MXPA05011134A

MXPA05011134A - Complejo de receptores de citocinas protectoras de tejido, ensayo para identificar compuestos protectores de tejido y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA05011134A
Application number: MXPA05011134A
Authority: MX
Inventors: Thomas Coleman
Original assignee: Kenneth S Warren Inst Inc
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2004-04-26
Publication date: 2006-05-25
Also published as: AU2004233985A1; US20090136519A1; CA2523578A1; KR20050121270A; IS8075A; WO2004096148A2; US7718363B2; BRPI0409678A; NO20055525L; US20040214236A1; EP1622570A4; EA009745B1; EA200501667A1; JP2006524827A; NZ543192A; WO2004096148A3; EP1622570A2; NO20055525D0

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para identificar compuestos que tienen una actividad protectora de tejido empleando un complejo de receptores heteromultimericos que media las actividades protectoras de tejido. El complejo consiste en al menos una EPO-R en complejo con al menos un receptor (c. Estos compuestos utilizados en los ensayos para identificar compuestos protectores de tejido incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, pequenas moleculas y biologicos. Los compuestos identificados empleando estos ensayos pueden utilizarse para tratar o prevenir varias enfermedades, trastornos, o condiciones del sistema nervioso central y periferico asi como los de otras celulas, tejidos y organos que responden a las eritropoyetinas o son excitables a traves de las eritropoyetinas.

Description

COMPLEJO DE RECEPTORES DE CITOCINAS PROTECTORAS DE TEJIDO, ENSAYO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS PROTECTORES DE TEJIDO Y USOS DE LOS MISMOS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente norteamericana co-pendiente No. 10/676,694, presentada el día 30 de septiembre de 2003, que reclama el beneficio de prioridad de conformidad con 35 U.S.C. § 119(e) sobre la Solicitud de Patente Provisional norteamericana No. 60/465,891, presentada el 25 de abril de 2003, cuyos contenidos enteros se incorporan aquí por referencia en su totalidad. 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a métodos que se enfocan a complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido blanco que tienen al menos un receptor beta común (jSc) (se conoce también como CD131) y al menos un receptor para eritropoyetina (EPO) para tamizaj e/descubrimiento de fármaco y métodos para el tratamiento o la profilaxis. En particular, la presente invención se refiere a métodos para identificar y tamizar compuestos que modulan la interacción de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Los métodos de la presente invención abarcan también métodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno empleando compuestos que modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido como por ejemplo compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la invención. La invención abarca también métodos para mejorar la función de tejido excitable utilizando compuestos que modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido tales como los compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la presente invención. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varias lineas de evidencia sugieren que la eritropoyetina, como miembro de la superfamilia de las citocinas, desempeña funciones fisiológicas importantes mediadas a través de la interacción con el receptor para eritropoyetina (EPO-R) . Estas acciones incluyen la producción de eritrocitos, mitogénesis, modulación del influjo de calcio en músculos lisos y células neurales y efectos sobre el metabolismo de los intermediarios. EPO-R es una proteina de 68 kDa y es parte de la familia de los receptores para citocinas de tipo 1. Esta familia incluye receptores para interleucina (IL)-IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, factor de estimulación de colonias macrófagos de granulocitos (GM-CSF) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de inhibición de la leucemia (LIF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , trombopoyetina, hormona de crecimiento y prolactina. Estos receptores están agrupados porque presentan homología en sus dominios extracelulares . El dominio extracelular conservado de estos receptores tienen una longitud de aproximadamente 200 aminoácidos, que contiene cuatro residuos de cisteína conservados en cuanto a posición en la región amino-terminal (Cys 294, Cys 283, Cys 248, Cys 238) y un motivo Trp-Ser-X- Trp-Ser ubicado próximo con relación al dominio de transmembrana. Las cuatro cisteínas parecen ser esenciales para el mantenimiento de la integridad estructural de los receptores (Murray, 1996, Harpers Biochemistry 24a edición, páginas 524-526, Appilion & Lange, Ltd.; Caravella et al., 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401;). Como muchos de los receptores dentro de la familia de los receptores para citocinas de tipo 1, el EPO-R parece ser activado por interacción de su ligando endógeno ???. El primer EPO-R en el dímero se une con EPO con una afinidad alta y el segundo EPO-R se une entonces con el complejo con una afinidad baja. Esta dimerización de EPO-R asocia estrechamente las Jak2 tirosina quinasas asociadas con EPO-R, induciendo su transfosforilación. Esta activación provoca la tirosina-fosforilación de varias proteínas que activan subsiguientemente varias vías diferentes como por ejemplo la vía fosfatidilinositol (PI) 3-quinasa, la vía Ras/MAP quinasa, y la vía STAT. Estas vías activan las funciones fisiológicas mediadas por la eritropoyetina (Kirito et al, 2002, Blood 99:102-110; Livnah et al . , 1999, Science 283:987-990/ Naranda et al, 2002, Endocrinology 143:2293-2302; Remy et al., 1999, Science 283:990-993; y Yoshimura et al, 1996, The Oncol. 1:337-339) .

Además de la formación de multimeros, muchos de los miembros de la familia de tipo 1 incorporan uno de tres componentes diferentes de receptores transductores de señales - gpl30, beta común (receptor ße) , o la sub-unidad gamma del receptor para IL2 (receptor yc) en sus complejos de receptor. Por ejemplo, el complejo de receptora para GM-CSF consiste de receptor para GM-CSF, dos receptores ßa/ y el ligando para GM-CSF. Se sabe que EPO-R forma un complejo con el receptor 3c (véase Yutaka et al., 1995, Bioch." Biophys . Res. Com. 208:1060-1066; Jubinsky et al., 1997, Blood 90:1867-1873; D'Andrea et al., 1998, J. Clin, Invest . 102 : 1951-1960) . Sin embargo, se ha reportado que estos complejos no resultan en ningún efecto fisiológicamente relevante (Scott et al., 2000, Blood, 96:1588-1590) . 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a enfocar "complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido" (de conformidad con lo definido infra) para, tamizaj e/descubrimiento de fármacos, y métodos para lograr una protección tisular o reparación in vivo, por ejemplo, para la profilaxis o el tratamiento de varias enfermedades, trastornos y condiciones, o bien para mejorar la función de tejido excitable en sujetos humanos u otros mamíferos- La invención se basa, en parte, en el descubrimiento por parte de los solicitantes que los complejos de receptor para EPO/receptor ß0 desempeñan una función en la protección de tejidos excitables. Los experimentos descritos aquí demuestran que EPO tiene un efecto protector, es decir, una apoptosis mitigada, en células de tipo silvestre que expresan tantos receptores para EPO como receptores ßa; sin embargo, EPO no tiene ningún efecto protector en células que no tienen los receptores ßa. En estudios con animales, se causó una lesión espinal isquémica en ratones de tipo silvestre (que expresan ambos receptores) y en ratones noqueados en cuanto al receptor ß^ (que no expresan el receptor ß0) . La administración de EPO carbamilada (que no es eritropoyética y no se une a dímeros de receptor de EPO) resultó en una recuperación mejorada de los ratones de tipo silvestre. Sin embargo, ni EPO ni EPO carbamilada tuvo ningún efecto sobre la recuperación en ratones noqueados en cuanto a receptor ßs. Estos resultados demuestran que la expresión del receptor ßs es esencial para lograr un efecto de protección tisular. En un aspecto, la presente invención se enfoca al uso de complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido, que comprenden un receptor para EPO, y un receptor ß en ensayos de tamizajes libres de células para identificar compuestos que se unen con complejos de receptores para ci'tocinas protectoras de tejido. En otros aspectos, la presente invención se enfoca al uso de complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido que comprenden un receptor para EPO y un s en ensayos de tamizaje basados en células para identificar compuestos que modulan, es decir, incrementan o inhiben, la actividad de complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido o presentan una actividad protectora de tejido. En otros aspectos, la presente invención se enfoca al uso de complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido, que comprenden un receptor para EPO y un ßa, en ensayos de tamizajes basados en animales para identificar compuestos que presentan una actividad protectora de tejido dependiente de complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido. En otro aspecto particular, los compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la invención modulan la interacción de un complejo de receptores para citocinas protectoras de tejido y un ligando del mismo y presentan una actividad protectora de tejido. En otras modalidades, la invención ofrece métodos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o condición, que comprende la administración de un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En otro aspecto, la invención ofrece métodos para incrementar la función de órganos, tejidos o células excitables mediante la administración de un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de tamizaje de la invención, el compuesto de prueba entra en contacto con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en presencia y/o ausencia de un ligando del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido como por ejemplo EPO, pero sin limitarse a este ejemplo. Tales ensayos pueden ser utilizados para identificar compuestos que modulan la interacción de un ligando y un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Se pueden utilizar ensayos libres de células para identificar compuestos que unen un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En tales modalidades, complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido o una preparación de membrana de tales complejos entra en contacto con un compuesto de prueba y se mide una indicación del enlace. El enlace puede ser un ensayo de enlace directo en donde un compuesto entra en contacto con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ensayos de enlace competitivo, dos compuestos (por ejemplo un compuesto de prueba y un ligando, o dos compuestos de prueba) entran en contacto con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con el objeto de determinar cuál de los dos tejidos tiene la mayor afinidad de enlace. El ensayo puede ser un ensayo de unión por desplazamiento en donde un primer compuesto está en contacto con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido que se une con el complejo y un segundo compuesto se agrega al ensayo con el objeto de determinar si el segundo compuesto tiene la capacidad de desplazar el primer compuesto unido. En ensayos de enlace, el enlace puede medirse etiquetando los compuestos agregados al ensayo y/o etiquetando un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Se pueden utilizar ensayos basados en células para identificar compuestos que enfocan un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en presencia y/o ausencia de un ligando para un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades de este tipo, una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido entra en contacto con un compuesto de prueba. Para determinar si el compuesto de prueba modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula, se observa o mide una lectura. La lectura puede ser una simple medición del enlace del compuesto de prueba con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba es etiquetado y se mide la unión del compuesto de prueba etiquetado con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido detectando la etiqueta fijada sobre el compuesto de prueba. En otras modalidades, la lectura es un cambio fenotipico, como por ejemplo un cambio de tamaño celular, un cambio de forma o apoptosis de la célula. En otras modalidades, la lectura es la expresión de un gen reportero o un cambio en un colorante indicador cargado en la célula o incluido en el medio de cultivo. En tales modalidades, . las células empleadas en el ensayo son genéticamente manipuladas para expresar un producto de gen reportero al activarse un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En otras modalidades, la lectura es determinada por una reacción enzimática de la célula. En tales modalidades, las células utili-zadas en el ensayo después de su contacto con un compuesto de prueba son sometidas a lisis. Los lisados celulares son después examinados para indicadores de la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Por ejemplo, un lisado celular puede ser expuesto a un anticuerpo que se une con el complejo, dicho anticuerpo puede también fijarse sobre un soporte que ancla el complejo. Otras modalidades pueden después ser agregadas al ensayo para detectar si el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido ha sido activado. Por ejemplo, anticuerpos anti-fosfotirisina pueden unirse a las porciones fosforiladas del complejo y/o a los componentes corrientes abajo del complejo de receptor para ???/ß común. En ciertas modalidades, se utilizan anticuerpos que pueden unirse a porciones fosforiladas de la porción de receptor ß común del complejo y/o anticuerpos que se unen a las porciones fosforiladas del receptor para EPO. En ciertas modalidades, células que expresan complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido entran en contacto con anticuerpos que se unen con las porciones fosforiladas del receptor ß común y/o receptor para EPO. En ciertas modalidades, complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido aislados están en contacto con anticuerpos que pueden unirse a porciones fosforiladas del receptor ß común y/o del receptor para EPO. En ciertas modalidades, anticuerpos que pueden "unirse a porciones fosforiladas del receptor para EPO son anticuerpos PY-JAK2. Conforme blancos de activación de citocinas corriente abajo son identificados para complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido, la lectura de los métodos de tamizaje de la invención puede ser la detección de la fosforilación de componentes celulares corriente abajo. La presencia de productos celulares corriente abajo puede ser utilizada para identificar compuestos que se enfocan a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Por ejemplo, después del contacto de un compuesto con una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la célula puede ser examinada para determinar la presencia de otros productos celulares tales como nucleolina o nuroglobina que son indicadores de la activación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de tamizaje de la invención, la célula es recombinantemente manipulada para expresar al menos un receptor para EPO o un receptor ß común. En ciertas modalidades, la célula es genéticamente manipulada para sobreexpresar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de receptor ß común o un polipéptido de receptor para EPO. En ciertas modalidades, la célula es genéticamente manipulada para sobreexpresar un ácido nucleic que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de receptor ß común y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de receptor para EPO. La sobreexpresion puede lograrse mediante el enlace operativo de los ácidos nucleicos con un promotor, la manipulación genética puede ocurrir por técnicas de transferencia estándares, recombinación homologa enfocada para lograr la activación génica de genes endógenos, o integración aleatoria y selección de células con el gen activado. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos es derivada de la misma especie que la célula. En ciertas modalidades, la célula expresa endógenamente un receptor ß común y/o un receptor para EPO. En una modalidad, la modalidad ofrece un método para identificar un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en una célula noqueada para receptor ß común, que comprende la administración del compuesto a una primera célula inmediatamente seguido por el sometimiento de la célula a un agente dañino, en donde la primera célula expresa endógenamente un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y mediante la administración del compuesto a una segunda célula inmediatamente seguido por el hecho de someter la célula al mismo agente de amino que la primera célula, en donde la segunda célula es del mismo tipo que la primera célula pero es deficiente en expresión de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido (es decir, no tienen expresión de receptor ß común) , de tal manera que si la supervivencia de la célula difiere en la primera célula en comparación con la segunda célula, entonces el compuesto es un compuesto que se enfoca a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En una modalidad, las células son derivadas de un animal nogueado para receptor ß común. Ensayos pueden ser efectuados en modelos de animales para identificar compuestos que se enfocan a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En una modalidad, la invención ofrece un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido en un mamífero que comprende la administración del compuesto a un primer animal inmediatamente después de causar una lesión, en donde el primer animal expresa en forma endógena un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y la administración del compuesto a un segundo animal inmediatamente después de causar el mismo tipo de lesión que la lesión causada al primer animal, en donde el segundo animal es deficiente en cuanto a la expresión de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, de tal manera que si la recuperación de la lesión difiere en el primer animal en comparación con el segundo animal, entonces se identifica un compuesto que modula una actividad protectora de tejido. Células que expresan un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido que pueden utilizarse en los métodos de tamizaje de la invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, a células de mamíferos, insectos, eucarióticas, procarióticas, fúngales o bacterianas. En ciertas modalidades se utilizan células humanas como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, células pre-B, células 293, células 293T, células HeLa, células HepG2, células K562 o células 3T3. En otras modalidades, se utilizan células de ratón, como por eje células BaF3, pero son limitarse a este ejemplo. En otras modalidades, se utilizan células fúngales, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, células de los géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, y Hansnula. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un ser humano, dicho método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido a un- ser humano que requiere de dicho tratamiento o prevención. En ciertas modalidades, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno de un tejido excitable o que afecta un tejido excitable . En una modalidad, la invención ofrece un método para mejorar la función de células, tejidos u órganos excitables en un ser humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido a un ser humano que lo requiere, en donde dicha mejora de la función de células, tejidos u órganos excitables resulta en la mejora de aprendizaje asociativo o memoria.. En otra modalidad, la invención ofrece un método para modular la" actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en un ser humano que comprende la adminis ;ración de un compuesto que modula la actividad de dicho complejo a un ser humano que requiere de dicho tratamiento o prevención. En otra modalidad, la invención ofrece un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un ser humano, dicho método comprende la modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en un ser humano. En otra modalidad, la invención ofrece un método para mejorar la función de células, tejidos u órganos excitables en un ser humano, dicho método comprende la modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en un ser humano . En modalidades de la invención para 'el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno, la mejora de la función de células, tejidos u órganos excitables, o la modulación de la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, el compuesto administrado puede ser identificado por el método de cualquiera de los métodos de tamizaje descritos arriba para identificar compuestos que tienen un efecto protectora para tejidos o modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, el compuesto es un anticuerpo especifico para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, el compuesto es un anticuerpo especifico para un ligando p.ira complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, el compuesto es una pequeña molécula, un péptido o un miembro de una biblioteca. En modalidades relacionadas, el compuesto se une al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, el compuesto mejora la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, el compuesto interfiere con la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, el compuesto es administrado en combinación con un EPO. En ciertas modalidades, el compuesto administrado es un EPO. En Ciertas modalidades, el compuesto administrado no es EPO. En modalidades relacionadas, el compuesto administrado no es un EPO modificado ni un EPO mutante. Ejemplo de compuestos de EPO modificado y EPO mutante, influyen, sin limitarse a estos ejemplos, los descritos en la sección 5.4.1.1. En ciertas modalidades de la invención en donde el compuesto administrado es un EPO, un EPO modificado o un derivado de EPO, el compuesto administrado no se une al receptor para EPO. En modalidades relacionadas de la invención, en donde el compuesto administrado es un EPO, un EPO modificado o un derivado de EPO, el compuesto administrado no es une a un dimero de receptor para EPO. En ciertas modalidades de los métodos de la invención para el tratamiento, prevención, mejora de la función de tejido excitable y modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, el compuesto administrado no es un EPO, es decir, no es un EPO, ni EPO modificado ni EPO mutado, ni un derivado de los mismos . En ciertas otras modalidades de los métodos de la invención para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o condición, la mejora de la función de tejido excitable, o modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, el compuesto administrado no se une al receptor para EPO. En ciertas otras modalidades de los métodos de la invención para el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o condición, mejora de la función de tejido excitable o modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, el compuesto administrado no se une a un dimero que consiste dos receptores para EPO. En ciertas otras modalidades de los métodos de la invención para el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o condición, la mejora de la función de tejido excitable, o modulación de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, el compuesto administrado se une a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades de la invención para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno, la enfermedad o trastorno es un trastorno del humor, un trastorno de ansiedad, depresión, autismo, un trastorno de hiperactividad con déficit de atención, enfermedad de Alzheimer, envejecimiento o disfunción cognitiva. En modalidades relacionadas, la enfermedad o trastorno es causado por hipoxia, ataques, enfermedades neurodegenerativas, envenenamiento por neurotoxinas, esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardiaco, radiación, o hipoglicemia. En modalidades relacionadas, la enfermedad o trastorno es isquemia o embolia. En modalidades relacionadas, la enfermedad o trastorno es una condición neurodegenerativa. En modalidades relacionadas, la condición neurodegenerativa es embolia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis cerebral, trauma cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, ataques, alcoholismo, isquemia retinal, envejecimiento glaucoma o pérdida neuronal. En otras modalidades relacionadas, la enfermedad o trastorno es una condición neuromuscular o muscular. En ciertas modalidades, la condición neuromuscular o muscular es de un tejido cardiaco. En ciertas modalidades de los métodos de la invención para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno o condición, mejora de la función de tejido excitable, o modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la enfermedad, trastorno, condición o células, tejidos u órganos excitables no son cerebrales. En ciertas modalidades de los métodos de la invención para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o condición, la mejora de la función de tejido excitable, o modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la enfermedad, trastorno, condición, o células, tejidos u órganos excitables no son del sistema nervioso central incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, tejidos renales, tejidos cardiacos, tejidos endoteliales, tejidos retínales, tejidos vasculares, tejidos pulmonares, tejidos pancreáticos, tejidos óseos, tejidos cutáneos, tejidos embriónicos, tejidos fetales, tejidos renales, tejidos de músculos estriados, tejidos hepáticos, tejidos gastrointestinales, tejido del tracto reproductivo, o tejidos endocrinos. En modalidades de la invención para mejorar la función de células, tejidos u órganos excitables, el tejido excitable es tejido del sistema nervioso, central o tejido del sistema nervioso periférico. En ciertas modalidades, el tejido del sistema nervioso periférico es tejido placental, tejido retinal, o tejido cardiaco. En modalidades de la invención para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno, la mejora de la función de células, tejidos u órganos excitables, o la modulación de la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la administració es oral, tópica, intracraneal, intraluminal, por inhalación, nasal, parenteral, intravenosa, periférica, intra-arterial, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, submucosal o intradérmica . En modalidades relacionadas, la administración es previa a un procedimiento médico o quirúrgico. En ciertas modalidades, el procedimiento quirúrgico es resección de tumor, reparación de aneorisma, o un procedimiento de desvio de arteria coronaria. En ciertas modalidades de la invención, el procedimiento médico es parto . 3.1 TERMINOLOGIA Como se emplea aquí, el término "actividad protectora de tejido" se refiere al efecto de inhibir o retardar el daño o muerte de una célula, tejido, u órgano. La actividad protectora de tejido puede ser contra varias condiciones, enfermedades, y daño a células, órganos y/o tejidos, por ejemplo, los descritos en la sección 5.5. Una actividad protectora de tejido puede ser específica para tejido, células, y/u órganos excitables que tienen un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, como por ejemplo los tejidos del sistema nervioso central, pero sin limitarse a este ejemplo. El término "complejo de receptor para citocinas receptoras de tejido" como se emplea aquí se refiere a un complejo que comprende por lo menos un receptor para eritropoyetina y al menos un receptor beta común. El complero de receptor para citocinas protectoras de tejido puede contener múltiples receptores para eritropoyetina y/o receptores beta comunes, asi como otros tipos de receptores de conformidad con lo descrito aquí en la sección 5.1.3. El término "ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido" se refiere a cualquier compuesto que se une con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y activa el complejo o inhibe la activación por un ligando de activación conocido. Un "ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido" puede ser cualquier tipo de compuesto, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, péptidos, moléculas pequeñas, moléculas orgánicas, o moléculas no orgánica. Ejemplos no limitativos de ligandos de complejo de receptores para citocinas protectoras de tejido incluyen EPO, incluyendo imitantes, modificaciones químicas, o fragmentos de enlace con complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido de los mismos. Otro ejemplo de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es un anticuerpo específico para el complejo. El término "prevención de una enfermedad, trastorno o condición" se refiere a retardar el inicio, impedir el avance, obstaculizar el surgimiento, proteger contra el surgimiento, inhibir el surgimiento o eliminar el surgimiento, o reducir la incidencia de dicha enfermedad, trastorno, o condición. El uso del término "prevención" no significa que todos los pacientes en una población de pacientes que recibieron una terapia de prevención nunca desarrollaran la enfermedad, trastorno o condición a la cual se dirige la prevención, sino que la población de pacientes presentará una reducción en cuanto a la incidencia de la enfermedad, trastorno, o condición. Por ejemplo, muchas vacunas contra la gripe no son 100% efectivas para prevenir la gripe en los pacientes que recibieron la vacuna. La prevención abarca también la protección de tejidos excitables. Una persona con conocimiento-s en la técnica podrá identificar fácilmente pacientes y situaciones en los cuales una terapia de prevención seria benéfica, como por ejemplo pacientes para los cuales se contempla una intervención quirúrgica, pacientes que presentan riesgos de enfermedades, trastornos o condiciones heredadas, pacientes en riesgo de enfermedades, trastornos o condiciones precipitadas por factores ambientales, o porciones de las poblaciones en riesgo para enfermedades, trastornos o condiciones particulares tales como los ancianos, los infantes, o las personas con sistemas inmunológicos debilitados, o pacientes con factores genéticos u otros factores de riesgo para una enfermedad, trastorno o condición, sin limitarse a estos ej emplos . El término "administrado en combinación con" dentro del contexto de los métodos de la invención se refiere a la administración de un compuesto antes del inicio de una enfermedad, trastorno o condición, al mismo tiempo que dicho inicio, y/o después del inicio. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los resultados- de un ensayo competitivo entre EPO y EPO carbamilada que demuestra que EPO carbamilada no se une con EPO-R. % La Figura 2 muestra la presencia de receptor ßs en membranas cerebrales de rata. La Figura 3 muestra tejido de médula espinal de rata teñido para determinar la presencia de receptor ßa. La Figura 4 muestra una vista ampliada de tejido de médula espinal de rata teñido para determinar la presencia de receptor ß0. La Figura 5 muestra la coprecipitación de receptor EPO-R y La Figura 6 muestra la configuración potencial del complejo de receptor protector de tejido. La Figura 7 muestra apóptosis en cardiomiocitos aislados de ratones noqueados en cuanto a receptor ßa y normales en presencia y ausencia de EPO. La Figura 8 muestra fotografías de Western , blot de las proteínas celulares separadas por geles de poliacrilamida utilizando anticuerpos de fosfotirina (PY)-Jak2. El gel superior muestra que Jak2 fosforilado estuvo presente en células estimuladas con EPO a concentraciones de 5 nM y 50 nM. El gel de la parte inferior muestra un control efectuado en donde membranas fueron agotadas y probadas de nuevo con un anticuerpo contra Jak2'para confirmar una carga igual. La Figura 9 muestra una gráfica de afinidad de enlace para ligando para células BaF3 que expresan el receptor para EPO. La concentración de ligando en nM (eje x) es graficada contra unión (cpm) (eje y) para células que expresan el receptor para EPO BaF3 en contacto con ligandos para receptor para EPO, EPO y EPO carbamilada. La Figura 10 muestra una gráfica de afinidad de enlace con ligando para membranas de células UT-7 que tienen el receptor para EPO. La concentración de ligando en nM (eje x) es graficada contra enlace (cpm) (eje y) par membranas de células que expresan receptor UT-7 EPO en contacto con ligandos de receptor para EPO, EPO y EPO carbamilada. La Figura 11 muestra istogramas de, 11A, hematócrito de conformidad con lo medido por el volumen porcentual de hematócrito (eje y), .y, 11B, niveles de hemoglobina medidos en concentración en nM (eje y), en ratones después de la administración de control (vehículos), EPO, EPO carbamilada, y asialoEPO (eje x) .

La Figura 12 muestra una fotografía del gel SDS-PAGE con una proteina de nucleolina de 103 KD circulada. La Figura 13 muestra una gráfica del resultado motor de BBB (eje y) versus tiempo medido en días después lesión espinal (eje x) en donde 5 grupos de ratones, dos de tipo silvestre y 3 noqueados en cuanto a ß0, recibieron ya sea PBS, EPO, ó EPO carbamilada inmediatamente después de una lesión espinal. El grupo de tipo silvestre de ratones que recibieron EPO carbamilada presentó resultados motores incrementados a lo largo del periodo de 42 dias después de la lesión en comparación con todos los demás grupos . La Figura 14 muestra un histograma de la severidad clínica medida en área bajo la curva (AUC) (eje y) y grupos de ratones (eje x) para los cinco grupos descritos arriba en la Figura 13. El grupo de ratones de tipo silvestre que recibieron EPO carbamilada (columna 1) presentaron un incremento significativo de los valores de severidad clínica (es decir, menos severidad) en comparación con todos los demás grupos) (columnas 2-5) . 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se enfoca a métodos para el uso de un complejo de receptor de heteromultímero que media la actividad protectora de tejido de compuestos protectores de tejidos. La invención ofrece métodos de tamizaje para identificar tales compuestos protectores de tejido y utilizar es :os compuestos en el tratamiento o la prevención de enfermedad, trastorno o condición, o el uso de tales compuestos en métodos para mejorar la función de células, tejidos y órganos excitables. La invención ofrece también métodos para tratar o prevenir enfermedades, trastornos, o condiciones mediante la administración de compuestos que modularon la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, los identificados por los métodos de tamizaje de la presente invención. La invención ofrece también métodos para mejorar la función de células, tejidos u órganos excitables mediante la administración de compuestos que modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, los identificados por los métodos de tamizaje de la presente invención. La invención ofrece también métodos para modular la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido mediante la administración de un compuesto que modula o es el blanco de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. La invención se basa en el descubrimiento por los inventores que el receptor para EPO forma un complejo con el receptor ßa dentro de células y tejidos excitables tales como cerebro, medula espinal y corazón. El complejo consiste de al menos un EPO-R en complejo con al menos un receptor 3C. Además del receptor se pueden incluir otros receptores de transducción de señales incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, el receptor yc y GP130, segmentos y porciones de otros receptores para citocinas tipo 1, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, GM-CSF, IL-3 IL-5, etcétera y receptores huérfanos, que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, R0R1, NR6, HM74, etcétera. Los métodos de tamizaje de la presente invención pueden utilizar tales complejos de receptores para citocinas protectoras de tejido en ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Tales ensayos incluyen ensayos de enlace para identificar compuestos que se unen con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o un ligando del mismo. El descubrimiento de los solicitantes proporcionó los medios para identificar compuestos excepcionalmente eficaces para su uso en el tratamiento y prevención de enfermedades, trastosnos, y condiciones, asi como para la mejora de células, tejidos y órganos excitables. La activación de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede llevar a la regulación ascendente de la producción de proteínas protectoras, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, nucleolina y globinas tales como neuroglobinas y citoglobinas (histoglobinas) . En ciertas modalidades de los métodos de la invención descrita aquí arriba, en donde se ensaya la actividad protectora de tejido, el paso de ensayar el compuesto identificado para actividad protectora de tejido comprende la detección de la presencia de nucleolina en la célula. En ciertas modalidades de los métodos de la presente invención descrita aqui, en donde se ensaya la actividad protectora de tejido, el paso de ensayar el compuesto identificado para actividad protectora de tejido comprende la detección o medición de un nivel incrementado de actividad de neuroglobina o citoglobina en una célula. Por consiguiente, los métodos de tamizaje para identificar compuestos con una actividad protectora de tejido pueden utilizar la detección de tales proteínas reguladas en forma ascendente. El complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y reguladores corriente abajo pueden utilizarse en ensayos para identificar compuestos protectores de tejido, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, moléculas pequeñas y biológicos. Los compuestos identificados utilizando estos ensayos pueden ser empleados para tratar varias condiciones del sistema nervioso central y del sistema nervioso periférico, así como de otras células, tejidos y órganos excitables. 5.1 EL COMPLEJO DE RECEPTOR PARA CITOCINAS PROTECTORAS DE TEJIDO El complejo de receptor para su uso en los métodos de la invención comprende al menos un receptor para EPO y al menos un receptor ßa. Varios tipos de receptores EPO que ocurren naturalmente, modificados y/o mutantes y receptores ß.= pueden combinarse para formar tales complejos de varios números de receptores . Ejemplos no limitativos de complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido se describen abajo. 5.1.1 EPO-R Se puede utilizar EPO-R de mamífero dentro del marco de la presente invención. El ADNc de EPO-R ha sido aislado de hígado de ratón, Tojo et al., 1987, Biochem. Biophys . Res. comm. 148: 443-48 y de hígado fetal humano (Jones etal . , 1990, Blood 76:31-35; Winkelmann et al:, 1990 Blood 76:24-30) . Este ADNc humano codifica -una cadena de polipéptidos de un peso molecular de aproximadamente 55kDa y tiene aproximadamente 508 aminoácidos. Otros clones genómicos de EPI-R humano que han sido aislados y secuenciados se contemplan también dentro del marco de la presente invención (Penny and Forget, 1991, Genomics 11:974-80; Noguchi et al., 1991, Blood 78:2548-2556). La estructura común de estos EPO-R consiste de aproximadamente 24 residuos de aminoácidos en un péptido de señal, aproximadamente 226 aminoácidos en un dominio extracelular, aproximadamente 23 aminoácidos en un dominio que abarca membrana, y aproximadamente .„ 235 aminoácidos en un dominio citoplásmico (D'Andrea and Zon, 1990, J. Clin. Invest., 86:681-637; Jones et al., 1990, Blood, 76: 31-35; Psnny and Forget, 1991, Genomics, 11:974-80) . La proteina de EPO-R humana madura tiene aproximadamtne 484 amino ácidos. EPO-R está comercialmetne disponible en BD Biosciences Clonetech (Palo Alto, CA) y tiene un número de acceso a banco de genes M60459 y un número de acceso SwissProt P19235. Las formas de EPO-R útiles en la práctica de la presente invención abarcan formas que ocurren naturalmente, sintéticas y recombinantes de moléculas relacionadas con EPO-R de ser humano y de otros mamíferos. Además, formas de EPO-R útiles en las prácticas de la presente invención incluyen proteínas que representan productos génicos funcionalmente equivalentes. Tales productos génicos funcionalmente equivalentes incluyen EPO-R mutante y EPO-R químicamente modificado. EPO-R mutante puede contener deleciones, incluyendo deleciones internas, adiciones, incluyendo adiciones que proporcionan proteínas de fusión, o sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos dentro y/o adyacente a la secuencia de aminoácidos pero que resultan en un cambio "silencioso", en la medida en el que el cambio produce un EPO-R funcionalmente equivalente. Tales sustituciones de aminoácidos pueden efectuarse con base a similaridad en cuanto a polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza antipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; aminoácidos cargados positivamente (básicos) arginina, lisina, e histidina; y aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico . Otras mutaciones conocidas de EPO-R tales como las divulgadas en la Patente norteamericana No. 5,292,654 están también abarcadas dentro del marco de la presente invención. Además, formas solubles (truncadas) del receptor para EPO que contienen solamente el dominio extracelular están también contempladas para su uso dentro del marco de la presente invención tales como las divulgadas en Harris et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 15205; Yang & Jones, 1993, Blood 82:1713; y Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20020031806. 5.1.2 Receptor ßs El receptor ß? es típicamente identificado como una subunidad de receptor de señalización asociada con GM-CSF, IL-3 e IL-5 de ser humano. Además de estas citocinas, se ha demostrado que el receptor ß0 (por ejemplo no', de acceso Suizo P32927 ó Genebak No. M59941) se une a EPO-R- en ciertos casos. La región conservada del receptor ß0 constituye la totalidad de una parte de la región de enlace con ligando extracelular . La presente invención se basa, en parte, en la demostración por parte de los Solicitantes que EP-R y el receptor ßa coexisten dentro de varias células excitables como por ejemplo cerebro (véase Figura 2) y médula espinal (véase Figuras 3 y 4) . Los solicitantes han descubierto también que complejos de EPO-R y receptor ß0 desempeñan una función en un mecanismo que lleva la proceso fisiológico de protección y reparación de tejidos que expresan estos complejos (véase Figuras 13 y 14) . Las formas de receptor ßa en la práctica de la presente invención abarcan formas que ocurren naturalmente, formas sintéticas y formas recombinantes de moléculas relacionadas con receptor ßa de ser humano y de otros mamíferos. Además, formas de receptor ßa útiles en la práctica de la presente invención incluyen proteínas que representan productos génicos funcionalmente equivalentes. Tales productos génicos funcionalmente equivalentes pueden incluir receptor ß-mutante y receptor ße químicamente modificado. Los receptores ßa mutantes deben contener deleciones, incluyendo deleciones internas, adiciones, incluyendo adiciones que proporcionan proteínas de fusión, o sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos dentro y/o adyacente a la secuencia de aminoácidos, pero que resultan en un cambio "silencioso", que resulta en un receptor ß0 funcionalmente equivalente.

Receptores ßa mutados incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, mutaciones de puntos 1374N, ??, AGA, H544R, V449, A459D, L445Q, CRD4 (I374N, L356P, W358N, Q375P, Y376N, W383R, y L399P)', y truncados extracelulares (1GH7) . {Véase R. J. D'Andrea y T.J. Gonda, 2000, Experimental Hematology 28:231-243; ¦ D'Andrea et al., 1998, J. Clin. Invest. 102: 1951-1960; Jenkins et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:8669-8677). Se contempla también que otras sub-unidades de receptor de señalización incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, yc y GP-130, y receptores huérfanos puedan utilizarse también dentro del marco de la presente invención. 5.1.3 Estructura de Complejo de Receptor He eromultimérico El receptor e forma un multimero con muchos de los receptores con los cuales ya se sabia que se enlazaba, es decir, GM-CSF, IL-3 e IL-5. Por ejemplo, el complejo de receptor para GM-CSF consiste de receptor para GM-CSF, dos receptores ßa, y el ligando para GM-CSF. Se sabe que el EPO-R forma un complejo con el receptor ß0. (Véase Yukata et al., 1995, Biochem. Biophy. Res. Com. 208:1060-1066; Jubinsky et al., 1997, Blood, 90:1867-1873; D'Andrea et al., 1998, J. Clin, Invest. 102 1951-1960.) De manera similar, según la presente invención, el receptor ß0 forma un heteromultimero con EPO-R para formar un compiejo de receptor protector de tejido. Esto se basa en unos estudios de Inmunoprecipitación que demuestran que el receptor ß0 y los receptores EPO-R se coprecipitan (véase Figura 5) . El complejo de receptor protector de tejido incluye al menos un EPO-R y al menos un receptor ßa. Preferentemente, como se muestra en la Figura 6, el complejo de receptor protector de tejido incluirá más que un receptor ßa. Dentro del marco de la presente invención se contemplan también configuraciones de complejo de receptor protector de tejido que incluyen más que un EPO-R. Ejemplos de complejos de receptor protector de tejido contemplados dentro del marco de la presente invención incluyen sin limitarse a estos ejemplos, EP0-R2/receptor ßa, EPO-R/receptor ß?2 y EPO-R/receptor ß03· L configuración más sujerida del complejo de receptor protector de tejido es EPO-R/receptor ßa2, de conformidad con lo ilustrado en la Figura 6. Como se muestra aquí, sin estar limitado a ninguna teoría particular, un mecanismo posible a través del cual el compuesto protector de tejido se une al complejo de receptor protector de tejido incluye el enlace primero del compuesto protector de tejido con EPO^R y después el enlace de dos receptores ßs al complejo. Esta presentación es simplemente ilustrativa de un método a través del cual un ligando puede unirse al complejo de receptor protector de tejido y las personas con conocimientos ordinarios en la técnica podrán contemplar razonablemente otros mecanismos a través de ; los cuales puede ocurrir un enlace - el complejo de receptor puede ser previamente formado (EPO-R y dos receptores ) antes de la unión con el ligando, etcétera. Los polipéptidos de receptor de la presente invención, incluyendo receptores de longitud completa, fragmentos de receptor (por ejemplo, fragmentos de enlace con ligando), y polipéptidos de fusión pueden ser producidos en células huéspedes genéticamente manipuladas de conformidad con técnicas convencionales. Por ejemplo, fragmentos de enlace de eritropoyetina del receptor de eritropoyetina han sido identificados (Barone et al., J. Biol Chem. 272:4985-4992). Tales fragmentos que forman también complejos con un receptor ß0 pueden emplearse en los métodos de tamizaje de la invención . 5.2 ENSAYO DE TAMIZAJE Complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, los descritos arriba, pueden emplearse en ensayos de tamizaje con el objeto de identificar compuestos que tienen una actividad protectora de tejido. Compuestos identificados en estos ensayos pueden modular la actividad de un complejo, por ejemplo, unirse a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o modular la interacción de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y el complejo. Además, los compuestos identificados pueden tener ellos mismos una actividad protectora de tejido.

Esta invención es especialmente útil para tamizar compuestos mediante la utilización de un complejo de receptor de EPO-receptor ßa en cualquiera de varias técnicas de tamizaje de fármaco. El complejo de receptor empleado en dicha prueba puede estar o bien libre en solución fijado sobre un soporte sólido, portado en una superficie celular, o localizados en forma intracelular . Un método de tamizaje de fármaco utiliza células eucarióticas establemente transformadas con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o fragmento. Fármacos son tamizados contra tales células transformadas en ensayos de enlace competitivo. Tales células ya sea en forma viable o fija, pueden emplearse para ensayos de enlace estándares. Se puede medir, como por ejemplo, la formación de complejos entre receptor y el agente que se está probando o bien examinar la disminución de la formación de complejo entre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y una linea de células apropiadas, lo que se conoce bien en la técnica. A titulo de ejemplo, véase las secciones de ejemplos 6 y 7 abajo. Los complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido descritos arriba en la sección 5.1 pueden ser utilizados de manera similar en ensayos para determinar la actividad biológica, incluyendo en un panel de receptores múltiples para tamizaje de alto rendimiento, como reactivo (incluyendo el reactivo etiquetado) en ensayos diseñados para determinar cuantitativamente los niveles de un compuesto protector de tejido, fluidos biológicos, como marcadores para tejidos en los cuales el compuesto protector de tejido correspondiente es preferentemente expresado (ya sea constitutivamente o en una etapa particular de la diferenciación tisular o desarrollo tisular o en un estado de enfermedad) y, evidentemente, para aislar ligandos correlativos . Métodos para efectuar los ensayos listados arriba son bien conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. Referencias que divulgan tales métodos, incluyen, sin limitación "molécula clocloning : clonación molécula un manual de laboratorio, segunda edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook J. E. F. Fritsch and T. Maniatis e'ds., 1989 and "Methods in Enzymology Guide to Molecular Cloning Techniques, Academia Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds . 1987. En ciertas modalidades, los ensayos de la presente invención descritos aquí pueden utilizarse para identificar un compuesto que interactúa con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Tales ensayos pueden efectuarse en ausencia de un ligando para complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. La interacción puede ser, por ejemplo, el enlace del compuesto de prueba con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. El compuesto identificado es un compuesto que produce una lectura, como por ejemplo sin limitarse" a estos ejemplos, activación del complejo de receptor para citocinas protectoras depende del tejido, transcripción de un gen reportero, plorifelación celular, o una actividad protectora de tejido. Tales ensayos se efectúan típicamente con un control, en donde el compuesto no esta en contacto con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido¾. Cuando existe una diferencia en la lectura con y sin el compuesto, el compuesto interactúa con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es identificado. Alternativamente, niveles estándares de lectura, como por ejemplo, sin limitarse a esto, actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, pueden medirse antes de poner en contacto el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con el compuesto de prueba, y la diferencia en cuanto a lectura antes y después de la adición del compuesto puede emplearse para identificar compuestos. En algunas otras modalidades, los ensayos de la presente invención pueden emplearse para identificar compuestos que modulan, la interacción entre un ligando para complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, es decir que mejoran no interfieren con dicha interacción. Tales ensayos pueden efectuarse en presencia de un ligando para complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, como por ejemplo un anticuerpo especifico para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En tales modalidades, la diferencia en el nivel de lectura en presencia o ausencia del compuesto de prueba puede detectarse. El nivel de lectura puede entones ser comparado con el nivel en ausencia de EPO. Si la diferencia en el nivel de lectura detectado con o sin el compuesto depende de la presencia de EPO, entonces se identifica un compuesto que modula la interacción de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con su ligando." Por ejemplo, si la diferencia en cuanto al nivel de lectura detectada resultad de un incremento de lectura en presencia de un compuesto, en donde el incremento depende de la presencia de EPO,. se identifica un agonista de la interacción entre el complejo de receptor para citocinas protectoras y su ligando. Alternativamente, si la diferencia en el nivel de lectura detectada resulta de la disminución de la lectura en presencia de un compuesto, en donde la disminución depende de la presencia de EPO, entonces se identifica un antagonista de la interacción entre un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y su ligando. La situación es invertida en modalidades en las cuales la lectura es una lectura negativa. Por ejemplo, una lectura puede estar presente cuando un compuesto no tiene efectos sobre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y ausente cuanto un compuesto con dicho efecto esta incorporado en el ensayo, entonces una lectura negativa puede identificar que un compuesto con el efecto deseado ha sido identificado. Cualquiera o todos estos ensayos que utilizan un complejo de rector para citocinas protectoras de tejido pueden desarrollarse en grado de reactivo con formato de kit para comercialización como productos de investigación y/o ciánicos . 5.2.1 Ensayos libres de células Los complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido: pueden utilizarse en ensayos libres de células para identificar compuestos que tienen una actividad protectora de tejido. En ciertas modalidades libres de tejido, los complejos de receptor para citocinas protectoras de tejidos pueden estar libres en solución o fijados sobre un soporte sólido. La actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede medirse de varias formas. Por ejemplo, la actividad puede ser la capacidad del compuesto para unirse con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o bien la afinidad de enlace de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un compuesto. En ciertas modalidades, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es agregado a ensayos da enlace en forma de membranas aisladas que contienen el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido.. En una modalidad, la invención ofrece un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido que comprende la puesta en contacto de un compuesto de prueba con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, mediante la medición del nivel de la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la identificación de un compuesto de prueba que incrementa o disminuye el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en comparación con el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medida en ausencia del compuesto de prueba, y ensayando el compuesto de prueba identificado en la actividad protectora de tejido. En un ensayo de enlace directo, ya sea el ligando y/o el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido entra en contacto con un compuesto de prueba en condiciones que permiten el enlace del compuesto de prueba con el ligando o el receptor. El enlace puede efectuarse en solución o en una superficie sólida. Preferentemente, el compuesto de prueba ha sido previamente marcado para su detección. Para marcado se puede utilizar cualquier compuesto detectable, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, el isótopo luminiscente, fluozescente, o radioactivo, o grupo que lo contiene, o bien un marcador no isotópico, como por ejemplo una encima o un colorante, después de un periodo de incubación suficiente para que se lleve a cabo el enlace, la reacción esta expuesta a condiciones y manipulaciones que remueven el exceso de compuestos de prueba o el ' compuesto de prueba no específicamente unido. Típicamente, esto incluye el lavado con un amortiguador apropiado. Finalmente, se detecta la presencia de un ligando unido al compuesto de prueba (por ejemplo compuestos de prueba EPO) o un compuesto de receptor para citocinas protectoras de tejido unido al compuesto de prueba . En un ensayo de enlace competitivo, compuestos de prueba son ensayados para determinar su capacidad para perturbar o mejorar el enlace del ligando (por ejemplo, EPO) con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. El ligando marcado (por ejemplo EPO o EPO carbamilada) puede mezclarse con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o fragmento del mismo, y colocado bajo opciones en las cuales ocurriría normalmente la interacción entre ellos, con o sin la adición del compuesto de prueba. La cantidad de ligando marcado (ejemplo EPO) que se une al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede compararse con la puede compararse con la cantidad unida en presencia o ausencia del compuesto de prueba. En una modalidad preferida, para facilitar la formación y detección de complejo, el ensayo de enlace se efectúa con uno o varios componentes inmovilizados en una superficie sólida. En varias modalidades, el soporte sólido podría ser, sin restringirse de estos ejemplos policarbonato, poliestireno, polipropileno, polietileno, vidrio, nitrocelulosa, dextrano, nylon, poliacrilamida, y agarosa. La configuración de soporte puede incluir perlas, membranas, micropartículas, la superficie interna de un recipiente de reacción por ejemplo, una placa de microtitulación, tubo de ensayo, un recipiente de reacción. La inmovilización de un -complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, u otro componente, puede lograrse a través de fijaciones covalentes o no covalentes. En una modalidad, la fijación puede ser indirecta, es decir, a través de un anticuerpo fijado. En otra modalidad, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y controles negativos son marcados con un epítopo, como por ejemplo, glutationa S-transferasa (GST) de tal manera que la fijación sobre la superficie sólida puede ser mediada a través de un anticuerpo comercialmente disponible como anti-GST (Santa Cruz Biotechnology) . Por ejemplo, dicho ensayo de enlace por afinidad puede efectuarse utilizando un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido el cual es inmovilizado en un soporte sólido, típicamente, el componente no movilizado lee la reacción de enlace, en este caso ya sea el ligando por ejemplo EPO o EPO carbamilada o el compuesto de prueba es marcado para permitir la detección. Varios métodos de marcado están disponibles y pueden utilizarse, por ejemplo isótopo luminiscente, cromóforo, fluorescente o radioactivo, o grupo que los contienen, y marcadores no isotópicos tales como enzimas o colorantes. En una modalidad preferida, el compuesto de prueba es marcado con un fluoróforo, como por ejemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC, disponible en Sigma Chemicals, St. Louis) . Los compuestos de prueba marcados, o ligando (por ejemplo EPO o EPO carbamilada) más compuestos de prueba, entran con el soporte sólido en condiciones que permiten un enlace específico, después de la reacción enlace, los compuestos.de prueba no unidos y no específicamente unidos son separados a través de lavado de la superficie. La fijación del socio de enlace sobre la fase sólida puede lograrse de varias formas conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, reticulación química, adhesión no específica sobre una superficie de plástico, interacción con un anticuerpo fijado sobre la fase sólida, interacción entre un ligando fijado sobre el socio de enlace (como por ejemplo biotina) y una proteina de enlace con ligando (como por ejemplo avidina , o estreptavidina) fijado sobre la fase sólida, etc. Preferentemente, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se agrega a ensayos de enlace en forma de células intactas que expresan el complejo de receptor para citocinas protectores de tejido (véase ensayos escritos en las secciones 5.2.2), o membranas aisladas que contienen el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Asi, el enlace directo con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o la capacidad de un compuesto de prueba para modular un ligando-complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido (por ejemplo EPO-complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido) puede ensayarse en células intactas en cultivo o en modelos de animales en presencia y ausencia del complejo de prueba. Un ligando marcado (por ejemplo EPO o EPO carbamilada) puede mezclarse con extractos crudos obtenidos en tales células y se puede agregar el compuesto de prueba. Membranas aisladas pueden ser utilizadas para identificar compuestos que interactúan con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Por ejemplo, en un experimento típico que utiliza membranas aisladas, células pueden ser genéticamente manipuladas para expresar el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Membranas pueden ser cosechadas por técnicas estándares y utilizadas en un ensayo de enlace consideradas in vitro . El ligando marcado (por ejemplo, EPO marcado con 12jI) es unido a las membranas y ensayados para actividades especifica; el enlace específico es determinado por comparación con ensayos de enlace efectuados en presencia de ligando (frío) marcado en exceso. El ligando soluble de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede también ser expresado recombinantemente y utilizado en ensayos no basados en célula para identificar compuestos que se unen con el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido.

Alternativamente un dominio de enlace con ligando del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido expresado recombinantemente, o un fragmento del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, puede emplearse en los ensayos de tamizaje no basados en células. En otra modalidad alternativa, péptidos que corresponden a uno o varios de los dominios de enlace del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o proteínas de fusión que contienen uno o varios de los dominios de enlace del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden utilizarse en sistemas de ensayo no basados en células con el objeto de identificar compuestos que se unen con la porción citoplásmica del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; tales compuestos pueden ser útiles para modular una vía de transducción de señales del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ensayos no basados en células, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido recombinantemente expresado es fijado sobre un sustrato sólido, como por ejemplo un tubo de ensayo, pozo de microtitulación o una columna, por medios bien conocidos en la técnica (véase Ausbel et al, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons, N.Y.). Los compuestos de prueba son después ensayados para determinar su capacidad de unirse con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Alternativamente, la reacción de enlace puede efectuarse en solución. En este ensayo, se permite al componente marcado interactuar con su(s) socio (s) de enlace en solución. Si las diferencias de tamaño entre el componente marcado y su(s) socio (s) de enlace permiten dicha separación, la separación puede lograrse mediante el hecho de pasar los productos de la reacción de enlace a través de un intrafiltro cuyos poros permiten el pasaje de componente marcado no unido pero no de su(s) socio (s) de enlace ni del componente marcado unido a su(s) socio (s). La separación puede lograrse también utilizando cualquier reactivo capaz de capturar un socio de enlace del componente marcado a partir de la solución, como por ejemplo un anticuerpo contra el socio . de enlace, una proteína de enlace con ligando que puede proteína de enlace con ligando que puede interactuar con un ligando previamente fijado sobre el socio de enlace, etc. En una modalidad, por ejemplo, una biblioteca de fagos puede ser tamizada mediante el pasaje de un fago de una biblioteca de continuo de fagos a través de una columna que contiene un complejo de receptor para citocinas protectores de tejido purificado o un fragmento o dominio del mismo, unido a una fase sólida como por ejemplo perlas de plástico. Mediante la alteración del nivel de estrictez del amortiguador de lavado, es posible enriquecer para fagos que expresan péptidos con alta afinidad para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. El fajo aislado a partir de la columna puede ser clonado y las afinidades de los péptidos cortos pueden medirse directamente. Secuencias para más que un oligonucleótido pueden ser combinadas para probar una unión con afinidad todavía más elevada para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o su complejo con su ligando. Sabiendo qué secuencias de aminoácidos proporcionan la unión más fuerte con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, se pueden utilizar modelos computarizados con el objeto de . identificar los contactos moleculares entre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y el compuesto de prueba. Esto permitirá el diseño de compuestos no proteína que imitan estos contactos. Dicho compuesto puede tener la misma actividad que el péptido y puede utilizarse terapéuticamente, con la ventaja de ser eficaz y menos costoso para producir. En otra modalidad especifica de este aspecto de la invención, el soporte sólido es unas membranas que contienen el complejo receptor para citocinas protectoras de tejido fijado sobre un plato de microtitulación . Compuestos de prueba, por ejemplo, células que expresan miembros de biblioteca, son cultivados bajo condiciones que permitan la expresión de los miembros de biblioteca en el plato de microtitulación. Se cosechan los miembros de biblioteca que se unen con la proteina (o ácido nucleico o derivado) . Tales métodos se describen, por ejemplo, en Parmley and Smith, 1988 Gene 73:305-318; Fo lkes et al., 1992 Bio Techniques 13:422-427;- PCT Publication No. WO 94/18318, y en las referencias citadas arriba. Finalmente, la etiqueta que permanece en la superficie sólida puede ser detectada a través de cualquier método de detección conocido en la técnica. Por ejemplo si el compuesto de prueba es marcado con un fluoróforo, se puede utilizar un fluorimetro para detectar complejos. Varios ensayos producidos in vitro pueden utilizarse para identificar y verificar la capacidad de un compuesto para unirse con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, para modular la interacción de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o modular la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En otra modalidad de la presente invención, interacciones entre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o ligandos (por ejemplo EPO o EPO carbamilidad) y un compuesto de prueba pueden ensayarse in vitro. Moléculas conocidas o desconocidas son ensayadas para enlace especifico con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o fragmentos del mismo bajo condiciones que llevan al enlace, y después se identifican las moléculas que se enlazan específicamente con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Los dos componentes pueden ser medidos de varias formas. Un enfoque es marcar uno de los componentes con un marcador fácilmente detectable, colocando junto con un (os) componente (s ) de prueba bajo condiciones que permiten el enlace, efectuar un paso de separación que separa el componente marcado unido del componente marcado no unido, y después medir la cantidad de componente unido . En una modalidad, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede ser marcado y agregado a un agente de prueba, utilizando condiciones que permiten el enlace. El enlace del agente de prueba puede ser determinado empleando análisis en gel de poliacrilamida con el objeto de comparar complejos formados en presencia y ausencia del agente de prueba.

Múltiples ensayos in vitro pueden efectuarse simultáneamente o secuencialmente con el objeto de evaluar el efecto de un compuesto sobre un proceso mediado por complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. La evaluación puede efectuarse mediante la medición o detección de la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, por ejemplo, en enlace de un compuesto de prueba con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, proliferación celular, diferenciación celular, y regulación ascendente de una proteina protectora, por ejemplo, globina. En una modalidad preferida, los ensayos in vitro descritos aquí se efectúan en un formato de alto rendimiento (por ejemplo en placas de microtitulación) . 5.2.2. Ensayos basados en células Un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede ser expresado en una célula cultivada, y la célula puede ser después utilizadas para tamizar ligandos -para el complejo de receptor, incluyendo el ligando natural, asi como agonistas y antagonistas del ligando natural. Para resumir el enfoque del ensayo basado en células, se combina un ADNc o gen que codifica el receptor con otros elementos genéticos requeridos para su expresión (por ejemplo un promotor de transcripción) y el vector de expresión resultante es insertado en una célula huésped. El vector que codifica un receptor para EPO o un receptor beta común puede ser sintetizado y utilizado para transfectar una célula huésped con el vector de interés para su uso en los términos de la invención. Se prefiere el uso de transformantes estados . Células que expresan ADN producen un receptor funcional, se seleccionan y se utilizan con uno de varios sistemas de tamiza e posibles, de conformidad con lo comentado a bajo. Un ejemplo de un método basado en células para identificar un compuesto que modula la interacción de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un ligando del mismo comprende los pasos siguientes: (A) poner en contacto compuestos de prueba con el ligando y una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y (b) medir el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula, de tal manera que si el nivel de actividad medido en (b) difiere del nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en ausencia del compuesto de prueba, entonces se identifica un compuesto que modula la interacción de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y su ligando. Otro ejemplo para un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora del tejido comprende la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una célula recombinantemente manipulada para expresar un receptor para EPO o un receptor beta coirún, en donde dicha célula es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos (i) esta enlazado operati amente a un promotor (ii) codifica un receptor beta común o un polipéptido de receptor para EPO, la medición y el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula, la identificación de un compuesto de prueba que incrementa o disminuye el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula en comparación con el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medido en una célula de control, en donde la célula de control es del mismo tipo de célula que a célula en contacto con el compuesto de prueba y no es transformada con un cido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) esta operativamente enlazado a un promotor, y (ii) codifica un receptor beta común o un polipéptido de receptor para EPO, y el ensayo del compuesto de prueba identificado para una actividad protectora de tejido. Alternativamente, se pueden utilizar ensayos basados en células para identificar compuestos que interactúan con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Por ejemplo, un compuesto de prueba puede entrar en contacto con una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y la actividad del complejo receptor para citocinas protectoras de tejido, de conformidad con lo medido con afinidad de enlace, proliferación celular, o la presencia de un transcriptor de gen reportero, puede determinarse. Si la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido difiere, por ejemplo incrementado o disminuir en comparación con la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en ausencia del compuesto de prueba, entonces se identifica un compuesto que interactúa con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de la invención descritas arriba en donde se mide la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras- de tejido, dicha actividad se mide por proliferación celular o diferenciación celular. En ciertas modalidades de los métodos de la invención, descritas arriba, en donde se mide la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, dicha actividad medida es la capacidad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido para interactuar con un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido . Ensayos de tamizaje basados en células son útiles para detectar ligandos tanto agonistas como antagonistas. Los agonistas (incluyendo el ligando natural) y los antagonistas tienen un potencial enorme en aplicaciones 'tanto in vitro como, in vivo. Compuestos identificados como agonistas para receptores son útiles para estimular la proliferación y desarrollo de células blanco in vitro e in vivo. Por ejemplo, compuestos agonistas son útiles como componentes de medio de cultivo celular definido y pueden también emplearse solo en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que es comúnmente utilizado de cultivo de células. Agonistas pueden ser útiles para promover específicamente el crecimiento y/o desarrollo de células que responden a EPO (incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, células nerviosas, células cardíacas y células derivadas de la retina) en cultivo. Antagonismos inútiles como reactivos de investigación para caracterizar sitios de interacción ligando-receptor in vivo, agonistas o antagonistas de receptores pueden encontrar aplicación en un tratamiento de enfermedades neurales, cardíacas y/o retínales. Varios ensayos adecuados son conocidos en la técnica. Estos ensayos pueden basarse en la detección de una respuesta biológica en una célula blanco. En una modalidad, el enlace de ligando (por ejemplo EPO o EPO carbamilado) con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede ser ensayado en células intactas en modelos de animales. Un ligando marcado (EPO o EPO carbamilada) puede ser administrado directamente a un animal con o sin un compuesto de prueba. Un efecto corriente abajo del ligando (por ejemplo EPO o EPO carbamilada) que une el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, por ejemplo, protección de tejido o proliferación celular, puede medirse en presencia o ausencia del compuesto de prueba. Para estos ensayos, células huéspedes a las cuales se agrega el compuesto de prueba pueden ser genéticamente manipuladas para expresar el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y/o ligando (por ejemplo EPO o EPO carbamilada) , que puede ser transitorio, inducido, o constitutivo, o estable. Para los propósitos de los métodos de tamizaje de la presente invención, se puede utilizar una amplia gama de células huéspedes, incluyendo sin limitarse a estos ejemplos, células de cultivo tisular, células de mamífero, y células de levadura. Células de mamífero, tales como células cerebrales u otras células que expresan el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden ser un tipo de células preferidas para llevar a cabo los ensayos de la presente invención. 5.2.2.1. Células En una modalidad preferida, la célula utilizada en los métodos de la presente invención es una célula de mamífero. En una modalidad más preferida, la célula huésped es una célula humana. En otra modalidad las células huéspedes son células primarias aisladas de un tejido u otra muestra biológica de interés. Una persona con conocimientos en la materia se dará cuenta que diferentes tipos de células pueden emplearse en los métodos de la invención para tamizar o identificar compuestos. Dos tipos de células que se utilizan pueden expresar en forma endógena un receptor para EPO, un receptor beta común, tanto un receptor para EPO como un receptor beta común, ni un receptor para EPO ni un receptor beta común. En una modalidad preferida, la célula huésped es derivada de un tejido excitable. En un modalidad preferida, la célula huésped es derivad de un tejido neuronal excitable. A titulo de ejemplo no limitativos, células excitables o células que responden pueden ser células o tejidos neuoronales, retínales, musculares, cardíacos, pulmonares, hepáticos, renales, de intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, endoteliales capilares, de testículos, de ovarios, de páncreas, de hueso, de piel, o células protegidas endometriales . Ejemplos adicionales no limitativos de células excitables o que responden incluyen células de fotorreceptores (varillas y conos) , células de gangliones, células bipolares, horizontales, amadrinas de Muller de Purkinje, del miocardio, del marcapaso, de nodos, de nodo sinusal, de tejido de. unión, de nodo atrioventricular, de fascículo de his, hepatocitos, células esteladas, células de kupffer, células meságicas, células intersticiales tubulares, células de goblet, células de glándulas intestinales (criptas) , células endocrinas entéricas, clomelulosa, fasciculadas, reticulares, cromafina, terisita, sertoli, esperma, folículo graciano, folículo primordial, isletas de langerhans, células alfa, células beta, células gamma, células F, osteoprogenitol, osteoplastas, osteoglastos, estroma endometrial, células endometriales, madres y endoteliales . Células mamífero adecuadas para su uso en la expresión del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y la transducción de una señal medida por receptor incluyen células que expresan al menos una de las unidades de receptor utilizadas para formar el complejo de receptor protector de tejido funcional. Estas sub-unidades pueden incluir las sub-unidades de los receptores de citocinas clase I. en ciertas modalidades de la invención, es también preferible utilizar célula de la misma especie que el receptor a expresar. Dentro de una modalidad preferida, la célula depende de un factor de crecimiento hematopoyético suministrado en forma exógena para su proliferación. En ciertas modalidades preferidas, las líneas de células de este tipo son la línea de células TF-1 de ser humano (ATCC número CR1-2003) y la línea de célula AML-193 (número ATCC CRL-9589) , que son líneas de células de leucemia humanas dependientes de GM-CSF. En una modalidad alternativa células huéspedes alentadas pueden ser manipuladas para producir la subunidad de receptor necesaria de células de murina BaF3 (Palacios and Steinmetz, 1985, Cell 41:727-734; Mat ey-Prevot et al., 1986, Mol. Cell. Biol 6:4133-4135) o una línea de células de riñon de hámster bebe (BHK) puede ser transfectadas para expresar el receptor EPO-R y betac necesario. Este último enfoque es provechoso puesto que todas las líneas de célula son manipuladas para expresar sub-unidades de receptor a partir de cualquier especie, superando por consiguiente las limitaciones potenciales que puedan surgir de especificidad de especie. En forma alternativa, ortólogos de especie del cDNA del receptor humano pueden ser clonados y utilizados dentro de línea de células de la misma especie, como por ejemplo ADNc de ratón en la línea de células BaF3. líneas de' células dependientes de un factor de crecimiento ematopellético, como por ejemplo GM-CSF, pueden por consiguiente ser manipuladas para volverse dependiente de un ligando del complejo de receptor protector de tejido. De manera similar, se observará por parte de una persona con conocimientos ordinarios en la materia que el ensayo arriba puede efectuarse en otras líneas de células que pueden ser transformadas de manera similar. Además, ensayos de proliferación celular pueden ser efectuados en células conocidas por alojar tanto receptores para EPO como receptores ß0. Tales células ' incluirían preferentemente líneas de células neuronales que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, P-19, PC-12 y astrocitos y otras lineas de células conocidas por responder a EPO incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, células retínales y células cardiacas. La presencia tanto de receptores para EPO como de receptores ße en estas líneas de células puede ser confirmada empleando métodos de inmunoprecipitación bien conocido por parte de las personas con conocimientos en la materia. Otras células huéspedes que pueden utilizarse para producir recombinantemente. complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o que pueden utilizarse en unos métodos de tamizaje de la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, hibridomas, células pre-B, células 293, células 293T, células HeLa, células HepG2, células K562, Células 3T3. En una modalidad preferida, las células huéspedes son líneas de células inmortalizadas derivadas de una fuente, por ejemplo un tejido. Otras células que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, células de levadura, células infectadas por virus, células bacterianas, células de insecto, o células vegetales. Células huéspedes de mamífero preferidos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, las células derivadas de seres humanos, monos y roedores (véase, por ejemplo, Kriegler M. en "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual", New York, Freeman & Co. 1990), tales como línea de células de • riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, No. de Acceso ATCC CRL 1651) ; líneas de células de riñon embriónico de ser humano (293, 293-EBNA, o células 293 succionadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59; células de riñon de hámster bebé (BHK, No. de Acceso ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. 77; 4216); células de sertoli de ratón (Mather, Biol. Reprod. 23:243-251); células de fibroblasto de ratón (NIH- 3T3) , células de riñon de ratón (CVI ATCC No. de Acceso CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC No. de Acceso ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, No. de Acceso ATCC CCL 2); células de riñon de canino (MDCK, No. de Acceso ATCC CCL 34); células de hígado de rata (BRL 3A, No. de Acceso ATCC CRL 1442); células de pulmón de ser humano (W138, No. de Acceso ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (M T 060562, No. de Acceso ATCC CCL 51) . Células de mamífero cultivadas adecuadas incluyen las líneas de células COS-1 (ATCC No. CRL 1650), BHK (ATCC No. CRL 1632), y BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Líneas de células adecuadas adicionales se conocen en la técnica y están disponibles a partir de organismos de depósitos públicos tales como el American Type Culture Collection, Manassas, Va. Otros sistemas huésped eucariótico-vector útiles pueden incluir sistemas de levadura e insecto. En levadura, numerosos vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles pueden ser utilizados con Saccharomyces cerevisiae (levadura de hornear) , Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisión) , Pichia pastoris, y Hansenula polymorpha (levaduras metilotrópicas) . Para una reseña véase, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Green Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Capitulo 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds . u & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, páginas 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C. Capitulo 3; y Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, páginas 673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols . I y II. Células fúngales, incluyendo células de levadura, y particularmente células del género Saccharomyces, pueden también utilizarse dentro del marco de la presente invención, como por ejemplo para producir polipéptidos de receptor, fragmentos de receptor, fusiones de polipéptidos, o complejos y para ensayos basados en células para identificar compuestos que modulan la actividad de citocinas protectoras de tejido. Métodos para transformar células de levadura con ADN exógeno y para producir polipéptidos recombinantes a partir de ahí se divulgan, por ejemplo, en Ka asaki, Patente Norteamericana No. 4,599,311, Kawasaki et al., Patente Norteamericana No. 4,931,373, Brake, Patente Norteamericana No. 4,870,008; Welch et al., Patente Norteamericana No. 5,037,743; y Murray et al., Patente Norteamericana No. 4,845,075. Células transformadas con seleccionadas por fenotipo determinado por el marcador seleccionable, habitualmente resistencia a fármaco o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vector preferido para su uso en levadura es el sistema de vector POTl divulgado por Kawasaki et al. (Patente Norteamericana No. 4,931,373), que permite seleccionar células transformadas mediante crecimiento en medios que contienen glucosa. Promotores y terminadores adecuados para uso en levadura incluyen los promotores y terminadores provenientes de genes de enzima glicolitica (véase, por ejemplo, Kawasaki, Patente Norteamericana No. 4,599,311; Kingsman et al., Patente Norteamericana No. 4,615,974; y Bitter, Patente Norteamericana No. 4,977,092) asi como genes de alcohol deshidrogenasa. Véase también las Patentes Norteamericanas Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosacch romyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastorisr Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa están también disponibles para su uso dentro del marco de la presente invención (Véase, por ejemplo, Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, y Cregg, Patente Norteamericana No. 4,882,279). Células de Aspergillus pueden utilizarse de conformidad con los métodos de McKnight et al., Patente Norteamericana No. 4,935,349. Métodos para transformar Acremonium chrysogenum son divulgados por Sumino et al., Patente Norteamericana No. 5,162,228. Métodos para transformar Neurospora son divulgados por Lambowitz, Patente Norteamericana No. 4,486,533. Métodos estándares para introducir una secuencia de ácidos nucleicos de interés en las células huéspedes pueden utilizarse. La transformación puede efectuarse a través de cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, envolver el polinucleótido en un virus y transducir una célula huésped con el virus y mediante absorción directa del polinucleótidos. El procedimiento de transformación utilizado dependen del huésped a transformar. Transformaciones de células de mamífero (es decir, transfecciones) por absorción directa pueden efectuarse utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham & Van der Eb, 1978, Virol. 52:546, o las varias modificaciones conocidas del mismo. Otrcs métodos para introducir polinucleótidos recomoinantes en células, particularmente en células de mamífero, incluyen transfección mediada por dextrano, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del (de los) polinucleótido (s) en liposomas, así como microinyección directa de los polinucleótidos en núcleos. Tales métodos son bien conocidos por parte de una persona con conocimientos en la materia. Células huéspedes adecuadas con los tipos de células que pueden ser transformadas o transfectadas con ADN exógeno que crece en cultivo, e incluyen células- fúngales, 'así como células eucarióticas superiores cultivadas. Células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares se prefieren. Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en varias células huéspedes son divulgadas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, y Ausubel et al., eds . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. Células huéspedes transformadas o transfectadas son cultivadas de conformidad con procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células huéspedes seleccionadas. Varios medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, son conocidos en la técnica e incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios pueden contener también componentes tales como factores de crecimiento o suero, según lo requerido . Células de mamífero cultivadas son huéspedes preferidos dentro del marco de la presente invención. Métodos para introducir ADN exógeno en células huéspedes de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro y Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603: Graham and Van der Eb, 1973, Virology 52:456), electroporación (Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845), transfección mediada por dextrano-DE7AE (Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), y transfección mediada por liposoma (Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15:73/ Ciccarone et al., 1993, Focus 15:80). La producción de polipéptidos recombinantes, incluyendo polipéptidos componentes del complejo de receptor de la invención en células de mamífero cultivadas es divulgada, por ejemplo, por Levinson et al., Patente Norteamericana No. 4,713,339; Hagen et al., Patente Norteamericana No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente Norteamericana No. 4,579,821; y Ringold, Patente Norteamericana No. 4,656,134. En general, se prefieren promotores de transcripción fuertes, tales como los promotores de SV-40 o citomegalovirus . (Véase, por ejemplo Patente Norteamericana No. 4,956,288). Otros promotores adecuados incluyen los provenientes de genes de metalotioneina (Patentes Norteamericanas Nos.' 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío mayor de adenovirus. El medio de crecimiento seleccionará generalmente células que contienen el ADN agregado exogenamente mediante, por ejemplo, selección de fármaco o deficiencia en un nutriente esencial complementado por el marcador seleccionable llevado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula huésped. En una modalidad preferida, líneas de células estables que contienen los constructos de interés son generadas para tamizaje de alto rendimiento. Tales líneas de células estables pueden ser generadas mediante la introducción de un constructo que comprende un marcador seleccionable, permitiendo que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y cultivada después las células en un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinantes confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar foci que a su vez pueden? ser clonados y expandidos en líneas de células.

La selección farmacológica se efectúa generalmente para seleccionar células de mamíferos cultivadas en las cuales se ha insertado un ADN foráneo. Tales células se conocen comúnmente como "transfectantes" . Células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y pueden pasar el gen de interés a su progenie se conocen como "transfectantes estables". Numerosos sistemas de selección pueden utilizarse, incluyendo los ejemplos siguientes pero sin limitarse a ellos: Los genes de timidina quinasa de virus de herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Nat . Acad. Sci. EUA 48:2026), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy -et al., 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk, hgprt ó aprt, respectivamente. Asimismo, la resistencia anti-metabolito puede ser empleada como la base para la selección para dhfr, que proporciona resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Nati. Acad. Sci. EUA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); y hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección puede efectuarse en presencia de un fármaco de tipo neomicina, como por ejemplo G-418 o similar. Sistemas de selección pueden también ser utilizados para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso conocido como "amplificación". La amplificación se efectúa cultivando transíectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo e incrementando después la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que producen niveles elevados de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que proporciona resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia al fármaco (por ejemplo, resistencia a fármacos múltiples, puromicina acetiltransferasa) puede también utilizarse. En ciertas modalidades, BaF3, una linea de células pre-B dependiente de interleucina-3 que posee el receptor ß0 puede ser transfectada con EPO-R recombinante . La presencia de EPO-R puede seleccionarse entonces por resistencia a compuestos tales como zeocina (a 2 mg/ml) y puromicina (a 2 g ml) . 5.2.2.2 Ensayo de Células BaF3 Ensayos de células BaF3 pueden también ser utilizados para identificar compuestos que modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Por ejemplo, un ensayo para probar la proliferación de células BaF3 a través de señalización a través del complejo de receptor puede efectuarse de la manera siguiente. En una placa de 96 pozos, ocho diluciones en serie 1:2 de medio de crecimiento solo (RPMI 1640, suero fetal de bovino al 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM) , y la pequeña molécula, compuestos biológicos o químicos de interés. El volumen final de cada dilución debe ser de aproximadamente 100 µ?. La línea parental BaF3 y las células BaF3 transfectadas con EPO-R pueden ser lavadas después tres veces en medio de cultivo (véase arriba) , pellas pueden ser re-suspendidas en medio de crecimiento, y las células pueden ser contadas y diluidas en medio de crecimiento a 5,000· células/100 µ?. Cien microlitros de células diluidas pueden agregarse después a cada dilución de muestras. La placa de ensayo puede ser entonces incubada en un incubador a 37 °C durante 3 a 4 días. Se puede agregar una alícuota de 20 µ? de Alomar azul a cada pozo y la placa es incubada durante la noche a 3 °C. Las placas son leídas en el lector de placa fluorescente a longitud de onda de excitación de 544 y longitud de onda de emisión de 590. Si el compuesto presenta una capacidad de protección de tejido, las células BaF3 deberían proliferar cuando están expuestas a la pequeña molécula, el compuesto biológico o químico de interés.

Un ligando natural para el complejo de receptor protector de tejido puede también ser identificado mediante la utilización de mutagénesis o una línea de células que expresan el complejo, de .receptor y cultivándola en condiciones que seleccionan un crecimiento autocrino. (véase publicación WIPO O 95/21930) . Dentro de un procedimiento tipico, células BaF3 que expresan complejo de receptor protector de tejido y las subunidades adicionales necesarias son sometidas a mutagénesis, como por ejemplo 2-etilmetanesulfonato (EMS) . Se permite después la recuperación de las células en presencia de IL-3, después estas células son transferidas a un medio de cultivo al cual le falta IL-3 e IL-4. Las células sobrevivientes son tamizada para una producción de un ligando de complejo de receptor protector de tejido, como por ejemplo mediante la adición de receptor soluble al medio de cultivo o mediante el ensayo del medio acondicionado en células BaF3 de tipo silvestre y células BaF3 que expresan el receptor. 5.2.2.3 Ensayos de Gen Reportero En ciertas modalidades de la invención, células manipuladas adicionalmente para expresar un gen reportero son utilizadas en ensayos para identificar compuestos con actividades protectoras de tejido. El gen reportero está enlazado a un elemento de promotor responsable de la vía enlazada a receptor, y el ensayo detecta la activación de trascripción del gen reportero.

Por ejemplo, un ensayo de gen reportero consistente con los métodos de la invención puede incluir el hecho de probar un compuesto para la modulación de la actividad de un complejo de receptor para situaciones protectoras de tejido, en donde el complejo activado resulta en la producción de un factor de transcripción en las células huésped. Las células huésped comprende también un elemento promotor de . SER enlazado prácticamente a un gen reportero de luciferasa cuya expresión es regulada por el activador transcripcional, de tal manera que el producto de gen luciferasa es activado o desactivado (es decir, presente o ausente, o presente en cantidades diferentes) en la célula en respuesta a la presencia de un compuesto que activa el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. La invención ofrece además un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido, que comprende la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, en donde dicha célula es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen reportero enlazado operativamente a un elemento de regulación asociado con una actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la identificación en un complejo de prueba que incrementa o disminuye el nivel de expresión de gen reportero según el nivel de expresión de gen reportero que se mide en ausencia del compuesto de prueba, y el ensayo de un compuesto de prueba identificado para una actividad protectora de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de la invención, el elemento regulador es un elemento de respuesta sérica. La invención ofrece además un método para identificar el compuesto que modula una actividad protectora de tejido, que comprende la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una célula que comprende, (i) un ácido nucleico que comprende un gen reportero enlazado operativamente a un sitio de enlace especifico para un dominio de enlace de ADN de un activador transcripcional, (ii) una primera proteina de fusión que comprende (A) en el dominio de -enlace con ADN del activador transcripcional y (B) un primer polipéptido de receptor para citocinas protectoras de tejidos con un fragmento del mismo, y (iii) una segunda proteína de fusión que comprende (A) un dominio de activación del activador transcripcional y (B) un segundo receptor para citocinas protectoras de tejido, la detección de la expresión de gen reportero, de tal manera que si la expresión del gen reportero detectada en presencia del compuesto de prueba difiere en comparación con la expresión del gen reportero detectada en ausencia del compuesto de prueba, se identifica un compuesto que modula una actividad protectora de tejido. Cualquier gen reportero bien conocido de una persona con experiencia en la materia puede ser utilizado en constructos de gen reportero para determinar el efecto de un compuesto sobre procesos mediados por citocinas protectoras de tejido o regulación ascendente de globulinas protectoras. Un elemento promotor preferido en cuanto a ese aspecto es un elemento de respuesta sérica, SER (véase como por ejemplo, al., 1989, Cell 56:563-572,). Una forma preferida de dicho gen reportero es un gen de luciferasa (por ejemplo luciferasa de luciérnaga, luciferasa de renilla, y luciferasa de escarabajo) (de Wet et.al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:725,). La expresión del gen de luciferasa es detectada por luminiscencia utilizando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo Baumgartner et. al. 1994, J. Bibl. Chem. 269: 29094-29101; Schenborn and Goiffin, 1993, Promega Notes 41:11). Kits de ensayo de actividades de luciferasa están disponibles en el comercio por ejemplo Promega Corp., Madison, .Wis. Lineas de células blanco de ese tipo pueden crearse para organizar bibliotecas de químicos, medios de cultivo acondicionados para células,, caldos fúngales, muestra de suelo, muestra de agua y similares. Por ejemplo, un banco de muestras de medio acondicionado para células puede ensayarse en una célula blanco con el objeto de identificar células que producen ligandos. Células positivas son después utilizadas para producir una biblioteca de cADN en una expresión vector de mamífero, lo cual está dividido en grupos, transfectadas en células huésped, y expresado. Muestras del medio de las células transfectadas son después ensayadas, con división subsiguiente de grupos, re-trasfección, subcultivo y reensayo de · células positivas para aislar cADN clonado que codifica el ligando. Ejemplos de genes reporteros incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, proteínas fluorescentes (por ejemplo proteína fluorescente verde ("GFP") proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente cian y proteína fluorescente azul) , beta-galactosida ("beta-gal") . beta-glucoronidasa, beta-lactamasa crorofenicol acetiltransferasa ("CAT") , fosfatos alcalinos secretados ("SEAP") , peroxídasa de rondano agrio"' ("HRP") y fosfatasa alcalina (SVAP") . Alternativamente, un gen reportero puede también ser una etiqueta de proteína, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, myc, His, FLAG, o GST, de tal manera que la supresión de aguerraciones producirán el péptido y la proteína podrá ser monitoreada por un ensayo ELISA, un ensayo western, o cualquier otro mini-ensayo para detectar la etiqueta de proteína. Tales métodos también conocidos por las personas con conocimientos en la materia. Los métodos de aprendizaje de la presente invención abarcan también el grupo de otros genes reporteros. Genes reporteros pueden ser obtenidos y la secuencia de nucleótidos de los elementos puede ser determinada por cualquier método bien conocido por parte de una persona con conocimientos en la materia. La secuencia de un nucleótido de un gen reportero puede ser obtenida, por ejemplo, a partir de la literatura o de una. base de datos como por ejemplo GenBank. Alternativamente, el polinucleótido que modifica un gen reportero puede ser generado a partir de ácido nucleico proveniente de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un gen reportero particular no está disponible, pero si se conoce la secuencia del gen reportero, un ácido nucleico que codifica un gen reportero puede ser químicamente sintetizado u obtenido a. partir de una fuente adecuada (por ejemplo una biblioteca de cADN o una biblioteca de cADN generada a partir de ácido nucleico preferentemente poli A + ARN, aislado de cualquier tejido con células expresamente de gen reportero) con amplificación o reacción en cadena de polimeraza (PCR) . Una vez determinada la secuencia de nucleótidos de un gen reportero, la secuencia de nucleótidos del gen reportero puede ser manipulada empleando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigidas por sitio, reacción- en cadena polimerancia etc. PCR como por ejemplo las técnicas descritas en Sambrook et. al., 1990, según la edición, y Ausebel et. al., eds . , 1998, que se incorporan aquí por referencia en sus totalidades) , para generar genes reporteros que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, como por ejemplo, para crear sustituciones de deleciones, y/o inserciones de aminoácidos. En ciertas modalidades, los ensayos de gen reportero descritas arriba pueden ser efectuados en ausencia de un dial de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En tales modalidades, el complejo de prueba identificado es un compuesto que interactúa con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas otras modalidades, los ensayos de gen reportero descritas arriba pueden efectuarse en presencia de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, como por ejemplo EPO. En tales modalidades, la diferencia en cuanto al nivel de transcripción del gen reportero ' en presencia y ausencia del compuesto de prueba puede detectarse. El nivel de transcripto puede entonces compararse con el nivel obtenido en ausencia de EPO. Si la diferencia en el nivel de transcriptor detectada con y sin el compuesto depende de la presencia de EPO, entonces se identifica un compuesto que no dura a la interacción de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y EPO. Por ejemplo, la diferencia del nivel de transcriptor detectado se eleva en presencia de un compuesto, en donde el instrumento depende de la presencia del compuesto de prueba entonces se identifica un agonista de la interacción de EPO en un compuesto de receptor para citocinas protectoras de tejido. 5.2.2.4 Ensayos de dos Híbridos de levadura. El sistema de "dos Híbridos" puede utilizarse para detectar interacciones proteína-proteína en la levadura Saccharomyces cerevisiae (Field and Song, 1989, Nature 340:245-246/ Patente americana número 5,283,173 por Field and Song). Debido al hecho que las interacciones son tamizadas en levadura, las interacciones de proteínas intermoleculares detectadas en ese sistema ocurren bajo condiciones fisiológicas que imitan las condiciones de las células de mamíferos (Chien et. al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88:9578-9581) .Este ensayo utiliza la reconstitución de un activador transcripcional como GAL4 (Johnston, 1987, Microbiol.- Rev.51 : 458/-476) a través de la interacción de dos dominios de proteínas que han sido fusionados sobre las dos unidades funcionales de un activador transcripcional, el dominio de enlace de ADN y el dominio de activación. Esto es posible debido a la naturaleza en dos partes de ciertos factores de trascripción tales como GAL . El hecho de ser caracterizado como en dos partes significa que las funciones de enlace de ADN y activación se encuentran en dominios separados y pueden funcionar en trans (keegan et. al., 1986, Science 231:699-704). La reconstitución del activador transcripcional es monitoreado con la activación de un gen reportero, por ejemplo, el gen lacZ, que se encuentra bajo el control de un producto que contiene un sito de enlace (Secuencia Activación Corriente arriba o UAS por sus siglas en inglés) para el dominio de enlace de ADN del activador transcripcional. Este método se utiliza comúnmente ya sea para detectar una interacción entre dos proteínas . conocidas (Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246) o para identificar proteínas que interactúan a partir de la formación .que se uniría a una proteína conocida (Durfee et. ai., 1993, Cell 75:791-803; Harper et. al., 1993 Cell 75:805-816; Vojtek et. al . , 1993, Cell 74:205-214). Variaciones con relación a los métodos descritos aquí para ensayos de dos Híbridos de levadura y otros métodos para ensayos de dos híbridos de levadura son bien conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia y pueden utilizarse en los métodos de tamizaje de la presente invención. La identificación de proteínas de interacción a través- del sistema mejorado de dos híbridos de levadura se basa en la detección de la expresión de un gen reportero cuya trascripción depende de la reconstitución de un regulador transcripcional por la interacción de dos proteínas, cada una fusionada sobre una mitad del regulador transcripcional. Las proteínas "carnada" (es decir, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido de la presente invención o derivados o análogos de los mismos) y "presa" (proteínas a probar en cuanto a su capacidad para interactuar con una carnada) Se expresa con una proteína de fusión con un dominio de ADN y con un dominio regulador de trascripción, respectivamente o viceversa. En una modalidad específica, expresiones biológicas recombinantes que expresan péptidos aleatorios pueden emplearse como la fuente de ácidos nucleicos "presas". En general proteínas de las poblaciones "carnadas" y "presas" se proporcionan como proteínas de fusión (quiméricas) (preferentemente por expresión recombinante de la secuencia codificadora quimérica) que comprenden cada proteína contigua a una secuencia preseleccionada . Para una formación de secuencia preseleccionada es un dominio de enlace con ADN. El enlace con ADN puede ser cualquier dominio de enlace con ADN, en la medida que reconoce específicamente una secuencia de ' ADN dentro del promotor. Por ejemplo el dominio de enlace con ADN es de un activador o inhibidor transcripcional . Para otra población, la secuencia preseleccionada es un dominio activador o inhibidor de un activador o inhibidor transcripcional, respectivamente. El dominio regulador solo (no como fusión sobre una secuencia de proteínas) y el dominio de unión ADN solo (no como fusión sobre una secuencia de proteínas) preferentemente no interactúan detectablemente (para evitar positivos falsos en el ensayo) . El sistema de ensayo incluya además un gen reportero enlazado operativamente con un promotor que contiene un sitio de enlace para el dominio de enlace y ADN del activador transcripcional (o inhibidor) . Por consiguiente, en el presente método de la presente invención, el enlace de una proteina de fusión de complejo de receptor' con citocinas protectoras de tejido con la proteina de fusión "presa" provoca la reconstitución de un activador transcripcional (o inhibidor) que activa (o inhibe) la expresión del gen reportero. La activación (o inhibición) de transcripción del gen reportero ocurre intracelularmente como por ejemplo, en células procarióticas o eucariótícas, preferentemente en cultivo celular. El promotor enlazado operativamente a la secuencia de nucleótidos de gen reportero puede ser -un promotor nativo o no nativo de la secuencia de nucleótidos, y el sitio (s) de enlace con ADN reconocidos por la porción de dominio de enlace con ADN de la proteina de fusión puede (n) ser nativo (s) para el promotor (si el promotor contiene realmente dicho (s) sitio (s) de enlace o no nativo (s) para el promotor. Alternativamente el sitio de enlace de activación transcripcional del (los) gen (es) deseado (s) puede seleccionarse y ser remplazado con sitios de enlace GAL4 (Bartel et. al., 1993, BioTechniques 14:920-924, Chascan et.al., 1989, Mol. Cell. Biol . 9:4746-4749). En dominio de activación y el dominio de enlace con ADN utilizados en el ensayo pueden ser de una amplia gama de proteínas de activadotes transcripcionales en la medida que estos activadores transcripcionales tienen dominios de enlace y activación transcripcional separables. Por ejemplo, la proteína GAL4 de S cerevisiae (Ma et. al., 1987, Cell 48:847-853), la proteína GCN4 de S cerevisiae (Hope & Struhl, 1986, Cell 46:885-894) y la proteína ARDI de S cerevisiae (Thukral et. al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2360-2369), y el receptor de estrógeno humano (Kumar et. al., 1987, Cell 51:941-951), tienen dominios de enlace con ADN y . activación separables. El dominio de enlace con ADN y el dominio de activación que se emplean en las proteínas de fusión no tienen que provenir del mismo activador transcripcional. En una modalidad específica, se emplea un dominio de enlace con ADN de GAL4 o LEXA. En otra modalidad específica, se emplea un medio de activación VP16 de virus de herpes simplex o GAL4 (Triezenberg et. al., 1988, Genes Dev. 2:730-742) en la modalidad específica, los aminoácidos 1-147 de GAL4 (Ma et. al., 1987, Cell 48:847-853; Ptashne et. al., 1990, Nature 346:329-331) que forman el dominio de enlace con ADN y los aminoácidos 411-455 de VP16 (Triezeberg et. al., 1988, Genes Dev. 2:730-742; Cress et. al., 1991, Science 251:87-90) forman el dominio de activación. En una modalidad específica, plásmidos que codifican las diferentes poblaciones de proteínas de fusión puede ser introducidos simultáneamente en una célula huésped (por e emplo una célula de levadura haploide) que contienen una o varios genes reporteros, con co-transformación para llevar a cabo el ensayo para interacciones proteina-proteina . 0 preferentemente, las dos proteínas de fusión son producidas en una sola célula ya sea por cruzamiento (en el caso de células de levadura o fusiones de células, por ejemplo, de células de mamíferos) . El ensayo de tipo cruzamiento, la conjugación de células de levadura haploides de tipo de cruzamiento opuesto que han sido transformado con un conjunto de expresión de fusión de dominio de enlaces (preferentemente un plásmido) y un conjunto de expresión de fusión de dominio de activación (o inhibidor) (preferentemente un plásmido) , respectivamente, proporcionarán ambos conjuntos en la misma célula diploide. El tipo de cruzamiento de una cepa de levadura puede ser manipulada mediante transformación con el gen HO (Herskwitz and Jensen, 1991, Meth Enzymol. 194:132-146) . En la modalidad preferida, el ensayo de cruzamiento por interacción de levadura se emplea utilizando dos tipos de células huéspedes, tipo de cepa a y oc de levaduras Saccharomyces cerevisiae . La . célula huésped contiene preferentemente al menos dos genes reporteros, cada uno con uno o varios sitios de enlace para el dominio de enlace con ADN (por ejemplo, un activador transcripcional) . El dominio de activador y el dominio de enlace con ADN son cado una partes de proteínas quiméricas formadas por las dos poblaciones respectivas de proteínas. Una cepa de células huéspedes como por ejemplo la cepa "a" contiene fusiones de la biblioteca de secuencias de nucleótidos con el dominio de enlace con ADN de un activador transcripcional, como por ejemplo GAL4. Las proteínas híbridas expresadas en este grupo de células huéspedes pueden reconocer el sitio 4de enlace con ADN en la región promotora o realzadora en el conjunto de gen reportero. El segundo conjunto de células huéspedes de levadura, como por ejemplo, la cepa a, contiene secuencias de nucleótidos que codifican fusiones de la biblioteca de secuencias de ADN fusionadas con el dominio de activación de un activador transcripcional. En una modalidad específica, la presente invención ofrece un método para detectar una o varias interacciones proteína-proteína que comprenden (a) la expresión recombinante en la primera población de células de levadura que es de un primer tipo de cruzamiento una primera proteína de fusión que contiene la secuencia de un complejo de receptor ¦ para citocinas protectoras de tejido o un fragmento del mismo y un dominio de enlace con ADN, en donde dicha primera población de células de levadura contiene una primera secuencia de nucleótidos enlazado operativamente a un promotor impulsado por uno o varios sitios de enlace con ADN reconocidos por un dominio de enlace con ADN de tal manera que una interacción de dicha primera proteina de fusión .con la segunda proteina de fusión, dicha segunda proteina de fusión que comprende el dominio de activación transcripcional, resulta en una transcripción incrementada de dicha primera secuencia de nucleótidos; (b) seleccionar negativamente para iluminar las células de levadura en dicha primera población en donde dicho transcriptor incrementado de dicha primera secuencia de nucleótidos ocurre en ausencia de dicho segundo proteina de fusión; (c) expresar recombinantemente en una segunda población de células de levadura de un segundo tipo de cruzamiento diferente del primer tipo de cruzamiento, varias dichas segundas proteínas de fusión cada segunda proteina de fusión conteniendo una secuencia de " un . fragmento, como derivado análogo de una proteína y un dominio de activación de un activador transcripcional, en donde el dominio de activación es el mismo en cada un de dichas segundas proteínas de fusión; (d) cruzar dicha primera población de células de levadura con dicha segunda población de células de levadura para formar una tercera población de células de levadura diploides, en donde dicha tercera población de células de levadura diploides contiene una segunda secuencia de nucleótidos enlazados operativamente a un promotor impulsado por un sitio de enlace con ADN reconocido por dicho dominio de enlace con ADN de tal manera que una interacción de dicha primera proteína de fusión con dicha segunda proteina de fusión resulte en la transcripción incrementada de dicha segunda secuencia de nucleótidos, en donde la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos pueden ser iguales o diferentes; (e) detectar dicha transcripción incrementada de dicha primera y/o segunda secuencia de nucleótidos, detectando por consiguiente una interacción entre dicha primera proteina de fusión y dicha segunda proteina de fusión. En la modalidad, la invención ofrece un método para identificar un compuesto que regule la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, dicho método comprende la puesta en contacto con un compuesto de prueba con una célula de una cepa de levadura modificada que contiene (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un gen reportero el cual está enlazado operativamente a un promotor que responde al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido (ii) expresan un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, y la determinación del nivel de actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido durante la medición del nivel de expresión de gene reportero de tal manera que si el nivel de actividad de gen reportero en presencia del compuesto se eleva o disminuye con relación al nivel de actividad de gen reportero en la ausencia del compuesto, entonces se identifica un compuesto que modula la actividad de un complejo receptor para citocinas protectoras de tejido. Los complejos de receptor pueden ser utilizados en ensayos de atrapamiento por interacción (como por ejemplo de conformidad con lo descrito en Gyuris et. al., 1993, Cell 75:791-803) para identificar proteínas que se unen a una proteína conocida y para identificar inhibidores en la interacción de enlace. Ese sistema es un sistema de dos híbridos modificado, de conformidad con lo descrito arriba, que emplea un gen reportero LEU2 como la primera secuencia de nucleótidos y un gen reportero lacZ como la segunda secuencia de nucleótidos, de tal manera que las interacciones proteína-proteína que resulten en la reconstitución del sistema de activado transcripcional puedan seleccionarse en células que no tienen leucina y para expresión de ß-galactosidad. El dominio de enlace con ADN puede ser del dominio de enlace ADN-LexA mientras que la secuencia de activador puede obtenerse a partir de un dominio de activación transcripcional B42 (Ma and Ptashne, 1987, Cell 51:113-119). Los promotores de los genes reporteros contienen secuencias de enlace LexA y son activados por la reconstitución de un activador transcripcional funcional. Otra característica de ese sistema es que el gen que codifica la proteína de fusión de dominio de enlace con ADN se encuentra bajo la influencia de un promotor inducible, como por ejemplo, un promotor GAL, de tal manera que se puedan efectuar pruebas de confirmación bajo condiciones de inducción y no inducción . En la modalidad especifica, la presente invención ofrece un método para detectar la interacción EPO y un compuesto receptor para citocinas protectoras de tejido. Una primera población de células de levadura que comprenden una primera proteína de fusión contienen la secuencia de un primer receptor para citocinas protectoras de tejido como por ejemplo un receptor para EPO, y el dominio de enlace con ADN LexA. Una segunda población de células de levadura comprende la segunda proteina de fusión que comprende el dominio de activación transcripcional B42 fusionado sobre la secuencia de un segundo receptor para citocinas protectoras de tejido como por ejemplo ß común. El gen reportero LEU2 y un gen reportero lacZ están enlazados operativamente a promotores que contienen la secuencia de enlace LexA, de tal manera que una interacción de dicha primera proteína de fusión con una segunda proteina de fusión resulta en una transcripción incrementada de dichos genes reporteros. Las funciones de células que comprenden las proteínas de fusión crecen en medio que no tienen leucina para selección. El medio que contiene EPO y el ensayo se efectúan en presencia y ausencia de un compuesto de prueba. Cuando el nivel de transcripción difiere en presencia de un compuesto de prueba, entonces se identifica un compuesto que no dura la interacción de un EPO y un complejo para citocinas protectoras de tejido.

Otras versiones de enfoque de dos híbridos existen, como por ejemplo, los que han reportado un "Ensayo de Replicación Contingente" (Nallur et. al . , 1993 Nucleic Acid Res. 21:3867-3873; Vasavada et. al., 1991, Proc Nati. Acad Sci. USA 88:10686-10690). En este caso, la reconstitución del factor de transcripción en células de mamífero con la interacción de las dos proteínas de fusión provoca la activación de la transcripción del antígeno TSV40. Este antígeno permite una replicación de los plás idos de fusión de fusión de dominio de activación. Otra modificación del enfoque de los híbridos utilizando células de mamífero es lo que se conoce como "Estrategia de Selección por Interacción Carioplásmica" que utiliza también la reconstitución " de un activador transcripcional (Fearon et. al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7958-7962). Genes reporteros utilizados en este caso han incluido el gen que codifica la clorofenicolacetil transferasa bacteriana, el gen para el antígeno para la superficie celular CD4, y el gen que codifica la resistencia a la Higromicina B. En ambos sistemas de mamíferos, el factor de transcripción que es reconstituido es un activador transcripcional híbrido en el cual el dominio de enlace con ADN es de GAL4 y el dominio de activación es de VP16. Un sistema de activación transcripcional ha sido descrito para aislar y catalogar posibles interacciones proteína-proteína dentro de una población, y permitir las comparaciones de tales interacciones entre dos poblaciones (véase publicación PCT WO 97/47763 publicada el 18 de Diciembre de 1997) . 5.2.3 Ensayos de Ligando/complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido En los métodos de tamizaje sin células y basados en células descritos aquí, ligandos de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden emplearse en los ensayos para identificar compuestos que modulen la interacción de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y sus ligandos. En una modalidad, la invención ofrece un método para identificar un compuesto al cual se une un complejo de receptor para citocinas protectoras de 'tejido, dicho método comprende la puesta en contacto de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con (i) un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido fijado sobre un primer marcador y (ii) una cantidad equivalente de un compuesto de prueba fijado sobre un segundo marcador bajo condiciones que fomentan el enlace, la remoción de material no unido del complejo de citocinas protectoras de tejido, y la detección del nivel del primer marcador y del segundo marcador y en donde si el segundo marcador está presente, el compuesto se enlaza con el complejo y si el nivel del primer marcador disminuye con relación al primer marcador en donde el ligando marcado esta en contacto con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido bajo condiciones que llevan al enlace en ausencia de un compuesto de prueba después de la remoción del material no unido, entonces se identifica un compuesto que se une a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido.

En otras modalidad, un método para identificar un compuesto que modula el enlace de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, que comprende la puesta en contacto de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con un complejo, de receptor para citocinas protectoras de tejido en presencia de uno o varios compuestos de prueba bajo condiciones que llevan al enlace, y la medición de la cantidad de ligando de compuesto de receptor para citocinas protectoras de tejido unido al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, de tal manera que si la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido unido medido en presencia de uno o varios compuestos de prueba difiere de la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido unido medida en ausencia de uno o varios compuestos de prueba, entonces se identifica un compuesto que modula el enlace de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido.

En ciertas modalidades de los métodos de la invención descrita aquí en donde se mide el enlace de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en contacto con un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide empleando un anticuerpo específico para ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de la invención descritos aquí arriba en donde el enlace de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en contacto con un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es marcado y el enlace de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y el complejo receptor para citocinas protectoras de tejido se mide mediante la detección del marcador fijado sobre el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de la invención descritos aquí arriba en donde, el enlace del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido el contacto con un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide, el ligando de complejo de rector para citocinas protectoras de tejido es marcado y se mide el enlace del ligando marcado con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido mediante la detección de la etiqueta fijada sobre el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En modalidades relacionadas, la etiqueta es fluorescente. En una modalidad, la invención ofrece un método para identificar la interacción entre un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un ligando de complejo del sector para citocinas protectoras de tejido, que comprende la puesta en contacto de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con uno o varios compuestos de prueba, y la medición de la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, de tal manera que si la actividad medida en presencia de uno o varios compuestos de prueba difiere de la actividad del complejo de receptor para citosinas protectoras de tejido en ausencia de uno o varios compuestos de prueba, entonces se identifica un compuesto que modula la interacción entre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de la invención que se describen arriba, el compuesto se enlaza con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de los métodos de la invención descritos arriba, el compuesto se enlaza con el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 5.2.2.4 ensayos de tamizaje de alto rendimiento los ensayos basados en células y no basados en células descritos aquí para ser utilizados en un formato de alto rendimiento para tamizar bibliotecas de compuestos para identificar los compuestos que modulan una actividad de complejo para citocinas protectoras de tejido o que modulan la interacción de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un complejo de receptor paracitocinas protectoras de tejido. Ejemplos de bibliotecas de compuestos que pueden emplearse en ensayos de tamizaje de alto rendimiento se divulgan en la sección 5.4 abajo. El tamizaje de alto rendimiento mediante la utilización de sondas etiquetadas puede emplearse para identificar compuestos que afectan la formación de sitios funcionales específicos. Perfiles de sitios funcionales pueden ser comparados entre células tratadas con fármacos y células no tratadas o células de control para identificar fármacos y candidatos a fármacos. Además en el caso en el cual un sitio funcional específico ha sido asociado con una actividad protectora de tejido, son las específicas para un sitio de este tipo puedan utilizarse con el objeto de identificar el estado del sitio antes y después del tratamiento farmacológico para identificar un fármaco que altera el estado del sit±o funcional y por consiguiente seria útil en terapia para proteger células, tejidos u órganos. En ciertas modalidades, el tratamiento con un fármaco restaura el estado del sitio funcional observado en una base de control. Los ensayos de tamizaje de la presente invención abarcan también tamizajes de alto rendimiento y ensayos para identificar moduladores de la actividad de complejo receptor ¦ para citocinas protectoras de tejido. De conformidad con esta modalidad, los sistemas descritos abajo pueden ser formulados en kits. Para este propósito, células que expresan un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o lizados de las mismas, pueden colocarse en varios recipientes, como por ejemplo, viales, tubos, placas de pozos de microtitulación, y similares. Otros agentes pueden estar incluidos en recipientes separados y proporcionados con el kit; por ejemplo, las muestras de control positivo, muestras de control . negativo, amortiguadores, medio de cultivo celular. Los ensayos de la presente invención pueden ser optimizados primero a pequeña escala (es decir, en tubos de ensayo) , y después pueden ser incrementados para ensayos de alto rendimiento. 5.3 ensayos para identificar compuestos o compuestos de prueba identificados en ensayos de tamizaje. 5.3.1. tamizajes biológicos o ensayos Compuestos identificados por tener un efecto sobre la actividad de complejo que receptor para citocinas protectoras de tejido o compuestos que modulan la interacción entre un complejo de citocinas protectoras de tejido y un ligando pueden probarse para actividad protectora de tejido, por ejemplo, protección de células, tejidos alargados. Actividades protectoras pueden probarse adicionalmente utilizando ensayos in vitro e in vivo. Las pruebas in vitro que son indicativas de actividad protectora de tejido incluyen por ejemplo ensayos de proliferación celular, ensayos de diferenciación celular, o detección de la presencia de proteínas o ácidos nucleicos regulados en forma ascendente por una actividad de compléjo de receptor para citocinas protectoras de tejido como por ejemplo nucleolina, neuroglobina y citoglobina. La neuroglobina, por ejemplo, puede participar en la operación de facilitar el transporte o almacenamiento de oxígeno de corto plazo. Por consiguiente, ensayo y transporte de oxígeno o almacenamiento de oxígeno como un ensayo para identificar o tamizar . compuestos que modulan la actividad de citocinas protectoras de tejido. La neuroglobina es expresada en células y tejidos del sistema nervioso central en respuesta a hipoxia o isquemia y puede proporcionar protección contra lesión (Sun et al 2001, PNAS 98:15306-15311; Schmid et al., 2003, J. biol. C em 276:1932-1935) . La citoglobina puede desempeñar una función similar en la protección, pero se expresa en varios tejidos en varios niveles (Pesce et al., 2002 EMBO 3; 1146-1151 ) . En una modalidad de la invención, los niveles de una proteina regulada en forma ascendente en una célula pueden medirse antes y después del contacto del compuesto de prueba identificado con una célula. En ciertas modalidades, la presencia de la proteína regulada en forma ascendente con actividad protectora para tejido en una célula, pueden emplearse para confirmar las actividades protectoras de un compuesto. La nucleodolina puede proteger células contra daño. Desempeña .numerosas funciones en células, incluyendo la modulación de procesos de transcripción, proteína de enlace RNA específica para secuencias, citoquinesis, nucleogénesis, transduccíón de señales, apóptosis inducida por células T, remodelación de cromatina, o replicación. Puede funcionar también como una ADN/ARN helicaza de receptor de superficie celular, ATPasa dependiente de ADN, proteína shuttle (proteína aislada del suero de leche) , componente de transcripción o represor transcripsional (Srivastava and Pollard, 1999, FASEB J., 13:1911-1922; and Ginisty et al., 1999, J. Cell Sci., 112-761-722) . La expresión en la proteína regular en forma ascendente puede ser detectada mediante la detección de niveles de IMAM correspondientes a la proteína en una célula. El UNAM puede ibridarse con una sonda que se une específicamente a un ácido nucleico que codifica la proteína regulada en forma ascendente. La hibridación puede consistir, por ejemplo, de Nothern blot, Southern blot, hibridación de conjunto, cromatografía por afinidad o bien hibridación in situ. En otra modalidad, sistema de ensayos rápidos y cuantitativos para tamizar compuestos de prueba para determinar su capacidad para activar un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden emplearse. Tales ensayos, de conformidad con lo descrito, por ejemplo en la patente norteamericana número 5,763,198, detectada la modulación de actividades tirosinquinasa o fosfatasa que participan en la transducción de señales mediante la terminación del estado de fosforación de tirosina de un sustrato de proteína utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina y un anticuerpo específico para el sustrato de proteína. Estos ensayos pueden ser practicados en un sistema de células enteras o un sistema libre de células. En otra modalidad, la invención ofrece un método para poner en contacto una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y paraliza la célula con el objeto de determinar si el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido ha sido fosforilado. En modalidades relacionadas, el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es precipitado con un anticuerpo antireceptor para EPO y el complejo piecipitado es marcado con un anticuperpo anti-fosfotirosina para el receptor betac. Sistemas de modelos de animales pueden utilizarse para demostrar la actividad de protección tisular de un compuesto o para demostrar la seguridad y eficacia de los compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la invención descritos arriba. Los compuestos identificados en los ensayos pueden ser entonces probados para actividad biológica utilizando modelos de animales para un tipo de daño tisular, enfermedad, condición, o síndrome de interés. Incluyendo animales manipulados para contener el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido acoplado a un sistema de lectura funcional, por ejemplo un ratón transgénico. Modelos de animales que puedan ser utilizados para probar la eficacia de la actividad protectora de tejido o células de un compuesto identificado, incluyen, protección contra el inicio de Encefalomielitis Alérgica Experimental Aguda (EAE) en ratas Lewis, restauración o protección de una función cognitiva disminuida en ratones después de recibir traumas cerebrales (Brines et al., 2000, PNAS, 97:10295-10672) y protección contra la isquemia retinal (Rosenbaum et al., 1997, Vis. Res. 37:3443-51). Tales ensayos se describen con detalles adicionales en la publicación PCT número WO02/053580, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Las pruebas in vivo descritas aqui son. enfocadas hacia la administración EPO, sin embargo, el compuesto de prueba que ha sido identificado por tener un efecto en su actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido podria administrarse en lugar de EPO para probar la actividad protectora de tejido. Otros ensayos para determinar la actividad protectora de tejido de un compuesto son bien conocidos por parte de las personas que tienen conocimientos en la materia. Los ensayos diseñados para determinar la actividad protectora de tejido de un compuesto identificado pueden llevarse a cabo en presencia o ausencia de un ligando de complejo receptor de para citocinas protectoras de tejido s'egún si el compuesto identificado es un compuesto que interactúa con el complejo de receptor paracitocinas protector de tejido o modula la interacción de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades/ se agrega un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido adicional al ensayo con el objeto de confirmar adicionalmente la actividad de modulación en un compuesto sobre la interacción de un ligando de complejo de receptor de para citocinas protectoras de tejido y un complejo de receptor de para citocinas protectoras de tejido. 5.3.2. Ensayos de enlace celular Alternativamente, ensayos de enlace celular que utilizan las células divulgadas arriba en la sección 5.2.2.1 pueden también utilizarse. Por ejemplo, células BaF3 pueden ser transfectadas por EPO y receptor betac de conformidad con lo comentado arriba. Además, la pequeña molécula, compuesto biológico o compuesto químico de interés, debe estar unido a un marcador biológico, por ejemplo marcador fluorescente o marcador radioetiquetado . En una placa de 96 pozos, se hacen diluciones en serie 1:2 de medio de cultivo solo (RPMI 1640, suero fetal bovino al 10%, piruvato de sodio lmM, L-glutamina 2mM) , y la pequeña molécula biológico o compuestos químicos de interés. El volumen final de cada dilución debe ser de aproximadamente 100 micro 1. La línea de células parentales BaF3 y células BaF3 transfectadas con EPO-R pueden ser lavadas tres veces en medio de cultivo (véase arriba) , las pellas pueden ser resuspendidas en medio de cultivo y las células pueden ser contadas y diluidas en medio de crecimiento a 5000 células/100 µ? . Cien microlitros de células diluidas pueden agregarse después a cada dilución de muestras. La placa de ensayo puede después ser incubada en una incubadora a 37 °C durante 3 a 4 días. Las células son después lavadas y la placa puede ser leída en un lector de placas fluorescentes o bien a través de otro método adecuado para detectar el biomarcador fijado sobre el compuesto de interés. De manera similar, un ensayo competitivo puede ser utilizado para determinar si un compuesto protege tejidos. En el ensayo competitivo, un compuesto del cual se sabe que protege tejidos, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, citocinas protectoras de tejido tales como las divulgadas en las Solicitudes de Patente Norteamericanas No. 10/188,905 y 10/185,841, pueden fijarse sobre un biomarcador adecuado. En una placa de 96 pozos, ocho diluciones en serie 1:2 de medio de cultivo solo (RPMI 1640, suero fetal de bovino 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM) y los pozos restantes tienen el compuesto protector de te ido/biomarcador, el compuesto protector de tejido/biomarcador y un exceso de la pequeña molécula, compuesto biológico o compuesto químico de interés en ellas . En volumen final de cada dilución debe ser de aproximadamente 100 µ? . Otra vez, las células BaF3 son sembradas en las placas de conformidad con lo divulgado arriba y se permite su incubación. Después de transcurrir un tiempo apropiado, las células son lavadas y la placa puede ser leída entonces en un lector de placas fluorescentes o bien a través de otro método adecuado para detectar el biomarcador. Si la lectura de las placas que contiene un compuesto protector de tejido/biomarcador y compuesto de interés es inferior a la lectura de las placas que contiene solamente el compuesto protector de tej ido/biomarcador, entonces el compuesto de interés es protector de tejido. 5.3.3 Citocina y actividad de proliferación/Diferenciación celular Un complejo de receptor de la presente invención puede ser útil para identificar compuestos protectores de tejido (pequeña molécula, proteína, agentes químicos) en citocina, ensayos de proliferación celular (ya sea inducción o inhibición) o diferenciación celular (ya sea inducción o inhibición) . Muchos factores de proteína descubiertos hasta la fecha incluyendo todas las citocinas conocidas han presentado una actividad en uno o · varios ensayos de proliferación de células dependientes de factores y por consiguiente estos ensayos sirven como confirmación convenientes de la actividad de citocina. La actividad de un compuesto puede ser evidencia a través de cualquiera de varios ensayos de proliferación de células dependiente de factor de rutina para líneas de células incluyendo, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, TIO, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+) , 2E8, RB5 , DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e y CMK, Estas células son cultivas en presencia o ausencia de un compuesto de prueba y la proliferación celular es detectada, por ejemplo, mediante la medición de la incorporación de timidina tritiada o por ensayo colorimétrico basado en la descomposición metabólica de bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazoiio (MTT) (Mosman, 1983, J. Immunol, Meth. 65:55-36). La actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede, entre otras cosas, medirse mediante la unión de un compuesto o ligando sobre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, proliferación celular, diferenciación celular, regulación ascendente de proteínas que tienen un efecto protectora para tejido, o una actividad protectora de tejido. 5.3.4 Proteínas de Fusión Un dominio extracelular de receptor puede ser expresado como una fusión con regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc que contiene dos dominios de región constante y una región de bisagra pero no tiene la región variable. Tales fusiones son típicamente secretadas como moléculas multiméricas en donde las porciones Fc son disulfuro unidos entre ellos y dos polipéptidos de receptor están colocados a proximidad estrecha entre ellos. De conformidad con la presente invención, los polipéptidos de receptor en la fusión deberían incluir al menos un dominio extracelular de EPO-R y un dominio extracelular de receptor . Las fusiones de este tipo pueden utilizarse para purificar el ligando correspondiente de la solución, como una herramienta de ensayo in vitro para bloquear señales ín vivo mediante la remoción especifica de ligando y como antagonistas in vivo mediante su administración parenteral para unir el ligando circulante y removerlo de la circulación. Para codificar ligando, se agrega un quimera de complejo de receptor protector de tejido a una muestra que contiene ligando (por ejemplo, medio de cultivo acondicionado por células, o extractos de tejido) bajo condiciones que facilitan el enlace receptor-ligando (típicamente temperatura casi fisiológica, pH, y fuerza iónica) . El complejo quimera-ligando es después separado mediante mezclado empleando proteína A, la cual es inmovilizada en un soporte sólido (por ejemplo, perlas de resina insolubles) . El ligando es eluido utilizando técnicas químicas convencionales como por ejemplo con un gradiente de pH o sal. En forma alternativa, la quimera misma puede estar unida a un soporte sólido, con unión y elución llevándose a cabo como arriba. Las quimeras con una alta afinidad de enlace son administradas parenteralmente (por ejemplo, con inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa) . Moléculas circulantes se unen al ligando y son depuradas de la circulación por procesos fisiológicos normales. Para su uso en ensayos, las quimeras pueden estar unidas sobre un soporte a través de la región Fc y se puede utilizar en un formato ELISA. Un sistema de ensayo preferido que emplea un proteína de fusión de complejo de ligando-receptor de enlace o fragmento de complejo de ligando-receptor de enlace utiliza un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore"M, Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.), en donde de la proteina de fusión es inmovilizada en la superficie de un chip de receptor. El uso de este instrumento es divulgado por Karlsson, 1991, J. Inmuno1. Met ods 145:229-240, y Cunningham and Wells, .1993, J. Mol. Biol . 234:554-563. Una proteina de fusión es covalentemente fijada, empleando química de amina o sulf idrilo, sobre fibras de dextrano fijadas sobre una película de oro dentro de la célula en flujo. Una muestra de prueba es pasada a través de la célula. Si ligando está presente en la muestra, se unirá a la proteína en fusión inmovilizada, provocando un cambio del índice de refracción del medio que es detectado como un cambio en resonancia de superficie de plasmón de la película de oro. Este sistema permite la determinación de regímenes conectados y desconectados a partir de lo cual se puede calcular la afinidad de enlace y se puede evaluar las características estequiométricas del enlace. · · Proteínas de fusión de enlace con ligando puede también utilizarse dentro de otro sistema de ensayo conocido en la técnica. Tales sistemas incluyen el análisis Scatchard para determinar la afinidad de enlace (véase, Scatchard, 1949, nn. NY Acad. Sci. 51:660-672) y ensayos calorimétricos (Cunningham et al., 1991, Science 253:545-548; Cunningham et al., 1991, Science 254:821-825). Una proteína de fusión de enlace con ligando de receptor puede también emplearse para purificar ligando. La proteína de fusión es inmovilizada en un soporte sólido, por ejemplo perlas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables en las condiciones de uso. Métodos para enlazar polipéptidos sobre soportes sólidos son conocidos en la técnica e incluyen química de aminas, activación con bromuro de cianógeno, activación N-hidroxisuccinimida, activación por epóxido, activación por sulfhidrilo y activación por hidrazida. El medio resultante será generalmente configurado en forma de una columna, y fluidos que contienen el ligando son pasados a través de la columna una o varias veces para permitir la unión del ligando con el polipéptido de receptor. El ligando es después eluido empleando cambios de concentración de sal o cambios de pH para perturbar el enlace ligando-receptor . 5.3.5 Otros Ensayos Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica reconocerá que el complejo de receptor de la presente invención es útil en varios ensayos bien conocidos pero no se limita a los ensayos ligando-receptor divulgados en Current Protocols In Immunology, Vol.4, Capítulo 18, 2001, John E.

Coligan Ed. John Wiley and Sons. Si el compuesto presenta una actividad protectora de tejido, una persona con conocimientos ordinarios en la materia reconocerá que seria benéfico verificar el resultado empleando uno de los ensayos neuroprotectores o protectores de tejido conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, ensayo de células P-19, PC-12, TF-l y UT-7. Además, varios modelos in vivo tales como modelos de animales relacionados con lesión de la médula espinal, embolia isquémica, daño al nervio periférico, y corazón y ojos serian útiles para caracterizar con mayor precisión el compuesto protector de tejido aislado. Ensayos *-in vitro e in vivo adecuados se divulgan en las solicitudes de patentes norteamericanas Nos. 10/188,905 y 10/185,841. 5.3.5.1 Ensayo que utilizan animales noqueados para ßa (-/-) La invención se refiere también al uso de células huéspedes y animales genéticamente manipulados para inhibir o "noquear" la expresión del receptor ß0 endógeno para el animal y/o par expresar el receptor ß0 humano (o mutantes del mismo) . Tales animales transgénicos pueden ser utilizados en métodos para identificar vias neuroprotectoras y compuestos que activan las vias neuroprotectoras . En la expresión de gen blanco endógeno puede también ser reducida mediante la desactivación o "noqueo" del gen blanco o su promotor empleando recombinación homologa enfocada (por ejemplo, véase Smithies et al., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson et al., 1989, Cell 5, 313-321; cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Por ejemplo, un imitante, gen blanco no funcional (o una secuencia de ADN totalmente no relacionada) flanqueada por ADN homólogo al gen blanco endógeno (ya sea la regiones codificadoras o regiones reguladoras del gen blanco) puede emplearse, con o sin marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresan el gen blanco in vivo. La inserción del constructo de ADN a través de recombinación homologa enfocada, resulta en la desactivación del gen blanco. Tales enfoques son modificaciones particularmente adecuadas para células ES (células madre embriónicas) y pueden utilizarse para generar crías de animales con el gen blanco inactivo (véase, por ejemplo, Thomas & Capecchi, 1978 y Thompson, 1989, supra) . Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado para su uso en seres humanos a condición que los constructos de ADN recombinante sean administrados o dirigidos directamente al sitio requerido in vivo empleando vectores virales apropiados. Una vez que los animales noqueados para receptor ß0 (-/-) han sigo generados, la expresión del gen de receptor ß0 recombinante puede ser ensayada utilizando técnicas estándares. Un tamizaje inicial puede lograrse por análisis Southern blot o técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para analizar tejidos animales para ensayar si se ha efectuado el noqueo del gen endógeno. El nivel de expresión de ARNm del transgen en los tejidos de los animales transgénicos puede también evaluarse empleando técnicas que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, el análisis Northern blot de muestras de tejido obtenidas del animal, en análisis de hibridación in situ, y RATA-PCR (reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa reversa) . Muestras de tejidos que expresan el gen de receptor fic pueden también ser evaluados inmunocitoquimicamente empleando anticuerpos específicos para el producto de transgen- de receptor (¾c. En una modalidad de la invención, animales noqueados para receptor ßa (-/-) se utilizan en ensayos para identificar vías y/o compuestos que involucran una actividad protectora de tejido. Por ejemplo, animales noqueados en cuanto a receptor ß0 (-/-) y normales pueden recibir ambos un agente o fuerza de la cual se sabe que provoca un daño tisular, por ejemplo, isquemia. Ambos animales pueden recibir después un compuesto y la actividad protectora de tejido del compuesto puede determinarse. Métodos para determinar una actividad protectora de tejido son bien conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia y ejemplos de tales métodos se divulgan en la publicación PCT No. WO 02/053580, que se incorpora por referencia aqui en su totalidad. Si se observa una actividad protectora de tejido en los animales normales pero no en los animales noqueados en cuanto a receptor ßa (-/-) que recibieron el mismo compuesto, entonces se identifica un compuesto con actividades protectoras de tejido dependientes del receptor ßa. Una investigación adicional en cuando a la via protectora de tejido dependiente de receptor ß0 identificado puede consistir de la determinación de si el compuesto se une al receptor ß,~ o complejos del mismo, o identificación de proteínas o transcriptos de ARN presentes solamente en los animales que tienen la actividad protectora de tejido. Los solicitantes plantean en forma hipotética que 'vías secundarias o redundantes para protección tisular pueden estar presentes y que los animales noqueados en cuanto a receptor ß0 (-/-) podrían ser utilizados para investigar tales vías. 5.4 COMPUESTOS Los métodos de la invención para tamizar e identificar compuestos pueden emplear numerosos tipos de compuestos incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, moléculas pequeñas, moléculas orgánicas, moléculas no orgánicas, péptidos, polipéptidos, análogos de péptidos, incluyendo péptidos que comprenden aminoácidos que no ocurren naturalmente, por ejemplo, D-amínoácidos, análogos de. fósforo de aminoácidos, como por ejemplo ácidos D-amino fosfóricos y ácidos D-aiaino fosfóricos, o aminoácidos que tienen enlaces no péptidos, análogos de ácido nucleico tales como fosforotioatos y PNAs . Compuestos que pueden ser probados y métodos identificados descritos aquí pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, compuestos obtenidos a partir de cualquier fuente comercial, incluyendo Aldrich (Mil aukee, WI 53233), Sigma Chemical (St. Louis, MO) , Fluka C emie AG (Buchs, Suiza) Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY) , Eastman Chemical Company, Fine Chemicals (Kingsport, TN) , Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania) , Takasago (Rockleigh, NJ) , SST Corporation (Clifton, NJ) , Ferro (Zachary, LA 70791), Riedel-deHaen Aktiengesellschaft (Seelze, Alemania) , PPG Industries Inc., Fine Chemicals (Pittsburgh, PA 15272). Además, cualquier tipo de producto natural puede ser tamizado utilizando los métodos de la invención, incluyendo extractos microbianos, fúngales, vegetales o animales. Bibliotecas ¦ de polipéptidos o proteínas pueden también utilizarse en los ensayos de la invención. Por ejemplo, el compuesto de prueba puede ser una molécula pequeña, una molécula orgánica, una molécula no orgánica, o un péptido. Ejemplos de bibliotecas de tales compuestos que pueden ser tamizados de conformidad con los métodos de la invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, peptoides; biooligómeros aleatorios, diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos polipéptidos vinílogos; peptidomiméticos no peptidales; oligocarbamatos; peptidil fosfonatos; bibliotecas de ácido nucleico de péptido, bibliotecas de anticuerpos; bibliotecas de carbohidratos; y bibliotecas de moléculas pequeñas (bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas o no orgánicas) . Ejemplos de tales bibliotecas incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, bibliotecas de péptidos aleatorios; (véase por ejemplo, Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86), y biblioteca molecular derivada por química de combinación que consiste de aminoácidos en configuración D y/o configuración L, fosfopéptidos (incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos, aleatorios o parcialmente degenerados; véase, por ejemplo, Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778), anticuerpos (incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos, o de cadena sencilla y fragmentos de bibliotecas de expresión FAb, F(ab')2 y FAb, así como fragmentos de enlace con epítopos de los mismos), y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. En una modalidad de la presente invención, bibliotecas de péptidos pueden ser utilizados como una fuente de compuestos de prueba que pueden utilizarse para tamizar moduladores de interacción de complejo de receptor para citocinas protectores de tejido, tales como complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido EPO. Bibliotecas variadas, como por ejemplo bibliotecas de péptidos o no péptidos aleatorios o de combinación pueden ser tamizadas para moléculas que se unen específicamente al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Muchas bibliotecas se conocen en la técnica las cuales pueden ser utilizadas como por ejemplo, bibliotecas sintetizadas químicamente, bibliotecas recombinantes (por ejemplo bibliotecas de despliegue de fagos) , y bibliotecas basadas en traducciones In vi tro. Ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente se describen en Fodor et al., 1991, -Science 251:767-773; Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86; Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9); 1233-1251; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmón et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; Publicación PCT No. WO 93/20242; y Brenner y Lerner, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8 : 5381-5383. Ejemplos de bibliotecas que despliegan fagos se describen en Scott & Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406; Christian et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718/ Lenstra, 1992, J. Iimunol. Met . 152:149-157/ Kay et al., 1993, Gene 128:59-65; y Publicación PCT No. WO 94718318 fechado el 18 de agosto de 1994. A titulo de ejemplos de bibliotecas no péptidos, se puede adaptar una biblioteca de benzodiacepinas (véase por ejemplo, Bunin et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:4708-4712) para su uso. Bibliotecas de peptoides (Simón et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:9367-9371) pueden también utilizarse. Otro ejemplo de una biblioteca que puede utilizarse en la cual funcionalidades amida en péptidos han sido permetiladas para generar una biblioteca de combinación químicamente transformada, es descrito" por Ostresh et al. (1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11138-11142). El tamizaje de las bibliotecas puede lograrse de cualquiera de varios métodos comúnmente conocidos. Véase, por ejemplo, las referencias siguientes, que divulgan el tamizaje de bibliotecas de péptidos: Parmley & Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott & Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes et al., 1992/ BioTechniques 13:422-427/ Oldenburg et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5393-5397/ Yu et al., 1994, Cell 76:933-945/ Staudt et al., 1988, Science 241:577-580; Bock et al., 1992, Nature 355:5-64-566/ Tuerk et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6988-6992/ Ellington et al., 1992, Nature 355:850-852/ Patente Norteamericana No. 5,096,815, Patente Norteamericana No. 5,223,409, y Patente Norteamericana No. 5,198,346, todas de Ladner et al.; Rebar & Pabo, 1993, Science 263:671-673; y Publicación PCT No. WO 94/18318. En una modalidad preferida, las bibliotecas de combinación son bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos,- benzodiazepinas, isoprenoides, tiazolidinonas, metatiazanonas, pirrolidinas, compuestos morfolino y benzodiazepinas. En otra modalidad, las bibliotecas de combinación comprenden peptoides; bio-oligómeros aleatorios; benzodiacepinas ; di ersómeros tales como hidantoínas, benzodiacepinas y dipéptidos; polipéptidos vinilogos; peptidomiméticos no peptidales; oligocarbamatos; peptidil fosfonatos; bibliotecas de ácido nucleico de péptido; biblioteca de anticuerpo; o bibliotecas de carbohidratos . Bibliotecas de combinación están comercialmente disponibles (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, New Jersey; Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Missouri; ChemStar, Ltd, Moscow Russia; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pennsylvania; Martek Biosciences, Columbia, Maryland; etc.). En una modalidad . referida, la biblioteca de pre-selecciona de tal manera que los compuestos de biblioteca sean más fácilmente disponibles para absorción celular. Por ejemplo, compuestos se seleccionan con base en parámetros específicos como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, tamaño, liofilicidad, hidrofilicidad, y enlace hidrógeno, que mejoran la probabilidad de la penetración de los compuestos en las células. En otra modalidad, los compuestos son analizados mediante programas de cómputo tridimensionales o cuatridimensroñales . En una modalidad, la biblioteca de compuestos de combinación para los métodos de la presente invención puede ser sintetizada. Existe un gran interés en métodos sintéticos dirigidos hacia la creación de grandes conexión de compuestos orgánicos pequeños, o bibliotecas, que podrían ser tamizados para actividad farmacológica, biológicas y otras actividades. Los métodos sintéticos aplicados para crear amplias bibliotecas de combinación se llevan a cabo en solución o en fase sólida, es decir, en un soporte sólido. La síntesis en fase sólida facilita la realización de reacción en etapas múltiples y lleva las reacciones hasta su terminación con altos rendimientos puesto que se puede agregar fácilmente reactivos en exceso los cuales pueden ser removidos después de cada paso de reacción. La síntesis de combinación en fase sólida tiende también a mejorar el aislamiento, purificación y tamizaje. Sin embargo, la química en fase de solución más tradicional soporta una variedad más amplia de reacción orgánicas que la química en fase sólida.

Bibliotecas de compuestos de combinación de la presente invención pueden sintetizarse empleando el aparato descrito, en la patente norteamericana No. 6, 190,619 de Kilcoin et al, que se incorpora por referencia en su totalidad. La Patente Norteamericana No. 6,190,619 divulga un aparato de síntesis capaz de contener varios recipientes de reacción para la síntesis en paralelo de múltiples compuestos discretos para bibliotecas de compuestos de combinación. En una modalidad, la biblioteca de compuestos de combinación puede sintetizarse en solución. El método divulgado en la patente norteamericana No. 6,194,612 de Boger et al, que se incorpora por referencia en su totalidad, presenta compuestos útiles como templados para síntesis en' fase en solución de bibliotecas de combinación. El templado está diseñado para permitir que productos de la reacción sean fácilmente purificados á partir de reactivos que no han reaccionado empleando extracción líquido/líquido o sólido/líquido. Los compuestos producidos por la síntesis de combinación utilizan el templado serán preferentemente moléculas orgánicas pequeñas. Algunos compuestos de la biblioteca pueden imitar los efectos de no péptidos o péptidos. En contraste con la síntesis en fase sólida de bibliotecas de componentes de combinación, la síntesis en fase líquida no requiere del uso de protocolos especializados para monitorear los pesos individuales de una síntesis en fase sólida en pasos múltiples (Egner et al., 1995, J. Org. Chem. 60:2652; Anderson et al., 1995, J. Org. Chem. 60:2650; Fitch et al., 1994, J. Org. Chem. 59:7955; Look et al., 1994, J. Org. Chem. 49:7588; Metzger et al., 1993, 7Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 32:894; Youngquist et al., 1994, Rapid Commun. Mass Spect . 8:77; Chu et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:5419; Brummel et al., 1994, Science 264:399; Stevanovic et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:431). Bibliotecas de compuestos de combinación útiles para los métodos de la presente invención pueden sintetizarse en soportes sólidos. En una modalidad, un método de síntesis dividida, un protocolo de separación y mezcla de soporte sólidos durante la síntesis, se utiliza para sintetizar una biblioteca de compuestos en soportes sólidos (véase, por ejemplo, Lam et al., 1997, Chem. Rev. 97:41-448; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 y referencias citadas ahí) . Cada soporte sólido en la biblioteca final tiene sustancialmente un tipo de compuesto fijado sobre su superficie. Otros métodos para sintetizar bibliotecas de combinación en soportes sólidos, en donde un producto- es fijado sobre cada soporte, serán conocidos de las personas con conocimientos en la materia (véase, por ejemplo, Nefzi et al., 1997, Chem. Rev. 97:449-472). Como se utiliza aquí, el término "soporte sólido" no se limita a un tipo específico de soporte sólido. Al contrario, un gran número de soportes están disponibles y son conocidos de una persona con experiencia en la materia. Los soportes sólidos incluyen geles de sílice, resinas, películas plásticas derivadas, perlas de vidrio, algodón, perlas de plástico, perlas de poliestireno, geles de alúmina y polisacáridos . Un soporte sólido adecuado puede ser seleccionado con base en el uso final deseado y carácter adecuado para varios protocolos sintéticos. Por ejemplo, para síntesis de péptidos, un soporte sólido puede ser una resina como por ejemplo resina p-metilbencilhidrilamina (pMBHA) (Peptides International, Louisville, KY) , poliestirenos (por ejemplo, resina PAM obtenida de Bachem Inc., Pen nsula Laboratories, etc.), incluyendo clorometilpoliestireno, hidroximetilpoliestireno y aminometilpoliestireno, poliestireno injertado con (dimetilacrilamida) co-divinilbenceno (por ejemplo, resina POLYHIPE, obtenida en Aminotech, Canadá) , resina de poliamida (obtenida de Península Laboratories), resina de poliestireno injertado con polietilenglicol (por ejemplo, TENTAGEL ó ARGOGEL, Bayer, Tubingen, Alemania) resina de polimetilacrilamida (obtenida de Milligen/Biosearch, California) , o Sepharose (Pharmacia, Suecia) . En ciertas modalidades de la presente invención, compuestos pueden ser fijados sobre soportes sólidos a través de enlazadores. Los enlazadores pueden ser integrados o parte del soporte sólido, o bien puede ser no integrados en la medida en que son o bien sintetizados en el soporte sólido o bien fijados sobre dicho soporte después de síntesis. Los enlazadores útiles no solamente para proporcionar puntos de fijación de compuestos sobre el soporte sólido, sino también para permitir que diferentes grupos de moléculas estén disociados del soporte sólido bajo condiciones diferentes, según la naturaleza del enlazador. Por ejemplo, enlazadores pueden ser inter alia, disociados electrofílicamente, disociados nucleofílicamente, fotodisociables, disociados e zimáticamente, disociados por metales, disociados bajo condiciones reductoras o disociados bajo condiciones oxidantes. En una modalidad preferida,-, los compuestos son disociados del soporte sólido antes del tamizaje de alto desempeño de los compuestos. En ciertas modalidades, el compuesto de la invención es una citocina. Ejemplos de citocinas que pueden emplearse en los métodos de tamizaje y métodos de tratamiento y prevención de la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-1 beta, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-13, IL-12, IL-15, IL-18, TNF-alfa, factor neurotrófico derivado de cerebro, proteína morfogenética ósea-2, factor de crecimiento nervioso beta, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblasto-ácido, factor de crecimiento de fibroblasto-básico, factor de estimulación de colonias - granulocitos, factor de estimulación de colonias - granulocitos, hormona de crecimiento de ser humano, factor de estimulación de colonias - macrófagos de granulocito, factor de crecimiento de hepatocitos, interferón-alfa 2a, interferón-alfa 2b, interferón-alfa Ib, interferón-beta la, interferón-beta Ib, interferón-gamma, factor de crecimiento de tipo insulina-i, factor de crecimiento de tipo insulina-II, factor de crecimiento de queratinocitos, neurotrofina-3, factor de crecimiento derivado de plaquetas-bb, factor de células madre, factor alfa de necrosis, factor beta de necrosis tumoral, factor de crecimiento endotelial vascular, leptina, o prolactina. En ciertas modalidades en donde el compuesto es una citocina, el compuesto se produce recombinantemente . En ciertas modalidades en donde el compuesto es una citocina, el compuesto es humano . En modalidades de los métodos de la invención en donde el compuesto es una molécula pequeña, la molécula pequeña puede ser especifica para un receptor para EPO, como por ejemplo los disponibles en Receptron (Receptron, Inc., Mountain Vie , CA) . Otros ejemplos de moléculas pequeñas incluyen los divulgados en Goldberg et al. (2002, J. Amer. Chem. Soc. 124:544-555) y Boger y Goldberg (2001, Bioorg. and Org. Chem. 9:557-562) . 5.4.1.1 EPO Modificada y Mutantes de EPO En ciertas modalidades de la invención, el compuesto de prueba utilizado en el ensayo y/o el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido utilizado en ensayos para identificar compuestos que modulan la interacción de un complejo de receptora para citocinas protectoras de tejido y un ligando del mismo es una EPO químicamente modificada, una EPO mutante, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/188,905 que fue publicada como 20030072737-A1 el 17 de abril de 2003, y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/612,665 que divulgan EPO químicamente modificada y/o mutante y que se incorporan por referencia aquí en su totalidad. Tales moléculas químicamente modificadas y/o mutantes pueden emplearse en los ensayos de tamizaje de la invención descritos aquí. Véase también Solicitud PCT No. PCT/US01/49479, Solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 10/188,905 y 10/185,841, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . Estas citocinas protectoras de tejido protegen, mantienen, mejoran y/o restauran la función y/o viabilidad de células de mamíferos, tejidos y órganos que responden a eritropoyetina, que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, células o tejidos neuronales, retínales, musculares, cardiacos, renales.

Moléculas de EPO químicamente modificadas que pueden emplearse en los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, eritropyetinas que han sido alteradas por al menos una modificación en comparación con una eritropoyetina nativa, y preferentemente en comparación con eritropoyetina humana nativa. La por lo menos una modificación puede ser una modificación de al menos un aminoácido de la molécula de eritropoyetina, o una modificación de al menos un carbohidrato de la molécula de eritropoyetina. Evidentemente, una EPO químicamente modificada útil para los propósitos aquí puede tener varias modificaciones en comparación con una molécula nativa, como por ejemplo múltiples modificaciones de la porción de aminoácido de la 'molécula, múltiples modificaciones de la porción carbohidrato de la molécula, o bien al menos una modificación de la porción de aminoácido de la molécula o por lo menos una modificación de la porción carbohidrato de la molécula. La molécula de EPO químicamente modificada conserva su capacidad de proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamíferos que responden, sin embargo una o varias de las propiedades de la molécula de eritropoyetina no relacionada con la característica deseablemente mencionada arriba puede estar ausente en comparación con la molécula nativa. En una modalidad preferida, la EPO químicamente modificada no tiene los efectos de la eritropoyetina sobre la médula ósea, es decir, hematócrito incrementado (eritropoyesis) , vasoconstricción (alta presión sanguínea), presión sanguínea incrementada, hiperactivación de las plaquetas, actividades pro-coagulatorias, así como producción ' incrementada de trombocitos. Con mayor preferencia, la EPO químicamente modificada no presenta eritropoyesis; con mayor preferencia, la EPO químicamente modificada no presenta los efectos de la eritropoyetina sobre la médula ósea. A título de ejemplo, la EPO químicamente modificada de la invención puede ser una asialoeritropoyetina . En otro ejemplo, la EPO químicamente modificada de la invención puede ser eritropoyetina o asialoeritropoyetina que ha reaccionado con uno o varios reactivos que modifican uno o varios grupos amino de residuos de aminoácidos de eritropoyetina nativa o asialoeritropoyetina. En una modalidad preferida, la EPO químicamente modificada no es ertritropoyetica . En una modalidad, la EPO químicamente modificada es una eritropoyetina que no tiene porciones de ácido siálico. En una modalidad preferida, la EPO químicamente modificada es asialoeritropoyetina, y con mayor preferencia asialoeritropoyetina humana. En otra modalidad, la EPO químicamente modificada tiene 1, 2, 3, 4,- 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 porciones de ácido siálico. Tales eritropoyetinas parcialmente desialiladas se conocen aquí como hiposialoeritropoyetinas . Pueden prepararse por modificación química o enzimática de eritropoyetina nativa o bien pueden obtenerse por expresión en un sistema que o bien no sialila la molécula en lo absoluto, o bien sialila solamente parcialmente la eritropoyetina. La asialoeritropoyetina y la híposialoeritropoyetina de la invención están abarcadas independientemente del medio a través del cual se preparan las moléculas. En otra modalidad preferida, la EPO químicamente modificada comprende al menos un o varios residuos de lisina modificados o una modificación del grupo N-terminal amino de la molécula de eritropoyetina, dichas modificaciones tales como las que resultan de la reacción del grupo épsilon amino de lisina o el grupo N-terminal amino con un agente de modificación de grupo amino o con agentes modificadores de grupo amino. El residuo de lisina modificado o el grupo N-terminal amino modificado puede ser químicamente reducido. En una modalidad preferida, una eritropoyetina es biotinilada, carbamilada, succinilada o acetilada en uno o varios grupos lisina o en la N-terminal. En otra modalidad preferida, la lisina reacciona con un aldehido o azúcar reductor para formar una imina la cual opcionalmente es después estabilizada por reducción química como por ejemplo mediante el uso de cianoborohidruro de sodio para formar un residuo de lisina N-alquilada como por ejemplo glucitolil lisina, o que, en el caso de azúcares reductores, puede estabilizarse por reacomodos de Amadori o Heyns para formar un alfa-desoxi alfa-amino azúcar como por ejemplo alfa-desoxi-alfa-fructosilisina . En otra modalidad preferida, la lisina o el grupo N-terminal amino es carbamilado (carbamoilado), por ejemplo en virtud de reacción con ion cianato, alquilo-carbamilado, aril-carbamilado, o aril-tiocarbamilado con un alquilo-isocianato, aril-isocianato, o aril-isotiocianato, respectivamente, o bien puede ser acilado por un derivado reactivo de ácido alquilcarboxilico o arilcarboxilico, como por ejemplo por reacción con anhídrido acético, anhídrido succínico, o anhídrido itálico. Al menos un grupo lisina en el grupo N-terminal amino puede ser también trinitrofenilo modificado por reacción con un ácido tririitrobensulfónico, o preferentemente con una de sus sales. En otra modalidad, residuos de lisina pueden ser modificados por reacción con un glioxal, como por ejemplo reacción con glioxal, metilglioxal ó 3-desoxiglucosona para formar los derivados de alfa-carboxialquilo correspondientes. En otra modalidad, una EPO químicamente modificada puede ser generada mediante la modificación de al menos un residuo de tirosina de eritropoyetina mediante la utilización de un reactivo electrofílico como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, modificación por nitración o yodinación, para modificar una posición de anillo aromático. Como se indicó arriba, un agente protector de tejido útil "para los propósitos aquí, puede tener al menos una de las modificaciones mencionadas arriba, pero puede tener más que una de las modificaciones indicadas arriba. A titulo de ejemplo, las EPOs químicamente modificadas con una modificación a la porción de aminoácido de la molécula y modificación opcional a la porción carbohidrato de la molécula, una EPO químicamente modificada es carbamoileritropoyetina, carbamilasialoeritropoyetina, carbamilhiposialoeritropoyetina, acetileritropoyetina, acetilasialoeritropoyetina, acetilhipoasialoeritropoyetina, succinileritropoyetina, succinilasialoeritropoyetina, succinilhiposialoeritropoyetina, biotinileritropoyetina, biotinilasialoeritropoyetina, biotinilhipsialoeritropoyetina, yodoeritropoyetina, yodoasialoeritropoyetina, yodohiposialoeritropoyetina, N-épsilon- carboximetlleritropoyetina, N-épsilon- mcarobximetileritropoyetina, N-épsilon- carboximetilhiposialoeritropoyetina, y glucitolileritropoyetina, glucitolilasialoeritropoyetina, glucitolilasialohipoeritropoyetina . Estos compuestos son solamente ejemplos de eritropoyetinas modificadas de la invención. Los nombres triviales mencionados arriba son simplemente representativos de las modificaciones de la molécula de eritropoyetina nativa, y como se describió arriba, la modificación del grupo amino puede estar en uno o varios grupos épsilon amino de residuos de lisina, o el grupo N-terminal amino, o, en el caso de eritropoyetinas nitromodificadas o yodomodificadas, de uno o varios residuos de tirosina. Cualquier combinación de lo anterior se encuentra dentro del marco de la presente invención. La presente invención abarca también EPO químicamente modificada que comprende una o varias de las modificaciones químicas mencionadas arriba. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamíferos que responden y sus células, tejidos y órganos asociados, mediante la administración de una cantidad efectiva de una o varias de las EPOs químicamente modificadas mencionadas arriba o un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, como por ejemplo los compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la invención. En un aspecto particular del método, las células de mamífero que responden y sus células, tejidos u órganos asociados son distantes con relación a la vasculatura en virtud de una barrera a células endoteliales estrecha. En otro aspecto particular, las células, tejidos, órganos u otras partes corporales son aisladas del cuerpo de un mamífero, de conformidad con lo contemplado para transplante o reinserción. A título de ejemplos no limitativos, la célula o tejido que responde puede ser células o tejidos neuronales, retínales, musculares, cardiacos, pulmonares, hepáticos, renales, de intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, endoteliales capilares, de testículos, de ovarios, de páncreas, de piel, de hueso, o células o tejidos endometriales . Estos ejemplos de células que responden son simplemente ejemplos. En una modalidad particular, la célula que responde o sus células, tejidos u órganos asociados no son células, tejidos u órganos excitables ni comprenden predominantemente % células o tejidos excitables. En otra modalidad particular, la célula de mamífero, tejido u órgano para el cual una EPO químicamente modificada mencionada arriba, o un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectora de tejido como por ejemplo los compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la presente invención, puede administrarse, son los que han permanecido o permanecerán durante un lapso de tiempo en al 'menos una condición adversa a la viabilidad de la célula, tejido u órgano. Tales condiciones pueden incluir hipoxia traumática in situ, o disfunción metabólica hipoxia in situ inducida quirúrgicamente o disfunción metabólica o exposición in situ a toxinas; este último puede relacionarse con quimioterapia o terapia con radiación. En una modalidad, la invención protege contra las condiciones adversas que resultan de desvío cardiopulmonar .

La invención ofrece también un método para tamizar que utiliza una EPO químicamente modificada que es y una eritropoyetina a la cual le falta porciones de ácido siálico; (ii) una eritropoyetina a la cual le falta carbohidratos enlazados con N o carbohidratos enlazados con 0; (ii) una eritropoyetina que tiene un contenido reducido de carbohidrato por tratamiento de eritropoyetina natina con al menos una glicosidasa; (iv) una eritropoyetina que tiene al menos uno o varios carbohidratos oxidados; (v) una eritropoyetina que comprende al menos uno o varios carbohidratos oxidados que es químicamente reducida; (vi) una eritropoyetina que comprende al menos uno o varios residuos de arginina modificados; (vii) una- eritropoyetina que comprende al menos uno o varios residuos de resina modificados, o una modificación del grupo N-terminal amino de la molécula de eritropoyetina; (viii) una eritropoyetina que comprende al menos un residuo de tirosina modificada; (ix) una eritropoyetina que comprende al menos un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico modificado; (x) una eritropoyetina que comprende al menos un residuo de triptófano modificado; (xi) una eritropoyetina que tiene al menos un grupo amino removido; (xii) una eritropoyetina que comprende al menos una abertura de al menos uno de los enlaces de cisteina en la molécula de eritropoyetina; _ (xiii) una eritropoyetina truncada.

En una modalidad, la EPO químicamente modificada para su uso en los métodos de la invención es asialoeritropoyetina o fenilglioxal-eritropoyetina . En otra modalidad, la EPO químicamente modificada es capaz de atravesar una barrera de células endoteliales . La barrera de células endoteliales puede seleccionarse dentro del grupo que consiste de barrear hematoencefálica, barrera hematocular, barrera hematotesticular, barrera hemato ariana, y barrera hematouterina . La invención ofrece también una EPO químicamente modificada o un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido tales como los compuestos identificados por los métodos de tamizaje de la invención para su uso en los métodos de la invención que es una eritropoyetina . En modalidades preferidas el compuesto es asialoeritropoyetina. En modalidades preferidas, el compuesto es asialoeritropoyetina humana. La EPO químicamente modificada es preferentemente una eritropoyetina sin carbohidratos enlazados con N. la EPO químicamente modificada es preferentemente una eritropoyetina sin carbohidratos enlazados con O. en una modalidad la EPO químicamente modificada es una eritropoyetina tratada con un al menos una glicosidasa. En otra modalidad, la EPO químicamente modificada es eritroproyetina oxidada con periodato. La eritropoyetina oxidada con periodato es preferentemente químicamente reducida con cianohidruro de sodio. En una modalidad la EPO químicamente modificada es una eritropoyetina que comprende una porción R-glioxal en uno o varios residuos de arginina, en donde R es una porción arilo o lquilo. La eritropoyetina es preferentemente fenilglioxal eritropoyetina. En otra modalidad, la EPO químicamente modificada es una eritropoyetina en la cual al menos un residuo de alginina es modificado por reacción con una disetona vecina seleccionada dentro del grupo que consiste de 1, 3-butandiona y ciclohexandíona . En otra modalida, la EPO químicamente modificada de la presente invención es una eritropoyetina en la cual al menos un residuo de alginina reacciona con 3-desoxiglucosona . En otra modalidad, la EPO químicamente modificada es una molécula de eritropoyetina que comprende al menos una lisina biotihnilida o un grupo N-termina amino . La molécula de eritropoyetina puede ser una eritropoyetina biotinilada. La invención ofrece también una EPO químicamente modificada que es glucitolil lisina eritropoyetina o una fructosil lisina eritropoyetina. En una modalidad, la EPO químicamente modificada de los métodos de la invención es una eritropoyetina que tiene al menos un resido de lisina carbamilado. En otra modalidad, la eritroproyetina carbamilada se selecciona dentro del grupo que consiste de alfa-N-carbomíleritropoyetina N-epilon-carbamoileritropoyetina; alfa-N-carbamoi1, N-epsilon-carbamoileritropoyetina; alfa-N-carbamoilasialoeritropoyetina; N-epsilon-carbamoilasialoeritropoyetina; alfa-N-carbamoil, N-epsilon-carbaiaoilasiloeritropoyetina; alfa-N-carbamoilhiposialoeritropoyetina;N-epsilon-carbamoilhiposialoeritropoyetina; y alfa-N-carbamoil, N-epsilon-carbamoilhiposialoeritropoyetina. En otra modalidad, la EPO químicamente modificada de los métodos de la invención es una eritropoyetina en la cual al menos un residuo de Usina es acilado. En otra modalidad, un residuo de lisina de dicha eritropoyetina es acetilado. En otra modalidad, la eritropoyetina acetilada se selecciona dentro del grupo que consiste de alfa-N-acetileritropoyetina; N-epsilon-acetileritropoyetina; alfa-N-acetil, N-epsilon-acetileritropoyetina; alf -N-acetil, N-epsilon-acetilasialoerítropoyetina alfa-N-acetilposialoeritropoyetina;N-epsilon-acetilhiposialoeritropoyetina; y alfa-N-acetil, N-epsilon-acetilhiposialoeritropoyetina . En una modalidad, la EPO químicamente modificada de la invención es una eritropoyetina que comprende un residuo de lisina succinilado. En una modalidad, la eritropoyetina se selecciona dentro del grupo que consiste de alfa-N-succinileritropoyetina; N-epsilon-succinileritropoyetina alfa-N-succinil, N-epsilon-succinileritropoyetina; alfa-F-succinilasialoeritropoyetina; N-épsilon-succinilasialoeritropoyetina; alfa-N-succinil/ N-épsilon-succinilasialoeritropoyetina; alfa-N-succinil, N- épsilon-succinilasialoeritropoyetina; alfa-N-succinilhiposialoeritropoyetina; N-épsilon-succinil iposialoeritropoyetina y alfa-N-succinil, N-épsilon-succinilhiposialoeritropoyetina . En una modalidad, la EPO químicamente modificada de los métodos de la invención es una eritropoyetina con al menos un residuo de lisina modificado por una sal de ácido 2, 4, 6-trinitrobensensulfónico en un aspecto de la invención la sal es 2, 4, 6-trinitrobensensulfonato de sodio. En otra modalidad, la EPO químicamente modificada de los métodos de la invención es una eritropoyetina en la cual al menos un residuo de tirosina es nitrado y/o indinado. En otra modalidad, la EPO químicamente modificada de los métodos de la invención es una eritropoyetina en la cual un residuo de cido aspártico y/o ácido glutámico reacciona con una carbodiimida seguida con una amina. En un aspecto de la invención, la amina es una glicinamida. Moléculas de EPO mutantes pueden también utilizarse, por ejemplo, el ligando de complejo de receptor para cítocinas protectoras de tejido puede ser una EPO mutante, que puede ser producida recombinantemente, que comprende uno o varios residuos de aminoácidos entre las posiciones 11 a 15 de SEQ ID No. 10 (SEQ ID No.2), posición 100-108 de SEQ ID NO (SEQ ID NO:3), o posiciones 146-151 de SEQ ID NO 10 (SEQ ID NO:4) En otra modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende un residuo de aminoácido alterado en una o varias de las posiciones siguientes de SEQ ID NO: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 156 ó 161. En otra modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 con un o varios de los cambios siguientes (cada secuencia alterada ha recibido un número de identificación de secuencia separado) : una alanina en residuo 6 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 15); una alanina en residuo 7 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 16) ; una serina en residuo 7 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 17) una isoleucina en residuo 10 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 18); una serina en residuo' 11 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 19); una alanina en residuo 12 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 20); una alanina en residuo 13 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 21); una alanina en residuo 14 de SEQ ID N0-: 10 (SEQ ID NO: 22); un ácido glutámico en residuo 14 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 23); una glutamina en residuo 14 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 24); una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 25); una fenilalanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 26); una isoleucina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 27); un ácido glutámico en residuo 20 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 28); una alanina en residuo 20 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 29) ; una alanina en residuo 21 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 30) ; una lisina en residuo 24 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 31); una serina en residuo 29 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 32) ; una tirosina en residuo 29 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 33) ; una asparagina en residuo 30 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 34); una treonina en residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 35); una serina en residuo 33 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 36); una tirosina en residuo 33 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 37); una lisina en residuo" 38 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 38); una lisina en residuo 83 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 39); una asparagina en residuo 42 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 40); una alanina en residuo 42 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 41); una alanina en residuo 43 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 42); una isoleucina en residuo 44 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 43) ; un ácido aspártico en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 44); una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 45); una alanina en residuo 46 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 46); una alanina en residuo 47 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 47); una isoleucina en residuo 48 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 48) ; una alanina en residuo 48 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 49); una alanina en residuo 49 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 50); una serina en residuo 49 de 'SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 51) ; una fenilalanina en residuo 51 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 52) ; una asparagina en residuo 51 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 53); una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 54); una asparagina en residuo 59 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 55); una treonina en residuo 62 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 56) ; una serina en residuo 67 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 57); una alanina en residuo 70 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 53); una arginina en residuo 96 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 59); una alanina en residuo 97 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 60) ; una arginina en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 61); un ácido glutámico en residuo 100 de SEQ ID NO:- 10 (SEQ ID NO: 62); una alanina en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 63) ; una treonina en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 64); una alanina en residuo 101 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 65) ; una isoleucina en residuo 101 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 66) ; una alanina en residuo 102 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 67) ; una alanina en residuo 103 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 68); un ácido glutámico en residuo 103 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 69); una alanina en residuo 104 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 70); una isoleucina en residuo 104 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 71); una alanina en residuo 105 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 72); una alanina en residuo 106 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 73); una isoleucina en residuo 106 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 74) ; una alanina en residuo 107 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 75) ; una leucina en residuo 107 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 76) ; una lisina en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 77) ; una alanina en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 78) ; una serlna en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 79) ; una alanina en residuo 116 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 80) ; una alanina en residuo 126 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 81) ; una alanina en residuo 132 de SEQ ID NO: 10 ÍSEQ ID NO: 82) ; una alanina en residuo 133 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 83) ; una alanina en residuo 134 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 84) ; una alanina en residuo 140 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 85) / una isoleucina en residuo 142 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 36) ; una alanina en residuo 143 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: í 37) ; una alanina en residuo 146 de SEC ID NO: 10 (SEQ ID NO: 88) ; una lisina en residuo 147 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 39) ; una alanina en residuo 147 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 90); una tirosina en residuo 148 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 91); una alanina en residuo 148 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 92); una alanina en residuo 149 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 93); una alanina en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 94); un ácido glutámico en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 95); una alanina en residuo 151 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 96); una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 97) ; un triptófano en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 98); una alanina en residuo 153 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 99); una alanina en residuo 154 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 100); una alanina en residuo 155 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 101); una alanina en residuo 158 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 102); una seriña en residuo 160 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 103); una alanina en residuo 161 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 104); o una alanina en residuo 162 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 105) . En una modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con uno o varios de las sustituciones de residuos de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15-105 y 119. En una modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con uno o varios de las sustituciones de residuos de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15-105 y 119. En otra modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con una deleción de residuos de aminoácidos 44-49 de SEQ ID NO: 10. En otra modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con al menos uno de los cambios siguientes (cada secuencia alterada ha recibido, un número de identificación de secuencia separado) : i) un ácido aspártico en el residuo 45 y un ácido glutámico en el residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 106) ; ii) una asparagina en el residuo 30, una treonina en el residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 107); iii) un ácido aspártico en el residuo 45, un ácido glutámico en el residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 108); iv) un' ácido glutámico en residuo 103, y una serina en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 109) ; v) una alanina en residuo 140 y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 110); vi) una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 111) ; vii) una alanina en residuo 97, y una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 112) ; xiii) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 113); ix)una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 114); x) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, y una alanina en residuo 140 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 115); xi) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 154, una Usina en residuo 24, una lisina en residuo 38, una lisina en residuo 83, una lisina en residuo 24 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 116); xii) una lisina en residuo 24, una lisina en residuo 38, y una lisina en residuo 83 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 117) ; o xiii) una lisina en residuo 24 y una alanina- en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 118) . En una modalidad, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con al menos una de las sustituciones siguientes de residuos de aminoácidos de SEQ ID NOs : 106-118. El ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO mutante y puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con .al menos uno de los cambios siguientes, es decir, sustituciones, (cada cambio o combinación de cambios listado ha recibido un número de identificación de secuencia separado) : i) un ácido aspártico en residuo 45, y un ácido glutámico en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 106) ; ii) una asparagina en residuo 30, una treonina en residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 107); iii) un ácido aspártico en residuo 45, un ácido glutámico en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 108); iv) un ácido glutámico en residuo 103, y una serina en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 109); v) una alanina en residuo 140 y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 110); vi) una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 45 de >EQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 111); vii) una alanina en residuo 97, y una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 112); xiii) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 113); ix) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 114); x) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, y una alanina en residuo 140 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 115) ; xi) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 154, una lisina en 24, una lisina en residuo 83, una lisina en residuo 84, una lisina en residuo 24 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 116); xii) una lisina en residuo 24, una lisina en residuo 38, y una lisina en residuo 83 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 117); o xiii) una lisina en residuo 24 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 118) . De conformidad con otro aspecto de la invención, el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es una EPO irtutante que comprende al menos una de las sustituciones de residuos de aminoácidos siguientes: (cada cambio o combinación de cambios listado ha recibido un número identificación de secuencia separado) : un triptófano en residuo 152 de SEQ ID NO : 10 (SEQ ID NO : 19 8) i una alanina en residuo 14 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 119); una alanina en residuo 6 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 15) ; una alaniña en residuo 7 de SEQ ID NO : 10 (SEQ ID NO: 16) ; una alanina en residuo 43 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 42) ; una alanina en residuo 42 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 41) ; una alanina en residuo 48 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 49) ; una alanina en residuo 49 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 50) ; una treonina en . residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 35) ; una alanina en residuo 133 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 83) ; una alanina en residuo 134 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 84) ; una alanina en residuo 147 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 90) ; una alanina en residuo 148 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID ¦ NO: 92) ; una alanina en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 94) ; una alanina en residuo 151 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 96) ; una alanina en residuo 158 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 102) ; una . alanina en residuo 161 de SEQ ID NO : 10 (SEQ ID NO: 104); o una alanina en residuo 162 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 105) . 5.4.1.2 Anticuerpos En ciertas modalidades de la invención, el compuesto probado en los ensayos de tamizaje arriba es un anticuerpo. El ligando puede ser también un anticuerpo especifico para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en ensayos de tamizaje diseñados para identificar compuestos que modulan la interacción de un ligando conocido con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Ahí se describen métodos para la producción de tales anticuerpos. Los anticuerpos identificados pueden ser también útiles para la protección de tejido. Los anticuerpos identificados pueden ser también útiles como compuestos en los métodos para el tratamiento ó la prevención de una enfermedad, trastorno o condición . Tales anticuerpos pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, anticuerpos poli'clonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípícos (anti-Id) , y fragmento de enlace con epítopos de cualquiera de los anteriores. Tales anticuerpos pueden ser utilizados en combinación, por ejemplo, con ¦ esquemas de tamizaje de compuestos, de conformidad con lo descrito arriba, para la evaluación del efecto de compuestos de prueba sobre la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido o una actividad protectora de tejido. Para la producción de anticuerpos específicos para un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, varios animales huéspedes pueden ser inmunizados por inyección con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o una porción del mismo. Una porción antigénica de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede ser fácilmente predic a por algoritmos conocidos en la técnica. Animales huéspedes, pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, conejos, ratones y ratas, solamente para nombrar algunos. Varios adyuvantes pueden ser utilizados para incrementar la respuesta inmunológica, según la especie huésped, incluyendo sin limitarse a estos ejemplos, adyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, po ianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) , y Corynebacteríum parvum. Anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros .de animales inmunizados con un antigeno, como por ejemplo complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o un derivado funcional antigénieo del mismo. Para la producción de anticuerpos policlonales, animales huéspedes tales como los descritos arriba pueden ser inmunizados por inyección con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o I porción del mismo, complementado. con adyuvantes de conformidad con lo descrito arriba. Anticuerpos monoclonales que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antigeno particular pueden obtenerse a través de cualquier técnica que permite la producción de moléculas de anticuerpo mediante lineas de células continuas en cultivo. Incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, la técnica de ibridoma de Kohler y Milstein, (1975, Nature 256, 495-497; y Patente Norteamericana No. 4,376,110), la técnica de hibridoma de células de B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Colé et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030), y la técnica de hibridoma EBV (Colé et al., 1985, Monoclonal Antibodies and' Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. Páginas 77-96) . Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb de esta invención puede ser cultivado in vitro o in vivo. La producción de altos títulos de mAbs in vivo hace que este método sea el método de producción actualmente preferido. Además, técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) por empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada pueden emplearse. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de ¦ diferentes especies de animales, como por ejemplo las que tienen un región variable derivada de un mAb de murino y una región constante de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Cabilly et al., Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Boss et al., Patente Norteamericana No. 4,816,397, que se incorporan aqui por referencia en su totalidad) . En una modalidad adicional de la invención, anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en animales sin gérmenes (véase Publicación Internacional PCT No. WO 98/12690, publicada el 12 de diciembre de 1989) . De conformidad con la invención, anticuerpos humanos pueden ser utilizados y pueden ser obtenidos mediante la utilización de hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) o mediante la transformación de células B humanas con virus de EBV in v tro. (Colé et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss. Páginas 77-96). Técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851- 6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) por empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada pueden también utilizarse/ tales anticuerpos están dentro del alcance de la presente invención . Se proporcionan también anticuerpos humanizados (véase Patente Norteamericana No. 5,225,539 por Winter) . Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste de una región "estructura" interrumpida por tres regiones hipervariables, que se conocen como regiones determinantes de complementariedad (CDRs) . La magnitud de la región de estructura y de las CDRs han sido definidas con precisión (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., Departamento Norteamericano de Salud y Servicios Humanos (1983) ) . En resumen, anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o varias CDRs de la especie no humana y una región de estructura de una molécula de inmunoglobulina humana. Tales anticuerpos injertados con CDRs han sido exitosamente construidos contra varios antígenos, como por ejemplo anticuerpos contra antireceptores par IL-2 de conformidad con lo descrito en Queen et al. 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029, anticuerpos contra el receptor de superficie celular CAMPATH de conformidad con lo descrito en Riechmann et al., 1988, Nature 332:32; anticuerpos contra la hepatitis B en Co et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:2869, asi como contra antigenos virales del virus sincitial respiratorio en Tempest et al, 1991, Bio-Technology 9:267, anticuerpos humanizados son especialmente preferidos para uso terapéutico en humanos. Alternativamente, técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente norteamericana número 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al, 1988, Proc Nati, Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, y Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena simple específicos para un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, o porciones del mismo. Anticuerpos de cadenas simples se forman enlazando los fragmentos de cadena pesada y de cadena ligera de la región Fv a través de un puente de aminoácidos, lo que resulta en un polipéptido de cadena simple. Fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos: los fragmentos F(ab")2 que pueden ser producidos por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden ser generados mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab )2.

Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresión Fab (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. Anticuerpos para un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden, a su vez ser utilizados para generar anticuerpos antiidiotípicos que imitan el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, utilizando técnicas bien conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia (véase, por ejemplo Greenspan and Bona, 1993, FASEB J. 7(5); 437-444/ and Nissinoff, 1991, J. Immunol . 147 (8) : 2429-2438) . Por ejemplo, anticuerpos que se unen con complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y que inhiben en forma competitiva el enlace de EPO u otros ligandos conocidos con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden emplearse para generar antiidiotipos que imitan el dominio de enlace del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, y, por consiguiente, se enlazan .y neutralizan los . ligandos de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Tales antiidiotipos neutralizantes o fragmentos Fab de tales antiidiotipos pueden emplearse en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando nativo lo que puede ser seguido por la administración de un compuestos identificado por los métodos de la invención que proporciona protección tisular, que puede ser superior en comparación con la protección proporcionada por un ligando nativo. Alternativamente, anticuerpos para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido que pueden actuar como agonistas de la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden ser generados. Tales anticuerpos se enlazan con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y activan la actividad de transducción de · señales del complejo de receptor. Además, anticuerpos que actúan como antagonista de la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, es decir, inhiben la activación del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden ser útiles como control negativo en ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Métodos para ensayar tales agonistas y antagonistas se detallan con detalles en la secciones arriba . 5.4.2 caracterización de la estructura de compuestos La estructura de un compuesto de prueba identificado por lo métodos de tamizaje de la presente invención puede ser determinada a través de varios métodos conocidos por las personas expertas en la materia. Por ejemplo, se puede utilizar la cristalografía de rayos x para elucidar una estructura de un compuesto. Para una reseña de la cristalografía de rayos x, véase por ejemplo Blundell et al., 2002, Nat Rev Drug Discov 1(1) : 45-54. En ciertas modalidades, se puede utilizar espectroscopia vibracional (por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, espectroscopia infrarroja (IR), espectroscopia Raman) para elucidar la estructura de un compuesto. Un espectrómetro Raman mejorado se describe en la patente norteamericana número 5,786, 893 de Fink et al., que se incorpora aquí por referencia. La microscopía vibracional puede ser medida en forma espacialmente resuelta para enfocar perlas individuales por integración de un microscopio visible y espectrómetro. Un espectrómetro infrarrojo microscópico se describe en la patente norteamericana número 5,581,085 de Reffner et al., que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Un instrumento que efectúa simultáneamente un análisis infrarrojo microscópico y un análisis Raman microscópico en una muestra se describe en la patente norteamericana número 5,841,139 de Sostek et al., que se incorpora por referencia en su totalidad. En una modalidad del método compuestos son sintetizados en perlas de poliestireno dopadas con monómeros de estireno químicamente modificados de tal manera que cada perla resultante tenga un patrón característico de líneas de absorción en el espectro vibracional (IR o Raman) a través de métodos que incluyen sin limitarse a estos ejemplos, los métodos descritos por Fenniri et al., 2000, J. Am. Chem. Soc. 123.8151-8152. Mediante la utilización de métodos de síntesis de división-agrupamiento, familiares de una persona con conocimientos en la materia se prepara la biblioteca de compuestos de tal manera que el patrón espectroscópico de la perla identifique uno de los componentes del compuestos en la perla. Perlas que han sido separadas de conformidad con su capacidad para unirse a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido pueden ser identificadas por su espectro vibracional. La espectrometría de masa (por ejemplo ionización por electrorociado ( ESI") y deserción-ionización láser asistida por matriz ("MALDI") resonancia de ciclotrón iónico de transformación de Fourier ("FT-ICR") pueden utilizarse tanto para tamizaje de alto desempeño de compuestos que se unen a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido como para elucidar la estructura del compuesto. MALDI utiliza un láser pulsado para deserción de los iones y un analizador de tiempo de vuelo, y ha sido utilizado para la detección de complejos no covalente tRNA:amino-acil-tRA sintetasa (Gruic-Sovulj et al., 1997, J. Biol Chem. 272:32084-32091). Sin embargo, la reticulación covalente entre el ácido nucleico blanco y el compuesto se requiere habitualmente para detección, puesto que un complejo unido no covalentemente puede disociarse durante el proceso MALDI.

La espectrometría de masa ESI ("KSI-MS") ha sido de mayor utilidad para estudiar las interacciones moleculares no covalentes puesto que a diferencia del proceso MALDI, la ESI-MS genera iones moleculares con poca o ninguna fragmentación (Xavier et al., 2000, Trenes Biotechnol. 18 (8) : 349-356) . ESI-MS ha sido utilizada para estudiar los complejos formados por el péptido Tat de VIH y proteina con el ARN de TAR (Sannes-Lowery et al., 1997, Anal. Chem. 69:5130-5135). La espectrometría de masa de resonancia de ciclotrón iónico de transformación de. Fourier ("FT-ICR") ofrece espectros de alta resolución, selección de iones precursores resueltos por isótopos, y asignaciones precisas de masas (Xavier et al., 2000, Trenes Biotechnol, 18 (8) : 349-356) . FT-ICR ha sido utilizada para estudiar la interacción de antibióticos de aminoglicósidos con AR s homólogos y no homólogos (Hofstadler et al., 1999, Anal. Chem. 71:3436-3440; Griffey et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 96:10129-10133). Como es cierto para todos los métodos de espectrometría de masa comentados aquí la FT-ICR no requiere del etiquetado del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido ni de compuesto. Una ventaja de la espectroscopia de masa es no solamente la elucidación de la estructura de un compuesto sino también la determinación de la estructura del compuesto unido a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido.

Dicha información puede permitir el descubrimiento de una estructura de consenso de un compuesto que se une específicamente a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Métodos de espectroscopia MR pueden también ser utilizados para caracterizar compuestos que se asocian con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. Por ejemplo, moléculas que forman complejos pueden ser examinadas mediante la determinación cualitativa de cambios en desplazamiento químico, específicamente desde distancias medidas empleando efectos de relajación y enfoques basados en NMR han sido utilizados en la identificación de aglomerantes de mo-léculas pequeñas de blancos de fármaco de proteínas (Xavier et al., 2000, Trenes Biotechnol. 18 (8¡ : 349-356) . La determinación de las relaciones de estructura-actividad ("SAR") por NMR es el primer método para NMR descrito en el cual pequeñas moléculas que se unen a subsidios adyacentes son identificadas por espectros H-3N bidimensionales de la proteína blanco (Shuker et al., 1996, Science 274:1531-1534). La señal de la molécula unida es monitoreada mediante el empleo de ensanchamiento de línea, NOEs transferidos y mediciones de difusión de gradiente de campo pulsado (Moore, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10:54-58). Una estrategia de generación por NMR utilizando una biblioteca de moléculas pequeñas ha sido pequeñas ha sido descrita recientemente (Feazo et al., 1999, Chem. Biol. 6:755-769). Otros ejemplos de métodos NMR pueden ser utilizados para la invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, métodos NMR unidimensionales, bidimensionales, tridimensionales, cuatridimensionales, asi como espectroscopia de correlación ("COSY") y espectroscopia de efecto Overhauser nuclear ("NOE") . Tales métodos de determinación de estructura de compuestos son bien conocidos por parte de una persona con experiencia en la materia. Es similar a la espectroscopia de masa, una ventaja de NMR es la elucidación no solamente de la estructura de un compuesto, sino también la determinación de la estructura del compuesto unido a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 5.5. USO TERAPÉUTICO üna persona con conocimientos ordinarios en la materia reconocerá que compuestos identificados por los presentes ensayos, son útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o la prevención de varias enfermedades, trastorno, y condiciones. Una persona con conocimientos en la materia reconocerá también que -tales compuestos pueden ser utilizados para lograr la modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. En ciertas modalidades de la invención, la modulación de la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede lograrse a través de un compuesto que mejora o inhibe la interacción del complejo con ligando del complejo. Se pueden utilizar tanto técnicas in vi tro como in vivo para evaluar las indicaciones terapéuticas de, por ejemplo, los compuestos identificados por los ensayos de la presente invención divulgados arriba, se divulgan en la Solicitud de PCT No. PCT/US01/49479, Solicitud de Patentes Norteamericanas Nos. 10/188,905 y 10/185,841, que se incorporan aquí por referencia. Los compuestos mencionados arriba identificados por los métodos de la invención pueden ser útiles en general para la prevención, tratamiento terapéutico, o tratamiento profiláctico de enfermedades o trastornos humanos del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico que tiene síntomas primariamente neurológicos o psiquiátricos, enfermedades oftálmicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades cardiopulmonares, enfermedades, respiratorias, enfermedades renales, urinarias y del sistema reproductivo, enfermedades óseas, enfermedades cutáneas, enfermedades gastrointestinales y anormalidades endocrinas y metabólicas . Ejemplos de uso incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, la protección contra lesión y reparación de lesión que resultan de trauma e inflamación resultante al cerebro (embolia isquémica, trauma por golpes, hemorragia subaracnoide) , médula espinal (isquemia, trauma por golpe) , nervios periféricos (lesión al nervio ciático, neuropatía diabética, síndrome del túnel de carpió) , retinal (edema macular) , y del corazón (infarto al miocardio, insuficiencia cardiaca crónica) . En particular, tales enfermedades, trastornos y condiciones incluyen condiciones hipóxicas que afectan negativamente los tejidos excitables tales como tejidos excitables del sistema neuro-central, tejido del sistema neuro-periférico, o tejido cardiaco o retinal, por ejemplo cerebro, corazón, o retina/ojo. Por consiguiente, científicos con los métodos de investigación para ser utilizados para tratar o prevenir el daño en tejido excitable que resulte de condiciones hipóxicas en varias condiciones y circunstancias . Ejemplos no limitativos de tales condiciones y circunstancias se proporcionan en la tabla que se ofrece a continuación. En el ejemplo de la protección de patologías de tejido neuronal tratables y prevenibles utilizando compuestos identificables por los métodos de la invención, tales patologías son problemas que resultan de una oxigenación reducida de tejidos neuronales. Cualquier condición que reduzca la disponibilidad de oxigeno para el tejido neuronal, resultan en estrés y finalmente muerte de la célula neuronal puede ser tratada utilizando compuestos identificados por los métodos de la presente invención. Generalmente conocidas como hipoxia y/o isquemia, estas condiciones surgen de los eventos siguientes o incluyen dichos eventos, pero sin limitarse a ellos, embolia, oclusión vascular privación prenatal o postnatal de oxigeno, sofocación, asfixia, casi ahogamiento, envenenamiento con monóxido de carbono, inhalación de humo, trauma, incluyendo intervención quirúrgica y radioterapia, asfixia, epilepsia, hipoglucemia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, síndrome de depresión respiratoria en adultos, choque hipotensivo, choque séptico, choque anafiláctico, choque de insulina, crisis de células falciformes, paro cardiaco, disritimia narcosis por nitrógeno, y déficit neurologicos causados por procedimientos de desvío cardiaco-pulmonar. En una modalidad, por ejemplo, los compuestos identificados por los métodos de la presente invención identificados utilizando el ensayo de la presente invención pueden administrarse solo o como parte de una composición para evitar lesión o daño tisular como resultado de riesgo de lesión o daño- tisular antes, durante, o después de un procedimiento quirúrgico o un procedimiento médico. Por ejemplo, procedimientos quirúrgicos pueden incluir resección tumoral o reparación de aneurisma, procedimientos médicos tales como quimioterapia, y procedimiento naturales tales como parto. Otras patologías causadas por hipoglicemia o que resultan de hipoglicemia que pueden ser tratadas utilizando los componentes identificados por los métodos de la presente invención incluyen sobredosis de insulina que se conoce también como hiperinsulinemia iatrogénica, insulinoma, deficiencia de hormona de crecimiento, hipocortisolismo, sobredosis de fármaco, y ciertos tumores. Otras patologías que resultan de un daño a tejido neuronal excitable incluyen trastornos de tipo ataques, como por ejemplo epilepsia, convulsiones, o bien trastornos de ataques crónicos. Otras condiciones tratables y enfermedades que pueden ser tratadas incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, enfermedades tales como embolia, esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardiaco, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis cerebral, trauma cerebral o trauma de la médula espinal, demencia" or SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos por ataques, alcoholismo, isquemia retinal, daño al nervio óptico que resulta de glaucoma, y pérdida neuronal. Dos compuestos específicos identificados por los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para tratar o prevenir inflamación resultante de condiciones de enfermedad o varios traumas como por ejemplo inflamación inducida física o químicamente. Tales traumas pueden incluir angitis, bronquitis crónica, pancreatitis, osteomielitis, artritis reumatoide, glomerulonefritis , neuritis óptica, arteritis temporal, encefalitis, meningitis, mielitis transversa, dermatomiositis, polimiositis, fascilitis necrotizante, hepatitis, y enterocolitis necrotizante. Los compuestos identificados por los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para tratar o prevenir condiciones de tejido retina o daño al tejido retinal. Tales padecimientos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, isquemia retinal, degeneración macular, desprendimiento de retina, retinitis pigmentosa, retinopatia arteriosclerótica, retinopatía hipertensiva, bloqueo de arteria retinal, bloqueo de vena retina, hipotensión y retinopatia diabética. En otra modalidad, los compuestos identificados por los métodos de la presente invención y principios de la invención pueden ser utilizados para prevenir o tratar una lesión que resulte de daño por radiación a un tejido excitable. Una utilidad de los compuestos identificados por los métodos de la presente invención se encuentra en el. tratamiento de envenenamiento por neurotoxinas como por ejemplo envenenamiento por mariscos con ácido domoico, neurolatirismo, y enfermedad de Guam, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Parkinson. De conformidad con lo mencionado arriba, la presente invención se enfoca también a compuestos identificados por los métodos de la presente invención para su uso en la mejora de la función de tejido excitable en un mamífero por administración periférica de una citocina protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba. Varias enfermedades y condiciones se presentan a tratamiento utilizando este método y además este método es útil para mejorar la función cognitiva en ausencia de condiciones o enfermedad. Estos usos de la presente invención se describen con detalles adicionales abajo e incluyen la mejora del aprendizaje y la capacitación en mamíferos humanos y en mamíferos no humanos . Condiciones y enfermedades que pueden ser tratadas o prevenidas utilizando compuestos identificados por los métodos de la presente invención dirigidos al sistema nervioso central incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, trastornos del humor, trastornos de ansiedad, depresión, autismo, trastorno de hiperactividad con déficit de atención, y dísfunción cognitiva. Estas condiciones se benefician del incremento de la función neuronal. Otros trastornos- que pueden ser tratados de conformidad con las enseñanzas de la presente invención incluyen perturbación del sueño, por ejemplo, apnea del sueño, y trastornos relacionados con el viaje; sangrados subaracnoides y por aneurismas, choque hipotensivo, lesión de tipo contusión, choque séptico, choque anafiláctico y secuelas de varias encefalitis y meningitis, por ejemplo cerebritis relacionadas con enfermedad de tejido conectivo como por ejemplo lupus. Otros usos incluyen la prevención o la protección contra envenenamiento por neurotoxinas, como por ejemplo envenenamiento por mariscos con ácido domoico, neurolatirismo y enfermedad de Guam, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson; tratamiento post-operatorio para lesión embolica o isquémica, irradiación de cerebro entero, crisis de células falciformes; y eclampsia. Un grupo adicional de condiciones que pueden ser tratadas o prevenidas utilizan compuestos identificador por los métodos de la presente invención incluyen disfunción mitocondrial de naturaleza hereditaria o de naturaleza adquirida que son la causa de varias enfermedades neurológicas tipificadas por lesión neuronal y muerte. Por ejemplo, la enfermedad de Liegh (encefalopatía necrotizante subaguda) sé caracteriza por una pérdida progresiva de la vista y encefalopatía, debido a una baja neuronal y miopatía. En estos casos, el metabolismo mitocondrial defectuoso no alcanza a suministrar substratos con alto contenido de energía para alimentar el metabolismo de células excitables. Un modulador de la actividad de receptor para eritropoyetina optimiza la función deficiente en varias enfermedades mitocondriales . Como se mencionó arriba, condiciones hipóxicas afectan negativamente los tejidos excitables. Los tejidos excitables incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, tejido del sistema nervioso central, tejido del sistema nervioso periférico, y tejido cardiaco. Además de las condiciones descritas arriba, los compuestos identificados por los métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de envenenamiento por inhalación como por ejemplo monóxido de carbono e inhalación de humo," asma severa, síndrome de depresión respiratoria de los adultos, y asfixia y casi ahogamiento. Condiciones adicionales que crean condiciones hipóxicas o que inducen daños al tejido excitable por otros medios incluyen hipoglicemia que puede ocurrir en una administración inapropiada de insulina, o bien con neoplasmas productores de insulina (insulinoma)¾ . Varios trastornos neuropsicológicos los cuales se creen se originan a partir de daño al tejido excitable son tratables utilizando compuestos identificados por los métodos de la presente invención. Trastornos crónicos en los cuales participa el daño neuronal y para los cuales se proporciona tratamiento o prevención a través de la presente invención incluyen trastornos que se relacionan con el sistema nervioso central y/o sistema nervioso periférico incluyendo enfermedad de la función cognitiva relacionada con la edad y demencia senil, trastornos de ataques crónicos, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia, pérdida de memoria, esclerosis amiotrófica lateral, esclerosis múltiple, esclerosis tuberosa, enfermedad de ilson, parálisis cerebral y supranuclear progresiva, enfermedad de Guam, demencia de cuerpo de Lewy, enfermedades causadas por priones, como por ejemplo encefalopatías espongiformes, por ejemplo enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington, distrofia miotónica, ataxia de Fiedrich y otras ataxias, así como síndrome de Gilíes de la Tourette, trastornos de ataques tales como epilepsia y trastorno de ataques crónicos, embolia, trauma cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, alcoholismo, autismo, isquemia retinal, glaucoma, trastornos de la función autonómica tales como hipertensión y trastorno del sueño así como padecimientos neuropsiquiátricos que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, esquizofrenia, trastornos esquizoafectivos, trastorno de déficit de atención, trastorno distímico, trastorno depresivo mayor, manía, trastorno obsesivo-compulsivo, trastornos por uso de sustancias psicoactivas, ansiedad, trastorno de pánico, así como trastornos unipolares y bipolares. Trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos adicionales incluyen, por ejemplo, los listados en el manual de Diagnóstico y Estadísticas de Trastornos Mentales (DSM) de la American Psychiatric Association, cuya versión más actualizada se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad, moléculas de toxinas quiméricas recombinantes que comprenden eritropoyetina pueden emplearse para la administración terapéutica de toxinas para tratar o prevenir un trastorno de la proliferación, como por ejemplo cáncer o un trastorno viral, como por ejemplo panencefalitis esclerosante subaguda. La tabla siguiente muestra una lista de indicaciones no limitativas, de ejemplo, adicionales en cuanto a las varias condiciones y enfermedades que pueden ser manejadas por el tratamiento por las citocinas protectoras de . tejido mencionadas arriba.

Célula, Disfunción o Condición o Tipo 1 tejido u patología enfermedad - órgano Corazón Isquemia Enfermedad de Aguda, crónica, arteria estable, coronaria inestable Infarto de Síndrome de miocardio Dressler Angina Enfermedad Cardiomiopatia cardiaca . valvular congénita Angina de Prinzmetal Ruptura Perforación cardiaca séptica aneurismática Angitis Arritmia Taquiarritmia, Estable, bradiarritmia inestable, supra- Nodo de seno de ventricular, carótida anorma1idades hipersensib1e de la conducción ventricular Insuficiencia Izquierda, Cardiomiopatias cardiaca derecha, bi- , como por congestiva ventricular, ejemplo sistólica, enfermedades diastólica idiopáticas familiares, infecciosas, metabólicas, de almacenamiento , deficiencias, trastorno de tej ido conectivo, infiltración y granulomas, neurovascul r Miocarditis Autoinmune, infecciosa, idiopática Cor pulmonar Trauma por golpes y trauma penetrante Toxinas Toxicidad por cocaína Vascular Hipertensión Primaria, secundaria Enfermedad de descompresión Hiperplasia fibromuscular Aneurisma Disección, roto, ampliado Pulmones Enfermedad Asma, obstructiva bronquitis crónica, enfisema y obstrucción de las vías respiratorias Enfermedad Embolia , pulmonar pulmonar, isquémica trombosis pulmonar , embolia grasa Enfermedades pulmonares ambientales Enfermedad Embolia pulmonar pulmonar, isquémica trombosis pulmonar Enfermedad Fibrosis pulmonar pulmonar intersticial idiopática Congénita Fibrosis cística Cor pulmonar Trauma Neumonía y Infecciosas, pneumonitis parásitas, tóxicas, traumáticas, quemaduras, aspiración Páncreas Sarcoidosis Endocrino Diabetes Insuficiencia mellitus, tipo de células I y II beta, disfunción, • Neuropatía diabética Otras insuficiencias de células endocrinas del páncreas Exocrino Insuficiencia Pancreatitis pancreática exocrina Hueso Osteopenia Primaria Hipogonadismo Secundaria Inmovilización Hiperparatiroid ismo relacionado con la edad post- menopáusico, hipertiroidismo , deficiencia de calcio, magnesio, fósforo y/o vitamina D Osteomielitis Necrosis avascular Trauma Enfermedad de Paget Piel , Alopecia Areata total Primaria, secundaria, alopecia de patrón masculino Vitíligo Localizado Primario Generalizado Secundario Ulceración diabética Enfermedad vascular periférica Lesiones por quemaduras Trastornos Lupus autoinmunes eritematosis, Sj iogren, artritis reumatoide, glomerulonefr itis, angitis Histiocitosis de Langerhans Ojo Neuritis óptica Lesiones por golpes y lésiones penetrantes, infecciones, sarcoide, enfermedad falciforme C, desprendimien to de retina, arteritis temporal Isquemia retínal, Degeneración macular, retinitis pigmentosa, retinopatía arterioscleró tica, retinopatia hipertensiva, bloqueo de arteria retinal, bloqueo de vena retinal, hipotensión, retinopatia diabética y edema macular Trastornos Asfixia erabriónicos Isquemia y fetales Sistema Síndrome de nervioso fatiga central crónica, síndromes hipoosmolares e hiperosmolare s agudos y crónicos, - demencia por SIDA, electrocución Encefalitis Rabia, herpes Meningitis Hematoma subdural Adicción a la nicotina Abuso de Abuso de droga y cocaína, retiro heroína, crack, marihuana, LSD, PCP, de drogas múltiples, ! éxtasis, opioides,- sedantes hipnóticos, anfetaminas, cafeína Trastornos obsesivos- compulsivos Estenosis - espinal, mielitis transversa, Guillian Barre, compresión de raíz nerviosa, compresión tumoral, insolación, tinitus, síndrome de Meuniere ENT Pérdida de oído Lesión traumática, barotraumas Riñon Insuficiencia Aguda, crónica Enfermedad renal intersticial, vascular/ isquémica, enfermedad renal diabética, síndromes nefróticos, infecciones, lesión, inducida por contraste, inducida por quimioterapia, inducida por CPB o preventiva Henoch S . Púrpura Músculo Trastornos Miastenia estriado autoinmunes grave, dermatomiositis , polimiositis Miopatías Metabólicas heredadas, endocrinas y tóxicas Insolación Lesión por aplastamiento Rabdorailosis Enfermedad mitocondrial Infección Fascitis necrotizante Disfunción Central y Impotencia sexual periférica secundaria a (por ejemplo medicación, disfunción (diabetes) eréctil) Hígado Hepatitis Viral, bacteriana, parásita Enfermedad isquémica Cirrosis, hígado graso Enfermedades infiltrantes/ metabólicas Gastrointest Enfermedad inal iiitestinal isquémica Enfe medad intestinal inflamatoria Enterocolitis necrotizante Transplante Tratamiento de órgano de donador y receptor Tracto Infertilidad Vascular, reproductivo Autoinmune, Anormalidades uterinas, Trastornos de implantación Endocrino Hiperfunción e hipofunción glandular De conformidad con lo mencionado arriba, estas enfermedades, trastornos o condiciones son simplemente ilustrativas del rango de beneficios proporcionados por · los compuestos identificados por los métodos de la presente invención. Por consiguiente, esta invención ofrece en términos generales un tratamiento preventivo, terapéutico, o profiláctico de las consecuencias de trauma mecánico o de enfermedades humanas. La prevención o el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o condiciones del sistema nervioso central y/o sistema nervioso periférico se contemplan. Se proporciona la prevención o el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o condiciones que tienen un componente psiquiátrico. Se proporciona la prevención o el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o condiciones que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, los que presentan un componente oftálmico, cardiovascular, cardiopulmonar, respiratorio, renal, urinario, reproductivo, gastrointestinal, endocrino o metabólico. En una modalidad, dicha composición farmacéutica que comprende un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, puede administrarse sistémicamente para proteger o mejorar las células, tejidos u órganos blanco. Dicha administración puede ser parenteral, por inhalación o transiuucosal, como por ejemplo, oral, nasal, rectal, intravaginal, sublingual, submucosal, o transdérmica . Preferentemente, la administración es parenteral, como por ejemplo, a través de inyección intravenosa o intraperitoneal, e incluye también, sin limitarse a estos ejemplos, la administración intraarterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea. La selección de la dosis efectiva preferida o cantidad efectiva preferida de un compuesto se determinará fácilmente por parte de una persona con conocimientos en la materia con base en la consideración de varios factores que son conocidos de una persona con experiencia en la materia. Tales factores incluyen, la forma particular de la. eritropoyetina y/o compuestos identificados por los métodos de la presente invención, y los parámetros farmacocinéticos tales como biodisponibilidad, metabolismo, vida media, etc., que serán establecidos durante los procedimientos de desarrollo habituales típicamente empleados en la obtención de la aprobación regulatoria para un compuesto farmacéutico. Factores adicionales cuando se considera la dosis incluyen la condición o enfermedad a tratar o en beneficio a lograr en un individuo normal, la masa corporal del paciente, la vía de administración, si la administración es aguda o crónica, medicaciones concomitantes y otros factores bien conocidos que afectan la eficacia de los agentes farmacéuticos administrados. Asi, la dosificación precisa será decidida según el criterio del médico y las circunstancias individuales de cada paciente, por ejemplo, según la condición y el estado inmune del paciente individual, y según las técnicas clínicas estándares. La presente invención se entenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos que se proporcionan como ejemplos de la invención. Los ejemplos siguientes se presentan con el objeto de ilustrar más completamente las modalidades preferidas de la invención. No se consideran de ninguna manera sin embargo como limitativos del alcance amplio de la invención. 6. EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1: BIOENSAYO DE EPO COMPETITIVO El ensayo de enlace competitivo descrito abajo fue efectuado para determinar si EPO carbamilada se une a EPO-R. Células UT-7 que expresan EPO-R fueron utilizadas para determinar si EPO carbamilada inhibe competitivamente el enlace de rhEPO con EPO-R. Con el enlace de rhEPO con EPO-R, las células presentaron proliferación. La inhibición de la proliferación es una indicación del enlace competitivo. Métodos Para el propósito del ensayo de enlace competitivo, células eritroleucémicas UT-7 ( omatsu, N. et al., 1991, Cáncer Res., 51:341-8) fueron obtenidas de DSMZ (Braunschweig, Alemania, ACC137) . Los ensayos de la EPO carbamilada y rhEPO fueron efectuados de conformidad con lo descrito en Leveque et al. (1996, Hematol Oncol 14 : 137-46) durante 48 horas. Una reducción WST-1 (Roche #1 644 807) fue utilizado para cuantificar las células vivas. La proporción entre señal y ruido del ensayo fue 8-15, y la concentración efectiva semi-máxima de EPO carbamilada y rhEPO fue determinada a través de un ajuste de cuairo parámetros a partir de las curvas de respuesta a concentración utilizando al menos 6 concentraciones de fármaco. En este ensayo particular, los ensayos fueron efectuados con rhEPO, después separadamente con EPO carbamilada, y después el ensayo fue efectuado tanto con rhEPO como con EPO carbamilada. Los resultados muestran que la proliferación celular fue 0.6 vez y 1.7 veces mayor, respectivamente, cuando se administró rhEPO así como cuando se incorporaron en el ensayo tanto EPO carbamilada como rhEPO. EPO carbamilada sola no demostró efectos sobre la proliferación celular aún cuando se utilizó en concentraciones incrementadas . La Figura 1 muestra la concentración del compuesto de prueba (rhEPO y EPO carbamilada) en el eje x, graficado contra la proliferación de células en el eje y. La Figura 1 muestra claramente que la presencia de EPO carbamilada no tiene un impacto sobre la capacidad de rhEPO para estimular la proliferación de células UT-7 dentro del ensayo, puesto que el ensayo competitivo tanto con EPO carbamilada como con rhEPO no presentó una disminución de la proliferación celular . Estos resultados sugieren que la EPO carbamilada no se une al complejo de dímeros EPO-R clásico presente en células UT-7. 6.2. EJEMPLO 2: WESTERN BLOT DE MEMBRANA CEREBRAL DE RATA Células cerebrales de rata responden a EPO. Proteínas de membrana de células cerebrales de rata fueron aisladas para determinar si estas células que responden a EPO expresan ya sea el receptor o el receptor p asociado con componente de receptor específico para IL-3. Métodos Se aislaron proteínas de membrana de" rata utilizando el protocolo siguiente. Cerebro de rata fue homogeneizado en PBS que contenía inhibidores de' proteasa (25 µg/ml de Leupeptina (5 mg/ml en solución madre), 10 µg/ml de aprotina (1 mg/ml en solución madre) , PMSF 1 mM (100 mM en solución madre) 20X- El tejido homogeneizado fue después centrifugado a 3,800 rpm durante 5 minutos a 4°C. el sobrenadante es después recogido y centrifugado adicionalmente a 14, 000 rpm durante 30 minutos a 4°C. la pella resultante de la centrifugación es después homogeneizada en PBS que contiene el inhibidor de proteasa Tritón X-100 al 1%. Este homogenado es después centrifugado adicionalmente a 14,000 rpm durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante contiene las proteínas de membrana.

Las proteínas de membrana fueron separadas por electroforesxs en gel . Las proteínas de membrana fueron bloqueadas durante la noche con IX caseína (Vector 10X Casein Sol-, número de catálogo SP-5020) a 4°C. Utilizando un kit de bloqueo de avidina/biotina Vector número de catálogo SP-2001), se generaron los bloques de avidina y biotina. Un bloque de avidina es generado mediante la adición de dos gotas de avidita por 10 mi de IX PBS-Tween-20 al 0.1%/1X caseína durante 20 minutos, enjuagando el bloque brevemente y después lavando el bloque con IX PBS-Tween-20 al 0.1%/1X caseína durante 10 minutos. Un bloque de biotina fue generado de manera similar mediante la adición de dos gotas de biotina por 10 mi de IX PBS-Tween-20 al 0.1%/1X caseína durante 20 minutos, enjuagando el bloque brevemente, y después lavando el bloque con lX-PBS-Tween-20 al 0.1%/1X caseína durante 10 minutos. El anticuerpo primario (unidad beta común K-17 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, C.A.) dilución 1:200) fue incubado durante una hora a temperatura ambiente. Los bloques fueron después lavados cuatro veces durante 10 minutos cada vez con IX PBS-Tween-20 al 0.1%/1X caseína. Una incubación secundaria a partir del kit VECTASTAIN ABC (IgG de Conejo Peroxidasa con número de catálogo: P -4001) en una dilución 1:1000 (una gota en 60 mi de IX PBS-Tween-20 al 0.1%/lX. caseína) se llevó a cabo durante una hora a temperatura ambiente. El bloque fue después lavado tres veces durante 10 minutos cada vez con lX-PBS-T een-20 al 0.1%. Durante el lavo el reactivo AB fue preparado en IX PBS-Tween-20 al 0.1%: dos gotas de reactivo A del kit en 10 mi IX PBS-Tween-20 al 0.1%, mezcle bien, dos gotas de reactivo B, mezcle bien, e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejo. Las membranas fueron después incubadas durante treinta minutos a temperatura ambiente, después lavadas tres veces durante 10 minutos en cada caso con IX PBS-Tween-20 al 0.1%. La solución de sustrato del Kit de sustrato de peroxidasa Vector DAB en agua destilada fue preparada (dos gotas de solución madre de amortiguador agregadas a 10 mi de agua destilada, mezcladas, 4 gotas de solución madre de AB mezclada, dos gotas de solución de peróxido de hidrógeno mezcladas) justo antes de agregar a los blots. El blot con la sustancia fue después incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos o hasta el revelado del color. Los blots fueron después lavados con dos cambios de agua destilada. Este procedimiento fue también repetido utilizando un anticuerpo primario para la subunidad especifica para IL-3 (T-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) . Los resultados indicaron que tanto el receptor ßa como el receptor ßa especifico para IL-3 fueron identificados en membranas de células de cerebro de rata.

La figura 2 muestra fotografías de geles de poliacrilamida de las proteínas de membrana separadas. El primer gel muestra una proteína de 130 KD que corresponde al receptor 0. El segundo gel muestra una proteína de 70 KD que corresponde a la forma del receptor pc específica para la proteína de receptor IL-3. Los resultados demuestran claramente la presencia del receptor ßa (banda a 130 KD) en una célula que responde a la eritropoyetina (cerebro) . Este hallazgo sugiere que un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido puede formarse en membranas de células de cerebro, puesto que tanto receptores para EPO como receptores ß? están presentes en las membranas. 6.3 Ejemplo 3: inmunohistoquímica para -receptor ßa en médula espinal de rata Una sección de médula espinal de rata fue teñida con el objeto de probar la presencia de receptores ßa. Métodos La médula espinal de una rata fue removida y fijada en parafina. El tejido integrado fue después seccionado (6 um) . La sección de la médula espinal fue después teñida utilizando anticuerpo anti receptor ß0 (K-17, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) . La figura 3 muestra una fotografía de la médula espinal seccionada teñida para receptor ße utilizando anticuerpo antireceptor ßa. La tinción indica que el receptor ßa está presente dentro de la médula espinal. La figura 4 muestra una fotografía de un acercamiento de las áreas teñidas de la médula espinal seccionada que demuestra la reactividad del anticuerpo antireceptor c. Este hallazgo sugiere la presencia de complejos de receptor para citocinas protectoras de tejido en tejido de la médula espinal, puesto que receptores y receptores EPO están presentes en estos tejidos. 6.4 Ejemplo 4: coprecipitación de EPO-R y receptor ßG Para determinar si el receptor para EPO y el receptor ß€ están asociados entre' ellos en células, se utilizaron anticuerpos para receptores con el objeto de coprecipitar complejos a partir de células que expresan ambos receptores. Proteínas de membrana a partir de células P-19 fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida y se efectuaron Western blots para teñir receptor para EPO y receptor ß~. Métodos La inmunoprecipitación de EPO-R y receptor ßa a partir de las células P-19, células de carcinoma eiabriónico de tipo neural, se efectuó de conformidad con el protocolo presentado en Jubinsky et al., 1997 (Blood 90:1867-1873). Se utilizaron anticuerpos específicos para el receptor de conformidad con lo descrito arriba en la sección 6.3. Inmunoprecipitados fueron después colocados en un gel de poliacrilamida y transferidos por Western y teñidos empleando anticuerpos específicos para receptores para EPO y receptores pc. La figura 5 muestra un Western blot de las muestras co-inmunoprecipitadas con anticuerpos anti EPO-R y anticuerpos antireceptor pc. El carril 1 muestra los resultados de la inmunoprecipitación del EPO-R en ausencia de EPO en un Western blot con el anticuerpo antireceptor ß^ (arriba) y el anticuerpo anti EPO-R (parte inferior) . Una banda que representa el receptor puede observarse claramente en el gel (la flecha que apunta hacia la banda apropiada, parte superior) . La flecha en el gel superior, teñido con anticuerpo antireceptor ß?, indica la' posición en donde migran los receptores para EPO si están presentes en la muestra. El carril 2 muestra los resultados de la inmunoprecipitación de la EPO-R en presencia de EPO en un Western blot con el anticuerpo antireceptor ß0 (parte superior) y el anticuerpo anti EPO-R (parte inferior) . El carril 3 muestra la inmunoprecipitación reversa, la banda (parte inferior) indica la presencia de EPO-R en la muestra inmunoprecipitada utilizando el anticuerpo antireceptor ß=. La primer flecha en el gel de fondo, teñido con anticuerpo anti EPO-R apunta a una banda aproximadamente 103 KD que fue identificada con nucleolina (véase ejemplo 10, abajo) . La segunda flecha en el gel de fondo, teñido con anticuerpo anti EPO-R apunta a una banda que se encuentra a aproximadamente 66 D que fue identificada como receptor para EPO (véase ejemplo 10, abajo) . Los resultados sugieren que EPO-R y el receptor ßa forman un complejo en células en donde ambos receptores están expresados. Finalmente, complejos fueron formados EPO este presente o no (compare el carril 1 con el carril 2) , lo que sugiere que EPO no es necesario para la formación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 6.5 Ejemplo 5: apoptosis en cardiomiocitos con y sin receptor La apoptosis en cardiomiocitos fue inducida en cardiomiocitos de tipo silvestre provenientes de ratones normales y en cardiomiocitos de ratones noqueados en cuanto a cadena ß0 (-/-) para determinar si los receptores ßa desempeñaban una función en la actividad protectora de EPO sobre células para provenir o retardar la apoptosis . Cardiomiocitos fueron aislados ya sea de C57BL/6-129SV de tipo silvestre o ratones ße noqueados en cuanto a cadena beta común (-/-) de cepas correspondientes (Robb et al., 1995, P.N.A.S. U.S.A. 92:9565-9569) de conformidad con lo descrito (Fiordaliso et al., 2001, Diabetes 50:2363-2375). Se indujo la muerte de células apoptóticas mediante incubación en estaurosporina (Sigma, 0.1 uM) en presencia o ausencia de eritropoyetina (100 ng/ml) . Células de cardiomiocitos de tipo silvestre y ß0 (-/-) sirvieron como control (columnas 1 y 2 de la figura 7) en donde la apoptosis no fue inducida. La apoptosis fue inducida en células de cardiomiocitos de tipo silvestre y ße (-/-) (columnas 3 y 4 de la figura 7), células de cardiomiocitos de tipo silvestre en presencia de EPO o EPO carbamilada (columnas 5 y 6 de la figura 7) y células de cardiomiocito ß0 (-/-) en presencia de EPO (columna 7 de la figura 7) . Después de 16 horas de incubación, células fueron fijadas y procesadas para la detección in situ de ADN fragmentada empleando TUNEL (Roche Diagnostics) . Los resultados se presentan en la figura 7, que muestran el porcentaje de apoptosis (eje Y) en cardiomiocitos aislados de ratones normales y ratones noqueados en cuanto a receptor ß en presencia y ausencia de EPO (columnas 3-7) . El porcentaje de apoptosis para células de cardiomiocitos ß= (-/-) en donde la apoptosis fue inducida en presencia de EPO (columna 7) no fue significativamente diferente de la apoptosis porcentual en células de cardiomiocitos de tipo silvestre y , ß0 (-/-) en ausencia de EPO (véase columnas 3 y 4) . Los resultados sugieren que la actividad protectora de tejido de EPO depende de la presencia de un receptor ß0 en estas células . 6.6 ejemplo 6: activación de quinasa corriente abajo a través del receptor para EPO Para determinar si EPO y EPO carbamilada de varias concentraciones pudieron inducir una actividad quinasa corriente abajo en células que expresaban receptor para EPO, células que expresan el receptor para EPO fueron examinadas para determinar la presencia de una actividad quinasa Jak2 fosforilada en presencia de EPO y EPO carbamilada Métodos Células BaF/3/EP0R fueron estimuladas durante 10 minutos con EPO o EPO carbamilada en concentraciones diferentes. La activación de Jak2 fue analizada por Western blot de Usados de células empleando un anticuerpo que reconoce Jak2 fosforilado con tirosina (PY-Jak2) . Membranas fueron agotadas y probadas de nuevo con un anticuerpo Jak2 para confirmar una carga igual. La figura 8 muestra Western blots de las proteínas de células separadas por electroforesis en gel de po1iacrilamida y teñidas utilizando anticuerpos contra PY-Jak2. La parte superior muestra que Jak2 fosforilado estuvo presente en células estimuladas con EPO en concentraciones de 5 nM y 50 nM. Los resultados sugieren que EPO carbamilada no puede inducir la activación corriente abajo del homodímero de receptor para EPO clásico en células que expresan el receptor para EPO. Esto sugiere que EPO carbamilada no se une al homodímero de receptor para EPO clásico. 6.7 Ejemplo 7: ensayo de enlace de BAF3/células EPOR Para determinar si células que expresan receptor para EPO se unen a EPO y a EPO cart>anillada, células BAF3 fueron puestas en contacto con cada ligando y se midió la afinidad de enlace en un ensayo de enlace competitivo. Métodos : Se incubaron 1251 EPO 0.1 nM y dosis graduadas de EPO no marcada y EPO carbamilada, respectivamente durante 30 minutos a temperatura ambiente en PBS en 106 pozos. Las membranas fueron lavadas en filtros y contadas para determinar la membrana unida a 125-1 EPO en contador de rayos gamma. La fracción de radioligando unido a receptor fue graficada como 125-1 EPO unida contra dosis graduadas de ligando no marcado. La figura 9 muestra una gráfica de afinidad de enlace con ligando para células BaF3 que expresan el receptor para EPO. La conservación de ligando de nM (eje x) es graficada contra el enlace (cpm) (eje y) para células que expresan el receptor para EPO BaF3 en contacto con ligandos de receptor para EPO y EPO carbamilada. La células BaF-3/EPO-R. se unen con EPO con una afinidad de aproximadamente 1 nM, mientras que no se pudo detectar un enlace con EPO carbamilada. Los resultados indican que EPO carbamilada no inhibe competitivamente la unión de EPO con células que expresan el receptor para EPO. 6.8 Ejemplo 8: ensayo de membrana UT-7 Para determinar si las células que expresan el dimero clásico de receptor para EPO se unen con EPO y EPO carbamilada, membrana de células UT-7 fueron puestas en contacto con cada ligando y se midió la afinidad de enlace en un ensayo de enlace competitivo. Métodos 100 micro gramos de membranas UT-7 fueron incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente en 200 ul PBS con EPO 0.1 n y dosis graduadas de EPO sin etiquetar y EPO carbamilada, respectivamente. Las membranas fueron lavadas en filtros y contadas para la membrana unida a EPO en un contador de rayos gamma. La fracción de radioligando unida al receptor fue graficada como EPO enlazada contra dosis graduadas de ligando no marcado. Las membranas UT-7 se enlazan con EPO con una afinidad de 0.1-0.5 nM. En contraste, no se detectó enlace con EPO carbamilada. La figura 10 muestra una gráfica de afinidad de enlace con ligando para membrana de células UT-7 que tienen el receptor para EPO. La concentración de ligando en nM (eje x) es graficada contra (cmp) (eje y) para membranas de células que expresan receptor para EPO UT-7 en contacto con ligandos de receptor para EPO, EPO y EPO carbamilada. Los resultados indican que EPO carbamilada no inhibe competitivamente el enlace de EPO con células que expresan tanto el dimero de receptor para EPO clásico. 6.9 EJEMPLO 9: CONCENTRACIONES DE HEMATOCRITO Y HEMOGLOBULINA Ratones recibieron EPO y EPO modificada para determinar si EPO carbamilada o asialoEPO tienen las mismas capacidades eritropoyéticas, es decir, un hematocrito incrementado y hemoglobina incrementada, como EPO. Métodos Ratones fueron inyectados en forma intravenosa 5 veces por semana con 50 g/kg de EPO, EPO carbamilada y asialoEPO durante 4 semanas. Concentraciones séricas de hemoglobina y el hematocrito fueron determinados a través de un hemoglobinómetro usando sangre (mayor que 50 micro 1) extraída del plexo retroorbital bajo anestesia con isoflurano. La figura 11 muestra histogramas de 11A, niveles de hematocrito de conformidad con lo medido por el volumen porcentual de hematocrito (eje y), y 11B, niveles de hemoglobina medidos en concentración en mM (eje y), en ratones después de administración de control (vehículos) EPO, EPO carbamilada, y asialoEPO (eje x) . Los resultados indican que EPO carbamilada y asialoEPO administrada a ratones no induce los niveles incrementados de hematocrito y hemoglobina presentados por ratones que recibieron EPO. Esto sugiere que EPO carbamilada y asialoEPO interactúan con células in vivo en comparación con EPO. Cuando se combinan con los resultados experimentales de los ensayos de enlace arriba, estos resultados confirman que EPO carbamilada y asialoEPO no se unen con el receptor para EPO y por consiguiente no pueden proporcionar las actividades eritropoyéticas de EPO. 6.10 ejemplo 10: detección de la presencia de nucleolina La precipitación utilizada en Western blot y el anticuerpo antireceptor ßa descritos en los ejemplos 4 arriba se analizó adicionalmente. En particular, la proteína que corresponda a la banda de 103 KD mostrada en la figura 5 carril 1 (arriba) fue analizada adicionalmente para determinar la identidad de otra proteína que fue precipitada en las muestras. Métodos Células P19 fueron cultivadas a una confluencia de 70% en medio completo. Fueron tratadas con 10 ng/ml de EPO o solución salina © durante 15 minutos, y después golpeando en ¦ el frasco, sometidas a rotación durante 7 minutos a 700 revoluciones por minuto y resuspendidas en amortiguador de lisis (TBS con inhibidores de proteasa, CaCl 2 mM, Tritón al 1% y NP40 al 1%) la concentración final de 1 mg de proteína/ml . CaCl estuvo presente en el amortiguador de lisis y se evito el congelamiento y el sometimiento a vórtice, para mantener las interacciones de proteína. Después de la remoción de residuos por centrifugación durante 10 minutos, 120,000 revoluciones por minutos, el lisado fue incubado con proteína A Sepharose (Pharmacia, 10 microL de gel drenado/ml) durante una hora a temperatura ambiente para remover los enlaces no específicos. El sobrenadante fue después incubado con protexna A Sepharose (10 micro L gel/ml) previamente acoplada al anticuerpo durante una hora y se lavo tres veces con amortiguador de lisis. Ya sea un anticuerpo contra la cadena beta común (K17, Santa Cruz Biotechnologies ) o una mezcla de dos anticuerpos contra EPO-R (M20 y hl94, Santa Cruz Biotechnologies) en una dilución final de 1:200 fueron utilizados y la incubación fue efectuada durante la noche a 4°C. Perlas de proteína A Sepharose fueron después lavadas 5 veces con amortiguador de lisis con bajo contenido de detergente (el mismo que arriba), excepto que se utilizó Tritón al 0.5% y -no se utilizó NP40) y las proteínas unidas fueron disociadas por adición de 30 microL de 2X Laemmli amortiguador de muestra con 5% beta-mercaptoetanol y se efectuó en SDS-PAGE al 10%. La banda de 103 KD fue removida del gel teñido con azul Coomassie, desteñido durante algunas horas en biocarbonato de amonio 25 mM/ etanol al 40% y lavada con un porcentaje secuencial creciente de acetonitrilo . Las proteínas fueron digeridas en gel durante la noche a 30 °C con tripsina (Promega, Madison WI) en una concentración de 12 ng/ml en una solución de bicarbonato de amonio 25 mm/acetonitrilo al 10%. Se llevó a cabo una toma de muestras digitales de masa de péptido (PMF) en un espectrómetro de masa de ionización/deserción láser asistido por matriz (MALDI) en Broker Reflex IITM con un ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (Broker Daltonics Billerica, MA) , matriz. Los espectros de masa fueron calibrados externamente con una mezcla de 7 péptidos estándares en el rango comprendido entre 1000 y 3000 Da. Los datos generados fueron sometidos a búsqueda en base de datos (NCBInr) empleando como programas Mascot .Ga¾~G?::^?6?-;·÷ . r:m) y Profound ( ':·. : :_. : ?. i: : '·:1. i .:·':÷ i÷l i-- .- ) y permitiendo hasta una disociación de tripsina faltante y una tolerancia de masa de más menos 0.2 Da. Se utilizó espectrometría de masa para determinar la identidad de la nucleolina. Los resultados sugieren que las células P19 que expresan el receptor para EPO y el receptor ßa que forman un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido producen nucleolina en respuesta a la administración de EPO. La figura 12 muestra una fotografía del gel SDS-PAGE con una proteína de nucleolina de 103 KD circulada. 6.11 ejemplo 11: lesión a la médula espinal en ratones noqueados para receptor ßa se indujo una lesión en la médula espinal en ratones noqueados en cuanto a cadena >c (-/-) y ratones normales (tipo silvestre) con el objeto de investigar adicionalmente los resultados descritos arriba en cardiomiocitos de ratones noqueados para p y para determinar si los receptores ßG desempeñaban una función en la actividad promotora de EPO después de una lesión espinal. Métodos Se efectuó una lesión de la médula espinal en ratones utilizando la modificación del protocolo de Farooque (2000, Acta Neuropathol (Berl) 100:13-22). La técnica produjo un modelo de animal que fue utilizado para tratar en forma de prueba células, tejidos y órganos excitables dañados utilizando EPO y EPO carbamilada. Específicamente, se utilizaron ratones C57/bl6 (silvestre) o noqueados en cuanto receptores ß0 (nulos) de ocho a 16 semanas de edad. Cada animal fue confirmado nulo por análisis por reacción en cadena de polimerasa de ADN obtenido de 'la cola. Se infringió una lesión espinal en 5 grupos de ratones cada uno ¦ conteniendo 4-9 ratones. Dos grupos de ratones de tipo silvestre y 3 grupos de ratones nulos. Durante la lesión espinal, los animales fueron anestesiados con isoflurano y se mantuvo una temperatura central normal. Se llevó a cabo una laminectomia a T3 y se aplicó una varilla de acero inoxidable de 2 mm sobre la dura con 15 gramos de fuerza durante 4 minutos y después se removió. Inmediatamente después de la lesión, una dosis individual de EPO carbamilada fue administrada al primer grupo de ratones nulos, una dosis individual de EPO fue administrada al segundo grupo de ratones nulos, se administro PBS como control al tercer grupo de ratones nulo, y se administró una dosis única de EPO carbamilada al primer grupo de ratones silvestres y una dosis única de PBS fue administrada al segundo' grupo de ratones de tipo silvestre. Los animales fueron después evaluados durante 42 días empleando el sistema de calificación de Basso et al (1995, J. Neurotrauma 12:1-21) . La escala Basso, Beatti, Bresnahan (BBB) es una escala de 21 puntos para probar la locomoción motriz en tierra normal la cual se utiliza normalmente para medir la recuperación funcional después de una lesión a la médula espinal. El resultado BBB es muy sensible para detectar déficits motores finos y también evalúa el grado de recuperación después de una lesión a la médula espinal. Los resultados motrices BBB fueron graficados vs número de días después de una. lesión a todos los grupos de animales. Se calculó la severidad clínica midiendo el área bajo la curva (AUC) de la gráfica de BBB vs el número de días después de la lesión. Los valores de severidad clínica entre grupos de ratones fueron analizados estadísticamente para diferencias y se generó una gráfica de barras que muestra los valores de severidad clínicos en cada grupo. Los resultados confirman los obtenidos en células de cardíomiocitos y sugieren que la actividad protectora de EPO depende de la presencia de receptor pc en animales. Los resultados se muestran en la figura 13, que presenta el resultado motriz B3B (e^e y) vs el tiempo en dias después de una lesión (eje x) . El grupo de ratones de tipo silvestre que recibieron EPO carbamilada presentaron resultados motrices incrementados durante todo el periodo de 42 dias postsesión en comparación con todos los demás grupos. Los resultados se muestran en la figura 14, que ofrece una perspectiva de la severidad técnica medida en área bajo la curva (AUC) (eje y) y grupos de ratones (eje x) . El grupo de ratones de tipo silvestre que recibió EPO carbamilada (columna 1) mostró un incremento significativo de los valores de severidad clínica (es decir, menos severidad) en comparación con todos los demás grupos (columnas 2-5) . El grupo de ratones nulos que recibió EPO (columna 5) presentó una mortalidad muy elevada en comparación ccn todos los demás grupos. El resultado sugiere que un receptor ßa es necesario para lograr el beneficio terapéutico de EPO para tratar una lesión. La invención no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades especificas descritas que se contemplan como ilustraciones individuales de aspectos particulares de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho varias modificaciones a la invención, además de las mostradas y descritas aquí serán aparentes a las personas con conocimientos en la materia a partir de la descripción anterior y a partir de los dibujos adjuntos. Tales modificaciones se contemplan pa :a que estén dentro de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias citadas aquí se incorporan por referencia aquí en su totalidad para todos los propósitos.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> THE KEN ETH S. WARREN INSTITUTE, INC. <120> COMPLEJO DE RECEPTORES DE CITOCINAS PROTECTORAS DE TEJIDO, ENSAYO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS PROTECTORES DE TEJIDO Y USOS DE LOS MISMOS <130> 10165-028-228 <140> <141> <150> 10/676,694 <151> 2003-09-30 <150> 60/465,891 <151> 2003-04-25 <160> 212 <170> Patentln versión 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Gln Arg Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Asn Phe Leu Arg Gly 1 5 <210> 5 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: muteina <400> 5 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn lie Thr Thr 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la Secuencia Artificial: muteina <400> 55 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Asn Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 56 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> 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Descripción de <400> 124 ccgtcagtgg ccttgagagc 32 <210> 125 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 125 cagagtggtg aggctctcaa 32 <210> 126 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 126 cgcagcctca ccacttcgct tcgggctctg g 31 <210> 127 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 127 ccagagcccg aagcgaagtg 31 <210> 128 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 128 gaatatcact gtcccagacg 40 <210> 129 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 129 catcctcttc caggcaccac 40 <210> 130 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 130 tacctcttgg aggccgcgga ggccgagaat atc 33 <210> 131 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 131 gatattctcg gcctccgcgg 33 <210> 132 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 132 gctgacactt tccgcgcact 35 <210> 133 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 133 gagtagactc ggaagagtgc 35 <210> 134 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 134 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 135 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 135 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 136 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 136 ctccggggaa agctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 137 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 137 tcccctgtgt acagcgccag ctttccccgg ag 32 <210> 138 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 138 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 139 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 139 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 146 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 147 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 147 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 148 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 148 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 149 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 149 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 150 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 150 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 151 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: <400> 151 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 152 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 152 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 153 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: <400> 153 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 154 <211> 35 <212> ADM <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 154 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 155 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 155 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 156 <211> 33 <212> . ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 156 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 157 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 157 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 158 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 158 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 159 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 159 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 160 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 160 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 161 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 161 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 162 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 162 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 163 <211> 33 <212> OT <213> Artificial <220> <223> Descripción de <4O0> 163 ctgtgtacag cttcagcgct 33 <210> 164 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 164 actgtcccag acaccgcagt 35 <210> 165 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 165 caggcataga aattaactgc 35 <210> 166 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 166 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 167 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 167 ggccactgac ggctgcatcc 33 <210> 168 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 168 atttcctccg gggagcgctg 33 <210> 169 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 169 ctgtgtacag cttcagcgct 33 <210> 170 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 170 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 171 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 171 caggcataga aattaactgc 35 <210> 172 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <4O0> 172 agttaatttc tatgcctggg 35 <210> 173 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 173 cgacctccat cctcgcccag 35 <210> 174 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 174 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 175 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 175 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 176 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 175 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 177 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 177 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 178 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 178 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 179 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 179 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 180 <211> 35 <:212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 180 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 181 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 181 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 182 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: <400> 182 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 183 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 183 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 184 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 184 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 185 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 185 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 186 <211> 33 <212> ADN - <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 186 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 187 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 187 ctgtgtacag cttcagcgct 33 <210> 188 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 188 actgtcccag acaccgcagt 35 <210> 189 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 189 caggcataga aattaactgc 35 <21D> 190 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 190 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 191 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 191 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 192 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial-<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 192 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 193 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 193 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 194 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 194 ctccggggag cgctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 195 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 195 tcccctgtgt acagcgccag 32 <210> 196 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 196 caaggaggcc gagaaaatca 31 <210> 197 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 197 acagcccgtc gtgattttct 31 <210> 198 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 198 actgcagctt gaatgagaaa atcactgtcc cagacac 37 <210> 199 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 199 gtgtctggga cagtgatttt ctcattcaag ctgcagt 37 <210> 200 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 200 aggccctgtt ggtcaaatct tcccagccgt g 31 <210> 201 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 201 cacggctggg aagatttgac caacagggcc t 31 <210> 202 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 202 atttcctccg gggatggctg aagctgtaca cag 33 <210> 203 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: <400> 203 ctgtgtacag cttcagccat ccccggagga aat 33 <210> 204 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223>. Descripción de la Secuencia Artificial: <400> 204 agccgagtcc tggaggcggc cctcttggag gccaa 35 <210> 205 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : <400> 205 ttggcctcca agagggccgc ctccaggact cggct 35 <210> 206 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 206 agccgagtcc tggagagggc cctcttggag gccaa 35 <210> 207 <2Í1> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 207 ttggcctcca agagggccct ctccaggact cggct 35 <210> 208 <211> 6059 <212> ADM <213? Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 208 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 - taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3120 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ocacgcttoc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 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gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 209 <211> 6059 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 209 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 j ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1 40 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 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acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgta atgaaacctg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 210 <211> 6059 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 210 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 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Artificial: plásmido <400> 211 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 27S0 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3120 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 212 <211> 6059 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 212 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 ^ gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 10 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 ^ aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 0 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 25 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2750 agatgctgaa gatcagtztgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3120 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc ' 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccgacgtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad de protección tisular, dicho método comprende : a) poner en contacto un compuesto de prueba con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; b) medir el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de te ido; c) identificar un compuesto de prueba que incrementa o disminuye el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en comparación con el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medida en ausencia del compuesto de prueba; y d) ensayar el compuesto de prueba identificado para actividad protectora de tejido. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide mediante la medición del enlace del compuesto de prueba con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , en donde el compuesto de prueba es marcado y el enlace del compuesto de prueba marcado con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide mediante la detección del marcador fijado sobre el compuesto de prueba. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide mediante la medición del enlace del compuesto de prueba con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 5. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido, dicho método comprende : a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; y b) medir el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula; c) identificar un compuesto de prueba que incrementa o disminuye la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en comparación con el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medida en ausencia del compuesto de prueba; y d) ensayar el compuesto de prueba identificado para una actividad protectora de tej ido . 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide a través de un ensayo de proliferación de células. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la célula es manipulada recombinantemente para expresar al menos un receptor de EPO o receptor ß común. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la célula expresa en forma endógena un receptor para EPO y es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) está enlazado operativamente a un promotor, y (ii) codifica un polipéptido de receptor ß común. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la célula expresa en forma endógena un receptor ß común y es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) está enlazado operativamente a un promotor y, (ii) codifica un polipéptido de receptor para EPO. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, en donde la secuencia de nucleótidos es derivada de las mismas especies que la célula. 11. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido, dicho método comprende : a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula la cual es recombinantemente manipulada para expresar un receptor para EPO, en donde dicha célula es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) está enlazado operativamente a un promotor, y (ii) codifica un polipéptido de receptor ß común,· b) medir el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula; c) identificar un compuesto de prueba que incrementa o disminuye el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula con relación al nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medida en una célula de control, en donde la célula de control es el mismo tipo de célula que la célula del paso (a) y no es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) está enlazada operativamente a un promotor, y (ii) codifica un polipéptido de receptor ß común; y d) ensayar el compuesto de prueba identificado para actividad protectora de tejido. 12. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido, que comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula recombinante que expresa un receptor ß común, en donde dicha célula es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) está enlazado operativamente a un promotor, y (ii) codifica un polipéptido de receptor para EPO; b) medir el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula; c) identificar un compuesto de prueba que incrementa o disminuye el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en la célula en comparación con el nivel de actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medida en una célula de control, en donde la célula de control es del mismo tipo de células que la célula del paso (a) y no es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) está enlazado operativamente a un promotor, y (ii) codifica un polipéptido de receptor ß común; d) ensayar el compuesto de prueba identificado para una actividad protectora de tejido. 13. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido, dicho método comprende : a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, en donde dicha célula es transformada con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen reportero enlazado operativamente a un elemento regulador asociado con una actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; b) identificar un compuesto de prueba que incrementa o disminuye el nivel de expresión de gen reportero en comparación con el nivel de expresión de gen reportero que se mide en ausencia del compuesto de prueba, y c) ensayar el compuesto de prueba identificado para una actividad protectora de te ido. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el elemento regulador es un elemento de respuesta sérica. 15. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido que comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen reportero enlazado operativamente sobre un sitio de enlace específico para un dominio de enlace de ADN de un activador transcripcional; (ii) una primer proteína de fusión que comprende (A) el dominio de enlace de ADN del activador transcripcional, y (B) un primer polipéptido de receptor para citocinas protectoras de tejido o un fragmento de mismo; y (iii) una segunda proteína de fusión que comprende (A) un dominio de activación del activador transcripcional y (B) un segundo receptor para citocinas protectoras de tejido, b) detectar la expresión de gen reportero, de tal manera que si la expresión de gen reportero en (b) difiere en comparación con la expresión de gen reportero detectada en ausencia del compuesto de prueba, se identifica un compuesto que modula una actividad protectora de tejido. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 11, 12, 13 ó 15, en donde la célula es una célula procariótica . 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 11, 12, 13 ó 15, en donde la célula es una célula eucariótica. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde la célula eucariótica es una célula humana. 19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5, 11, 12, 13 ó 15, en donde la célula expresa en forma endógena al menos un receptor del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 20. El método de conformidad con cualquiera de las ¦ reivindicaciones 5, 11, 12, 13 ó 15, en donde la célula es una célula BaF3. 21. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, dicho método comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula de una cepa de levadura modificada que contiene (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un gen reportero el cual está enlazado operativamente a un promotor de respuesta a complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y (ii) expresa un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; y b) determinar el nivel de actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido mediante la medición del nivel de expresión de gen reportero, de tal manera que si el nivel de actividad de gen reportero en presencia del compuesto se eleva o disminuye en comparación con el nivel de actividad de gen reportero en ausencia del compuesto, entonces se identifica un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 22. Un método para identificar un compuesto que se une a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, que comprende: a) poner en contacto un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con (i) un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido fijado sobre una primera etiqueta y (ii) una cantidad equivalente de un compuesto de prueba fijada sobre una segunda etiqueta en condiciones que llevan al enlace; b) remover el material no unido del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; y c) detectar el nivel de primer etiqueta y segunda etiqueta en donde si la segunda etiqueta está presente, el compuesto se une al complejo y si el nivel de la primera etiqueta disminuye con relación al nivel de la primera etiqueta cuando el ligando marcado entra en contacto con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido bajo condiciones que llevan al enlace en ausencia de un compuesto de prueba bajo remoción de material no unido, entonces se identifica un compuesto que se une a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 23. Un método para identificar un compuesto que modula la unión de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con un complejo de receptora para citocinas protectoras de tejido, dicho método comprende: a) poner en contacto un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en presencia de uno o varios compuestos de prueba en condiciones que llevan al enlace; y b) medir la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido unido al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; de tal manera que si la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido unido medido en (b) difiere de la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido unido medido en ausencia del compuesto de prueba o de los varios compuestos de prueba, entonces se identifica un compuesto que modula el enlace del ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la cantidad de ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido unido se mide utilizando un anticuerpo específico para ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es marcado y el enlace del ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide mediante la detección de la etiqueta fijada sobre el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 26. el método de la reivindicación 23, en donde el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es marcado y se mide la unión del ligando marcado con el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido mediante la detección de la etiqueta fijada sobre el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde la etiqueta es fluorescente. 28. Un método para identificar un compuesto que modula la interacción entre un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, dicho método comprende : a) poner en contacto un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con uno o varios compuestos de prueba; y b) medir la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, de tal manera que si la actividad medida en (b) difiere de la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en ausencia del compuesto de prueba o de los varios compuestos de prueba, entonces se identifica un compuesto que modula la interacción entre el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido y el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12 ó 28, en donde la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se mide a través de la proliferación celular o diferenciación celular . 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12 ó 28, en donde la actividad de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido medida es la capacidad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido para interactuar con un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tej ido . 31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 22 ó 28, en donde el paso de ensayar el compuesto identificado para la actividad protectora de tejido comprende la detección de la presencia de nucleolina en la célula. 32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 22 ó 28, en donde el paso de ensayar el compuesto identificado para la actividad protectora de tejido comprende la detección o la medición de un nivel incrementado de actividad de neuroglobina o citoglobina en una célula. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicación 1, 22, 23 ó 28, en donde el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido está en solución . 3 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 22, 23 ó 28, en donde el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido está en una célula . 35. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 28, en donde el compuesto inhibe el enlace de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 36. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 28, en donde el compuesto mejora el enlace de un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido con un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido . 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 22, 23 ó 28, en donde el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido que entró en contacto en el paso (a) se encuentra en la superficie celular . 38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 22, 23 ó 28, en donde el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido se encuentra en una membrana celular aislada. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 22, 23 ó 28, en donde el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido está inmovilizado en una superficie sólida. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde la superficie sólida es un plato de microtitulación. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde la superficie sólida es un chip. 42. Un método para identificar un compuesto que se une a un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, dicho método comprende: (a) poner en contacto el compuesto de prueba con un fragmento de complejo de receptor protector de tejido de enlace con ligando que comprende al menos un dominio extracelular de receptor para EPO y por lo menos un dominio extracelular de receptor ß, fusionados en un fragmento Fc fijado sobre un soporte sólido; y (b) remover los compuestos de prueba no unidos del soporte sólido; (c) identificar el compuesto fijado sobre el fragmento de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido, de tal manera que el compuesto unido sobre el soporte sólido sea identificado como un compuesto que se une a complejo de receptor para citocinas protectoras de te ido. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 15, 16, 22, 23, 28 ó 42, en donde el complejo de prueba es un anticuerpo específico para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16, 22, 23, 28 ó 42, en donde el complejo de prueba es un anticuerpo específico para un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 15, 16, 22, 23, 28 ó 42, en donde el complejo de prueba es una molécula pequeña. 46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 15, 16, 22, 23, 28 ó 42, en donde el complejo de prueba es un péptido. 47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 15, 16, 22, 23, 28 ó 42, en donde el complejo de prueba es un miembro de una bibliotec . 48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16, 22, 23, 28 ó 42, en donde el ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido es un EPO. 49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 11, 12, 13, 28 ó 42, en donde el compuesto se une al complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16, 23, 28 ó 42, en donde el compuesto se une al ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tej ido . 51. Un método para identificar un compuesto que modula una actividad protectora de tejido en un mamífero, dicho método comprende: (a) administrar un compuesto a un primer animal inmediatamente después de causar una lesión, en donde el primer animal expresa de manera endógeno un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; y (b) administrar el compuesto a un segundo animal inmediatamente después de causar la misma lesión que en el paso (a) , en donde el segundo animal es deficiente en expresión de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido; de tal manera que si la recuperación de la lesión difiere en el animal del paso (a) en comparación con el animal del paso (b) , se identifica un compuesto que modula una actividad protectora de tejido. 52. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un ser humano, dicho método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido a un ser humano que requiere de dicho tratamiento o prevención, a condición que el compuesto no sea una EPO. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno o afectación de un tejido excitable. 54. Un método para mejorar la función de células, tejidos u órganos excitables en un ser humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que modula la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido a un ser humano que lo requiere, en donde dicha mejora de la función de células, tejidos u órganos excitables resulta en la mejora del aprendizaje asociativo o memoria, a condición que el compuesto no sea una EPO. 55. Un método para modular la actividad de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en un ser humano, dicho método comprende la administración de un compuesto que modula la actividad de dicho complejo a un ser humano que requiere de dicho tratamiento o prevención, a condición que el compuesto no sea una EPO. · 56. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un ser humano, que comprende la modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en un ser humano. 57. Un método para mejorar la función de células, tejidos u órganos excitables en un ser humano, que comprende la modulación de un complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido en un ser humano. 58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto es identificado a través del método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 11-15, 21-23, 28, y 42. 59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto es un anticuerpo específico para el complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto es un anticuerpo específico para un ligando de complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto es una molécula pequeña, péptido, o un miembro de una bibliotec . 62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto se une al complejo de receptor para citocinas protectoras de tej ido . 63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto mejora la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde- el compuesto interfiere con la actividad del complejo de receptor para citocinas protectoras de tejido. 65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54 ó 55, en donde el compuesto es administrado en combinación con una EPO . 66. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es un trastorno del humor, un trastorno de ansiedad, depresión, autismo, un trastorno de hiperactividad con déficit de atención, enfermedad de Alzheimer, envejecimiento, o disfunción cognitiva. 67. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es causado por hipoxia, trastornos de ataques, trastornos neurodegenerativos, envenenamiento con neurotoxinas , esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardiaco, radiación, o hipoglicemia . 68. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es isquemia o embolia. 69. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es una condición neurodegenerativa. 70. El método de conformidad con la reivindicación 69, en donde la condición neurodegenerativa es embolia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis cerebral, trauma cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos de ataque, alcoholismo, envejecimiento, o pérdida neuronal . 71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es una condición neuromuscular o muscular. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, en donde la condición neuromuscular o muscular es de un tejido cardiaco. 73. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es del corazón. 74. El método de conformidad con la reivindicación 73, en donde la enfermedad o trastorno es insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad de arteria coronaria, isquemia, infarto del miocardio, angina, enfermedad cardiaca congénita, angina de prinzmetal , ruptura cardiaca, angitis, arritmia, taqui-bradiarritmia, anormalidades supraventriculares, ventriculares , o de la conducción, miocarditis, cor pulmonar, o bien trauma de golpe o de penetración. 75. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, ó 56, en donde la enfermedad o trastorno es del ojo. 76. El método de conformidad con la reivindicación 73, en donde la enfermedad o trastorno es neuritis óptica, lesiones de golpes o penetración, infecciones, sarcoides, enfermedad de células falsiformes, desprendimiento de retina, arteritis temporal, isquemia retinal, degeneración macular, retinitis pigmentosa, retinopatia arteriosclerótica, retinopatía hipertensiva, bloqueo de arteria retinal, bloqueo de vena retinal, hipotensión, retinopatía diabética, o edema macular . 77. El método de conformidad con la reivindicación 54 ó 57, en donde el tejido excitable es tejido del sistema nervioso central o tejido de sistema de nervioso periférico. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, en donde el tejido de sistema nervioso periférico es tejido placental, tejido retinal, o tejido cardiaco. 79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54, ó 55, en donde la administración es oral, tópica, intracranial , intraluminal, por inhalación, parenteral, intravenosa, periférica, intraarterial , subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, submucosal, o intradérmica . 80. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53, 54, ó 55, en donde la administración es previa a un procedimiento médico, quirúrgico o natural. 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, en donde el procedimiento quirúrgico es resección de tumor, reparación de aneurisma, o un procedimiento de desvío de arteria coronaria. 82. El método de conformidad con la reivindicación 80, en donde el procedimiento médico es quimioterapia. 83. El método de conformidad con la reivindicación 80, en donde el procedimiento natural es parto.