NL8104410A

NL8104410A - Werkwijze ter bereiding van cyclodextrine.

Info

Publication number: NL8104410A
Application number: NL8104410A
Authority: NL
Original assignee: Proefstation Voor Aardappelver
Priority date: 1981-09-24
Filing date: 1981-09-24
Publication date: 1983-04-18
Also published as: JPS58129991A; US4477568A; JPH0376916B2

Description

* 1* * w

UitTTdnders^ Hendrik. Hokse, ' VO 2399 Frederik Simon Eaper,

Jacob Tines Wijpkema

Werkwijze ter bereiding van cyclodextrine

De uitvinding betreft een verkwij ze ter bereiding van cy-clodexferine door enzymatiscbe omzetting van zetmeelachtige stoffen.

Cyclodextrines zijn kristallijne, cyclische oligosaccba-riden, doorgaans bestaande uit 6, 7 of 8 glucose-eenheden (resp. aan-5 geduid als α-, β- en γ-cyclodextrine), die door 0-1,¾. bindingen onderling zijn verbonden. De drie genoemde cyclodextrines verscbillen onderling in vateroplosbaarhe id, optische draaiing, kristalvorm, enz..

Indertijd ontdekte Scbardinger, dat Bacillus macerans een enzyme kan vormen, dat bij inwerking op zetmeel cyclodextrines pro-10 duceert. Aldus vordt in relatief lage opbrengst een mengsel van cyclodextrines verkregen, dat slechts door toevoeging van toxische organische oplosmiddelen kan vorden gefractioneerd. Hadien zijn andere microorga-nismen ontdekt velke een cyclodextrinevormend enzyme, cyclodextrine gly-cosyltransferase (EC 2.it·. 1.19) genaamd en hierna soms afgekort tot CGT, 15 produceren. Hiervan kunnen vorden genoemd:

Bacillus megaterium T 5 (ATCC 21737) Amerikaans o.s. 3.812.011

Bacillus stearothermophilus (FERM-P 2217) Amerikaans o.s. 3.988-206 Bacillus So. 38-2 (ATCC 21783)

Bacillus Sp. 135 (ATCC 21595) 20 Bacillus Sp. 169 (ATCC 2159¾) Amerikaans o.s. 3.923.598

Bacillus Sp. 13 (ATCC 31006) 3acillus Sp. 17-1 (ATCC 31007) ’Micrococcus Su. Europese 0A 0.017·2¾2.

Een aantal van deze cyclodextrine glycosyltransferasen heb-25 ben het voordeel, dat zij preferentieel β-cyclodextrine vormen, vaardocr de isolatie van kristallijn cyclodextrine uit bet reaktiemengsel vordt vergemakkelijkt.

Gevonden is nu, dat bet microorganisme Bacillus circulans HIV nr. 11115 een cyclodextrine glycosyltrans?erase kan vormen, dat in 30 hoge opbrengst cyclodextrines - in bet bijzonder β-cyclodextrine - vormt.

8104410 ί 'δ -2-

Het betreft hier een nit vlasrootvater geisoleerd mi-croorganisme. Daartoe werd rootvater van vlas, afkomstig uit Zeeuws-Vlaanderen, op 37°C resp. ^8°C gehouden en werden op willekeurige tijden monsters genomen en na pasteurisatie bij 80°C uitgeplaat op het vol-5 gende medium: ' Qplosbaar zetmeel : 20 g/l

Pepton :5 g/l

Gistextrakt : 5 g/l

KgHPO^ : 1 g/l 10 MgSO^.7H20 : 0,2 g/l

FeCl3.6H20 : 20 mg/1

Agar : 18 g/l.

De pH verd ingesteld met HagCO^ op 8,5·

De platen werden geinkubeerd bij 37°C en 1+8°C gedurende ma-.jej ximaal 96 uur. Geisoleerde kolonies werden overgeSnt op nieuwe platen en opnieuv geinkubeerd onder dezelfde omstandigheden.

Om de vorming van CGT te kontroleren werden de microorga-nismen geent op schudcultures en na de groeiperiode de eellen afgecen-trifugeerd en een monster vloeistof geinkubeerd met Λ$ amylopectine-20 oplossing.

De samenstelling van de gevormde koolhydraten verd vloeistof chromatograf is ch bepaald. Van de CGT-vormende microorganismen werden reincultures aangelegd in schuine buizen. Op deze vijze werd een micro-organisme 251 geisoleerd, welke door bet RIV te Bilthoven werd gedeter-25 mineerd als Bacillus circulans met negatieve mannitol, RIV nr. 11115·

De determinatie leverde de volgende resultaten op: Morfologie : sporen ovaal, terminaal tot subterminaal, duidelijk uitpuilend.

Zuurvorming uit koolhydraten : bij 37°C (aerobb,niet verrijkt) werd uit 30 glycerol, arabinose, xylose, glucose, mannose, salicine, maltose, lactose en saccharose zuur gevormd; er werd geen zuur gevormd uit aldonitol, rhamnose, dul-citol, inositol, mannitol, sorbitol en 35 gluconaat.

8104410 -3-

Groei : goed aeroob anaeroob groei bij 1)-20C (ook in 3% HaCi), geen groei bij 6,3% Had.

5 Diverse omzettingen : geen gas nit glucose sterk oxidase positief katalase positief indol negatief

HgS-vorming negatief 10 ureum negatief * nitraatreduktie negatief, geen gas uit nitraat gelatinase positief acetoxne negatief.

1? De fermentatie geschiedde op de volgende vijze:

Oplosbaar zetmeel : 12,5 ' g/l

Pepton : 5 g/l

Gistextrakt :5 g/l

KgHPOj^ : 1 g/l 20 KHgPO^ : 1,5 g/l

MgSOip^O : 0,2 g/l

PeCl3 : 20 mg/l

Begin pH : 6*9 o

Sterilisatie : Simultaan in fermentor, 30 min. 120 C.

25 Temperatuur : U8°C

Fermentatieduur : 15 uur

Belucbting : 1l/min, bij 600 ?pm roersnelheid

pH-regeling : 5,0 <-pH ^7,0met titrator, 2 N MaOH en 2 N

HgSO^ 30 Antiscnuim : 1 cm^ MS-10 per fermentor, verder automatische dosering van suspensie van MS-10 in 0,2$ xan-thomannan, (MS = Midland Silicones).

Ent : Uit voorkweek tot 5$ van fermentatievolnme (+ T0-80 cm3).

8104410

. -U

Monstername : Automatisch met instelbare tussentijden, iedere 2- uur.

Bepaling totaal koolstof : Beckman Model 915-B TOC-Analyzer.

• Bepaling celgroei · : Optxsche dichtheid bij 650 am. Troebelings- 5 meting na 5 x verdunning.

Bepaliag azijnzuur :. Gaschromatagrafisehe analyse.

Kenmerkend hierbij zijn: 1. De fermentatietemperatuur van U8°C; deze temperatuur werd toegepast, aangezien de groei bij deze temperatuur beter is dan bij 3T°C.

10 2. De relatief korte fermentatieduur.

3. Het feit, dat de enzymevorming is gekoppeld aan de groei.

Het enzyme kan op een gebruikelijke vijze uit de fermen-tatieoplossing worden gewonnen, bij voorbeeld als volgt: concentratie van de geklaarde fermentatievloeistof door indampen in 15 vacuum; door uitzouten met bij voorbeeld ammoniumsulfaat; door precipi-tatie met bij voorbeeld ethanol of door adsorptie aan DEAE-cellulose, verknoopt dextraan of zetmeel, (Brits octrooi 1.UlU.235) gevolgd door elutie. Een zeer goede methode, die bij voorkeur wordt gebruikt, bestaat uit het toevoegen van speciale zetmeelprodukten aan de geklaarde 20 en desgewenst geultrafiltreerde fermentatievloeistof, waaraan het enzyme wordt geadsorbeerd. Door keuze van deze zetmeelprodukten, zodanig dat . zij bij kamertemperatuur onoplosbaar in water zijn, maar bij 65 C na-genoeg volledig in water oplossen, kan men het aan zetmeel geadsorbeerd enzyme als zodanig bij de cyclodextrinebereiding toepassen, zonder dat 25 een desorptie noodzakelijk is. Dergelijke zetmeelprodukten worden ver-kregendoor zetmeel, amylose of amylopectine volledig in water op te lossen, te laten retrograderen door inwerking van tijd, zouten en/of vriestemperaturen en de, eventueel na ontdooien, geprecipiteerde zetmeelprodukten af te scheiden en te drogen. Dergelijke geretrogradeerde zet-30 meelprodukten hebben een groter adsorptievermogen voor het CGT enzyme dan natief zetmeel of zetmeel behandeld boven 100°C, al of niet bij aan-wezigheid van vocht. Daar zij in water van 50-65°C vrijwel volledig oplossen, is een elutie van het enzyme overbodig. De zetmeelprodukten kun-nen worden toegevoegd aan de fermentatievloeistof in hoeveelheden van 8104410 -5- 1 g tot 5 g/1, hij voorkeur max. 3 g/1. Toevoeging van ammoniumsulfaat of organische oplosmiddelen is niet nodig. Het is voldoende 30-45 minuten te roeren, het zetmeel-enzymcomplex af te filtreren, te wassen met koud •water en te drogen.

5 De volgende eigensehappen van het enzymcomplex warden vastgesteld: pg-optimum o

Temperatuur : 35 C

Substraat : 1% oploshaar zetmeel in buffer 10 Enzym-substraat verhouding : 10 mg enzym - 5 cm3 substraatoplossing Reaktietijd : 4 uur

Buffers : pH = 4 - pH = 6 - 0,01 M citraat pH = 6 - pH - 7,5 0,01 M fosfaat pH = 7,5 - pH = 9 0,01 M Tris 15 Analyse : vloeistofchromatografische analyse, zoais beschreven in Journal of Chromatography 189 (1980) 98-100·.

Aldus verd een pH-optimum gevonden bij pH 6 - 6,5, hetgeen een duidelijk onderscheid. vormde met de CGT, genoemd in Amerikaans octrooischrift 20 3.923.598.

Temperatuurstabiliteit pH : 6 (0,01 M Ca-acetaat)

Substraat : 10% oplosbaar zetmeel in buffer

Enzyme-substraat verhouding: 10, 25 en 50 mg enzyme ----5 en 10 g substraat-25 oplossing

Reaktietijd : tot 44 uur

Temperatuur : 35, 50, 55, 60 em 65°c

Analyse : vloeistofchromatografische analyse, verdun- ning 1+8 met water.

Uit deze metingen bleek, dat bij temperaturen van 60°C het enzyme stabiel is, maar dat bij 65°C de enzyme-aktiviteit beduidend terugloopt.

Invloed van calcium op enzymstabiliteit Temperatuur " : 65°C

pH :6 8104410 J- t -6-

Substraat : 10# oplosbaar zetmeel in buffer

Reaktietijd : tot W uur

Analyse : als boven

Buffer : 0,01 M Na-citraat met resp. 0, 1 en 5 ' 10· nmol Ca-acetaat/liter.

Enzym-substraat verhouding : 25 mg' - 10 g substraatoplossing.

Uit deze proeven is gebleken,-dat de aanwezigheid van calcium stabili-serend werkt op bet enzyme.

Produktie van g-CD

10 Temperatuur : 50° (voor de zetmeelconcentraties vanien2#) en 60°C (voor cie zetmeelconcentraties van5 .entE^) pH :6

Substraat : oplosbaar zetmeel, resp. 1, 2, 5 en 10$

Eeaktietijd : UU uur 15 Enzym-substraat verhouding : maximaal 50 mg, minimaal 5 mg enzym per 5 gram substraatoplossing Analyse * : als boven

De resultaten worden weergegeven in de volgende tabel: TAPED- A : De produktie van cyclodextrine bij verschillende oplosbaar-20 zetmeelconcentraties. Samenstelling van het reaktiemengsel na W uur reaktie: % cone. Enz. % rest % % % % oplosbaar prep, poly- a-CD S-CD Y-CD CD a : 6 : γ zetmeel mg meer 25 1 10 10 86,6 1;2. 9,9 2,3 13,¾ 1 : 8,3 : 1,9 2 10 25 77,7 2,5 15,7 M 22,3 1:6,3 :1,6 3 10 50 70,1 2,8 20,¾ 6,7 29,9 1 : 7,3 : 2,¾ ¾ 5 5 87,6 1,5 9,1 1,8 12,¾ 1 : 6,1 : 1,2 55 10 73,2 2,8 18,9 5,1 26,8 1 : 6,8 : 1,8 30 6 5 25 65,5 3,9 25,1 5,5 3^,5 1 : 6,¾ : 1,¾ 7 2 5 67,7 3,3 22,8 6,2 32,3 1 : 6,9 : 1 ,9 •8 2 10 61,9 M 27,9 5,9 38,1 1 : 6,5 : 1,¾ -9 2 15 52,1 6,0 33,5 8,¾ ¾7,9 1 : 5,6 : 1,¾ io 1 5 5M 6,0 35,0 5,0 ¾6,0 1 : 5,8 : 0,8 35 11 1 10 40,0 8,0 ^,0 12,0 60,0 1:5 : 1,5 12 1 15 39,5 8,0 to,0 12,5 60,5 1:5 : 1 ,6 8104410 e -7-

Uit deze tabel blijkt, dat het nieuwe CGT-enzyme tenminste 60% cyclo-dextrines kan vormen, waarvan 66% uit fr^cyelodextrine bestaat.

Als zetmeelachtige grondstoffen kunnen o.a. worden gebruikt ’zetmeel van mais, kleefmais, tarwe, sorghum, aardappelen, enz.. Ook kan 5 men oplosbaar zetmeel, amylose of amylopectine gebruiken. Het zetmeel wordt bij voorkeur gedispergeerd in water bij 110-- 170°C of enzymatisch rerviSeid. bij 80 - 95°C, waarbij hefcdextrose-equivalent beneden de 10 wordt gehouden. Bij voorkeur wordt 1-2# enzyme (g/g droge stof) toegevoegd. De pH ligt tussen 4 en 7» bij voorkeur 5,5 - 6,5, terwijl de 10 reaktietemperatuur beneden 65°C, bij voorkeur 55 - 60°C, wordt ingest eld. De zetmeelconcentratie wordt voor fabrieksmatige bereiding het meest e-conomisch op 5 - 2.0% gehouden, waarbij de reaktieduur kan varieren .van 1 - U. dagen. Ha de reaktie wordt het enzyme geinactiveerd door verhitting op 100 - 120°C. Het is dan mogelijk om na eventuele ontkleuring en filtra-15 tie polymere zetmeelsuikers te preeipiteren bij voorbeeld met ethanol en het filtraat in te dampen onder vacuum. Door afkoeling tot +; 12°C wordt het β-cyclodextrine tot kristallisatie gebracht, afgefiltreerd, met koud gedemineraliseerd water gewassen en gedroogd. Een andere mogelijkheid is om de polymere zetmeelsuikers af te breken door toevoeging van ct-amylase 20 0f giucoamylase. Ha ontkleuring, filtratie, indampen, demineralisering met ionenwisselaars kan de β-cyclodextrine tot kristallisatie worden gebracht. De moederloog, die een mengsel van α-, β- en γ-cyclodextrine alsmede glucose, maltose en oligosaccharides bevat, kan ook als bron van cyclodextrine in de praktijk worden toegepast. Dezelfde mogelijk-25 heid bestaat voor een gesproeidroogd produkt verkregen door de vloeistof (eventueel na enzymatische afbraak) in zijn geheel te sproeidrogen.

Een elegante manier om de cyclodextrines van elkaar en van de zetmeelprodukten te scheiden is door vloeistofchromatografie over een poreuze polystyreenhars met sulfonzuurgroepen, bij voorkeur in de cal-30 ciuravorm, bij voorbeeld Dowex50W-X 2, Dowex 50 W-X U, Aminex AG^H-X^. Men kan de kolom elueren met warm water,’ waardoor het gebruik van organi-sche oplosmiddelen overhodig wordt. a-Cyclodextrine wordt het minst sterk vastgehouden op de kolom, γ-cyclodextrine wordt steviger vastgehou-den en 3-cyclodextrine nog steviger.

8104410 I' -t -8-

Een "bij voorkeur toegepaste methode bestaat in het onder-werpen van de reaktievloeistof aan ultrafiltratie, waarbij de membranen (scheiding tot molecuulgewicht 5000) de cyclodextrines in het permeaat doorlaten en het zetmeel en het enzyme tegenhouden. Door de zetmeel-5 produkten aan voortgezette·. enzymatische omzetting te onderwerpen vordt . op deze wijze de opbrengst aan cyclodextrines aanzienlijk verhoogd, terwijl de gevormde cyclodextrines .een zodanigezuiverheid hebben, dat het 0-cyclodextrine zonder verdere kunstgrepen nit het geconcentreerde permeaat kan worden gekristalliseerd. fO Cyclodextrines worden in de praktijk toegepast vanwege hun grote vermogen om met een groot aantal organische verbindingen kris-tallijne complexen (insluitverbindingen) te vormen.

VOOKBEELD I

Een aardappelzetmeelsuspensie van 12°Be (+ 20% droge-stofgehalte)' in leidingwater, waarvan de pH was ingesteld op 6,5s werd gedispergeerd in een "jetcooker" bij 1U0°C. Na afdamping werd verdund met leidingwater ter verkrijging van een zetmeeloplossing met een droge-stofgehalte van 10% en een temperat uur van 65°G. Aan deze zetmeeloplossing werd o,o t g/g drogestof zetmeel CGT, afkomstig van Bacillus circu-20 Ians RIV nr. 11115 geadsorbeerd aan een geretrogradeerd zetmeelprodukt, toegevoegd. Ha uur reageren bij 57°C werd de reaktie thermisch afge- ..o stopt bij 100 c en pH k,8, na toevoeging van 0,2% Dicalite. Aan de ge- filtreerde vloeistof werd een equivalente volumehoeveelheid 98%’s ethanol toegevoegd. De neergeslagen polymere zetmeelsuikers werden afgefiltreerd, 25 de ethanol afgedampt en het filtraat onder verminderde druk mgedampt tot 25 Bx; · Door afkoeling tot 12 c en enting kristalliseerde de g-cyclo-dextrine uit. De kristallen werden afgef iltreerd, gewassen met koud gedemi-neraliseerd water engedroogd. Opbrengst: 20 g 0-cyclodextrine per 100 g zetmeel. Het kristallijne produkt bevatte meer dan 98% 0-cyclodextrine, 30 o,2 ppm calcium, 90 ppm natrium en 15 ppm kalium.

V00RBEELD II

Een aardappelzetmeeloplossing met 20% drogestof, verkregen ' r o als in Voorbeeld I, werd bij een temperatuur van 60 C in een membraanre-aktor (Amicon, Model 202) met membranen van het type YH 5 (scheiding tot 8104410 molecuulgevicht 5000) omgezet met 0,01% g/g drogestof zetmeelCGT, afkomstigTan Bacillus eirculans RIV nr. 1111? geadsorbeerd aan geretrogradeerde amy-lopectine. Door middel van -water onder overdruk (0,75 ato) -werd het volume konstant gehouden. De gevormde cyclodextrines bevonden zicb in bet 5 permeaat. Ha U8 uur was de drogestof in de reaktor nog 1%. In bet perme-aat bevond zich dan 5$,5% cyclodextrine (berekend op de uitgangsboeveel-beid zetmeel), vaaruit zicb na concentratie h2% kristallijne B-cyclodex-trine liet winnen. Ter vergelijking diene ν' dat de opbrengst aan cyclodextrines uit een 20% zetmeeloplossing normaliter slecbts 18,5% bedraagt, 10 waarvan 10% kristallijne 3-cyclodextrine kan worden gewonnen als in Voorbeeld I.

8104410

Claims

3. Werkwijze volgens eonclusie 1 en-2,.m e t het kenmerk, dat het enzyme vordt toegepast in geadsorbeerde vorm op een zetmeelprodukt dat bij karnertemperatuur in water onoplosbaar is, maar oplost in water bij een temperatunr tot 65°C.
10 U. Werkwijze volgens conclusies 1-3, methetken- m e r k, dat men tijdens de enzymatische omzetting de reaktievloeistof onderwerpt aan nltrafiltratie, vaarbij de doorgelaten cyclodextrines wor-den afgevoerd, en de tegengehouden zetmeelprodukten verder enzymatisch omzet. 15 5- Werkvi j ze volgens conclusies 1-1*, met het'kenmerk, dat het cyclodextrine vordt gefractioneerd door vloeistofchromatografische scheiding op een kolom van een polystyreensulfonzuurharsy 8104410