MXPA05001349A - Composiciones de vacunas que contienen lipooligosacaridos de inmunotipo l2 y/o l3 de minigitidis neiseria lgtb. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al campo de composiciones de vacunas de Neisseria, su fabricacion, y el uso de dichas composiciones en medicina. Mas particularmente se refiere a procedimientos de fabricacion de nuevas capas meningococicas modificadas geneticamente que son mas adecuadas para la produccion de vacunas de vesiculas (o ampolla) de membrana externa, de Neisseria, en particular meningococica. Los procedimientos ventajosos y productos de vacunas tambien se describen a base del uso de vacunas nuevas de subunidades de LOS o de vesiculas (o ampollas) de membrana externa meningococicas que se han obtenido mas seguras y/o mas eficaces para uso en sujetos humanos. En particular se describen las combinaciones de regulaciones hacia niveles menores de genes tales como PorA y OpA, PorA y OpC, OpA y OpC, y Por A y OpA y OpC. Alternativamente o ademas, se muestra que IgtB- es una mutacion optima para usar eficazmente y con seguridad LOS L3 y/o L2 en composiciones de vacunas de Neisseria. Tambien se describen adicionalmente las vacunas de ampollas derivadas de IgtB- y mutantes meningococicos deficientes en polisacaridos capsulares; ya que son procedimientos ventajosos para fabricar preparaciones de ampollas donde LOS se va a conservar como un antigeno importante.

Description

COM POSICIONES DE VACUNAS QUE CONTIENEN LIPOOLIGOSACÁRI DOS DE I N MUNOTI PO L2 Y/O L3 DE MINIGITIDIS NEISSERIA LGTB CAMPO DE LA I NVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacunas de Neissería, a su fabricación y a la utilización de dichas composiciones en medicina. Más particularmente se refiere a procedimientos para fabricar cepas meningocócicas nuevas modificadas genéticamente que son más adecuadas para la producción de vacunas de Neisseria, en particular meningocócicas, de vesículas de la membrana externa (o ampolla) . También se describen los procedimientos ventajosos y productos de vacunas a base del uso de nuevas vacunas de subunidades de LOS o de vesículas de la membrana externa (o ampolla) que se han mostrado más seg uras y más eficaces para uso en sujetos humanos.

ANTEC EDENTES DE LA INVENCIÓN Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es una causa de enfermedades bacterianas invasoras graves tales como bacterem ia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geog ráficas, estacionales y anuales (Schwartz, B. , Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. icrobiol. Rev. 2 (suplemento), 518 -524, 1989). La bacteria se clasifica comúnmente según el serogrupo de su polisacárido capsular. La mayoría de enfermedades en los países templados se debe a cepas del serogrupo B y varía en incidencia entre 1 - 10/100.000/año de total de población alcanzando algunas veces valores más altos (Kaczmarski, E. B. (1977), Comunn. Dis. Rep. Rev. 7: R55 - 9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A, Poolman, J. T. y col. Clin. Infecí. Dls. 16: 237 - 246, 1993; Cruz, C, Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epldemiol. Infecí. 105: 1 19 - 126, 1 990). Las enfermedades epidémicas dominadas por meningococos del serogrupo A, la mayoría en África Central, algunas veces alcanzan niveles de incidencia hasta de 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S. , Broome, C. V.; Clin. Microbio!. Rev. 2 (suplemento), S18 - S24, 1989). Casi todos los casos como un conjunto de enfermedad meningocócica están ocasionados por meningococos de serogrupos A, B, C, W - 135 e Y y se dispone de una vacuna tetravalente de polisacáridos capsulares A, C, W-135 e Y (Armand, J., Arminjon, F. , Mynard, M. C , Lafaix, C , J. Biol. Stand. 10: 335 - 339, 1982). La frecuencia de infecciones de Neisseria meningitidls han crecido en las pasadas pocas décadas en muchos países de Europa. Esto se ha atribuido a un incremento de transmisión debido a un incremento de actividades sociales (por ejemplo, piscinas, teatros, etc.). Ya no es infrecuente aislar cepas de Neisseria meningiíidis que son menos sensibles o resistentes a alguno de los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no cubierta y demanda nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y ensayos de diagnósticos para este organismo. Las vacunas disponibles de polisacáridos se están actualmente mejorando por medio de su conjugación químicamente a proteínas portadoras (Lieberman, J. M. , Chiu, S. S., Wong, V. K., y col. JAMA 275: 1499 -1503, 1996). Sin embargo, no se dispone de una vacuna de serogrupo B. El polisacárido capsular de serogrupo B se ha encontrado que es no ¡nmunogénico muy probablemente porque comparte similar estructura con componentes del hospedador (Wyle, F. A, Artenstein, . S., Brandt, M. L. Y col. J. Infecí. Dis. 126: 514 - 522, 1972; Finne, J. M. , Leinonen, M., ákelá, P. M. Lancet i¡. : 355 - 357. 1983). Por lo tanto se ha fijado el esfuerzo para tratar de desarrollar vacunas de serogrupo B de vesículas de la membrana externa (o ampollas) o componentes proteicos purificados de los mismos. Los antígenos meningocócicos alternativos para el desarrollo de vacunas son lipooligosacáridos meningocócicos (abreviadamente LOS). Éstos son glicolípidos unidos a la membrana externa que se diferencian de los lipopolisacáridos (abreviadamente LPS) de las Enterobacteriáceas por la carencia de las cadenas secundarias O y de este modo se parecen a la forma basta de LPS (Griffis y col. , Rev Infecí Dis 1988; 10: S287 - 295). La heterogeneidad en el resto de oligosacáridos de los LOS genera diversidad estructural y antigénica entre diferentes cepas meningocócicas (Griffiss y col. Inf. Immun. 1 987; 55: 1792 - 1800). Esto se ha utilizado para subdividir las cepas en 12 inmunotipos. Los inmunotipos L3, L7, L9 tienen una estructura de carbohidratos idéntica y se han designado por lo tanto L3, 7, 9 (o para los propósitos de esta memoria descriptiva, genéricamente como "L3"). Los LOS meningocóclcos L3, 7, 9 (L3), L2 Y L5 se pueden modificar mediante sialllación o mediante la adición de 5'-monofosfato de histidina-ácido N-acetilneuramínico. Aunque los LOS L2, L4 y L6 pueden ser distinguidos inmunológicamente, estructuralmente son similares y cuando se menciona L2 aquí, puede sustituirse opcionalmente con L4 o L6, dentro del alcance de la Invención. Los anticuerpos de LOS se ha mostrado que protegen en ratas experimentales contra la infección y contribuyen a la actividad bactericida en niños infectados con N. meningitldis (Griffiss y col. J. Infecí Dis 1 984; 150: 71 - 79). Sin embargo, un problema asociado con el uso de LOS en una vacuna meningocócica, es su toxicidad (debida a su resto de Iípido A). Los LOS están también presentes en la superficie de ampollas meningocócicas. Durante muchos años los esfuerzos se han fijado en desarrollar vacunas a base de vesículas de la membrana externa meningocócica (o ampolla) (de Moraes, J. C, Perkins, B. , Camargo, M. C. y col Lancet 340: 1074 - 1078, 1 992; Bjune, G., Holby, E. A. Gronnesby, J. K. y col 338: 1093 - 1096, 1991 ). Dichas vacunas tienen la ventaja de Incluir diversas proteínas de la membrana externa en una conformación plegada adecuadamente que puede provocar una respuesta inmunológica protectora cuando se administra a un hospedador. Además, las cepas de Neisseria (incluyendo N. meningitidis serogrupo B - menB) excretan ampollas de membrana externa en cantidades suficientes para permitir su producción a escala industrial. Sin embargo, más a menudo las ampollas se preparan mediante procedimientos que comprenden una extracción con 0.5 por ciento de detergente (por ejemplo, desoxicolato) de las células bacterianas (por ejemplo, EP 1 1243). Aunque esto es deseable debido a la toxicidad de LOS (también llamada endotoxina) como se ha descrito anteriormente, también tiene el efecto de eliminar el costo de la mayor parte del antígeno LOS de la vacuna. Un problema adicional con el uso de LOS como antígeno de vacuna es que los 12 inmunotipos de LPS existen con un intervalo diverso de estructuras de carbohidratos (M. P. Jennings y col, Microbiology 1999, 145, 3013 - 3021 ). Los anticuerpos que surgen contra un inmunotipo fracasan para reconocer un inmunotipo diferente. Aunque se ha fijado el esfuerzo para producir una región "central" genérica de las porciones de oligosacárido de los inmunotipos de LOS (por ejemplo el documento WO 94/08021 ), la actividad bactericida de los anticuerpos generados contra los LOS modificados se pierde. De este modo una vacuna puede necesitar tener muchos componentes de LOS de inmunotipos diferentes para ser eficaz. Existe un problema adicional con el uso de LOS (también conocidos como LPS o lipopolisacárido) como antígenos en vacunas humanas, particularmente las que llevan estructuras de sacáridos que son similares a las estructuras de sacáridos de tipo humano (por ejemplo, en glóbulos rojos humanos), de este modo planteando una cuestión de seguridad con su uso. Incluso cambiar la estructura de LOS es problemático debido a la sensibilidad estructural de la eficacia bactericida del antígeno de LOS. La presente invención presenta procedimientos para la mejora de uno o más de los problemas anteriores y presenta procedimientos para fabricar nuevas vacunas a base de LOS meningococicos como un antígeno protector, en particular cuando está presente en una vesícula de membrana externa.

DESCRIPCIÓN DE LA I NVENCiÓN La materia sujeto de y la información descrita en las publicaciones y patentes o solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan como referencia en esta memoria descriptiva, La referencia a "lipooligosacárido" (o "LOS") también puede denominarse "lipopolisacárido" o "LPS". Los términos "comprendiendo", "comprenden" y "comprende" en esta memoria descriptiva tiene la intención de los inventores de ser opcionalmente sustituibles con los términos "consistiendo en" "consisten en" y "consiste en" respectivamente en cada caso. Los presentes inventores han encontrado que el acortamiento de las estructuras de oligosacáridos LOS conduce a la pérdida de epítopos que pueden provocar una respuesta inmune abactericida. En cambio, los inventores han encontrado que con el fin de utilizar LOS más eficazmente en una formulación de vacunas, la estructura de oligosacáridos LOS se debe conservar tanto como sea posible, pero una combinación, de justo 2 antígenos de LOS puede producir una vacuna (preferiblemente meningocócica) de Neisseria universalmente eficaz. Un primer aspecto de la invención es una composición inmunogénica para la prevención o tratamiento de enfermedad de Neisseria (preferiblemente meningocócica o meningocócica B) que comprende LOS (preferiblemente meningocócicos) de Neisseria de inmunotipo L2 y LOS de inmunotipo L3. Los LOS se puede aislar bien mediante procedimientos de purificación o pueden estar presente en al menos 2 preparaciones de vesícula de membrana externa (o ampolla) derivadas de cepas de Neisseria 12 y L3. Con el fin de eliminar la ligera toxicidad retenida en LOS de la preparación de ampollas, pero conservar altos niveles de antígeno de LOS integrado en la ampolla, se prefiere que se extraigan las ampollas usando una baja concentración de detergente O - 0.3%, preferiblemente 0.05 - 0.2%, más preferiblemente alrededor de 0.1 %, preferiblemente desoxicolato (o abreviadamente DOC). Dicha combinación de antígenos de LOS es sorprendentemente ventajosa siendo eficaz contra el 90% de cepas de N. meningitidis. Los autores de la invención también han encontrado que las composiciones inmunogénicas de ampollas anteriores de la invención, y sin duda cualquier composición inmunogénica de ampollas derivada de Neisseria (preferentemente gonocócica o meningocócica) puede tener un efecto potenciado de antígenos protectores (incluyendo LOS) en su superficie si ciertas combinaciones de proteínas de membrana externa inmunodominantes se regulan hacia menores niveles de expresión (y preferiblemente se suprimen). Por consiguiente un segundo aspecto de la invención es una preparación de ampollas de Neisseria derivada de una cepa de Neisseria que ha tenido 2 o más de las siguientes proteínas de membrana externa reguladas hacia menores niveles de expresión y preferiblemente suprimidas, comparada con la cepa nativa no modificada: ParA, PorB, OpA, OpC o Pi lC. Preferiblemente ParA y OpA, PorA y OpC, OpA Y OpC, o ParA y OpA y OpC se regulan hacia menores niveles o se suprimen. La regulación hacia menores niveles (preferiblemente supresión) de expresión de FrpB se ha mostrado también q ue es beneficiosa potenciando el efecto de antígenos de protección cruzada particularmente en preparaciones de ampollas preparadas a partir de cepas de Neisseria desarrolladas en condiciones limitantes de hierro. Una ampolla de Neisseria derivada de una cepa con esta mutación es de este modo una realización adicional de la invención, como son las ampollas derivadas de una combinación de la regulación hacia niveles menores de FrpB con una o más de las regulaciones hacia niveles menores mencionadas anteriormente. Se pefiere q ue si PorA se regula hacia niveles inferioes, no se debe regular PorB hacia niveles inferiores, y viceversa. Dichas mutaciones son beneficiosas en cualquier cepa de Neisseria (preferiblemente meningocócica) de la que las composiciones inmunogénícas de ampollas van a derivar, particularmente las descritas aquí; sin embargo se prefiere que se usen las cepas de Neisseria (preferiblemente meningocócica, muy preferible, menB) de ¡nmunotipo L2 o L3. típicamente extraídas con un proceso de baja extracción porcentual de DOC, como se describe aquí. Preferiblemente las composiciones inmunogénícas de ampollas de la invención contienen tanto ampollas L2 como L3 donde al menos una (y preferiblemente ambas) son deficientes en las combinaciones anteriores de las proteínas de membrana externa inmunodominante (u OMP). Las técnicas para la regulación hacia niveles menores de estos genes se describen en el documento WO 01/09350 (incorporado en esta memoria descriptiva como referencia). Se conocen cuatro diferentes genes Opa que existen en el genoma meningococico (Aho y col., 1991 Mol. Microbio!. 5: 1429 - 37), por lo tanto cuando se dice que Opa se regula hacia niveles menores de expresión quiere decir que preferiblemente 1 , 2, 3 o (preferiblemente) los 4 genes presentes en meningococos se regulan también hacia niveles menores. Dicha regulación hacia niveles menores se puede realizar genéticamente como se describe en el documento WO 01/09350 o buscando cepas naturales meningocócicas estables, fácilmente encontradas, que tienen nula o baja expresión de los sitios Opa. Dichas cepas se pueden encontrar utilizando la técnica descrita en Poolman y coL, (1985 J. Med. Micro. 19: 203 - 209) donde las células que son Opa tienen un fenotipo diferente a la células que expresan Opa que se pueden ver mirando la aparición de las células en placas o en un microscopio. Una vez encontrada, la cepa se puede mostrar que es establemente Opa mediante la realización de una transferencia Western en contenidos celulares después de que se realiza una fermentación para establecer la carencia de Opa.

Seguridad de las composiciones inmunoqénicas de LPS anteriores Se ha cuestionado la seguridad de los anticuerpos surgidos de LPS L3 o L2 debido a la presencia de una estructura similar al grupo de oligosasaridos de lacto-N-neotetraosa (Gal 1 -4GlcNAc 1 -3Gal 1 -4Glc 1 -; figura 1 ) presentes en glicofingolípidos humanos. Aun cuando un gran número de personas se haya vacunado seguramente con vacunas de vesículas extraídas con desoxicolato que contienen una cantidad residual de LPS L3 (G. Sjune y coL, Lancet (1 991 ), 338, 1 093 -1096; GVG. Sierra y col, N I PH ann (1 991 ), 14, 1 95 - 21 0), si se ha de retener LOS como un antígeno, tal como se discute en la presente, los inventores de la presente han encontrado que la eliminación de una parte terminal de la estructura del sacárido LOS es ventajosa para prevenir la reacción cruzada de la respuesta inmune anti-LOS con estructuras presentes en la superficie de los tejidos humanos. En una modalidad preferida, la inactivación del gen thelgtB da por resultado una estructura LOS intermedia, en la q ue están ausentes el residuo galactosa terminal y el ácido siálico (véase las figuras 1 y 2, la m utación deja una estructura a4GlcNAc (31 -3 Gal (31 -4Glc/31 en los LOS L2 y L3) . Dichos intermedios se podrían obtener en una cepa de LPS L3 y L2. Una versión alternativa y menos preferida (corta) del LPS se puede obtener desactivando el gen IgtE. Una versión alternativa adicional y menos preferida de los LPS se puede obtener desactivando el gen IgtA. Si se selecciona dicha mutación de IgtA- se prefiere también desactivar la expresión de IgtC para evitar el inmunotipo Ll no ¡nmunogénico que se forma. Los mutantes LgtB- se prefieren más ya que los inventores han encontrado que es el truncamiento óptimo para resolver la cuestión de - In ¬ seguridad mientras todavía mantienen un epítopo de oligosacárido protector de LPS que todavía puede inducir una respuesta de anticuerpo bactericida (e incluso bactericida cruzada). Por lo tanto, las preparaciones anteriores L2 o L3 (si están purificadas o en una ampolla aislada de las preparaciones de la invención o de ampollas meningocócicas se derivan en general ventajosamente de una cepa de Neisseria (preferiblemente meningocócica) que se ha modificado genéticamente para regular hacia niveles menores permanentemente la expresión del producto génico funcional de IgtS, IgtA o el gen IgtE, preferiblemente inactivando el gen , más preferiblemente suprimiendo todo o parte del promotor y/o el marco de lectura abierta del gen. Preferiblemente las cepas de Neisseria de la invención son deficientes en la síntesis del polisacárido capsular. Cuando las preparaciones de ampollas de la invención se derivan de una cepa de meningococo B, se prefiere adicionalmente que también se elimine el polisacárido capsular (que también contiene las estructuras de sacáridos similares a las humanas). Aunque muchos genes se podrían inactivar para llevar a cabo esto, los inventores han mostrado ventajosamente que se prefiere que la cepa de producción de ampollas se modifique genéticamente para regular hacia niveles menores permanentemente la expresión del producto génico funcional del gen siaD (es decir, regulando hacia niveles menores la actividad de a-2-8 polisialiltransferasa), preferiblemente inactivando el gen, más preferiblemente, suprimiendo todo o parte del promotor y/o el marco de lectura abierta del gen. Dicha inactivación se describe en el documento WO 01/09350. La mutación siaD (también conocida como assynD) es la más ventajosa de muchas mutaciones que pueden dar como resultado la eliminación del epítopo similar al humano del polisacárido capsular, porque es una de las únicas mutaciones que no tienen efecto en la biosíntesis de los epítopos protectores de LOS, de esta manera siendo ventajosa en un procedimiento que pretende usar finalmente LOS como antígeno protector y tiene un efecto mínimo en el desarrollo de la bacteria. Un aspecto preferido de la invención es por lo tanto una preparación inmunogénica de ampollas como se ha descrito anteriormente que se deriva de una cepa muíante de meningococo B IgtE-siaD, IgtA-siaD o preferiblemente una IgtB-siaD'. La cepa en sí misma es un aspecto adicional de la invención. Aunque la mutación siaD' es preferible por las razones anteriores, se pueden utilizar otras mutaciones que inactivan la síntesis de polisacárido capsular de meningococo B. De este modo la cepa de producción de ampollas se puede modificar genéticamente para regular permanentemente hacia niveles menores la expresión del producto génico funcional de uno o más de los genes siguientes: genes ctrA, ctrS, ctrC, ctrO, synA (equivalente a synX y siaA), synB (equivalente a SiaB) o synC (equivalente a siaC), preferiblemente inactivando el gen, más preferiblemente suprimiendo todo o parte del promotor y/o el marco de lectura abierta del gen. La mutación IgtE- se puede combinar con una o más de estas mutaciones. Preferiblemente la mutación IgtB- se combina con una o más de estas mutaciones. Un aspecto adicional de la invención es por lo tanto una preparación inmunogénica de ampollas como se ha descrito anteriormente que se deriva de dicha cepa muíante combinada de meningococo B (o meningococo en general). La cepa en sí misma es un aspecto adicional de la invención. Se conoce en la técnica un sitio de Neisseria que contiene varios genes incluyendo IgtB y IgtE y su secuencia (véase M. P. Jennings y col. , Microbiology 1999, 145, 3013 - 3021 y las referencias citadas en esta memoria descriptiva y J. Exp. Med. 180: 2181 - 21 90

[1994]). Cuando LOS de longitud completa (no truncada) se va a utilizar en el producto final, es deseable para LOS que no se sialice (de este modo LOS genera una respuesta inmune contra las cepas de meningococo B invasoras, más peligrosas que también están sin sializar). En dicho caso es ventajoso el uso de una cepa negativa de cápsula que ha suprimido el gen synA (equivalente a synX y siaA), synB (equivalente a siaB) o synC (equivalente a siaC), de tal manera una mutación también produce LOS menB incapaz de ser sializados.

La toxicidad de LOS Los LOS anteriormente purificados o composiciones inmunogénicas de ampollas de la invención también se pueden hacer menos tóxicas mediante la regulación hacia niveles menores de expresión de ciertos genes en la cepa de producción bacteriana de la que se derivan. Aunque dicha destoxificación puede ser no necesaria para inmunización intranasal con OMV de tipo nativo (J. J. Dabrick y col., Vaccine (2000), 18, 160 -172), presentaría una ventaja para la destoxificación de la vacunación parenteral. Preferiblemente los LOS, LOS purificados o composiciones ¡nmunogénicas de ampollas de la invención se destoxifican genéticamente mediante ingeniería genética de la cepa de producción de Neisseria mediante mutación/modificación/inactivación de los genes implicados en la biosíntesis de LípidoA, particularmente los genes implicados en la adición de las cadenas de acilo secundarias al lípido A, en particular mediante la regulación hacia niveles menores de la expresión del producto génico funcional de los genes msbB y/o htrB y preferiblemente mediante la inactivación del gen, más preferiblemente mediante la supresión de todo o parte del promotor y/o el marco de lectura abierta del gen. Alternativamente (o además) los LOS purificados o las composiciones inmunogénicas de ampollas se pueden derivar de una cepa de Neisseria que se ha modificado genéticamente de manera que uno o más de los siguientes genes se regulan hacia niveles mayores (mediante la introducción de un promotor más fuerte o integrando una copia extra del gen): pmrA, pmrB, pmrE y pmrF. Alternativamente (o además) los LOS purificados o las composiciones inmunogénicas de ampollas se pueden destoxificar mediante la adición de equivalentes funcionales peptídicos no tóxicos de polimixina B [una molécula con alta afinidad para Lípido A] a las composiciones. Véase el documento WO 01/09350 para más detalle sobre los procedimientos de destoxificación anteriores y para las secuencias de promotor/génicas relevantes y los procedimientos de regulación hacia niveles mayores y regulación hacia niveles menores. Los genes msbB y htrB de Neisseria se llaman también IpxL 1 y lpxL2. respectivamente (véase el documento WO 00/026384) y las mutaciones de supresión de estos genes se caracterizan fenotípicamente por el muíante de LOS msbB-que pierde una cadena acilo secundaria comparado con el tipo silvestre (y q ue mantiene la cadena acilo primaria 4 y secundaria 1 ), y el muíante de LOS thrB- que pierde ambas cadenas de acilo secundarias. Dichas mutaciones se combinan preferiblemente con mutaciones para asegurar que la cepa de producción es deficiente en polisacárido capsular (véase más arriba) para asegurar la presentación óptima de LOS destoxificados en la ampolla o para ayudar la purificación del LOS de subunidad destoxificada. Véanse los documentos WO 93/141 15, WO 95/03327, Velucchi y col. , (1 997) J. Endotoxin Res. 4: 1 - 12 y el documento EP 976402 para detalles adicionales de equivalentes funcionales de péptidos no tóxicos de polimixina B que se pueden utilizar en las composiciones de esta invención - particularmente el uso del péptido SAEP 2 (de secuencia KTKCKFLKKC donde las dos cisteínas forman un puente disulfuro). Por "regulación hacia niveles menores de la expresión del producto génico funcional" se entiende que las adiciones, supresiones o sustituciones se realizan al promotor o al marco de lecíura abiería del gen en cuestión de manera que la actividad biosintética del producto génico total se reduce (60. 70. 80. 90. 95 o más preferiblemente 1 00%). Evidentemente se pueden introducir mutaciones de desplazamiento de fase, o sustituirse con promotores más débiles, sin embargo m uy preferiblemente la mayoría o toíalidad del marco de lectura abierta y/o del promotor se suprime para asegurar una regulación hacia niveles menores permanente del producto génico (activo) (como se describe en el documento WO 01/09350). Las mutaciones anteriores son benéficas en cualquier cepa neisseriana (de preferencia meningocócica, muy preferible, en menú), de la que se vayan a derivar las composiciones inmunógenas de vejiga, en particular las descritas aquí; sin embargo, se prefiere que se utilicen cepas neisserianas del inmunotipo L2 o L3 (de preferencia meningocócicas, muy preferible, menú), extraídas típicamente con un proceso de extracción con bajo porcentaje de DOC, como se describe aquí. De preferencia las composiciones inmunogénicas de la invención contienen tanto ampollas L2 como L3, donde por lo menos una (o de preferencia ambas) se derivan de cepas deficientes en la expresión de los genes anteriores. Los aspectos adicionales de la invención incluyen las cepas de Neisseria (preferiblemente meningocócica o gonocócica o meningocócica B) modificadas genéticamente descritas anteriormente de las que los LOS o preparaciones inmunogénicas de ampollas de la invención se pueden derivar.

Las preparaciones de LOS o de ampollas que contienen LOS de la invención Un aspecto adicional de la invención son las preparaciones de LOS (particularmente cualquiera de las descritas anteriormente) aisladas de las cepas de Neisseria de la invención. Preferiblemente los LOS aislados (o ampolla que contiene LOS) es inmunotipo L2 o L3 y preferiblemente las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden ambas preparaciones de LOS (o ampolla) L2 y L3 de la invención. Dichas preparaciones también se pueden mejorar mediante la conjugación de la porción de oligosacárido de los LOS anteriores (si está purificada o presente en una preparación de ampollas) a un portador que comprende una fuente de epítopos de células T (de este modo obteniendo los LOS incluso un inmunógeno [T dependiente]). Una preparación de LOS purificada de la invención puede producir alternativamente (o además) un antígeno mejor presentándolo en formulaciones de liposomas conocidas en la técnica (véase por ejemplo el documento WO 96/40063 y las referencias citadas en esta memoria descriptiva. El procedimiento de aislamiento de LOS a partir de bacterias se conoce bien en la técnica (véase por ejemplo, el procedimiento de agua -fenol en caliente de Wesphal y Jann [Meth. Carbo. Chem. 1965, 5: 83 -91 ]). Véase también Galanos y coL, 1969, Eur J. Biochem 9: 245 - 249, Y Wu y coL, 1987 Anal Bio Chem 160: 281 - 289. Se conocen también las técnicas para conjugar LOS aislado (véase por ejemplo el documento EP 941738 incorporado en esta memoria descriptiva como referencia). Para los propósitos de esta invención "un portador que comprende una fuente de epítopos de células T" es usualmente un péptido o, preferiblemente, un polipéptido o proteína. Las técnicas de conjugación se conocen bien en la técnica. Los portadores típicos incluyen proteína D de H. influenzae no caracterizable, toxoide de tétanos, toxoide de difteria y CRM197 o proteínas de membrana exterior presentes en las preparaciones de ampolla (particularmente .neisserianas o meningocócicas) Las composiciones de LOS aisladas preferidas de la invención son: una composición que comprende LOS L2 Y L3 aislados en los que la porción de oligosacarido de cada LOS se conjuga opcional mente con un portador que comprende una fuente de epítopos de células T, una composición que comprende LOS que tiene una estructura consistente con la que se ha derivado de una cepa meningocócica IgtB- en la que la porción de oligosacárido de cada LOS se conjuga opcionalmente con un portador que comprende una fuente de epítopos de células T y más preferiblemente una composición que comprende una fuente de epítopos de células T y muy preferiblemente una composición que comprende LOS L2 Y L3 aislados que tienen una estructura consistente con ellos que se han derivado de una cepa meningocócica IgtB' en las que la porción de oligosacárido de cada LOS se conjuga opcionalmente con un portador que comprende una fuente de epítopos de células T. Preferiblemente las composiciones de LOS de la invención se han destoxificado. Esto se puede hacer mediante técnicas conocidas de tratamientos químicos de hidracina o hidrólisis alcalina que retiran las cadenas de acilo de la molécula (pero que pueden reducir la eficacia protectora de la molécula), pero se realiza preferiblemente mediante el aislamiento de LOS de un mutante meningococico htrB' o msbB' (como se ha descrito anteriormente; particularmente en cepas de menos polisacáridos de las cápsulas), o mediante la adición de un equivalente funcional peptídico no tóxico de polimixina B [una molécula con alta afinidad a Lípido A] a la composición, en particular SAEP 2 (como se ha descrito anteriormente ). Los LOS de la invención se puede administrar en un estado aislado (usualmente en forma de micelas si el resto de lípido A está todavía intacto) o se puede administrar en un liposoma. En tal caso las proteínas de membrana externa se pueden añadir al liposoma y los LOS se pueden conjugar intraüposoma a dichas proteínas de membrana externa para obtener el oligosacárido un antígeno T dependiente. Esto se puede realizar con una química similar a la reticulación de LOS intra-ampollas como se describe más adelante.

Reticulación (conjugación) intra- ampolla (de la porción de oligosacárido de LOS a las proteínas de membrana externa presentes en la superficie de la ampolla Cuando LOS (en particular los LOS de la invención) está presente en una formulación de ampolla el LOS se conjuga preferiblemente in situ mediante procedimientos que permiten la conjugación de LOS a una o más proteínas de membrana externa también presentes en la preparación de las ampollas (por ejemplo, PorA o PorB en meningococo). De tal manera, otro aspecto de la invención es una preparación de ampolla a partir de una cepa bacteriana Gram-negativa en cuya membrana exterior está integrada una proteína de membrana exterior, conjugada a LOS. Aunque se puede añadir el LOS a una preparación de ampolla para conjugación, se prefiere que el LOS esté presente naturalmente sobre la superficie de la preparación de ampolla. Este procedimiento puede potenciar ventajosamente la estabilidad y/o inmunogenicidad (que proporciona auxiliar de células T) y/o antigenicidad del antígeno LOS dentro de la formulación de ampollas -proporcionando de esta manera auxiliar de células T para el inmunogeno de oligosacárido independiente de T en su conformación más protectora -como LOS en su ambiente natural en la superficie de membrana externa. Además, la conjugación de los LOS dentro de la ampolla puede dar como resultado una destoxificación de los LOS (sin que se desee atenerse a la teoría, la porción de lípido A puede estar establemente enterrada en la membrana externa estando así menos disponible para ocasionar toxicidad). De este modo los procedimientos de destoxificación mencionados anteriormente de aislamiento de ampollas a partir de mutantes htrB- o msbB- o mediante la adición de equivalente funcional peptídico no tóxico de polimixina B a la composición pueden no requerirse (pero que se pueden añadir en combinación para la seguridad adicional). Las preparaciones de ampolla conjugadas de la invención son típicamente tales, que la toxicidad de los LOS en la ampolla se reduce en comparación con las mismas ampollas con la misma cantidad de LOS totalmente sin conjugar. Se puede determinar fácilmente la toxicidad de los LOS por las personas expertas en la materia, por ejemplo, usando el análisis de pirogenicidad de LOS en conejos, de la Farmacopea Europea (véase el ejemplo 7). Las preparaciones de ampolla conjugada de la invención ventajosamente son tales, que el LOS conjugado tiene una conformación adecuada para provocara una respuesta inmune en un huésped, cuyo suero es reactivo (puede unirse a) con el LOS sin conjugar, de preferencia presente en la bacteria de la que se hizo la preparación de ampolla y, muy preferible, de una manera bactericida, en un análisis SBA. Cuando las ampollas neisserianas se conjugan a LOS, y las ampollas son derivadas de una cepa regulada en sentido de disminución, en una o más proteínas de membrana exterior inmunodominantes, como se describe aquí, se prefiere que, si se regula en sentido de disminución PorA, no se debe regular en sentido de disminución PorB, y viceversa. Esto permite que se entrelace la mayoría de los LOS con una proteína principal de membrana exterior y, de esa manera, se reduzca al mínimo cualquier efecto de conjugación sobre los antígenos menores de membrana exterior, protectores de entrelazamiento, presentes en la ampolla. En particular los inventores han encontrado que una composición que comprende ampollas en la que LOS presente en las ampollas se ha conjugado con una forma intra- ampolla a las proteínas de membrana externa también presentes en la ampolla puede formar la base de una vacuna para el tratamiento o prevención de enfermedades ocasionadas por el organismo a partir del cual se han derivado las ampollas, siendo dicha vacuna sustancialmente no tóxica y es capaz de inducir una respuesta bactericida T dependiente contra LOS en su ambiente nativo. Por lo tanto esta invención proporciona además una preparación de ampollas conjugada a LOS intra-ampolla. Preferiblemente las ampollas se han derivado de cualquier organismo Gram negativo a partir de las que se pueden producir las ampollas (véase el documento WO 01/09350), preferiblemente Moxarella catarrhalis, Haemophilus ¡nfluenzae no caracterizable o Neiseria (más preferiblemente meningococo). Dichas preparaciones de ampollas se pueden aislar a partir de la bacteria en cuestión (véase el documento WO 01 /09350) y después se somete a procedimientos químicos de conjugación conocidos a grupos de unión (por ejemplo, NH2 o COOH) en la porción de oligosacárido de LOS a grupos (por ejemplo, NH2 o COOH) en las proteínas de membrana externa de la ampolla. Se pueden usar las técnicas de reticulación que utilizan glutaraldehído, formaldehído o mezclas de glutaraldehído/formaldehído, pero se prefiere que se usen las técnicas químicas más selectivas tales como EDAC o EDAC/NHS (J. V. Staros, R. W. Wright y D. M. Swingle. Enhancement by N-hidroxisuccinimide of water soluble carbodiimide -mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220 - 222 (1986); y Bioconjugates Techniques : Grez T. Hermanson (1996) pp. 173 - 176). Otras técnicas químicas de conjugación o tratamientos capaces de crear enlaces covalentes entre LOS y moléculas de proteínas que se podrían usar se describen en el documento EP 941738. Preferiblemente las preparaciones de ampollas se conjugan en ausencia de polisacárido capsular. Las ampollas se pueden aislar a partir de una cepa que no produce polisacárido capsular (naturalmente o mediante mutación), o se pueden purificar de la mayoría (más del 60. 70. 80. 90 o 99 por ciento eliminado) y preferiblemente la totalidad de los polisacáridos capsulares contaminantes. De esta forma, la reacción de conjugación de LOPS intra-ampolla es mucho más eficaz. Preferiblemente mas que 5, 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. ó 95% de LOS presentes en las ampollas está reticulados/conjugados. De preferencia se han preparado las ampollas de la invención de manera que el contenido de LOS de las ampollas sea 3-30. 5-25, 10-25, 15-22, y muy preferible, aproximadamente o exactamente 20 por ciento de contenido de LOS, cuando se mide mediante manchado con plata después de electroforesis SDS-PAGE, usando LOS purificado como norma (véase el método de Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14: 25-33). Se puede obtener 20 por ciento de LOS en ampollas meningocócicas con una extracción baja de DOC de 0.1 por ciento, que puede eliminar las moléculas de LOS mantenidas flojamente, pero conservará la mayor parte del antígeno. Cuando las ampollas conjugadas intra-ampolla se derivan de menigogococo, se prefiere que la cepa a partir de la cual se derivan sea un muíante que no puede producir polisacárido capsular (por ejemplo, una de las cepas de mutantes descritas anteriormente, en particular siaD). También se prefiere que las composiciones inmunogénicas eficaces coníra la enfermedad meningocócica comprendan tanto una ampolla L2 como L3, en las que LOS L2 Y L3 se conjugan ambos con las proteínas de membrana externa de las ampollas. Además, se prefiere que la estructura LOS dentro de la ampolla conjugada intraampolla sea consistente con la que se ha derivado de una cepa meningocócica ItB'. Más preferiblemente composiciones inmunogénicas comprenden ampollas conjugadas intra-ampolla: derivadas de una cepa menigocócica muíante que no puede producir polisacárido capsular y es IgtB-; comprendiendo ampollas de L2 y L3 derivadas de cepas meningocócicas mutaníes que son IgíB- o más preferiblemeníe comprendiendo ampollas de L2 y L3 derivadas de cepas meningocócicas muíanles que no pueden producir polisacárido capsular y son IgtB-.

Una típica cepa meningocócica L3 que se puede usar en la presente invención es la cepa H44/76 menB. Una cepa típica de L2 es la B16B6 menB o la cepa menigocócica 39E tipo C o la cepa 760676. Como se ha indicado anteriormente las ampollas de la invención se han destoxificado a un grado mediante el acto de conjugación y no necesitan destoxificarse posteriormente, sin embargo para seguridad adicional se puede utilizar procedimientos adicionales de destoxificación, por ejemplo usando ampollas derivadas de una cepa meningocócica que es htrB- o msbB- o añadiendo un equivalente péptido funcional no tóxico de poiimixina B [una molécula con alta afinidad a Lipido A] (preferiblemente SEAP 2) a la composición de ampollas (como se ha descrito anteriormente). La conjugación de LOS (particularmente en una manera intra-ampolla) muestra de este modo sorprendentemente una menor toxicidad de LOS comparada con las preparaciones que comprenden la misma cantidad de LOS no conjugado. De este modo un procedimiento para destoxificar ampollas se proporciona adicional mente por medios de conjugación intra-ampolla de LOS a la proteína de membrana externa de las ampollas. En la anterior forma se proporcionan las ampollas meningocócicas y composiciones inmunogénicas que comprenden ampollas que tienen como un LOS de antígeno importante que es sustancial mente no tóxico, desprovisto de problemas de autoinmunidad, tiene un carácter T-dependiente, está presente en su ambiente natural y es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo bactericida contra más del 90% de cepas meningocócicas (en el caso de composiciones de L2 + L3).

Uno o más de polisacáridos capsulares de Men A, C, Y o W u oligosacáridos (preferiblemente al menos MenC, o MenA y MenC, o Men C y MenY) se pueden también conjugar en una proteína de membrana externa de la ampolla de la invención también. Aunque esto se podría hacer en la misma reacción como reticulación de LOS, se prefiere que se haga en una reacción separada (de preferencia posteriormente). El procedimiento de conjugación de LOS intra-ampolla óptimo es un aspecto adicional de la presente invención. Dicho proceso debe incorporar los pasos de aislar las ampollas de una bacteria Gram-negativa (de preferencia usando un porcentaje bajo de DOC, como se describe aquí), efectuar las operaciones químicamente estables para conjugar los LOS (de preferencia mediante su porción oligosacárido) presentes en las ampollas, a una proteína de membrana exterior presente en la misma ampolla; aislar la preparación de ampolla conjugada intra-ampolla, preparada medianate el mismo procedimiento, pero que tiene un inmunotipo de LOS diferente (de preferencia mezclando ampollas Neisseriana/meningocócica L2 y L3) y/o formular la preparación de ampolla con un excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición de vacuna. La conjugación intra-ampolla debe incorporar 1 , 2 ó 3 de las siguientes etapas de procedimiento: el pH de la conjugación debe ser mayor pH 7,0. preferiblemente mayor o igual que pH 7,5 (más preferiblemente inferior a pH 9); condiciones de 1 - 5% preferiblemente 2 -4% más preferiblemente alrededor de 3% de sacarosa se debe mantener durante la reacción; NaCI se debe minimizar en la reacción de conjugación, preferiblemente por debajo de 0.1 M, 0.05 M, 0.01 M, 0.005 M, 0.001 M y más preferiblemente que no esté presente en absoluto. Todas estas características del procedimiento aseguran que las ampollas permanezcan estables y en solución durante todo el procedimiento de conjugación. El procedimiento de conjugación EDAC/NHS es un procedimiento preferido para la conjugación intra-ampolla. EDAC/NHS se prefiere a formaldehído que puede reticular a demasiada altura una extensión de este modo afectando adversamente a la filtrabilidad. EDAC reacciona con ácidos carboxilicos (tal como KDO en LOS) para crear un intermedio éster activo. En presencia de un nucleófilo de amina, se forma un enlace de amida con liberación de un subproducto de isourea. Sin embargo, la eficacia de una reacción mediada por EDAC se puede incrementar mediante la formación de un intermedio de éster de Sulfo-NHS. El éster de Sulfo-NHS sobrevive en solución acuosa más tiempo que el éster activo formado a partir de la reacción de EDAC solo con un carboxilato. De este modo rendimientos más altos de la formación de enlace de amida se pueden realizar usando este procedimiento en dos etapas. La conjugación de EDAC/NHS se describe en J. V. Staros, R. W. Wright y D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysucc¡n¡m¡de of water-soluble carbodimida-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220 -222 (1986); y Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp 173 - 176. Preferiblemente se usa en la reacción 0.01 - 5 mg de EDAC por mg de ampolla, preferiblemente 0.05 - 1 mg de EDAC por mg de ampolla. La cantidad de EDAC usada depende de la cantidad de LOS presente en la muestra que a su vez depende del porcentaje de desoxicolato (DOC) usado para extraer las ampollas. A bajo porcentaje de DOC, (por ejemplo, 0.1 por ciento) se usan altas cantidades de EDAC (1 mg/mg y más), sin embargo a alto porcentaje de DOC, se utilizan menos cantidades de EDAC (0.05 0.1 mg/mgj para evitar demasiada reticulación inter-ampollas. Por lo tanto, un procedimiento preferido de la invención es un procedimiento para producir LOS conjugado intra-ampolla (preferiblemente meningocócico) que comprende las etapas de conjugar ampollas en presencia de EDAC/NHS a un pH entre 7.0 y pH 9.0 (preferiblemente alrededor de pH 75) en 1 - 5% (preferiblemente alrededor 3%) de sacarosa y opcionalmente en condiciones sustancialmente desprovistas de NaCI (como se ha descrito anteriormente) y aislar las ampollas conjugadas de la mezcla de reacción. A la reacción puede seguir geles de separación de Western de la mezcla de reacción usando anti-LOS (por ejemplo, anti-L2 o anti L3) mAbs para mostrar el incremento de peso molecular de LOS para una mayor proporción de LOS en las ampollas a medida que transcurre el tiempo de reacción. Se pueden recuperar 99% de ampollas usando dichas técnicas. Se encontró que EDAC es un agente de reticulación intra-ampollas excelente porque retículo LOS a OMP suficientemente para mejorar la inmunogenicidad dependiente de T de LOS, pero no lo retículo a tal alto grado que se produjeran los problemas tales como escasa filtrabilidad, agregación y reticulación intra-ampolla. La morfología de las ampollas generadas es similar a la de las ampollas no conjugadas (mediante microscopio electrónico). Además, el protocolo anterior evitaba que tuviese lugar una demasiada reticulación (que puede disminuir la inmunogenicidad de las OMP protectoras presentes naturalmente en la superficie de la ampolla por ejemplo TbpA o Hsf).

Técnicas para aislar ampollas Las vesículas de membrana externa (abreviadamente OMV o ampollas) se pueden aislar mediante muchas técnicas conocidas (Fredriksen y col , NIPH Annals (1 991 ), 14,67 - 79; Zollinger y col. , J. Clin Invest (1 979), 63, 836 - 848; Saunders y col , ¡nfect Immun (1999), 67, 13 -1 1 9; J. J. Drabick y col , Vaccine (1 999), 1 8, 160 - 172) . Éstos se dividen en dos grupos principales de técnicas que usan desoxicolato (alrededor de 0.5%) para extraer ampollas de meningococo y técnicas que usan bajos niveles de desoxicolato (abreviadamente DOC) o nada de desoxicolato en absoluto . El DOC libre que produce ampollas tiene la característica interesante de mantener alto nivel de LOS en las O MV q ue es ventajoso en una vacuna donde LOS es un antígeno protector. Comparadas con las ampollas extraídas con DOC la concentración de L3 Ags en OMV obtenida mediante un procedimiento exento de DOC es aproximadamente diez veces más alta. Por esta razón se prefiere un procedimiento exento de detergente (preferiblemente exento de DOC) de preparación de ampollas para los propósitos de los procedimientos de esta invención, aunque la extracción con un tampón que contiene bajos niveles de detergente (preferiblemente DOC) puede también ser ventajosa en que la etapa dejaría la mayoría de LOS que interacciona estrechamente en la ampolla mientras que elimina cualquier LOS más tóxico flojamente retenido. Típicamente 0 - 0.5% Y preferiblemente 0.02 - 0.4%, 0.04 3% ó 0.06 - 2% de detergente (preferiblemente DOC) se utiliza para la extracción de ampollas, más preferiblemente 0.08 - 0.15% y más preferiblemente alrededor de o exactamente 0.1 % se utiliza para obtener una cantidad óptima de LOS para estar establemente presente en las ampollas. Los procedimientos de extracción exentos de DOC (o bajos en DOC) se prefieren particularmente cuando los LOS se han destoxificado mediante uno o más de los procedimientos detallados anteriormente. Se prefiere que el contenido de LOS en las ampollas, en todas las modalidades de la presente invención sea 3-30. 5-25, 10-25, 15-22 y, muy preferible, aproximadamente o exactamente 20 por ciento de contenido de LOS, cuando se mide mediante manchado con plata, después de electroforesis SDS-PAGE, usando LOS purificado como una norma (véase el método de Tsai, J. Bioí. Standardization (1986) 14: 25-33). Usando Nmen L3 LOS como norma en este método, en general el contenido de LOS en ampollasde Nmen, del inmunotipo L3, extraídas con 0.1 por ciento de DOS es aproximadamente 20 por ciento de LOS, con 0.2 por ciento de DOS, es aproximadamente 15 por ciento de LOS; con 0.3 por ciento de DOC es aproximadamente 10 por ciento de LOS; y con 0.5 por ciento de DOC es aproximadamente 5 por ciento de LOS.

Composiciones de vacunas Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden formular fácilmente en forma de composiciones de vacunas mediante la adición de un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un procedimiento para fabricar las composiciones inmunogénicas de Neisserla (preferiblemente meningocócica) o vacunas de la invención se proporciona adicionalmente comprendiendo las etapas de aislar LOS purificados de la invención (preferiblemente L2 o L3) como se ha descrito anteriormente o producir ampollas aisladas de la invención (preferiblemente con un inmunotipo L2 o L3) como se ha descrito anteriormente y formular los LOS o ampollas con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente LOS purificados o ambos ¡nmunotipos L2 y L3 de la invención, o ampollas de ambos inmunotipos L2 y L3 de la invención, o un LOS purificado de L2 y una ampolla de L3 (o viceversa), se combinan en una etapa de mezcla. Preferiblemente los LOS purificados o ampolla de la invención se han conjugado como se ha descrito anteriormente después del aislamiento. También se puede añadir una etapa adicional de formulación de liposomas para los LOS purificados (usando técnicas conocidas en la técnica, véase por ejemplo el documento WO 96/40063 y referencias citadas en esta memoria descriptiva). Preferiblemente las preparaciones de ampollas se aislan mediante extracción con concentraciones bajas (o sin) de DOC (como se ha descrito anteriormente). Dichos procedimientos de combinación de L2 y L3 pueden producir una vacuna que es eficaz contra casi todas las cepas de meningococos B. Las composiciones inmunogénicas anteriores (o procedimientos) pueden tener añadidos uno o más (2, 3 ó 4) polisacáridos u oligosacáridos meningocócicos (bien puros o conjugados a un portador que comprende epitopos de células T, como se ha descrito anteriormente) de serogrupos A, C, Y o W a la composición. Preferiblemente al menos se añade C (más preferiblemente conjugado) y más preferiblemente A y C o Y y C (preferiblemente todos conjugados) y muy preferiblemente A, C, Y y W (preferiblemente todos conjugados). Ventajosamente un polisacárido u oligosacárido capsular B de H. influenzae también se incluye en las composiciones anteriores para genera una vacuna de meningitis universal. Preferiblemente las composiciones que consisten en o que comprenden composiciones específicamente individualizadas en el documento WO 94/08021 no se reivindican en la presente invención.

Formulaciones de vacunas de la invención Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden formular con un adyuvante adecuado para generar composiciones de vacunas de la invención. Los adyuvantes adecuados comprenden una sal de aluminio tal como gell hidróxido de aluminio (abreviadamente alum) o fosfato de aluminio (preferiblemente hidróxido de aluminio), pero también puede ser una sal de calcio (particularmente carbonato cálcico), hierro o cinc, o puede ser una suspensión ¡nsoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónica o amónicamente derivatizados, o polifosfacenos. Los sistemas adyuvantes adecuados de Thl que se pueden añadir incluyen lípido A monofosforilo, particularmente lípido A monofosforilo de 3-de-Oacilado (u otros derivados de LPS no tóxicos) y una combinación de lípido A monofosforilo, preferiblemente lípido A monofosforilo de 3-de-Oacilado (abreviadamente 3D-MPL) [o derivados de LPS no tóxicos] junto con una sal de aluminio (preferiblemente fosfato de aluminio. Un sistema potenciado implica la combinación de un lípido A monofosforilo y un derivado de saponina particularmente la combinación de OS21 [u otra saponina] y 3D-MPL [o un derivado de LPS no tóxico] como se describe en el documento WO 94/001 53 o una com posición menos reactogénica donde la OS21 [o saponina] se inactiva con colesterol como se describe en el documento W096/33739. Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica OS21 , 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento W095/1 721 O y es una formulación preferida que también puede añadirse. Otros adyuvantes que también se pueden añadir comprenden una saponina, más preferiblemente OS21 y/o una emulsión de aceite en agua y tocoferol. También se puede añadir oligonucleótidos q ue contienen CpG sin metilar (documento WO 96/02555). La preparación de vacunas se describe generalmente en Vaccine Design (" The subunlt and adjuvant approach"(eds Powell M. F. Y Newman M. J.) (1995) Plenum Press, Nueva York). Una dosis inmunoprotectora de vacunas se puede administrar mediante la vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir las vías de inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante la administración a la mucosa a los tractos oral/alimentarío (preferiblemente administración intranasal) , respiratorio, genitourinario. Típicamente la cantidad de ampolla en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo del tipo de inmunógeno específico utilizado y como se presenta. Generalmente se espera que cada dosis comprenderá 1 - 100 pg de cada ampolla, preferiblemente 5 - 50 pg y más típicamente en el intervalo 5 - 251 Ig .

Mejoras adicionales a las composiciones inm unoqénicas de las ampollas de la invención Las composiciones de ampollas anteriores de la invención se pueden mejorar adicionalmente en eficacia en vacunas de la invención si la cepa de Neisseria de las q ue se derivan (incluyendo gonococos y preferiblemente meningococos, más preferiblemente H. meningitidis B) tienen uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) regulados hacia niveles mayores mediante la inserción de copias adicionales del gen en el genoma, o introduciendo un promotor más fuerte corriente arriba del gen existente, o cualquiera de las otras formas descritas en el documento WO 01 /09350 que son capaces de inducir cepas modificadas para fabricar sobre 1 ,2, 1 , 5, 2, 3, 5 ó 1 0 veces el nivel de antígeno comparado con la cepa no modificada: NspA (documento WO 96/2941 2), Hsf o truncados de los mismos (documentos WO 99/31 132 y WO 01 /55182; también conocido como NhhA), Hap (documento PCT/E99/02766) O P85 (documento WO 00/23595, PilQ (documento PCTIE99/03603J, PidA (documento PCT/EP99/03603), FrpB (documento WO 96/3161 8), TbpA (documentos WO92/03467, US591 12336, W093/06861 Y EP586266), TbpB (documentos W093/06861 y EP586266), NadA (Comanducci y col. , J. Exp. Med 2002 195: 1445 - 1454), FrpAI FrpC o porciones en común entre estos antígenos que implican 5 o más secuencias repetidas (documento WO 92/01460; Thompson y col, (1993) J . BacterioL 1 75: 81 1 - 81 8; Thompson (1993) Infect. Immun. 61 : 2906 -291 1 ), LbpA, LbpB (documento PCT/EP98/051 17), FhaB (documento W098/02547 SEC ID N° 38 [nucleótidos 3083 - 9025]), HasR (documento PCTIEP99/05989), Iipo02 (documento PCT/EP99/0831 5). Tbp2 (documento WO 99/57280;, MitA (documento WO 99/57280;, TspA (documento WO 00103003;, TspB (documento WO 001 03003) y ctrA (documento PCT/EPOOI00135). Donde Hsf se menciona en esta memoria descriptiva, el término puede ser sustituible en cada caso por truncados de Hsf, en particular los descritos en WO 01 /551 82. Se prefiere particularmente si tanto Hsf como TbpA (formas de peso molecular bajo o alto, o ambos bajo y alto [documento EP 586266] , o Hsf y OMP85, u OMP85 y TbpA (formas de peso molecular bajo o alto, o ambos bajo y alto), o NspA y Hsf, o NspA y OMP85. o NspA y TbpA (formas de peso molecular bajo o alto, o ambos bajo y alto) están ambos regulados hacia niveles mayores. Donde 2 ampollas están comprendidas en la composición, se prefiere que cada ampolla tenga diferentes regulaciones hacia niveles mayores. Si TbpA alto y bajo se van a regular hacia niveles mayores, se prefiere q ue estos regulan hacia niveles mayores en dos ampollas separadas presentes en la composición derivada de 2 cepas que comprenden naturalmente las 2 formas de TbpA. Más preferiblemente, las dos cepas tienen ¡nmunotipos de LOS L2 Y L3. TbpA se puede regular hacia niveles mayores genéticamente o mediante desarrollo de las cepas de producción de Neisseria/meningocócica en condiciones limitadas de hierro por ejemplo en presencia de 50 - 70 tM de Desferal (mesilato de deferoxamina, disponible de Sigma). Si se toma el último planteamiento, se prefiere que el gen de expresión de FrpB se regule hacia niveles menores (preferiblemente suprimido) ya que este antígeno variable puede hacerse ¡nmunodominante en ampollas aisladas de cepas meningocócicas aisladas en condiciones limitadas de hierro. En una realización preferida, la composición de la invención comprende una ampolla de L3 de un -msbB' de polisacárido capsular de IgtB' preferiblemente regulado hacia niveles mayores en TbpA alto y Hsf y una ampolla de L2 de un msbB- de polisacárido capsular de IgtS-preferiblemente regulado hacia niveles mayores en TbpA bajo y Omp85. Más preferiblemente ambas ampollas están adicionalmente reguladas hacia niveles menores de expresión de PorA y/o FrpB y opcionalmente la expresión de OpC y/o OpA. Las ampollas se aislan más preferiblemente mediante un procedimiento de DOC bajo como se ha descrito anteriormente y el LOS en ambas ampollas está reticulado intra-ampolla a la proteína de membrana externa.

Vacunas de células fantasma o enteras muertas Los inventores contemplan que las composiciones y vacunas anteriores concernientes a las ampollas se pueden fácilmente extender a procedimientos que conciernen a las preparaciones y vacunas de células fantasmas o enteras muertas (con idénticas ventajas) Los procedimientos para fabricar preparaciones fantasma (células vacías con envolturas intactas) de cepas Gram negativas se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo el documento WO 92/01791 ). Los procedimientos para matar células enteras para fabricar preparaciones de células inactivadas para uso en vacunas también se conocen bien. Por lo tanto las composiciones y vacunas que implican ampollas descritas en todo este documento se contemplan para ser aplicables a las mismas composiciones o vacunas que comprenden preparaciones equivalentes de células fantasma y muertas enteras de la invención.

Análisis bactericidas en suero de las composiciones de la invención El ensayo bactericida en suero es el procedimiento preferido para valorar relaciones sinérgicas entre antígenos cuando se combinan en una composición inmunogénica de la invención. Tal respuesta sinérgica se puede caracterizar mediante el SBA provocado por la combinación de antígenos que son al menos 50%, dos veces, tres veces preferiblemente cuatro veces, cinco veces, seis veces siete veces, ocho veces, nueve veces y más preferiblemente diez veces más alto que el SBA provocado por cada antígeno separadamente.

Preferiblemente SBA se mide contra una cepa homologa de la que se derivan los antígenos y preferiblemente también contra un panel de cepas heterólogas. (Véase más adelante para un panel representativo por ejemplo BZ10 (B:2b:P1 ,2) que pertenecen al grupo A-4; B16B6 (B2a: P1 ,2) perteneciente al complejo ET-37; y H44176 (B:15:P1 ,7, 16)). SBA es el marcador inmunológico comúnmente acordado para estimar la eficacia de una vacuna meningocócica (Perkins y coL, J. Infecí Dis. 1998, 177: 683 -691 ). SBA se puede averiguar satisfactoriamente mediante cualquier procedimiento conocido. SBA se puede llevar a cabo usando sueros obtenidos de modelos de animales o de sujetos humanos. Un procedimiento preferido de manejar SBA con sueros humanos es el siguiente. Se toma una muestra de sangre antes a la primera vacunación, dos meses después de la segunda vacunación y un mes después de la tercera vacunación (tres vacunaciones en un año siendo un programa de vacunación principal humana administrada en, por ejemplo, 0. 2 y 4 meses, ó 0. 1 y 6 meses. Tales programas de vacunación principal humana se pueden llevar a cabo en niños de un año de edad (por ejemplo al mismo tiempo como se llevan a cabo las vacunaciones con Hib) o de 2 -4 años de edad o adolescentes también se pueden vacunar para el SBA de ensayo con dicho programa de vacunación principal. Una muestra adicional de sangre se puede tomar 6 a 12 meses después de la vacunación principal y un mes después de la dosis de refuerzo, si es aplicable. SBA será satisfactorio para un antígeno o preparación de ampollas con actividad bactericida homologa si un mes después de de la tercera dosis vacuna (del programa de vacunación principal) (en niños de 2 - 4 años de edad o adolescentes, pero preferiblemente en niños en el primer año de vida) el porcentaje de sujetos con un crecimiento cuatro veces en términos de título de SBA (dilución de anticuerpo) (comparado con el título de prevacunación) contra la cepa de meningococo de la que los antígenos de la invención se derivaban es mayor que 30%, preferiblemente mayor que 40%, más preferiblemente mayor que 50% y más preferiblemente mayor que el 60% de los sujetos. Ciertamente un antígeno o preparación de ampollas con actividad bactericida heteróloga también puede constituir preparación de ampollas con actividad bactericida homologa si puede también provocar SBA satisfactoria contra la cepa meningocócica de la que se deriva. SBA será satisfactorio para un antígeno o preparación de ampollas con actividad bactericida heteróloga si un mes después de la tercera dosis de vacuna (del programa de vacunación principal) (en niños de 2 - 4 años de edad o adolescentes, pero preferiblemente en niños en el primer año de vida) el porcentaje de sujetos con un crecimiento cuatro veces en términos de título de SBA (dilución de anticuerpo) (comparado con el título de prevacunación) contra tres cepas heterólogas de meningococo es mayor que 20%, preferiblemente mayor que 30%, más preferiblemente mayor que 35% y más preferiblemente mayor que 40% de los sujetos. Tal ensayo es una buena indicación de si el antígeno o preparación de ampollas con actividad bactericida heteróloga puede inducir anticuerpos bactericidas cruzados contra diversas cepas meningocócicas. Las tres cepas heterólogas deben preferiblemente tener complejo de tipo electroforético (abreviadamente ET) o configuración de tipo de secuencias multilocus (abreviada mente MLST) (véase Maiden y co!. , PNAS Estados Unidos 1998,95: 3140 - 5) a cada otra y preferiblemente a la cepa de la que el antígeno o preparación de ampollas con actividad bactericida heteróloga se fabrica o deriva. Una persona experta será capaz de determinar fácilmente tres cepas con complejo ET diferente que reflejan la diversidad genética observada entre meningococos, particularmente entre cepas de meningococo de tipo B que se reconocen que son la causa de la carga de enfermedad significativa y/o que representan líneas hipervirulentas de MenB reconocidas (véase Maiden y col. , anteriormente). Por ejemplo tres cepas que se podrían utilizar son las siguientes: BZ1 0 (B:2b:P1 ,2) perteneciente al grupo A-4; B16B6 (B:2b:P1 ,2) perteneciente al complejo ET-37; y H44176 (B: 15:P1 ,7, 16) perteneciente al complejo ET-5, o cualquiera otra cepa perteneciente al mismo grupo ET. Dichas cepas se pueden usar para ensayar un antígeno o preparación de ampollas con actividad bactericida heteróloga fabricada o derivada de, por ejemplo, la cepa meningocócica CU385 (B:4:P1 ,5) que pertenece al complejo ET-5. Otra cepa de muestra que se podría utilizar es del clon epidémico de la línea 3 (por ejemplo NZ124 [B:4:P1 ,7, 4]. Otra cepa de ET-37 es NGP165 (B:2a:P1 ,2). Los procedimientos para medir la actividad de SBA se conocen en la técnica. Por ejemplo un procedimiento que podría usarse se describe en el documento WO 99/09176 en el ejemplo 1 0C. En términos generales, un cultivo de la cepa a ensayarse se desarrolla (preferiblemente en condiciones de supresión de hierro mediante adición de un agente quelante de hierro tal como EDDA al medio de crecimiento) en la fase logarítmica de crecimiento. Esto se puede suspender en un medio con BSA (tal como medio de Hanks con BSA al 0.3%) con el fin de obtener una suspensión de células de trabajo ajustada a aproximadamente 20000 UFC/ml. Una serie de mezclas de reacción se pueden preparar mezclando una serie de diluciones dos veces de sueros a ensayarse (preferiblemente inactivados por calor a 56°C durante 30 minutos) [por ejemplo en un volumen de 50 µ?/concavidad] y la suspensión a ensayarse de la cepa meningocócica de 20000 UFC/ml [por ejemplo en un volumen de 25 µ?/concavidad). Los frascos de la reacción se deben incubar (por ejemplo 37DC durante 15 minutos) y agitarse (por ejemplo a 210 rpm). La mezcla final de reacción [por ejemplo en un volumen de 100 1 -1 1] adicionalmente contiene una fuente de complemento [tal como 25% de volumen final de suero de conejo pequeño preensayado, o suero humano para serología humana] y se incuba como antes [por ejemplo 37°C durante 60 minutos]. Se puede usar para este ensayo una placa de microtitulación de fondo en U de 96 concavidades de poliestireno estéril. Una alícuota [por ejemplo 10 µ?] se puede tomar de cada concavidad usando una pipeta multicanal y gotearse en placas de agar de Mueller - Hinton (conteniendo preferiblemente 1 % de Isovitalex y 1 % de suero de caballo inactivado por calor) e incubadas (por ejemplo durante 1 8 horas a 37°C en C02 al 5%). Preferiblemente, se pueden contar colonias individuales hasta 80 UFC por alícuota. Las siguientes tres muestras de ensayo se pueden utilizar como controles: tampón + bacterias + complemento; tampón + bacterias + complemento inactivado; suero + bacterias + complemento inactivado. Los títulos de SBA se pueden calcular sencillamente usando un programa que procesa los datos para dar una medida de la dilución que corresponde al 50% de muerte celular mediante un cálculo de regresión. Todas las referencias de solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva de la patente se incorporan como referencia en esta memoria descriptiva.

EJ EMPLOS Los ejemplos citados más adelante se llevan a cabo usando técnicas convencionales, que se conocen bien y rutinariamente por los expertos en la técnica, excepto donde de otra manera se describe en detalle. Los ejemplo son ilustrativos pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Los ejemplos describen genes de supresiones que codifican proteínas implicadas en la producción de polisacáridos capsulares 8 de meningococo 8, la supresión del gen PorA, la regulación hacia niveles mayores de diversas proteínas de membrana externa en la superficie de ampollas meningocócicas, la regulación hacia niveles menores de proteínas inmunodominantes o enzimas biosintéticas y procedimientos para aislar ampollas se describen en el documento WO 01 /09350.

Ejemplo 2 : LOS : un antíqeno protector cruzado clave Para valorar el papel de LOS como un antígeno protector cruzado potencial, cepa de meningococo B H44/76 de tipo salvaje (abreviadamente WT) (que expresa LOS L3) y una cepa H44176 modificada que expresa un "LOS de tipo galE" (con una estructura corta como para un LOS IgtE-) se usaron para producir ampollas según dos procedimientos diferentes. El primer procedimiento usaba 0.1 % de DOC con el fin de tener altos niveles de LOS en ampollas, el segundo usaba 0.5% de DOC para tener bajos niveles de LOS en las ampollas resultantes. Los ratones recibieron tres inyecciones (el día O, 21 Y 28) por vía 1 M de 5 l-lg de ampollas adsorbidas en sales de AI3+(fosfato de aluminio) y 3D-MPL por dosis. Se tomaron muestras de sangre14 días después de la tercera inyección. Se efectuó un análisis ELISA de LOS anti-L3 en suero combinado y usando LOS L3 purificado. Los resultados mostrados en la figura 3A muestran claramente que el procedimiento con 1 % de DOC producía ampollas capaces de provocar una respuesta anti - LOS en ratones. Esto demuestra que LOS galE- y LOS L3 son capaces de inducir la producción de anticuerpos. Por otra parte 0.5% de DOC extraía demasiado LOS con el fin para él de actuar como un antígeno clave en la vacuna de ampollas. Se llevaron a cabo análisis bactericidas de suero SBA en sueros individuales usando diferentes cepas de NmenB: la cepa WT H44/76 homologa, una cepa PorA(-) H44176 y dos cepas heterólogas basadas en subtipo suero) Cu385 y NZ124. Estas cuatro cepas expresan un LOS L3. Se añade una quinta cepa. Comparada con H44/76, esta cepa (81686) es heteróloga no solamente para PorA sino también para LOS (es una cepa de inmunotipo L2). Los resultados mostrados en la figura 3B indican una respuesta bactericida cruzada solamente contra cepas L3 pero solamente con las ampollas de 0. 1 % de DOC WT. No se observó respuesta bactericida cruzada para ampollas gal E de 0.1 % de DOC y ampollas WT de 0.5% de DOC. Además, se conoce bien que la respuesta bactericida inducida por anticuerpos PorA es serotipo depend iente. Esto también se observó en este experimento con bien ampollas WT de 0.5% de DOC o ampollas de galE y también con datos de S BA hechos con la cepa PorA(-) H44/76. Todos estos resultados sugieren q ue la respuesta bactericida cruzada inducida por ampollas que contienen alto porcentaje de LOS L3 se debe a la producción de Abs dirigida contra el antígeno LOS. Solamente el LOS L3 (y no el LOS galE-) es capaz de provocar la producción de anticuerpos bactericidas. Aunque, en ELISA se observó una buena respuesta anti - LOS con ampollas galE' de 0.1 % de DOC, esta respuesta no es biológicamente relevante (sin SBA). Además parece también que la respuesta es especifica de inmunotipo de LOS como Abs LOS anti-L3 matan solamente las cepas L3 pero no las cepas L2, indicando q ue una vacuna óptima debe contener idealmente LOS L3 y L2 para cobertura óptima.

Experimento de supresión Con el fin de demostrar que la respuesta inducida por ampollas WT de DOC ala, 1 % se debe principalmente a los anticuerpos anti-LOS, combinaciones de suero se agotaron con diferentes concentraciones de LOS L3 purificado. Después del agotamiento se usaron sueros en un ensayo bactericida contra la cepa homologa WT H44/76. Los resultados obtenidos (véase la figura 3C) con sueros activados contra ampollas WT de 0.1 % de DOC muestran una clara inhibición de dosis - intervalo, demostrando que la mayoría de los anticuerpos inducidos por esta preparación se dirigen contra LOS (confirmando los resultados de SBA generados con la cepa PorA(-) H44/76. En contraste, la respuesta inducida por WT 0.5% de DOC no se dirige contra LOS como se demuestra por SBA hecho con la cepa PorA(-) H44/76 y también indicada por agotamiento de LOS. Este resultado se mantiene probablemente para LOS L2.

Ejemplo 3: Experimentos con ampollas de L3 e intermedio (IqtSO) exentas de DOC (LOS no destoxificado) inducía anticuerpos bactericida cruzada La cepa derivada de meningococos MCS8 usada es B: P,7, 16, opc-, s/aD-. Esta cepa se modificó genéticamente para expresar bien L3 (cepa 2G2) o un epítopo intermedio (cepa 2G EcoN1 b-1 , como 2G2 pero adicionalmente IgtB-) o un LPS en versión corta (cepa C6, que es IgtE).

O V se produjeron según un procedimiento de DOC (0.5%) de altura normal o bien un procedimiento exento de DOC. Se inmunizaron ratones (1 0 por grupo) tres veces mediante la vía intramuscular el día 0. 20 Y 28. Recibían 1 ó 10 pg (contenido en proteína) de ampollas formuladas en AI(OH)3 Se tomaron muestras de sangre el día 28 (posición II) y día 42 (posición III). Se hicieron ensayos bactericidas en sueros combinados y utilizando cepas homólogas ( CS8 y H44/76) y dos cepas heterologas (M97250687 y 9725078) con suero de conejo pequeño como fuente de complemento exógeno. La siguiente tabla resume los resultados (títulos bactericidas para 50% de muerte): Claramente la presencia de L3 (2g2) o epítopo intermedio (2 geconlb -1 ) induce anticuerpos bactericidas cruzados, mientras las ampollas de la cepa LPS truncada (C6) induce un nivel inferior de anticuerpos de reacción cruzados. Esto se ¡lustraba particularmente cuando se inyectó 1 pg de OMV. Además, como se muestra con OMV purificadas con DOC, reduciendo el contenido de LPS de las ampollas se reduce la inducción de anticuerpos bactericidas cruzados. Aparte de LPS aumentado, es posible que ampollas exentas de DOC puedan retener ventajosamente algunas proteínas que interactúan perdidamente con los OMV tales como lipoproteínas.

Ejemplo 4: reticulación intra ampollas de LOS L3 y proteína de membrana externa Las ampollas de Men8 utilizadas se derivan de una cepa H44/76 (LOS de inmunotipo de L3) q ue era SiaD' (de este modo no expresando polisacárido capsular) y PorA' . Se utilizaron dos cepas diferentes: un completo L3 (cepa 8171 7, siad (-) Por A (-) completo L3) y un truncado L3 (cepa 81 727, siad (-) PorA(-) Igt8(-) TrL3). El procedimiento de conjugación de EDAC/N HS se utilizó según procedimientos conocidos para reticular LOS y OMP en las ampollas para obtener el componente de oligosacárido de LOS un antígeno T dependiente (EDAC/N HS se prefiere a formaldehído que se encontró reticular demasiado alto una extensión que afectaba de este modo adversamente la filtrabilidad). EDAC reacciona con ácidos carboxílicos para crear un intermedio de éster activo. En presencia de un nucleófilo de amina, se forma un enlace de amida con liberación de un subproducto de ¡sourea. Sin embargo, la eficacia de una reacción mediada por EDAC se puede incrementar mediante la formación de un intermedio de éster Sulfo-NHS. El éster sulfo-NHS sobrevive en solución acuosa más tiempo que el éster formado de la reacción de EDAC solo con un carboxilato. De este modo se pueden llevar a cabo rendimientos más altos de la formación de enlace de amida usando este procedimiento en dos etapas. La conjugación de EDAC/NHS se describe en J . V. Staros, R. W. Wright y D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 1 56: 220 - 222 (1 986); y Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1 996) pp 1 73 - 1 76.

La mezcla de reacción contenía 1 ,5 mg de Sulfo-NHS y 5 mg de EDAC en sacarosa al 3% (para estabilidad de ampolla) en un volumen final de 1 mi. Las ampollas estaban presentes en una relación de 0.025 mg EDAC/mg de ampollas. Las ampollas estaban presentes en una concentración de 2 mg/ml y el pH se ajustó hasta 7,5 con HCI 0.1 N. La reacción se dejó durante 4 horas a temperatura ambiente y se dializó la mezcla contra tampón fosfato 2 mM que contenía sacarosa al 3%, pH 7,5. Después la mezcla se filtró sobre Sterivex G10 0.22 !-1 m. Se recuperó una producción de 99% de ampollas. La reacción podría seguirse en una transferencia de Western usando anti-L3 mAb. Mediante la reacción del bajo LOS MW se llega a hacer más débil y una nueva banda de MW más alta aparece en el gel. Esta banda de MW más alta parece predominar y puede representar la mayoría de LOS conjugados que llega a estar covalentemente unido a PorB. Se encontró que EDAC es un agente excelente de reticulación intra-ampollas en que reticulaba LOS a OMP irreversiblemente y suficientemente para inmunogenicidad T dependiente de LOS mejorado, pero no se reticulaba a tan alto grado que sucedían problemas tales como escasa filtrabilidad, agregación y reticulación intra-ampollas. La morfología de las ampollas generadas es similar a la de las ampollas no conjugadas (como se observó mediante micrografía electrónica). Además el protocolo anterior evitaba que tuviese lugar una demasiada reticulación (que puede disminuir la inmunogenicidad de OMP protectoras presentes naturalmente en la superficie de la ampolla por ejemplo TbpA).

Ejemplo 5: L3 y L3 truncado (intermedio IgtB-) pueden inducir la producción de ABs bactericida que reconoce LOS L3 truncado (intermedio IgtB; TrL3) O V (ampollas) se produjeron de la cepa de enB H44/76 siaD-PorA- L3 o de H44/76 siad- parA TrL3. Se realizaron dos extracciones diferentes; el porcentaje de DOC usado era bien 0.1 % ó 0, 5%. También se evaluaron dos formulaciones diferentes de adyuvante: Al(OH)3 o fosfato de aluminio + 3D-MPL. Ratones (hembras de ratones OF1 , 6 - 8 semanas de edad, 30 por grupo) se inyectaron 3 veces (en los días O, 21 Y 28) por vía 1 (5 pg de ampollas / inyección). SBA se recogió en la posición 1 1 (día 28) y la posición 1 1 1 (día 42 ) los sueros (sueros combinados o sueros individuales). El título medio geométrico y el título de sueros combinados para 50% de muerte celular era mayor para los sueros inducidos mediante ampollas extraídas con 0.1 % de DOC comparado con la extracción de 0.5% de DOC. Esto se explica probablemente por el hecho que allí tiende a ser 2,5 veces como mucho de LOS en las ampollas anteriores comparada con la última. No había diferencia significativa entre SBA de suero inducido con las ampollas que contienen LOS L3 completo o LOS L3 truncado. Hay un incremento en SBA si las ampollas se adyuvan con fosfato de aluminio + 3D-MPL comparado con hidróxido de aluminio. También se hicieron experimentos de agotamiento de sueros. Los sueros se agotaron usando 1 mg/ml de L3 o LOS trL3 purificados y después se realizaron SBA sobre estos sueros agotados. Los resultados mostraban que Abs bactericida (que contenía anticuerpos anti-L3) su puede agotar casi completamente mediante pretratamiento de LOS trL3 de sueros, y Abs bactericida (que contenía anticuerpos anti-trL3) se puede casi agotar completamente mediante pretratamiento con LOS L3 de sueros.

Los Abs bactericidas anti-L3 son de este modo capaces de reaccionar con LOS trL3 y los Abs bactericidas anti-trL3 son de este modo capaces de reaccionar con LOS L3. Además, de este modo se han demostrado la especificidad de Abs bactericida para una estructura de LOS presente en ambos L3 y LOS trL3. En conclusión, los autores han demostrado que la estructura de TrL3 (en las OMV) es capaz de inducir la producción de Abs bactericida contra cepas L3. En combinación con los experimentos de agotamiento, los autores han mostrado que TrL3 y LOS L3 son estructuras muy próximas en una base inmunológica, y trL3 se puede utilizar para generar Ab capaz de matar cepas L3.

Ejemplo 6: TrL3 soluciona el problema potencial de autoinmunidad con la estructura de L3 completa Si las estructuras L3 y trL3 están tan próximamentes relacionadas inmunológicamente en términos de anticuerpos protectores, ¿hay alguna diferencia entre las estructuras con respecto a las posibles cuestiones de autoinmunidad asociadas con LOS L3 (y L2) [mediante el resto de lacto-N- neotetraosa]? ¿Los autores han dirigido esta cuestión mirando si las aglutininas frías son capaces de reconocer LOS trL3? MAb 1 B2-1 B7 (J Bio Chem 256(1981 ) 1 0967 -10972; y depósito de ATCC número TIB - 189) se conoce que aglutinan los glóbulos rojos de adultos de seres humanos (abreviadamente RBC) a bajas temperaturas y reaccionan con LNnT (lacto-N-neotetraosa). Esto es una aglutinina fría típica. Se utilizó el anticuerpo monoclonal en el siguiente experimento en conjunción con un anticuerpo monoclonal MabL3,7,9 que es capaz de matar cepas meningocócicas L3. Estos dos mAbs se utilizaron en ELISA con microplacas pre-recubiertas con poli-L-lisina (1 pg/ml, 2 h a 37°C) y después de recubrieron con L3 purificado o LOS TrL3 purificado (5 g, durante una noche a 4°C). Después las placas se saturaron con BSA (1 %,30 minutos a temperatura ambiente). Después se llevó a cabo un ELISA convencional con cada uno de los dos anticuerpos. Los resultados (figura 4) muestran claramente que Mab L379 reacciona con L3 y TrL3 (figura 4B) pero 1 B2-1 B7 reacciona solamente contra LOS L3 (figura 4A). De este modo los autores pueden decir que TrL3 no se reconoce por aglutinina fría que reacciona contra estructuras que contienen tetrasacárido LNnT (tal como LOS L3 y glóbulos rojos de seres humanos). De este modo LOS TrL3 tiene las características óptimas de ser mucho tiempo suficiente capaz para retener epítopos protectores, pero brevemente suficientes para perder epítopos que pudieran tener implicaciones autoinmunes en seres humanos. o existe razón para sugerir que esto no debe también ser el caso para la estructura de LOS L2 (IgtB-) truncada propuesta en esta solicitud de patente.

Ejemplo 7: Impacto de reticulación en la piro enicidad/antiqenicidad de ampollas B1820 0.1 % de DOC Ampollas (de la cepa B1820; que se derivaban de H44176 con siaD (-) PorA(-) FrpB(-)Hsf truncado regulado hacia niveles mayores, L3 truncado mediante la cepa de mutación IbtB(-), cultivadas en presencia de desferral, se extrajeron las ampollas con 0.1 % de DOC se reticularon utilizando diferentes concentraciones de EDAC (cuanto más de EDAC está presente, más se reticulan la ampollas). La reticulación es intra-ampolla como se muestra mediante filtración estéril de las ampollas. El contenido en LOS en las ampollas es 18% como se mide mediante tinción con plata después de electroforesis de SDS-PAGE utilizando LOS L3 Nmen purificado como patrón (Tsai, J. Biol. Standarization (1986) 14: 25 - 33). En general el contenido de LOS en las ampollas extraídas con 0.1 % de DOC es alrededor de 20% de LOS, con 0.2% de DOC es alrededor de 15% de LOS, con 0.3% de DOC es alrededor de 10% de LOS y con 0.5% de DOC es alrededor de 5% de LOS. En general las ampollas que comprenden 10% de LOS sin conjugar o más son inaceptablemente pirógenas.

Piroqenicidad en conejos Se ensayaron dos formulaciones (ampollas absorbidas en AI(OH)3 o AIP04) Y los conejos recibieron 500 ng/kg por vía IV en un ensayo de pirogenicidad como se describe en la Farmacopea Europea. Los resultados muestran claramente (en la tabla que viene más adelante) un impacto positivo de la reticulación intra-ampolia en la pirogenicidad de las ampollas. El mismo lote de ampollas se utilizó como control o se reticularon con diferentes concentraciones de EDAC. Cuanto más se reticuiaban las ampollas (más EDAC) eran menos pirógenas. Esto se observó para dos diferentes formulaciones. concentración de EDAC: mg de EDAC por mg de ampollas * suma de incremento de temperatura (°C) individual (3 conejos por grupo) $ suma de seis conejos (3 del grupo de AI(OHh y 3 para el grupo de AIP04) Antiqenicidad de ampollas reticuladas La antigenicidad de las ampollas anteriores (no adsorbidas) se valoró para determinar si la reticulación tenía algún impacto en la antigenicidad de las ampollas. Las diferentes preparaciones de ampollas (reticuladas o no) se recubrieron en una microplaca (10 !-lg/ml, durante una noche a 4°C). Después de lavado y saturación, se añadieron a la placa dilución en serie de MAb L379 o sueros de ratones inmunizados con B1820 DOC al 0.1 ó al 0.5% (30 minutos a temperatura ambiente con agitación). La fijación de anticuerpos en ampollas recubiertas se revelaba usando anti-ratón Ig acoplado a biotina después usando un complejo de estreptavidina-peroxidasa seguido de un revelado usando OPD y H202. La densidad de cada microconcavidad se medía usando un lector de microplacas. Los resultados muestran que MAb L739 (dirigida contra LOS L3 pero también capaz de reaccionar con LOS TrL3 (el muíante IgtB-) y bactericida contra cepas L3) reconoce equivalentemente ampollas B1820 (sin conjugar) no tratadas y las diferentes ampollas reticuladas (sea la que sea la concentración de EDAC utilizada). Véase la figura 5A. La respuesta más alta obtenida con 0.2 y 1 de EDAC podría reflejar un mejor anclaje de LOS en las ampollas o al menos una mejor estabilidad de LOS en ampollas reticuladas a estas concentraciones de EDAC. También se utilizó suero de ratones para valorar la antigenicidad de estas ampollas. Se utilizaron dos diferentes tipos de sueros; el primero se obtuvo de ratones inmunizados con ampollas B1820 0.5% de DOC (ampollas con bajo contenido en LOS < 8% induciendo principalmente anticuerpos antiproteína). El segundo suero se obtuvo de ratones inmunizados con ampollas B1820 0.1 % de DOC (ampollas con contenido en LOS 215% induciendo Abs bactericida cruzado dirigido principalmente contra LOS) Como se observa con MAb, L379 los resultados obtenidos con estos dos sueros (figura 5B y 5C respectivamente) no mostraban ninguna diferencia entre ampollas no tratadas (sin conjugar) y ampollas reticuladas (sea la que sea la concentración de EDAC utilizada). En conclusión, parece que la antigenicidad de LOS no se afectaba por la reticulación y que la antigenicidad "global" de las ampollas tampoco se modificaba por el tratamiento de EDAC. Los experimentos de inmunogenicidad en ratones están en curso para confirmar que la reticulación (con altas concentraciones de EDAC) no destruye la inmunogenicidad de antígenos protectores clave. Sin embargo, los resultados preliminares (ejemplo 8) muestran donde la reticulación se hizo con 0.05 de EDAC en ampollas extraídas con 0.5% de DOC indicaban un incremento en la inmunogenicidad de estas ampollas después de tratamiento con EDAC.

Ejemplo 8 : Inm u nogenicidad de am pollas reticuladas (quím ica con 0.05 mg de EDAC) En este experimento se produjeron ampollas de la cepa B1727. Esta cepa es una cepa modificada genéticamente de H44/76, que es siaD(-) PorA(-) trL3 (IgtB-) Hsf+ TbpA regulada hacia niveles mayores) Se extrajeron las ampollas utilizando 0.5% de DOC. Se inmunizaron los ratones tres veces (los días 0, 21 Y 28) por vía 1 M. Por inyección, recibían 5 pg de ampollas adsorbidas en AI(OH)3. Se realizó un ensayo bactericida de suero contra la cepa H44/76 en sueros individuales tomados 14 días después de la tercera inyección. Los resultados muestran un impacto positivo de tratamiento de EDAC sobre el número de respondedores (número de ratones con título de SBA > 100) : 37% de respondedores para ampollas tratadas con EDAC y solamente 1 7% con ampollas no modificadas. La ausencia de 3D-MPL en form ulación y el relativamente bajo porcentaje de LOS en las preparaciones de ampollas (alrededor de 5%) después de extracción con 0.5% de DOC explican la bajas respuestas.

También se realizó un ELISA de anti-Hsf para determinar si la reticulación tiene un impacto en la inm unogenicidad de esta proteína. Los resultados (obtenidos en sueros combinados) indican que la reticulación no tiene impacto en la respuesta de Ig anti-Hsf. No se detectó IgM.

Ejemplo 9: Datos de LOS TrL3 El siguiente experimento valoraba: el impacto de LOS L3 (IgtB (-)TrL3) en la inducción de Abs capaz de reaccionar con LNnT (lacto-N-neotetraosa); la inducción de anticuerpos bactericidas de la construcción anterior. Se produjeron las ampollas a partir de dos cepas genéticamente modificadas de H44/76. Ambas eran siaDO PorA(-) pero una producía un WT L3 LOS Y la segunda un LOS TrL3 (IgtB(-)). Estas ampollas se produjeron según dos procedimientos diferentes con el fin de tener alto contenido en LOS (alrededor de 18%, usando extracción con 0.1 % de DOC) o bajo contenido en LOS próximo al 5%, usando extracción con 0.5% de DOC). Los ratones se inmunizaron tres veces (los días 0, 21 y 28) por vía M con 5 pg de ampollas (por inyección) adsorbidas en AI(OH)3 con o sin 3D- PL.

ELISA de anti-LNnT Procedimiento: se recubrieron microplacas con LNnT conjugado a albúmina sérica de tipo humano mediante un espaciador (ADH) (5 Mg de conjugados por mi en PBS, 100 i g por microconcavidad). Después de una incubación durante una noche a 4°C, se lavaron las placas y se saturaron con 1 % de PBS-BSA (40 minutos a temperatura ambiente). Después de lavado, se diluyeron en serie en 0.2% de PBS - 0.5% de BSA. Se añadió Tween 20 (30 minutos a temperatura ambiente). La fijación de IgG a LNnT se reveló mediante anti-ratón-lgG acoplado a peroxidasa (Jackson) seguido de incubación con OPDA y H202. Resultados: El control positivo es 1 B2-1 B7 MAb. Este MAb reacciona con LNnT y con LOS L3 (pero no LOS TrL3) (véase ejemplo anterior) y aglutina los glóbulos rojos de seres humanos. El control negativo (-) es forma de sueros de ratones inmunizados con adyuvante solo. Los resultados (figura 6) muestran claramente que solamente las ampollas de L3 con alto contenido en LOS (0.1 % de DOC) inducen la producción de IgG capaz de reaccionar con LNnT. Las ampollas de Tr L3 con un contenido similar de LOS no inducen la producción de IgG dirigida contra LNnT, como no ambas preparaciones de ampollas que contienen menor cantidad de LOS (0.5% de DOC).SBA en la cepa H44176 Se realizaron ensayos de SBA contra la cepa H44/76 en sueros individuales tomados 14 día después de la tercera inyección. Los resultados muestran claramente más adelante que ampollas LOS trL3 (lgtB(-»inducen niveles similares de anticuerpos bactericidas que LOS L3 (véase GMT pero también el número de ratones con el título de SBA > 1 / 00 (=SC» Ejemplo 10: Eliminación de FrpB Los siguientes datos son un sumario de dos experimentos preclínicos. En estos experimentos dos cepas genéticamente modificadas de H44176 se utilizaron para producir ampollas usando 0.1 % de DOC. Las ampollas obtenidas mediante este procedimiento tienen un contenido en LOS próximo a 20%. Las dos cepas de H44/76 eran las siguientes: B1733: siaD(-) Por A(-) Tr (truncada) Hsf regulada en ascenso lgtB(-) B1820: siaD(-) Por A(-) TrHs regulada hacia niveles mayores IgtB(-) FrpB(-) Las ampollas se produjeron después de que las cepas se desarrollaran en presencia de desferral para regular hacia niveles mayores la producción de proteínas dependientes de hierro tales como LbpAIB, TbpAIB, FrpB (en B1733), etc. Las diferentes preparaciones de ampollas se adsorbieron en AI(OH)3 y se inyectaron en ratones por vía 1 M dos veces, con una separación de tres semanas. Se tomaron muestras de sangre 7 días después de la segunda administración. Los ratones recibían por inyección 5 pg de ampollas.

Resultados de SBA Se realizaron ensayos bactericidas en tres cepas de L3 (la cepa de tipo salvaje homologa H44176 y dos cepas heterólogas de L3: NZ124 y M97250687. Los resultados muestran claramente que las ampollas (B1 820) FrpB(-) (eliminación) inducen una mejor respuesta bactericida cruzada heteróloga (títulos altos y mejor seroconversión (abreviadamente SC)) que las ampollas (B1733) FrpB(+). La respuesta homologa, aunque se reducía mediante la supresión de FrpB, es todavía satisfactoria. Estos datos sugieren que FrpB es un mayor conductor en la respuesta inmune provocada por ampollas, pero, como esta proteína de membrana externa es altamente variable, los anticuerpos dirigidos contra esta proteína son solamente capaces de inducir la muerte de la cepa homologa. La supresión de FrpB en la cepa de producción de ampollas es por lo tanto un medio ventajoso de mejorar la cobertura de la vacuna de ampollas producida.

Ejemplo 1 1 : 1 m ampollas Dos cepas de NmenB se utilizaron para esta evaluación: la cepa de control que es galE( -) [y de este modo incapaz de fabricar polisacárido capsular] la cepa muíante msbB: que es galE(-) y msbB(-) Las ampollas se produjeron a partir de estas dos cepas usando 0.1 % de DOC con el fin de tener más de 15% de contenido en LOS en las OMV (ampollas). Como se ha establecido en los ejemplos previos, las preparaciones de ampollas con un contenido en LOS mayor que 10% no son satisfactorias desde un punto de vista de pirogenicidad y fracasa el ensayo de pirogenicidad en conejos de la Farmacopea Europea. Las ampollas anteriores se formularon en AI(OH)3 (50 pg de OMV(500 pg de sales de A13) para un ensayo de pirogenicidad en ratones (500 ng de ampollas/kg inyectados por vía IV). Los resultados más adelante demuestran claramente que la supresión de msbB (particularmente en una cepa incapaz de fabricar polisacárido capsular) permite la producción de ampollas que son no pirógenas en conejos incluso para un contenido en LOS mayor que 15%.

Reglas de la Farmacopea Europea: "Pasa" si la suma de t individuales < 1 .15°C "Fracasa si no repite" si la suma de t individuales está entre 1 .15°C 65°C "Fracasa" si la suma de t individuales > 2.65°C Conclusión : Una composición que comprende ampollas L3 y L2 derivadas de cepas meningocócicas que tienen las mutaciones IgtB(-) y msbB(-) y se extraen con bajas concentraciones de desoxicolato (por ejemplo 0.1 %) proporciona una base fuerte para una vacuna eficaz, segura contra meningococo B. Las cepas de producción de ampollas son idealmente deficientes en síntesis de polisacárido capsular y tienen LOS que están reticulados intra-ampolla a la proteína de membrana externa. Cualquiera o ambas de PorA(-) y FrpB(-) son de ayuda adicional en la mejora de la eficacia bactericida cruzada, como son regulaciones hacia niveles mayores de antígenos Hsf y/o TbpA

Claims (1)

1. REIVIND1CACI0NES 1. Una preparación de ampollas de Neisseria derivada de una cepa de Neisseria con un inmunotipo LOS L2 o de una cepa de neisseral con un inmunotipo L3 LOS Y en la que la cepa es IgtB-; o una preparación en ampolla de Neisserial que comprende una combinación de ampollas derivadas de una cepa neisserial con un inmunotipo L2 LOS Y una cepa neisserial con un inmunotipo L3 LOS, en la que opcional mente cada cepa es IgtB-. 2. La preparación de ampollas de Neisseria de la reivindicación 1 , en la que la (s) cepa (s) de Neisseria son meningocócicas, preferiblemente serogrupo B. 3. La preparación de ampollas de Neisseria de la reivindicación 1 ó 2, en la que la (s) cepa (s) de Neisseria no pueden sintetizar polisacárido capsular. 4. La preparación de ampollas de Neisseria de la reivindicación 3, en la que la (s) cepa (s) de Neisseria tienen uno de los siguientes genes de polisacárido capsular regulados hacia niveles menores de expresión, y preferiblemente suprimidos, comparados con la (s) cepa (s) nativa (s) a partir de las que se derivan: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA, synB, synC o, preferiblemente, siaD; y en la que cuando las ampollas L2 y L3 están ambas presentes, las cepas de las que se derivan tienen preferiblemente el mismo gen de polisacárido capsular regulado hacia niveles menores de expresión en cada cepa. 5. La preparación de ampollas de Neisseria de las reivindicaciones 1 4, en la que la (s) cepa (s) de Neisseria tienen cualquier o ambos de los siguientes genes de lípido A regulado hacia niveles menores de expresión, y preferiblemente suprimidos, comparados con la (s) cepa (s) nativa (s) a partir de las que se derivan: msbB o htrB, preferiblemente el primero; y en la que cuando las ampollas L2 y L3 están ambas presentes, las cepas de las que se derivan tienen preferiblemente el (los) mismo (s) gen (es) de lípido A regulado hacia niveles menores de expresión en cada cepa. 6. La preparación de ampollas de Neisseria de las reivindicaciones 1 5, en la que la (s) cepa (s) de Neisseria tienen 1 o más de los siguientes genes de proteína de membrana externa regulados hacia niveles menores de expresión, y preferiblemente suprimidos, comparados con la (s) cepa (s) nativa (s) a partir de las que se derivan: porA, porB, opA, opC, pilC o frpB; y en la que cuando las ampollas L2 y L3 están ambas presentes, las cepas de las que se derivan tienen preferiblemente el (los) mismo (s) gen (es) de proteína de membrana externa regulados hacia niveles menores de expresión en cada cepa. 7. La preparación de ampollas de Neisseria de la reivindicación 6, en la que la (s) cepa (s) de Neisseria tienen cualquiera de las siguientes combinaciones de genes de proteína de membrana externa regulado hacia niveles menores de expresión, y preferiblemente suprimidos, comparados con la (s) cepa (s) nativa (s) a partir de las que se derivan: PorA y OpA, PorA y OpC, OpA y OpC, PorA y OpA Y OpC, PorA y FrpB, OpC y FrpB, OpA y FrpB, PorA y OpA Y OpC y FrpB. 8. La preparación de ampollas de Neisseria de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la (s) cepa (s) de Neisseria tienen 1 o más de los siguientes antígenos de proteína de membrana externa regulados hacia niveles mayores de expresión: NspA, TbpA bajo, TbpA alto, Hsf, Hap, OMP85, Pila, NadA, LbpA, MitA; y en la que donde las ampollas L2 y L3 están ambas presentes, las cepas de las que se derivan tienen preferiblemente uno o más antígenos diferentes de proteína de membrana externa regulados hacia niveles mayores de expresión en cada cepa. 9. Una preparación de ampollas de Neísería derivada de una cepa de Neisseria que ha tenido dos o más de las proteínas de membrana externa reguladas hacia niveles menores de expresión, y preferiblemente suprimidas, comparadas con la cepa nativa de la que se deriva: PorA, PorB, OpA, OpC, PilC o FrpB. 1 0. La preparación de ampollas de Neisseria de la reivindicación 9, en la que la cepa de Neisseria ha tenido cualquiera de las siguientes combinaciones de proteínas de membrana externa reguladss hacia niveles menores de expresión, y preferiblemente suprimidas, comparadas con la cepa nativa a partir de las que se deriva: PorA y OpA, PorA y OpC, OpA y OpC, PorA y OpA y OpC, PorA y FrpB, OpC y FrpB, OpA y FrpB, PorA y OpA y OpC y FrpB. 1. La (s) cepa (s) de Neisseria a partir de las que las preparaciones de ampollas de Neisseria de las reivindicaciones 1 - 1 0 se derivan. 12. Una preparación de LOS aislada de la (s) cepa (s) de Neisseria de la reivindicación 1 1 que comprende inmunotipo LOS L2 y/o L3. 13. La preparación de LOS de la reivindicación 12 en una formulación de liposomas. 14. La preparación de las ampollas de Neisseria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 1 0 o la preparación de LOS de la reivindicación 12 ó 1 3, en la que los LOS contenidos en ella se conjugna a una fuente de epítopos auxiliares de T, preferiblemente una proteína o proteína de la membrana externa. 1 5. La preparación de las ampollas de Neisseria de la reivindicación 14 que se puede obtener mediante un procedimiento de reticulación intra-ampollas. 1 6. Una composición o vacu na inmunogénica que comprende la preparación de ampollas de Neisseria la preparación de LOS de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10 ó 1 2 - 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 1 7. La vacuna de la reivind icación 16, que comprende adicionalmente un adyuvante, preferiblemente hidróxido de alum inio, o 3D- PL y fosfato de aluminio. 1 8. La vacuna de la reivindicación 1 6 ó 1 7 que comprende adicionalmente uno o más polisacáridos capsulares conjugados u oligosacáridos derivados de las siguientes cepas: meningococo serogrupo A, meningococo serogrupo C, meningococo serogrupo W-135, meningococo serogrupo Y, y H. influenzae tipo b. 1 9. Un procedimiento de fabricación de vacuna de preparación de ampollas de Neisseria de la reivindicación 16 q ue comprende las etapas de cultivar la (s) cepa (s) de Neisseria de la reivindicación 1 1 , aislar las ampollas de aq uellas, opcionalmente combinar las ampollas L2 y L3 si es adecuado, y formular las ampollas con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la etapa de aislamiento se lleva a cabo mediante extracción con 0- 0.5, 0.02 - 0.4, 0.04 0.3, 0.06 - 0.2 ó 0.08 - 0.15% de desoxicolato, preferiblemente con aproximadamente o exactamente 0.1 % de desoxicolato. 21 . Una preparación de ampollas de una cepa de bacterias Gram -negativas en la membrana externa de la que se integra una proteína de membrana externa conjugada a LOS. 22. La preparación de ampollas de la reivindicación 21 , en la que más de 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 95, ó 99% de LOS conjugados tienen su resto de lípido A integrado en la membrana externa de la ampolla y/o en un ambiente en el que su toxicidad se reduce o se protege de un hospedador al cual se ha administrado. 23. La preparación de ampollas de la reivindicación 21 ó 22, en la que la toxicidad de LOS en la ampolla se reduce comparada con las ampollas con la misma cantidad de LOS no conjugada. 24. La preparación de ampollas de la reivindicación 21 - 23, en la que más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, ó 99% de LOS conjugado está en una conformación nativa adecuada para inducir una respuesta de anticuerpo bactericida contra él cuando se administra a un sistema inmune de hospedador. 25. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 24, en la que los LOS con tiene una conformación adecuada para provocar una respuesta inmune en un reactivo de hospedador contra LOS no conjugados. 26. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 25, en la que la proteína de membrana externa se conjuga al resto de oligosacáridos o polisacáridos de la molécula de LOS. 27. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 26, en la que la proteína de membrana externa y la molécula de LOS son nativas a la cepa de bacterias Gram - negativas de las que las ampollas se derivan. 28. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 27 obtenible mediante un procedimiento de reticulación intra-ampolla. 29. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 28, en la que más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, ó 99% de LOS presente en las ampollas está reticulado. 30. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 29 derivada de una cepa Gram - negativa que no produce polisacárido capsular. 31 . La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 30. en la que el polisacárido capsular no se conjuga a una proteína de membrana externa integrada en la preparación de ampollas. 32. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 31 derivada de una cepa de Moraxella catarrhalis o de Haemophilus influenzae no caracterizable. 33. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 31 derivada de una cepa de Nelsseria preferiblemente Neísseria meningitidis. 34. La preparación de ampollas de la reivindicación 33, en la que la preparación de ampollas comprende LOS L2 conjugados, LOS L3 conjugados o una mezcla de de LOS L2 Y L3 conjugados, preferiblemente conjugados separadamente a al menos 2 ampollas diferentes. 35. La preparación de ampollas de la reivindicación 33 ó 34 derivada de cepas IgtB-, o en la que el LOS tiene una estructura truncada consistente con la que se ha derivado de una cepa q ue es IgtB-. 36. La preparación de ampollas de las reivindicaciones 33 - 35 derivada de cepas htrB y/o msbB, o en la que el resto de lípido de LOS carece de cadenas de acilo secundarias consistente con la que se ha aislado de una cepa meningocócica htrB- y/o msbB-. 37. Una composición o vacuna inm unogénica que comprende la preparación de ampollas de las reivindicaciones 21 - 36 Y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 38. La composición o vacuna inmunogénica de la reivindicación 37 q ue comprende adicional mente un adyuvante, preferiblemente hidróxido de aluminio, o 3D-M PL y fosfato de aluminio. 39. La composición o vacuna inmunogénica de la reivindicación 37 ó 38 q ue comprende adicional mente uno o más polisacáridos u oligosacáridos capsulares conjugados derivados de las cepas siguientes: meningococo serogrupo A, meningococo serogrupo e, meningococo serogrupo W-1 35, meningococo serogrupo Y, y H. influenzae tipo b. 40. Un procedimiento de producir una preparación de ampollas conjugadas ¡ntra-ampolla de una cepa de bacterias Gram - negativas en la membrana externa de la que se integra una proteína de mem brana externa conjugada a LOS, q ue comprende las etapas de: a) aislar ampollas de la cepa Gram - negativa, b) llevar a cabo la química adecuada para conjugar el resto de oligosacáridos de LOS presente en las ampollas a una proteína de membrana externa presente en la misma ampolla, c) aislar la preparación de ampollas conjugadas intra-ampolla, y d) formular opcional mente la preparación de ampollas conjugadas intra ampolla con una preparación adicional de ampollas conjugadas intra-ampolla fabricada mediante el mismo procedimiento pero teniendo un inmunotipo LOS diferente y/o formular al preparación de ampollas con un excipiente farmacéuticamente aceptable para fabricar una composición de vacunas. 41 . El procedimiento de la reivindicación 40 en el que en la etapa a) las ampollas se extraen usando una concentración baja de desoxicolato tal como O 0.3%, preferiblemente alrededor de o exactamente 0.1 %. 42. El procedimiento de la reivindicación 40 ó 41 , en el que en la etapa b) el pH se mantiene entre 7 y 9, preferiblemente alrededor de 7,5. 43. El procedimiento de las reivindicaciones 40 - 42, en el que la etapa b) se lleva a cabo en 1 - 5% de sacarosa, preferiblemente alrededor de 3%. 44. El procedimiento de las reivindicaciones 40 - 43, en el que la etapa b) se lleva a cabo en condiciones de baja concentración de NaCI. 45. El procedimiento de las reivindicaciones 40 - 44, en el que la etapa b) se lleva a cabo con química de EDAC/NHS. 46. El procedimiento de las reivindicaciones 40 - 45, en el que en la etapa a) las ampollas se aislan de una cepa de Neisseria, preferiblemente una cepa meningocócica, más preferiblemente una cepa de meningococo B. 47. El procedimiento de la reivindicación 46 en el que la cepa no puede fabricar polisacárido capsular y es preferiblemente un mutante siaD-. 48. El procedimiento de la reivindicación 46 ó 47 en el que la cepa es un mutante IgtB-. 49. El procedimiento de las reivindicaciones 46 - 48 en el que la cepa es un msbB- y/o htrB-. 50. El procedimiento de las reivindicaciones 46 - 49 en el que la cepa tiene un inmunotipo LOS L2. 51 . El procedimiento de las reivindicaciones 46 - 50 en el que la cepa tiene un inmunotipo LOS L3. 52. El procedimiento de las reivindicaciones 46 - 51 en el que en la etapa d) una preparación de ampollas conjugadas intra-ampolla meningocócica con un inmunotipo L2 fabricado mediante el procedimiento de la reivindicación 50 se combina con una preparación adicional de ampollas conjugada intra-ampolla meningocócica con un inmunotipo L3 fabricado mediante el procedimiento de la reivindicación 51 .