 -1.4 6/6 0.0064 15.5 141 -2.2 6/6 0.0032 15.5 141 -2.5 6/6 0.0016 16.5 150 -1.0 6/6 0.0008 15.0 136 -1.2 6/6 0.0004 15.0 136 -2.0 6/6 0.0256 ip, q4d x 3; TOX TOX -1.5 '1/6 0.0128 10.0 91 -2.5 5/6 0.0064 17.5 159 -1.9 6/6 0.0032 17.0 155 -0.8 6/6 0.0016 17.0 155 -2.0 6 / 6 0.0008 1S.0 136 -1.7 6/6 0.0004 15.0 136 -0.4 6/6 0.0002 13.0 118 -0.8 6/6 0.0001 13.0 118 -1.3 6/6 0.00005 13.5 123 -1.0 6/6 0.0128 ip, qd x 5 ; TOX TOX 0/6 0.0064 TOX TOX --- 3.6 3/6 0-0032 17.5 155 -2.2 5/6 0.0016 14.5 132 -2.0 6/6 0.0008 15.5 141 -2.2 6/6 0.0004 16.0 145 -2.8 6/6 0.0002 17.0 155 -1.3 6/6 0.0001 14.0 127 -1.6 5/6 0.00005 15.0 136 -1.6 6/6 0.000025 15.0 136 -1.0 6/6

Controle (drager) 1 x 106 i.p.,q4dx3; 11.0 100 -0.7 9/9Control (vehicle) 1 x 106 i.p., q4dx3; 11.0 100 -0.7 9/9

Gaatheer: CDF1 vrouwtjes muizenHost: CDF1 female mice

Implantatie niveau en plaat: 1 x 10^ cellen, i.p.Implantation level and plate: 1 x 10 ^ cells, i.p.

84015728401572

TABEL FFTABLE FF

-50--50-

Effekt van gezuiverd bbm-167sa^ of l-1210 Leukemie "(Dag 1 ^behandeling) Gem. gew. Overle-Effect of purified bbm-167sa ^ or l-1210 Leukemia "(Day 1 ^ treatment) Avg.

Verbin- Dosis mst verandering venden ding (mq/ka/dosis Route, schema dagen (%) op dag 5 dag 5_ BBM-1675A1 0.1024 i.p., qd x 1 TOX TOX 1/6 0.0512 TOX TOX -2.0 0/6 0.0256 8.0 114 -2.9 4/6 0.0128 11.0 157 -2.0 6/6 0.0064 11.0 157 -1.9 6/6 0.0032 10.0 143 -2.0 6/6 0.0016 10.0 143 -2.6 5/6 0.0008 8.0 114 -0.4 6/6 0.0256 i.p., q4d x 3 TOX TOX -2.3 2/6 0.0128 10.5 150 -1.7 6/6 0.0064 11.0 157 -1.8 6/6 0.0032 11.0 157 -1.4 6/6 0.0016 10.5 150 -1.9 6/6 0.000 8 9.0 129 -0.6 6/6 0.0004 8.5 121 -0.7 6/6 0.0002 8.0 114 -0.5 6/6 0.0128 i.p., qd x 5 TOX TOX -2.8 2/6 0.0064 7.0 100 -1.8 5/6 0.0032 11.5 164 -1.0 6/6 0.0016 11.0 157 -1.5 6/6 0-0008 10.0 143 -1.6 5/6 0.0004 8.5 121 -0.4 6/6 0.0002 8.5 121 0.1 6/6 0.0001 8.5 121 0.0 6/6Connection Dose mst change rate (mq / ka / dose Route, schedule days (%) on day 5 day 5_ BBM-1675A1 0.1024 ip, qd x 1 TOX TOX 1/6 0.0512 TOX TOX -2.0 0/6 0.0256 8.0 114 -2.9 4/6 0.0128 11.0 157 -2.0 6/6 0.0064 11.0 157 -1.9 6/6 0.0032 10.0 143 -2.0 6/6 0.0016 10.0 143 -2.6 5/6 0.0008 8.0 114 -0.4 6/6 0.0256 ip, q4d x 3 TOX TOX -2.3 2/6 0.0128 10.5 150 -1.7 6/6 0.0064 11.0 157 -1.8 6/6 0.0032 11.0 157 -1.4 6/6 0.0016 10.5 150 -1.9 6/6 0.000 8 9.0 129 -0.6 6/6 0.0004 8.5 121 -0.7 6/6 0.0002 8.0 114 -0.5 6/6 0.0128 ip, qd x 5 TOX TOX -2.8 2/6 0.0064 7.0 100 -1.8 5/6 0.0032 11.5 164 -1.0 6/6 0.0016 11.0 157 -1.5 6 / 6 0-0008 10.0 143 -1.6 5/6 0.0004 8.5 121 -0.4 6/6 0.0002 8.5 121 0.1 6/6 0.0001 8.5 121 0.0 6/6

Controle (drager) l χ ίο6 i.p., qd x s 7.0 100 0.1 10/10Control (carrier) l χ ίο6 i.p., qd x s 7.0 100 0.1 10/10

Gastheer: CDF1 vrouwtjes muizen Implantatieniveau en plaats: 1 x 10^ cellen, i.p.Host: CDF1 female mice Implantation level and site: 1 x 10 ^ cells, i.p.

14015721401572

TABEL GGTABLE GG

-51--51-

Effekt van gezuiverd 3BM-i675Ajop. Βίε Melanoma (Dag _1-Behandeling) Gem.gew. Overle-Effect of purified 3BM-i675Ajop. Βίε Melanoma (Day _1 Treatment) Avg. Survived

Verbin- Dosis ffiT verandering venden ding(ma/kq/dosis Route schema dagen t%) op dag j dag s *BBM-1S75A^ 0.0064 i.p.,q4dx3 16.5 110 -3.8 8/10 0.0032 22.5 150 -3.0 10/10 0.0016 25.0 167 -1.8 10/10 0.0008 22.0 147 -2.3 10/10 0.0004 24.0 160 -1.8 9/10 0.0016 i.p., qd x 9 27.0 180 -3.7 10/10 0.0008 27.0 180 -2.9 10/10 0.0004 26.0 173 -2.3 10/10 0.0002 24.5 163 -2.4 10/10 0.0001 25.5 170 -2.3 10/10Connect-Dose ffiT change in rate (Mo / Kq / dose Route schedule days t%) on day j day s * BBM-1S75A ^ 0.0064 ip, q4dx3 16.5 110 -3.8 8/10 0.0032 22.5 150 -3.0 10/10 0.0016 25.0 167 -1.8 10/10 0.0008 22.0 147 -2.3 10/10 0.0004 24.0 160 -1.8 9/10 0.0016 ip, qd x 9 27.0 180 -3.7 10/10 0.0008 27.0 180 -2.9 10/10 0.0004 26.0 173 -2.3 10 / 10 0.0002 24.5 163 -2.4 10/10 0.0001 25.5 170 -2.3 10/10

Controle (drager) 0.5 ML i.p.. qd x 9 15.o loo -o.3 10/10 **SBM-1675Aj 0.0064 i.v., q4d x 3 15.0 86 ”4.7 10/10 0.0032 32.5 186 -2.1 0.0016 26.0 149 -1.4 10/10 0.0008 24.0 137 ”0.4 10/10 0.0004 24.5 140 -0.0 10/10 0.0064 i.p.,q4dx3 18.0 103 ”2.7 10/10 0.0032 23.0 131 -1.4 10/10 0.0016 · 24.0 137 -0.7 10/10 0.0008 25.5 146 ”0.8 10/10 0.0004 21.5 123 -1.4 10/10Control (carrier) 0.5 ML ip. Qd x 9 15.o loo -o.3 10/10 ** SBM-1675Aj 0.0064 iv, q4d x 3 15.0 86 ”4.7 10/10 0.0032 32.5 186 -2.1 0.0016 26.0 149 -1.4 10/10 0.0008 24.0 137 ”0.4 10/10 0.0004 24.5 140 -0.0 10/10 0.0064 ip, q4dx3 18.0 103” 2.7 10/10 0.0032 23.0 131 -1.4 10/10 0.001624.0 137 -0.7 10/10 0.0008 25.5 146 0.8 10/10 0.0004 21.5 123 -1.4 10/10

Controle (drager) 0.2 ml i.v.,q4dx3 17.5 100 -o.4 10/10Control (carrier) 0.2 ml i.v., q4dx3 17.5 100 -o.4 10/10

Gastheer: CDF1 vrouwtjes muizen SImplantatieniveau en plaats: 0,5 ml 10$ brei, i.p.Host: CDF1 female mice Implantation level and site: 0.5 ml 10 $ knit, i.p.

SSImplantatieniveau en plaats: Fragment. s.c.SS Implantation Level and Location: Fragment. s.c.

De bovengenoemde analysegegevens tonen aan dat de gezuiverde BBM-5 1675 A^-component nagenoeg dezelfde anti-tumoreigenschappen heeft als het eerder onderzochte minder gezuiverde monster. De verbinding heeft een uitzonderlijk hoge kracht, aangezien de activiteit daarvan is aangetoond bij een dosering van 25 nanogram/kg op een schema van 5 x per dag tegen P-388 leukemie bij muizen. Volgens proeven tegen P-388 en L-1210 leukemie, is 10 BBM-1675 A.j effektief, hetzij toegediend als enkelvoudige injectie, dag 1, 8401572 -52- elke vierde dag 3 injecties, of 5 x per dag. Tegen B—16 melanoma was de verbinding even effektief · bij intraveneuze toediening aan dieren met sub-cutane tumors als bij intraperitoneale toediening aan dieren, met IP-tumors implantaten. Deze eigenschap van een succesvolle farmacologisch afgifte 5 van een geneesmiddel aan een tumor op een verwijderde plaats is bij antitumor antibiotica ongewoon.The above analysis data show that the purified BBM-5 1675 A 1 component has substantially the same anti-tumor properties as the previously purified less purified sample. The compound has an exceptionally high potency, since its activity has been demonstrated at a dose of 25 nanograms / kg on a 5 x daily schedule against P-388 leukemia in mice. According to tests against P-388 and L-1210 leukemia, 10 BBM-1675 A.j. is effective either as a single injection, day 1, 8401572 -52- 3 injections every fourth day, or 5 times a day. Against B-16 melanoma, the compound was as effective when administered intravenously to animals with subcutaneous tumors as it was when administered intraperitoneally to animals with IP tumor implants. This property of successful pharmacological delivery of a drug to a tumor at a distant site is uncommon in anti-tumor antibiotics.

Zoals boven aangetoond bezitten de BBM-l675-componenten een krachtige antimicrobiële activiteit, waardoor zij bruikbaar zijn voor de therapeutische behandeling van zoogdieren en andere dieren tegen dergelijke micro-10 organismen, veroorzaakte infectieziekten. Bovendien zijn de componenten geschikt voor andere gebruikelijke toepassingen van desinfectiemateriaal zoals voor medische en tandheelkundige apparatuur.As shown above, the BBM-1675 components have potent antimicrobial activity, making them useful for the therapeutic treatment of mammals and other animals against such microorganisms caused infectious diseases. In addition, the components are suitable for other common disinfection material applications such as for medical and dental equipment.

De profaaginductie in lysogene bacteriën en de activiteit tegen tu-morsystemen bij muizen bewijzen dat de BBM-1675-componenten eveneens thera-15 peutisch geschikt zijn voor het remmen van de groei van tumoren bij zoogdieren.The propage induction in lysogenic bacteria and activity against tumor systems in mice prove that the BBM-1675 components are also therapeutically suitable for inhibiting tumor growth in mammals.

De onderhavige uitvinding voorziet aldus in een werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een dierlijke gastheer die is aangetast door een microbiële infectie of door een kwaadaardige tumor, waarbij aan genoem-20 de gastheer eenueffektieve antimicrobiële of tumor-remmende dosis van BBM-1675 Αί, A2, A3, A^, B1 of Bg, of een farmaceutische preparaat daarvan wordt toegediend.The present invention thus provides a method of therapeutically treating an animal host affected by a microbial infection or a malignant tumor, wherein said host has an effective antimicrobial or tumor inhibitory dose of BBM-1675 A2, A2. , A3, A1, B1 or Bg, or a pharmaceutical preparation thereof.

In een ander aspect voorziet de onderhavige uitvinding in een farmaceutisch preparaat in de vorm van een effektieve antimicrobiële of tumor-25 remmende hoeveelheid van BBM-1675 A^, Ag, A^, A^, B^ of Bg, in combinatie met een inerte farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunningsimiddel.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition in the form of an effective antimicrobial or tumor-inhibiting amount of BBM-1675 A ^, Ag, A ^, A ^, B ^ or Bg, in combination with an inert pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Deze preparaten kunnen zijn samengesteld uit elke farmaceutische vorm, die geschikt is voor parenterale toediening.These formulations can be formulated in any pharmaceutical form suitable for parenteral administration.

Preparaten volgens de uitvinding voor parenterale toediening omvat-30 ten steriele waterige of niet-waterige oplossingen, suspensies of emulsies. Zij kunnen tevens worden gemaakt in de vorm van steriele, vaste preparaten, die onmiddellijk voor gebruik in steriel water, fysiologische pekel of een ander steriel injecteerbaar middel kunnen worden opgelost.Compositions of the invention for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. They can also be made in the form of sterile solid preparations, which can be dissolved in sterile water, physiological brine or other sterile injectable immediately before use.

Opgemerkt wordt dat de feitelijke voorkeurshoeveelheden van BBM-1675-35 antibiotica zullen variëren, al naar gelang de specifieke component, het specifiek samengestelde preparaat, de wijze van toediening en de specifieke plaats, gastheer en ziekte. De vakman zal rekening houden met de vele fac- 8401572 -53- toren, die de werking van het geneesmiddel modificeren zoals leeftijd, gewicht, sexe, diëet, tijd van toediening, route van toediening, excretié-, snelheid, toestand van het subject, geneesmiddelcombinaties, reactiegevoe-lighedén en ernst van de ziekte. De toediening kan continu of periodiek 5 geschieden binnen de maximaal getolereerde dosis. De vakman zal aan de hand van gebruikelijke doseringsproeven via de boven gegeven richtlijnen in staat zijn bij een bepaalde combinatie van omstandigheden een optimale toedieningsroute vast te stellen.It should be noted that the actual preferred amounts of BBM-1675-35 antibiotics will vary depending on the specific component, the specifically formulated composition, the mode of administration and the specific site, host and disease. Those skilled in the art will take into account the many factors modifying the action of the drug such as age, weight, sex, diet, time of administration, route of administration, excretion, rate, condition of the subject, drug combinations, reactions and disease severity. Administration can be continuous or periodic within the maximum tolerated dose. Those skilled in the art will be able to determine an optimal route of administration under a given combination of conditions, using conventional dosing tests, through the guidelines given above.

De volgende voorbeelden dienen ter verdere illustratie van de uit-10 vinding zonder beperkend te zijn.The following examples serve to further illustrate the invention without being limiting.

Voorbeeld IExample I

Fermentatie van BBM-I675Fermentation of BBM-I675

Actinomadura stam nr. H96U-92 werd gekweekt en gehandhaafd op een schuine agarcultuur, die 1$ moutextract, 0,\% glucose, 0,h% gistextract, ' 15 0,05% CaCOg en 1,6$ agar bevatte. Een goed gekweekte schuine agarcultuur werd toegepast voor het inoculeren van een vegetatief medium, dat 3$ oplosbare zetmeel, 3% droge gist, 0,3$ K^HPO^, 0,1$ KJ^O^, 0,05% MgSO^T^O, 0,2$ UaCl en 0,1$ CaCO^ bevatte, waarbij de pH v66r sterilisatie werd ingesteld op 7,0. De vegetatieve cultuur werd gedurende 72 uur bij 32°C op 20 een roterende schudinrichting (250 tpm) geïncubeerd en 5 nil van het kweek-materiaal werd overgebracht in een 500 ml Elenmeyer-kolf, die 100 ml van het fermentatiemedium bevatte, samengesteld uit 3$ suikerriet, 1$ maïszetmeel, 1$ vismeel, 0,1$ CaCO^ en 0,005$ CuSOj^H^O (pH 7,0 v66r sterilisatie). De fermentatie werd bij 28°C gedurende 6 dagen uitgevoerd op de 25 roterende schudinrichting. De antibiotische activiteit in de fermentatie-vloeistof werd bepaald door papierschijfagardiffusie onder toepassing van Staphylococcus aureus 209P als proeforganisme. De antibiotische capaciteit bereikte een maximum van.ongeveer 1 mcg/ml na 5 dagen fermentatie.Actinomadura strain No. H96U-92 was grown and maintained on an oblique agar culture containing 1% malt extract, 0.1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.05% CaCOg and 1.6% agar. A well-grown oblique agar culture was used to inoculate a vegetative medium containing 3% soluble starch, 3% dry yeast, 0.3% K ^ HPO ^, 0.1% KJ ^ O ^, 0.05% MgSO ^ Contained 0.2% UaCl and 0.1% CaCO 2, adjusting the pH to 7.0 before sterilization. The vegetative culture was incubated on a rotary shaker (250 rpm) at 32 ° C for 72 hours and 5 nil of the culture material was transferred to a 500 ml Elenmeyer flask containing 100 ml of the fermentation broth composed of 3 $ sugar cane, $ 1 corn starch, $ 1 fish meal, $ 0.1 CaCO3, and $ 0.005 CuSO3 ^ H ^ O (pH 7.0 before sterilization). The fermentation was carried out on the rotary shaker at 28 ° C for 6 days. The antibiotic activity in the fermentation broth was determined by paper disc agar diffusion using Staphylococcus aureus 209P as a test organism. The antibiotic capacity reached a maximum of about 1 mcg / ml after 5 days of fermentation.

De fermentatie van BBM-1675 werd tevens uitgevoerd in fermentatie-30 kolven, voorzien van een roermechanisme. 500 ml van de inoculumkweek als boven bereid werd overgebracht in fermentatiekolven van 20 1, die 10 1 fermentatiemedium bevatte, bestaande uit dezelfde ingrediënten als toegepast bij de fermentatie in schudkolven. De fermentatie werd uitgevoerd bij 32°C met een beluchtingssnelheid van 12 1/minuut en een roersnelheid van 35 250 tpm. Onder deze omstandigheden bereikte de antimicrobiotische produk-tie een maximum van ongeveer 0,9 mcg/ml na een fermentatieperiode van 68-76 uur.The fermentation of BBM-1675 was also carried out in fermentation flasks equipped with a stirring mechanism. 500 ml of the inoculum culture as prepared above was transferred to 20 L fermentation flasks containing 10 L fermentation medium consisting of the same ingredients as used in the shake flasks fermentation. The fermentation was carried out at 32 ° C with an aeration rate of 12 1 / minute and a stirring speed of 250 rpm. Under these conditions, antimicrobial production reached a maximum of about 0.9 mcg / ml after a fermentation period of 68-76 hours.

8401572 -5h-8401572 -5h-

Fermentatiestudies werden tevens uitgevoerd in fermentatietanks.Fermentation studies were also conducted in fermentation tanks.

Een entcultuur werd gedurende h dagen bij 30°C geschud in Erlenmeyer-kolven die vegetatief medium bevatten, bestaande uit 3% oplosbaar zetmeel, 3% droge gist, 0,3% KgHPO^, 0,1% ΚΗ^ΡΟ^, 0,05% MgSO^HgO, 0,2% NaCl en 0,1% CaCO .A seed culture was shaken in Erlenmeyer flasks containing vegetative medium consisting of 3% soluble starch, 3% dry yeast, 0.3% KgHPO ^, 0.1% ΚΗ ^ ΡΟ ^, 0 for 1 day at 30 ° C. 05% MgSO4 HgO, 0.2% NaCl and 0.1% CaCO.

5 De entcultuur.werd geïnoculeerd in een 200 1 enttank, die 130 1 entmateri-aal van dezelfde samenstelling als boven vermeld, bevatte en gedurende 31 uur bij 30°C met 2^0 tpm geroerd. De tweede entcultuur werd toegepast voor het inoculeren van 3000 1 van fermentatiemedium, dat 1% maïszetmeel, 3% suikerriet, 1% vismeel, 0,005% CuSOj^HgO en 0,1% CaCO^ bevatte. De pro-10 duktietank werd ingesteld op 28° bij lèk tpm met een beluchtingssnelheid van 2000 l/minuut. De pH van de vloeistof steeg geleidelijk met het verloop van de fermentatie en bereikte na 1U0-180 uur 7,7-7,8, waarbij een antibiotische piekactiviteit van 1,7 kcg/ml werd geproduceerd.The seed culture was inoculated into a 200 L seed tank containing 130 L of seed material of the same composition as mentioned above and stirred at 30 ° C for 31 hours at 30 ° C. The second seed culture was used to inoculate 3000 L of fermentation broth containing 1% corn starch, 3% sugar cane, 1% fish meal, 0.005% CuSO 2 HgO and 0.1% CaCO 2. The pro-10 pressure tank was set at 28 ° at every rpm with an aeration rate of 2000 l / minute. The pH of the liquid gradually increased with the course of the fermentation and reached 7.7-7.8 after 100-180 hours, producing a peak antibiotic activity of 1.7 kcg / ml.

Voorbeeld IIExample II

15 Isolatie en zuivering van BBM-1675-componenten15 Isolation and purification of BBM-1675 components

De geoogste fermentatievloeistof (3000 1, pH 7,8) werd met behulp van een Sharpless-centrifuge in myceliumkoek en een bovenstaande vloeistof-laag gescheiden. De myceliumkoek werd in 1,600 1 methanol gesuspendeerd en het mengsel gedurende 1 uur geroerd. De onoplosbare materialen werden 20 afgefiltreerd en het methanolische extract werd in vacuum tot k3 1 geconcentreerd. De in de vloeistofbovenlaag verkregen activiteit werd daaruit gewonnen door extractie met 2 x 1000 1 delen n-butanol. De n-butanolextrac-ten en het geconcentreerde methanolextracten werden gecombineerd en azeotro-pisch ingedampt onder zo nu en dan toevoeging van water aan een waterige 25 oplossing (20 l) waaruit het grootste deel van de antibiotische activiteit als een olieachtige vaste stof werd neergeslagen. De vaste stof werd in 30 1 methanol opgenomen en onoplosbaar materiaal werden door filtratie verwijderd. Het methanolextract werd dan in vacuum tot een 10 1 oplossing geconcentreerd, waaraan HO 1 ethylacetaat en 30 1 water werden toegevoegd.The harvested fermentation broth (3000 L, pH 7.8) was separated in mycelium cake with a Sharpless centrifuge and a supernatant broth. The mycelium cake was suspended in 1,600 L of methanol and the mixture was stirred for 1 hour. The insoluble materials were filtered off and the methanolic extract was concentrated in vacuo to k3. The activity obtained in the liquid top layer was recovered therefrom by extraction with 2 x 1000 1 parts of n-butanol. The n-butanol extracts and the concentrated methanol extracts were combined and azeotropically evaporated with occasional addition of water to an aqueous solution (20 L) from which most of the antibiotic activity precipitated as an oily solid. The solid was taken up in 30 L of methanol and insolubles were removed by filtration. The methanol extract was then concentrated in vacuo to a 10 L solution to which HO 1 ethyl acetate and 30 L water were added.

30 Nadat gedurende 30 minuten was geroerd werd de organische laag afgescheiden, op natriumsulfaat gedroogd en in vacuum tot k 1 ingedampt. Na toevoeging van het concentraat aan 20 1 n-hexaan verkreeg men een lichtgele vaste stof van ruw BBM-1675-complex (90,1^ g, activiteit: 55 mcg/mg). Het complex bestond volgens TLC uit een mengsel van twee hoofdcomponenten, BBM-1675 A^ en 35 Ag, en verschillende ondergeschikte componenten. Deze werden afgescheiden en gezuiverd door herhaalde chromatografie, dat in een gekoeld vertrek werden uitgevoerd om ontleding te voorkomen.After stirring for 30 minutes, the organic layer was separated, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo to k1. After adding the concentrate to 20 l of n-hexane, a pale yellow solid of crude BBM-1675 complex (90.1 g, activity: 55 mcg / mg) was obtained. The complex, according to TLC, consisted of a mixture of two major components, BBM-1675 A and 35 Ag, and several minor components. These were separated and purified by repeated chromatography performed in a cooled room to avoid decomposition.

8401572 -55-8401572 -55-

Het BBM-1675-complex (20 g) werd in methanol (20 ml) opgelost en in een kolom van Sephadex LH-20 (5,5 x 85 cm) geladen. De kolom werd met methanol ontwikkeld en de elutie gevolgd door biolanalyse onder toepassing van Staphylococcus aureus. 2Q9P. De actieve eluaten werden gecombineerd, in 5 vacuum geconcentreerd en gelyofiliseerd, waarbij een half-zuivere vaste stof van het BBM-1675-complex (i+,19 g) werd verkregen. De vaste stof werd vervolgens gechromatografeerd over een kolom van silicagel (0 5,0 x 50 cm) met chloroform plus een toenemende hoeveelheid (1 — 5% v/v) van methanol als eluenten.The BBM-1675 complex (20 g) was dissolved in methanol (20 ml) and loaded into a column of Sephadex LH-20 (5.5 x 85 cm). The column was developed with methanol and the elution followed by biol analysis using Staphylococcus aureus. 2Q9P. The active eluates were combined, concentrated in vacuo and lyophilized to yield a semi-pure BBM-1675 complex solid (+ 19 g). The solid was then chromatographed on a column of silica gel (0 5.0 x 50 cm) with chloroform plus an increasing amount (1 - 5% v / v) of methanol as eluents.

10 De eluaten werden verzameld op basis van antibacteriële activiteit (vs. £3. aureus) en TLC (SiOgj CH^Cl^-CH^OH =5:1 v/v) en onder vacuum geconcentreerd. Nagenoeg homogeen BBM-1675 (opbrengst na indampin: 351 mg) werd eerst geëlueerd met 2% methanol in chloroform en daarna een mengsel van BBM-1675 Ag, A^ en A^ (507 mg) gevolgd door een BBM-1675 B-mengsel 15 (210 mg) met 3%'s methanol in chloroform. De vaste stof van BBM-1675 A^ werd aangebracht op een kolom van Sephadex LH-20 {φ 2,0 x 80 cm), die met methanol werd ontwikkeld. De actieve fracties werden onder vacuum tot droge toestand geconcentreerd en het vaste residu uit methanol gekristalliseerd, waarbij kleurloze plaatjes van zuiver BBM-1675 A^ (12¾ mg) werden verkre-20 gen (dit materiaal is het uitgangsmateriaal voor voorbeeld IIIA). Het complex BBM-1675 Ag, A3 en A^ werd afgescheiden door chromatografie over een kolom van Bondapak C^g (Waters, φ 3,0 x 50 cm). De elutie werd uitgevoerd met waterig acetonitril en de bioactieve eluaten werden onderzocht door TLC (Merck, 1gesilaniseerd: CH^CN-HgO = 75:25 v/v). De ondergeschikte com-25 ponenten A^ (33 mg) en Ag (18 ml) werden achtereenvolgens in die volgorde geëlueerd met 20%'s acetonitril, gevolgd door een andere hoofdcomponent Ag (301 mg) (dit materiaal is het uitgangsmateriaal voor voorbeeld IIIB) met 50%'s acetonitril.The eluates were collected based on antibacterial activity (vs. 3. Aureus) and TLC (SiOgj CH 2 Cl 2 CH 2 OH = 5: 1 v / v) and concentrated in vacuo. Substantially homogeneous BBM-1675 (yield after indampin: 351 mg) was first eluted with 2% methanol in chloroform and then a mixture of BBM-1675 Ag, A ^ and A ^ (507 mg) followed by a BBM-1675 B mixture 15 (210 mg) with 3% methanol in chloroform. The solid of BBM-1675 A ^ was applied to a column of Sephadex LH-20 (φ 2.0 x 80 cm) developed with methanol. The active fractions were concentrated in vacuo to dryness and the solid residue crystallized from methanol to obtain colorless platelets of pure BBM-1675A (12¾mg) (this material is the starting material for Example IIIA). The complex BBM-1675 Ag, A3 and A ^ was separated by chromatography on a column of Bondapak C ^ g (Waters, φ 3.0 x 50 cm). Elution was performed with aqueous acetonitrile and the bioactive eluates were examined by TLC (Merck, 1 silanized: CH 2 CN-HgO = 75:25 v / v). The minor components A 3 (33 mg) and Ag (18 ml) were successively eluted in that order with 20% acetonitrile followed by another major component Ag (301 mg) (this material is the starting material for Example IIIB ) with 50% acetonitrile.

De vaste stof die BBM-1675 B^ en Bg bevatte werd gechromatografeerd 30 over een kolom van silicagel {φ 3,0 x Uo cm) met chloroform en methanol als ontwikkelingsoplosmiddel. De actieve fracties geëlueerd met k%'s methanol in chloroform werden gecombineerd en ingedampt, waarbij zuiver BBM-1675 B^ (7 mg) werd verkregen. Een andere actieve fractie werd geëlueerd bij een % concentratie van methanol, waarbij na indamping BBM-1675 Bg (8 mg) werd 35 verkregen.The solid containing BBM-1675 B ^ and Bg was chromatographed on a column of silica gel (φ 3.0 x 10 cm) with chloroform and methanol as developing solvent. The active fractions eluted with k% methanol in chloroform were combined and evaporated, yielding pure BBM-1675 B1 (7 mg). Another active fraction was eluted at a% concentration of methanol to give BBM-1675 Bg (8 mg) after evaporation.

8401572 C^g omgekeerde fase silicagel -56-8401572 C ^ g reverse phase silica gel -56-

Voorbeeld IIIExample III

Verdere zuivering van BBM-1675 A^ en A. Zuivering van BBM-1675 A^Further purification of BBM-1675 A ^ and A. Purification of BBM-1675 A ^

Een 2,67 cm inwendige diameter x 75 cm Gleneo-kolom werd gepakt met 5 een suspensie van aan Baker gebonden fase octadecyl (C 18) silicagel (deeltjesafmeting 40 micron) in methanol. De kolom werd verbonden met een mediumdruk HPLC-systeem en in evenwicht gebracht met 1,5 eluent (1+1,6% acetonitril-21,6% methanol-36,8% 0,1 M ammoniumacetaat). Gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 A^ (100,5 mg), verkregen volgens de zuiveringsprocedure 10 van voorbeeld II, werd opgelost in 2 ml acetonitril en in de monsterlus getrokken. Het monster werd op de kolom gepompt. De kolom werd met de bovengenoemde eluent geëlueerd, waarbij fracties van 87 ml werden verzameld.A 2.67 cm internal diameter x 75 cm Gleneo column was packed with a suspension of Baker-bonded phase octadecyl (C 18) silica gel (40 micron particle size) in methanol. The column was connected to a medium pressure HPLC system and equilibrated with 1.5 eluent (1 + 1.6% acetonitrile-21.6% methanol-36.8% 0.1 M ammonium acetate). Partially purified BBM-1675 A ^ (100.5 mg), obtained according to the purification procedure of Example II, was dissolved in 2 ml of acetonitrile and drawn into the sample loop. The sample was pumped onto the column. The column was eluted with the above eluent to collect 87 ml fractions.

De eluent werd gevolgd bij 25^· nm en 3^-0 nm. De fracties 55-71 werden gecombineerd en twee maal met 1500 ml aliquots chloroform geëxtraheerd.The eluent was monitored at 25 µm and 3 µm-0 nm. Fractions 55-71 were combined and extracted twice with 1500 ml aliquots of chloroform.

15 Het chloroform werd tot droge toestand ingedampt en men verkreeg 89,8 mg van residu C.The chloroform was evaporated to dryness to give 89.8 mg of residue C.

Een 1,5 cm inwendige diameter x 20 cm Glenco-kolom werd gepakt met een suspensie van 12 g Woelm silicagel (deeltjesafmeting 60-200 micron).A 1.5 cm internal diameter x 20 cm Glenco column was packed with a suspension of 12 g of Woelm silica gel (particle size 60-200 microns).

Het residu C werd in de kolom aangebracht in een chloroformoplossing.The residue C was placed in the column in a chloroform solution.

20 De kolom werd met een 500 ml lineaire gradiënt van chloroform tot 10% methanol in chloroform geëlueerd, waarbij - fracties van 20-25 ml werden verzameld. Na analyse volgens TLC over silicagel werden fracties 6-9 verzameld en tot droge toestand ingedampt, waarbij 73 mg van residu D werd verkregen .The column was eluted with a 500 ml linear gradient from chloroform to 10% methanol in chloroform to collect fractions of 20-25 ml. After analysis by TLC on silica gel, fractions 6-9 were collected and evaporated to dryness to yield 73 mg of residue D.

25 Een 1,5 cm inwendige diameter x 20 cm Glenco-kolom werd gepakt met een suspensie van 12 g Woelm silicagel (deeltjesafmeting 63-200 micron) in Skellysolve B. Het residu D werd in ongeveer 2 ml CHCl^ opgelost en in de kolom aangebracht. Het chloroform werd vervangen door 25 ml Skellysolve B. De kolom werd daarna geëlueerd met een 500 ml lineaire gradiënt van 30 Skellysolve B tot 60% aceton in Skellysolve B, waarbij fracties van 28-25 ml werden verzameld. De fracties 19-23 werden verzameld en vervolgens drooggedampt onder vorming van 65,6 mg zuiver BBM-1675 A^.A 1.5 cm internal diameter x 20 cm Glenco column was packed with a suspension of 12 g of Woelm silica gel (particle size 63-200 microns) in Skellysolve B. The residue D was dissolved in about 2 ml CHCl 2 and in the column applied. The chloroform was replaced with 25 ml of Skellysolve B. The column was then eluted with a 500 ml linear gradient from 30 Skellysolve B to 60% acetone in Skellysolve B, collecting fractions of 28-25 ml. Fractions 19-23 were collected and then evaporated to dryness to give 65.6 mg of pure BBM-1675 A ^.

Dit residu was homogeen in drie TLC-systemen (5% methanol in chloroform; 5% methanol in ether; en 50% aceton in Skellysolve B over silica-35 gel) en HPLC (C—18 silicagel-Ul,5% acetonitril:21,5% methanol:37,0% 0,1 M ammoniumacetaat).This residue was homogeneous in three TLC systems (5% methanol in chloroform; 5% methanol in ether; and 50% acetone in Skellysolve B over silica-35 gel) and HPLC (C-18 silica gel-Ul, 5% acetonitrile: 21 .5% methanol: 37.0% 0.1 M ammonium acetate).

8401572 -57-8401572 -57-

Gelpermeatiechromatografie met gezuiverd BBM-1675 Α^Gel permeation chromatography with purified BBM-1675 Α ^

Een 2,5 cm inwendige diameter x k5 cm Pharmacia-kolom werd gepakt met een suspensie van Sephadex LH-20 in methanol tot een 33 Λ cm chromato-grafiebed. Gezuiverd BBM-1675 A (ongeveer 120 mg) werd opgelost in 2 ml 5 methanol en overgebracht naar een 2,5 ml monsterreservoir. Het monster werd op de kolom aangebracht en de elutie met methanol gestart met 1,75 ml/minuut, waarbij fracties van 10 ml werden verzameld [Pharmacia FRAC-100 fractieverzamelaar]. De eluent werd gevolg bij 25k nm met een Iscro UA-5 detector. Waargenomen werd, dat BBM-1675 A^ bij Ve/Vt van 0,79-10 0,91 werd geëlueerd (Ve = elutievolume; Vt = bedvolume).A 2.5 cm internal diameter x k5 cm Pharmacia column was packed with a suspension of Sephadex LH-20 in methanol to a 33 cm cm chromatography bed. Purified BBM-1675 A (about 120 mg) was dissolved in 2 ml of methanol and transferred to a 2.5 ml sample reservoir. The sample was applied to the column and the elution with methanol started at 1.75 ml / minute, collecting 10 ml fractions [Pharmacia FRAC-100 fraction collector]. The eluent was monitored at 25k nm with an Iscro UA-5 detector. It was observed that BBM-1675 A ^ was eluted at Ve / Vt from 0.79-10 0.91 (Ve = elution volume; Vt = bed volume).

B. Zuivering van BBM-1675 A^B. Purification of BBM-1675 A ^

Een 2,65 cm inwendige diameter x 75 cm Glenco-kolom werd gepakt met een suspensie van Baker-gebonden fase-octadecyl (C l8)-silicagel (^0 micron deeltjesafmeting) in methanol. De kolom werd met het mediumdruk ΗΡΙΟ-Ι 5 systeem verbonden en in evenwicht gebracht met 1,5 1 eluent (50% acetoni-tril-20% methanol-30% 0,1 M ammoniumacetaat). Gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 Α^ (76,9 mg), verkregen volgens de procedure van voorbeeld II werd in 2 ml acetonitril opgelost en in de monsterlus getrokken. Het monster werd op de kolom gepompt. De kolom werd met de voomoemde eluent geëlueerd, 20 waarbij fracties van 87 ml werden verzameld. De eluent werd gevolgd bij 25^ en 3^-0 nm. Fracties 31-38 werden samengevoegd en 2 x met 500 ml aliquots chloroform geëxtraheerd. Het chloroform werd drooggedampt en men verkreeg 6598 mg homogeen BBM-1675 Ag.A 2.65 cm internal diameter x 75 cm Glenco column was packed with a suspension of Baker-bonded phase octadecyl (C18) silica gel (00 micron particle size) in methanol. The column was connected to the medium pressure ΗΡΙΟ-Ι 5 system and equilibrated with 1.5 l of eluent (50% acetonitrile-20% methanol-30% 0.1 M ammonium acetate). Partially purified BBM-1675 Α ^ (76.9 mg) obtained according to the procedure of Example II was dissolved in 2 ml of acetonitrile and drawn into the sample loop. The sample was pumped onto the column. The column was eluted with the aforementioned eluent, collecting 87 ml fractions. The eluent was monitored at 25 ^ and 3 ^ -0 nm. Fractions 31-38 were combined and extracted 2x with 500 ml aliquots of chloroform. The chloroform was evaporated to dryness to yield 6598 mg of homogeneous BBM-1675 Ag.

BBM-1675 Ag was homogeen in 2 TLC-systemen, een 2-d TLC-analyse en 25 HPLC.BBM-1675 Ag was homogeneous in 2 TLC systems, a 2-d TLC analysis and 25 HPLC.

Voorbeeld IVExample IV

Voorkeursextractiewerkwijze voor BBM-1675 A^Preferred extraction method for BBM-1675 A ^

Een ruw fermentaat (6,8 l) verkregen volgens de algemene procedure van voorbeeld I werd overgebracht in een polypropeenemmer (12 cm D top; 30 10 cm D, bodem; 37 cm hoog), aan de bodem voorzien van een kraan. Een gelijk volume chloroform werd toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2 uur goed geroerd met behulp van een CRC-lucht aangedreven roerder. Ongeveer b 1 (1,3 kg) Dicalite (filterhulpmiddel) werd toegevoegd en ingedampt. Het mengsel werd via een dicalite-prop, bevestigd in een nr. 12 Buchmer-trechter, ' 35 gefiltreerd. Het filtraat werd verzameld in een kolf van 19 1 voorzien van een vacuumaftakking (Ace. nr. 5396-06). Het vlies werd met 2 1 chloroform gewassen. Het filtraat werd naar een scheidingstrechter van 20 1 overge- 8401572 -58- bracht, waarin men fasescheiding liet plaatsvinden. De onderste fase (chloroform) werd verwijderd.A crude fermentate (6.8 L) obtained according to the general procedure of Example I was transferred to a polypropylene bucket (12 cm D top; 10 cm D, bottom; 37 cm high), fitted with a tap at the bottom. An equal volume of chloroform was added. The mixture was stirred well for 2 hours using a CRC air powered stirrer. About b 1 (1.3 kg) Dicalite (filter aid) was added and evaporated. The mixture was filtered through a dicalite plug, fixed in a No. 12 Buchmer funnel, 35. The filtrate was collected into a 19 L flask equipped with a vacuum tap (Ace No. 5396-06). The web was washed with 2 L of chloroform. The filtrate was transferred to a 20 L separating funnel, where phase separation was allowed to take place. The bottom phase (chloroform) was removed.

Een 2,5 cm inwendige diameter x lO cm Glenco-huis werd gepakt met een suspensie van 91 g Woelm silicagel (deeltjes van 63-200 micron). On-5 der toepassing van een FMI RPY-2CSD pomp werd de voornoemde ehloroformfase door de kolom gepompt. De kolom werd met 600 ml vers chloroform gespoeld.A 2.5 cm internal diameter x 10 cm Glenco housing was packed with a suspension of 91 g of Woelm silica gel (63-200 micron particles). Using an FMI RPY-2CSD pump, the aforementioned chloroform phase was pumped through the column. The column was rinsed with 600 ml of fresh chloroform.

De chloroformeluent werd afgevoerd. De kolom werd vervolgens met 600 ml 10%'s methanol in chloroform geëlueerd. Deze eluent werd tot droge toestand ingedampt en men verkreeg 5^7 mg van residu A.The chloroform eluent was discarded. The column was then eluted with 600 ml of 10% methanol in chloroform. This eluent was evaporated to dryness to give 5 ^ 7 mg of residue A.

10 Residu A werd in 50 ml chloroform opgelost. De chloroformoplossing werd aan 20 g Dicalite in een rondhodemkolf van 1 1 overgebracht. Door toevoeging van ongeveer 200 ml Skellysolve B werd een suspensie gevormd.Residue A was dissolved in 50 ml of chloroform. The chloroform solution was transferred to 20 g of Dicalite in a 1 L round bottom flask. A suspension was formed by adding about 200 ml of Skellysolve B.

De oplosmiddelen werden in een roterende verdamper gebracht. Het residu werd in 300 ml Skellysolve B gesuspendeerd. De suspensie werd via de vol-15 gende procedure in een Ace-kolf-chromatografiebuis (deel nr. 8B5ÖT2—1U) (41 mm inwendige diameter x U5,7 cm) gepakt. In de hals van de kraan tussen de kraan en de kolombuis werd een glaswolprop aangebracht. Boven het glaswol werd een laag van 1 cm standaard Ottawa-zand ingebracht. De kraan, het glaswol en het zandbed werden van lucht gezuiverd door een'vooraf onder 20 druk gebrachte (5,7 psi) stroom van Skellysolve B door te leiden. De suspensie werd vervolgens aan de kolom toegevoegd en door een drukstroom tot een gepakt bed gevormd. Men liet de kolom nooit droog worden.. Nadat een stabiel kolombed was verkregen, werd op de top van het bed een laag van 2 cm Ottawa-zand aangebracht. Het bed werd dan geëlueerd met extra 600-700 ml 25 Skellysolve B. Het bed werd met 500 ml tolueen geëlueerd. De tolueeneluent werd drooggedampt en men verkreeg 93 mg van residu B. Dit gedeeltelijk gezuiverde BBM-1675 A kan dan verder volgens de procedure van voorbeeld III worden gezuiverd.The solvents were placed in a rotary evaporator. The residue was suspended in 300 ml Skellysolve B. The suspension was packed into an Ace flask chromatography tube (part No. 8B5ÖT2-1U) (41 mm internal diameter x U5.7 cm) via the following procedure. A glass wool plug was placed in the neck of the tap between the tap and the column tube. A 1 cm layer of standard Ottawa sand was placed above the glass wool. The tap, glass wool and sand bed were purified from air by passing a pre-pressurized (5.7 psi) stream of Skellysolve B. The suspension was then added to the column and packed into a packed bed by a pressure stream. The column was never allowed to dry. After a stable column bed was obtained, a 2 cm layer of Ottawa sand was applied to the top of the bed. The bed was then eluted with additional 600-700 ml of Skellysolve B. The bed was eluted with 500 ml of toluene. The toluene eluent was evaporated to dryness to give 93 mg of residue B. This partially purified BBM-1675 A can then be further purified according to the procedure of Example III.

Voorbeeld VExample V

30 Fermentatie van BBM-1675-complex onder toepassing van variant H96^-92-A1327Y Een variantstam A1327Y, verkregen door NTG-behandeling van een Actinomadura verrucosospora stam nr. H-96U-92, werd toegepast voor het inoculeren van vegetatief medium, dat 2$ oplosbare zetmeel, 1% glucose, 0,5% gistextract, 0,5% ÏÏB-amine-type A en 0,1% CaCO^ bevatte, waarbij de pH v6or 35 sterilisatie op 7,0 werd ingesteld. De vegetatieve cultuur werd gedurende dagen op een roterende schudinrichting (250 tpm) bij 32°C geïncubeerd en 5 ml van de kweek overgebracht in een 500 ml Erlenmeyerkolf, die 100 ml 8401572 #' -59- fermentatiemedium bevatte, bestaande uit 3# suikerriet, \% maïszetmeel, 1# vismeel, 0,005# CuS0^.5H20, 0,05# MgSO^.T^O en 0,1# CaC03, waarbij de pH vóór sterilisatie op 7,0 werd ingesteld.Fermentation of BBM-1675 complex using variant H96 ^ -92-A1327Y A variant strain A1327Y, obtained by NTG treatment of an Actinomadura verrucosospora strain No. H-96U-92, was used to inoculate vegetative medium, which 2% soluble starch, 1% glucose, 0.5% yeast extract, 0.5% IB-amine type A and 0.1% CaCO 2, adjusting the pH to 7.0 before sterilization. The vegetative culture was incubated on a rotary shaker (250 rpm) at 32 ° C for days and 5 ml of the culture transferred to a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of 8401572 # '-59 fermentation medium consisting of 3 # sugar cane, % corn starch, 1 # fish meal, 0.005 # CuSO5 .5H2 O, 0.05 # MgSO4 .T2 O and 0.1 # CaCO3, adjusting the pH to 7.0 before sterilization.

De fermentatie werd gedurende 7 dagen bij 28°C op de roterende schud-5 inrichting uitgevoerd. De produktie van antibioticum bereikte een maximum van ca 1,5 mcg/ml.The fermentation was carried out on the rotary shaker at 28 ° C for 7 days. Antibiotic production reached a maximum of about 1.5 mcg / ml.

Voorbeeld VIExample VI

Isolering en zuivering van BBM-1675-componentenIsolation and purification of BBM-1675 components

De geoogste fermentatievloeistof van voorbeeld V (3000 1, pH 7,6) 10 werd gescheiden in myceliumkoek en een bovenstaande vloeistof door toepassing van een Sharpless-centrifuge. De myceliumkoek werd met 2000 1 methanol gedurende êén uur geroerd en het onoplosbare materiaal door filtratie verwijderd. De in de bovenstaande vloeistof aanwezige actieve component werd daaruit met 1.800 1 n-butanol geëxtraheerd. De methanol en n-butanolextrac-15 ten werden gecombineerd en azeotropisch door nu en dan toevoegen van water tot een waterige oplossing (20 l) geconcentreerd, waaruit het grootste deel van het actieve antibioticum werd neergeslagen als een olieachtige vaste stof. Het mengsel werd 3 x met 20 1 ethylacetaat geschud om de actieve component te extraheren. De extracten werden verzameld, gefiltreerd ter ver-20 wijdering van het onoplosbare materiaal en in vacuum tot 1+ 1 ingedampt.The harvested fermentation broth of Example V (3000 L, pH 7.6) was separated into mycelium cake and a supernatant using a Sharpless centrifuge. The mycelium cake was stirred with 2000 L of methanol for one hour and the insoluble matter was removed by filtration. The active component present in the supernatant was extracted therefrom with 1,800 l of n-butanol. The methanol and n-butanol extracts were combined and concentrated azeotropically by adding water occasionally to an aqueous solution (20 L), from which most of the active antibiotic was precipitated as an oily solid. The mixture was shaken 3x with 20 L of ethyl acetate to extract the active component. The extracts were collected, filtered to remove the insoluble material and evaporated in vacuo to 1+ 1.

Na toevoeging van het concentraat aan 30 1 n-hexaan onder roeren verkreeg men een lichtgele vaste stof van ruw BBM-1675-complex (81,7 g, activiteit: 59 mcg/mg). Volgens TLC en HPLC bestond het complex uit een mengsel van twee hoofdcomponenten, BBM-1675 A^ en A2 en verschillende ondergeschikte 25 componenten. Deze werden afgescheiden en gezuiverd via een reeks chromato-grafiebehandelingen, die in een koud vertrek werden uitgevoerd om ontleding te voorkomen.After adding the concentrate to 30 l of n-hexane with stirring, a pale yellow solid of crude BBM-1675 complex was obtained (81.7 g, activity: 59 mcg / mg). According to TLC and HPLC, the complex consisted of a mixture of two major components, BBM-1675 A and A2 and several minor components. These were separated and purified by a series of cold room chromatography treatments to avoid decomposition.

Het ruwe BBM-1675-complex (20 g) werd in methanol (20 ml) opgelost en geladen op een kolom van Sephadex LH-20 (φ 5,5 x 85 cm). De kolom werd 30 ontwikkeld met methanol en de elutie gevolgd door bioanalyse onder toepassing van Staphylococcus aureus 209P. De actieve eluaten werden verzameld, in vacuum geconcentreerd en gelyofiliseerd, waarbij een half-zuivere stof van het BBM-1675-complex werd verkregen (1+,86 g, activiteit: 203 mcg/mg).The crude BBM-1675 complex (20 g) was dissolved in methanol (20 ml) and loaded onto a column of Sephadex LH-20 (φ 5.5 x 85 cm). The column was developed with methanol and the elution followed by bioanalysis using Staphylococcus aureus 209P. The active eluates were collected, concentrated in vacuo and lyophilized to yield a semi-pure substance of the BBM-1675 complex (1 +, 86 g, activity: 203 mcg / mg).

De vaste stof werd vervolgens over een kolom van silicagel (¢5 3,0 x 70 cm) 35 gechromatografeerd onder toepassing van chloroform en een toenemende hoeveelheid (1-5#) methanol als ontwikkelingsoplosmiddelen. De eluaten werden verzameld op basis van antibacteriële activiteit tegen _S. aureus en TLCThe solid was then chromatographed on a column of silica gel (¢ 3.0 x 70 cm) using chloroform and an increasing amount (1-5 #) of methanol as developing solvents. The eluates were collected based on antibacterial activity against _S. aureus and TLC

8401572 -60- (Si02, CHCl^-MeOH =5:1, v/v) en in vacuum geconcentreerd.'Het BBM-1675 A^ (1+25 mg na indamping, activiteit: 960 mcg/mg) werd eerst geëlueerd met 2$ methanol in chloroform en vervolgens een mengsel van BBM-1675 Ag, A^ en A^ (732 mg, activiteit: 3^+0 mcg/mg) gevolgd door BBM-1675 B-complex (200 mg, 5 activiteit: 190 mcg/mg) met 3$’s methanol in chloroform. Het "bovengenoemde BBM-1675 A^ werd opnieuw over silicagel gechromatografeerd (kolom: φ 2,0 x 1+1+ cm) met 2% methanol in henzeen. De bioactieve eluaten werden geanalyseerd volgens HPLC (Lichrosorb HP-18: CH^N-MeOH-0,1M CH COONH^ = 5:2:3, v/v) en de fracties die homogeen BBM-1675 A^ bevatten werden in vacuum tot droge 10 toestand ingedampt. De restvaste stof werd gekristalliseerd uit methanol (10 ml) en men verkreeg kleurloze prisma’s van BBM-1675 A^ (197 mg, activiteit: 1000 mcg/mg).8401572 -60- (SiO2, CHCl2 -MeOH = 5: 1, v / v) and concentrated in vacuo. The BBM-1675 A (1 + 25 mg after evaporation, activity: 960 mcg / mg) was first eluted with 2 $ methanol in chloroform and then a mixture of BBM-1675 Ag, A ^ and A ^ (732 mg, activity: 3 ^ + 0 mcg / mg) followed by BBM-1675 B complex (200 mg, 5 activity: 190 mcg / mg) with 3% methanol in chloroform. The above BBM-1675 A ^ was re-chromatographed on silica gel (column: φ 2.0 x 1 + 1 + cm) with 2% methanol in benzene. The bioactive eluates were analyzed by HPLC (Lichrosorb HP-18: CH ^ N -MeOH-0.1M CH COONH ^ = 5: 2: 3, v / v) and the fractions containing homogeneous BBM-1675 A ^ were evaporated in vacuo to dryness The residual solid was crystallized from methanol (10 ml ) and colorless prisms of BBM-1675 A ^ (197 mg, activity: 1000 mcg / mg) were obtained.

Het complex van BBM-1675 Ag, A^ en A^ (537 mg) werd gescheiden door kolomchromatografie over Bondapak C^g (Waters, Φ 2,0 x 1+2 cm). De elu-15 tie werd uitgevoerd met waterig acetonitril en de bioactieve eluaten werden onderzocht met TLC (Merck, gesilaniseerd: CH CN-Ho0 = 75:25, v/v).The complex of BBM-1675 Ag, A 2 and A 2 (537 mg) was separated by column chromatography over Bondapak C 2 (Waters, Φ 2.0 x 1 + 2 cm). The elution was performed with aqueous acetonitrile and the bioactive eluates were examined by TLC (Merck, silanized: CH CN-HoO = 75:25, v / v).

3 k3k

De ondergeschikte componenten BBM-1675 A^ (1+5 mg, activiteit: 1+10 mcg/mg) en Ag (10 mg, activiteit: 300 mcg/mg) werden achtereenvolgens met 20$ acetonitril geëlueerd, gevolgd door een hoofdcomponent, BBM-1675 A^ 20 (203 mg) met 50$ acetonitril. De BBM-1675 Ag-fractie wrrd gekristalliseerd uit chloroform-n-hexaan, waarbij kleurloze staafjes werden neergeslagen (70 mg, activiteit: 290 mcg/mg). De vaste stof die het BBM-1675 B-mengsel bevatte werd gechromatografeerd over een kolom van silicagel {φ 3,0 x 1+0 cm) met chloroform en methanol als ontwikkelingsoplosmiddel. De actieve frac-25 ties, geëlueerd met l+$’s methanol in chloroform werden verzameld en ingedampt en men verkreeg zuiver BBM-1Ö75 B^ (7 mg, activiteit: 180 mcg/mg).The minor components BBM-1675 A ^ (1 + 5 mg, activity: 1 + 10 mcg / mg) and Ag (10 mg, activity: 300 mcg / mg) were successively eluted with 20% acetonitrile, followed by a major component, BBM -1675 A ^ 20 (203 mg) with 50% acetonitrile. The BBM-1675 Ag fraction was crystallized from chloroform-n-hexane, precipitating colorless rods (70 mg, activity: 290 mcg / mg). The solid containing the BBM-1675 B mixture was chromatographed on a column of silica gel (φ 3.0 x 1 + 0 cm) with chloroform and methanol as developing solvent. The active fractions, eluting with 1 + methanol in chloroform, were collected and evaporated to give pure BBM-1075B (7 mg, activity: 180 mcg / mg).

Een andere actieve fractie werd geëlueerd bij een methanolconcentratie, en leverde na indamping BBM-1675 Bg (8 mg, activiteit: 1U0 mcg/mg).Another active fraction was eluted at a methanol concentration, yielding BBM-1675 Bg (8mg, activity: 1U0 mcg / mg) after evaporation.

84015728401572

Claims (26)

1. Anti-tumor antibioticum BBM-1675 A^ dat in nagenoeg gezuiverde vorm (a) het uiterlijk heeft van witte tot lichtgele kristallen; (b) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, in lichte mate oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in 5 n-hexaan en koolstoftetrachloride; (c) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens-reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproe-ven; (d) een infraroodabsorptiespectrum (KBr) vertoont, zoals in wezen 10 getoond in fig. 9; (e) indien opgelost in CDCl^ een magnetisch protonkernresonantie-spectrum geeft, zoals in wezen getoond in fig. 10; (f) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 156—15Ö°C; (g) een optische rotatie heeft van [a]^ = -191° (c 0,5, CHCl^); 15 (h) een schijnbaar molecuulgewicht heeft van 12U8 als bepaald vol gens. massaspectroscopie; (i) een elementaire samenstelling heeft van ongeveer 52,17$ koolstof, 6,15$ waterstof, 63$ stikstof, 9*09$ zwavel en 27,96$ (door verschil) zuurstof; 20 (j) volgens silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van Γ 0,7^ met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) en in omgekeerde fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,18 met een oplosmi d-delsysteem CH3CN-H20 (75=25 v/v) bezit; (k) bij oplossing in methanol in een concentratie van 0,01356 g/1 25 de volgende ultraviolette absorptiemaxima en absorpties vertoont: \ (nm) Λ max_ Absorpties 320 12,U 280 schouder 253 25,1 30 210 25,5 zonder significante verandering bij toevoeging van zuur of base; (l) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografie-retentietijd van 13,3 minuten met een C g-omgekeerde fasesilicagelkolom en een oplosmiddel- 8401572 -62- systeem C^CN-C^OH-O,IM-CH^OONH^ (5:2:3 v/v) vertoont; (m) effektief is voor het remmen van de groei van verschillende bacteriën en schimmels; (n) profaag induceert in lysOgene bacteriën; en 5 (o) effektief is voor het remmen van de groei van P-3Ö8 leukemie, L-1210 leukemie, B16 melanoma en Lewis-longcarcinoom bij muizen.1. Anti-tumor antibiotic BBM-1675 A ^ which in substantially purified form (a) has the appearance of white to pale yellow crystals; (b) is soluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in benzene and water, and insoluble in 5 n-hexane and carbon tetrachloride; (c) gives a positive reaction with ferric chloride, Erlich and Tollens reagents and a negative reaction in Sakaguchi, ninhydrin and anthron tests; (d) exhibits an infrared absorption spectrum (KBr), as shown essentially in Figure 9; (e) when dissolved in CDCl 4 gives a magnetic proton nuclear resonance spectrum, as shown essentially in Figure 10; (f) has a melting point in the range of about 156-15 ° C; (g) has an optical rotation of [a] ^ = -191 ° (c 0.5, CHCl ^); 15 (h) has an apparent molecular weight of 12U8 as determined by gene. mass spectroscopy; (i) has an elemental composition of about $ 52.17 carbon, $ 6.15 hydrogen, $ 63 nitrogen, $ 9 * 09 sulfur, and $ 27.96 (by difference) oxygen; 20 (j) according to silica gel thin layer chromatography an R ^ value of Γ 0.7 ^ with the solvent system CHCl ^ -CH ^ OH (5: 1 v / v) and in reverse phase silica gel thin layer chromatography an R ^ value of 0.18 with a solvent sharing system CH 3 CN-H 2 O (75 = 25 v / v); (k) when dissolved in methanol at a concentration of 0.01356 g / L the following ultraviolet absorption maxima and absorptions: \ (nm) Λ max_ Absorptions 320 12, U 280 shoulder 253 25.1 30 210 25.5 without significant change upon addition of acid or base; (l) a high capacity liquid chromatography retention time of 13.3 minutes with a Cg inverted phase silica gel column and a solvent 8401572 -62 system C ^ CN-C ^ OH-O, IM-CH ^ OONH ^ (5: 2: 3 v / v); (m) effective to inhibit the growth of various bacteria and fungi; (n) induces propage in lysogenic bacteria; and 5 (o) is effective to inhibit the growth of P-308 leukemia, L-1210 leukemia, B16 melanoma and Lewis lung carcinoma in mice. 2. Anti-tumor-antibioticum BBM-1Ö75 , dat in nagenoeg gezuiverde vorm: (a) de vorm heeft van witte kristallen; 10 (b) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetrachloride; (c) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens-reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproe- 15 ven; (d) een infraroodabsorptiespeetrum (KBr) vertoont zoals in wezen voorgesteld in fig. 12; (e) na oplossing in CDCl^ een magnetische proton kernresonantie-epectrum geeft, zoals in wezen aangegeven in fig. 13; 20 (f) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer lVjT-1^9°C; 27 (g) een optische rotatie heeft van {a]^ = -179,1* (c 0,5, CHCl^); (h) een schijnbaar molecuulgewicht heeft van 12^8, zoals bepaald volgens massaspectroscopie; (i) een benaderde elementaire samenstelling heeft van ongeveer 25 52,71$ koolstof, 5,9^$ waterstof, 3,9*1$ stikstof, 9,39$ zwavel en 28,1$ (door verschil) zuurstof; (j) in dunnelaag silicagelchromatografie een R_-waarde van 0,71 met £ het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (25:1 v/v) en in omgekeerde fasesilica- geldunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,21 met het oplosmiddel- £ 30 systeem CH^OH-H^O (75:25 v/v) bezit; (k) bij oplossing in methanol in een concentratie van 0,02052 g/1 de volgende ultraviolet-absorptiemaxima en absorpties vertoont: 8401572 -63- ^ max Absorpties 320 12,2 282 16,3 282 26,2 5 25,8 zonder significante verandering bij toevoeging van zuur of base; (1) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografie-retentietijd van 1TS3 minuten vertoont met een C^g omgekeerde fase-silicagelkolom en het oplosmiddelsysteem CH^N-CI^OH-O,1M CHgCOONH^ (5:2:3 v/v); 10 (m) het actief is in het remmen van de groei van verschillende bac teriën en schimmels; (n) profaag induceert in lysogene bacteriën; en (o) effektief is in het remmen van de groei van P-388 leukemie,2. Anti-tumor antibiotic BBM-1075, which is in substantially purified form: (a) in the form of white crystals; (B) is soluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in benzene and water and insoluble in n-hexane and carbon tetrachloride; (c) gives a positive reaction with ferric chloride, Erlich and Tollens reagents and a negative reaction in Sakaguchi, ninhydrin and anthron experiments; (d) exhibits an infrared absorption spectrum (KBr) as represented essentially in Figure 12; (e) after dissolution in CDCl 4 gives a proton magnetic core resonance spectrum, as indicated essentially in Figure 13; (F) has a melting point in the range of about 1/4 / -1-9 ° C; 27 (g) has an optical rotation of {a] ^ = -179.1 * (c 0.5, CHCl ^); (h) has an apparent molecular weight of 12 ^ 8 as determined by mass spectroscopy; (i) has an approximate elemental composition of about $ 52.71 carbon, $ 5.9 hydrogen, 3.9 * 1 nitrogen, $ 9.39 sulfur, and $ 28.1 (by difference) oxygen; (j) in thin layer silica gel chromatography an R value of 0.71 with the solvent system CHCl 2 CH 2 OH (25: 1 v / v) and in reverse phase silica gel thin layer chromatography an R value of 0.21 with the solvent - possesses system CH 2 OH-H 2 O (75:25 v / v); (k) when dissolved in methanol at a concentration of 0.02052 g / l shows the following ultraviolet absorption maxima and absorptions: 8401572 -63- ^ max Absorptions 320 12.2 282 16.3 282 26.2 5 25.8 without significant change upon addition of acid or base; (1) exhibits a high capacity liquid chromatography retention time of 1TS3 minutes with a C 1 g reversed phase silica gel column and the CH 1 N-C 1 OH-0.1 solvent system (5: 2: 3 v / v); (M) it is active in inhibiting the growth of various bacteria and fungi; (n) induces propage in lysogenic bacteria; and (o) effective in inhibiting the growth of P-388 leukemia, 15 L—1210 leukemie, B16 melanoma en Lewis longcarcinoom bij muizen.L-1210 leukemia, B16 melanoma and Lewis lung carcinoma in mice. 3. Anti-tumor-antibioticum BBM-16T5 A3, dat (a) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetrachloride; 20 (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride. Erlich en Tollens reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antron-proeven; (c) een infraroodabsorptiespectrum (KBr) vertoont, zoals in wezen voorgestel! in fig. 3; 25 (d) bij oplossing in CDC13 een magnetisch protonkernresonantiespec- trum geeft zoals in wezen getoond in fig. 7; (e) een smeltpunt heeft in een traject van ongeveer 125-127°C; 2*7 q een optische rotatie heeft van [α]^ = -I61 (c 0,5, CHC13); (g) een elementaire samenstelling heeft van ongeveer 5^355% kool-30 stof, 6,k6% waterstof, 3,73% stikstof, 7S^9% zwavel en 27,77% (door verschil) zuurstof; (h) in silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde bezit van 0,72 met het oplosmiddelsysteem CHC13-CH30H (5:1 v/v) en in omgekeerde fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^,-waar de van 0,28 met het oplosmid- Γ 35 delsysteem CI^CN-HgO (75:25 v/v) bezit; (i) bij oplossing in methanol de volgende ultraviolet absorptiemaxi-ma geeft 0,01N HCl-CH^H en 0,01N NaOH-CE^OH 8401572 -6k- ÜV \v nm (E** ) : 253 (286) max lcm in methanol 282 (158) 320(122) 07 Ό : 253 (287.> in 0.01N HC1-CH30H 282 (160) 320 (126) w nm . ! 252 l280) in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (162) 318 (120) ; (j) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografieretentietijd van 8,0 minuten geeft met een C^g omgekeerde fase-silicagelkolom en het oplos-middelsysteem CHgCN-CHgOH-O,1M CïïgCOONH^ (5:2:3 v/v); (k) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bac-5 teriën en schimmels; (l) profaag induceert in lysogene bacteriën; en --------------- (m) effektief is in het remmen van de groei van P-388 leukemie bij muizen.3. Anti-tumor antibiotic BBM-16T5 A3, which (a) is soluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in benzene and water and insoluble in n-hexane and carbon tetrachloride; (B) gives a positive reaction with ferric chloride. Erlich and Tollens reagents and a negative reaction in Sakaguchi, ninhydrin and anthron experiments; (c) exhibits an infrared absorption spectrum (KBr), as essentially suggested! in fig. 3; (D) when dissolved in CDCl3 gives a magnetic proton core resonance spectrum as shown essentially in Fig. 7; (e) has a melting point in the range of about 125-127 ° C; 2 * 7 q has an optical rotation of [α] ^ = -I61 (c 0.5, CHCl3); (g) has an elemental composition of about 5 ^ 355% carbon, 6.06% hydrogen, 3.73% nitrogen, 7S ^ 9% sulfur, and 27.77% (by difference) oxygen; (h) in silica gel thin layer chromatography it has an R 2 value of 0.72 with the solvent system CHCl 3 -CH 3 OH (5: 1 v / v) and in reverse phase silica gel thin layer chromatography it has a R 2 value of 0.28 with the solvent system CI 35 CN CN CN-HgO (75:25 v / v); (i) when dissolved in methanol the following ultraviolet absorption maxima gives 0.01N HCl-CH ^ H and 0.01N NaOH-CE ^ OH 8401572 -6k-ÜV \ v nm (E **): 253 (286) max lcm in methanol 282 (158) 320 (122) 07 Ό: 253 (287.> in 0.01N HC1-CH30H 282 (160) 320 (126) w nm.! 252 l280) in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (162) 318 (120); (j) gives a high capacity liquid chromatography retention time of 8.0 minutes with a C 1 g reversed phase silica gel column and the solvent system CHgCN-CHgOH-0.1M CCOGH (5: 2: 3 v / v); (k) is effective in inhibiting the growth of various bacteria and fungi; (l) induces propage in lysogenic bacteria; and --------------- (m) is effective in inhibiting the growth of P-388 leukemia in mice. 10 U. Anti-tumor-antibioticum BBM-1675 dat: (a) oplosbaar is in chlorform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigs zins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetrachloride; (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride. Erlich en Tollens 15 reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproe- ven; (c) een infraroodabsorptiespectrum (KBr) geeft zoals in wezen getoond in fig. H; (d) bij oplossing in CDCl^ een magnetisch protonkernresonantiespec-20 tra vertoont, zoals in wezen voorgesteld in fig. 8; (e) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 123-126°C; (f) een optische rotatie heeft van [a]^ = -1j60 (c 0,5, CHClg); (g) een elementaire samenstelling heeft van ongeveer 5)+,65% kool- 8401572 -65- stof, 6,29% waterstof, 3,51% stikstof, 8,07% zwavel en 27,^8% (door verschil) zuurstof; (h) volgens silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde bezit Γ van 0,71 met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (25,1 v/v) en in omgekeer-5 de fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R -waarde van 0,78 met het Γ oplosmiddelsysteem CHgCN-HgO (75:25 v/v) bezit; (i) de volgende ultraviolet absorptiemaxima vertoont bij oplossing in methanol, 0,01N HCl-CH^H en 0,01N Na0H-CH30H m tEiL> : 253 ‘258> in 0.01N HC1-CH30H 282 (155) 320 (118) Xmax n” 'O : 252 <2««> in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (160) 318 (118) ; ov Nnax nm (Eïom) ! 253 <257> in methanol 282 (153) . 320 (117) (j) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografie-retentietijd van 10 5,1 minuut vertoont met een C^g omgekeerde fase-silicagelkolom en het oplosmiddelsysteem CH2CN-CH30H-0,1M CHgCOONH^ (5:2:3 v/v); (k) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bacteriën en schimmels; (l) profaag induceert in lysogene bacteriën; en 15 (m) effektiefis in het remmen van de groei van P-388 leukemie bij muizen.10 U. Anti-tumor antibiotic BBM-1675 which: (a) is soluble in chlorform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in benzene and water and insoluble in n-hexane and carbon tetrachloride; (b) gives a positive reaction with ferric chloride. Erlich and Tollens reagents and a negative reaction in Sakaguchi, ninhydrin and anthrone; (c) gives an infrared absorption spectrum (KBr) as shown essentially in Fig. H; (d) when dissolved in CDCl 4, exhibits a magnetic proton core resonance spect-20 as represented essentially in Figure 8; (e) has a melting point in the range of about 123-126 ° C; (f) has an optical rotation of [α] = = -1j60 (c 0.5, CHClg); (g) has an elemental composition of about 5) +, 65% carbon 8401572 -65, 6.29% hydrogen, 3.51% nitrogen, 8.07% sulfur, and 27.8% (by difference) oxygen; (h) according to silica gel thin layer chromatography has an R ^ value Γ of 0.71 with the solvent system CHCl ^ -CH ^ OH (25.1 v / v) and in reverse-phase silica gel thin layer chromatography an R value of 0.78 with the ysteem solvent system CHgCN-HgO (75:25 v / v); (i) shows the following ultraviolet absorption maxima when dissolved in methanol, 0.01N HCl-CH2 H and 0.01N NaOH-CH30H m tEiL>: 253 '258> in 0.01N HCl-CH30H 282 (155) 320 (118) Xmax n ”0: 252 <2% in 0.01N NaOH-CH 3 OH 283 (160) 318 (118); ov Nnax nm (Eïom)! 253 <257> in methanol 282 (153). 320 (117) (j) exhibits a high capacity liquid chromatography retention time of 5.1 minutes with a C ^ g reverse phase silica gel column and the CH2CN-CH30H-0.1M CHgCOONH ^ (5: 2: 3 v / v) solvent system. ; (k) is effective in inhibiting the growth of various bacteria and fungi; (l) induces propage in lysogenic bacteria; and 15 (m) is effective in inhibiting the growth of P-388 leukemia in mice. 5. Anti-tumor-antibioticum BBM-1675 dat: (a) oplosbaar is in hcloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan 20 en koolstoftetrachloride; (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi- ninhydrine en antronproe-ven; 8401572 -66- (c) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 159—161°C; (d) een optische rotatie heeft van [a]j^ -171° (c 0,5, CHCl^); (e) in silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde hezit van 0,63 met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) en volgens omgekeer- 5 de fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,23 met het oplosmiddelsysteem CH^CN-ïïgO (75:25 v/v) bezit; (f) de volgende ultravioletabsorptiemaxima vertoont bij oplossing in methanol, 0,01N HC1-CH OH en 0,01N NaOH-CH OH DV \nax “ (8i«> : 253 12251 in methanol 282 (140) 320 (104) 07 niïl <Eicm> : 253 12251 in 0.01N HCl-CH3OH 282 (140) 320 (105) m Xmax 9« ‘Bïa> 8 252 12361 in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (141) 318 (105) ; (g) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bac-10 teriën en schimmels; en (h) profaag induceert in lysogene bacteriën.Anti-tumor antibiotic BBM-1675 which: (a) is soluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol slightly soluble in benzene and water and insoluble in n-hexane 20 and carbon tetrachloride; (b) gives a positive reaction with ferric chloride, Erlich and Tollens reagents, and a negative reaction in Sakaguchinin hydrin and anthrone tests; 8401572 -66- (c) has a melting point in the range of about 159-161 ° C; (d) has an optical rotation of [α] ^ -171 ° (c 0.5, CHCl 3); (e) in silica gel thin layer chromatography it has an R ^ value of 0.63 with the solvent system CHCl ^ -CH ^ OH (5: 1 v / v) and according to reverse phase silica gel thin layer chromatography an R ^ value of 0.23 with the solvent system CH 2 CN-2gO (75:25 v / v); (f) shows the following ultraviolet absorption maxima when dissolved in methanol, 0.01N HCl-CH OH and 0.01N NaOH-CH OH DV \ nax "(8i>>: 253 12251 in methanol 282 (140) 320 (104) 07 niil <Eicm>: 253 12251 in 0.01N HCl-CH3OH 282 (140) 320 (105) m Xmax 9 «Bia> 8 252 12361 in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (141) 318 (105); (g) is effective in inhibiting the growth of various bacteria and fungi, and (h) induces propage in lysogenic bacteria. 6. Anti-txmior-antibioticum BBM-1675 B^, dat: (a) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n- 15 hexaan en koolstoftetrachloride; (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproeven; (c) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 15β-159°0; (d) een optische rotatie heeft van [a]^ -122° (c.0,5, CHCl^); 20 (e) volgens silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde bezit van 0,60 met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) en volgens omgekeerde fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,16 met 8401572 -67- het oplosmiddelsysteem CH^CN-HgO (75:25 v/v) “bezit; (f) de volgende ultraviolet absorptiemaxima geeft bij oplossing in methanol, 0,0W HCl-CH^H en 0,011 NaOH-CH^OH UV Ly nm (E1'ij : 248 (212) max lcm in methanol 279 (141) 318 (103)6. Anti-antibiotic BBM-1675 B1, which is: (a) soluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in benzene and water and insoluble in n-hexane and carbon tetrachloride; (b) gives a positive reaction with ferric chloride, Erlich and Tollens reagents and a negative reaction in Sakaguchi, ninhydrin and anthron experiments; (c) has a melting point in the range of about 15β-159 ° O; (d) has an optical rotation of [α]--122 ° (c 0.5, CHCl 3); (E) according to silica gel thin layer chromatography has an R ^ value of 0.60 with the solvent system CHCl 2 -CH 2 OH (5: 1 v / v) and according to reverse phase silica gel thin layer chromatography an R 2 value of 0 16 with 8401572 -67- the solvent system has CH 2 CN-HgO (75:25 v / v); (f) gives the following ultraviolet absorption maxima when dissolved in methanol, 0.0W HCl-CH 2 H and 0.011 NaOH-CH 2 OH UV Lynm (E1ij: 248 (212) max 1cm in methanol 279 (141) 318 ( 103) 07 Xmax nm (ElL> = 248 ‘210) in 0.01N HCl-CH3OH 279 (140) 318 (103) «V ^ » <b“,J = 2« (233) .in 0.01N NaOH-CH3OH 278 (150) 318 (110) ; (g) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bac-5 teriën en schimmels; en (h) profaag induceert in lysogene bacteriën.07 Xmax nm (ElL> = 248 '210) in 0.01N HCl-CH3OH 279 (140) 318 (103) «V ^» <b “, J = 2« (233) .in 0.01N NaOH-CH3OH 278 (150 318 (110); (g) is effective in inhibiting the growth of various bacteria and fungi; and (h) induces propage in lysogenic bacteria. 7. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 A^, met het kenmerk, dat een BBM-1675 -producerende stam van Aetinomadura verrucosospora in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare bronnen 10 van koolstof en stikstof bevat onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 A^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 A^ uit het cultuurmedium wordt gewonnen.7. Method of preparing the anti-tumor antibiotic BBM-1675 A, characterized in that a BBM-1675 producing strain of Aetinomadura verrucosospora in an aqueous nutrient medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen under submerse aerobic conditions is grown until a significant amount of BBM-1675 A ^ has been formed by said organism in said culture medium and then BBM-1675 A ^ is recovered from the culture medium. 8. Werkwijze volgens conclusie 7S met het kenmerk, dat het BBM-1675 A^-15 producerende organisme de identificatie-eigenschappen heeft van de stam Aetinomadura verrucosospora H96U-92 (ATCC 3933^), de stam Aetinomadura verrucosospora A 1327Y (ATCC 39638) of een mutant daarvan,Method according to claim 7S, characterized in that the BBM-1675 A ^ -15 producing organism has the identification properties of the strain Aetinomadura verrucosospora H96U-92 (ATCC 3933 ^), the strain Aetinomadura verrucosospora A 1327Y (ATCC 39638) or a mutant thereof, 9. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 Ag met het kenmerk, dat een BBM-1675 A^-producerende stam van Aetinomadura 20 verrucosospora in een waterig voedingsmedium dat assimileerbare koolstof en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemde organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke 8401572 * -68- hoeveelheid BBM-1675 is gevormd en vervolgens BBM-1Ö75 A2 uit het cul-tuurmedium wordt gewonnen.Process for the preparation of the anti-tumor antibiotic BBM-1675 Ag, characterized in that a BBM-1675 A-producing strain of Aetinomadura 20 verrucosospora in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources under submerse aerobic conditions grown until a significant amount of BBM-1675 has been formed in said culture medium in said culture medium and then BBM-1075 A2 is recovered from the culture medium. 10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het BBM-1675 Ag-producerende organisme de identificatie-eigenschappen heeft vanMethod according to claim 9, characterized in that the BBM-1675 Ag producing organism has the identification properties of 5 Actinomadura verrucosospora stam H96*+-92 (ATCC 3933*0. Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638) of een mutant daarvan.Actinomadura verrucosospora strain H96 * + - 92 (ATCC 3933 * 0. Actinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638) or a mutant thereof. 11. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 A^ met het kenmerk, dat een BBM-1675 A^,-producerende stam van Actinomadura verrucosospora in een waterig voedingsmedium dat assimileerbare koolstof- 10 en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemde organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 A^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 A^ uit het cultuurmedium wordt gewonnen.11. A method of preparing the anti-tumor antibiotic BBM-1675 A, characterized in that a BBM-1675 A producing strain of Actinomadura verrucosospora in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, under submerse aerobic conditions are grown until a significant amount of BBM-1675 A ^ has been formed by said organism in said culture medium and then BBM-1675 A ^ is recovered from the culture medium. 12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het BBM-1675 15 A^-producerende organisme de identificerende eigenschappen heeft van Actinomadura verrucosospora stam H96*+-92 (ATCC 3933*)·), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.Method according to claim 11, characterized in that the BBM-1675 15 A-producing organism has the identifying properties of Actinomadura verrucosospora strain H96 * + - 92 (ATCC 3933 *) ·), Actinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638 ), or a mutant thereof. 13. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 A^, met het kenmerk, dat een BBM-1675 A^-producerende stam van Actinomadura 20 verrucosospora in een waterig voedingsmedium met assinileerbare koolstof-en stikstofbronnen bevat onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 A^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 A^ uit het cultuurmedium wordt gewonnen. 25 1*+. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het BBM-1675 A^-producerende organisme de identificatie eigenschappen heeft van Actinomadura verrucosospora stam H96*+-92 (ATCC 3933*+), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.Process for the preparation of the anti-tumor antibiotic BBM-1675 A ^, characterized in that a BBM-1675 A-producing strain of Actinomadura contains 20 verrucosospora in an aqueous nutrient medium with assinilable carbon and nitrogen sources under submerse aerobic conditions is grown until a significant amount of BBM-1675 A ^ has been formed by said organism in said culture medium and then BBM-1675 A ^ is recovered from the culture medium. 25 1 * +. Method according to claim 13, characterized in that the BBM-1675 A-producing organism has the identification properties of Actinomadura verrucosospora strain H96 * + - 92 (ATCC 3933 * +), Actinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638), or a mutant thereof. 15. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-167515. A method of preparing the anti-tumor antibiotic BBM-1675 30 B^ met het kenmerk, dat een BBM-1675 B^-producerende stam van Actinomadura verrucosospora in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof-en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd kweekmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 B^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 B^ uit het cul-35 tuurmedium wordt gewonnen.Characterized in that a BBM-1675 B1 producing strain of Actinomadura verrucosospora in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources is grown under submerse aerobic conditions to a substantial amount of BBM by said organism in said culture medium. -1675 B ^ is formed and then BBM-1675 B ^ is recovered from the culture medium. 16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het BBM-1675 B^-producerend organisme de identificerende eigenschappen heeft van 8401572 % -69- Actinomadura verrucosospora stam H96U-92 (ATCC 3933^), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.A method according to claim 15, characterized in that the BBM-1675 B1 producing organism has the identifying properties of 8401572% -69-Actinomadura verrucosospora strain H96U-92 (ATCC 3933 ^), Actinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638 ), or a mutant thereof. 17. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 B2 met het kenmerk, dat een BBM-1675 B^-producerende stam van Actinomadura 5 verrucosospora in een waterig voedingsmedium dat. assimileerbare koolstof-en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 Bg.is gewonnen en vervolgens BBM-1675 Bg uit het cultuurmedium wordt gewonnen.Process for the preparation of the anti-tumor antibiotic BBM-1675 B2, characterized in that a BBM-1675 B1 producing strain of Actinomadura 5 verrucosospora in an aqueous nutrient medium. contains assimilable carbon and nitrogen sources, cultivation is performed under submerged aerobic conditions until a significant amount of BBM-1675 Bg is recovered by said organism in said culture medium and then BBM-1675 Bg is recovered from the culture medium. 18. Werkwijze volgens conclusie 17» met het kenmerk, dat het BBM-1675 B2-producerende organisme de identificatie eigenschappen heeft van Actinomadura verrucosospora stam Η96^~92 (ATCC 3933^-), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.Method according to claim 17, characterized in that the BBM-1675 B2 producing organism has the identification properties of Actinomadura verrucosospora strain Η96 ^ ~ 92 (ATCC 3933 ^ -), Actinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638), or a mutant thereof. 19. Werkwijze voor de therapeutische behandeling van een dierlijke gast-15 heer, die is aangetast door een microbiële infectie, met het kenmerk, dat aan genoemde gastheer een effektieve antimicrobiële dosis van BBM-1675 , BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A^, BBM-1675 B1 of BBM-1675 B2 wordt toegediend.19. A method of therapeutic treatment of an animal host affected by a microbial infection, characterized in that said host receives an effective antimicrobial dose of BBM-1675, BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A ^, BBM-1675 B1 or BBM-1675 B2 is administered. 20. Werkwijze voor de therapeutische behandeling van een dierlijke 20 gastheer, aangetast door een kwaadaardige tumor, met het kenmerk, dat aan genoemde gastheer een effektieve tumor-remmende dosis wordt toegediend van BBM-1675 Ar BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A^, BBM-1675 B1 of BBM-1675 B .20. Method for the therapeutic treatment of an animal host affected by a malignant tumor, characterized in that said host is administered an effective tumor inhibitory dose of BBM-1675 Ar BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A ^, BBM-1675 B1 or BBM-1675 B. 21. Farmaceutisch preparaat met het kenmerk, dat dit een effektieve 25 antimicrobiële hoeveelheid omvat van BBM-1675 A^, BBM-1675 A2, BBM-1675 A3» BBM-1675 A^, BBM-1675 B^ of BBM-1675 Bg in combinatie met een farmaceutische drager of verdunningsmiddel.21. Pharmaceutical composition characterized in that it comprises an effective antimicrobial amount of BBM-1675 A, BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A, BBM-1675 B, or BBM-1675 Bg in combination with a pharmaceutical carrier or diluent. 22. Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit een effektieve tumorremmende hoeveelheid van BBM-1675 A^, BBM-1675 Ag, BBM-1675 A3, BBM-1675 A^, BBM-1675 B1 of BBM-1675 B2 in combinatie met een farmaceu- 30 tische drager of verdunningsmiddel.Pharmaceutical composition, characterized in that it contains an effective tumor inhibiting amount of BBM-1675 A ^, BBM-1675 Ag, BBM-1675 A3, BBM-1675 A ^, BBM-1675 B1 or BBM-1675 B2 in combination with a pharmaceutical carrier or diluent. 23. Biologisch zuivere cultuur van het micro-organisme Actinomadura verrucosospora stam H96^-92 (ATCC 3933^·) , welke cultuur in staat is bij kweken in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen bevat een aanzienlijke hoeveelheid van het antibioticum BBM- 35 1675 te leveren. 2k. Biologisch zuivere cultuur van het micro-organisme Actinomadura 8401572 -70- verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), welke cultuur in staat is bij kweken in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stik-stofbronnen bevat, een aanzienlijke hoeveelheid van het antibioticum BBM-1675 te leveren. 840157223. Biologically pure culture of the microorganism Actinomadura verrucosospora strain H96 ^ -92 (ATCC 3933 ^ ·), which culture is capable of culturing in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources a significant amount of the antibiotic BBM - 35 1675 to be delivered. 2k. Biologically pure culture of the microorganism Actinomadura 8401572 -70- verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638), which culture is capable of cultivation in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, a significant amount of the antibiotic BBM -1675. 8401572
NL8401572A 1983-05-16 1984-05-16 ANTIBIOTICS. NL8401572A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49523183A 1983-05-16 1983-05-16
US49523183 1983-05-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL8401572A true NL8401572A (en) 1984-12-17

Family

ID=23967812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8401572A NL8401572A (en) 1983-05-16 1984-05-16 ANTIBIOTICS.

Country Status (28)

Country Link
JP (2) JPS59232094A (en)
KR (2) KR840008817A (en)
AT (1) AT393691B (en)
AU (1) AU569294B2 (en)
BE (1) BE899667A (en)
CA (1) CA1241282A (en)
CY (1) CY1465A (en)
DE (1) DE3418023A1 (en)
DK (1) DK163127C (en)
ES (1) ES8700267A1 (en)
FI (1) FI81114C (en)
FR (1) FR2547594B1 (en)
GB (1) GB2141425B (en)
GR (1) GR81581B (en)
HK (1) HK9889A (en)
HU (1) HU193928B (en)
IE (1) IE57444B1 (en)
IL (1) IL71824A (en)
IT (1) IT1175498B (en)
KE (1) KE3846A (en)
LU (1) LU85362A1 (en)
NL (1) NL8401572A (en)
NZ (1) NZ208013A (en)
PT (1) PT78590A (en)
SE (1) SE460364B (en)
SU (1) SU1344249A3 (en)
YU (1) YU43846B (en)
ZA (1) ZA843591B (en)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR78648B (en) * 1982-07-26 1984-09-27 Bristol Myers Co
IL79519A0 (en) * 1985-08-27 1986-10-31 Bristol Myers Co Bbm-1675c and d antitumor antibiotics
US4837206A (en) * 1987-04-29 1989-06-06 Bristol-Myers Company Esperamicin derivatives
US4996305A (en) * 1988-02-29 1991-02-26 American Cyanamid Company Process for producing the antibiotic and antitumor agents LL-E33288.epsilon.ε-Br
CA2027601A1 (en) * 1989-11-06 1991-05-07 Koko Sugawara Antitumor antibiotic bu-3983t
KR20230156643A (en) * 2021-03-17 2023-11-14 가부시키가이샤 닛스이 Purification methods and purified products

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4195079A (en) * 1979-01-31 1980-03-25 Pfizer Inc. New polycyclic ether antibiotic
JPS56113791A (en) * 1980-02-15 1981-09-07 Kaken Pharmaceut Co Ltd Novel antibiotic and its preparation
GR78648B (en) * 1982-07-26 1984-09-27 Bristol Myers Co
US4539203A (en) * 1984-11-13 1985-09-03 Warner-Lambert Company CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use

Also Published As

Publication number Publication date
HK9889A (en) 1989-02-10
IL71824A (en) 1988-09-30
KE3846A (en) 1989-04-07
DK163127B (en) 1992-01-20
FI81114C (en) 1990-09-10
SE460364B (en) 1989-10-02
ES8700267A1 (en) 1986-09-16
FI81114B (en) 1990-05-31
JPS59232094A (en) 1984-12-26
HU193928B (en) 1987-12-28
IT1175498B (en) 1987-07-01
AT393691B (en) 1991-11-25
JPH02128693A (en) 1990-05-17
KR920001366B1 (en) 1992-02-11
GB8412368D0 (en) 1984-06-20
GB2141425A (en) 1984-12-19
NZ208013A (en) 1987-07-31
IL71824A0 (en) 1984-09-30
CY1465A (en) 1989-07-21
PT78590A (en) 1984-06-01
LU85362A1 (en) 1985-03-21
IT8420928A0 (en) 1984-05-15
JPH0229079B2 (en) 1990-06-27
ATA160984A (en) 1991-05-15
YU84984A (en) 1988-04-30
GR81581B (en) 1984-12-11
IT8420928A1 (en) 1985-11-15
IE841200L (en) 1984-11-16
CA1241282A (en) 1988-08-30
KR900019562A (en) 1990-12-24
FI841906A (en) 1984-11-17
ES532476A0 (en) 1986-09-16
GB2141425B (en) 1986-12-03
DK163127C (en) 1992-06-09
DK239784D0 (en) 1984-05-15
JPH0555111B2 (en) 1993-08-16
AU569294B2 (en) 1988-01-28
AU2779184A (en) 1984-11-22
YU43846B (en) 1989-12-31
FR2547594A1 (en) 1984-12-21
BE899667A (en) 1984-11-16
HUT37168A (en) 1985-11-28
SU1344249A3 (en) 1987-10-07
ZA843591B (en) 1985-02-27
IE57444B1 (en) 1992-09-09
KR840008817A (en) 1984-12-19
SE8402619L (en) 1984-11-17
FR2547594B1 (en) 1988-03-25
DE3418023A1 (en) 1984-11-22
DE3418023C2 (en) 1988-08-18
DK239784A (en) 1984-11-17
FI841906A0 (en) 1984-05-11
SE8402619D0 (en) 1984-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4675187A (en) BBM-1675, a new antibiotic complex
YOSHIDA et al. A novel antifungal antibiotic, fr-900848 i. production, isolation, physico-chemical and biological properties
US4518589A (en) BBM-2478 Antibiotic complex
EP0095154B1 (en) Biologically active ws 6049 substances, a process for the production thereof and their pharmaceutical compositions
HU184256B (en) Process for producing citostatic antibiotic complexes
NL8401572A (en) ANTIBIOTICS.
NL8501708A (en) ANTITUMOR ANTIBIOTIC.
US4360458A (en) Antitumor antibacterial agents
EP0350623A2 (en) BU-3420T antitumor antibiotic
Mizutani et al. STUDIES ON THE IONOPHOROUS ANTIBIOTICS. XXIV LEUSERAMYCIN, A NEW POLYETHER ANTIBIOTIC PRODUCED BY STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS
US4572895A (en) Process for preparing an antibiotic complex by culturing actinomyces strain ATCC 39417
Ogawa et al. RUBEOMYCIN, A NEW ANTHRACYCLINE ANTIBIOTIC COMPLEX I. TAXONOMY OF PRODUCING ORGANISM, ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITIES OF RUBEOMYCIN A, A 1, B AND B 1
US4708872A (en) Antitumor antibiotic complex
CA2351222A1 (en) Vancoresmycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical
US4868117A (en) BBM-1675, a new antitumor antibiotic complex
US4451456A (en) Antitumor antibacterial agents
US4780416A (en) Microorganism for BBM 928 production
US5116845A (en) BU-3420T antitumor antibiotic
US4952572A (en) BU-3420T antifungal antibiotic
US5639735A (en) Antitumor antibiotic compounds: hayumicins and analogs thereof
JPS60226892A (en) Antitumoral
KR100489914B1 (en) Preparation method and antioomycete activity of a novel antibiotic produced by Lechevalieria aerocolonigenes strain VK-A9 against Phytophthora capsici
CH663155A5 (en) Antitumour antibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
A85 Still pending on 85-01-01
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
DNT Communications of changes of names of applicants whose applications have been laid open to public inspection

Free format text: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY

BC A request for examination has been filed
BV The patent application has lapsed