MXPA06004235A - Metodo de separar y ensayar multimero de adiponectina. - Google Patents

Abstract

La intencion es proveer un metodo de separar adiponectina, la cual existe en forma de varias especies multimericas en una muestra biologica, y ensayar inmunologicamente la misma; y un metodo de separar y ensayar un multimero de adiponectina para obtener datos que no se pueden adquirir ensayando meramente estos multimeros de adiponectina en total, ensayar asi con mas precision la relacion entre la adiponectina y las enfermedades; especialmente, un metodo de separar y ensayar un multimero de adiponectina en una muestra biologica, caracterizado porque comprende separar el multimero de adiponectina a ensayar de otra especie multimerica de adiponectina, usando una proteasa y/o anticuerpo y ensayar inmunologicamente el mismo.

Description

MÉTODO PARA SEPARAR Y ENSAYAR UN ULTIMERO DE APIPONECTiNA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a selectivamente ensayar formas de multímeros de adiponectina (de aquí en adelante referidas como multímeros de adiponectina) presentes en una muestra biológica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La adiponectina es una hormona sensible a insulina que es específicamente secretada de células grasas, y está presente en la sangre a un nivel relativamente alto (de 5 a 10 µl/ml). Se ha reportado un efecto fisiológico de adiponectina a través de los presentes inventores; es decir, la disminución en el nivel de adiponectina es una causa de diabetes de tipo -II debido a la obesidad o una causa del trastorno de metabolismo del azúcar o lípido en diabetes lipoatrófica (Documento 1 no de patente). Han sido propuestas las aplicaciones médicas de adiponectina, incluyendo diagnosis del trastorno de metabolismo del azúcar; en particular, monitoreo del efecto terapéutico de un derivado de tiazolidina que es un fármaco que mejora la resistencia a insulina (Documento 1 de Patente), y una dosificación del supresor fibrogenético hepático que utiliza el efecto de adiponectina, incluyendo la supresión de la activación y crecimiento de células estrelladas y la supresión de la producción de la matriz extracelular (Documento 2 de patente). La adiponectina se clasifica en la familia Ciq (Complemento 1q) sobre las bases de su estructura, y de esta forma tiene un dominio de tipo colágeno, que es un aspecto característico de la familia Ciq. Se ha reportado que la adiponectina forma multímeros basados en unidades de trímeros (Documentos 2 y 3 no de Patente). Se han reportado las relaciones entre las estructuras de adiponectina y el efecto fisiológico, la actividad, etc. Tsao y otros han reportado que el efecto de la activación de NF- KB se observa solamente en multímeros de adiponectina que son más grandes que un trímero pero no se observan en un trímero en un dominio globular que carece del dominio de tipo colágeno. Utpal y otros han reportado que solamente la adiponectina de alto peso molecular se disminuye significativamente a través de la administración de insulina o glucosa, y que al adiponectina en donde la cisteina en el domino de tipo colágeno está substituida a través de serina o adiponectina que ha experimentado un tratamiento de reducción que exhibe un fuerte efecto de reducción de azúcar en la sangre, pero substancialmente no se observa ningún efecto reductor de azúcar en la sangre que haya experimentado un tratamiento de no reducción y en adiponectina globular (Documento 4 no de patente). Sin embargo, la adiponectina empleada en estos estudios reportados se produce a través de la recombinación de gen a través del uso de E. coli o similares. Por consiguiente, el comportamiento o acción de adiponectina que se produce en un organismo no se puede reflejar acertadamente. Además se sabe, que el nivel de tipo adiponectina en la sangre difiere entre los sexos. Según comparado con valores, se ha reportado que las mujeres tienen un nivel de adiponectina en ia sangre significativamente alto (Documento 5 no de patente). Una prueba que utiliza suero de ratón ha revelado que las mujeres particularmente tienen un alto contenido de adiponectina de peso molecular alto (Documento 4 no de patente). Como se describió anteriormente, a través de la medición de solamente la cantidad total de adiponectina, no se puede obtener suficiente información acerca de la relación entre las estructuras de adiponectina y los efecto o enfermedades fisiológicas. Por consiguiente, aún existe una demanda de un método para selectivamente ensayar multímeros de adiponectina presentes en una muestra biológica. En un método de la técnica anterior para ensayar adiponectina, una muestra que se va medir se hierve en la presencia de dodeciisulfato de sodio (SDS) antes de que se realice el inmunoensayo (Documento tres de patente). El tratamiento hervido habilita la exposición de un sitio de reconocimiento del anticuerpo de adiponectina que ha estado oculto estereoestructuralmente, con el fin de inmunológicamente determinar la cantidad total de adiponectina. Por consiguiente, este método no está dirigido a selectivamente ensayar los multímeros de adiponectina. No se ha descrito un método para ensayar adiponectina contenida en una muestra con el tratamiento de desnaturalización SDS ni con el tratamiento de desnaturalización térmica (documento 1 de patente, se describe en el documento que se midió la adiponectina nativa). Sin embargo, no se ha hecho ninguna referencia al ensayo selectivo, y este método no se puede utilizar para el ensayo selectivo. [Documento 1 de patente] WO 03/016906 [Documento 2 de patente] JP-A-2002-363094 [Documento 3 de patente] JP-A-2000-304748 [Documento 1 de no de patente] Yamuchi T., y otros Nat Med., 7, 941-946, 2001. [Documento 2 de no de patente] Nakano Y., y otros, J. Biochem., 120, 803-812, 1996. [Documento 3 de no de patente] Tsao T-S., y otros, J. Biol.

Chem., 277, 29359-29362, 2002. [Documento 4 de no de patente] Utpal B., y otros, J. Biol. Chem., 278, 9073-9085, 2003. [Documento 5 de no de patente] Yamamoto Y., y otros, Clin. Sci., 103, 137-142, 2002.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problemas a resolver a través de la invención La presente invención provee un método para selectivamente ensayar un multímero de adiponectina objetivo en una muestra biológica, y un método para la acertadamente evaluar la relación entre una enfermedad y adiponectina a través del ensayo selectivo de multímeros de adiponectina. El ensayo selectivo da cierta información que no se puede obtener a través de la medición de solamente la cantidad total de adiponectina.

Medios para resolver los problemas Con el fin de resolver los problemas, los presentes inventores han llevado a cabo estudios extensivos y han encontrado que la sangre contiene adiponectina que se puede clasificar en los siguientes tres tipos sobre las bases del peso molecular según medido a través de cromatografía de filtración de gel; 150 kDa o más de 200 kDa o menos (principalmente cerca de 160 kDa) (de quien adelante referido como LMW-Ad), más de 200 kDa y menos de 400 kDa (principalmente cerca de 260 kDa) (de aquí en adelante referido como MMW-Ad), y 400 kDa o más y 800 kDa o menos (principalmente cerca de 400 kDa) (de quien adelante referido como HMW-Ad). Los presentes inventores además han realizado estudios adicionales, y fueron eventualmente exitosos en la obtención de cuatro tipos de productos separados y purificados de multímeros de adiponectina de sangre humana.

Estos cuatro tipos se pueden separar a través de electroforesís de poliacrilamida (de 2 a 15%) ") bajo condiciones no de desnaturalización, y se definen como ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad, de alta movilidad a baja movilidad. De estos cuatro tipos de adiponectina, LMW-Ad, MMW-Ad y HMW-Ad se encontró que corresponden a los tres tipos anteriores adiponectina contenidos en el suero. Además, los presentes inventores han encontrado que LMW-Ad es un trímero adiponectina al cual la albúmina esta enlazada a través de un enlace de disulfuro, y esto, a través del uso combinado de por lo menos un anticuerpo anti-adiponectina y un anticuerpo anti-albúmina, LMW-Ad se puede ensayar selectivamente. Además, los presentes inventores han encontrado que, a través del cálculo del peso molecular con electroforesis de SDS-poliacrilamida (de 2 a 15%) (de aquí en adelante se puede referir como "SDS-PAGE") después del entrelazamiento intramolecular, ULMW-Ad se determina como siendo un trímero de adiponectina, MMW-Ad se deduce como siendo un hexámero o nanómero, y HMW-Ad se deduce como siendo un multímero formado de monómeros cuyo número es dos veces o más que los monómeros formados MMW-Ad. Sobre las bases de estos hallazgos, los presentes inventores han encontrado que, través de la reacción de una proteasa adecuada con una muestra conteniendo adiponectina, la adiponectina diferente de HMW-Ad se puede digerir, y que la HMW-Ad que persiste después de la digestión con la proteasa se puede ensayar selectivamente a través del uso de un anticuerpo anti-adiponectina.

Los presentes inventores también han encontrado que la cantidad de MMW-Ad contenida en una muestra se puede determinar a través del procesamiento de ULMW-Ad y LMW-Ad con proteasa, el cálculo de la cantidad total de HMW-Ad y MMW-Ad que persiste, y la sustracción de la cantidad de HMW-Ad de la cantidad total de HMW-AD y MMW-Ad, y que la cantidad total de ULMW-Ad contenida en una muestra se puede determinar a través de procesamiento de ULMW-Ad y LMW-Ad con proteasa, el cálculo de la cantidad total de HMW-Ad y MMW-AD que persiste, y la sustracción de la cantidad total de HMW-AD y MMW-Ad y la cantidad de LMW-Ad de la cantidad total de adiponectina, que ha sido determinada selectivamente. La presente invención se ha logrado sobre las bases de estos hallazgos. De esta forma, lo presente invención provee un método para selectivamente ensayar un multímero de adiponectina objetivo en una muestra biológica, que comprende un paso de distinguir el multímero de adiponectina objetivo de los otros multímeros de adiponectina a través del uso de una proteasa y/o un anticuerpo para ensayar inmunológicamente. Los presentes inventores también proveen un método para ensayar adiponectina en una muestra biológica, en donde el multímero de adiponectina derivado de la sangre humana es de los siguientes cuatro tipos de adiponectina, y uno o dos de los cuatro tipos de adiponectina se seleccionan del total de adiponectina y se inmunoensayan, a través del uso de una proteasa y/o un anticuerpo; (1 ) ULMW-Ad: exhibe la movilidad más alta entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 100 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular; (2) LMW-Ad: exhibe la segundad movilidad más alta, después de ULMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, tiene un peso molecular de alrededor de 150 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular, y se enlaza a albúmina a través de un enlace de disulfuro; (3) MMW-Ad: exhibe la tercera movilidad más alta después de LMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 250 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular; y (4) HMW-Ad: exhibe la movilidad más baja entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 300 kDa o más alto según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular. La presente invención también provee un método para evaluar una enfermedad o una condición patológica de un ser humano, caracterizada por que comprende selectivamente ensayar uno o dos de ios cuatro tipos anteriores de adiponectina derivados de la sangre humana a partir del resto del adiponectina e inmunoensayando el (los) multímero(s) de adiponectina objetivo, a través del uso de una proteasa y/o un anticuerpo, y obteniendo información acerca de la enfermedad o de la condición patológica sobre las bases de los resultados del ensayo selectivo.

Efectos de la invención La presente invención permite el ensayo selectivo de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad y por consiguiente la evaluación precisa del efecto fisiológico de adiponectina y la evaluación del principio, diagnosis, desarrollo, prognosis y efecto terapéutico de las enfermedades y las condiciones patológicas, especialmente diabetes de tipo II, enfermedad arteroesclerótica, enfermedad renal, enfermedad hepática, obesidad, y síndrome metabólico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Cromatografía de filtración de gel de multímeros de adiponectina en el ejemplo 1. Figura 2. Resultados de la tinción CBB de LMW-Ad, MMW-Ad, o HMW-Ad después de PAGE (de 2 a 15%), en el ejemplo 1. Figura 3. Resultados de la tinción CBB de LMW-Ad, MMW-Ad, o HMW-Ad después de SDS-PAGE (de 2 a 15%), en el ejemplo 2. Figura 4. Resultados del análisis de la tinción western de adiponectina de suero humano en el ejemplo 5. Figura 5. Resultados del inmunoensayo de LMW-Ad (adiponectina enlazada a albúmina) en el ejemplo 6. Figura 6. Resultados de la tinción CBB de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad derivados los productos purificados de seres humanos después de PAGE (de 2 a 15%), en el ejemplo 3. Figura 7. Los resultados de la tinción CBB de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad derivados los productos purificados de seres humanos después de SDS-PAGE (de 2 a 15%), en el ejemplo 4. Figura 8. Resultados de la tinción western ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad derivados los productos purificados que han experimentado el entrelazamiento intramolecular y SDS-PAGE (de 2 a 15%), en el ejemplo 4. Figura 9. Resultados del inmunoensayo de LMW-Ad (adiponectina enlazada a albúmina) en el ejemplo 7. Figura 10. Resultados del ejemplo 13, que muestra específicamente la proteinasa K después de la digestión de los multímeros de adiponectina. Figura 11. Resultados del ejemplo 13, que muestran específicamente la proteasa A "Amano" después de la digestión de los multímeros adiponectina.

MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre la muestra biológica que se van emplear en la presente invención, mientras la muestra biológica contenga el multímero de adiponectina. Los ejemplos de la muestra biológica incluyen fluidos dei cuerpo (por ejemplo, sangre, orina), extractos de tejido, y sobrenadantes de caldo de cultivo de células derivadas de tejido obtenidas de un mamífero tal como un ser humano, un animal (por ejemplo, mono, cabra, oveja, conejo, ratón, rata, conejillos de Indias). Con el fin de precisamente evaluar el efecto fisiológico de adiponectina, o enfermedades o condiciones patológicas de un paciente, se prefiere la sangre (suero, plasma) como la muestra biológica. No se ha impuesto ninguna limitación particular en el método para la obtención de una muestra, mientras ei método no afecte adversamente la adiponectina presente en la muestra en términos del ensayo selectivo de adiponectina. Dependiendo de los propósitos de la evaluación, se puede seleccionar un método adecuado para la obtención de la muestra. Por ejemplo, una muestra de sangre humana se puede extraer de un ser humano en ayunas, o después de la administración de un fármaco al ser humano. Se describirá un método para selectivamente inmunoensayar LMW-Ad. En el método, LMW-Ad se captura y se detecta través del uso de un anticuerpo que reconoce LMW-Ad. Específicamente, no se ha impuesto ninguna limitación particular al anticuerpo utilizado en el método en donde LMW-Ad se captura y se detecta través del uso de un anticuerpo que reconoce LMW-Ad, mientras el anticuerpo pueda reconocer, capturar, y detectar LMW-Ad, el cual es un complejo de un trímero de adiponectina y albúmina. Los ejemplos preferidos del anticuerpo incluyen una combinación de un anticuerpo que reconoce adiponectina y un anticuerpo que reconoce albúmina, y un anticuerpo que específicamente reconoce un complejo de adiponectina y albúmina. Un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal que reconoce adiponectina, albúmina, un complejo fr adiponectina-albúmina se puede obtener a través de un método conocido a través de inmunización de un animal adecuado. Dicho anticuerpo puede estar comercialmente disponible. Ejemplos de un anticuerpo de adiponectina anti-humano incluyen el anticuerpo de Cabra a humano Acrp 30 (Cosmo Bio Co., Ltd., GT), conejo a hu adiponectina-PoAb (Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon), Hu Acrp30-MoAb (Fujisawa Pharmaceuticals Co., Ltd., BD), Ratón hu Adiponectina MoAb (Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon) y el anticuerpo monocolonal ACRP30 anti-humano (AX773, AX741 , Ne, Na, Wako Puré Chemical Industries, Ltd.). Ejemplos de un anticuerpo de albúmina antihumano incluyen el anticuerpo humano, Cabra a Albúmina, (Cosmo Bio Co., Ltd., BET, ACD, BMD), el anticuerpo humano Ratón a Albúmina (Cosmo Bio Co., Ltd., NBT, ZYM, MED), el anticuerpo humano Conejo a Albúmina (Cosmo Bio Co., Ltd., CL, ACM), y el anticuerpo humano Cabra a Albúmina (Funakoshi Co., Ltd., ANT). Los ejemplos específicos de inmunoensayos de acuerdo con la presente invención incluyen un método conocido como ELISA (inmunoensayo de enzima), CLEIA (inmunoensayo de enzima quimioluminiscente), RÍA (radioinmunoensayo), y LTIA (inmunoensayo turbidimétrico de látex). En el caso de ELISA, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos siguientes se puede emplear. Específicamente, en un procedimiento, un anticuerpo que reconoce adiponectina se inmoviliza a un portador insoluble, y un anticuerpo marcado de enzima que reconoce albúmina se utiliza en combinación con el portador. En otro procedimiento, un anticuerpo que reconoce un complejo de adiponectina-albúmina se inmoviliza a un portador insoluble, el complejo de adiponectina-albúmina se captura través del uso del portador, y un anticuerpo marcado con enzima que reconoce la adiponectina se utiliza en combinación con el portador. Cada uno de los procedimientos de ensayo se describirá con detalle. Un anticuerpo que reconoce adiponectina se inmoviliza a un portador insoluble, y el portador se pone en contacto y se mezcla con una muestra que contiene un complejo de adiponectina-albúmina, para por lo tanto capturar el complejo de adiponectina-albúmina sobre el portador insoluble.

Subsiguientemente, un anticuerpo marcado con enzima que reconoce albúmina se pone en contacto y se mezcla con el portador, mientras se forma un complejo de tres componentes "portador insoluble"-"complejo de adiponectina-albúmina"-"anticuerpo marcado con enzima". Enseguida, la enzima que marca el anticuerpo se hace reaccionar con un sustrato adecuado de la enzima, y el cambio en la absorbancia atribuida al producto de reacción se mide ópticamente, mientras el complejo de adiponectina-albúmina puede ser cualitativa o cuantitativamente ensayado. En el caso de LTIA se lleva un anticuerpo que es capaz de específicamente enlazarse a un complejo de adiponectina-albúmina sobre un portador insoluble, y el portador se mezcla con el complejo de adiponectina-albúmina para originar el entrelazamiento (agregación) del portador insoluble a través del complejo de adiponectina-albúmina. La turbiedad resultante se mide ópticamente, mientras ei complejo de adiponectina-albúmina puede ser cualitativa o cuantitativamente ensayado. Para una medición precisa, conveniente y rápida de un complejo de adiponectina-albúmina, LTIA es preferida. El portador insoluble que se va a emplear en la presente invención puede ser un portador insoluble orgánico que ha sido utilizado en los inmunoensayos de rutina y que se puede producir industrialmente a gran escala. En ELISA, se prefiere una microplaca de 96 cavidades y hecha de, por ejemplo, poliestireno, el cual tiene una excelente adsorbabilidad del anticuerpo y que es capaz de mantener la actividad biológica estable durante un largo periodo de tiempo. En LTIA, se prefieren las partículas de látex de poliestireno. Se conocen varios métodos para llevar un anticuerpo en dicho portador ¡nsoluble, y cualquiera de los métodos conocidos se puede emplear en la presente invención según se desee. Por ejemplo, se puede llevar un anticuerpo (sensibilizar) a través de adsorción física de un anticuerpo sobre la superficie de un portador insoluble. Alternativamente, la superficie de un portador insoluble que tiene un grupo funcional puede sensibilizarse eficientemente con un anticuerpo a través de un método de enlace físico o químico. No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre las condiciones de reacción bajo las cuales un portador insoluble que lleva un anticuerpo y/o un anticuerpo marcado de enzima se hacen reaccionar con un complejo de adiponectina-albúmina, mientras la reacción del antígeno-antícuerpo ocurra bajo las condiciones de reacción. No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre la mezcla de reacción que contiene un complejo de adiponectina-albúmina, mientras la mezcla de reacción no afecte adversamente la reacción del antígeno-anticuerpo del complejo de adiponectina-albúmina. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede contener un componente regulador del pH para ajustar el pH (por ejemplo, regulador de pH de fosfato, regulador de pH de glicina, regulador de pH Tris, regulador de pH Good), cloruro de sodio, un agente tensioactivo, una sustancia similar para prevenir la reacción no especifica, y un estabilizador tal como una albúmina de suero de bovino (BSA), sacarosa, un polímero de polisacárido, según se 'desee. La mezcla de reacción también puede contener, además de las sustancias anteriores que controlan la reactividad, un polisacárido soluble en agua tal como dextrina, un aditivo tal como un inhibidor enzima, según se apropiado. Un anticuerpo marcado con enzima utilizado en ELISA puede prepararse a través de un método conocido. Por ejemplo, a través del método de Ishikawa y otros (maleimide method: "Enzyme Immunoassay, 3a. Edición," Igaku-shoin Ltd.), un anticuerpo no tratado o un anticuerpo que ha experimentado una proteólisis limitada con una proteasa adecuada para formar F(ab')2 o Fab' de acuerdo con las necesidades se puede marcar con un enzima. Ejemplos de enzimas para marcar incluyen peroxidasa, fosfatasa alcalina, ß-D-galactosidasa, y oxidasa de glucosa. La actividad de la enzima se determina a través de medios de un sustrato, y, si es necesario, un agente de desarrollo de color. Cuando la peroxidasa se emplea como enzima, se puede utilizar peróxido ácido como un sustrato, y o-fenilenodiamina, 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina, sal de amonio de 2,2'-azínoid-(ácido 3-etilbenzotiazolin sulfónico), o se puede emplear una sustancia similar como un agente desarrollador del color. Cuando la enzima es fosfatasa alcalina, se puede utilizar p-nitrofenilfosfato o una sustancia similar como un sustrato. Cuando la enzima es ß-D-galactosidasa, se puede emplear ß-D-galactopiranosida o una sustancia similar como un sustrato. Cuando la enzima es oxidasa de glucosa, en la presencia de peroxidasa, se puede utilizar ß-D-glucosa como un sustrato de oxidasa de glucosa, y se puede emplear un agente desarrollador de color •similar a aquel empleado en el caso de peroxidasa. Cuando se lleva a cabo ELISA, no se impone ninguna limitación particular al método para ensayar el producto de reacción entre el sustrato y un enzima, sobre las bases de la actividad del enzima del anticuerpo marcado con enzima. Por ejemplo, cuando la enzima, el sustrato, y el agente desarrollador de color son peroxidasa, peroxidasa acida, y o-fenilenodiamina, respectivamente, el producto de reacción de la enzima se puede detectar a través de la determinación de la absorbancia a 492 nm, la cual es una longitud de onda característica del producto de reacción, a través del uso de un lector de microplacas de 96 cavidades. No se ha impuesto ninguna limitación particular al método para determinar el grado de agregación de los portadores insolubles en LTIA. Por ejemplo, con el fin de cualitativa o semicuantitativamente evaluar la agregación, el grado de agregación se puede determinar visualmente a través de la comparación de las turbiedad entre las muestras que tienen concentraciones conocidas y la muestra objetivo. Con el fin de cuantitativamente evaluar la agregación, preferiblemente, se emplea la medición óptica, a partir del punto de vista de conveniencia y precisión. La medición óptica de la masa agregada se puede llevar a cabo a través de un método conocido. Los ejemplos específicos de la medición óptica que se puede utilizar en la presente invención incluyen la llamada medición turbodimétrica (se observa la formación de masa agregada como un incremento en las turbiedad), la medición de la distribución del tamaño de •partícula (se observa la formación de la masa agregada como un cambio en la distribución del tamaño de partícula o tamaño de partícula promedio), y el ensayo turbidimétrico de integración de esfera (el cambio en la radiación distribuida hacia adelante originada por la formación de la masa agregada se mide a través del uso de una esfera de integración, y se compara la proporción en la intensidad de la radiación transmitida). Ahora se describirá un método para selectivamente inmunoensayar HMW-Ad. Una proteasa adecuada se hace reaccionar con una muestra que contiene adiponectina para digerir adiponectina diferente de HMW-Ad. HMW-Ad, que persiste después de la digestión con proteasa, se ensaya a través del uso de un anticuerpo anti-adiponectina. No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre la proteasa que se puede utilizar para ensayar HMW-Ad selectivamente, mientras la proteasa digiera la adiponectina diferente de HMW-Ad. No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre el origen de la proteasa, y la proteasa se puede derivar de un microorganismo, un animal, una planta, o similar. Preferiblemente, las proteínas las K derivadas del género Tritirachium o proteasa derivadas del microorganismo que pertenecía, por ejemplo, el género Aspergillus o Bacillus se emplean. Ejemplos de productos comercialmente disponibles de proteasa derivadas del microorganismo que pertenece al género Aspergillus incluyen proteasa P "Amano", proteasa A "Amano", y Umamizima (productos de Amano Enzyme Inc.) y sumizima MP y simizima FP (productos de Shin Nihon Chemical Co., Ltd.). Ejemplos de productos comercialmente disponibles de 'proteasa derivados de un microorganismo pertenecientes al género Bacillus incluyen proteasa N "Amano" (Amano Enzyme Inc.) y proteína PC (Daiwa Kasei K.K.). La proteasa se puede obtener a través de la tecnología recombinante de gen. La proteasa puede ser químicamente modificada. Las condiciones bajo las cuales se lleva cabo el procesamiento de la proteasa difieren dependiendo del tipo de proteasa empleada. Preferiblemente, el procesamiento con proteasa se lleva cabo en un regulador de pH tal como regulador de pH de fosfato, regulador de pH tris, o regulador de pH Good durante de 5 minutos a 24 horas de 4 a 60°C. La concentración de la proteasa empleada para el procesamiento se determina en vista de la actividad específica de la proteasa, la temperatura de reacción, el tiempo de reacción, y factores similares. Típicamente, la proteasa se emplea a una concentración que cae dentro del escala de 0.01 a 100 u/ml o 0.01 a 100 mg/ml. El anticuerpo que es utiliza para ensayar HMW-Ad, que persiste después de procesamiento de una muestra biológica con proteasa, puede ser un anticuerpo que reconoce adiponectina. Un anticuerpo policlonal o monoclonal anti-adiponectina se puede producir a través de la inmunización de un animal adecuado a través de un método conocido, o se puede obtener como un producto comercialmente disponible. Cualquiera de estos se puede utilizar en la presente invención. Por ejemplo, los ejemplos de un anticuerpo de adiponectina anti-humana incluyen el anticuerpo de Cabra a humano Acrp 30 (Cosmo Bio Co., Ltd., GT), conejo a hu adiponectina-PoAb (Cosmo Bio *Co., Ltd., Chemicon), Hu Acrp30-MoAb (Fujisawa Pharmaceuticals Co., Ltd., BD), Ratón hu Adiponectina MoAb (Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon) y el anticuerpo monocoional ACRP30 anti-humano (AX773, AX741 , Ne, Na, Wako Puré Chemical Industries, Ltd.). Alternativamente, se puede emplear el equipo comercialmente disponible para determinar la cantidad total de adiponectina, tal como el "equipo ELISA de adiponectina humana" (Otsuka Pharmaceuticals Co., Ltd.). Se puede emplear un método alternativo que ha sido desarrollado a través de los presentes inventores (Solicitud internacional que reclama la prioridad de la solicitud de patente japonesa número 2003-354715), en la cual por lo menos un agente de reducción, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa se agregan a la muestra biológica para la reacción con adiponectina, mientras los multímeros de adiponectina se forman en una forma específica, y la adiponectina resultante se ¡nmunoensaya. Ahora se describirá ún método para selectivamente inmunoensayar MMW-Ad. La cantidad de MMW-Ad se puede determinar en la siguiente forma; es decir, una proteasa que específicamente digiere ULMW-Ad y LMW-Ad se hace reaccionar con una muestra se determina; la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad no digerida que persiste; y la cantidad de HMW-Ad se sustrae de la cantidad total. No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre la proteasa empleada en este método, mientras la proteasa específicamente digiera solamente ULMW-Ad y LMW-Ad. No se ha impuesto ninguna limitación particular sobre el origen de la proteasa, y la proteasa se puede derivar de un microorganismo, un animal, una planta, o similar. Una 'proteasa preferida es una derivada de un microorganismo que pertenece a, por ejemplo, el género Bacillus, Aspergillus, o Straphylococcus. Un producto comercialmente disponible, incluyendo la proteasa s "Amano" y proteasa A "Amano" (productos de Amano Enzyme Co.), sumizima AP y simizima LP50D (productos de Shin Nihon Chemical Co., Ltd.), y proteasa V8 (Seikagaku Corporation), se pueden emplear. La proteasa se puede obtener a través de tecnología recombinante de gen. La proteasa puede ser químicamente modificada. La cantidad de MMW-Ad y HMW-Ad que persiste se puede determinar a través del uso de un equipo comercialmente disponible para determinar ia cantidad total de adiponectina. La cantidad de HMW-Ad contenido en la muestra se puede determinar a través del método descrito anteriormente. El método para procesar una muestra biológica con una proteasa difiere dependiendo del tipo de proteasa. Preferiblemente, el procesamiento con proteasa se lleva cabo en un regulador de pH tal como regulador de pH de fosfato, regulador de pH tris, o regulador de pH Good durante 5 minutos a 24 horas de 4 a 60°C. La concentración de la proteasa empleada para el procesamiento se determina en consideración con actividad específica de la proteasa, la temperatura de reacción, el tiempo de reacción, y factores similares. Típicamente, la proteasa se emplea a una concentración que cae dentro de la escala de 0.01 a 100 ul/ml o 0.01 a 100 mg/ml. El ¡nmunoensayo se puede llevar a cabo a través de ELISA o LTIA con referencia a las descripciones anteriores acerca del inmunoensayo selectivo de LMW-Ad.

Alternativamente, la cantidad de MMW-Ad se puede determinar en la siguiente forma; es decir, la cantidad total de ULMW-Ad, LMW-Ad, y MMW-Ad se determina como la cantidad total de la adiponectina convertida a través del uso de una proteasa descrita anteriormente con relación al ensayo selectivo de HMW-Ad; y la cantidad total de ULMW-Ad y LMW-Ad, convertidos que han sido determinados a través del uso de la proteasa anterior que específicamente digieren ULMW-Ad y LMW-Ad, se sustraen de la cantidad total anterior de ULMW-Ad, LMW-Ad, y MMW-Ad. El inmunoensayo se puede llevar a cabo a través de ELISA o LTIA con referencia a las descripciones anteriores acerca del inmunoensayo selectivo de LMW-Ad o HMW-Ad. Ahora se describirá un método para selectivamente inmunoensayar ULMW-Ad. La cantidad de ULMW-Ad se puede determinar a través de la sustracción, de la cantidad total de adiponectina, de la cantidad total de LMW-Ad, MMW-Ad y HMW-Ad determinada anteriormente. Específicamente, se hace reaccionar una proteasa que específicamente digiere ULMW-Ad y LMW-Ad, se determina la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad que persiste; y la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad y la cantidad total de LMW-Ad se sustraen de la cantidad total de adiponectina, la cual ha sido determinada separadamente. De acuerdo con la presente invención, cada uno de los cuatro tipos de adiponectina humanos presentes en una muestra de sangre humana se pueden ensayar selectivamente. Por consiguiente, la presente invención permite la evaluación del inicio, diagnosis, desarrollo, prognosis, y efecto "terapéutico de diabetes de tipo II, la enfermedad arteroesclerótica, enfermedad renal, enfermedad hepática, obesidad, y síndrome metabólico. Por ejemplo, la evaluación se puede llevar a cabo a través de la observación del cambio en una o más de las cantidades de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW- Ad, y HMW-Ad o la observación de la proporción de por lo menos dos de las cantidades totales de adiponectina, la cantidad de ULMW-Ad, la cantidad de LMW-Ad y la comparación de los resultados con un valor estándar. Alternativamente, la evaluación se puede llevar a cabo a través de la observación del cambio a través tiempo de estas cantidades en el mismo individuo. Alternativamente, la evaluación se puede llevar a cabo a través de la correlación de un índice conocido que ha sido utilizado para ciertas enfermedades o condiciones patológicas (por ejemplo, insulina en diabetes de tipo II, o colesterol HDL en la enfermedad arteroesclerótica, o similar) con por io menos una de las cantidades de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad, o con la proporción de por lo menos dos de las cantidades de la cantidad total de adiponectina, la cantidad de ULMW-Ad, la cantidad de LMW-Ad, la cantidad de MMW-Ad, y ia cantidad de HMW-Ad.

EJEMPLOS La presente invención enseguida se describirá con detalle a través de los ejemplos, los cuales no se construirán como limitantes de la invención.

Reactivos y materiales Los reactivos y los materiales empleados en los ejemplos y los ejemplos de referencia son: a. Líquido de lavado en resina enlazada a anticuerpo: 0.1 M NaHCO3-NaOH (pH de 8.3) conteniendo 0.5 M de NaCI; b. eluyente de resina enlazado al anticuerpo: 0.1 M de Glicina-HCI (pH 2.5); c. líquido de neutralización de resina enlazado ai anticuerpo: 2M de Tris-HCl (pH = 8.0); d. Placa ELISA: microplaca de 96 cavidades (producto de NUNC); e. Solución de sensibilización del anticuerpo ELISA: PBS (pH 7,4); f. Regulador de pH ELISA: PBS (pH 7.4) conteniendo 1% de albúmina de suero de bovino y 0.1 % de Tween 20; g. Equipo ABC de Vector (ratón): producto de Funakoshi Co., Ltd., número de catálogo PK-6102; h. Equipo de sustrato DAB (sustrato de desarrollo de color de tinción western): producto de Funakoshi Co., Ltd., número de catálogo SK-4100; i. Anticuerpo monoclonal de adiponectina anti-humano (hu Acrp-30-MoAb): producto de Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratorios, código del producto: A 12820; j. Anticuerpo policlonal de adiponectina anti-humano de cabra (anticuerpo Cabra a Acrp30 humano): producto de Cosmo Bio Co., Ltd., GT, número de catálogo 421065; k. Anticuerpo marcado HRP de IgG de anti-ratón: Cosmo Bio Co., Ltd., producto de Capple; I. Líquido de lavado ELISA: PBS conteniendo 0.05% de Tween 20; m. Regulador de pH 2 ELISA: PBS conteniendo 1 % de BSA y 0.05% de Tween 20; n. Anticuerpo marcado HRP policlonal de albúmina anti-humano de cabra (anticuerpo anti-HSA HRP-Gt ): producto de PARÍS; y o. HRP-Avidina: producto de PIERCE.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Preparación de adiponectina globular de ratón recombinante E. coli (rMgAd) La secuencia del dominio globular (correspondiente a los residuos 104-247) de la secuencia del gen de adiponectina de ratón ( número de registro NCBI U 37222) se insertó en BamHi y Hindi de un vector pQE390 conteniendo la etiqueta 6xHi9s, y después se introdujo en E. coli. La adiponectina globular de ratón recombinante (rMgAd) expresada a través de E. coli se purificó a través del siguiente procedimiento. Específicamente, una 'fracción soluble de E. Coli se agregó a agarosa Ni-NTA (producto de QIAGEN), y rMgAd originó el enlace durante 16 horas a 4°C. rMgAd se eluyó serialmente con imidazol, y se recolectó una fracción conteniendo adiponectina y después dializó con PBS (pH 7.4) durante tres días. El contenido de proteína de rMgAd resultante se determinó a través de medios de un equipo de ensayo de proteína Bio-Rad DC.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2 Producción del anticuerpo anti-rMgAd Se mezclaron juntos 50 µg de rMgAd preparado en el ejemplo de referencia 1 y la misma cantidad del auxiliar completo de Freund, y se inmunizaron dos conejos con la mezcla 6 veces, a intervalos de dos semanas, para producir el antisuero. El anticuerpo específico (IgG) presente en el antisuero se purificó a través de un método de rutina mediante el uso de una resina de proteína A (anticuerpo anti-rMgAd).

EJEMPLO DE REFERENCIA 3 Purificación del multímero de adiponectina derivado de sangre humana Se enlazaron 500 mg del anticuerpo anti-rMgAd preparado en el ejemplo de referencia 2 con Sepharose 4B activada con CNBr (Amersham Bioscíence) (50 ml), para de esta forma preparar la resina de Sepharose 4B 'enlazada al anticuerpo anti-rMgAd. Se agregaron 2.5 litros de suero humano a la resina de Sepharose 4B enlazada al anticuerpo anti-rMgAd, y la resina se lavó vigorosamente con el líquido de lavado de resina enlazado al anticuerpo. El eluyente de la resina enlazado al anticuerpo se aplicó para obtener una fracción de adiponectina de suero humano (mAd), y se agregó el líquido de sensibilización de resina enlazado al anticuerpo en una cantidad de 1/10 de la fracción. Enseguida, la fracción neutralizada se aplicó a la resina de la Proteína A, y una fracción conteniendo los componentes que no se adsorbieron en la resina de la Proteína A se recolectaron como mAd purificado. El contenido de adiponectina se determinó a través de medios de un "equipo ELISA de adiponectina humana" (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).

EJEMPLO DE REFERENCIA 4 Producción del anticuerpo monoclonal de adiponectina anti- humana El mAd purificado (20 µg) obtenido en el ejemplo de referencia 3 se mezcló con la misma cantidad de la auxiliar completo de Freund, y dos o ratones inmunizaron con la mezcla tres o cuatro veces, a intervalos de dos semanas. La mezcla se volvió a administrar a los ratones tres días antes de la fusión de célula. Las células del bazo se recolectaron de los ratones inmunizados, y la fusión de células se realizó con células de mieloma P3U1 a través de un método de rutina mediante el uso de un glicol polietilénico. Las ' células fusionadas que producen el anticuerpo monoclonal de adíponectina anti-humana se seleccionaron a través de un método conocido. Específicamente, las cavidades que fueron altamente reactivas con mAd se seleccionaron a través de ELISA, y se llevó a cabo la dilución limitante. Las células fusionadas seleccionadas se administraron ¡ntraperitonealmente a los ratones que habían sido tratados con pristano, y los ascitos se recolectaron como el anticuerpo monoclonal de adiponectina anti-humano. La purificación del anticuerpo específico (IgG) a partir de los ascitos se llevó a cabo a través de un método de rutina mediante el uso de resina de proteína A. De esta forma se obtuvieron las células fusionadas que producen 11 anticuerpos monoclonales dei adiponectina anti-humanos así como los anticuerpos monoclonales (números de identificación 64401 a 64411 ).

EJEMPLO 1 Separación y purificación de multímeros de adiponectina derivados de sangre humana (1) El mAb purificado obtenido en el ejemplo de referencia 3 se desmineralizó a través de diálisis con 20 mM de regulador de pH de fosfato (pH 7.0), se adsorbió en una columna de Gelatina-Celulofina (Siekagaku Corporation), y después se eluyó serialmente con 20 mM de reguladores de pH de fosfato (pH 7.9), conteniendo 0, 100, 200, 300, y 500 mM de NaCl. Las fracciones eluidas resultantes, que se habían obtenido a través del uso de * reguladores de pH de diferente concentración de NaCI, contuvieron mezclas de adiponectina de diferentes pesos moleculares. Cada una de las fracciones del eluato se concentraron y después se sometieron a cromatografía de filtración de gel utilizando Sephacryl S-300 (peso molecular fraccionado; de 10 a 1500 kDa, tamaño de particular promedio; 47 µm, Amersham Bioscience). En la cromatografía de filtración de gel, se emplearon 20 mM de regulador de pH de fosfato (pH 7.0) conteniendo 150 mM de NaCI como eluyente. La calibración del peso molecular de la columna Sephacryl S-300 había sido realizada través del uso de un equipo de calibración de filtración de gel (Amersham Biosciences). En la cromatografía, se detectó la adiponectina por medio de un "equipo ELISA de adiponectina humana" (Otsuka Pharmaceuticals Co., Ltd.). La Figura 1 muestra el cromatograma de filtración de gel. Las fracciones del eluato se dividieron en tres porciones; es decir, 150 kDa o más y 200 kDa o menos (en su mayoría cerca de 200 kDa), y 400 kDa o más y 800 kDa o menos (en su mayoría cerca de 400 kDa), para por lo tanto preparar productos separados y purificados de multímeros de adiponectina. Un primer producto de 150 kDa o más y 200 kDa o menos (en su mayoría cerca de 160 kDa) es referido como LMW-Ad, un segundo producto de más de 200 kDa y menos de 400 kDa (en su mayoría cerca de 260 kDa) es referido como MMW-Ad, y un tercer producto de 400 kDa o más y 800 kDa o menos (en su mayoría 450 kDa) es referido como HMW-Ad. Cada uno de los tres productos separados y purificados de • multímeros de adiponectina preparados anteriormente; es decir, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad se sometieron a electraforesis de gei de poliacrilamida (concentración de poliacrilamida: de 2 a 15%) (de aquí en adelante referido como PAGE (de 2 a 15%)) para la separación y después para la tinción de la proteína con CBB (Azul Brillante Coomassie). La Figura 2 muestra los resultados de la tinción de las proteínas sujetas a electroforesis. En cada uno de LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad, las bandas diferentes de la banda teñida principal se observaron pero se detectaron con considerablemente menos claridad según comparado con la banda principal, revelando que la separación y la purificación se completaron exitosamente. Ya que los multímeros de adiponectina se formaron con base en un trímero como se describió anteriormente, el peso molecular de cada uno de LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad según medido a través de PAGE no necesariamente coincide con aquel medido a través de la filtración de gel.

EJEMPLO 2 Análisis de estructura de multímeros de adiponectina (LMW-Ad, MMW- Ad y HMW-Ad) derivados de sangre humana 1) Análisis con SDS-PAGE Cada uno de los productos separados y purificados de multímeros de adiponectina obtenidos en el ejemplo uno se sometieron a SDS-PAGE (de 2 a 15%) bajo condiciones de no reducción para la separación •y después la tinción de la proteína con CBB. La Figura 3 muestra los resultados de la tinción de las proteínas sometidas a electroforesis. En cada uno de LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad, se observó una banda teñida transparente en la cercanía de 60 kDa. La banda teñida se dedujo como siendo un dímero de adiponectina sobre las bases del estructura reportada y del peso molecular de adiponectina. En LMW-Ad, además de la banda cerca de 60 kDa, se observó una banda teñida no identificada en la cercanía de los 90 kDa. 2) Análisis del adiponectina no identificada correspondiente a la banda cerca de 90 KdA observada en SDA-PAGE (de 2 a15%) Se cortó una porción de gel conteniendo la banda teñida no identificada de cerca de 90 kDa, la cual se había detectado en 1 ), y la proteína se extrajo por medio de un electroeluyente Modelo 422 (producto de Bio-Rad Laboratorios, Inc.). La proteína extraída se hirvió y se redujo a través del uso de una solución de procesamiento conteniendo 2-mercaptoetanol, y el producto se sometió a SDS-PAGE (de 2 a 15%) para la separación y después la transferencia a una membrana PVDF, seguido por la tinción de la proteína con CBB. Se observaron dos bandas teñidas en la cercanía de los 60 kDa y 30 kDa. Las proteínas que mostraron las bandas cerca de 60 kDa y 30 kDa se analizaron en términos de secuencias de aminoácido en el N-término. La secuencia de aminoácido del N-término de la proteína de la banda cerca •de los 60 kDa se encontró que coincide con la secuencia de aminoácido del N-término de albúmina humana. La secuencia de aminoácido del N-término de la proteína de la banda cercana a 30 kDa se encontró que coincide con una porción de la secuencia de aminoácido de adiponectina inicia el residuo de aminoácido 19avo. A partir de los resultados descritos anteriormente, la proteína correspondiente a la banda cercana los 90 kDa, la cual se detectó cuando LMW-Ad se sometió a SDS-PAGE (de 2 a 15%), se encontró como siendo un heterodímero formado a través del enlace de disulfuro del monómero de albúmina y el monómero de adiponectina. Por consiguiente, la adiponectina contenida en la fracción LMW-Ad se encontró que tiene una estructura en la cual el trímero de adiponectina y la albúmina se enlazan juntos a través de un enlace de disulfuro.

EJEMPLO 3 Separación y purificación de multímeros de adiponectina derivados de sangre humana (2) Se volvió a preparar mAd purificado de acuerdo con el método descrito en el ejemplo de referencia 3, se desmineralizó a través de diálisis con 20 mM de regulador de pH de fosfato (pH 7.0), se adsorbió en una columna de Gelatina-Celulofina (Siekagaku Corporation), y después se eluyó serialmente con cada 20 mM de cada uno de los reguladores de pH de fosfato -(pH 7.0) conteniendo 0, 100, 200, y 500 mM de NaCl. La fracción resultantes eluidas con 100 mM de NaCI se encontró que contienen ULMW-Ad, LMW-Ad, y MMW-Ad, y la fracción eluida con 200 mM de NaCI se encontró que contiene MMW-Ad y HMW-Ad. Sin embargo, la fracción eluida con 500 mM de NaCI se encontró que contiene solamente HMW-Ad. Por consiguiente, la fracción del eluato de 500 mM de NaCl se utilizó en el siguiente paso como el producto separado y purificado de HMW-Ad. Subsecuentemente, se preparó resina Sepharose 4B enlazada al anticuerpo ALB de cabra a humano de acuerdo con el método descrito en el ejemplo de referencia 3 anterior, y la fracción eluida con 100 mM de NaCI se aplicó a la resina, por lo tanto se obtuvo una fracción no adsorbida y una fracción adsorbida. La fracción no adsorbida se encontró que contiene ULMW-Ad y MMW-Ad, pero la fracción adsorbida se encontró que contiene solamente LMW-Ad. Por consiguiente, la fracción adsorbida se utilizó en el siguiente paso como la fracción LMW-Ad. Enseguida, la fracción no adsorbida se concentró y después se sometió a cromatografía de filtración de gel a través del uso de Sephacryl S-300 (peso molecular fraccionado; de 10 a 1500 kDa, tamaño de particular promedio; 47 µm, Amersham Bioscience), de esta forma, se separaron ULMW-Ad y MMW-Ad uno del otro. Las fracciones resultantes se emplearon en el siguiente paso como el producto separado y purificado de MMW-Ad, respectivamente. La separación y la purificación en este ejemplo se llevaron a cabo con base en la información obtenida en la separación y purificación del ejemplo 1 , mientras que las condiciones de separación y purificación se •modificaron. Como resultado, en este método, se aisló un nuevo tipo de adiponectina (de quien adelante referida como ULMW-Ad) además de los tres tipos anteriores LMW-Ad, MMW-Ad y HMW-Ad. Los cuatro tipos de productos separados y purificados de multímeros de adiponectina; es decir, ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad y HMW- Ad, se separaron uno del otro a través de PAGE (de 2 a 15%) bajo condiciones de no desnaturalización, seguido por la tinción de la proteína con CBB. La Figura 6 muestra los resultados de la tinción de las proteínas sujetas a electroforesis.

EJEMPLO 4 Análisis del estructura de los multímeros de adiponectina (ULMW-Ad, LMW-Ad. MMW-Ad y HMW-Ad) derivados de sangre humana 1 ) Análisis con SDS-PAGE Cada uno de los productos separados y purificados de multímeros de adiponectina obtenidos en el ejemplo 3 se sometieron a SDS-PAGE (de 2 a 15%) bajo condiciones no de reducción para la separación y después la tinción de la proteína con CBB. La Figura 7 muestra los resultados de la tinción de las proteínas sometidas a electroforesis. En cada uno de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad y HMW-Ad, se observó una banda teñida transparente en la cercanía de 60 kDa. La banda teñida se dedujo como siendo un dímero de adiponectina sobre las bases del • estructura reportada y el peso molecular de adiponectina. En LMW-Ad, además de la banda cerca de 60 kDa, se observó una banca teñida no identificada en la cercanía de los 90 kDa. En ULMW-Ac, ya que se observó una banda teñida atribuida al monómero además de la banda teñida atribuida al dímero, ULMW-Ad se dedujo como siendo un trímero. En la Figura 7, se observaron dos bandas teñidas atribuidas a LMW-Ad. De manera separada, las dos bandas se confirmaron para corresponder con la adiponectina enlazada a albúmina. 2) Estimación del peso molecular a través del entrelazamiento intramolecular. Cada uno de los productos separados y purificados de multímeros de adiponectina obtenidos en el Ejemplo 3 se diluyeron con 100 mM de regulador de pH de fosfato (pH 8.0) a aproximadamente 5 aproximadamente 10 µg/ml. Un agente de entrelazamiento, bis(sulfosuccinimidil)suberato (nombre comercial BS3: producto de PIERCE), se diluyó con agua purificada a 20 mg/ml. se mezclaron cantidades iguales del producto diluido y el agente de entrelazamiento diluido uno con el otro y se dejaron en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente, se agregó la misma cantidad de 100 mM de regulador de pH de Tris-HCl (pH 8.0) a la mezcla, y la mezcla resultante se dejó en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente. El líquido resultante se sometió a SDS-PAGE (de 2 a 15%) bajo condiciones no de reducción para la • separación, se transfirió a una membrana PVDF a través de tinción semiseca, y después el ¡nmunotiñó. Específicamente, se bloqueó una membrana de transferencia con PBS conteniendo 5% de leche desnatada y 0.1 % de NaN3, se lavó con PBS conteniendo 0.1% de Tween 20, y después se hizo reaccionar con un anticuerpo monoclonal de adiponectína anti-humano (hu Acrp30-MoAb) (1 µg/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó vigorosamente con PBS conteniendo 0.1% de Tween 20, y se dejó desarrollar el color a través del uso de un equipo Vector ABC (Ratón) y un equipo de sustrato DAB. Los resultados se muestran en la Figura 8. La calibración del peso molecular se llevó a cabo través del uso de un marcador de peso molecular. ULMW-Ad provee una banda teñida cerca de alrededor de 100 kDa y se identificó como siendo un trímero sobre las bases de la estructura reportada previamente y del peso molecular de adiponectina. LMW-Ad provee una banda teñida cerca de alrededor de 150 kDa y se identificó como siendo un trímero enlazado a albúmina similar a aquel obtenido anteriormente, sobre las bases del peso molecular. MMW-Ad provee una banda teñida cerca de 250 kDa y se dedujo como siendo un hexámero o un nanómero. HMW-Ad provee una banda teñida a un peso molecular considerablemente alto, y se dedujo como que tiene un peso molecular muy alto, por lo menos 300 kDa o mayor, y como siendo un 12- o 18-mer aproximadamente. Sin embargo, la forma exacta de HMW-Ad permanece no identificada.

EJEMPLO 5 Análisis de la tinción Western de adiponectina contenida en suero humano Las muestras de suero (0.2 µl) obtenidas de ocho sujetos sanos se sometieron a PAGE (de 2 a 15%) para la separación, se transfirieron a la membrana PVDF a través de tinción semiseca, y después se inmunotiñeron. Específicamente, la membrana de transferencia se bloqueó con PBS (pH 7.4) conteniendo 5% de leche desnatada, y 0.1 % de NaN3, se lavó con PBS (pH 7.4) conteniendo 0.1 % de Tween 20, y después se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina (hu Acrp30-MoAb; Fujisawa Pharmaceutícals Co., Ltd., BD Transduction Laboratorios) (1 µg/ml). La membrana se lavó vigorosamente con PBS (pH 7.4) conteniendo 0.1 % de Tween 20, y se dejó desarrollar el color a través del uso de un equipo Vector ABC (Ratón) y un equipo de sustrato DAB (Funakosi Co., Ltd.) Como resultado, se observaron bandas principales en posiciones similares de las fracciones LMW-Ad, MMW-Ad y HMW-Ad preparadas en el Ejemplo 1 , revelando que la sangre predominantemente contiene estos tres tipos de adiponectina (Figura 4). ULMW-Ad no provee sustancialmente ninguna banda teñida. Aunque la razón de esto no se ha aclarado, se postula que la cantidad de ULMW-Ad presente en la sangre fue pequeña (Figura 4).

EJEMPLO 6 Ensayo de adiponectina enlazada a albúmina (1) Un anticuerpo políclonal de adíponectina anti-humana de cabra (anticuerpo Acrp30 Cabra a humano) se diluyó con una solución de sensibilización del anticuerpo ELISA a 1 µg/ml, y la placa ELISA se sensibilizó con el producto diluido. La placa se bloqueó con un regulador de pH de ELISA. El LMW-Ad preparado en el ejemplo 1 se diluyó con regulador de pH ELISA a 1 , 0.1 y 0.01 µg/ml (Ad contení) y después se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó con regulador de pH ELISA. Se hizo reaccionar un líquido del anticuerpo monocional de albúmina antihumano (Solicitud de Patente Japonesa Expuesta (kiokai) No. 2001-337092) que había sido diluido 2000 veces con regulador de pH ELISA con la placa ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó con un regulador de pH ELISA. Se hizo reaccionar un líquido del anticuefo marcado HRP de IgG de anti-ratón de cabra (Cabra a ratón) que había sido diluido 1000 veces con un regulador de pH ELISA con la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. HRP desarrollo color a través de la reacción de la enzima con sustratos; es decir, TMB (tetrametilbencidina) y peróxido ácido. Se agregaron 2N de ácido sulfúrico a la mezcla de reacción para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm. Los resultados de la medición se muestran en la Figura 5. Se observó un incremento dependiente de la concentración en ia ' absorbancia, lo que indica que el inmunoensayo de emparedado fue justificado. Por consiguiente, se confirma que LMW-Ad es adiponectina que se enlaza a albúmina (adiponectina enlazada a albúmina). Además, ei método del presente ejemplo se encuentra que habilita selectivamente el ensayo de LMW-Ad.

EJEMPLO 7 Ensayo de adiponectina enlazada a albúmina (2) (1 ) Linealidad en la dilución Se sensibilizó una placa ELISA con un anticuerpo monoclonal de anti-adiponectina (64402) que había sido diluido con una solución sensibilizadora de anticuerpo ELISA a 5 µg/ml. Subsecuentemente, la placa se bloqueó con un regulador de pH ELISA conteniendo 20% de suero de cabra. El producto purificado LMW-Ad preparado en el Ejemplo 3 se diluyó con un regulador de pH ELISA a 0 a 20 ng/ml (Ad content), y después se hizo reaccionar con la placa 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó con líquido de lavado ELISA, y después se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo de albúmina anti-humano de cabra marcado HRP (HPR-Gt anti-HSA) que había sido diluido 1000 veces con un regulador de pH ELISA. La placa se lavó con un líquido de lavado ELISA y después se desarrolló el color con un líquido desarrollador de color OPD (250 mM de regulador de pH de cítrato conteniendo 2 mg/ml de clorhidrato de * ortofenilenodiamina y 0.02% de peróxido ácido, pH 5.0). Se agregó un líquido de detención (1.5N de ácido sulfúrico, 1 mM de EDTA-2Na) a la placa para detener la reacción, y se midió la absorbancia a 492 nm. Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 9. Se observó un incremento dependiente de la concentración en la absorbancia, lo que indica que se justifica el inmunoensayo de emparendado. Por consiguiente, se confirma que LMW-Ad es adiponectina que se enlaza a albúmina (adiponectina enlazada a albúmina). (2) prueba de recuperación de adición Se diluyó suero humano de 100 a 800 veces con un regulador de pH 2 ELISA, y el producto purificado LMW-Ad preparado en el Ejemplo 3 (de 0 a 50 ng/ml) se agregó al producto diluido. La mezcla se ensayó con un sistema ELISA similar a que el de (1 ), el porcentaje de recuperación se determinó sobre las bases de la cantidad adicionada y de la cantidad medida. Los resultados se muestran en el 4 1.

CUADRO 1 En todos los casos, se obtuvo un porcentaje de recuperación, revelando que el método del presente ejemplo habilita el ensayo selectivo de LMW-Ad.

EJEMPLO 8 Procesamiento con proteasa (1) El mAd purificado preparado en el ejemplo de referencia 3 y cada proteasa comercialmente disponible se adicionaron a 50 mM de regulador de pH de fosfato (pH 8. 0), y la mezcla se calentó durante 60 minutos a 37°C. El líquido del procesamiento se sometió a PAGE (de 2 a 15%) para la separación y la tinción con CBB. De esta forma, la acción de * cada proteasa a cada una de las fracciones se comparó con aquella del control al cual no se agregó proteasa (Cuadro 2). A través del procesamiento con proteasa bajo cualquiera de las condiciones 1 y 2, la fracción correspondiente a LMW-Ad desapareció, mientras que MMW-Ad y HMW-Ad quedaron estando presentes. No se observó ningún producto convertido obvio. A través del procesamiento con proteasa bajo las condiciones 3 y 4, no se observó LMW-Ad mientras que MMW-Ad y HMW-Ad estuvieron presentes. En este caso, se observó una nueva banda teñida atribuida al producto convertido derivada de LMW-Ad en una región de bajo peso molecular. A través del procesamiento con proteasa con cualquiera de las condiciones 5 y 6, LMW-Ad y NNW-Ad desaparecieron, mientras que HMW-Ad permaneció estando presente. En este caso, se observó una nueva banda teñida atribuida a un producto convertido derivado de LMW-Ad en una región de bajo peso molecular. Las regiones en las cuales estos productos convertidos se detectaron a través de PAGE (de 2 a 15%) caen dentro de la escala de 30-42 kDa; los valores exactos pueden variar dependiendo del tipo de proteasa. Esto resultados indican que la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se pueden determinar a través del procesamiento bajo las condiciones 1 o 2; la cantidad de LMW-Ad solamente o la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se puede determinar a través del procesamiento bajo las condiciones 3 o 4; y la cantidad total de HMW-Ad solamente o la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se puede determinar a través del procesamiento bajo las condiciones 5 o 6.

CUADRO 2 (-): Ausente, (+): Sin cambio, o producción del producto convertido EJEMPLO 9 Procesamiento con proteasa (2) El mAd purificado analizado en el Ejemplo 3 y cada proteasa comercialmente disponible (1 mg/ml) se adicionó a 50 mM de regulador de pH de fosfato (pH 8. 0), y la mezcla resultante se calentó durante 30 minutos a 37°C. El líquido dei procesamiento se sometió a PAGE (de 2 a 15%) para la separación y la tinción con CBB. De esta forma la acción de cada proteasa hacia cada una de las fracciones se comparó con aquélla del control a la cual no se le agregó proteasa (Cuadro 3). A través del procesamiento con proteasa bajo cualquiera de las condiciones 7 a 9, ULMW-Ad y LMW-Ad desaparecieron, mientras que MMW-Ad y HMW-Ad permanecieron estando presentes. En este caso, se observaron nuevas bandas teñidas atribuidas a los productos convertidos derivados de ULMW-Ad y LMW-Ad en regiones con peso molecular bajo. A través del procesamiento con proteasa bajo cualquiera de las condiciones 10 a 12, LMW-Ad, LMW-Ad y MMW-Ad desaparecieron, y HMW-Ad se mantuvo estando presente. En este caso, se observaron nuevas bandas teñidas atribuidas a los productos convertidos de ULMW-Ad, LMW-Ad y MMW-Ad en regiones de peso molecular bajo. La regiones en donde los productos convertido se detectaron a través de PAGE (de 2 a 15%) caen dentro del escala de aproximadamente 30-40 kDa; los valores exactos pueden variar dependiendo del tipo de proteasa. Esto resultados indican que la cantidad total de ULMW-Ad y de LMW-Ad se pueden determinar a través del ensayo selectivo mediante el uso de la proteasa empleada en las condiciones de procesamiento 7 a 9 y a través de la medición de la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad que persisten con la cantidad de los dos productos Ad convertidos. Además, la cantidad de HMW-Ad que persiste o la cantidad total de ULMW-Ad, LMW-Ad y MMW-Ad se pueden determinar a través del ensayo selectivo mediante el uso de cualquiera de las proteasas empleadas en las condiciones de procesamiento 10 a 12.

CUADRO 3 (+): disminución, (++): invariable, (+++): incremento, o producción de producto convertido (-) ausente, o no producción de producto convertido EJEMPLO 10 Procesamiento con proteasa para llevar a cabo el ensayo HMW-Ad Cada uno de los productos separados y purificados del multímeros de adiponectina obtenidos en el Ejemplo 3 se agregaron a la fracción no de adsorción de resina enlazada al anticuerpo obtenida en el Ejemplo de referencia 3 (de quien adelante referido como "plasma adicionado - removido") a una concentración final de 10 µg/ml o aproximadamente, y la mezcla resultante se utilizó como una muestra de investigación. La proteinasa K se disolvió en 50 mM de regulador de pH de Tris-HCl (pH 8.0) para preparar una solución de 5-10 ul/ml, y la solución se utilizó como una solución de enzima de pre-tratamiento. La solución de enzima de pre-tratamiento (90 • µl) se agregó a cada una de las muestras (10 µl), y la mezcla se hizo reaccionar a 37°C durante periodos predeterminados en escala de 10 a 30 minutos. Se agregaron 100 mM regulador de pH de citrato (pH 3.0, conteniendo 2% de SDS) (400 µl) a cada una de las mezclas de reacción resultantes para detener la rección de ias enzima (pre-tratamiento). La mezcla de reacción (20 µl) se diluyó con un regulador de pH ELISA 2 (1.0 ml), y la mezcla resultante se utilizó como una muestra pre-tratada. La cantidad de adiponectina persistente en la muestra pre-tratada se determinó a través del uso del sistema ELISA para la medición de adiponectina el cual se describirá más adelante.

EJEMPLO 11 Procesamiento con proteasa para la medición de la cantidad totoal de MMW-Ad y HMW-Ad En una forma similar a aquella empleada en el ejemplo 10, cada uno de los productos separados y purificados del multímeros adiponectina en el ejemplo 3 se agregaron a un plasma Ad-removido a una concentración final de 10 µg/ml o aproximadamente, y la mezcla resultante se utilizó como una muestra para investigación. La proteasa A "Amano" se disolvió en 50 mM de regulador de pH de Tris-HCl (pH 8. 0) para preparar una solución de 0.6 -1.0 mg/ml y la solución se utilizó como una solución de enzima de pre-tratamiento. La solución de enzima de pre-tratamiento (90 µl) se agregó a cada una de las muestras (10 µl) y la mezcla se hizo reaccionar a 37°C durante periodos predeterminados en la escala de 10 a 30 minutos. Se agregaron 100 mM de regulador de pH de citrato (pH 3.0, conteniendo 2% de SDS) (400 µl) a cada una de las mezclas de reacción resultantes para detener la reacción de la enzima (pre-tratamiento). La mezcla de reacción (20 µl) se diluyó con un regulador de pH ELISA 2 (1.0 m), y la mezcla se utilizó como una muestra pre-tratada. La cantidad de adiponectina que persistió en la muestra pre-tratada se determinó a través del uso del sistema ELISA para la medición de adiponectina el cual se describirá más adelante.

EJEMPLO 12 Preparación de muestras para determinar la cantidad total de adiponectina Los presentes inventores han desarrollado un método (Solicitud internacional que reclama la prioridad de la solicitud de patente Japonesa número 2003-354715), en el cual por lo menos un agente de reducción, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y/o proteasa se agregan a una muestra biológica para la reacción con adiponectina, mientras los multímeros de adiponectina se forman en una forma específica para inmunoensayo. En el presente ejemplo, se utilizaron un ácido y un agente tensioactivo en el pre-tratamiento. Específicamente, se agregaron 100 mM de regulador de pH de citrato (pH 3.0, conteniendo 2% de SDS), (490 µl) a • plasma humano o suero humano (10 µl), y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla de reacción (20 µl) se diluyó con un regulador de pH ELISA 2 (1.0 ml) la mezcla se utilizó como una muestra pre-tratada. La cantidad de adiponectina que persistió en la muestra pre-tratada se determinó a través del uso de un sistema ELISA para la medición de adiponectina el cual se describirá más adelante.

EJEMPLO 13 Sistema ELISA para la medición de adiponectina Se sensibilizó una placa ELISA con anticuerpo monoclonal de adiponectina anti-humana (64405) que se había diluido con PBS a 5 µl/ml. la placa se bloqueo con un regulador de pH ELISA 2. Cada una de las muestras pre-tratadas en el ejemplo 10 y 11 se agregaron y se hicieron reaccionar con la placa durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lavó con un líquido de lavado ELISA. El anticuerpo monoclonal de adiponectina antihumano marcado con bíotina (64404) que había sido diluido 2000 veces con un regulador de pH ELISA 2 se hizo reaccionar con la placa durante una hora a temperatura ambiente. HRP-avidina que había sido diluido 2000 veces con un regulador de pH ELISA 2 se agregó y se hizo reaccionar con la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó con un líquido de lavado ELISA. El color se desarrolló con un líquido desarrollador de color OPD (250 mM de regulador de pH de citrato conteniendo 2 mg/ml de • clorhidrato de ortofenilenodiamina y 0.02% de peróxido ácido, pH 5.0). Se agregó una solución de detención (1.5 N de ácido sulfúrico, 1 mM de EDTA- 2Na) a la placa para detener la reacción, y se midió la absorbancia a 492 nm. De forma separada, se preparó una muestra estándar. Específicamente, la solución de enzima de pre-tratamiento (90 µl) y 100 mM de regulador de pH de citrato (pH 3.0, conteniendo 2% de SDS) (400 µl) se mezclaron juntos, y cada una de ias muestras (10 µl) se agregaron a la mezcla. La muestra estándar también se midió a través de ELISA en una forma similar aquella descrita anteriormente, y el valor del desarrollo de color de la muestra estándar se definió como 100%. La medición del valor obtenido de cada una de las muestras preparadas en los ejemplos 10 y 11 se convirtió a porcentaje. En cada caso, se calculó el valor promedio del porcentaje de los valores del desarrollo de color obtenidos. Los resultados obtenidos a partir de las muestras preparadas en el ejemplo 10 y 11 se muestran en las Figuras 10 y 11 , respectivamente. Ya que es claro a partir de los resultados mostrados en la Figura 10, a través del procesamiento con proteasa (proteinasa K), los multímeros Ad diferentes de HMW-Ad contenidos en el plasma se digirieron, y se hallaron en forma directa específicamente para que HMW-Ad se pudiera llevar a cabo. Los resultados mostrados en la Figura 11 indican que, el procesamiento con proteasa (proteasa A "Amano"), multímeros Ad diferentes de MMW-Ad y HMW-Ad contenidos en el plasma se digirieron, mientras la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se puede determinar en una forma directamente • específica para MMW-Ad y HMW-Ad. La cantidad de MMW-Ad se puede capturar a través de la sustracción de la cantidad de HMW-Ad a partir de la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad. Ya que es claro a partir de los resultados descritos anteriormente, la cantidad de ULMW-Ad presente en una muestra se puede calcular en la siguiente forma: la muestra se pre-trató en una forma similar a aquella descrita en el ejemplo 12, se determinó la cantidad total de adiponectina contenida en la muestra resultante, y la cantidad de LMW-Ad se determinó una forma similar a aquella descrita en el ejemplo 6 o 7, la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se determina en una forma similar a aquella descrita en los ejemplos 11 y 13, y la cantidad de LMW-Ad y la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se sustrajo de la cantidad total de adiponectina. De esta forma, los cuatro tipos de multímeros Ad presentes en la sangre humana se puede ensayar selectivamente, y se puede determinar la cantidad total de estos cuatro tipos de adiponectina.

EJEMPLO 14 Relación con la enfermedad arteroesclerótica Se dividieron en dos grupos 298 pacientes que sufren de diabetes de tipo II pero que no han recibido tratamiento de insulina; es decir, un grupo con enfermedad arteria coronaria (CAD) (90 pacientes que tienen una lesión orgánica detectada a través de la angiografía coronaria (CAG), y un • grupo con enfermedad de arteria no coronaria (NCAD) (el resto, 208 pacientes). En una forma similar aquella a descrita en los ejemplos anteriores, se determinó el contenido de adiponectina total (T.Ad), y cada uno de los multímeros de adiponectina se ensayó selectivamente. Específicamente, el contenido T.Ad se determinó a través de los métodos descritos en los ejemplos 12 y 13; el contenido HMW-Ad se determinó a través de métodos descritos en los ejemplos 10 y 13; y el contenido de MMW-Ad se calculó a través de la sustracción del contenidos de HMW-Ad a partir de la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad se determinó a través de los métodos descritos en los ejemplos 11 y 13. La cantidad total de ULMW-Ad y LMW-Ad se calculó a través de la sustracción de la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad a partir el contenido de T. Ad. Las cantidades obtenidas de multímeros se compararon a través de la prueba t con el fin de determinar si existe o no una diferencia significativa entre el grupo CAD y el grupo NCAD. Los resultados se muestran en el cuadro 4. Entre cada grupo CAD y NCAD, no se observó ninguna diferencia significativa en el contenido de T.Ad, pero se observó una diferencia significativa en el contenido de HMW-Ad (p<0.05). En la proporción (%) del contenido HMW-Ad con el contenido T. Ad, se observó una diferencia significativa (p?.0001). Los resultados revelan que, el contenido de HMW-Ad, especialmente la proporción (%) del contenido de MMW-Ad con el contenido de T.Ad., puede servir su como un indicador más preciso de CAD el contenido de T. Ad.

CUADRO 4 EJEMPLO 15 Relación con el síndrome metabólico Los 298 pacientes empleados en el ejemplo 14 se dividieron en cuatro grupos sobre las bases del contenido de adiponectina total (T.Ad) y la proporción de contenido de HMW-Ad con el contenido de T.Ad; es decir, HMW-Ad/T.Ad x 100% (HMW-R), a través del uso de siguiente criterio. Primero, se calcularon los valores promedio de T.Ad y HMW-Ad como siendo 9.8 µg/ml y 32%, respectivamente. Los pacientes que exhiben los valores T.Ad y HMW-Ad que son más bajos que los valores promedio respectivos se clasificaron en el Grupo A; los pacientes que exhibieron valores T.Ad que son más bajos que el valor promedio y que exhibieron valores HMW-Ad que son iguales a o más altos que valor promedio se clasificaron dentro del Grupo B; * los pacientes que exhibieron valores T.Ad que son iguales a o mayores que valor promedio y que exhibieron valores HMW-Ad que son más bajos que valor promedio se clasificaron dentro del Grupo C; y los pacientes que exhibieron valores T.Ad y HMW-Ad que son ¡guales a o más altos que los valores promedio respectivos se clasificaron dentro del Grupo D. además, los pacientes dentro de cada grupo se dividieron en dos grupos en vista del criterio de diagnosis de síndrome metabólico (JAMA, 285: 2486, 2001) del Panel III de Tratamiento para Adultos (APTIII); es decir, un primer grupo formado por pacientes que exhiben, dentro de cualquiera de dos o más de los cinco aspectos de factor de riesgo, los niveles del factor de riesgo que son más altos el criterio respectivo; y un segundo grupo formado de pacientes que exhiben, menos de dos aspectos de factor de riesgo, los niveles del factor de riesgo que son más altos que el criterio respectivo. Usualmente, de acuerdo con el criterio de diagnosis de ATPIII, un paciente que tiene, en cualquiera de tres o más aspectos, niveles de factor de riesgo que son más altos que el criterio respectivo se definen como que sufren el síndrome metabólico. Sin embargo, en el presente ejemplo, se utilizó un criterio severo. Los resultados se muestran en el cuadro 5. La prueba de Kruskal-Wallis reveló que el número de aspectos del criterio de diagnosis en el síndrome metabólico tiene una correlación estadísticamente significativa con los valores de T.Ad y HMW-Ad (valor p = 0.001 ). En los grupos A y C, que consisten HMW-Ad, de pacientes que exhiben valores menores de valor promedio la proporción de los pacientes clasificados que exhiben dos o más aspectos del criterio de diagnosis de síndrome metabólico fue más grande. Los resultados indican que, según comparado con el valor T.Ad, el valor de HMW-Ad sirve como un buen indicador para el síndrome metabólico. Es decir, los presentes inventores han encontrado por primera vez que a medición del valor HMW-Ad y el uso del valor HMW-Ad como un índice para el síndrome metabólico son efectivos en la prevención o prognosis del síndrome metabólico.

CUADRO 5 (pacientes) Como es claro partir de la descripción anterior, aún cuando se utiliza el contenido total de adiponectina como un índice para una enfermedad o condición patológica no es suficiente para la evaluación de las enfermedades o condiciones patológicas, el ensayo de un cierto tipo de multímeros Ad o la proporción de la cantidad de una cierta fracción del multímeros Ad con la cantidad total de adiponectina que habilita la prognosis y la prevención de la enfermedad o la evaluación de la condición patológica.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para selectivamente ensayar un multímero de adiponectina objetivo en una muestra biológica, que comprende un paso de distinguir el muitímero adiponectina objetivo de otros multímeros de adiponectina a través del uso de una proteasa y/o un anticuerpo para el ensayo inmunológico.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteasa y/o el anticuerpo se utilizan para distinguir el multímero de adiponectina objetivo de los otros multímeros de adiponectina permitiendo que la proteasa reaccione con los multímeros anteriores, y ensayar de manera inmunológica el multímero de adiponectina objetivo restante.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteasa y/o el anticuefo se utilizan para distinguir el multímero de adiponectina objetivo de los otros multímeros adiponectina permitiendo que la proteasa reaccione con el multímero de adiponectina objetivo y ensayar inmunológicamente el producto digerido del multímero de adiponectina objetivo.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el multímero de * adiponectina se deriva de sangre humana.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el multímero de adiponectina derivado de sangre humana es uno de los cuatro siguientes tipos de adiponectina, y uno o dos de los cuatro tipos de adiponectina seleccionados de la adiponectina total inmunoensayada, a través del uso de una proteasa y/o un anticuerpo; (1) ULMW-Ad: exhibe la movilidad más alta entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 100 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular; (2) LMW-Ad: exhibe la segundad movilidad más alta, después de ULMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, tiene un peso molecular de alrededor de 150 kDa según medido a través de SDS- PAGE después de el entrelazamiento intramolecular, y se enlaza a albúmina a través de un enlace de disulfuro; (3) MMW-Ad: exhibe la tercera movilidad más alta después de LMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gei de * poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 250 kDa según medido a través de SDS- PAGE después de el entrelazamiento intramolecular; y (4) HMW-Ad: exhibe la movilidad más baja entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 300 kDa o más alto según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-albúmina y/o un anticuerpo anti-adiponectína.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado además porque la adiponectina que se va a ensayar selectivamente es ULMW-Ad y/o LMW-Ad.

8. El método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado además porque la adiponectina que se va a ensayar selectivamente es MMW-Ad, HMW-Ad, una combinación de MMW-Ad y HMW- Ad.

9. El método de conformidad con la reivindicación 5, 6, u 8, caracterizado además porque el adiponectina que se va a ensayar selectivamente es HMW-Ad, y HMW-Ad se ensaya selectivamente a través de la reacción de una proteasa con los tres tipos de adiponectina diferentes de • HMW-Ad.

10. El método de conformidad con la reivindicación 5, 6, 8, o 9, caracterizado además porque, antes de ensayar HMW-Ad, se hace reaccionar una proteasa con los tres tipos de adiponectina diferentes de HMW-Ad.

11. El método de conformidad con la reivindicación 5, 6 u 8, caracterizado además porque la adiponectina que se va a ensayar selectivamente es MMW-Ad, y MMW-Ad se separa y se ensayar a través de medios que incluyen el procesamiento de ULMW-Ad y LMW-Ad con una proteasa, el cálculo de la cantidad total de HMW-Ad y MMW-Ad que persiste, y la sustracción de la cantidad de HMW-Ad a partir de la cantidad total de HMW-Ad y MMW-Ad.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado además porque el adiponectína que se va a ensayar selectivamente es LMW-Ad, y LMW-Ad se ensaya selectivamente a través de medios que incluyen un uso combinado de un anticuerpo anti-albúmina y un anticuerpo anti-adiponectina.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado además porque la adiponectina que se va a ensayar selectivamente es ULMW-Ad, y ULMW-Ad se ensaya selectivamente a través de medios que incluyen ei procesamiento de ULMW- Ad y LMW-Ad con una proteasa, el cálculo de la cantidad total de HMW-Ad y MMW-Ad que persiste, y la sustracción de la cantidad total de HMW-Ad y MMW-Ad y la cantidad de LMW-Ad de la cantidad total de adiponectina, que - ha sido determinada separadamente.

14. Un método para evaluar una enfermedad o una condición patológica en un ser humano, caracterizado por que comprende selectivamente ensayar uno o dos de los siguientes cuatro tipos de adiponectina derivados de sangre humana a partir del resto de la adíponectina e inmunoensayando el (los) multímero(s) de adiponectina objetivo, a través del uso de proteasa y/o un anticuerpo y la obtención de la información acerca de la enfermedad o la condición patológica sobre las bases de los resultados del ensayo selectivo; (1 ) ULMW-Ad: exhibe la movilidad más alta entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 100 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular; (2) LMW-Ad: exhibe la segundad movilidad más alta, después de ULMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, tiene un peso molecular de alrededor de 150 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular, y se enlaza a albúmina a través de un enlace de disulfuro; (3) MMW-Ad: exhibe la tercera movilidad más alta después de LMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha - sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 250 kDa según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular; y (4) HMW-Ad: exhibe la movilidad más baja entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando la adiponectina que ha sido purificada a través de suero humano o plasma humano se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida (de 2 a 15%) bajo condiciones no de desnaturalización, y tiene un peso molecular de alrededor de 300 kDa o más alto según medido a través de SDS-PAGE después de el entrelazamiento intramolecular.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la evaluación se lleva cabo sobre las bases del cambio en la(s) cantidad(es) de uno o más de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la evaluación se lleva cabo a través del cálculo de la proporción de por lo menos dos de la cantidad total de adiponectina, la cantidad total de ULMW-Ad, la cantidad total de LMW-Ad, la cantidad total de MMW-Ad, y la cantidad total de HMW-Ad.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la evaluación se realiza a través de la correlación de un índice con la(s) cantidad(es) de uno o más de ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, y HMW-Ad o con la proporción de por lo menos dos de la » cantidad total de adiponectina, la cantidad total de ULMW-Ad, la cantidad total de LMW-Ad, la cantidad total de MMW-Ad, y la cantidad total de HMW-Ad.

18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la enfermedad o la condición patológica en diabetes de tipo II, enfermedad arteroesclerótica, enfermedad renal, enfermedad hepática, obesidad, o síndrome metabólico.

19. El método de conformidad con la reivindicación 14, para evaluar el principio, la diagnosis, el desarrollo, la prognosis, o el efecto terapéutico de diabetes de tipo II, enfermedad arteroesclerótica, enfermedad renal, enfermedad hepática, obesidad, o síndrome metabólico.