MXPA04010781A

MXPA04010781A - Variantes de polipeptido del factor vii o viia.

Info

Publication number: MXPA04010781A
Application number: MXPA04010781A
Authority: MX
Inventors: Anders Hjelholt Pedersen
Original assignee: Maxygen Holdings Ltd
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2003-04-29
Publication date: 2005-03-07
Also published as: CY1111626T1; ATE488581T1; AU2008261165A1; WO2003093465A1; IL164764A; SI1499719T1; CN101942019A; KR20040106424A; US20060270002A1; EP1499719B1; US20100260741A1; ES2355713T3; JP2010213706A; US7700733B2; US20060276377A1; PL373728A1; CA2483478A1; KR101121593B1; BR0309576A; DE60334983D1

Abstract

La presente invencion se refiere a variantes de polipeptido novedosas de los polipeptidos factor VII, FVII, o factor VIIA, FVIIA, en donde dichas variantes comprenden una sustitucion de aminoacido en las posiciones 10, 32, y en donde ademas, dichas variantes comprenden una porcion de azucar unida covalentemente en un sitio de N-glicosilacion introducido in vivo localizado fuera del domino Gla; dichas variantes de polipeptido son utiles en terapia, en particular para el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la coagulacion, tales como en traumas.

Description

VARIANTES DE POLIPEPTIDO DEL FACTOR VII O Vlla CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a variantes novedosas de polipéptido del factor VII (FVII) o del factor Vlla (FVIIa), en donde dichas variantes comprenden una sustitución de aminoácido en las posiciones 10 y 32 y en donde además, dichas variantes comprenden una porción de azúcar unida covalentemente en un sitio de N-glicosilación introducido ¡n vivo. La presente invención también se refiere al uso de dichas variantes de polipéptido en terapia, en particular para el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la coagulación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION - - - - - La coagulación de la sangre es un procesó qüé"cons¡ste"de una=- ¡nteracción compleja de varios componentes (o factores) de la sangre que finalmente originan un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes de la sangre que participan en lo que se ha referido como la "cascada de coagulación", son proenzimas o zimógenos, esto es, proteínas enzimáticamente inactivas que son convertidas en una forma activa por la acción de un activador. Uno de estos factores de coagulación es el FVII. El FVII es una proteína del plasma dependiente de vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre como una glicoproteína de una sola cadena con un peso molecular de 53 kDa (Broze y Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255:1242-1247). El zimógeno FVII es convertido en una forma activada (FVIIa) por corte proteolítico en un solo sitio, R152-1153, dando como resultado dos cadenas enlazadas por un solo puente disulfuro. El FVIIa en complejo con el factor de tejido (complejo FVIIa) es capaz de convertir tanto el factor IX como el factor X en sus formas activadas, seguido por reacciones que conducen a la producción rápida de trombina y a la formación de fibrina (0sterud y Rapaport, Proc Nati Acad Sci USA 1977; 74:5260-5264). El FVII sufre modificaciones posteriormente a la traducción, incluyendo carboxilación dependiente de vitamina K, que origina diez residuos de ácido ?-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. De esta manera, los residuos Nos. 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 mostrados en la SEQ ID NO: 2, son residuos de ácido ?-carboxiglutámico en el dominio Gla importantes para la actividad del FVII. Otras modificaciones posteriores a la traducción incluyen la unión de porción de azúcar en ~dos~sitios de~N-glicosilación naturales en las posiciones 145 y 322, respectivamente, y dos sitios de O-glicosilación naturales en las posiciones 52 y 60, respectivamente. El gen que codifica para el FVII humano (hFVII) ha sido mapeado en el cromosoma 13 en q34-qter 9 (de Grouchy y otros, Hum Genet 1984; 66:230-233). Contiene nueve exones y abarca 12.8 Kb (O'Hara y otros, Proc Nati Acad Sci USA 1987; 84:5158-5162). La organización genética y la estructura de proteína del FVII son similares a los de otras proteínas procoagulantes dependientes de vitamina K, los exones 1 a y 1 b codificando para la secuencia final; el exón 2 el propéptido y el dominio Gla; el exón 3 una región hidrofóbica corta; los exones 4 y 5 los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico; y el exón 6 a 8 el dominio catalítico de serina proteasa (Yoshitake y otros, Biochemistry 1985; 24: 3736-3750). Existen reportes sobre estructuras tridimensionales experimentales de hFVIIa (Pike y otros, PNAS U.S.A., 1999; 96:8925-30 y Kemball-Cook y otros, J. Struct. Biol, 1999; 127:213-223); de hFVIIa en complejo con el factor de tejido soluble usando métodos cristalográficos de rayos X (Banner y otros, Nature, 1996; 380:41 y Zhang y otros, J. Mol. Biol, 1999; 285: 2089); y de fragmentos más pequeños de hFVII (Muranyi y otros, Biochemistry, 1998; 37:10605 y Kao y otros, Biochemistry, 1999; 38:7097). Se han reportado algunas variantes de FVII construidas por ingeniería de proteína. Véase, por ejemplo, Dickinson y Ruf, J Biol Chem, 1997; 272:19875-19879, Kemball-Cook y otros, J Biol Chem, 1998; 273:8516-8521 , Bharadwaj y otros," J Biol Chem, 1996;" 271 :30685-3069l Ruf-y otros, Biochemistry, 1999; 38:1957-1996; WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; US 5,580,560. Existen reportes sobre la expresión de FVII en BHK u otras células de mamífero (WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y la coexpresión de FVII y endoproteasa kex2 en células eucarióticas (WO 00/28065). Las preparaciones comerciales de FVIIa humano recombinante se venden como NovoSeven®. NovoSeven® está indicado para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes de hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rhFVIIa disponible en el mercado para el tratamiento efectivo y confiable de episodios de hemorragia. En WO 91/1154 se ha reportado una forma inactiva del FVII en la cual está modificada la arginina 152 o la isoleucina 153, o ambas. Estos aminoácidos están localizados en el sitio de activación. WO 96/12800 describe la inactivación del FVIIa mediante un inhibidor de serina proteinasa; una inactivación por carbamilación del FVIIa en el grupo a-aminoácido 1153 ha sido descrita por Petersen y otros, Eur J Biochem, 1999; 261 :124-129. La forma inactivada es capaz de competir con FVII o FVIIa de tipo silvestre para unirse a un factor de tejido e inhibir la actividad coaguladora. Se sugiere usar la forma inactivada del FVIIa para el tratamiento de pacientes que están en estados de hipercoagulación, por ejemplo pacientes con sepsis, en riesgo de sufrir infarto de miocardio o ataque trombótico. . .En _"Summary Basis for ÁpprovaPfor NovoSeven®"; Número de referencia FDA 96-0597, se reportó una vida media de 2.3 horas del rhFVIIa en circulación. Se requiere dosis relativamente altas y administración frecuente para alcanzar y sostener el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Como consecuencia, es difícil de obtener una regulación adecuada de la dosis, y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones sobre el modo de vida del paciente. Con respecto al tratamiento de sangrado incontrolado, tal como en un trauma, se considera que el factor VI la es capaz de activar el factor X o el factor Xa sin unirse al factor de tejido, y se cree que esta reacción de activación ocurre principalmente en plaquetas de la sangre activadas (Hedner y otros, Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2000; 11 ; 107-1 11 ). Sin embargo, el hFVIIa o el rhFVIIa tiene una actividad baja para con el factor X en ausencia de factor de tejido y, consecuentemente, el tratamiento de sangrado incontrolado, por ejemplo en pacientes con trauma, requiere dosis múltiples y relativamente altas de hFVIIa o rhFVIIa. Por lo tanto, para tratar el sangrado incontrolado más eficazmente (para minimizar la pérdida de sangre), se requieren moléculas de FVIIa mejoradas, que posean una actividad alta para con el factor X en ausencia de factor de tejido. Tales moléculas de FVIIa mejoradas exhibirán un tiempo de coagulación reducido (o acción más rápida) en comparación con rhFVIIa cuando se administran para sangrado incontrolado. Una molécula con una vida media en circulación prolongada reduciría el número de administraciones necesáriás Dada el producto actual de rhFVIIa y las inyecciones frecuentes, y el potencial para obtener concentraciones terapéuticas óptimas del FVIIa con un mejor efecto terapéutico concomitante, existe una clara necesidad de moléculas de tipo FVII o FVIIa mejoradas. Una forma de aumentar la vida media en circulación de una proteína es asegurar una reducción de la depuración renal de la proteína. Esto se puede lograr conjugando la proteína con una porción química capaz de conferirle una depuración renal reducida. Además, la unión de una porción química a la proteína o la sustitución de aminoácidos expuestos a proteólisis puede bloquear eficazmente el contacto con una enzima proteolítica que degrada proteolíticamente la proteína. El polietilenglicol (PEG) es una de tales porciones químicas que se ha usado en la preparación de productos terapéuticos de proteína. WO 98/32466 sugiere que el FVII, entre otras proteínas, puede ser PEGilado, pero no contiene mayor información a este respecto. WO 01/58935 describe una nueva estrategia para desarrollar moléculas de FVII o FVIIa que tienen, entre otras cosas, una vida media prolongada. Como se indicó arriba, otro problema en el tratamiento actual con rhFVIIa es la relativa inestabilidad de la molécula con respecto a la degradación proteolítica. La degradación proteolítica es un obstáculo mayor para obtener una preparación en solución en contraste con un producto _ . liofilizado. La_ventaja de obtener una preparación soluble estable estriba-en. . -.- J que es más fácil de manejar para el paciente y, en caso de emergencia, de acción más rápida, lo que potencialmente puede llegar a salvar una vida. En WO 88/10295 se han descrito intentos para prevenir la degradación proteolítica mediante mutagénesis dirigida a sitios proteolíticos mayores. Un objeto de la presente invención es proveer moléculas mejoradas de FVII o FVIIa (variantes de FVII o FVIIa) con una vida media en circulación prolongada (reduciendo por lo tanto el número de administraciones necesarias), y que son capaces de activar el factor X al factor Xa (sin unirse al factor de tejido) más eficientemente que el hFVIIa o rhFVIla (siendo así capaces de tratar más eficientemente el sangrado incontrolado, tal como en un trauma). Otro objeto de la presente invención es proveer moléculas mejoradas de FVII o FVIIa (variantes de FVII o FVIIa) con una mayor biodisponibilidad (por ejemplo mayor área bajo la curva en comparación con rhFVIla cuando se administra intravenosamente), y que son capaces de activar el factor X al factor Xa (sin unirse al factor de tejido) más eficientemente que hFVIIa o rhFVIla (siendo así capaz de tratar más eficientemente el sangrado incontrolado, tal como en un trauma). Estos objetos son alcanzados con las variantes de FVII o FVIIa provistas en la presente.

En su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a una variante de polipéptido de FVII o FVIIa, que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3- 5 modificaciones de aminoácido con respecto al hFVII o hFVIIa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, en donde dicha secuencia de aminoácidos de la variante comprende una sustitución de aminoácido en las posiciones 10 y 32, y en donde una porción de azúcar está unida covalentemente en un sitio de N-glicosilación introducido in vivo, localizado fuera del dominio Gla. Otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de polipéptido de la invención. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención. En un aspecto más, la invención se refiere a una célula hospedera que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención o el vector de expresión de la invención. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención se refiere a la variante de polipéptido de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para usarse como medicamentos. Aspectos adicionales de la presente invención serán evidentes deja siguiente descripción, así cómo de las reivindicaciones anexas. — - DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones En el contexto de la presente solicitud e invención se aplican las siguientes definiciones: El término "conjugado" (o intercambiablemente "polipéptido conjugado") indica una molécula heterogénea (en el sentido de mixta o quimérica), formada por la unión covalente de uno o más polipéptidos y una o más porciones no polipeptídicas tales como moléculas de polímero, compuestos lipofílicos, porciones de azúcar o agentes de derivación orgánicos. Preferiblemente, el conjugado es soluble a las concentraciones y condiciones relevantes, es decir, es soluble en fluidos fisiológicos como la sangre. Ejemplos de polipéptidos conjugados de la invención incluyen polipéptidos glicosilados o PEGilados. El término "unión covalente" o "unido covalentemente" significa que la variante de polipéptido y la porción no polipeptídica están unidas entre sí directamente por enlace covalente, o bien están unidas entre sí indirectamente por enlace covalente por medio de una o más porciones intermedias, tales como una o más porciones de puente, espaciadoras o de enlace. El término "porción no polipeptídica" significa una molécula diferente de un polímero de péptido" compuesto de monómeros dé aminoácido -enlazados entre sí por enlaces peptídicos; dicha molécula es capaz de conjugarse con un grupo de unión de la variante de polipéptido de la invención. Ejemplos preferidos de tales moléculas incluyen moléculas de polímero, porciones de azúcar, compuestos lipofílicos o agentes de derivación orgánicos. Cuando se usa en el contexto de una variante conjugada de la invención, se entenderá que la porción no polipeptídica está enlazada con la parte de polipéptido de la variante conjugada por medio de un grupo de unión del polipéptido. Como se explica arriba, la porción no polipeptídica puede estar unida directamente por enlace covalente con el grupo de unión, o puede estar unida indirectamente por enlace covalente con el grupo de unión por medio de una o más porciones intermedias, tales como una o más porciones de puente, espaciadoras o de enlace. Una "molécula de polímero" es una molécula formada de dos o más monómeros por enlace covalente, en donde ninguno de los monómeros es un residuo de aminoácido, excepto en donde el polímero es albúmina humana u otra proteína abundante del plasma. El término "polímero" se puede usar intercambiablemente con el término "molécula de polímero". El término también pretende cubrir moléculas de carbohidrato unidas por glicosilación in vitro, esto es, una glicosilación sintética realizada in vitro que implica normalmente un enlace covalente de una molécula de carbohidrato con un grupo de unión de la variante de polipéptido, opcionalmente usando un agente de entrelazamiento. La glicosilación in vitro se describe más abajo en mayor detalle. El término "porción de azúcar" indica una molécula que contiene carbohidrato que comprende uno o más residuos de monosacárido, y es capaz de unirse a la variante de polipéptido (para producir un conjugado de variante de polipéptido en forma de una variante de polipéptido glicosilado), por medio de glicosilación in vivo. El término "glicosilación in vivo" significa cualquier unión de una porción de azúcar que ocurre in vivo, esto es, durante el procesamiento posterior a traducción en una célula glícosilante usada para la expresión de la variante de polipéptido, por ejemplo por medio de glicosilación N-enlazada u O-enlazada. La estructura exacta de oligosacárido depende en gran medida del organismo glicosilante en cuestión. Un sitio de "N-glicosilación" tiene la secuencia N-X-S/T/C, en donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es cualquiera de serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y de preferencia treonina. Preferiblemente, el residuo de aminoácido en la posición +3 con respecto al residuo de asparagina no es un residuo de prolina. Un sitio de ?-glicosilación" es el grupo OH de un residuo de serina o treonina. El término "grupo de unión" indica un grupo funcional de la variante de polipéptido, en particular de un residuo de aminoácido del mismo o una porción de carbohidrato, capaz de unirse con una porción no polipeptídica tal como una molécula de polímero, una molécula lipofílica, una porción de azúcar o_ un agente de derivación, orgánico. Grupos de unión útiles y sus-porciones no polipeptídicas correspondientes son evidentes del siguiente cuadro.

Grupo de Aminoácido Ejemplos de Método de Referencia unión porción no conjugación/ polipeptídica PEG activado -CONH2 Gln Porción de Acoplamiento Yan y Wold, carbohidrato in vitro Biochemistry, 31 julio 1984; 23( 6):3759-65 Aldehido Oligosacárido Polímero, p. ej. PEGilación Andresz y Cetona oxidado PEG, otros, 1978, PEG-hidrazida Makromol. Chem., 179:301 ; WO 92/16555, WO 00/23114 Guanidino Arg Porción de Acoplamiento Lundblad y carbohidrato in vitro Noyes, "Chemical reagents for protein modification" CRC Press Inc. Boca Ratón, Florida, E.U.A.

Anillo de His Porción de Acoplamiento Como para imidazol carbohidrato in vitro guanidina Para N-glicosilación in vivo, el término "grupo de unión" se usa de una manera no convencional para indicar los residuos de aminoácido que constituyen un sitio de N-glicosilación (con la secuencia N-X-S T/C, en donde X es cualquier residuo de aminoácido, excepto prolina, N es asparagina y S T/C es cualquiera de serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y muy preferiblemente treonina). Aunque el residuo de asparagina del sitio de N-glicosilación es uno en el que la porción de azúcar se une durante la glicosilación, dicha unión no puede ser lograda a menos que estén presentes otros residuos de aminoácido del sitio de N-glicosilación. Por consiguiente, cuando la porción no polipeptídica es una porción de azúcar y la conjugación se ha de lograr por N-glicosilación in vivo, el término "residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptídica", como se usa en relación con alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, significa que se han de alterar uno o más residuos de aminoácido que constituyen un sitio de N-glicosilación in vivo para introducir un sitio funcional de N-glicosilación in vivo en la secuencia de aminoácidos. En la presente solicitud, los nombres de los aminoácidos y los nombres de los átomos (por ejemplo CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, etc), se usan como los define el Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org) en base a la nomenclatura de la lUPAC ("lUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides" (nombres de residuos, nombres de átomos, etc.), Eur. J. Biochem., - 138, 9-37_ (1984). junto con las correcciones .indicadas en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)). El término "residuo de aminoácido" indica un residuo de aminoácido contenido en el grupo que consiste de los residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (lie o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W) y tirosina (Tyr o Y).

La terminología usada para identificar las posiciones de aminoácido se ilustra de la siguiente manera: I205 indica que la posición 205 está ocupada por un residuo de isoleucina en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2. I205T indica que el residuo de isoleucina en la posición 205 ha sido sustituida con un residuo de treonina. Las sustituciones alternativas se indican con 7", por ejemplo I205S/T significa una secuencia de aminoácidos en la que la isoleucina en la posición 205 está sustituida con serina o treonina. Las sustituciones múltiples están indicadas con "+", por ejemplo K143N+N145T significa una sustitución del residuo de lisina en la posición 143 con un residuo de asparagina y una sustitución del residuo de asparagina en la posición 145 con un residuo de treonina. La inserción de un residuo de aminoácido adicional se indica de la siguiente manera: La inserción de un residuo de tirosina después de A3 (es decir, en la posición 4), es indicada como A3AY (llevando a la inserción de un residuo de tirosina en la posición 4). Una supresión de un residuo de aminoácido se indica- con un asterisco. Por ejemplo, una supresión de un residuo de valina en la posición 172 se indica como V172*. La inserción y sustitución simultáneas se indican de la siguiente manera: la sustitución de un residuo de alanina en la posición 175 con un residuo de treonina, seguida por la inserción de un residuo de leucina después de la posición 175, se indica como A175TL. A menos que se indique de otra manera, la numeración de los residuos de aminoácido en la presente se hace con respecto a la secuencia del polipéptido hFVII/hFVIIa (SEQ ID NO:2).

Se considera que el término "difiere de", como se usa con respecto a mutaciones específicas, permite la presencia de diferencias adicionales aparte de la diferencia de aminoácido especificada. Por ejemplo, además de la introducción de sitios de N-glicosilación in vivo (localizados fuera del dominio Gla), el polipéptido puede comprender otras modificaciones que no están relacionadas con la introducción de dichos residuos de aminoácido. De una manera muy similar, además de las modificaciones realizadas en el dominio Gla dirigidas a aumentar la afinidad de unión de fosfolípido de membrana, el polipéptido puede contener otras modificaciones que no necesariamente están relacionadas con este efecto. De esta manera, además de las modificaciones de aminoácido que aquí se exponen, se entenderá que la secuencia de aminoácidos de la variante de polipéptido de la invención, si se desea, puede comprender otras alteraciones, esto es, otras sustituciones, inserciones o supresiones. Estas pueden-incluir por ejemplo truncamiento del extremo N o C en uno o más residuos de aminoácido (por ejemplo en 1-10 residuos de aminoácido), o la adición de uno o más residuos extra en el extremo N o C, por ejemplo la adición de un residuo de metionina en el extremo N o la introducción de un residuo de cisteína en el extremo C o cerca del mismo, así como también "sustituciones conservativas de aminoácidos", es decir, sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos aromáticos.

Ejemplos de estas sustituciones conservativas se muestran en el siguiente cuadro. 1 Alanina (A) Glicina (G) Serina (S) Treonina (T) 2 Acido aspárticó (D) Acido glutámico (E) 3 Asparagina (N) Glutamina (Q) 4 Arginina (R) Histidina (H) Lisina (K) 5 Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V) 6 Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W) Otros ejemplos de modificaciones adicionales se describen más abajo en la sección titulada "Otras modificaciones fuera del dominio Gla". El término "secuencia de nucleótidos" indica un tramo consecutivo de dos o más moléculas de nucleótido. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos. El término "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere en general a un método de amplificación in vitro de una secuencia de nucleótidos deseada, como se describe por ejemplo en la patente de E.U.A. No. 4,683,195. En general, el método de PCR incluye ciclos repetidos de síntesis de extensión por iniciador usando oligonucleótidos iniciadores capaces de hibridar preferentemente con un ácido nucleico molde. El término "vector" se refiere a un plásmido u otras secuencias de nucleótidos que son capaces de duplicarse dentro de una célula hospedera, o susceptibles de ser integradas en el genoma de la célula hospedera, y por tanto son útiles para realizar diferentes funciones en conjunto con células hospederas compatibles (un sistema vector-hospedero): para facilitar la clonación de la secuencia de nucleótidos, es decir, para producir cantidades utilizables de la secuencia, para dirigir la expresión del producto de gen codificado por la secuencia, y para integrar la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula hospedera. El vector contendrá diferentes componentes dependiendo de la función por realizar. "Célula", "célula hospedera", "línea de células" y "cultivo de células" se usan intercambiablemente en este documento, y se entiende que todos estos términos incluyen la progenie que resulta del crecimiento o cultivo de una célula. "Transformación" y "transfección" se usan intercambiablemente para referirse al proceso de introducción de ADN en una célula. "Ligado operativamente" se refiere a la unión covalente de dos o más secuencias de nucleótidos, por medio de ligación enzimática o de otra manera, en una configuración relativa unas con otras de modo que puedan - realizar la función normal de las -secuencias. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una presecuencia o guía secretora es ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido, si es expresada como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido: un promotor o incrementador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; un sitio de unión de ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificadora si está colocada a fin de facilitar la traducción. En general, "ligada operativamente" significa que las secuencias de nucleótidos están enlazadas y contiguas y, en caso de una guía secretora, contiguas y en fase de lectura. El enlace es realizado por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces se usan oligonucleótidos adaptadores o enlazadores sintéticos, en conjunto con métodos estándares de ADN recombinante. En el contexto de la presente invención, los términos "modificación" o "modificación de aminoácido" cubren el reemplazo de una cadena lateral de aminoácido, sustitución de un residuo de aminoácido, supresión de un residuo de aminoácido o inserción de un residuo de aminoácido. Los términos "mutación" y "sustitución" se usan intercambiablemente en el presente documento. El término "se introduce" se refiere a la introducción de un residuo de aminoácido por sustitución de un residuo de aminoácido existente o, alternativamente.-por nserción de un residuo de aminoácido adicional. El término "remover" se refiere a la remoción de un residuo de aminoácido por sustitución del residuo de aminoácido con otro residuo de aminoácido o, alternativamente, por supresión (sin sustitución) del residuo de aminoácido por remover. El término "FVII" o "polipéptido de FVM" se refiere a una molécula de FVII provista en forma de una sola cadena. Un ejemplo de un polipéptido de FVII es el FVII humano de tipo silvestre (hFVII) mostrado en la SEQ ID NO:2. Sin embargo, se debe entender que el término "polipéptido de FVII" también cubre moléculas similares al hFVII, tales como fragmentos o variantes de la SEQ ID NO:2, en particular variantes en donde la secuencia comprende por lo menos una modificación de aminoácido, por ejemplo 1-15 o 1-10, en comparación con la SEQ ID NO:2. El término "FVIIa" o "polipéptido de FVIIa" se refiere a una molécula de FVII provista en su forma activada de dos cadenas. Cuando se usa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 para describir la secuencia de aminoácidos del FVIIa, se entenderá que se ha cortado el enlace peptídico entre R152 e 1153 de la forma de una sola cadena, y que una de las cadenas comprende los residuos de aminoácido 1-152 y la otra cadena los residuos de aminoácido 153-406. Los términos "rFVII" y "rFVIIa" se refieren a polipéptidos de FVII y FVIIa producidos por técnicas recombinantes. Los términos "hFVII" y "hFVIIa" se refieren al FVII y FVIIa humanos de .. tipo silvestre, respectivamente, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2. Los términos "rhFVII" y "rhFVIIa" se refieren al FVII y FVIIa humanos de tipo silvestre, respectivamente, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, producidos por medios recombinantes. Un ejemplo de rhFVIIa es NovoSeven®. Cuando se usa aquí, el término "dominio Gla" cubre los residuos de aminoácido Nos. 1 a 45 de SEQ ID NO:2. Por consiguiente, el término "localizado fuera del dominio Gla" cubre los residuos de aminoácido Nos. 46-406 de SEQ ID NO:2. Las abreviaciones "TF" y "TFPI" significan factor de tejido e inhibidor de la ruta del factor de tejido, respectivamente. El término "dominio de proteasa" se usa sobre los residuos 153- 406 contados desde el extremo N. El término "sitio catalítico" se usa para indicar la tríada catalítica que consiste de S344, D242 y H193 de la variante de polipéptido. El término "original" indica la molécula que se ha de modificar/mejorar de acuerdo con la presente invención. Aunque el polipéptido original que se va a modificar con la presente invención puede ser cualquier polipéptido de FVII o FVIIa, y de esta manera ser de cualquier origen, por ejemplo de mamífero no humano, se prefiere que el polipéptido original sea hFVII o hFVIIa. Una "variante" es un polipéptido que difiere en uno o más - residuos .de aminoácido de su polipéptido original, normalmente en , 3- 5 _ residuos de aminoácido (por ejemplo en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácido), por ejemplo 3-10 residuos de aminoácido, como 3-8 o 3-5 residuos de aminoácido. En otras palabras, una "variante" contiene típicamente 3-15 modificaciones de aminoácido (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 o 15 modificaciones de aminoácido), por ejemplo 3-10 modificaciones de aminoácido, como 3-8 o 3-5 modificaciones de aminoácido con respecto al polipéptido original. En el presente contexto, el término "modificación" abarca inserciones, supresiones, sustituciones y combinaciones de los mismas. Se entenderá que una variante de polipéptido de acuerdo con la presente invención será modificada por lo menos en tres posiciones, particularmente por lo menos en las posiciones 10 y 32 (localizadas en el dominio Gla), y por lo menos en una posición localizada fuera del dominio Gla, en donde dicha modificación (por lo menos una) crea un sitio de N-glicosilación in vivo. El término "actividad coaguladora" se usa para indicar la actividad medida en la "prueba de coagulación" que se describe en la presente. Para exhibir "actividad coaguladora", una variante de la invención en su forma activada debe tener por lo menos 10% de la actividad coaguladora del rhFVIIa cuando se prueba según la "prueba de coagulación" que se describe en la presente. En una modalidad preferida de la invención, la variante en su forma activada tiene por lo menos 20% de la actividad coaguladora de rhFVIIa, por ejemplo por lo menos 30%, por ejemplo por lo menos 40%, ~de preferencia por lo menos 50%, como por lo.menos.60%, por ejemplo por lo menos 70%, de preferencia por lo menos 80%, como por lo menos 90% de la actividad coaguladora del rhFVIIa, cuando se prueba según la "prueba de coagulación" descrita en la presente. En una modalidad interesante, la variante en su forma activada tiene sustancialmente la misma actividad coaguladora que el rhFVlls, tal como una actividad coaguladora de 75-125% la actividad coaguladora de rhFVIIa. El término "actividad amidolítica" se usa para indicar la actividad medida en la "prueba amidolítica" que se describe en la presente. Para exhibir "actividad amidolítica", una variante de la invención en su forma activada debe tener por lo menos 10% de la actividad amidolítica de rhFVIIa cuando se prueba en la "prueba amidolítica" que se describe en la presente. En una modalidad preferida de la invención, la variante en su forma activada tiene por lo menos 20% de la actividad amidolítica de rhFVIIa, como por lo menos 30%, por ejemplo por lo menos 40%, de preferencia por lo menos 50%, como por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 70%, muy de preferencia por lo menos 80%, como por lo menos 90% de la actividad amidolítica de rhFVIIa, cuando se prueba según la "prueba amidolítica" que se describe en la presente. En una modalidad interesante, la variante en su forma activada tiene sustancialmente la misma actividad amidolítica que rhFVIIs, tal como una actividad amidolítica de 75-125% de la actividad amidolítica de rhFVIIa. En el presente contexto, el término "actividad" también se usa con respecto a la.capacidad de las variantes de activar FX a FXa. Esta actividad también es denotada como "actividad de activación de FX" o "actividad de generación de FXa". El término "incremento de la actividad de activación de FX" o "incremento de la actividad de generación de FXa" se usa para indicar que una variante de la invención en su forma activada tiene una capacidad mayor estadísticamente significativa para activar FX a FXa en comparación con rhFVIIa. El grado en que una variante de la invención (en su forma activada) tiene una mayor actividad de activación de FX puede ser determinado convenientemente en la "prueba de activación del factor X independiente de TF", que se describe en la presente. El término "coágulo fuerte" o "mayor fuerza de coágulo" se usa para indicar que la fuerza del coágulo generado por la variante de polipéptido es mayor de forma estadísticamente significativa con respecto al generado por rhFVIIa, determinada bajo condiciones comparables. Este efecto se puede determinar como el área bajo la curva (ABCtrom) generada por la variante de la invención en su forma activada cuando se prueba según la "prueba de trombogramo" que se describe en la presente. De forma similar, el término "mayor ABCtrom" se usa para indicar que el área bajo la curva generada por la variante (en su forma activada) es mayor de manera estadísticamente significativa con respecto a la generada por rhFVIIa, determinada bajo condiciones comparables y cuando se mide según la "prueba de trombogramo" que se describe en la presente. ,EI término "Tmax" se usa respecto al tiempo en que se obtiene el nivel máximo de actividad de trombina en la "prueba de trombogramo". El término "inmunogenicidad" usado con respecto a una sustancia dada indica la capacidad de la sustancia para inducir una respuesta del sistema inmune. La respuesta inmune puede ser una respuesta mediada por célula o por anticuerpo (véase por ejemplo Roitt: "Essential Immunology", 8a edición, Blackwell, para una definición más detallada de la inmunogenicidad). Normalmente, la reducción de la reactividad de anticuerpo será una indicación de reducción de la inmunogenicidad. La reducción de inmunogenicidad se puede determinar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo in vivo o in vitro. El término "vida media funcional in vivo" se usa en su significado normal, es decir, el tiempo en que 50% de la actividad biológica del polipéptido está todavía presente en el cuerpo/órgano objetivo, o el tiempo en que la actividad del polipéptido es el 50% de su valor inicial. Como una alternativa para determinar la vida media funcional in vivo, se puede determinar la "vida media en el suero", es decir, el tiempo en el que 50% del polipéptido circula en el plasma o corriente sanguínea antes de ser eliminado. La determinación de la vida media en el suero frecuentemente es más simple que la determinación de la vida media funcional in vivo, y la magnitud de la vida media en el suero usualmente es una buena indicación de la magnitud de la vida media funcional in vivo. Términos alternativos a la vida media en el suero incluyen "vida media en el plasma", "vida media en circulación", "depuración del. suero", y "depuración del plasma". El polipéptido es eliminado por la acción de uno o más de los sistemas reticuloendoteliales (RES), riñon, bazo o hígado, por el factor de tejido, el receptor SEC u otra eliminación mediada por receptor, o por proteólisis específica o inespecífica. Normalmente, la eliminación depende del tamaño (con respecto al cierre de la filtración glomerular), carga, cadenas unidas de carbohidrato, y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad por retener normalmente se selecciona de actividad procoagulante, proteolítica o de unión de receptor. La vida media funcional in vivo y la vida media en el suero se pueden determinar por medio de cualquier método adecuado conocido. El término "mayor" como se usa sobre la vida media funcional in vivo o la vida media en el suero, se usa para indicar que la vida media relevante de la variante de polipéptido es de manera estadísticamente significativa mayor con respecto a la de rhFVIIa, determinada bajo condiciones comparables (determinada normalmente en un animal experimental, tal como rata, conejo, cerdo o mono). El término "ABCiv" o "área bajo la curva cuando se administra intravenosamente", se usa en su significado normal, es decir, como el área bajo la actividad en una curva de suero-tiempo en donde la variante de polipéptido ha sido administrada intravenosamente, en particular cuando se administra intravenosamente en ratas. Normalmente, la actividad medida es la "actividad de coagulación" como se definió aquí anteriormente. Una vez que se han determinado los puntos de actividad-tiempo experimentales, la ABCiv. puede ser calculada convenientemente" por r un~ plográma de --- - -computadora, tal como el GraphPad Prism 3.01. Se entenderá que para hacer una comparación directa entre los valores de ABC¡V de diferentes moléculas (por ejemplo entre las variantes de la invención y una molécula de referencia como rhFVIIa), se debe administrar la misma cantidad de actividad. Consecuentemente, los valores de ABC¡V típicamente se normalizan (es decir, se corrigen las diferencias en las dosis inyectadas) y se expresan como ABC¡V/ dosis administrada. El término "menor sensibilidad a la degradación proteolítica" indica principalmente que la variante de polipéptido tiene una menor sensibilidad a la degradación proteolítica en comparación con hFVIIa o rhFVIIa, determinada bajo condiciones comparables. Preferiblemente, la degradación proteolítica se reduce en al menos 10% (por ejemplo 10-25% o 10-50%), por ejemplo por lo menos 25% (por ejemplo 25-50%, 25-75% o 25%-100%), de preferencia por lo menos 25%, por ejemplo por lo menos 50% (por ejemplo 50-75% o 50-100%); muy de preferencia por lo menos 60%, por ejemplo 75% (por ejemplo 75-100%), o mejor por lo menos 90%. De preferencia, la degradación proteolítica es reducida por lo menos en 100%. El término "depuración renal" se usa en su significado normal para indicar cualquier depuración realizada por los ríñones, por ejemplo por filtración glomerular, excreción tubular o degradación en las células tubulares. La depuración renal depende de las características físicas del polipéptido que incluyen su tamaño (diámetro), volumen hidrodinámico, simetría, forma/rigidez y carga. Normalménte7 un" pes^~m¾lécular~de"alrededor"de--67 -kDa=se-considera un valor de corte para depuración renal. La depuración renal se puede ser establecer por medio de cualquier prueba adecuada, por ejemplo una prueba establecida in vivo. Típicamente la depuración renal se determina administrando a un paciente un polipéptido marcado (por ejemplo radiomarcado o marcado por fluorescencia) y midiendo la actividad de la marca en orina recogida del paciente. La reducción de depuración renal se determina con respecto a un polipéptido de referencia correspondiente, por ejemplo rhFVIIa, bajo condiciones comparables. Preferiblemente, la velocidad de depuración renal de la variante de polipéptido se reduce en al menos 50%, de preferencia por lo menos 75% y muy preferiblemente por lo menos 90% en comparación con rhFVIIa. Los términos "por lo menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" y "por lo menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" se definen con respecto al ejemplo 1 , en donde se describen en detalle los cálculos, etc. Se debe indicar que cuando se usan los términos "por lo menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" y "por lo menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" con respecto a la introducción de un sitio de N-glicosilación ¡n vivo, estos términos se refieren a la capacidad de acceso a la superficie de la cadena lateral de aminoácido en la posición en donde la porción de azúcar está unida realmente. En muchos casos será necesario introducir un residuo de serina o treonina en la posición +2 con "respecto arresidú¾ d ~ sr^ gina arcual está— ~ unida realmente la porción de azúcar (desde luego, a menos que esta posición ya esté ocupada por un residuo de serina o treonina), y se permite que estas posiciones, en donde se introducen los residuos de serina o treonina, estén ocultas, es decir, tengan menos de 25% o 50% de sus cadenas laterales expuestas a la superficie de la molécula. Los términos "sitio de unión del factor de tejido", "región del sitio activo" y "reborde de la abertura de unión del sitio activo" se definen en el ejemplo 1 de la presente, en donde se determinan los sitios/regiones anteriormente mencionados. El término "residuo de aminoácido hidrofóbico" incluye los siguientes residuos de aminoácido: isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). El término "residuo de aminoácido cargado negativamente" incluye los siguientes residuos de aminoácido: ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E). El término "residuo de aminoácido cargado positivamente" incluye los siguientes residuos de aminoácido: Lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

Variantes de la invención En su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a una variante de polipéptido de FVII o FVIIa que tiene una secuencia de aminoácidos que comprendé 3- 5~modificacioñes"de^miñ ácido~con respecto^ a hFVII o hFVIIa, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, en donde dicha secuencia de aminoácidos de la variante comprende una sustitución de aminoácido en las posiciones 10 y 32, y en donde una porción de azúcar está unida covalentemente a un sitio de N-glicosilación introducido in vivo localizado fuera del dominio Gla. Las modificaciones realizadas en las dos regiones antes indicadas del polipéptido FVII original sirven para los siguientes propósitos: Las modificaciones realizadas en las posiciones localizadas fuera del dominio Gla (introducción de uno o más sitios de N-glicosilación in vivo) son preferiblemente de una naturaleza tal que el ABCiv, la vida media funcional in vivo o la vida media en el suero de la variante resultante, sea mayor en comparación con rhFVIIa. Las modificaciones realizadas en el dominio Gla del polipéptido original son preferiblemente de una naturaleza tal que se logra una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana de la molécula resultante, o de una naturaleza tal que la molécula resultante tiene una mejor capacidad para activar FX o FXa, o una naturaleza tal que se forma un coágulo más fuerte. Sin desear limitarse a alguna teoría particular, actualmente se considera que el incremento de la afinidad de membrana produce una concentración local más alta de las variantes de polipéptido activado en estrecha cercanía a los otros factores de coagulación, particularmente FX. De esta manera, la velocidad de activación de FX a FXa será más alta, simplemente debido a la relación móTar más alta ""déla vá?iáñte~dé VII r activada con respecto a FX. La mayor velocidad de activación de FX origina entonces una cantidad más alta de trombina activa y de esta manera una velocidad de entrelazamiento de fibrina más alta. De esta manera, en modalidades preferidas de la invención el polipéptido FVII o FVIIa original ha sido modificado de modo que la variante de polipéptido activado resultante tiene (en comparación con rhFVIIa): (i) una mayor biodisponibilidad (ABC¡V) y una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana; (¡i) una mayor biodisponibilidad (ABC¡V) y una mayor capacidad de activar FX a FXa; (iii) una mayor biodisponibilidad (ABC¡V) y es capaz de generar un coágulo más fuerte (mayor ABCtrom); (iv) una mayor biodisponibilidad (ABCiv) y una menor Tmax; (v) una mayor vida media funcional in vivo y una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana; (vi) una mayor vida media funcional in vivo y una mayor capacidad de activar FX a FXa; (vii) una mayor vida media funcional in vivo y es capaz de generar un coágulo más fuerte (mayor ABCtrom); (viii) una mayor vida media funcional in vivo y una menor Tmax; (ix) una mayor vida media en el suero y una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana; (x) una mayor vida media en el suero y una "mayor capacidad de activación de FX a FXa; (xi) una mayor vida media en el suero y es capaz de generar un coágulo más fuerte (mayor ABCtrom); o (xii) una mayor vida media en el suero y una menor Tma . Consecuentemente, el tratamiento médico con una variante de polipéptido de acuerdo con la invención ofrece varias ventajas sobre el compuesto rhFVIIa actualmente disponible (NovoSeven®), por ejemplo la administración de dosis más bajas, duración prolongada entre las inyecciones, mayor fuerza de coágulo o acción más rápida. De esta manera, las variantes preferidas de la invención son las variantes que en sus formas activadas, cuando se comparan con rhFVIIa, generan una mayor área bajo la curva cuando se administran intravenosamente (ABCiv), en particular cuando se administran intravenosamente en ratas. Más particularmente, las variantes de la presente invención que se prefieren son aquellas en donde la relación entre el ABC¡V de dicha variante en su forma activada y el ABC¡V de rhFVIIa es de por lo menos 1.25, por ejemplo por lo menos 1.5, por ejemplo por lo menos 1.75, de preferencia por lo menos 2, por ejemplo por lo menos 3, muy de preferencia por lo menos 4, por ejemplo por lo menos 5, en particular cuando se administran (intravenosamente) en ratas. A su vez, este efecto puede corresponder (aunque no necesariamente) con una mayor vida media funcional in vivo o una mayor vida media en_el suero en comparación con fhFVI \á. "Por consiguiente, en otra ~ modalidad preferida de la invención, la relación entre la vida media funcional in vivo o la vida media en el suero para la variante en su forma activada, y la vida media funcional in vivo o la vida media en el suero para rhFVIIa, es de por lo menos 1.25. Muy preferiblemente, la relación entre la vida media relevante de la variante en su forma activada y la vida media relevante de hFVIIa o rhFVIIa, es de por lo menos 1.5, por ejemplo por lo menos 1.75, por ejemplo por lo menos 2, de preferencia por lo menos 3, por ejemplo por lo menos 4, por ejemplo por lo menos 5.

Como se entenderá, las variantes de la invención también poseen, además de la funcionalidad antes mencionada (es decir, mayor ABC¡v, mayor vida media funcional in vivo o mayor vida media en el suero), una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana en comparación con rhFVII, una mayor capacidad para activar FX a FXa, una capacidad para generar un coágulo más fuerte (mayor ABCu-om) o menor Tmax. De esta manera, en una modalidad preferida de la invención, la variante de polipéptido tiene (además de una mayor ABC¡V, mayor vida media funcional in vivo o mayor vida media en el suero), una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana con respecto a rhFVIIa. La afinidad de unión de membrana se puede medir con métodos conocidos, tales como por ejemplo la prueba Biacore® descrita por K. Nagata y H. Handa (Ads.), "Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions", Springer-Verlag, Tokio, 2000, cap. 6 titulado "Lipid-Protein Interactions". Alternativamente, la afinidad de unión de membrana se puede medir corno "se describlT'en "él ejemplo : 1~de~WOr ~- ~ ----- - 99/20767. En otra modalidad preferida de la invención, la variante de polipéptido tiene (además de una mayor ABC¡V, mayor vida media funcional in vivo o mayor vida media en el suero), una mayor actividad de activación de FX en comparación con rhFVIIa, en particular cuando se prueba en una prueba independiente de TF, tal como la "prueba de activación del factor X independiente de TF" que se describe en la presente. Más particularmente, se prefiere que la relación entre la actividad de activación de FX de la variante de polipéptido en su forma activada y la actividad de activación de FX del rhFVIIa, sea de por lo menos 1.25 cuando se prueba en la "prueba de activación del factor X independiente de TF" que se describe en la presente. Muy preferiblemente, la relación entre la actividad de activación de FX de la variante en su forma activada y la actividad de activación de FX del rhFVIIa, es de por lo menos 1.5, por ejemplo por lo menos 1.75, como por lo menos 2; de preferencia por lo menos 3, de preferencia por lo menos 4; por ejemplo, por lo menos 5; de preferencia por lo menos 6, por ejemplo por lo menos 7, por ejemplo por lo menos 8; muy de preferencia por lo menos 9, por ejemplo por lo menos 10, cuando se prueba en la "prueba de activación del factor X independiente de TF" que se describe en la presente. En otra modalidad preferida de la invención, la variante de polipéptido en su forma activada (además de una mayor ABC¡V, mayor vida media funcional in vivo o mayor vida media en el suero), es capaz de generar un coágulo" más fuerte en comp raciórrcor fHFVI la:~ Este efecto-se puede- -determinar en la "prueba de trombograma" que se describe en la presente como un incremento del área bajo la curva (ABCtrom). El ABCtr0m algunas veces también es denotada como "trabajo total de trombina" y constituye una medida de la fuerza del coágulo formado. Más particularmente, se prefiere que la relación entre el ABCtrom generada por la variante en su forma activada y el ABCtrom generada por rhFVIIa, sea de por lo menos 1.15, cuando se prueba según la "prueba de trombogramo" que se describe en la presente. Preferiblemente, la relación es de 1.2, por ejemplo por lo menos 1.25, por ejemplo por lo menos 1.3; de preferencia por lo menos 1 .4, por ejemplo por lo menos 1.5, por ejemplo por lo menos 1.6; muy de preferencia por lo menos 1.7, por ejemplo por lo menos 1.8, por ejemplo por lo menos 1.9 o por lo menos 2. En otra modalidad preferida de la invención, la vahante de polipéptido tiene en su forma activada (además de una mayor ABC¡V> mayor vida media funcional in vivo o mayor vida media en el suero), una acción más rápida. Este efecto se puede determinar con la "prueba de trombogramo" que se describe en la presente, como una reducción del tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima de trombina (Tmax). Por consiguiente, las variantes preferidas son variantes tales que la relación entre JmaK de la variante en su forma activada y la Tmax de rhFVIIa, es de 0.95 como máximo, cuando se prueba en la "prueba de trombogramo" que se describe en la presente. Preferiblemente, la relación es de 0.9 como máximo, por ejemplo 0.8 como máximo, por ejemplo 0.7 corfTo~máximóT de^ preferencia"^ máximo, por ejemplo 0.5 como máximo.

Introducción de sitios de N-glicosilación in vivo localizados fuera del dominio Gla En WO 01/58935 se describen varias modificaciones adecuadas que producen un incremento del ABC¡V, vida media funcional in vivo o vida media en el suero. Las variantes descritas en WO 01/58935 son el resultado de una estrategia generalmente nueva para desarrollar moléculas de FVII o FVIIa mejoradas, que también se puede usar para el polipéptido original de FVII o FVIIa de la presente invención. La posición por modificar se selecciona preferiblemente de una parte de la molécula del FVII o FVIIa que está localizada fuera del sitio de unión del factor de tejido, o fuera de la región del sitio activo, o fuera del reborde de la abertura de unión del sitio activo. Estos sitios/regiones se identifican en el ejemplo 1 de la presente. Sin embargo, se debe enfatizar que en algunas situaciones, por ejemplo en caso de que se desee una variante de polipéptido inactivado, puede ser ventajoso realizar modificaciones en dichas regiones o cerca de las mismas. Por ejemplo, se contempla que uno o más sitios de N-glicosilación in vivo se pueden introducir ventajosamente en la región de sitio activo o en el reborde de la abertura de unión del sitio activo de la molécula de FVII o FVIIa. La región del sitio activo, el sitio de unión del factor de tejido y el reborde de la abertura de unión del sitio activo, se definen en el ejemplo 1 de la preseñte y~éstáh constituidos por los siguientes residuos"7 1153, Q167, V168, L169, L170, L171 , Q176, L177, C178, G179, G180, T181 , V188, V189, S190, A191 , A192, H193, C194, F195, D196, K197, 1198, W201 , V228, I229, I230, P231 , S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241 , D242, I243, A244, L245, L246, V281 , S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341 , G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, 1361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y F405 (región del sitio activo); L13, K18, F31 , E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, 169, C70, F71 , C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, 190, V92, N93, E94, R271 , A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 y R379 (sitio de unión del factor de tejido); y N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291 , A292, P321 y T370 (el reborde de la abertura de unión del sitio activo). El número total de residuos de aminoácido por modificar fuera del dominio Gla en el polipéptido FVII o FVIIa original (en comparación con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2), normalmente no rebasa los 10. Preferiblemente, la variante de FVII o FVIIa comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en 1-10 residuos de aminoácido de los residuos de aminoácido 46-406 mostrados en SEQ ID NO:2, típicamente en 1-8 o en 2-8 residuos de aminoácido, por ejemplo en 1-5 o 2-5 residuos de aminoácido, por ejemplo 1-4 ó 1-3 residuos de aminoácido^o? ejé7nplorén 2 o 3 residuos de aminoácido de los residuos de aminoácido 46-406 mostrados en SEQ ID NO:2. De esta manera, la variante de polipéptido de la invención puede contener 1-10 sitios de N-glicosilación in vivo (adicionales o introducidos), normalmente 1-8 o 2-8 sitios de N-glicosilación in vivo (adicionales o introducidos), de preferencia 1-5 o 2-5 sitios de N-glicosilación in vivo (adicionales o introducidos), por ejemplo 1-4 o 1-3; de preferencia 1 , 2 o 3 sitios de N-glicosilación in vivo (adicionales o introducidos). Análogamente, la variante de polipéptido de la invención puede contener 1-10 porciones de azúcar (adicionales o introducidas), normalmente 1-8 o 2-8 porciones de azúcar (adicionales o introducidas), de preferencia 1-5 o 2-5 porciones de azúcar (adicionales o introducidas), de preferencia 1-4 o 1-3 porciones de azúcar (adicionales o introducidas), por ejemplo 1 , 2 o 3 porciones de azúcar (adicionales o introducidas). Se entenderá que la o las porciones de azúcar introducidas estarán unidas covalentemente con el o los sitios de N- glicosilación in vivo introducidos. Cuando se utiliza en el presente contexto, el término "sitio de glicosilación que ocurre naturalmente" cubre los sitios de glicosilación en las posiciones N145, N322 S52 y S60. En una forma muy similar, el término "sitio de O-glicosilación in vivo que ocurre naturalmente" incluye las posiciones S52 y S60, mientras que el término "sitio de N-glicosilación in vivo que ocurre naturalmente" incluye las posiciones N145 y N322. ~ ' ~~ ~ ~ ~ Sé" ^entenderá que pará=preparar una variante:de polipéptido que comprende una o más porciones de azúcar unidas covalentemente en uno o más sitios de N-glicosilación in vivo, la variante de polipéptido debe ser expresada en una célula hospedera capaz de unir porciones de azúcar (oligosacárido) en los sitios de glicosilación, o alternativamente debe ser sometida a glicosilación in vitro. Ejemplos de células hospederas glicosilantes se dan más adelante en la sección titulada "Acoplamiento con una porción de azúcar". Ejemplos de posiciones en donde se pueden introducir los sitios de N-glicosilación incluyen, sin limitación, las posiciones que comprenden un residuo de aminoácido que tiene por lo menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 de la presente), tal como en una posición que comprende un residuo de aminoácido que tiene por lo menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 de la presente). En general, se prefiere que el sitio de N-glicosilación in vivo sea introducido por sustitución, aunque también se contempla la inserción. La posición se selecciona preferiblemente de una parte de la molécula que está localizada fuera del sitio de unión del factor de tejido o la región del sitio activo o fuera del reborde de la abertura del sitio activo. Estos sitios/regiones se identifican en el ejemplo 1 de la presente. Se debe entender que cuando se usa el término "por lo menos 25% (o por lo menos 50%) de su cadena lateral expuesta a la superficie" con respecto a la introducción de un sitio de N-glicosilación in vivo, este término se refiere a la capacidad de acceso a la superficie dé la cadena lálérál¾é~ámmoacidó~ erf la posición en donde está unida realmente la porción de azúcar. En muchos casos será necesario introducir un residuo de serina o treonina en la posición +2 con respecto al residuo de asparagina al cual está realmente unida la porción de azúcar (desde luego, a menos que esta posición ya esté ocupada por un residuo de serina o treonina), y se permite que estas posiciones, en donde se introducen los residuos de serina o treonina, estén ocultas, es decir, tengan menos de 25% de sus cadenas laterales expuestas a la superficie. Ejemplos específicos y preferidos de tales sustituciones que crean un sitio de N-glicosilación in vivo incluyen una sustitución seleccionada del grupo que consiste de A51 N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de las mismas. Muy preferiblemente, el sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por medio de una sustitución seleccionada del grupo que consiste de A51 N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, S314N+K316T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de las mismas. Muy preferiblemente, el sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por medio de una sustitución seleccionada del grupo que consiste de T106N, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, y combinaciones de las mismas, en particular I205T. de N-glicosilación in vivo. En otra modalidad, se han introducido por sustitución dos o más sitios de N-glicosilación in vivo (por ejemplo dos). Ejemplos de sustituciones preferidas que crean dos sitios de N-glicosilación in vivo incluyen sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de A51 N+G58N, A51 N+T106N, A51 N+K109N, A51 N+G124N, A51 N+K143N+N145T, A51 N+A175T, A51 N+I205T, A51 N+V253N, A51 N+T267N+S269T, A51 N+S314N+K316T, A51 N+R315N+V317T, A51 N+K316N+G318T, A51 N+G318N, A51 N+D334N, G58N+T106N, G58N+K109N, G58N+G124N, G58N+K143N+N145T, G58N+A175T, G58N+I205T, G58N+V253N, G58N+T267N+S269T, G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N145T, T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K 09N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, K143N+N145T+I205T, K143N+N145T+V253N, K143N+N145T+T267N+S269T, Kl43N+N145T+S314N+K316Tf K143N+N145T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N, V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N y G318N+D334N. Preferiblemente, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste de T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T y V253N+T267N+S269T; muy preferiblemente del grupo que consiste de T106N+I205T, T106N+V253N e I205T+T267N+S269T. En una modalidad muy preferida, se han introducido por sustitución tres o más sitios de N-glicosilación in vivo (por ejemplo tres). Ejemplos de sustituciones preferidas que crean tres sitios de N-glicosilación in vivo iñcluye ^lá^ sustituciones- selecc¡onadas~del -grupo^-que consiste^de- _ I205T+ V253N+T267N+S269T y T106N+I205T+V253Ñ. Como se expuso arriba, se prefiere que el sitio de N-glicosilación in vivo sea introducido en una posición que ni forme parte del sitio de unión de factor de tejido ni forme parte de la región del sitio activo ni del reborde de la abertura de unión del sitio activo como se define en la presente. Se contempla que tales variantes de glicosilación pertenecen principalmente a la clase de variantes de polipéptido activo definidas anteriormente. Se entenderá que, como una alternativa a la introducción de sitios de N-glicosilación in vivo en las posiciones anteriormente indicadas, se puede introducir (ya sea por sustitución o por inserción) residuos de cisteína en las mismas posiciones, en donde el residuo de cisteína introducido se une entonces covalentemente con una porción no polipeptídica tal como PEG, en particular mPEG. De esta manera, ejemplos de posiciones en donde se puede introducir un residuo de cisteína incluyen, sin limitación, las posiciones que comprenden un residuo de aminoácido que tiene por lo menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 de la presente), por ejemplo en una posición que comprende un residuo de aminoácido que tiene por lo menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 de la presente). La posición se selecciona preferiblemente de una parte de la molécula que está localizada fuera del sitio de unión del factor de tejido o la región del sitio activo o fuera del reborde de la abertura del sitio activo. Estos sitios/regiones se identifican eñ e ejemplo 1 de la-presente— Deísta manera, la-anterior-exposicjón sobre _ la introducción de sitios de N-glicosilación in vivo se aplica, cambiando lo que haya que cambiar, a la introducción de residuos de cisteína. Se entenderá que las modificaciones en las posiciones localizadas fuera del dominio Gla descritas en la sección anterior, se deben combinar con una o más modificaciones en el dominio Gla (véase la sección titulada "Modificaciones en el dominio Gla" más abajo).

Modificaciones en el dominio Gla Como se entenderá, las variantes de la presente invención comprenden, además de por lo menos un sitio de N-glicosilación in vivo localizado fuera del dominio Gla (véase arriba), por lo menos dos sustituciones en el dominio Gla, particularmente una sustitución en la posición 10 y una en la posición 32. En WO 99/20767 y WO 00/66753 se describen varias modificaciones adecuadas que producen una mayor afinidad de unión de fosfolípido de membrana. En una modalidad preferida de la invención, la sustitución en la posición 10 es P10Q. En otra modalidad preferida de la invención, la sustitución en la posición 32 es K32E. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la variante comprende las siguientes sustituciones P10Q+K32E. ~ ~ "^Eñ"''üliá~"Tñóclalidadr"interesante-_de la- invención, -la variante comprende, además de las sustituciones en las posiciones 10 y 32, por ejemplo, además de las sustituciones P10Q+K32E, por lo menos una modificación adicional en el dominio Gla. En una modalidad preferida de la invención, la modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución de aminoácido en la posición 33. Preferiblemente, se introduce un residuo de aminoácido hidrofóbico por sustitución en la posición 33, tal como D33I, D33L, D33M, D33V, D33F, D33Y o D33W, en particular D33F. Por consiguiente, en una modalidad muy interesante de la invención, la vanante comprende las siguientes sustituciones P10Q+K32+D33F. En otra modalidad preferida de la invención, la modificación adicional en el dominio Gla comprende una inserción de por lo menos un residuo de aminoácido (por ejemplo uno) entre las posiciones 3 y 4. Se prefiere que el residuo de aminoácido insertado sea un residuo de aminoácido hidrofóbico. Muy preferiblemente la inserción es A3AY. Por consiguiente, en otra modalidad muy interesante de la invención, la variante comprende las siguientes modificaciones A3AY+P10Q+K32E o A3AY+P10Q+K32E+D33F. En otra modalidad preferida de la invención, la modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución en la posición 34. Se prefiere que un residuo de aminoácido cargado negativamente sea introducido por sustitución en la posición 34. Muy preferiblemente, la sustitución es A34E. Por consiguiente, en otra modalidad muy interesante de la invención, la " variante-- comprende r las siguientes-- modificaciones-- P 0Q+K32E+A34E, . P10Q+K32E+D33F+A34E, A3AY+PIOQ+K32E+A34E o A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E. El dominio Gla también puede contener modificaciones en otras posiciones, en particular en las posiciones 8, 1 1 y 28, tales como R28F o R28E. Por otra parte, se debe entender que el dominio Gla no se debe modificar a tal grado que se deterioren las propiedades de unión de membrana. Por consiguiente, se prefiere no hacer modificaciones en los residuos que se llegan a ?-carboxilar, es decir, se prefiere no hacer modificaciones en los residuos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35. De manera similar, en general se prefiere no introducir porciones no polipeptídicas, tales como porciones de azúcar o grupos de PEG, en el dominio Gla. Consecuentemente, se prefiere no hacer modificaciones en el dominio Gla que originen un sitio de N-glicosilación in vivo. Finalmente, se entenderá que las modificaciones en el dominio Gla expuestas en esta sección, se deben combinar con una o más de las modificaciones descritas en la sección anterior titulada "Introducción de sitios de N-glicosilación in vivo localizados fuera del dominio Gla ". A continuación se dan ejemplos específicos de tales variantes "combinadas". En una modalidad de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T106N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de ^=FVII o FVIIa comprende las:siguientes=modificaciones:-R10Q+K32E+A175T.— . - En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T267+S269T.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T106N+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T106N+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P1 OQ+K32E+I205T+T267N+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T106N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: " A3AY+P10Q+K32E+A175T -- - =.. ^ En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+V253N.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+PLOQ+K32E+T267+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T106N+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T106N+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+10Q+K32E+I205T+T267N+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: : ' P10Q+K32E+D33F+T106N. ' — ^- = - -= -_-r-— - - . - r. .~t - ^ -_ - En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A175T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+I205T.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T267+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T106N+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T106N+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: ^ P10Q+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T. - En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+PLOQ+K32E+D33F+T106N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A175T.

En una modalidad adicional de la Invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+PIOQ+K32E+D33F+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+ 10Q+K32E+D33F+T267+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P1 OQ+K32E+D33F+T106N+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N+V253N. -= . . · , ·. · ·.· · ..- ·· · En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T106N.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+A175T. En una modalidad adicional de la invención, dicha vanante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha vanante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T267+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T106N+I205T. : . - ... -.· r.-_- -._·_- - .- .·· . En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T106N+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+I205T+T267N+S269T.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E+T106N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E A175T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E T267+S269TV - ~-^=r — r= - En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E ?? 06?+?205?. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+V253N.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E I205T+T267N+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E+T106N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E A175T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: ~ - A3AY+P1 OQ+K32E+A34E V253N. - -=r- ^ — -- .-^=^ En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E+T267+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E+T106N+I205T.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E+T106N+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha vanante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E+I205T+T267N+S269T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+10Q+K32E+D33F+A34E+T106N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P 0Q+K32E+D33F+A34E A175T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E I205T. - . r _ ^ ^ ^ En una modalidad adicional de Ta invención" dicha variante' de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E T267+S269T.

En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+I205T. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+V253N. En una modalidad adicional de la invención, dicha variante de FVII o FVIIa comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E I205T+T267N+S269T.

Otras modificaciones fuera del dominio Gla En una modalidad adicional de la presente invención, la variante de FVII o FVIIa, además de las modificaciones descritas en las secciones anteriores, también pueden contener mutaciones que aumentan la actividad intrínseca del polipéptido que ya-son conocidasppor-ejemplo comoJasrque se describen en WO 02/22776. Ejemplos de sustituciones preferidas incluyen sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de V158D, E296D, M298Q, L305V y K337A. Muy preferiblemente, dichas sustituciones se seleccionan del grupo que consiste de V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A, V158D+E296D+M298Q+K337A, V158D+E296D+M298Q+L305V, V158D+E296D+M298Q, M298Q, L305V+K337A, L305V y K337A. En una modalidad adicional de la presente invención, la variante de FVIi o FVIIa, además de las modificaciones descritas en las secciones anteriores, puede tener mutaciones que causan reducción de la inhibición por TFPI que ya son conocidas. Un ejemplo incluye la sustitución K341 Q descrita por Neuenschwander y otros, Biochemistry, 1995; 34: 8701-8707. Además, la variante puede contener modificaciones que se espera que aumenten la afinidad de unión del TF. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de L39E, L39Q, L39H, I42K, I42R, S43H, S43Q, K62E, K62R, L65Q, L65S, F71 D, F71Y, F71 E, F71Q, F71 N, E82Q, E82N, E82K y F275H. Como ya se indicó arriba, la variante también puede contener sustituciones conservativas de aminoácidos.

La porción no polipeptídica En base a la presente descripción, el experto en la materia entenderá=que losrresiduos-de aminoácido unión se pueden introducir por sustitución en el polipéptido original usando~el mismo enfoque ilustrado arriba con sitios de N-glicosilación in vivo. Por ejemplo, se pueden introducir uno o más residuos de aminoácido que comprenden un grupo ácido (ácido glutámico o ácido aspártico), tirosina o lisina en las posiciones anteriormente indicadas. En particular, se pueden introducir uno o más residuos de cisteína en las posiciones anteriormente indicadas. Como se indicó arriba, la porción no polipeptídica de la variante conjugada se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de una molécula de polímero, un compuesto lipofílico, una porción de azúcar (por medio de glicosilación in vivo) y un agente de derivación orgánico. Todos estos agentes pueden conferir propiedades deseables al polipéptido variante, en particular mayor ABC¡V, mayor vida media funcional in vivo o mayor vida media en el plasma. El polipéptido variante normalmente se conjuga con solo un tipo de porción no polipeptídica, pero también se puede conjugar con dos o más tipos diferentes de porciones no polipeptídicas, por ejemplo con una molécula de polímero y una porción de azúcar, con un grupo lipofílico y una porción de azúcar, con un agente de derivación orgánico y una porción de azúcar, con un grupo lipofílico y una molécula de polímero, etc. La conjugación con dos o más porciones no polipeptídicas diferentes se puede hacer simultánea o secuencialmente. -.=- - -- _ - . Métodos -de- preparación de juna variante conjugada de la invención . . ... _ , — En las siguientes secciones, "Conjugación con un compuesto lipofílico", "Conjugación con una molécula de polímero", "Conjugación con una porción de azúcar" y "Conjugación con un agente de derivación orgánico", se describe la conjugación con tipos específicos de porciones no polipeptídicas. En general, una variante conjugada de acuerdo con la invención se puede producir cultivando una célula hospedera apropiada bajo condiciones conducentes para la expresión del polipéptido variante, y recuperando el polipéptido variante, en donde (a) el polipéptido variante comprende por lo menos un sitio de N- u O-glicosilación y la célula hospedera es una célula hospedera eucariótica capaz de glicosilación in vivo, o (b) el polipéptido variante se somete a conjugación in vitro con una porción no polipeptídica. Se entenderá que la conjugación debe ser diseñada de tal manera de producir la molécula óptima con respecto al número de porciones no polipeptídicas unidas, el tamaño y la forma de tales moléculas (por ejemplo si son lineales o ramificadas), y el o los sitios de unión en el polipéptido. El peso molecular de la porción no polipeptídica por usar, por ejemplo, se puede elegir en base al efecto deseado que se busca. Por ejemplo, si la finalidad principal de la conjugación es obtener una variante conjugada que tenga un peso molecular alto (por ejemplo para reducir la depuración renal), usualmente es conveniente conjugar tan pocas porciones no polipeptídicas de peso molecular alto como sea posible, para obtener el peso molecular deseado. - CuanjJo^se busca_jjji ajto grado^ de protección, esto se puede obtener usando úñ número suficientemente alto de porciones no polipeptídicas de peso molecular bajo (por ejemplo con un peso molecular de 300 Da a 5 kDa, aproximadamente, por ejemplo un peso molecular de 300 Da a 2 kDa). Conjugación con una molécula de polímero La molécula de polímero por acoplar al polipéptido variante puede ser cualquier molécula de polímero adecuada, tal como por ejemplo un homopolímero o heteropolímero natural o sintético, normalmente con un peso molecular en la escala de 300-100,000 Da, aproximadamente; de preferencia 500-20,000 Da, aproximadamente; de preferencia en la escala de 500-15,000 Da, aproximadamente, muy preferiblemente 2-12 kDa, aproximadamente; por ejemplo, en la escala de 3-10 kDa, aproximadamente. Cuando se usa aquí el término "aproximadamente" con respecto a cierto peso molecular, indica un peso molecular promedio aproximado y refleja el hecho de que habrá normalmente una cierta distribución de peso molecular en una preparación de polímero dada. Ejemplos de homopolímeros incluyen un poliol (esto es, poli-OH), una poliamina (esto es, poli-NH2) y un ácido policarboxílico (esto es, poli- COOH). Un heteropolímero es un polímero que comprende diferentes grupos de acoplamiento, tales como un grupo hidroxilo y un grupo amina. Ejemplos de moléculas de polímero adecuadas incluyen moléculas de polímero seleccionadas del grupo que consiste de óxido de — -polialquileno - (PAO),-- incluyendo _ , polialquilengljcol (PAG), tal como polietilenglicol (PÉG) y polipropilenglicol (PPG),* PEGs ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarbonato, poli(vinilpirrolidona), poliet¡leno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, dextrano, incluyendo carboximetil-dextrano, o cualquier otro biopolímero adecuado para reducir la inmunogenicidad o aumentar la vida media funcional ¡n vivo o la vida media en el suero. Otro ejemplo de una molécula de polímero es albúmina humana u otra proteína plasmática abundante. Generalmente, los polímeros derivados de polialquilenglicol son biocompatibles, no tóxicos, no antigénicos, no inmunogénicos, tienen varias propiedades de solubilidad en agua y son excretados fácilmente de los organismos vivos. El PEG es la molécula de polímero preferida porque tiene solo unos pocos grupos reactivos capaces de entrelazamiento en comparación por 5 ejemplo con polisacáridos tales como dextrano. En particular, es de interés el PEG monofuncional, por ejemplo metoxipolietilenglicol (mPEG), ya que su química de acoplamiento es relativamente simple (solo está disponible un grupo reactivo para la conjugación con grupos de unión en el polipéptido). Consecuentemente, como se elimina el riesgo de entrelazamiento, las 10 variantes conjugadas resultantes son más homogéneas y la reacción de las moléculas de polímero con el polipéptido variante es mas fácil de controlar. Para efectuar la unión covalente de la o las moléculas de polímero con el polipéptido variante, los grupos terminales hidroxilo de la molécula de polímero deben ser provistos en forma activada, esto es, con — -15~_-grupos Juncionales„Treactiyos _ (ejemp os„deJos_cuales incluyen grupos amino primarios, hidrazida (HZ), tiol, succinato (SUC), "succinato de succinimidilo (SS), succinimidil-succinamida (SSA), propionato de succinimidilo (SPA), butirato de succinimidilo (SBA), carboximetilato de succinimidilo (SCM), carbonato de benzotriazol (BTC), N-hidroxisuccinimida (NHS), aldehido, 20 nitrofenilcarbonato (NPC) y tresilato (TRES)). Moléculas de polímero activadas adecuadas están disponibles comercialmente, por ejemplo de Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama, E.U.A., o de PolyMASC Pharmaceuticals pie, Reino Unido.

Alternativamente, las moléculas de polímero se pueden activar por medio de métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en WO 90/13540. Ejemplos específicos de moléculas de polímero activadas lineales o ramificadas para usar en la presente invención, se describen en los catálogos de Shearwater Polymers, Inc., 1997 y 2000 ("Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Phármaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives", incorporados aquí como referencia). Ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen ios siguientes PEGs lineales: NHS-PEG (por ejemplo SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, y SCM-PEG), y NOR- PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, y MAL-PEG, y PEGs ramificados tales como PEG2-NHS y los que se describen en US 5,932, 462 y US 5,643, 575, ambas incorporadas aquí como referencia. Además, las siguientes ^publicaciones, incorporadas^^uLcomo Referencia, describen mqléculas de polímero útiles~o químicas de PEGilación: US' 5,824,778, "US 5;476;653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281 ,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791 , WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131 , US 5, 736, 625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629, 384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473, 034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316. Ejemplos específicos de polímeros de PEG activados, particularmente preferidos para acoplamiento con residuos de cisteína, incluyen los siguientes PEGs lineales: vinilsulfona-PEG (VS-PEG), preferiblemente vinilsulfona-mPEG (VS-mPEG); maleimida-PEG (MAL-PEG), preferiblemente maleimida-mPEG (MAL-mPEG) y ortopiridil-disulfuro-PEG (OPSS-PEG), preferiblemente ortopiridil-disulfuro-mPEG (OPSS-mPEG). Típicamente, tales polímeros de PEG o mPEG tendrán un tamaño de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 12 kDa o aproximadamente 20 kDa. La conjugación entre la variante de polipéptido y las moléculas de polímero activadas se realiza usando cualquier método convencional, por ejemplo como se describe en las siguientes referencias (que también describen -métodos , adecuad^^ Harris y Zalipsky, eds., "Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications", AZC, Washington; R. F. Taylor, (1991 ), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation y Crosslinking", CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson y otros, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N. Y.). La persona experta entenderá que el método de activación o química de conjugación a utilizar depende del grupo o grupos de unión del polipéptido variante (ejemplos de los cuales se dieron arriba), así como también los grupos funcionales de los polímeros (por ejemplo si es amina, hidroxilo, carboxilo, aldehido, sulfhidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La pegilación puede estar dirigida a la conjugación con todos los grupos de unión disponibles sobre el polipéptido variante (esto es, los grupos de unión que están expuestos en la superficie del polipéptido), o puede estar dirigida a uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo el grupo amino N-terminal, como se describe en US 5,985,265, o a residuos de cisteína. Además, la conjugación se puede lograr en un paso o de manera gradual (por ejemplo como se describe en WO 99/55377). Para pegilación con residuos de cisteína (véase arriba), la variante de FVII o FVIIa usualmente se trata con un agente reductor tal como ditiotreitol (DDT) antes de la pegilación. El agente reductor se remueve subsiguientemente mediante cualquier método convencional, por ejemplo por - -desalac¡ón.~J_a.jC9jijuga residuo de ciste^ tiene fugar en un amortiguador adecuado a pH 6-9, a temperaturas que varían - de 4 °C a 25 °C durante períodos de 16 horas. Se entenderá que la pegilación se diseña a fin de producir la molécula óptima con respecto al número de moléculas de PEG unidas, el tamaño y la forma de dichas moléculas (por ejemplo si son lineales o ramificadas), y el o los sitios de unión en el polipéptido variante. El peso molecular del polímero a usar se puede elegir por ejemplo en base al efecto deseado.

Con respecto a la conjugación con un solo grupo de unión en la proteína (por ejemplo el grupo amino N-terminal), puede ser ventajoso que la molécula de polímero, que puede ser lineal o ramificada, tenga un peso molecular alto, de preferencia de 10-25 kDa, aproximadamente; de 5 preferencia 15-25 kDa, aproximadamente, por ejemplo 20 kDa aproximadamente. Normalmente, la conjugación del polímero se realiza bajo condiciones dirigidas a hacer reaccionar muchos de los grupos de unión de polímero disponibles con moléculas de polímero. Esto se logra por medio de 10 un exceso molar adecuado de polímero con respecto al polipéptido. Típicamente, las relaciones molares de moléculas de polímero activado a polipéptido son de hasta 1000-1 aproximadamente, por ejemplo hasta 200-1 aproximadamente, o hasta 100-1 aproximadamente. Sin embargo en algunos casos la relación puede ser un poco menor, por ejemplo hasta 50-1 , 10-1 , 5-1 , ;15~ 2-1.0 1 -1 ,. aproximadamente, para obtener unajeacción óptima. De acuerdo con la invención también se contempla acoplar las moléculas de polímero con el polipéptido por medio de un enlazador. Los enlazadores adecuados son muy conocidos para el experto en la materia. Un ejemplo preferido es el cloruro cianúrico (Abuchowski y otros, (1977), J. Biol. 20 Chem., 252, 3578-3581 ; US 4,179, 337; Shafer y otros, (1986), J. Polym. Sc¡. Polym. Chem. Ed. , 24,375-378). Después de la conjugación, las moléculas de polímero activadas residuales se bloquean de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo por adición de amina primaria a la mezcla de reacción, y las moléculas de polímero inactivadas resultantes se remueven mediante un método adecuado. Se entenderá que dependiendo de las circunstancias, por ejemplo la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, la naturaleza del compuesto de PEG activado usado y las condiciones específicas de pegilación, incluyendo la relación molar de PEG a polipéptido, se pueden obtener grados variables de pegilación, siendo obtenido generalmente un grado más alto de pegilación con una relación más alta de PEG a polipéptido variante. Sin embargo, los polipéptidos variantes pegilados que resultan de cualquier proceso de pegilación dado, normalmente comprenden una distribución estocástica de variantes de polipéptido conjugado que tienen grados ligeramente diferentes de pegilación.

Acoplamiento con una porción de azúcar - — - - ir - Para Jograr glicosilaciónjA7j//w_de_una molécula de FVII que comprende uno ó más sitios ~de glicosilación, la secuencia de nucleótidos que -codifica el polipéptido variante se debe insertar en un hospedero de expresión eucariótico glicosilante. La célula hospedera de expresión se puede seleccionar de células de hongo (hongo filamentoso o levadura), insecto o animal, o de células de plantas transgénicas. En una modalidad, la célula hospedera es una célula de mamífero, tal como una célula CHO, BHK o HEK, por ejemplo HEK 293, o una célula de insecto tal como una célula SF9, o una célula de levadura, por ejemplo S. cerevisiae o Pichia pastorís, o cualquiera de las células hospederas que se mencionan más abajo. El acoplamiento covalente in vitro de porciones de azúcar (tales como dextrano) con residuos de aminoácido del polipéptido variante, también se puede usar por ejemplo como se describe en WO 87/05330 y en Aplin y otros, CRC Crit Rev. Biochem, p. 259-306, 1981. El acoplamiento in vitro de porciones de azúcar o PEG con residuos de GIn enlazados a proteína o péptido, se puede llevar a cabo por medio de transglutaminasas (TGasas). Las transglutaminasas catalizan la transferencia de grupos amino donadores a residuos de GIn enlazados a proteína y péptido, en una reacción que se llama de entrelazamiento. Los grupos amino donadores pueden estar enlazados a proteína o péptido, tal como el grupo e-amino en residuos de Lys, o pueden ser parte de una molécula orgánica pequeña o grande. Un ejemplo de una molécula orgánica pequeña que funciona como el donador de amino en entrelazamiento catalizado por TGasa, es la putrescina (1 ,4-diaminobutano). yn_§j§m to^ más grande que funciona como donador de amino erTéntrelazamiento catalizado por TGasa, es un PEG que contiene amina (Sato y otros, 1996, Biochemistry 35, 13072-13080). En general, las TGasas son enzimas altamente específicas y no todo residuo de GIn expuesto sobre la superficie de una proteína es accesible al entrelazamiento catalizado por TGasa con sustancias que contienen amino. Por el contrario, solo unos pocos residuos de GIn funcionan naturalmente como substratos de TGasa, pero los parámetros exactos que determinan qué residuos de GIn son buenos substratos de TGasa, siguen siendo desconocidos. De esta manera, para hacer a una proteína susceptible de reacciones de entrelazamiento catalizado por TGasa es frecuentemente un prerrequisito agregar, en posiciones convenientes, tramos de secuencia de aminoácido que se sabe funcionan muy bien como substratos de TGasa. Se conocen varias secuencias de aminoácidos que son o que contienen excelentes substratos naturales de TGasa, por ejemplo la sustancia P, elafina, fibrinógeno, fibronectina, inhibidor de ci2-piasmina, a-caseínas y ß-caseínas.

Conjugación con un agente de derivación orgánico La modificación covalente del polipéptido variante se puede realizar haciendo reaccionar uno o más grupos de unión del polipéptido variante con un agente de derivación orgánico. Agentes y métodos de derivación adecuados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, muy comúnmente, residuos cisteinilo se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y - _aminjS- cojrespondientes),^tales ;gmo ácido^ cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de cáfboximetilo o carboxiamidométilo:- Los residuos- cisteinilo también se modifican por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(4-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p- cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa- 1 ,3-diazol. Los residuos de histidilo se modifican por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5.5-7.0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo. La reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0.1 M a pH 6.0. El lisinilo y los residuos amino terminales se hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La modificación con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para modificar residuos que contienen a-amino incluyen ¡midoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y la reacción con glioxilato catalizada por transaminasa. Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1 ,2- ciclohexanodiona y ninhidrina. La modificación de residuos de arginina requiere que la reacción sea realizada en condiciones alcalinas debido al pKa alto del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de -.Jisina asLcoj^o JajT^ _ J-os grupos Jaterales carboxilo (aspartilo b glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), en donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia- 4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo son convertidos a residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Conjugación con un compuesto lipofílico El polipéptido variante y el compuesto lipofílico se pueden conjugar entre sí directamente o bien usando un enlazador. El compuesto lipofílico puede ser un compuesto natural tal como un ácido graso saturado o 5 insaturado, una dicetona de ácido graso, un terpeno, una prostaglandina, una vitamina, un carotenoide o esteroide, o un compuesto sintético tal como un ácido carbónico, un alcohol, una amina y ácido sulfónico, con uno o más compuestos alquilo, arilo, alquenilo u otros compuestos insaturados múltiples. La conjugación entre el polipéptido variante y el compuesto lipofílico, 10 opcionalmente por medio de un enlazador, se puede hacer de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como lo describe Bodanszky en "Peptide Synthesis", John Wiley, New York, 1976 y en WO 96/12505.

Métodos de preparación de una variante de polipéptido de la - -.15--— invención _ _ La variante dé polipéptido" de la presente- invención se puede- - producir por medio de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos incluyen construir una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de polipéptido y expresar la secuencia en un hospedero adecuado 20 transformado o transfectado. Preferiblemente, la célula hospedera es una célula hospedera gamma-carboxilante tal como una célula de mamífero. Sin embargo, se pueden producir variantes de polipéptido de la invención, aunque menos eficientemente, por síntesis química o por una combinación de síntesis químicas, o una combinación de síntesis química y tecnología recombinante de ADN. Una secuencia de nudeótidos que codifica un polipéptido de la invención se puede construir aislando o sintetizando una secuencia de nudeótidos que codifica el FVII original, tal como el hFVII con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, y después cambiando la secuencia de nudeótidos a fin de introducir (esto es, insertar o sustituir) o remover (esto es, suprimir o sustituir) el o los residuos de aminoácido relevantes. La secuencia de nudeótidos se modifica convenientemente por mutagénesis dirigida a sitio de acuerdo con los métodos convencionales. Alternativamente, la secuencia de nudeótidos se prepara por síntesis química, por ejemplo usando un sintetizador de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos se diseñan en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y preferiblemente seleccionando aquellos codones que spjTLfavored^dqs^en la^lula^hospedera^enja qu ,será.prpducidp el polipéptido_ recombinante. Por ejemplo, se" pueden sintetizar varios "oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado y se pueden ensamblar por PCR, ligación o reacción en cadena por ligación (LCR) (Barany, PNAS 88:189-193, 1991 ). Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente tramos salientes 5' o 3' para ensamble complementario. Están disponibles métodos alternativos de modificación de secuencia de nudeótidos para producir variantes de polipéptido para análisis y selección de alto rendimiento, por ejemplo métodos que incluyen cruzamiento homólogo como se describe en US 5,093,257, y métodos que incluyen entremezclado de genes, es decir, recombinación entre dos o más secuencias de nucleótidos homologas, que origina secuencias de nucleótidos nuevas que tienen varias alteraciones de nucleótidos en comparación con las secuencias de nucleótidos iniciales. El entremezclado de genes (también conocido como entremezclado de ADN) incluye uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y reensamble de las secuencia de nucleótidos, seguido por análisis para seleccionar las secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con propiedades deseadas. Para que tenga lugar el entremezclado de ácido nucleico en base a homología, las partes relevantes de las secuencias de nucleótidos son, de preferencia, por lo menos 50% idénticas, por ejemplo por lo menos 60% idénticas, de preferencia por lo menos 70% idénticas, por ejemplo por lo menos 80% idénticas. La recombinación se puede realizar in vitro o in vivo. -.- — -.-Se.desmb^ de genes en Stemme? y otros (1994), Proc. Nati. Acád. Sci. ÜSA, voI. "91 ,~ p~ 10747-10751 ; Stemmer (1994), Nature, vol. 370, p. 389-391 ; Smith (1994), Nature vol. 370, p. 324-325; Zhao y otros, Nat. Biotechnol. 1998, Marzo; 16 (3): 258-61 ; Zhao H. y Arnold FB, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25. No. 6 p. 1307-1308; Shao y otros, Nucleic Acids Research 1998, Enero 15; 26 (2): p. 681-83; y WO 95/17413. Un ejemplo de un método adecuado de entremezclado in vivo se describe en WO 97/07205. Se describen otras técnicas de mutagénesis de secuencias de ácido nucleico por recombinación in vitro o in vivo, por ejemplo, en WO 97/20078 y US 5,837,458. Ejemplos de técnicas de entremezclado específicas incluyen "entremezclado de familia", "entremezclado sintético" y "entremezclado in silico". El entremezclado de familia incluye someter una familia de genes homólogos de diferentes especies a uno o más ciclos de entremezclado y posterior análisis o selección. Las técnicas de entremezclado de familia se describen por ejemplo en Crameri y otros (1998), Nature, vol. 391 , p. 288-291 ; Christians y otros (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, p. 259-264; Chang y otros (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, p. 793-797; y Ness y otros (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, 893-896. El entremezclado sintético incluye proveer colecciones de oligonucleótidos sintéticos traslapantes basados por ejemplo en una alineación de secuencia de genes homólogos de interés. Los oligonucleótidos generados_,s¡ntéticamer te^ej^ ácido^ nucleico recórnbinantes resultantes se analizan y, si se desea, se usan para ciclos de -entremezclado adicionales. Se describen técnicas de entremezclado sintético en WO 00/42561 . El entremezclado in silico se refiere a un procedimiento de entremezclado de ADN que se realiza o modela usando un sistema de computadora, evitando así, parcial o totalmente, la necesidad de manipular físicamente los ácidos nucleicos. Las técnicas de entremezclado in silico se describen en WO 00/42560.

Una vez ensamblada (por síntesis, mutagénesis dirigida a sitio u otro método), la secuencia de nucleotidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector recombinante y se enlaza operativamente con secuencias de control necesarias para la expresión del FVII en la célula hospedera transformada deseada. Desde luego, se debe entender que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionan igualmente bien para expresar la secuencia de nucleotidos que codifica las variantes de polipéptido que se describen en la presente. Tampoco todos los hospederos funcionan igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia puede hacer sin mayor experimentación una selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y hospederos. Por ejemplo, al seleccionar un vector, se debe considerar al hospedero porque el vector se debe duplicar en él o debe ser capaz de integrarse en el cromosoma. También.se debe_considerar el número de copias del vector, la^ capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibiótico. Al seleccionar una secuencia de control de expresión también se debe considerar una variedad de factores. Estos incluyen por ejemplo la resistencia relativa de la secuencia, su facilidad de control y su compatibilidad con la secuencia de nucleotidos que codifica el polipéptido, particularmente con respecto a posibles estructuras secundarias. Los hospederos se deben seleccionar considerando su compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad del producto codificado por la secuencia de nucleótidos, sus características de secreción, su capacidad para plegar correctamente la variante de polipéptido, sus requerimientos de fermentación o cultivo y la facilidad de purificación de los productos codificados por la secuencia de nucleótidos. 5 El vector recombinante puede ser un vector que se duplica autónomamente, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica cuya duplicación es independiente de la duplicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector es un vector en el cual, cuando se introduce en una célula hospedera, es integrado 10 en el genoma de la célula hospedera y duplicado junto con el o los cromosomas en los cuales se ha integrado. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión en el cual la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de polipéptido de la invención está ligada operativamente con segmentos adicionales requeridos de -la -secuencia - -de -nucleótidos.- . -El-vectqr- -deriva .- — _ - - ------ típicamente de ÁDÑ plasmídico o viral. Varios vectores de expresión adecuados para expresión en las células hospederas aquí mencionadas están disponibles comercialmente o se describen en la literatura. Vectores de expresión útiles para hospederos eucarióticos incluyen, por ejemplo, vectores 20 que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma de bovino, adenovirus y citomegalovirus. Vectores específicos son por ejemplo pCDNA3.1 (+) \ Hyg (Invitrogen, Carisbad, California, E.U.A.) y pCI-neo (Stratagene, La Jolla, California, E.U.A.). Vectores de expresión útiles para células de levadura incluyen el plásmido 2µ y derivados del mismo, el vector POT1 (US 4,931 ,373), el vector PJS037 descrito por Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, y PPICZ A, B o C (Invitrogen). Vectores útiles para células de insecto incluyen pVL941 , pBG311 (Cate y otros, "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, p. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 y pMelbac (ambos disponibles de Invitrogen). Vectores de expresión útiles para hospederos bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, como los plásmidos de E. coli, incluyendo pBR322, pET3a y pET12a (ambos de Novagen Inc., Wisconsin, E.U.A.), plásmidos de una gama de hospederos más amplia, tales como RP4, ADNs de fago, por ejemplo los muchos derivados del fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN como M13 y fagos de ADN filamentoso de una sola cadena . Otros vectores para usar en esta invención incluyen los que permjten~que la~secuenciar de -nucleótidos -que -codifica- la variante-de^ polipéptido sea amplificada en cuanto a su número de copias. Tales vectores amplificables son muy conocidos en la técnica. Incluyen, por ejemplo, vectores susceptibles de ser amplificados por amplificación DHFR (véase por ejemplo Kaufman, patente de E.U.A. No. 4,470,461 ; Kaufman y Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reducíase CDNA Gene: Analysis Of Signáis Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, p. 1304-19 (1982)) y amplificación de glutamina sintetasa ("GS") (véase por ejemplo, US 5,122,464 y EP 338,841 ).

El vector recombinante puede comprender además una secuencia de ADN que permite al vector duplicarse en la célula hospedera en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia (cuando la célula hospedera es una célula de mamífero) es el origen de duplicación de SV40. Cuando la célula 5 hospedera es una célula de levadura, las secuencias adecuadas que permiten al vector duplicarse son los genes de duplicación del plásmido de levadura 2µ REP 1-3 y el origen de duplicación. El vector también puede comprender un marcador seleccionare, por ejemplo un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula 10 hospedera, tal como el gen que codifica para dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen TPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P. R. Russell, Gene 40, 1985, p. 125-130), o uno que confiere resistencia a un fármaco, por ejemplo ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexate. Para Saccharomyces cerevisiae, los marcadores _15__ seleccionares ^incluyen - ura3^. y- Ieu2~~ -Para - ^hongos-filamentosos," os- marcadores seleccionares incluyen amdS, pyrG, arcB, niaD y sC. El término "secuencias de control", como se usa aquí, incluye todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de la variante de polipéptido de la invención. Cada secuencia de control puede 20 ser natural o ajena a la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, sin limitación, una secuencia guía, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, incrementador o secuencia activadora hacia el extremo 5', secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor. Se puede usar una amplia variedad de secuencias de control de expresión en la presente invención. Tales secuencias útiles de control de expresión incluyen las secuencias de control de expresión asociadas con genes estructurales de los vectores de expresión ajenos, así como cualquier secuencia conocida que controla la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. Ejemplos de secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en células de mamífero incluyen los promotores temprano y tardío de SV40 y adenovirus, por ejemplo el promotor tardío mayor 2 de adenovirus, el promotor MT-1 (gen de metalotioneina), el promotor del gen inmediato-temprano de citomegalovirus humano (CMV), el promotor del factor de. elongaciónr1a-(EF.- a) humano,-el promotor de proteína-70 de;choque de~ calor mínimo de Drosophila, el promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV), el promotor de ubiquitina C (UbC) humana, el terminador de la hormona de crecimiento humana, SV40 o señales de poliadenilación de la región Elb de adenovirus, y la secuencia de consenso de Kozak (Kozak, M. J Mol Biol 1987 20 de agosto; 196 (4): 947-50). Para mejorar la expresión en células de mamífero se puede insertar un intrón sintético en la región 5' no traducida de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un ejemplo de un intrón sintético es el intrón sintético del plásmido pCI-Neo (disponible de Promega Corporation, Wisconsin, E.U.A.). Ejemplos de secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en células de insecto incluyen el promotor de polihedrina, el promotor P10, el promotor de proteína básica de virus de polihedrosis de Autographa californica, el promotor del gen 1 inmediato temprano de baculovirus y el promotor del gen retrasado-temprano de 39K de baculovirus, y la secuencia de poliadenilación de SV40. Ejemplos de secuencias de control adecuadas para usar en células hospederas de levadura incluyen los promotores del sistema de a-apareamiento de levadura, el promotor de triosa fosfato isomerasa (TPI) de levadura, promotores de genes glicolíticos de levadura o genes de alcohol deshidrogenasa, el promotor ADH2-4c, y el promotor GAL inducible. Ejemplos de secuencias de control adecuadas para usar en células hospederas de hongos filamentosos incluyen el promotor y terminado/ de, AJDH3, -un - — ~- t -ámilasa triosa fosfato isomerasa TAKÁ o proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, una a-amilasa de A. niger, glucoamilasa de A. niger o A. nidulans, acetamidasa de A. nidulans, aspártico proteinasa o lipasa de Rhizomucor miehei, el terminador TPI1 y el terminador ADH3. Ejemplos de secuencias de control adecuadas para usar en células hospederas bacterianas incluyen los promotores del sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, y las regiones mayores de promotor del fago lambda. La presencia o ausencia de un péptido señal, por ejemplo, dependerá de la célula hospedera de expresión usada para la producción de la variante de polipéptido por expresar (si es un polipéptido intracelular o extracelular), y si es deseable obtener secreción. Para usar en hongos filamentosos, el péptido señal puede derivar convenientemente de un gen que 5 codifica una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen que codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido señal deriva preferiblemente de un gen que codifica amilasa de A. oryzae TAKA, a-amilasa neutra de A. niger, amilasa estable al ácido de A. niger, o glucoamilasa de A. niger. Para usar en células de insecto, 10 el péptido señal puede derivar convenientemente de un gen de insecto (véase WO 90/05783), tal como el precursor de hormona adipocinética de Lepidopteran manduca sexta (véase US 5,023,328), la melitina de abeja obrera (Invitrogen), ecdiesteroide UDPglucosiltransferasa (egt) (Murphy y otros, Protein Expression and Purification 4,349-357 (1993) o lipasa „1.5__r pancreática hi^ana (hpl) (/WefA70ofs-/ Enzymo/ogy.- 284, -p.-262-272r 997). --- Un péptido señal preferido para usar en células de mamífero es el de hFVII o el péptido señal de la cadena ligera kappa de Ig de murino (Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152: 89-104). Para usar en células de levadura se han encontrado como péptidos señal adecuados el péptido señal de factor a de S. 20 cereviciae (véase US 4,870,008), un péptido señal de carboxipeptidasa modificado (véase L.A. Valls y otros, Cell 48, 1987, p. 887-897), el péptido señal BAR1 de levadura (véase WO 87/02670), el péptido señal de aspártico proteasa 3 de levadura (YAP3) (véase M. Egel-Mitani y otros, Yeast 6,1990, p. 127- 137), y la secuencia guía sintética TA57 (W098/32867). Para usar en células de E. coli se ha encontrado como un péptido señal adecuado el péptido señal ompA (EP581821 ). La secuencia de nucleótidos de la invención que codifica una variante de polipéptido, preparada por mutagénesis dirigida a sitio, síntesis, PCR u otros métodos, opcionalmente puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. El péptido señal está presente cuando se busca que la variante de polipéptido sea secretada de las células en las que se expresa. Dicho péptido señal, si está presente, debe ser reconocido por la célula elegida para la expresión de la variante de polipéptido. El péptido señal, por ejemplo, puede estar asociado normalmente con hFVII, o alternativamente el péptido señal puede ser de otra fuente diferente a hFVII, tal como los asociados normalmente con otros polipéptidos dependientes de vitamina K humanos de tipo silvestre. Además, el péptido señaLpuede. se£- uru epjido^ sefial^expresado-normalmente- der-la célula—, hospedera, o uno que ño se expresa normalmente de la célula hospedera. Por consiguiente, el péptido señal puede ser procariótico, por ejemplo derivado de una bacteria como E. coli, o eucariótico, por ejemplo derivado de una célula de mamífero o insecto o levadura. Cualquier hospedero se puede usar para producir la variante de polipéptido, incluyendo bacterias (aunque no son particularmente preferidas), hongos (incluyendo levaduras), plantas, insectos, mamíferos u otras células o líneas de células de animales apropiadas, así como animales o plantas transgénicos. Ejemplos de células hospederas bacterianas incluyen bacterias gram-positivas, tales como cepas de Bacillus, por ejemplo B. brevis o B. subtilis, Pseudomonas o Streptomyces, o bacterias gram-negativas tales como cepas de E. coli. La introducción de un vector en una célula hospedera bacteriana puede realizarse por transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961 , Journal of Bacteriology 81 : 823- 829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971 , Journal of Molecular Biology 56: 209-221 ), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 ), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278). Ejemplos de células hospederas adecuadas de hongos filamentosos incluyen cepas de Aspergillus, por ejemplo A. oryzae, A. niger, o A. nidulans, Fusarium o Trichoderma. Las células de hongo pueden ser _ ^transformadas. _p r^ .un . proceso- que ^.incluye -formaciónr de protoplastos, --- transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular, de una forma conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células hospederas de Aspergillus se describen en EP 238 023 y US 5,679,543. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen en Malardier y otros, 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Ejemplos de células hospederas de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, por ejemplo S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia como P. pastoris o P. methanolica, Hansenula como H. polymorpha o Yarrowia. La levadura se puede transformar usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J. N. y Simón, M. I., editores, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods In Enzymology", Volumen 194, p. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito y otros, 1983, Journal of Bacteríology 153: 163; Hinnen y otros, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920: y como lo describen los Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, California, E.U.A. (en el protocolo del equipo del sistema de transformación de levadura Yeastmaker™). Ejemplos de células hospederas de insecto adecuadas incluyen una línea de células de Lepidoptora, tales como células de Spodoptera frugiperda (Sf9 o Sf21 ) o Trichoplusioa ni (High Five) (US 5,077,214). La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos heterólogos en las mismas se pueden realizar como lo describe Invitrogen. Ejemplos de células hospederas de mamífero adecuadas incluyen ;- ATCC CCL-61 ), líneas de células de~mono verde (COS) (por ejemplo COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651 )); células de ratón (por ejemplo NS/O), líneas de células de riñon de crías de hámster (BHK) (por ejemplo ATCC CRL-1632 o ATCC CCL- 0), y células humanas (por ejemplo HEK 293 (ATCC CRL-1573)), así como células vegetales en cultivo de tejidos. Se conocen más líneas de células que son adecuadas y están disponibles de centros de depósito público tales como la American Type Culture Collectíon, Rockville, Maryland. también, la célula de mamífero, por ejemplo una célula CHO, se puede modificar para expresar sialil transferasa, por ejemplo 1 ,6-sialil transferasa, por ejemplo como se describe en US 5,047,335, para proveer una mejor glicosilación de la variante de polipéptido. Para aumentar la secreción, puede ser de interés particular 5 producir el polipéptido variante de la invención junto con una endoproteasa, en particular PACE (enzima convertidora de aminoácido básico apareado) (por ejemplo como se describe en US 5,986,079), tal como endoproteasa Kex2 (por ejemplo como se describe en WO 00/28065). Los métodos para introducir ADN exógeno en células 10 hospederas de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposoma, vectores virales y el método de transformación descrito por Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido, usando Lipofectamin 2000. Estos métodos son muy conocidos y por ejemplo los describen Ausbel y otros New York, E.U.A. El cultivo de células de mamífero se realiza de acuerdo con los métodos establecidos, por ejemplo como se describe en "Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols", editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, E.U.A. y Harrison MA y Rae IF, 20 "General Techniques of Cell Culture", Cambridge University Press 1997). En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción de la variante de polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo de matraz agitado, fermentación en pequeña escala o en gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, lote cargado o en estado sólido), en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten la expresión o aislamiento del polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos. Se tienen disponibles medios adecuados de proveedores comerciales, o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo en los catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante de polipéptido es secretada hacia el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si la variante de polipéptido no es secretada, se puede recuperar de los lisados de células. La variante de polipéptido resultante se puede recuperar por —.-medio puede recuperar del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, sin limitación, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los polipéptidos se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos que incluyen, sin limitación, cromatografía (por ejemplo de intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio), HPLC o extracción (véase, por ejemplo, "Protein Purification", J.C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989). Las variantes de polipéptido de una sola cadena de la invención 5 se pueden purificar y activar para convertirlas en variantes de polipéptido de dos cadenas por medio de varios métodos descritos en la literatura (Broze y Majerus, 1980, J. Biol. Chem. 255: 1242-47 y Hedner y Kisiel, 1983, J. Clin. Invest. 71 : 1836-41 ). Otro método con el cual la variante de polipéptido de una sola cadena se puede purificar es por incorporación de iones Zn durante 10 la purificación, como se describe en US 5,700,914. En una modalidad preferida, la variante de polipéptido se purifica como una variante de polipéptido de una sola cadena. La variante de polipéptido de una sola cadena se activa usando una enzima inmovilizada (por ejemplo factores lia, IXa, Xa y XIIA), o por autoactivación usando una matriz de intercambio iónico _15. cargada.ppsiti a^ente. . - ~ - - - -_- : - _ - Es conveniente primero purificar la variante de polipéptido en su forma de una sola cadena, después pegilar (si se desea) y finalmente activar por alguno de los métodos anteriormente descritos o por autoactivación, como lo describen Pedersen y otros, 1989, Biochemistry 28: 9331-36. La ventaja de 20 llevar a cabo la pegilación antes de la activación es que se evita la pegilación del nuevo extremo amino formado por el corte de R152-1153. La pegilación de este nuevo extremo amino inactivaría la molécula, puesto que la formación de un enlace de hidrógeno entre D242 y el extremo amino de 1153 es necesaria para la actividad.

Composición farmacéutica de la invención y su uso En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición, en particular a una composición farmacéutica que comprende una variante de polipéptido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La variante de polipéptido o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede usar como un medicamento. Debido a las propiedades mejoradas anteriormente mencionadas, las variantes de polipéptido de la invención, o las composiciones farmacéuticas de la invención, son de particular utilidad para el tratamiento de eventos de sangrado incontrolable en pacientes con trauma, pacientes trombocitopénicos, pacientes en tratamiento anticoagulante y pacientes. de^c¡rrosjs_con * gastrointestinal"" superior, y en pacientes que sufren transplante de hígado ortotópico, o resección de hígado (permitiendo cirugía sin transfusión). El trauma se define como una lesión al tejido vivo causada por un agente extrínseco. Es la cuarta causa principal de muerte en los E.U. y una fuerte carga financiera en la economía. El trauma se clasifica como contundente o penetrante. El trauma contundente produce compresión interna, daño de órgano y hemorragia interna, mientras que el trauma penetrante (como consecuencia de un agente que penetra el cuerpo y destruye tejido, vasos y órganos), produce hemorragia externa. La hemorragia, como resultado del trauma, puede iniciar una cascada de problemas. Por ejemplo, se inician mecanismos de 5 compensación fisiológica con vasoconstricción periférica y mesentérica para desviar sangre a la circulación central. Si la circulación no se restablece, sobreviene choque hipovolémico (falla de múltiples órganos debido a perfusión inadecuada). Como los tejidos en todo el cuerpo quedan privados de oxígeno, comienza un metabolismo anaerobio. Sin embargo, el ácido 10 láctico concomitante lleva a la caída del pH sanguíneo y se desarrolla acidosis metabólica. Si la acidosis se hace severa y no se corrige, el paciente puede desarrollar falla de múltiples sistemas y muere. Aunque la mayoría de los pacientes con trauma están hipotérmicos al llegar a la sala de emergencia debido a las condiciones _t5__ajpbjentales.en. la^escena.-una^protección inadecuada, la-administración-de—- fluido intravenoso y la pérdida de sangre en marcha empeoran el estado hipotérmico. Puede presentarse deficiencia de factores de coagulación por pérdida o transfusión de sangre. Entretanto, la acidosis y la hipotermia dificultan los mecanismos de coagulación sanguínea. De esta manera, se 20 desarrolla coagulopatía que a su vez puede enmascarar sitios de sangrado quirúrgico y estorbar el control de sangrado mecánico. La hipotermia, coagulopatía y acidosis se caracterizan frecuentemente como la "tríada de muerte del trauma".

El trauma puede ser causado por varios eventos. Por ejemplo, los accidentes de tráfico en los caminos dan como resultado muchos tipos diferentes de trauma. Aunque probablemente algunos accidentes de tráfico en los caminos ocasionan trauma penetrante, muchos accidentes de tráfico probablemente infligen trauma contundente tanto en la cabeza como en el cuerpo. Sin embargo, todos estos tipos de trauma pueden producir coagulopatía en el paciente. Los accidentes de tráfico en los caminos son la causa principal de muerte accidental en los E.U.A. Cada año hay más de 42,000 muertes por dichos accidentes en los E.U. Muchos pacientes con trauma mueren en el sitio del accidente, mientras son atendidos por los paramédicos, antes de que lleguen a la sala de emergencia o rumbo a la misma. Otro ejemplo incluye heridas por disparo de arma. Las heridas por disparo de arma son traumas que pueden ocasionar sangrado masivo. Son pendrantes y destruyen_el .tejido conforme.. lámbala Tpasa_.a través del cuerpo, esté' en el torso o en un miémbro. En los E.U. mueren cerca de 40,000 personas al año por heridas de disparo de bala. Un ejemplo adicional incluye las caídas. Las caídas originan un perfil similar de tipo de trauma que los accidentes de tráfico en los caminos. Caer desde la altura sobre un objeto sólido o el piso puede causar trauma tanto penetrante como contundente decelerativo. En los E.U., las caídas son una causa común de muerte accidental, ascendiendo a cerca de 13,000. Un ejemplo más incluye accidentes de maquinaria. Un número menor de personas mueren en los E.U. por muerte relacionada con accidentes de maquinaria, ya sea golpeados por la maquinaria o embrollados en la maquinaria. Las cifras son pequeñas pero significativas -alrededor de 2,000. Otro ejemplo son las heridas con arma blanca. Las heridas por arma blanca son lesiones penetrantes que también pueden ocasionar sangrado masivo. Los órganos más probablemente dañados en una herida con arma blanca son el hígado, intestino delgado y colon. La cirrosis del hígado es la secuela terminal de una lesión repetida y prolongada del parénquima hepático. El resultado final es la formación de bandas anchas de tejido fibroso que separan nodulos regenerativos que no mantienen la organización normal de los lóbulos del hígado, y de esta manera deterioran la función hepática. Los pacientes tienen tiempos de protrombina prolongados como resultado del agotamiento de los factores de^coagulación depejndienJe^-de -yjtamina .K-— Patogenéticamente, lar " cirrosis hepática" sé clébe considerar " como la ruta común final de la lesión hepática crónica, que se puede originar de cualquier forma de lesión intensa repetida y prolongada de las células del hígado. La cirrosis del hígado puede ser causada por lesión directa del hígado, incluyendo alcoholismo crónico, hepatitis crónica viral (tipos B, C y D) y hepatitis autoinmune, así como por lesión indirecta por medio de daño del conducto biliar, que incluye cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y atresia biliar. Causas menos comunes de cirrosis incluyen lesión directa del hígado por enfermedad hereditaria tal como fibrosis cística, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, hemocromatosis, enfermedad de Wilson, galactosemia y enfermedad de almacenamiento de glicógeno. El transplante está reservado principalmente para pacientes cirróticos en etapa tardía, en donde la intervención es la clave del tratamiento de la enfermedad. Para ser elegible para transplante, un paciente debe ser clasificado como niño B o C y cubrir criterios adicionales para la selección. El año pasado, solo en los E.U., se realizaron 4,954 transplantes. Se ha estimado que cada año hay 6,000 episodios de sangrado asociados con pacientes sometidos a resección. Esto se correlaciona con la posición reservada de este procedimiento aunque parece ligeramente alto en comparación con el número de transplantes. Es difícil obtener datos exactos sobre la incidencia de sangrado variceal. Los hechos clave conocidos son que en el momento de la diagnosis, Jas vanees _ están_ presentes _ en _cerca_ de _60%~ .. de.-_ Jos.— pacientes— descompensados y 30% de los pacientes compensados, y aproximadamente 30% de estos pacientes con várices experimentarán un sangrado, y que cada episodio de sangrado variceal está asociado con un 30% de riesgo de mortalidad. De esta manera, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una variante de polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos en donde es deseable la formación de coágulo. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno en donde es deseable la formación de coágulo, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de lo mismo, una cantidad efectiva de la variante de polipéptido o la composición farmacéutica de la invención. La trombocitopenia es causada por uno de tres mecanismos -reducción de la producción de la médula ósea, aumento del secuestro esplénico o aceleración de la destrucción de plaquetas. La trombocitopenia es un factor de riesgo para la hemorragia, y la transfusión de plaquetas reduce la incidencia de sangrado. El umbral para la transfusión profiláctica de plaquetas es de 10,000/µ?. En pacientes sin fiebre ni infecciones, un umbral de 5000/µ? puede ser suficiente para prevenir la hemorragia espontánea. Para procedimientos invasivos, el nivel objetivo usual es de 50,000 plaquetas/pl. En pacientes que desarrollan anticuerpos contra plaquetas después de tjansfusiones repetidas, el j¾ajigrado_ _puede _ser_^ controlar. " " " " " ' Ejemplos de enfermedades/trastornos en donde es deseable aumentar la formación de coágulo incluyen, sin limitación, hemorragias, que incluyen hemorragias cerebrales y pacientes con sangrado severo incontrolado, por ejemplo con trauma. Ejemplos adicionales incluyen pacientes sometidos a transplantes vitales, pacientes sometidos a resección y pacientes con sangrado variceal. Las variantes de polipéptido de la invención se administra a los pacientes en una dosis terapéuticamente efectiva, normalmente una que sea aproximada a la empleada en la terapia con rFVII tal como NoveSeven®, o a una dosis más baja. Por "dosis terapéuticamente efectiva" se entiende aquí una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados con respecto a la condición para la cual se administra. La dosis exacta dependerá de las circunstancias y será determinable por un experto en la materia usando las técnicas conocidas. Normalmente, la dosis debe ser capaz de prevenir o disminuir la severidad o extensión de la condición o indicación tratada. Será evidente para el experto en la materia que una cantidad efectiva de una variante de polipéptido o composición de la invención, depende, entre otras cosas, de la enfermedad, la dosis, el régimen de administración, si la variante de polipéptido o composición se administra sola o en conjunto con otros agentes terapéuticos, la vida media en el plasma de las composiciones y la salud general del paciente. Preferiblemente, la variante de polipéptido o _composición de la invención se ad ministraren unamos js,. efectiva , Len : particular una dosis que es suficiente para normalizar el trastornó de coagulación. La variante de polipéptido de la invención se administra preferiblemente en una composición que incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo o excipiente que no causa efectos adversos en los pacientes a los que se les administra. Tales vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos (véase por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing 3 Company

[1990]; "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis

[2000]; y "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press

[2000]). La variante de polipéptido de la invención se puede formular en composiciones farmacéuticas por medio de métodos muy conocidos. Se describen formulaciones adecuadas en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin (Mark Publ. Co., 16a ed., 1980). La variante de polipéptido de la invención se puede usar "como tal" o en una forma de sal de la misma. Las sales adecuadas incluyen, sin limitación, sales con metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio, y también por ejemplo las sales de zinc. Estas sales o complejos pueden estar presentes como una estructura cristalina o amorfa. La composición farmacéutica .._de la _ in vencjón _ se _ puede administrar sola o en "conjunto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la misma composición farmacéutica, o se pueden administrar separadamente de la variante de polipéptido de la invención, ya sea concurrentemente o de acuerdo con cualquier otro régimen de tratamiento. Además, la variante de polipéptido o la composición farmacéutica de la invención se pueden usar como un auxiliar para otras terapias. Para los fines de la presente invención, un "paciente" incluye tanto humanos como otros mamíferos. De esta manera, los métodos son aplicables tanto para terapia humana como veterinaria. La composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la invención se puede formular en una variedad de formas, por ejemplo como un líquido, gel, producto liofilizado o un sólido comprimido. La forma preferida dependerá de la indicación particular que se trata y será evidente para el experto en la materia. En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la invención se puede formular en forma liofilizada o en forma soluble estable. La variante de polipéptido se pude liofilizar mediante una variedad de procedimientos conocidos. La variante de polipéptido puede estar en una forma soluble estable mediante la remoción o protección de los sitios de degradación proteolítica que se describen en la presente. La ventaja de obtener una preparación soluble estable está en que es más_ fáci e jnanejar. p_ara,_eLpac¡ente.-y .en-caso-.de emergencia -es-de- -· ~ acción más "rápida, lo que "posiblemente puede llegar a salvar una vida. La forma preferida dependerá de la indicación particular tratada y será evidente para el experto en la materia. La administración de las formulaciones de la presente invención se puede realizar por una variedad de formas que incluyen, sin limitación, por vía oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, ¡ntraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular, o de cualquier otra manera aceptable. Las formulaciones se pueden administrar continuamente por infusión, aunque es aceptable la inyección de bolo usando técnicas muy conocidas tales como bombas o implantes. En algunos casos las formulaciones se pueden aplicar directamente como una solución o aspersión.

Parenterales Un ejemplo preferido de una composición farmacéutica es una solución diseñada para administración parenteral. Aunque en muchos casos las formulaciones farmacéuticas en solución se proveen en forma liquida apropiada para uso inmediato, estas formulaciones parenterales también se pueden proveer en forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición debe ser descongelada antes de usar. La última forma se usa frecuentemente para aumentar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición bajo una variedad más amplia de condiciones de _ almacenamiento, ya que es rec nocido_pojJos^expert preparaciones liofilizadas generalmente' son más estables que " sus contrapartes líquidas. Dichas preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de usar agregando uno o más diluyentes adecuados farmacéuticamente aceptables, tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril. En caso de parenterales, se preparan para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas, mezclando según sea apropiado la vanante de polipéptido que tiene el grado de pureza deseado, con uno o más de los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables empleados típicamente (todos los cuales se denominan "excipientes"), por ejemplo agentes amortiguadores, agentes estabilizadores, conservadores, agentes de tonicidad, agentes tensioactivos o detergentes no iónicos, antioxidantes u otros varios aditivos. Los agentes amortiguadores ayudan a mantener el pH en una escala que se aproxima a las condiciones fisiológicas. El agente amortiguador está presente normalmente en una concentración que varía de 2 mM a 50 mM, aproximadamente. Los agentes amortiguadores adecuados para usar en la presente invención incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como amortiguadores de citrato (por ejemplo una mezcla de citrato de monosodio-citrato de disodio, una mezcla de ácido cítrico-citrato de trisodio, una mezcla de ácido cítrico-citrato de monosodio, etc.), amortiguadores de succinato (por ejemplo una mezcla de ácido succínico-succinato de monosodio^una mezcla de Jicido succínic rhidróxido. de sodio, - una -mezcla -d ácido succínico-succinato de disodió; etc.), amortiguadores de tartrato (por ejemplo una mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, una mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), amortiguadores de fumarato (por ejemplo una mezcla de ácido fumárico-fumarato de monosodio, una mezcla de ácido fumárico-fumarato de disodio, una mezcla de fumarato de monosodio-fumarato de disodio, etc.), amortiguadores de gluconato (por ejemplo una mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, una mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, una mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), amortiguadores de oxalato (por ejemplo una mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, una mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, una mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), amortiguadores de lactato (por ejemplo una mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, una mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, una mezcla de ácido láctico-lactato de potasio), y amortiguadores de acetato (por ejemplo una mezcla de ácido acético-acetato de sodio, una mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Son posibilidades adicionales los amortiguadores de fosfato, los amortiguadores de histidina y las sales de trimetilamina tales como Tris. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar de un agente de relleno a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a las paredes del recipiente. Los estabilizadores típicos pueden ser ajcqholes de azúcar pol^ aminoácidos tales como arginina," lisina"- glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles como ¡nositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácido; agentes reductores que contienen azufre tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina de humano, seroalbúmina de bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, monosacáridos tales como xilosa, mañosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa, y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizadores están presentes típicamente en la escala de 0.1 a 10,000 partes en peso en base al peso de proteína activa. Los conservadores se agregan para retardar el crecimiento microbiano y se agregan típicamente en cantidades de aproximadamente 0.2%-1 % (p/v). Los conservadores adecuados para usar con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, halogenuros de benzalconio (por ejemplo cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio), cloruro de hexametonio, alquilparabenos como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanoL _ _ ~ - - Los agentes- de tonicidad - sé agregan para" asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas, e incluyen alcoholes de azúcar polihídrico, preferiblemente alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihídricos pueden estar presentes en una cantidad entre 0.1 % y 25% en peso, típicamente 1 % a 5%, tomando en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes. Pueden estar presentes agentes tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes de mojado") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, y también para proteger el polipéptido terapéutico contra la agregación inducida por agitación, lo que también permite exponer la formulación a esfuerzo cortante de superficie sin ocasionar desnaturalización del polipéptido. Los agentes tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles Pluronic®, monoéteres de polioxietilensorbitán (Tween®-20, Tween®-80, etc.). Varios excipientes adicionales incluyen agentes de volumen o relleno (por ejemplo almidón), agentes quelantes (por ejemplo EDTA), antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes. El ingrediente activo también se puede atrapar en microcápsulas, preparadas por ejemplo por medio de técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo __ ]as__m|crocápsula| _ _de hidroximetilcelulosa, gelatina o poli(metacrilato de" metilo), " en sistemas coloidales de suministro de fármaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences", arriba citado. Las formulaciones parenterales para su administración ¡n vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por ejemplo por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Preparaciones de liberación sostenida Ejemplos de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la variante de polipéptido, las matrices teniendo una forma adecuada tal como una película o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos, copolímeros de ácido L-glutámico y L- glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico tales como la tecnología ProLease®, o Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólico y ácido láctico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante largos períodos, por ejemplo hasta 100 días o más, algunos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más j;ojrtqs. Cuando Jos. - polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo" durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregarse como resultado de exposición a humedad a 37 °C, ocasionando pérdida de la actividad biológica y posibles cambios de inmunogenicidad. Se pueden contemplar estrategias racionales para estabilización, dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace S-S intermolecular por medio de intercambio de tio-disulfuro, se puede estabilizar modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando en soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas. La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.

Area de superficie accesible (ASA) El programa de computadora Acces (B. Lee y F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971 )) versión 2 (© 1983 Yale University), se usó para calcular el área de superficie accesible (ASA) de los átomos individuales de la estructura. Este método usa típicamente un tamaño de sonda de 1.4 Á y define el área de superficie accesible (ASA) como el área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo se deben remover de la serie de coordenadas todas las moléculas desagua, Jodos átomos,de.hidrógeno-y -otros -átomos no relacionados directamente "con lá proteína.

ASA fraccional de cadena lateral El ASA fraccional de los átomos de cadena lateral se calcula por división de la suma del ASA de los átomos de la cadena lateral entre un valor que representa el ASA de los átomos de cadena lateral de ese tipo de residuo en un tripéptido extendido Ala-x-Ala (véase Hubbard, Campbell y Thornton (1991 ) J. Mol. Biol.: 220,507-530). Para este ejemplo, el átomo CA se considera como una parte de la cadena lateral de residuos de glicina, pero no para el resto de los residuos. El siguiente cuadro se usa como estándar de 00% de ASA para la cadena lateral: Se define que los residuos no detectados en la estructura tienen 100% de exposición pues se considera que residen en regiones flexibles. Los ácidos gamma-carboxi-glutámicos en las posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 se definen todos como 100% expuestos.

Determinación de distancias entre átomos La distancia entre los átomos se determina usando software de gráficas moleculares, por ejemplo Insight II® v. 98.0, MSI INC.

Región del sitio activo La región del sitio activo se define como cualquier residuo que tiene por lo menos un átomo en el espacio de 10 A de cualquier átomo en la tríada catalítica (residuos H193, D242, S344).

Determinación del sitio de unión del factor de tejido Se define que el sitio de unión del TF comprende todos los residuos que cambian su área de superficie accesible por unión al TF. Esto se determina con al menos dos cálculos de ASA; uno sobre los ligandos aislados en el complejo ligando/receptor, y otro sobre el complejo completo ligando/receptor. __ _. . _ „ „ „_ -_ -„— =_— ~— -- Medición de la reducción de sensibilidad a la degradación proteolítica La degradación proteolítica se puede medir usando la prueba descrita en US 5,580,560, ejemplo 5, en donde la proteólisis es una autoproteólisis. Además, la reducción de proteólisis se puede probar en un modelo ¡n vivo usando muestras radiomarcadas y comparando la proteólisis del rhFVIIa y la variante de polipéptido de la invención, extrayendo muestras de sangre y sometiendo estas a SDS-PAGE y autorradiog rafia. Sin considerar la prueba usada para determinar la degradación proteolítica, la "reducción de la degradación proteolítica" indica una reducción de corte, medible en comparación con la obtenida por rhFVIIa medida por exploración en gel de geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassle, HPLC, o determinada según la actividad catalítica conservada en comparación con el tipo silvestre, usando la prueba de actividad independiente del factor de tejido que se describe abajo.

Determinación del peso molecular de variantes de polipéptido El peso molecular de las variantes de polipéptido se determina por SDS-PAGE, filtración en gel, Western blots, espectrometría de masa de desorción de láser asistida por matriz o centrifugación de equilibrio, por ejemplo SDS-PAGE de acue do_cqn J^mmlj,^ 680-85: " " - - . - - Prueba de activación del factor X independiente del TF Esta prueba se ha descrito en detalle en la página 39826 en Nelsestuen y otros, J Biol Chem, 2001 ; 276: 39825-39831. Brevemente, la molécula por probar (ya sea hFVIIa, rHFVIIa o la variante de polipéptido de la invención en su forma activada), se mezcla con una fuente de fosfolípido (fosfatidilcolina y fosfatidilserina en una relación de 8:2, o fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanol en una relación de 4:2:4) y factor X en amortiguador de Tris conteniendo BSA. Después de un tiempo de incubación específico, la reacción se detiene agregando un exceso de EDTA. Después se mide la concentración del factor Xa del cambio de absorbancia a 405 nm después de la adición de un substrato cromogénico (S- 2222, Chromogenix). Después de corrección por el valor basal, se determina la actividad del rhFVIIa (awt) independiente del factor de tejido como el cambio de absorbancia después de 10 minutos, y también se determina la actividad de la variante de polipéptido de la invención (avar¡ante) independiente del factor de tejido, como el cambio de absorbancia después de 10 minutos. La relación entre la actividad de la variante de polipéptido en su forma activada y la actividad de rhFVIIa, se define como avariante awt- Prueba de coagulación tiempos de coagulación se registran en un coagulómetro Thrombotrack IV (MEDINOR). Plasma humano agotado en FVII (American Diagnostica) se reconstituye y equilibra a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Después se transfieren 50 µ? de plasma a los recipientes del coagulómetro. Se diluyen hFVIIa, rhFVIIa o las variantes en amortiguador de glioxalina (5.7 mM de barbiturato, 4.3 mM de citrato de sodio, 117 mM de NaCI, BSA 1 mg/mL, pH 7. 35). Las muestras se agregan al recipiente en cantidades de 50 µ? y se incuban a 37°C durante 2 minutos.

La tromboplastina (MEDINOR) se reconstituye con agua y se le agrega CaCb. La reacción se inicia agregando 0.1 mi de tromboplastina conteniendo CaCI2 4.5 mM. Los datos se analizan usando software PRISM.

Prueba de coagulación independiente de TF Esta prueba se realiza como se describe arriba en la "Prueba de coagulación", pero sin la adición de tromboplastina.

Prueba amidolítica La capacidad de las variantes para cortar substratos de péptido pequeños se puede medir usando el substrato cromogénico S-2288 (D-lle-Pro-Arg-p-nitroanilida). La actividad amidolítica se puede medir tanto en presencia como en ausencia de antitrombina III (ATIII). Se diluyen hFVIIa, rhFVII_a_o__ La _v a 90 nM. en_ amortiguador de prueba (50 mM Na-Hepes" pH" 7.5, 150 mM ÑaCI, 5 mM CaCI2, 0.1 % BSA, 1 U/mL heparina). Además se diluye TF (sTF) a 450 nM en amortiguador de prueba. Se diluye ATIII a 900 nM en amortiguador de prueba. Se mezclan 120 pL de amortiguador de prueba con 20 pL de la muestra de FVIIa, 20 pL de sTF y 20 pL de ATIII o amortiguador de prueba. Las concentraciones finales de FVIIa, sTF y ATIII son 10, 50 y 100 nM, respectivamente. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente con agitación suave, seguidos por 10 min de incubación a 37°C, se inicia la reacción de THE agregando el substrato S-2288 a 1 mM, y se determina la absorbancia a 405 nm en varios puntos de tiempo.

Prueba de trombogramo El efecto de hFVIIa, rhFVIIa o la variante sobre la generación de trombina en plasma humano se prueba en una versión modificada de la prueba descrita en la página 589 en Hemker y otros, Haemost 2000; 83:589- 91. Brevemente, la molécula por probar (hFVIIa, rhFVIIa o la variante) se mezcla con plasma normal enriquecido de plaquetas (PRP), plasma normal deficiente de plaquetas (PPP) o PPP agotado en FVII, con o sin la adición de factor de tejido humano recombinante (rTF), rTF repuesto de lípidos u otra fuente de TF (tal como tromboplastina). Se puede agregar una fuente de fosfolípido (fosfatidilcolina y fosfatidilserina en una relación de 8:2 o fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanol en una relación de 4:2:4). La reacción se inicia ^gregandojuji substrae - trombina y cloruro de calcio: La fluorescencia se mide continuamente y "s e calcula la actividad amidolítica de trombina calculando la pendiente de la curva de fluorescencia (el aumento de fluorescencia con el tiempo). De esta manera se obtiene el tiempo de actividad amidolítica máxima de trombina (Tmax) y se puede calcular el trabajo de trombina total (área bajo la curva (ABC)). Se usa el siguiente procedimiento: Se obtiene PRP centrifugando sangre recién extraída a 250g, 15 °C durante 10 minutos. La coagulación de la sangre se inhibe usando citrato (tris-citrato de sodio 13 mM), inhibidor de tripsina de maíz (50-100 g/ml de sangre) o una combinación de citrato e inhibidor de tripsina de maíz. El recuento de plaquetas se ajusta a 3 x 108 / ml_ usando amortiguador o plasma autólogo deficiente en plaquetas (PPP). El PPP se obtiene por centrifugación doble de PRP a 1000g, 15 °C durante 0 min. El agotamiento de FVII se hace incubando PPP con un anticuerpo monoclonal específico de FVII acoplado en una fase sólida. En una placa de microtítulo de 96 cavidades se agregan por cavidad 80 µ?_ de PRP y 20 pl_ de amortiguador que contiene rhFVII o variante por probar, en concentraciones finales entre 0.1 y 100 nM. Se agrega rTF en 5 µ?_ de amortiguador de prueba a una concentración final de 1 pM. El amortiguador de prueba consiste de Hepes 20 mM, NaCI 150 mM y BSA 60 mg/ml en agua destilada. La reacción se inicia agregando 20 µ?_ de la solución de substrato conteniendo cloruro de calcio 0.1 M. La placa de prueba y los reactivos se calientan previamente a 37 °C y la reacción tienejugar a - esta temperatura. El fluorímetro usado es un fluorímetro BMG con un filtro de excitación a 390 nm y un filtro de emisión a 460 nm. La fluorescencia se mide en cada cavidad de placas de fondo transparente de 96 cavidades en intervalos de 20-40 segundos durante 30-180 minutos. Los datos se analizan usando el software PRISM.

Prueba ELISA Las concentraciones de FVII/FVIIa (o variante) se determinan por ELISA. Las cavidades de una placa de microtítulo se recubren con un anticuerpo dirigido contra el dominio de proteasa usando una solución de 2 pg/mL en PBS (100 pL por cavidad). Después de recubrir 2 horas a temperatura ambiente, las cavidades se lavan 4 veces con amortiguador THT (100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7.2, 0.05% Tween-20). Subsiguientemente, para bloquear se agregan 200 pL de caseína al 1 % (diluida de una sol. de abastecimiento al 2.5% usando 100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7.2) por cavidad. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las cavidades se vacían y se les agrega 100 pL de muestra (diluida opcionalmente en amortiguador de dilución (THT + caseína al 0.1 %)). Después de otra incubación por 1 h a temperatura ambiente, las cavidades se lavan 4 veces con amortiguador THT y se les agrega 100 pL de un anticuerpo marcado _con biotinajdirigido ^contra_el dominio_simi|aj a_ EGF (1__pg/mL). ¦" Después de otra incubación de 1 h a temperatura ambiente, seguida por 4 lavados más con amortiguador THT, se les agrega 100 pL de estreptavidina - peroxidasa de rábano (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, diluida 1/10000). Después de otra incubación de 1 h, seguida por 4 lavados más con amortiguador THT, se les agrega 100 pL de TMB (S.S'.S.S'-tetrametilbencidina, Kem-en-Tech A/S, Dinamarca). Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, se les agrega 100 pL de H2S04 1M y se determina la DO450nm- Se prepara una curva patrón usando rhFVIIa (NovoSeven®). Alternativamente, FVII/FVIIa o las variantes se pueden cuantificar por medio del dominio Gla en lugar del dominio de proteasa. En este protocolo de ELISA, se recubren las cavidades durante la noche con un anticuerpo dirigido contra el dominio similar a EGF, y para la detección se usa un anticuerpo monoclonal anti-dominio Gla marcado con biotina dependiente de calcio (2 pg/ml, 100 µ? por cavidad). En este protocolo se agrega CaCI2 5 mM a los amortiguadores de THT y de dilución.

Prueba en sangre total La prueba de coagulación en sangre total se realiza como la describen Elg y otros, Thrombosis Res. 2001 , 101 (3): 159-170.

Prueba de coagulación reconstituida - - La prueba de coagulación reconstituida- se realiza como la describen Van't Veer y otros, Blood 2000, 95(4), 1330- 335.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Para este ejemplo se usa la estructura de rayos X del hFVIIa en complejo con el factor de tejido soluble de Banner y otros, J Mol Biol, 1996; 285: 2089. Es de notar que la numeración de los residuos en la referencia no sigue la secuencia. En este documento, los inventores han usado la numeración secuencial de acuerdo con SEQ ID NO:2. Aquí, todos los ácidos gamma-carboxi-glutámicos en las posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 se denominan GLU (abreviación de tres letras) o E (abreviación de una letra). Los residuos 143-152 no están presentes en la estructura.

Exposición en superficie La realización de Jos cájculos de ASA fraccionaL sobre Jos. - fragmentos de FVII solos, combinada con la" definición de la capacidad de acceso de residuos no estándares o faltantes descrita en los métodos, dieron como resultado los siguientes residuos que tienen más de 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1 , N2, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21 , S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31 , K32, D33, A34, E35, R36, K38, L39, W41 , 142, S43, S45, G47, D48, Q49, A51 , S52, S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71 , L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, 190, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109, S1 11 , Rl 13, El 16, G117, S1 19, L120, L121 , A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131 , E132, 1140, L141 , E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151 , R152, G155, K157, V158, P160, K161 , E163, L171 , N173, G174, A175, N184, T185, 1186, H193, K197, K199, N200, R202, N203, I205, S214, E215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251 , V253, T255, D256, E265, R266, T267, E270, R271 , F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291 , A292, T293, L295, E296, N301 , 306, T307, Q308, D309, L311 , Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321 , N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341 , G342, H351 , R353, G354, Q366, G367, T370, V371 , G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401 , R402, P404 y P406 (A1-S45 están localizadas en el dominio Gla, las posiciones restantes están localizadas fuera del dominio Gla). _ Los siguientes residuos tuvieron más- de 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1 , A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21 , S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, 142, S43, G47, D48, A51 , S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71 , L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107, T108, K109, S1 II, E1 16, S119, L121 , A122, D123, G124, V131 , E132, L141 , E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151 , R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249, Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291 , A292, T293, L295, N301 , M306, Q308, D309, L311 , Q312, Q313, R315, K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341 , G354, G367, V371 , E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 y P406 (A1-S43 están localizadas en el dominio Gla, las posiciones restantes están localizadas fuera del dominio Gla).

Sitio de unión del factor de tejido Realizando los cálculos ASA, los siguientes residuos en el FVII humano cambian su ASA en el complejo. Se definió que estos residuos constituyen el sitio de unión del receptor: L13, K18, F31 , E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, 169, C70, F71 , C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, 190, V92, N93, E94, R271 , A274, F275, V276, R277, F278, Q312, Q313, E325 y R379. - - -· - - - Región del sitio activo La región del sitio activo se define como cualquier residuo que tiene por lo menos un átomo dentro de una distancia de 10 Á desde cualquier átomo en la tríada catalítica (residuos H193, D242, S344): 1153, Q167, V168, L169, L170, L171 , Q176, L177, C178, G179, G180, T181 , V188, V189, S190, A191 , A192, H193, C194, F195, D196, K197, 1198, W201 , V228, I229, I230, P231 , S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241 , D242, 1243, A244, L245, L246, V281 , S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341 , G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, 1361 , V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y F405.

El reborde de la abertura de unión del sitio activo El reborde de la región de abertura de unión del sitio activo se definió por inspección visual de la estructura del FVIIa I FAK.pdb como: N 73, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291 , A292, P321 y T370.

EJEMPLO 2 Diseño de un cassette de expresión para la expresión de rhFVII en células de mamífero - Se sintetizó la secuencia de ADN mostrada" en SECTID NO:1 , que abarca la forma corta del ADNc de longitud completa que codifica hFVII con su péptido señal corto nativo (Hagen y otros, 1986. PNAS 83: 2412), para facilitar la expresión superior en células de mamífero. Primero se modificó el contexto del codón de iniciación ATG de acuerdo con la secuencia de consenso de Kozak (Kozak, M. J Mol Biol, 20 de agosto de 1987; 196 (4): 947-50), de tal manera que hay una concordancia perfecta con la secuencia de consenso hacia el extremo 5' del codón de iniciación ATG. En segundo lugar, se modificó el marco de lectura abierto del ADNc nativo haciendo un sesgo en el uso de codón hacia los codones usados frecuentemente en genes humanos altamente expresados. Además, se insertaron dos codones de detención de traducción al final del marco de lectura abierto para facilitar una detención eficiente de la traducción. El gen hFVII completamente sintético y de expresión optimizada se ensambló desde oligonucleótidos de ADN de 50 unidades y finalmente se amplificó usando iniciadores de extremo insertando sitios fíamHI y HindW l en los extremos 5' y 3', respectivamente, usando técnicas estándares de PCR, lo que dio como resultado la siguiente secuencia: ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgca gggctgcctggctgccgtcttcgtcaccca ggaggaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctggaagag ctccgccctggctccctggaacgcgaatgc aaagaggaacag^agcjttgaggaagc^gggagattttcaaagacgctgagcgg_ accaaactgttttggattagctatagcgatggc" ~ ~ " gatcagtgcgcctccagcccttgccagaacgggggctcctgcaaagaccagctgcaga g ctatatctg cttctgcctg cctg cctttg agg ggcgcaattgcgaaacccataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacggggg ctgcgagcagtactgcagcgatcacacggg cacgaagcggagctgccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtcct gcacgcccacggtggaatacccttgcggg aagattcccattctagaaaagcggaacgctagcaaaccccagggccggatcgtcggc gggaaggtctgccctaagggggagtgcccct ggcaggtcctgctcctggtcaacggggcccagctgtgcggcgggaccctcatcaatacc atttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcg ataagattaagaattggcggaacctcatcgctgtgctcggcgaacacgatctgtccgagc atgacggggacgaacagtcccgccgggtg gctcaggtcatcattccctccacctatgtgcctggcacgaccaatcacgatatcgctctgct ccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccga tcacgtcgtgcctctgtgcctgcctgagcggacctttagcgaacgcacgctggctttcgtcc gctttagcctcgtgtccggctggggccag ctgctcgaccggggcgctaccgctctcgagctgatggtgctcaacgtcccccggctgatg acccaggactgcctgcagcagtcccgcaa agtgggggactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgctggctatagcgatggctcc aaggatagctgcaagggggactccggcg ggccccatgccacgcactatcgcggga^ctggtacctc^ccgggajcgtcag ccagggctgcgccacggtggggcactttg · gcgtctacacgcgcgtcagccagtacattgagtggctgcagaagctcatgcggagcga accccggcccggggtgctcctgcgggccc ctttcccttgataaaagctt. Se preparó un vector para la clonación del producto generado por PCR que abarca el cassette de expresión para hFVII, clonando el intrón de pCINeo (Promega). El intrón sintético de pCI-Neo se amplificó usando las condiciones estándares de PCR y los iniciadores: CBProFprl 74: 5'- AG CTGG CTAG C C ACTG GGCAG G TAAGTATCA-3' y CBProFprl 75: 5'-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGT AATTGAACT- -3' Dando como resultado un fragmento de PCR de 332 pb; El fragmento se cortó con Nhe\ y SamHI antes de clonar en pCDNA3.1/HygR (obtenido de Invitrogen), dando como resultado PF#34. El cassette de expresión para hFVII se clonó entre los sitios BamHI y Hind\\\ de PF#34, dando como resultado el plásmido PF#226.

EJEMPLO 3 Expresión de las variantes de polipéptido en células CHO K1 La línea de células CHO K1 (ATCC # CCL-61 ) se siembra a 50% de confluencia en matraces T-25 usando MEMa, 10% FCS (Gibco/BRL Cat # - 0091 ), P/S y 5 pg/mL de filoquinona, y se deja desarrollar hasta confluencia. La monocapa de células de confluente se transfecta con 5 pg del plásmido relevante descrito arriba, usando el agente de transfeccion Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se toma una muestra 24 h después de la transfeccion y se cuantifica usando por ejemplo una ELISA que reconoce el dominio EGF1 de hFVII. En este punto de tiempo se puede aplicar a las células selección relevante (por ejemplo higromicina B), con la finalidad de generar un reservorio de transfectantes estables. Cuando se usan células CHO K1 y el gen de resistencia a higromicina B como marcador seleccionare sobre el plásmido, usualmente esto se logra en el transcurso de una semana. 5 EJEMPLO 4 Generación de células CHO K1 que expresan establemente variantes de polipéptido Un frasco de reservorio de células CHO-K1 transfectadas se 10 descongela y las células se siembran en un matraz de tejido de 175 cm2 conteniendo 25 ml_ de MEMa, FCS 10%, filoquinona (5 pg/mL), penicilina 100 U/l, estreptomicina 100 pg/l, y se desarrollan 24 horas. Las células se cosechan, se diluyen y se depositan en placas de microtitulo de 96 cavidades a una densidad celular de ½-1 célula/cavidad. Después de una semana de 5 desarrollo, están presentes en las cavidades colonias _de_20-1 \00 células, yjas - . - cavidades que -contienen solo una colonia se marcan. - Después de dos semanas más, el medio en todas las cavidades que contienen solo una colonia se sustituye con 200 pL de medio nuevo. Después de 24 h se retira una muestra de medio y se analiza, por ejemplo, por ELISA. Se seleccionan 0 clonas de alta producción y se usan para producir FVII o variante a una escala mayor.

EJEMPLO 5 Purificación de variantes de polipéptido y activación subsiguiente El FVII y las variantes del FVII se purifican de la siguiente manera: El procedimiento se realiza a 4 °C. El medio de cultivo cosechado de la producción a escala mayor se somete a ultrafiltración usando un sistema Millipore TFF con membranas Pellicon de corte de 30 KDa. Después de concentración del medio se le agrega citrato a 5 mM y el pH se ajusta a 8.6. Si es necesario, la conductividad se reduce a menos de 10 ms/cm. Subsiguientemente, la muestra se aplica en una columna Q-sepharose FF, equilibrada con 50 mM de NaCI, 10 mM de Tris, pH 8.6. Después de lavar la columna con 100 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8.6, seguido por 150 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8.6, el FVII se eluye usando 10 mM de Tris, 25 mM de NaCI, 35 mM de CaCI2, pH 8.6. Para el segundo paso ^romatográfico_se prepara una cpjumna ¦ de afinidad,- clonando un anticuerpo monoclonal anti-dominio de da dependiente de calcio con Sepharose FF activada con CNBr. Se acoplan aproximadamente 5.5 mg de anticuerpo por ml_ de resina. La columna se equilibra con 10 mM de Tris, 100 mM de NaCI, 35 mM de CaCI2, pH 7.5. Se agrega a la muestra NaCI a una concentración de 100 mM de NaCI y el pH se ajusta a 7.4-7.6. Después de la aplicación O/N de la muestra, la columna se lava con 100 mM de NaCI, 35 mM de CaCI2, 10 mM de Tris pH 7.5, y la proteína FVII se eluye con 100 mM de NaCI, 50 mM de citrato, 75 mM de Tris pH 7.5. Para la tercera cromatografía, la conductividad de la muestra se reduce a menos de 10 ms/cm, si es necesario, y el pH se ajusta a 8.6. Después, la muestra se aplica en una columna de Q-sepharose (equilibrada con 50 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8.6) a una densidad de cerca de 3-5 mg de proteína por mi de gel para obtener activación eficiente. Después de la aplicación, la columna se lava con 50 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8.6 durante cerca de 4 h, con un flujo de 3-4 volúmenes de columna (ve) por hora. La proteína FVII se eluye usando un gradiente de 0-100% de 500 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8.6 sobre 40 ve. Se reúnen las fracciones que contienen FVII. Para el paso cromatográfico final, la conductividad se reduce a menos de 10 ms/cm. Subsiguientemente, la muestra se aplica en una columna de Q-Sepharose_(equilibrada conj]40_mM de_ NaCI, lO^m de glicilglicina-pH 8:6) a una concentración de 3-5 mg de proteína por mi de ' gel. La columna se lava después con 140 mM de NaCI, 10 mM de glícilglicina pH 8.6, y el FVII se eluye con 140 mM de NaCI, 15 mM de CaCI2, 10 mM de glícilglicina pH 8.6. El producto eluido se diluye con 10 mM de CaCI2 y el pH se ajusta a 6.8-7.2. Finalmente se le agrega Tween-80 a 0.01% y el pH se ajusta a 5.5 para almacenamiento a -80°C.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Maxygen ApS; Maxygen Holdings <120> Variantes de polipéptido del factor VII o Vlla <130> 0259wo210 <140> <141> <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1338 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (115)..(1335) <400> 1 atggtcagcc aggccctccg cctcctgtgc ctgctcctgg ggctgcaggg ctgcctggct 60 gccgtcttcg tcacccagga ggaagcccat ggcgtcctgc atcgccggcg ccgg gc 117_ - - - ¦ - - ~ ¦ - " 1 ' -aat gcc ttt ctg gaa gag ctc cgc cct ggc tcc ctg gaa cgc gaa tgc 165 Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys 5 10 15 aaa gag gaa cag tgc age ttt gag gaa gcc cgg gag att ttc aaa gac 213 Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp 20 25 30 gct gag cgg acc aaa ctg ttt tgg att age tat age gat ggc gat cag 261 Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln 35 40 45 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) tgc gcc tcc age ect tgc cag aac ggg ggc tec tgc aaa gac cag ctg 309 Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu 50 55 60 65 cag age tat ate tgc ttc tgc ctg ect gcc ttt gag ggg cgc aat tgc 357 Gln Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys 70 75 80 gaa acc cat aag gat gac cag ctg att tgc gtc aac gaa aac ggg ggc 405 Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly 85 90 95 tgc gag cag tac tgc age gat cae acg ggc acg aag cgg age tgc cgc 453 Cys Glu Gta Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg 100 105 110 tgc cae gaa ggc tat age etc ctg gct gac ggg gtg tcc tgc acg ecc 501 Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro 115 120 125 acg gtg gaa tac ect tgc ggg aag att ecc att cta gaa aag cgg aac 549 Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn 130 135 140 145 gct age aaa ecc cag ggc cgg ate gtc ggc ggg aag gtc tgc ect aag 597 Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys _ __ _ __ _ _ _ i50^--^-.- -- - --155— - - -- ~" -^" T'-160"- ""-J=~ ggg gag tgc ecc tgg cag gtc ctg etc ctg gtc aac ggg gcc cag ctg 645 Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu 165 170 175 tgc ggc ggg acc etc ate aat acc att tgg gtc gtg tcc gcc gct cae 693 Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His 180 185 190 tgc ttc gat aag att aag aat tgg cgg aac etc ate gct gtg etc ggc 741 Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly 195 200 205 gaa cae gat ctg tcc gag cat gac ggg gac gaa cag tcc cgc cgg gtg 789 Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val 210 215 220 225 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) gct cag gtc ate att ecc tec acc tat gtg ect ggc acg acc aat cae 837 Ala Gln Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His 230 235 240 gat ate gct ctg etc cgc etc cae cag ecc gtc gtg etc acc gat cae 885 Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His 245 250 255 gtc gtg ect ctg tgc ctg ect gag cgg acc ttt age gaa cgc acg ctg 933 Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu 260 265 270 gct ttc gtc cgc ttt age etc gtg tec ggc tgg ggc cag ctg etc gac 981 Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp 275 280 285 cgg ggc gct acc gct etc gag ctg atg gtg etc aac gtc ecc cgg ctg 1029 Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu 290 295 300 305 atg acc cag gac tgc ctg cag cag tec cgc aaa gtg ggg gac tec ecc 1077 Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro 310 315 320 aat ate acg gag tat atg ttt tgc gct ggc tat age gat ggc tec aag 1 125 Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys 325 330 335 gat age tgc ..aag ggg gac tec ggc ggg ecc cat gee acg cae tat cgc 1173 ~ Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg 340 345 350 ggg acc tgg tac etc acc ggg ate gtc age tgg ggc cag ggc tgc gee 1221 Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala 355 360 365 acg gtg ggg cae ttt ggc gtc tac acg cgc gtc age cag tac att gag 1269 Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr lie Glu 370 375 380 385 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) tgg ctg cag aag ctc atg cgg age gaa ecc cgg ecc ggg gtg etc ctg 1317 Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu 390 395 400 cgg gee ect ttc ect tga taa 1338 Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 2 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 -Gly Cys Glu^Gln-T r Cys Ser- Asp'His Thr Gly-Thr Lys~Arg Ser Cys^ 100 . . .. ... 105 - 110- · Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) Val Ala Gln Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr lie 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 3 -<2·?> 31^ =.-----=^-- ~~— ~ — <212> ADN - - <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Iniciador CBProFprl74 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Iniciador CBProFprl74 <400> 3 agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a 31 <210> 4 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Iniciador CBProFprl75 <400> 4 tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t 31

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. - Una variante de polipéptido del factor VII (FVII) o factor Vlla (FVIIa) que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3-15 modificaciones de aminoácidos, con respecto al factor VII humano (hFVII) o factor Vlla humano (hFVIIa) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, en donde dicha secuencia de aminoácidos de la variante comprende una sustitución de aminoácido en las posiciones 10 y 32, y en donde una porción de azúcar está unida covalentemente con un sitio de N-glicosilación introducido in vivo localizado fuera del dominio Gla.

2. - La variante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha sustitución en la posición 10 es P10Q.

3. - La variante de conformé caracterizada además porque dicha sustitución en la posición 32 es K32E.

4. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha sustitución en la posición 10 es P10Q y dicha sustitución en la posición 32 es K32E.

5. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha variante comprende por lo menos una modificación de aminoácido adicional en el dominio Gla.

6. - La variante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución de aminoácido en la posición 33.

7. - La variante de conformidad con la reivindicación 6, 5 caracterizada además porque un residuo de aminoácido hidrofóbico es introducido por sustitución en la posición 33.

8. - La variante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha sustitución es D33F.

9. - La variante de conformidad con la reivindicación 8, 10 caracterizada además porque dicha variante comprende las sustituciones P10Q+K32E+D33F.

10. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, caracterizada además porque dicha modificación adicional en el dominio Gla comprende la inserción de por lo menos un 15 residuo dejaminoác[dq_en¾ 4. __ _____ -,;-^---. - . — - - - 11.- La variante dé conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha modificación adicional en el dominio Gla comprende la inserción de un residuo de aminoácido entre las posiciones 3 y 4. 20 12.- La variante de conformidad con la reivindicación 10 u 11 , caracterizada además porque un residuo de aminoácido hidrofóbico es insertado entre las posiciones 3 y 4. 13.- La variante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha inserción es A3AY. 14.- La variante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende las modificaciones A3AY+P10Q+K32E. 5 15.- La variante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende las modificaciones A3AY+P 0Q+K32E+D33F. 16. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-15, caracterizada además porque dicha modificación 10 adicional en el dominio Gla comprende una sustitución de aminoácido en la posición 34. 17. - La variante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque un residuo de aminoácido cargado negativamente es introducido por sustitución en la posición 34. 15 18.-_La jyariante ^de^confprmldad^con -la- reivindicación—I 7,^ - caracterizada además porque dicha sustitución es Á34E. 19.- La variante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E. 20 20.- La variante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque comprende las sustituciones P10Q+K32E+D33F+A34E. 21.- La variante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque comprende las modificaciones A3AY+P10Q+K32E+A34E. 22. - La variante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque comprende las modificaciones A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E. 23. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-22, caracterizada además porque dicha modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 8, 1 1 y 28. 24.- La variante de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicha sustitución en la posición 28 es R28F o R28E. 25.- La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque no se hacen _ jrodjficacic^es L en Jos residuos_6, 7, 14, 6,? ,20, 25, 26, 29 y;35.- ¦ - - ·' - 26.- La * variante" ~ dé conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho sitio de N- glicosilación in vivo es introducido por sustitución. 27. - La variante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicho sitio de N-glicosilación in vivo es introducido en una posición que comprende un residuo de aminoácido que tiene por lo menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie. 28. - La variante de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicho sitio de N-glicosilación in vivo es introducido en una posición que comprende un residuo de aminoácido que tiene por lo menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie. 29. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, caracterizada además porque dicho sitio de N- glicosilación in vivo es introducido por una sustitución seleccionada del grupo que consiste de A51 N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de las mismas. 30. - La variante de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho sitio de N-glicosilación in vivo es introducido por una sustitución seleccionada del grupo que consiste de A51 N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, _ T267N+S|69T, _ S314N+K316T, _..R315N+V317Tr -K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de las mismas. 31. - La variante de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicho sitio de N-glicosilación in vivo es introducido por una sustitución seleccionada del grupo que consiste de T106N, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T y combinaciones de las mismas. 32. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-31 , caracterizada además porque se le ha introducido por sustitución un sitio de N-glicosilación in vivo. 33.- La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-31 , caracterizada además porque se le han introducido por sustitución dos o más sitios de N-glicosilación in vivo. 34.- La variante de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque se le han introducido por sustitución dos sitios de N-glicosilación in vivo. 35.- La variante de conformidad con la reivindicación 33 o 34, caracterizada además porque dichos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por medio de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de A51 N+G58N, A51 N+T106N, A51 N+K109N, A51 N+G124N, A51 N+K143N+N145T, A51 N+A175T, A51 N+I205T, A51 N+V253N, A51 N+T267N+S269T, A51 N+S314N+K316T, A51 N+R315N+V317T, A51 N+K316N+G318T, A51 N+G318N, A51 N+D334N, G58N+T106N, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G3 8T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N145T, T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, K143N+N145T+I205T, K143N+ 145T+V253N, K143N+N145T+T267N+S269T, K143N+N145T+S314N+K316T, K143N+N145T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K3 6T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N, V253N+D334N, _ T267N+S269T+S314N†K316"n,- ·.- - -· - T267N+S269T+R315N+V3Í7T," T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N y G318N+D334N. 36.- La variante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque dichos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por medio de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T y V253N+T267N+S269T. 37. - La vanante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dichos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por medio de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de T106N+I205T, T106N+V253N y I205T+T267N+S269T. 38. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-37, caracterizada además porque se le han introducido por sustitución tres o más sitios de N-glicosilación in vivo. 39 - La variante de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque se le han introducido por sustitución tres sitios de N-glicosilación in vivo. 40. - La variante de conformidad con la reivindicación 38 o 39, de I205T+V253N+T267N+S269T y T106N+I205T+V253N. 41. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque está en su forma activada. 42. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque en su forma activada tiene por lo menos 10% de la actividad amidolítica de rhFVIIa cuando se prueba en la "prueba amidolítica". 43. - La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque en su forma activada tiene por lo menos 10% de la actividad de coagulación de rhFVIIa 5 cuando se prueba en la "prueba de coagulación". 44. - Una secuencia de nucleótidos que codifica una vanante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -43. 45. - Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos como la que se reclama en la reivindicación 44. 0 46.- Una célula hospedera que comprende una secuencia de nucleótidos como la que se reclama en la reivindicación 44 o un vector de expresión como el que se reclama en la reivindicación 45. 47.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque es una célula gamma-carboxilante capaz de 5 . glicosilación -.m-vivo— — - •==^~"~----"::~- , . . ... - ~ 48.- Una composición farmacéutica que comprende una variante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-43, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 49. - Una variante como la que se reclama en cualquiera de las 0 reivindicaciones 1 -43, o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 48, para usar como un medicamento. 50. - El uso de una variante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-43, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en donde es deseable la formación de coágulo. 51. - El uso que se reclama en la reivindicación 50, en donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de hemorragia, que incluye hemorragia cerebral, sangrado severo incontrolado, por ejemplo en trauma, sangrado en pacientes sometidos a transplantes vitales, sangrado en pacientes sometidos a resección y sangrado variceal. 52. - El uso que se reclama en la reivindicación 51 , en donde dicha enfermedad o trastorno es el trauma. 53. - El uso que se reclama en la reivindicación 52, en donde dicha enfermedad o trastorno es el trauma contundente. 54. - El uso que se reclama en la reivindicación 52, en donde dicha enfermedad o trastorno es el trauma penetrante.