NL1005677C2 - Werkwijze voor het winnen van groeifactoren, of een samenstelling die één of meer groeifactoren bevat, uit melk of een derivaat daarvan. - Google Patents

Description

VO 1077

Titel: Werkwijze voor het winnen van groeifactoren, of een samenstelling die één of meer groeifactoren bevat, uit melk of een derivaat daarvan

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het winnen van groeifactoren, of een samenstelling die één of meer groeifactoren bevat, uit melk of een derivaat daarvan.

5 Melk bevat behalve de zogenaamde macro- voedingsstoffen (vetten, eiwitten, koolhydraten) een groot aantal micro-componenten met een specifieke functionaliteit. De bekendste hiervan zijn lactoferrine en lactoperoxidase, maar ook een diversiteit aan groeifactoren 10 behoort tot deze groep van micro-componenten.

Lactoferrine en lactoperoxidase kunnen uitstekend op industriële schaal uit melk of melkproducten worden gewonnen. In het Amerikaanse octrooischrift 5.596.082 is een werkwijze beschreven, waarbij lactoferrine en 15 lactoperoxidase aan een kationenwisselaar worden geadsorbeerd door melk of een melkproduct met een hoge aanstroomsnelheid (meer dan 500 cm per uur) en een hoge vloeistofbelasting (100-600 bedvolumes per uur) over de kationenwisselaar te leider en vervolgens de 20 kationenwisselaar te elueren met een aantal zoutoplossingen van verschillende concentratie. Aldus worden een lactoferrine bevattende fractie en een lactoperoxidase bevattende fractie verkregen, die op gebruikelijke wijze kan worden opgewerkt.

25 De groeifactoren die in melk en derivaten daarvan aanwezig zijn, hebben verschillende, zeer specifieke werkingen. Deze werkingen, die veelal te herkennen zijn aan de naam van de betreffende groeifactor, kunnen positieve effecten hebben bij de mens. Er is gesuggereerd Epidermal 30 Growth Factor (EGF) toe te passen teneinde het herstel van huid bij wonden te bevorderen. Van Insulin Growth Factor (IGF) wordt aangenomen dat het een belangrijke rol speelt in het botvormingsmetabolisme.

1005677 2

Een tweetal overzichten van de in melk aanwezige groeifactoren wordt gegeven door D. Schams in Endocrine Regulations, 2fi, (1994), 3-8 en door C.E. Grosvenor et al. in Endocrine Reviews, JL4., (1992), 710-728, waarbij in het 5 laatste artikel tevens een kwalitatief overzicht van de in melk aanwezige hormonen wordt gegeven.

In de stand der techniek zijn verschillende werkwijzen beschreven voor het isoleren van andere micro-componenten dan lactoferrine en lactoperoxidase uit melk.

10 In de Europese octrooiaanvrage 0 556 083 is een werkwijze beschreven waarbij een zogenaamde "secretory component" wordt geïsoleerd. Volgens deze werkwijze wordt melk of een melkderivaat geadsorbeerd aan een kationenwisselaar, waarna verschillende fracties worden 15 verkregen door elutie met zoutoplossingen met verschillende concentraties. Behalve een fractie die de "secretory component" bevat, worden hierbij lactoferrine en lactoperoxidase bevattende fracties verkregen. Echter, door de lange contacttijden die bij de adsorptie nodig zijn en 20 geringe doorstroomsnelheden die te realiseren zijn, is deze werkwijze niet geschikt voor industriële toepassing.

In WO-A-95/26984 is een werkwijze beschreven voor het bereiden van een samenstelling die een runder-insuline-achtige groeifactor-1 bevat. Daarbij wordt uitgegaan van 25 vooraf verhitte kaaswei of taptemelk. De soort en de hoeveelheid van de groeifactoren, die kunnen worden geïsoleerd, is bij deze werkwijze echter beperkt.

De Europese octrooiaanvrage 0 489 884 beschrijft de isolering van groeifactoren uit biest, een grondstof die 30 van nature rijk is aan groeifactoren. De beschreven werkwijze vereist een aantal achtereenvolgende chromatografische stappen met verschillende kolomvullingen. Volgens deze werkwijze blijkt slechts de helft van de aanwezige groeifactoren te kunnen worden gewonnen.

35 Het is een doel van de uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het winnen van één of meer groeifactoren 1005677 3 uit melk of derivaten daarvan, waarbij een hoge opbrengst aan groeifactoren gerealiseerd wordt.

Het is een ander doel van de uitvinding een werkwijze voor het winnen van één of meer groeifactoren uit 5 melk of derivaten daarvan te verschaffen, welke werkwijze kan worden gecombineerd met een industrieel proces voor het winnen van lactoferrine en lactoperoxidase en waarbij het winnen van de groeifactor(en) geen noemenswaardig nadelig effect heeft op de opbrengst aan lactoferrine en 10 lactoperoxidase en omgekeerd.

Een mogelijke wijze om deze doelen te bereiken zou kunnen bestaan uit het adsorberen van de groeifactoren uit de melk of het derivaat daarvan aan een kationenwisselaar gevolgd door gefractioneerde elutie van de 15 kationenwisselaar. Thans is echter gevonden dat de verdere opwerking van een aldus verkregen fractie die verrijkt is aan groeifactoren problemen oplevert.

Ter verdere opwerking van een fractie, die is verkregen na adsorptie aan een kationenwisselaar gevolgd 20 door elutie, worden doorgaans enkele vervolg behandelingen uitgevoerd, zoals ontzouten, concentreren, verwijderen en/of afdoden van aanwezige bacteriën en drogen. Gebleken is dat bij de uitvoering van deze behandelingen enerzijds onaanvaardbaar grote hoeveelheden groeifactoren verloren 25 gaan. Anderzijds is gebleken, dat de bij het verrichten van de genoemde behandelingen benodigde apparatuur, zoals filters en ionenuitwisselaars, slechts gedurende korte tijd bruikbaar zijn, voordat deze schoongemaakt en/of vervangen moeten worden.

30 Derhalve bestaat een ander doel van de uitvinding uit het verschaffen van een werkwijze voor het winnen van één of meer groeifactoren uit melk of derivaten daarvan, waarbij de verdere opwerking van een aan groeifactoren verrijkte fractie niet of nauwelijks ten koste gaat van de 35 opbrengst aan groeifactoren.

1005677 4

Volgens de uitvinding kunnen de bovenstaande doelen worden bereikt, zonder dat de genoemde problemen bij de verdere opwerking optreden, doordat ten minste één groeifactor uit de melk of het derivaat daarvan aan een 5 kationenwisselaar wordt geadsorbeerd, gevolgd door gefractioneerd elueren van de kationenwisselaar, waarbij ten minste één fractie verkregen wordt die verrijkt is aan groeifactoren, gevolgd door het verder opwerken van deze fractie bij een pH van niet meer dan 4,5.

10 Thans is gevonden dat, wanneer de opwerking van de fractie verrijkt aan groeifactoren bij een pH van niet meer dan 4,5 wordt uitgevoerd, de bovengenoemde problemen niet optreden, zodat bij de verdere opwerking geen groeifactoren verloren gaan en de opbrengst aan groeifactoren bijzonder 15 hoog is. Eventueel gebruikte filters en/of ionenuitwisselaars blijken niet dicht te slibben en gaan dus langer mee. Verrassenderwijs ondervinden de groeifactoren en de opbrengst daarvan niet of nauwelijks nadelige effecten van het werken onder zure omstandigheden.

20 Als uitgangsstof voor de werkwijze volgens de uitvinding komen melk en alle groeifactoren bevattende derivaten daarvan, zoals kaaswei of caseïnewei, in aanmerking. De voorkeur gaat uit naar melk als uitgangsstof omdat melk aanzienlijke hoeveelheden groeifactoren bevat en 25 in grote hoeveelheden voorhanden is.

De uitgangsstof wordt bij voorkeur eerst onderworpen aan een minimale hittebehandeling. Dit is voordelig, omdat bij een dergelijke hittebehandeling een aanzienlijk deel van de van nature in melk voorkomende bacteriën wordt 30 gedood. Onder een minimale hittebehandeling wordt een verhitting tot maximaal 80°C gedurende niet meer dan enkele seconden verstaan.

Voorts is het zeer voordelig om de uitgangsstof van vet te ontdoen alvorens haar te onderwerpen aan de 35 adsorptie- en elutiestappen. Gebleken is dat na ontvetting de kolom, waarin de kationenwisselaar gevat is, vrijwel 1 0 0 5 6 7 7 5 niet versmeerd of verstopt raakt, tijdens de adsorptiestap aan de kationenwisselaar. Aldus wordt voorkomen dat een te grote drukopbouw in de kolom zou optreden en dat de adsorptiecycli ongunstig kort zouden worden.

5 Het heeft de voorkeur de ontvetting uit te voeren door middel van microfiltratie, omdat daarbij tevens een reductie van de micorbiële besmetting van de uitgangsstof bewerkstelligd wordt. Onder microfiltratie wordt in dit verband verstaan het filtreren over een filter met 10 openingen tussen 0,1 en 10 μιη.

De kationenwisselaar, waaraan de melk of het derivaat daarvan volgens de uitvinding wordt geadsorbeerd, kan elke in dit veld van de techniek gebruikelijke kationenwisselaar zijn. Bij voorkeur wordt een 15 kationenwisselaar gebruikt met een gemiddelde korrelgrootte boven 100 μπι en een voldoende mechanische sterkte om grote druk te weerstaan. Dit heeft als voordeel dat de kationenwisselaar bestand is tegen hoge vloeistofbelasting. terwijl de bindingscapaciteit behouden blijft, zodat de 20 voor een industrieel toepasbaar proces benodigde grote vloeistofhoeveelheden in de gewenste korte tijd verwerkt kunnen worden. Voorbeelden van geschikte kationenwisselaars zijn Toyo Pearl MD-P SP, SP-Toyo Pearl, SP-Sepharose en Sepharose Big Beads.

25 Bij voorkeur wordt de kationenwisselaar vooraf geconditioneerd door buffering met een fosfaatbuffer met een pH-waarde van 5,5-7,5. Vervolgens wordt de melk of het derivaat daarvan door een kolom met de kationenwisselaar geleid, bijvoorbeeld door pompen, waarbij micro-componenten 30 uit de uitgangsstof aan de kationenwisselaar adsorberen. De adsorptie wordt bij voorkeur bij een temperatuur lager dan 10°C uitgevoerd om eventuele microbiële groei tot een minimum te beperken.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de 35 uitvinding wordt de uitgangsstof met hoge aanstroomsnelheid (meer dan 500 cm per uur) en hoge vloeistofbelasting 1005677 6 (100-600 bedvolumes per uur) over een kationenwisselaar met een gemiddelde deeltjesgrootte van 100-3 00 μτη gepompt, zoals is beschreven in het bovengenoemde Amerikaanse octrooischrift 5.596.082. Volgens deze uitvoeringsvorm 5 wordt een vanuit economisch standpunt zeer gunstig proces gerealiseerd, dat buitengewoon goed op industriële schaal toepasbaar is.

Bij voorkeur wordt de kolom met de kationenwisselaar na de adsorptiestap gereinigd van achterblijvend 10 melkproduct (uitgangsstof) door te wassen met een zout (NaCl) oplossing die is gebufferd bij een pH gelegen tussen 5,5 en 7,5 en die een zout concentratie van 0,2 molair of minder heeft.

Na de adsorptie van de uitgangsstof aan de 15 ionenuitwisselingshars wordt een gefractioneerde elutie uitgevoerd. Dit betekent dat achtereenvolgens met verschillende elutiemiddelen wordt geëlueerd ter verkrijging van een aantal fracties die een verschillende samenstelling aan micro-componenten hebben.

20 Bij voorkeur worden ten minste drie elutiestappen uitgevoerd met verschillende zoutoplossingen die zijn gebufferd op een pH tussen 5,5 en 7,5, bij voorkeur op een pH van circa 6,5. Door een steeds hogere zoutconcentratie toe te passen kunnen achtereenvolgens fracties worden 25 verkregen die verrijkt zijn aan verschillende micro- componenten afkomstig uit de melk of het derivaat daarvan.

Elueren met een oplossing met een lage NaCl concentratie, bijvoorbeeld tussen 0,15 en 0,25 molair, levert een fractie die in hoofdzaak lactoperoxidase bevat. 30 Door vervolgens te elueren met een oplossing met een hogere NaCl concentratie, bijvoorbeeld tussen 0,25 en 0,5 molair, wordt de aan groeifactoren verrijkte fractie verkregen, welke fractie tevens kleine hoeveelheden lactoperoxidase en lactoferrine bevat. Door tenslotte te elueren met een 35 zoutoplossing die een nog hogere concentratie molair NaCl 1 0 0 5 67 7 7 bevat, bijvoorbeeld tussen 0,7 en 1,2, wordt een fractie verkregen die hoofdzakelijk lactoferrine bevat.

De verschillende fracties kunnen worden gekarakteriseerd door middel van FPLC, 'fast protein liquid 5 chromatography', met bijvoorbeeld een mono-S-kolom. Deze FPLC techniek kan eventueel ook worden toegepast om op preparatieve schaal één of meer van de verkregen fracties verder te zuiveren.

De verkregen fracties die in hoofdzaak lactoferrine 10 respectievelijk lactoperoxidase bevatten, kunnen volgens gebruikelijke methoden verder worden verwerkt. Deze methoden kunnen de stappen van ontzouten, concentreren, bacterievrij maken en drogen omvatten. Aldus kan de werkwijze volgens de uitvinding op zeer voordelige wijze 15 worden gecombineerd met een winningsproces van lactoferrine en lactoperoxidase uit melk of een derivaat daarvan op industriële schaal.

Zoals hierboven reeds is uiteengezet, is het volgens de uitvinding van essentieel belang dat de fractie verrijkt 20 aan groeifactoren die is verkregen na de gefractioneerde elutie verder wordt opgewerkt bij een pH van niet meer dan 4,5. Bij voorkeur wordt de fractie verrijkt aan groeifactoren verder opgewerkt bij een pH van niet meer dan 4, aangezien aldus een nog hogere opbrengst aan 25 groeifactoren wordt bereikt. De genoemde pH waarden kunnen worden bereikt door aanzuren van het eluaat met zoutzuur, of elk ander zuur dat geen nadelig effect op de groeifactoren heeft.

Eén van de handelingen waaraan de fractie verrijkt 30 aan groeifactoren kan worden onderworpen ter verdere opwerking, is ontzouten. Na de elutie met de zoutoplossingen zal de fractie die de gewenste groeifactoren bevat een aanzienlijke hoeveelheid zout, in het bijzonder NaCl, bevatten. Bij mogelijke toepassingen 35 van de groeifactoren kunnen deze zouten ongewenst zijn. Het ontzouten kan worden uitgevoerd met behulp van 1005677 8 elektrodialyse of ultrafiltratie. Onder ultrafiltratie wordt in dit verband verstaan het filtreren over een membraan beneden 2,5 kDa. Een groot voordeel van de uitvinding is dat er geen gevaar bestaat voor het 5 dichtslibben van het ultrafiltratie membraan ten gevolge van aanwezigheid van neerslagen die kunnen worden gevormd in de fractie verrijkt aan groeifactoren.

Een andere handeling die veelal deel uit zal maken van de verdere opwerking is het verder zuiveren of 10 concentreren van de fractie verrijkt aan groeifactoren. De verdere zuiveringsstap bestaat bij voorkeur uit een tweede chromatografiestap onder toepassing van een kationenwisselaar. Hierbij worden de in de fractie aanwezige lactoperoxidase en lactoferrine van de 15 groeifactoren gescheiden. Het uitvoeren van een tweede chromatografiestap is gunstig omdat daarbij geen groeifactoren, lactoferrine of lactoperoxidase verloren gaan, hetgeen veelal wel het geval is door verwijdering van lactoferrine en lactoperoxidase door inactivering door 20 verhitting en afscheiding.

Gevonden is dat, bij de belading van een kationenwisselaar, die met een oplossing met een concentratie NaCl van 0,15-0,25 molair is geconditioneerd, met de fractie verrijkt aan groeifactoren, de 25 vloeistofdoorloop vrijwel alle nog aanwezige lactoperoxidase bevat. Door vervolgens achtereenvolgens te elueren met NaCl-oplossing met concentraties van 0,4-0,7 en 0,8-1,2 molair worden twee fracties verkregen. De eerste van die twee bevat vrijwel uitsluitend groeifactoren en de 30 tweede bevat vrij zuiver lactoferrine.

Een derde handeling die onderdeel kan zijn van de opwerking van de fractie verrijkt aan groeifactoren is het verwijderen van de daarin aanwezige bacteriën en/of het afdoden van die bacteriën. Bij voorkeur worden de bacteriën 35 verwijderd door microfiltratie, daar hierbij geen product verloren gaat of geïnactiveerd wordt.

1005677 9

Een vierde handeling waaraan de fractie verrijkt aan groeifactoren kan worden onderworpen is drogen, ter bevordering van de houdbaarheid van het verkregen product. Voorkeurswijzen van drogen zijn sproeidrogen of 5 vriesdrogen.

Indien het gewenst is de verschillende groeifactoren, die in de verkregen fractie verrijkt aan groeifactoren aanwezig zijn, van elkaar te scheiden, kan de fractie worden onderworpen aan een vijfde mogelijkheid van 10 verdere opwerking. Een dergelijke scheidingsstap kan worden uitgevoerd met bijvoorbeeld preparatieve FPLC.

De vijf genoemde behandelingen die deel uit kunnen maken van de opwerking van de fractie verrijkt aan groeifactoren die volgens de uitvinding wordt verkregen na 15 gefractioneerde elutie kunnen in elke geschikte volgorde worden uitgevoerd. Het zal niet in alle gevallen nodig of gewenst zijn om alle vijf de handelingen uit te voeren. De vakman zal in de gegeven situatie in staat zijn om te bepalen welke handelingen in welke volgorde dienen te 20 worden uitgevoerd, afhankelijk van de toepassing van het verkregen materiaal. De bovengenoemde problemen met de vorming van een vaste stof in de fractie verrijkt aan groeifactoren treden volgens de uitvinding echter bij geen van de vijf behandelingen op.

25 Tenslotte heeft de uitvinding tevens betrekking op een groeifactor of op een samenstelling, die één of meer groeifactoren bevat, alsmede op lactoperoxidase, lactoferrine of een samenstelling die lactoperoxidase of lactoferrine bevat, verkrijgbaar onder toepassing van de 30 hierboven beschreven werkwijzen.

De uitvinding zal thans nader worden toegelicht aan de hand van de volgende, niet als beperkend te achten voorbeelden.

1005677 10

Voorbeeld 1

Een ionenwisselingskolom met een diameter van 1,6 meter werd gepakt met 200 liter grofkorrelige (100-300 μπι) 5 kationenwisselaar (S-Sepharose Big Beads, verkrijgbaar bij Pharmacia), waardoor een bedhoogte van 10 centimeter ontstaat. De kolom werd geconditioneerd met een fosfaatbuffer (pH=6,5, 0,025 molair fosfaat). Gedurende 3 uur werd gemicrofiltreerde mager melk door deze kolom 10 gepompt met een snelheid van 100 bedvolumes per uur, in totaal 60.000 liter.

Hierna werd de kolom gewassen met 5 bedvolumes gebufferde (pH=6,5) 0,1 M NaCl-oplossing. Vervolgens werden de aan de kolom geadsorbeerde micro-componenten 15 achtereenvolgens geëlueerd met: a) 5 bedvolumes 0,2 M NaCl-oplossing, b) 5 bedvolumes 0,3 M NaCl-oplossing, c) 5 bedvolumes 1,0 M NaCl-oplossing.

Eluaten a) en c), welke in hoofdzaak respectievelijk 20 lactoperoxidase en lactoferrine bevatten, werden via ultrafiltratie bij een pH van 6,5 ontzout en gedroogd.

Eluaat b), dat naast residuen lactoferrine en lactoperoxidase groeifactoren bevatte, werd aangezuurd met zoutzuur tot een pH van 4 en vervolgens geultrafiltreerd 25 met een 2,5 kDa membraan (verkrijgbaar bij Koch) tot een geleidbaarheid van 2,5 mS was bereikt (volumereductie 99%).

Na microfiltratie werd geneutraliseerd tot een pH van 6,5 en aansluitend werd gedroogd en geanalyseerd met behulp van FPLC. In het verkregen chromatogram waren de 30 pieken voor lactoperoxidase en lactoferrine duidelijk herkenbaar en waren pieken voor de groeifactoren te onderscheiden.

1005677 11

Voorbeeld 2

Onder identieke omstandigheden aan die welke zijn beschreven in Voorbeeld 1 werd een 0,3 M NaCl-eluaat 5 verkregen uit rauwe, magere melk.

Dit eluaat werd aan een tweede chromatografiestap onderworpen, waarbij een tweede kolom, met een diameter van 1,6 centimeter, gevuld met 40 ml kationenwisselaar (S-Sepharose) en geconditioneerd met 0,2 M NaCl-oplossing met 10 een pH van 6,5 werd gebruikt. Het eluaat werd door deze kolom gepompt met een snelheid van 10 bedvolumes per uur.

De vloeistofdoorloop bevatte residueel lactoperoxidase, terwijl de groeifactoren en de lactoferrine aan de kolom geadsorbeerd werden.

15 Vervolgens werd achtereenvolgens met een 0,55 M

NaCl-oplossing (in totaal 5 bedvolumes) en een 1 M NaCl-oplossing geëlueerd, waarbij het laatste eluaat dat hierbij werd verkregen lactoferrine bevatte. De fractie die verkregen werd door elutie met 0,55 H NaCl-oplossing werd 20 met zoutzuur op een pH van 4 gebracht, geultrafiltreerd tot een geleidbaarheid van 2,5 mS en aansluitend gedroogd.

Met behulp van chromatografische identificatie met FPLC werd aangetoond, dat het gedroogde product nauwelijks nog lactoferrine en/of lactoperoxidase bevatte.

10056/7

Claims (19)

1. Werkwijze voor het winnen van één of meer groeifactoren uit melk of een derivaat daarvan, omvattende het adsorberen van ten minste één groeifactor uit de melk of het derivaat daarvan aan een kationenwisselaar, gevolgd 5 door gefractioneerd elueren van de kationenwisselaar, waarbij ten minste één fractie verkregen wordt die verrijkt is aan groeifactoren, gevolgd door het verder opwerken van deze fractie bij een pH van niet meer dan 4,5.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het verder 10 opwerken van genoemde fractie geschiedt bij een pH van niet meer dan 4.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de genoemde fractie verder wordt opgewerkt door ontzouten en/of concentreren.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij wordt ontzout door ultrafiltratie of door elektrodialyse.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij wordt geconcentreerd door nogmaals te adsorberen aan een kationenwisselaar en gefractioneerd te elueren.

6. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarbij de melk of het derivaat daarvan wordt ontvet, voor de adsorptie aan de kationenwisselaar plaatsvindt.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de melk of 25 het derivaat daarvan wordt ontvet door toepassing van microfiltratie.

8. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarbij de melk of het derivaat daarvan vooraf een minimale hittebehandeling heeft ondergaan. 1005677

9. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarbij het adsorberen van ten minste één groeifactor aan een kationenwisselaar wordt uitgevoerd door de melk of het derivaat daarvan met hoge aanstroomsnelheid 5 en hoge vloeistofbelasting door een kolom gevuld met de kationenwisselaar te leiden.

10. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusie, waarbij voorafgaand aan de fractie welke verrijkt is aan groeifactoren ten minste één fractie wordt 10 gewonnen die verrijkt is aan lactoperoxidase.

11. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusie, waarbij volgend op de fractie welke verrijkt is aan groeifactoren ten minste één fractie wordt gewonnen die verrijkt is aan lactoferrine.

12. Werkwijze volgens conclusie 10 of 11, waarbij één of meer van genoemde fracties verder opgewerkt wordt onder vorming van een lactoperoxidase en/of lactoferrine product.

13. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarbij verder wordt opgewerkt door de in de 20 fractie aanwezige bacteriën af te doden en/of te verwijderen.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, waarbij de bacteriën worden verwijderd onder toepassing van microfiltratie.

15. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarbij de fractie verder wordt opgewerkt door te sproeidrogen of te vriesdrogen.

16. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarbij de fractie die verrijkt is aan 30 groeifactoren wordt gescheiden onder toepassing van 'fast protein liquid chromatography1-technieken.

17. Groeifactor of samenstelling, die één of meer groeifactoren bevat, verkrijgbaar onder toepassing van een werkwijze volgens conclusies 1-16. 1005677

18. Lactoperoxidase of samenstelling die lactoperoxidase bevat verkrijgbaar onder toepassing van een werkwijze volgens conclusies 10 en/of 12-15.

19. Lactoferrine of samenstelling die lactoferrine bevat 5 verkrijgbaar onder toepassing van een werkwijze volgens conclusies 11-15. 1005677 ! SAMENWERKINGSVERDRAG (PCT) RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHEIDSONDERZOEK VAN INTERNATIONAAL TYPE IOENTIFIKATIE VAN OE NATIONALE AANVRAGE Kenmerk van de aanvrager of van d· gemachtigde NW 1077 Nederlandse aanvrage nr. Indieningsdatum 1005677 27 maart 1997 Ingaroapan voorrengsdetum Aanvrager (Naam) CAMPINA MELKUNIE B.V. Datum van het verzoek voor aan onderzoek van internationaal tv pa Door da Instantie voor Internationaal Onderzoek (ISA) aan het var* zoek voor aan onderzoek van internationaal type toegekend nr. SN 29182 NL I. CLASSIFICATIE VAN HET ONOERWERP (bij toepassing van verschillende classificaties,ale classificatiesymbolen opgeven) Volgens da Internationale classificatie IIPC) Int. Cl.6: C 07 K 14/475, C 07 K 14/79, C 12 N 9/08, C 07 K 1/22 II. ONDERZOCHTE GEBIEDEN VAN DE TECHNIEK Onderzochte minimum documentatie Classificatiesysteem Clessificatiesymbolen Int. Cl.6 C 07 K, C 12 N Onoerzoch» andere documentatie dan da minimum documtntatia voor zover dergelijke documenten in de onderzochte gebieden zijn oogenom en * III. [^] GEEN ONOERZOEK MOGELIJK VOOR BEPAALOE CONCLUSIES (opmerkingen op aanvullingsblad) A IV. □ GEBREK AAN EENHEID VAN UITVINDING (opmerkingen op aanvullingsblad) Ψ - Form PCT/ISA/TOK») 07.tg79