MXPA04009206A

MXPA04009206A - Nuevas proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis.

Info

Publication number: MXPA04009206A
Application number: MXPA04009206A
Authority: MX
Inventors: Rie Jeroen Van
Original assignee: Bayer Bioscience Nv
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2004-11-26
Also published as: EP1490397B1; BRPI0308659B1; EP1490397A1; CA2479769A1; ES2348509T3; AU2003209748B2; BR0308659A; EP1490397B2; DK1490397T3; ES2348509T5; CA2479769C; AU2003209748A1; BRPI0308659B8; WO2003080656A1; ATE469171T1

Abstract

Control de plagas vegetales, particularmente control de insectos. Se proveen secuencias de nucleotidos de Bacillus thuringiensis que codifican proteinas insecticidas; se proveen ademas metodos y medios para usar dichas secuencias de nucleotidos para controlar plagas de insectos en plantas.

Description

NUEVAS PROTEINAS INSECTICIDAS DE BACILLUS THURINGIENSiS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con el campo del control de plagas vegetales, particularmente el control de insectos. Se proveen nuevas secuencias de ácidos nucleicos de cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) que codifican proteínas insecticidas expresadas durante las etapas de crecimiento vegetativo. Particularmente, se proveen secuencias de ADN que codifican proteínas designadas como ISP3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J, que son útiles para proteger las plantas del daño causado por insectos. Además, se proveen plantas y microorganismos que comprenden al menos una de las nuevas moléculas de ácidos nucleicos, así como métodos y medios para usar estas secuencias de ácidos nucleicos para reducir el daño causado por los iñ~s^ctos~á"las^lantás".

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las plagas de insectos causan grandes pérdidas económicas en la producción de cultivos en todo el mundo, y los granjeros enfrentan cada año la amenaza de sufrir pérdidas en el rendimiento debido a la infestación de insectos. La ingeniería genética de resistencia a insectos en cultivos agrícolas ha sido un enfoque atractivo para reducir los costos asociados con el manejo de cultivos y las prácticas de control químico. Se introdujo en el mercado la primera generación de cultivos resistentes a insectos a partir de 1996, basada en la expresión en plantas de proteínas aisladas de la bacteria gram positiva de la tierra Bacillus thuringiensis (Bt). Las proteínas insecticidas Bt Cry se 5 producen durante la etapa de esporulación de las cepas de Bt, y las proteínas se acumulan en grandes cristales citoplasmáticos dentro de la bacteria. Cuando son asimiladas por los insectos, las proteínas tóxicas para lepidópteros Bt Cry se solubilizan y se procesan en el mesenterón del insecto para dar una forma activa de entre aproximadamente 60 y 65 kDa. La proteína 10 activa ejerce su efecto tóxico al unirse a las células epiteliales del mesenterón, causando la formación de poros en la membrana celular, lo que conduce a la * lisis osmótica de las células (Gilí et al., 1992). Una cepa de Bt puede producir muchas toxinas diferentes. 100 genes que codifican Bt Cry y han podido controlarse plagas de insectos en forma efectiva expresando las proteínas derivadas de Bt en especies importantes de cultivos agrícolas. Sin embargo, el uso de proteínas Bt individuales está comúnmente limitado, ya que la mayor parte de las proteínas 20 Bt son solamente activas contra una cantidad relativamente pequeña de las numerosas plagas de insectos existentes. Se cree que la especificidad de las proteínas Bt Cry está determinada por factores tales como la activación de la toxina en el intestino del insecto (Haider et al. 1986) y su capacidad de unirse a receptores específicos (Hofmann et al., 1988). Se reconoce ampliamente que existe el riesgo de que especies de insectos susceptibles desarrollen resistencia contra toxinas Bt Cry. Consecuentemente, se han realizado esfuerzos activos para identificar nuevas proteínas insecticidas. Una estrategia usada fue analizar cepas de Bacillus para determinar la producción de proteínas insecticidas durante las etapas de crecimiento vegetativo, en vez de durante las etapas de esporulación. Usando este enfoque, se identificó una cantidad de "proteínas insecticidas vegetativas" o "VIP". Estruch et al.(1996), W094/21795, WO96/10083, W098/44137, US 5877012, US 6107279, US 6137033 y US 6291 156 describen el aislamiento de vip3A(a), vip3A(b) y vip3A(c) a partir de fluidos sobrenadantes de las cepas de Bt AB88, AB424 y AB51. De acuerdo con los autores, estos genes codifican proteínas con actividad insecticida sobre un amplio rango de plagas de lepidópteros. W098/18932 y W099/57282 describen una cantidad de secuencias de nucleótidos aisladas de cepas de Bt. Estas secuencias se conocen como mis (mis-1 a mis-8), war y sup. De acuerdo con los autores, las proteínas codificadas tienen actividad contra plagas de lepidópteros o coleópteros. WO00/09697 describe toxinas débiles ante el calor, solubles, de tipo MIS y WAR, así como toxinas más pequeñas (de entre 1 y 10 kDa) que pueden obtenerse de los sobrenadantes de cultivos de cepas de Bacillus laterosporus, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra larvas de la oruga occidental de las raíces de maíz. WO98/00546 y US 6274721 describen el aislamiento de cepas de Bt y toxinas de Bt, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra plagas de lepidópteros. W099/33991 describe el aislamiento de cepas de Bt y toxinas de Bt, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra plagas de lepidópteros. Recientemente, Selvapandiyan et al. (2001 ) describieron el aislamiento de un gen que codifica una proteína designada como VIP-S. De acuerdo con los autores, la proteína VIP-S mostró toxicidad contra una cantidad de especies de insectos lepidópteros. Doss et al. (2002) describen la clonación de VIP3V a partir de la cepa Bt kurstaki. WO02/078437 describe toxinas VI P3 de Bt, tales como toxinas híbridas VIP3A, VIP3B y VIP3A-B. A pesar del aislamiento y la caracterización de cantidades relativamente grandes de distintas proteínas insecticidas hasta la fecha, subsiste la necesidad de identificar, aislar y caracterizar nuevas proteínas insecticidas. Las razones de esto son diversas. Primero, debido a la especificidad de las proteínas insecticidas respecto de grupos particulares de plagas blanco (insectos huésped), existe la necesidad de clonar genes que codifican proteínas con distintos espectros de actividad, de modo que, para distintos cultivos y distintas regiones geográficas, existen proteínas adecuadas para combatir plagas de insectos. P.ej., la especificidad de las proteínas Bt Cry, está limitada en gran medida. Es deseable la identificación de toxinas con especificidad para distintos insectos plaga. Segundo, después de un uso prolongado en una región geográfica, se sabe que los insectos tienen la capacidad de desarrollar resistencia a insecticidas químicos y rocíos microbianos (p.ej., basados en mezclas de esporas y cristales Bt), y se cree que tienen la capacidad de desarrollar resistencia a plantas que expresan proteínas insecticidas. El desarrollo de resistencia dentro de poblaciones de insectos podría potencial mente volver inefectivas a las proteínas insecticidas existentes, generando la necesidad de nuevos genes y proteínas. Tercero, por razones de salubridad y ambientales, es deseable identificar proteínas con una gran potencia insecticida específica y bioactividad aguda contra las especies de insectos blanco. De aquí en adelante, incluyendo las distintas modalidades descriptas en las reivindicaciones, se describen nuevas secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos aisladas de cepas de Bacillus thuríngiensis, que son útiles para proteger las plantas del daño causado por los insectos.ya sea a través de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos en las plantas.bajo el control de promotores adecuados.o por medio de la aplicación externa de las toxinas a las plantas.Las toxinas de la presente invención se distinguen de las toxinas pesticidas antes descriptas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención provee proteínas insecticidas ISP3 y ácidos nucleicos que las codifican. Se proveen proteínas insecticidas ISP3-1099E (SEQ ID N° 2), ISP3-327D (SEQ ID N° 4) e ISP3-2245J (SEQ ID N° 6) y los ácidos nucleicos que las codifican, isp3-1099E (SEQ ID N° 1 ), isp3-327D (SEQ ID N° 3) e ISP3-2245J (SEQ ID N° 5), respectivamente. Las proteínas de la invención tienen actividad insecticida contra plagas de insectos lepidópteros, particularmente contra insectos seleccionados del grupo que consiste en Helicoverpa zea, Helicoverpa armígera, Helicoverpa punctigera, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotls ípsilon, Pectinophora gossypíella, Scírphophaga ¡ncertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia ¡nferens, Chito partellus, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Pseudoplusia includens, Spodoptera exigua, Spodoptera ornithogalU, Epinotia aporema y Rachiplusia nu. En otra modalidad de la invención, se proveen variantes insecticidas y fragmentos de las proteínas ISP3, y de los ácidos nucleicos que las codifican. Las variantes que se proveen son, p.ej., secuencias de ácidos nucleicos que hibridizan bajo condiciones estrictas con SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 3 o SEQ ID N° 5. En una modalidad de la invención, se proveen proteínas insecticidas que comprenden al menos 91 % de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, al menos 91 % de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4 o al menos 88% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 6. En otra modalidad de la invención, se proveen secuencias aisladas de ácidos nucleicos que comprenden al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1 , al menos 94% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 3 o al menos 97% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5. En aún otra modalidad, se proveen secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas ISP3 de la invención, donde la secuencia de ácido nucleico es una secuencia sintética que ha sido optimizada para una expresión en plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas.o en células vegetales. Es otro objetivo de la invención proveer genes quiméricos que comprenden una secuencia promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D o ISP3-2245J, o variantes activas como insecticidas o fragmentos de las mismas. También se proveen vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D o ISP3-2245J, o variantes activas como insecticidas o fragmentos de las mismas. La invención provee además células huésped que comprenden genes quiméricos, particularmente microorganismos o células vegetales transgénicas, tejidos vegetales, órganos de plantas, semillas de plantas o plantas completas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D o ISP3-2245J, o fragmentos activos como insecticidas o variantes de las mismas. En una modalidad, la planta transformada es una planta de maíz o algodón. En otra modalidad, la planta transformada es una planta de arroz o soya. En otra modalidad, la planta transformada es cualquier planta, particularmente cualquier planta seleccionada del grupo que comprende sorgo, trigo, cebada, centeno, girasol, caña de azúcar, tabaco, especies de Brassica (tales como colza oleaginosa, mostaza, repollo, brócoli, etcétera), especies de verduras (tomate, coliflor, rábano, espinaca, pimienta, cebolla, poroto, arveja, zanahoria, etcétera), remolacha, especies de árboles (manzana, pera, ciruela, coniferas, árboles caducifolios, etcétera), papa, alfalfa, mango, papaya, banana. En otra modalidad, se proveen métodos para proteger una planta contra el daño causado por insectos, que comprenden poner en contacto dicha planta con una proteína insecticida ISP3. La planta puede ponerse en contacto con cualquier proteína ISP3, transformando la planta con una secuencia de nucieótidos que codifica una proteína ISP3, o aplicando una proteína ISP3 por vía externa a la planta. En una modalidad de la invención, se provee una cepa Bt que comprende un ácido nucleico ¡sp3, particularmente isp3-1099E, ¡sp3-327D o ¡sp3-2245J. En otra modalidad, se provee una composición insecticida que comprende una cantidad efectiva como insecticida de una proteína ISP3. Cuando se aplica por vía externa a una planta, la composición insecticida incrementa la resistencia al daño causado por insectos, en comparación con las plantas control, sobre las cuales no se aplica ninguna composición. En una modalidad adicional, se provee un método para mejorar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ISP3, método que comprende los pasos de: (a) Proveer una población de secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 2 y/o 4 y/o 6, o variantes o fragmentos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 2 y/o 4 y/o 6, donde dichas variantes o fragmentos tienen una identidad de secuencia de al menos 91 % con SEQ ID N° 2 o 4 y de al menos 88% con SEQ ID N° 6 (b) Barajar dicha población de variantes o fragmentos para formar moléculas recombinantes de ácidos nucleicos (c) Seleccionar o analizar moléculas recombinantes de ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen actividad insecticida (d) Repetir los pasos (a) a (c) con las moléculas recombinantes de ácidos nucleicos seleccionadas en el paso (c) hasta que se halla una molécula recombinante de ácido nucleico en el paso (c), donde la proteína codificada por dicha molécula de ácido nucleico tiene la propiedad insecticida deseada.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCION El campo de la invención es proveer métodos y medios para reducir el daño causado a las plantas por las plagas, particularmente plagas de insectos, más particularmente plagas de insectos lepidópteros. Se han identificado y aislado nuevas secuencias de ácidos nucleicos y proteínas, que se distinguen de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas antes descriptas, y que pueden usarse para controlar plagas de insectos por medio de la integración y la expresión de al menos una de estas nuevas secuencias de nucleótidos en plantas o células vegetales, o a través del tratamiento externo de las plantas o de partes de las mismas con composiciones que comprenden las toxinas codificadas por estas moléculas de ácidos nucleicos. Es una modalidad de la invención proveer nuevas toxinas pesticidas aisladas de cepas de Bacillus thuringiensis. Particularmente, se proveen proteínas pesticidas designadas como proteína ISP3-1099E, proteína ISP3-327D y proteína ISP3-2245J. De acuerdo con esta invención, una "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma de cadena simple o doble, preferiblemente un ADN o ARN, particularmente un ADN, que codifica cualquiera de las proteínas ISP3 de esta invención. Una "secuencia aislada de ácido nucleico", como se lo usa en la presente documentación, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que no está más en el ambiente natural del que se aisló, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico en otro huésped bacteriano o en el genoma nuclear de una planta. De acuerdo con esta invención, los términos "proteína" o "polipéptido" se usan indistintamente para hacer referencia a una molécula que consiste en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, tamaño, estructura tridimensional u origen. Por consiguiente, un fragmento o porción de una proteína ISP3 de la invención se conoce aún en la presente documentación como una "proteína". Una "proteína aislada", como se lo usa en la presente documentación, se refiere a una proteína que no está más en su ambiente natural. El ambiente natural de la proteína se refiere al ambiente en que podría hallarse la proteína cuando se expresara la secuencia de nucleótidos que la codifica y se la tradujera en su ambiente natural, es decir, el ambiente a partir del cual se aisló la secuencia de nucleótidos. P.ej., una proteína aislada puede estar presente ¡n vitro, en otro huésped bacteriano o en una célula vegetal, o puede secretarse de otro huésped bacteriano o de una célula vegetal. De acuerdo con esta invención, se han aislado y caracterizado secuencias de ácidos nucleicos, particularmente secuencias de ADN, que codifican nuevas proteínas ISP3. Los nuevos genes se denominaron ¡sp3-1099E, isp3-327D e ISP3-2245J y sus proteínas codificadas, ISP3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J, respectivamente. De acuerdo con esta invención "proteína ISP3-1099E" se refiere cualquier proteína que comprende el fragmento más pequeño de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°2 que retiene actividad insecticida (conocido de aquí en adelante como "fragmento tóxico más pequeño"). Este incluye proteínas híbridas o quiméricas que comprenden el fragmento tóxico más pequeño. También se incluyen en esta definición las variantes de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID N°2, tales como las secuencias de aminoácidos esencialmente similares a SEQ ID N°2, que tienen una identidad de secuencia de al menos 91 %, particularmente al menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a nivel de la secuencia de aminoácidos, determinada usando alineaciones por pares empleando el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUU, versión 10.2). Se usa el programa GAP con los siguientes parámetros para comparaciones de secuencias de aminoácidos: la matriz de puntuación 'blosum62', una 'restricción de creación de faltas de coincidencia o huecos' (o 'peso de la falta de coincidencia") de 8 y una 'restricción de extensión de faltas de coincidencia' (o 'peso de extensión') de 2. Preferiblemente.se incluyen en esta definición las proteínas tienen algunos.preferiblemente 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos agregados, reemplazados o eliminados sin cambiar significativamente, preferiblemente sin cambiar la actividad insecticida de la proteína, o al menos sin cambiar la actividad insecticida de la proteína en una forma negativa. De acuerdo con esta invención "proteína ISP3-327D" se refiere a cualquier proteína que comprende el fragmento más pequeño de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 4 que retiene actividad insecticida (conocido de aquí en adelante como "fragmento tóxico más pequeño"). Esto incluye proteínas híbridas o quiméricas que comprenden el fragmento tóxico más pequeño. También se incluyen en esta definición las variantes de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID N° 4, tales como secuencias de aminoácidos esencialmente similares, que tienen una identidad de secuencia de al menos 91 %, particularmente al menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a nivel de la secuencia de aminoácidos, determinada usando alineaciones por pares empleando el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUU, versión 10.2). Se usa el programa GAP con los siguientes parámetros para comparaciones de secuencias de aminoácidos: la matriz de puntuación 'blosum62\ una 'restricción de creación de faltas de coincidencia o huecos' (o 'peso de la falta de coincidencia') de 8 y una 'restricción de extensión de faltas de coincidencia' (o 'peso de extensión') de 2. Preferiblemente, se incluyen en esta definición las proteínas tienen algunos, preferiblemente 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos agregados, reemplazados o eliminados sin cambiar significativamente, preferiblemente sin cambiar la actividad insecticida de la proteína, o al menos sin cambiar la actividad insecticida de la proteína en una forma negativa De acuerdo con esta invención "proteína ISP3-2245J" se refiere a cualquier proteína que comprende el fragmento más pequeño de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 6, que retiene actividad insecticida (conocido de aquí en adelante como "fragmento tóxico más pequeño"). Esto incluye proteínas híbridas o quiméricas que comprenden el fragmento tóxico más pequeño. También se incluyen en esta definición las variantes de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID N° 6, tales como las secuencias de aminoácidos esencialmente similares a SEQ ID N° 2, que tienen una identidad de secuencia de al menos 88%, particularmente al menos 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a nivel de la secuencia de aminoácidos, determinada usando alineaciones por pares empleando el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUU, versión 10.2). Se usa el programa GAP con los siguientes parámetros para comparaciones de secuencias de aminoácidos:la matriz de puntuación 'blosum62\ una 'restricción de creación de faltas de coincidencia o huecos' (o 'peso de la falta de coincidencia') de 8 y una 'restricción de extensión de faltas de coincidencia' (o 'peso de extensión') de 2. Preferiblemente, se incluyen en esta definición las proteínas tienen algunos.preferiblemente 5-10, particularmente menos de 5,aminoácidos agregados, reemplazados o eliminados sin cambiar significativamente.preferiblemente sin cambiar la actividad insecticida de la proteína, o al menos sin cambiar la actividad insecticida de la proteína en una forma negativa. Como se lo usa en la presente documentación, "que comprende" debe interpretarse como un término que especifica la presencia de las características establecidas, los enteros, los pasos o los componentes mencionados, pero que no excluye la presencia o la adición de una o más características, enteros, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Por consiguiente, el término "ADN/proteína que comprende la secuencia o región X", como se lo usa en la presente documentación, se refiere a un ADN o proteína que incluye o contiene al menos la secuencia o región X, de modo que pueden incluirse otras secuencias de nucleótidos o aminoácidos en el extremo 5' (o N-terminal) y/o 3' (o C-terminal), p.ej. (la secuencia de nucleótidos de) una proteína marcadora de selección, como se describe en EP 0 193 259, (la secuencia de nucleótidos de) un péptido de tránsito, y/o una secuencia directriz 5' o 3'. El "fragmento tóxico más pequeño" de una proteína ISP3 de la invención, como se lo usa en la presente documentación, es el fragmento o porción más pequeña de una proteína ISP3 que retiene actividad insecticida, que puede obtenerse por medio de la digestión enzimática de la proteína completa ISP3, o el fragmento o porción más pequeña de una proteína ISP3 que retiene actividad insecticida, que puede obtenerse preparando deleciones de nucleótidos en el ADN que codifica una proteína ISP3. Se comprende que el ADN que codifica fragmentos tóxicos ISP3 más cortos puede sintetizarse también por medios químicos y que el fragmento tóxico más pequeño que puede obtenerse a través de la transcripción y traducción de ADN sintético queda incluido en la definición de fragmento tóxico más pequeño. En una modalidad de la invención, el fragmento tóxico más pequeño de proteína ISP3 tiene un peso molecular de aproximadamente 65 kDa, como puede determinarse por medio de un análisis de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio). En otra modalidad, el fragmento tóxico más pequeño de una proteína ISP3 tiene un peso molecular de aproximadamente 23 kDa. En otra modalidad, el fragmento tóxico más pequeño de una proteína ISP3 tiene un peso molecular de aproximadamente 33 kDa. En otra modalidad, el fragmento tóxico más pequeño comprende los aminoácidos centrales de la proteína ISP3, en particular desde el aminoácido 200 hasta en aminoácido 455 de SEQ ID IN° 2, SEQ ID N° 4 o SEQ ID N° 6. Las digestiones enzimáticas de las proteínas ISP3 pueden realizarse usando enzimas purificadas o fluidos de jugos gástricos de larvas de insectos, e incubando los extractos de jugos gástricos con soluciones que comprenden una de las proteínas ISP3, como se describe en Yu et al. (1997). Pueden separarse y visualizarse los productos proteolíticos mediante SDS-PAGE. Pueden realizarse bioensayos con fragmentos de proteínas procesados, fraccionados por cromatografía, con el fin de determinar la relación entre cada fragmento proteolítico y su actividad insecticida. El jugo gástrico preferido usado para determinar el fragmento tóxico más pequeño de proteínas ISP3 es jugo gástrico de insectos lepidópteros, preferiblemente de oruga de la espiga de maíz (Helicoverpa zea), oruga del algodón (Helicoverpa armígera), oruga de los retoños del tabaco (Helicoverpa punctígera), gusano cogollero de tabaco (Heliothis virescens), taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), oruga militar tardía (Spodoptera frugiperda), oruga cortadora negra (Agrotis Ípsilon), lagarta rosada (Pectinophora gossypiella), taladro amarillo de los tallos (Scirphophaga incertulas), minador de hojas {Cnaphalocrocis medinalis), taladro rosado de los tallos (Sesamia inferens), taladro moteado de los tallos (Chito partellus), oruga aterciopelada (Anticarsia gemmatalis), rizador de soya (Pseudoplusia includens), taladro de las vainas (Epinotia aporema), Rachiplusia nu. Se determinan convenientemente los extremos N y C de la secuencia de aminoácidos del fragmento tóxico más pequeño convenientemente por medio de la determinación de la secuencia de aminoácidos de los fragmentos anteriores, empleando procedimientos disponibles comúnmente en la técnica. Como se los usa en la presente documentación, los términos "isp3-1099E", "isp3-327D" e "isp3-2245J" se refieren a cualquier secuencia de ADN que codifica la "proteína ISP3-1099E", la "proteína ISP3-327D" o la "proteína ISP3-2245J", respectivamente, como se definió previamente. Esto incluye secuencias de ADN de ocurrencia natural, artificiales o sintéticas que codifican las proteínas de SEQ ID N° 2 o SEQ ID N° 4 o SEQ ID N° 6, o los fragmentos o variantes insecticidas definidos previamente. También se incluyen en la presente documentación las secuencias de ADN que codifican proteínas insecticidas que son suficientemente similares a las secuencias de ADN provistas en el listado de secuencias, de modo que pueden hibridizar (es decir, tienen la capacidad de hacerlo) con estas secuencias de ADN bajo condiciones severas de hibridización. "Condiciones severas de hibridización", como se lo usa en la presente documentación, se refiere particularmente a las siguientes condiciones: inmovilizar el ADN relevante en un filtro y prehibridizar los filtros por entre 1 y 2 horas en 50% de formamida, 5 x SSPE, reactivo de Denhardt 2x y 0.1 % de SDS a 42°C, o entre 1 y 2 horas en SSC 6x, reactivo de Denhardt 2x y 0.1 % de SDS a 68°C. Se agrega luego directamente la sonda desnaturalizada marcada (con digoxigenina o radioactividad) al fluido de prehibridización se realiza la incubación por entre 16 y 24 horas a la temperatura apropiada antes mencionada. Después de la incubación, se lavan luego los filtros por 30 minutos a temperatura ambiente en SSC 2 x, 0.1 % de SDS, seguido por 2 lavados de 30 minutos cada uno a 68°C en SSC 0.5x y 0.1 % de SDS. Se realiza una atorradiografía exponiendo los filtros por entre 24 y 48 horas a una película de rayos X (Kodak XAR-2 o equivalente) a -70°C, con una pantalla de intensificación. [SSC 20x = NaCI 3 M y citrato de sodio 0.3 M; reactivo de Denhart 100x = 2% (p/v) de albúmina de suero bovino, 2% (p/v) de Ficoll™ y 2% (p/v) de polivinilpirrolidona; SDS = dodecil sulfato de sodio; SSPE 20X = NaCI 3.6 M, fosfato de sodio 0.2 M y EDTA 0.02 M, pH 7.7]. Por supuesto, pueden usarse condiciones y parámetros equivalentes en este proceso y aún mantener las condiciones severas de hibridización. Está claro que existen muchos enfoques conocidos en la técnica para el aislamiento de variantes de las secuencias de ADN de la invención. Las variantes pueden, p.ej., aislarse de cepas de Bt por hibridizaciones como las que se describieron previamente y/o por tecnología de PCR, como se conoce en la técnica. Pueden prepararse cebadores específicos o degenerados a partir de regiones de las secuencias de ADN isp3, y puede usárselos para amplificar variantes de cepas conocidas o nuevas de Bt.

Las variantes preferidas del ADN ¡sp3-1099E de esta invención son secuencias de ADN que codifican las variantes de proteínas insecticidas ISP3-1099E descriptas previamente, o una secuencia de ADN que codifica una proteína insecticida, con al menos 93%, particularmente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, 96% o 97%, más preferiblemente al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1. Las variantes preferidas del ADN isp3-327D de esta invención son secuencias de ADN que codifican las variantes de proteínas ISP3-327D descriptas previamente, o una secuencia de ADN que codifica una proteína insecticida, con al menos 94%, preferiblemente al menos 95%, particularmente al menos 96%, 97%, 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 3. Las variantes preferidas del ADN isp3-2245J de esta invención son secuencias de ADN que codifican las variantes de proteínas ISP3-2245J descriptas previamente, o una secuencia de ADN que codifica una proteína insecticida, con al menos 97%,preferiblemente al menos 98%,o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N°5. Las identidades de secuencia mencionadas anteriormente se calculan usando el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin.EEUU) Versión 10.2. Se usa el programa GAP con los siguientes parámetros para ácidos nucleicos: la matriz de puntuación "nwsgapdna", una 'restricción de creación de faltas de coincidencia o huecos'(o 'peso de la falta de coincidencia') de 50 y una 'restricción de extensión de faltas de coincidencia'(o 'peso de extensión') de 3. Las condiciones severas de hibridización son como se las definió previamente. "Actividad insecticida" de una proteína, como se lo usa en la presente documentación, significa la capacidad de una proteína de matar insectos cuando se suministra dicha proteína a los insectos, preferiblemente a través de su expresión en un huésped recombinante, tal como una planta. Se comprende que una proteína tiene actividad insecticida si puede matar al insecto durante al menos una de sus etapas de desarrollo, preferiblemente la etapa larval. "Cantidades para el control de insectos" de una proteína, como se lo usa en la presente documentación, se refieren a una cantidad de proteína que es suficiente para limitar el daño sobre una planta causado por los insectos (p.ej., larvas de insectos) que se alimentan de ella, hasta niveles aceptables para el uso comercial, p.ej., matando los insectos o inhibiendo el desarrollo de los insectos, su fertilidad o su crecimiento, de modo tal que generan menos daño a la planta y el no se ve afectado de una forma significativamente adversa el rendimiento de la planta. De acuerdo con esta invención, los insectos susceptibles a las nuevas proteínas ISP3 de la invención se ponen en contacto con esta proteína en cantidades adecuadas para controlar insectos, preferiblemente cantidades insecticidas. Los insectos blanco preferidos para las proteínas de esta invención son plagas de insectos que causan daños comerciales en el maíz, el algodón, el arroz o la soya, particularmente en países de Norte y Sudamérica, Asia y Australia. El término planta, como se lo usa en la presente documentación, abarca plantas completas, así como partes de plantas, tales como hojas, tallos, semillas, flores o raíces. Los insectos blancos particularmente preferidos para las proteínas ISP3 de esta invención son plagas de insectos lepidópteros, tales como Heliothis spp., Helicoverpa spp., Spodoptera spp., Ostrinia spp., Pectlnophora spp, Agrotis spp., Scirphophaga spp., Cnaphalocrocis spp., Sesamia spp, Chilo spp., Anticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp., y Rachiplusia spp., preferiblemente Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armígera, Helicoverpa punctera, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotis ípsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia ¡nferens, Chito partellus, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens, Epinotia aporema y Rachiplusia nu. Las proteínas ISP3 de la invención preferiblemente tienen actividad insecticida contra al menos una especie de insecto lepidóptero, más preferiblemente contra varias especies de insectos lepidópteros. Los términos "proteína ISP3", "proteína ISP3 de esta invención", "proteína ISP" o "proteína ISP de esta invención", como se los usa en la presente documentación, se refieren a cualquiera de las nuevas proteínas aisladas de acuerdo con esta invención, e identificadas y definidas en la presente documentación como proteínas ISP3-1099E, ISP3-327D o ISP3-2245 J. Una proteína ISP3, como se lo usa en la presente documentación, puede ser una proteína de tamaño completo puede tomar una forma truncada, siempre y cuando se mantenga la actividad insecticida, o puede ser una combinación de distintas proteínas o dominios de proteínas en una proteína híbrida o de fusión. Una "toxina ISP3" abarca un fragmento insecticida o una porción de una proteína ISP3, particularmente el fragmento tóxico más pequeño de la misma. Un "gen ¡sp", "gen isp3", "ADN de ¡sp" o "ADN de isp3", como se lo usa en la presente documentación, es una secuencia de ADN que codifica una proteína ISP3 de acuerdo con esta invención, que se refiere particularmente a cualquiera de las secuencias de ADN de ¡sp3-1099E, isp3-327D o isp3-2245J antes descriptas. La secuencia de ácido nucleico, particularmente la secuencia de ADN, que codifica las proteínas ISP3 de esta invención puede preparase en forma sintética y puede insertarse en vectores de expresión para producir grandes cantidades de proteínas SP3.Las proteínas ISP3 pueden usarse para preparar anticuerpos específicos monoclonales o policlonales de una forma convencional(Hofte et al.,1988;Harlow y Lañe, 1988). En una modalidad de la invención, se proveen anticuerpos que se unen específicamente a la proteína ISP3. En particular.se proveen anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen a ISP3-1099E, ISP3-327D o ISP3-2245J.O a fragmentos o variantes de la misma. Se incluyen fragmentos de anticuerpos monoclonales o policlonales que retienen la capacidad de unirse a la proteína ISP3 o al fragmento contra el cual se generan. Puede prepararse un anticuerpo contra una proteína ISP3 usando la proteína ISP3 como antígeno en un animal (tal como un conejo o un ratón), usando métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Harlow y Lañe "Using Antibodies: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998), en Liddell y Ccentenor "A Practical Guide to Monoclonal Antibodies" (Wiley & Sons, 1991 ).Los anticuerpos pueden usarse para aislar, identificar, caracterizar o purificar la proteína ISP3 a la cual se une. P.ej., puede usarse el anticuerpo para detectar la proteína ISP3 en una muestra, permitiendo que el anticuerpo y la proteína formen un inmunocomplejo, y detectando la presencia del inmunocomplejo,p.ej.,a través de ELISA o inmunotransferencias. Además.se proveen equipos inmunológicos útiles para detectar proteínas ISP3,fragmentos de proteínas o epitopes en una muestra.Las muestras pueden ser células, sobrenadantes celulares.suspensiones de células y semejantes. Dicho equipo comprende un anticuerpo que se une a la proteína ISP3 (o a un fragmento de la misma) y uno o más reactivos de inmunodetección. Los anticuerpos pueden usarse también para aislar proteínas insecticidas con una actividad similar, p.ej., por medio de ELISA (inmunoensayo conectado a enzimas) o transferencia Western. Pueden usarse también líneas de anticuerpos monoclonales con una especificidad de unión deseada para clonar el DNA del anticuerpo monoclonal particular. En otra modalidad de la invención, se proveen cebadores de PCR y/o sondas y equipos para detectar las secuencias de ADN de ¡sp3-1099E, ¡sp3-237D o isp3-2245J. Pueden sintetizarse cebadores de PCR para amplificar ADN de isp3 a partir de muestras, sobre la base de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 3 o SEQ ID N° 5, como es conocido en la técnica (véanse Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer Verlag, Alemania). Del mismo modo, pueden usarse fragmentos de ADN de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 3 o SEQ ID N° 5 como sondas de hibridización. Un equipo de detección isp3 puede comprender cebadores específicos para isp3 o sondas específicas para isp3, y un protocolo asociado para usar los cebadores o sondas para detectar el ADN de ¡sp3 en una muestra. Dicho equipo de detección puede, p.ej., usarse para determinar si la planta ha sido transformada con un gen de isp3 (o una parte del mismo) de la invención. Debido a la degeneración del código genético, pueden cambiarse algunos codones de aminoácidos por otros sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, pueden reemplazarse algunos aminoácidos por otros aminoácidos equivalentes sin cambiar significativamente, preferiblemente sin cambiar en absoluto, la actividad insecticida de la proteína, al menos sin cambiar la actividad insecticida de la proteína de forma negativa. P.ej., las sustituciones conservativas de aminoácidos dentro de las categorías básicas (p.ej., Arg, His, Lys), ácidas (p.ej., Asp, Glu), no polares (p.ej., Ala, Val, Trp, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp) o polares (p.ej. Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, GIn) están dentro del alcance de la invención, siempre y cuando no se altere significativamente la actividad insecticida de la proteína ISP3, preferiblemente no se altere en absoluto, al menos no se altere de forma negativa. Además, las sustituciones no conservativas de aminoácidos estarán dentro del alcance de la invención, siempre y cuando no se altere la actividad insecticida de la proteína ISP3 en forma significativa, preferiblemente no se altere en absoluto, al menos no se altere de forma negativa. Las variantes o los equivalentes de las secuencias de ADN de la invención incluyen secuencias de ADN que hibridizan con la secuencia de ADN de ¡sp3 de SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 3 o SEQ ID N° 5, bajo condiciones estrictas de híbridización, y que codifican una proteína con las mismas características insecticidas que la proteína de esta invención, o secuencias de ADN que tienen un distinto uso de codones que los genes isp3 nativos de esta invención, pero que codifican una proteína con la misma actividad insecticida y con sustancialmente la misma, preferiblemente la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de ADN isp3 pueden optimizarse para codones adaptando el uso de codones a aquél más preferido en genes vegetales, particularmente para genes nativos al género o la especie a la que pertenece la planta de interés (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977), usando tablas disponibles de uso de codones (p.ej., más adaptadas para una expresión en algodón, soya, maíz o arroz). Se indica el uso de codones para varias especies de plantas en las publicaciones, p.ej., de Ikemura (1993) y Nakamura et al. (2000). También pueden eliminarse grandes extensiones de nucleótidos AT o GC, y pueden agregarse sitios de estriccíón adecuados.

También, puede modificarse el extremo N de una proteína ISP3 de modo que tenga un contexto óptimo para el inicio de la traducción, agregando o eliminando así uno o más aminoácidos en el extremo N de la proteína. En la mayor parte de los casos, se prefiere que las proteínas de la invención que se expresan en células vegetales comiencen con un dipéptido Met-Asp o et-Ala para lograr un inicio óptimo de la traducción, lo que requiere de la inserción en el ADN de isp3 de un codón que codifica un aminoácido de Asp o Ala río abajo del codón de inicio, como un segundo codón. Como alternativa, puede reemplazarse el cuarto nucleótido de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 3 o SEQ ID N° 5 por 'G', de modo que el segundo aminoácido (después de Met) sea Asp. Del mismo modo, el segundo codón (AAC o AAT, que codifica para Asn) puede ser reemplazado por un codón para Asp (GAT o GAC) o Ala (GCT, GCC, GCA o GCG), o por cualquier otro codón que comience con 'G'. También pueden modificarse las secuencias de ADN, de modo de eliminar sitios de separación ilegítimos. Como los genes bacterianos contienen motivos que son reconocidos en otros huéspedes, especialmente en huéspedes eucariotas como las plantas, tales como sitios de separación 5' ó 3', la transcripción en estos otros huéspedes puede terminarse en forma prematura, lo que resulta en un ARNm truncado. Pueden identificarse los sitios de separación ilegítimos a través de un análisis basado en computadora de las secuencias de ADN y/o por medio de un análisis de PCR, como se conoce en la técnica.

Por supuesto, puede construirse cualquier secuencia de ADN que difiere en su uso de codones, pero que codifica la misma proteína o una proteína similar con sustancialmente la misma actividad insecticida, dependiendo del propósito particular. Se ha descripto en sistemas de expresión en procariotas y eucariotas que es deseable el cambio del uso de codones para adaptarlos a aquellos de la célula huésped, con el fin de lograr la expresión de los genes deseada en huéspedes foráneos (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977). Existen tablas de uso de codones disponibles en la literatura (Wada et al., 1990; Murray et al., 1989) y en las bases de datos más importantes de secuencias de ADN (p.ej., EMBL en Heidelberg, Alemania), y como se describe en Nakamura et al (2000). Por consiguiente, pueden construirse secuencias sintéticas de ADN, de modo que se produzca la misma o sustancialmente la misma proteína. Es evidente que pueden prepararse varias secuencias de ADN una vez que se conoce la secuencia de aminoácidos de las proteínas ISP3 de esta invención. Dichas otras secuencias de ADN incluyen secuencias de ADN sintéticas o semisintéticas que inactivan algunos sitios en el gen, p.ej., inactivando selectivamente algunos elementos reguladores críticos o de procesamiento presentes en la secuencia nativa, como se describe en las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218, pudiendo también adaptarse el uso total de codones con el fin de obtener uno más semejante al de un organismo huésped más relacionado, preferiblemente aquél del organismo huésped en el cual se desea obtener la expresión. Pueden hallarse varias técnicas para modificar el uso de codones y obtener aquél indicado como preferido por las células huésped en la literatura científica y de patentes. El método exacto de uso de codones no es critico para esta invención, siempre y cuando se hayan reemplazado la mayor parte o todas las secuencias reguladoras críticas o los elementos de procesamiento por otras secuencias. Pueden realizarse comúnmente modificaciones pequeñas a una secuencia de ADN, tales como aquellas descriptas previamente, es decir, mutagénesis basada en PCR (Ho et al. ,1989, White et al., 1989). Pueden realizarse comúnmente modificaciones más profundas a una secuencia de ADN por medio de la síntesis de novo de ADN de una región codificante deseada, usando técnicas disponibles. El término "sustancialmente la misma", cuando se refiere a la secuencia de aminoácidos de una proteína ISP3, pretende incluir una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 5%, preferiblemente no más de 2%, de la secuencia de aminoácidos de la proteína con la que se la compara; y, cuando se refiere a la toxicidad de una proteína ISP3, pretende incluir una proteína cuyo valor medio de LC5o (que es la concentración de proteína que causa 50% de mortalidad de la población de prueba), calculada o partir de tres bioensayos independientes realizados usando las mismas condiciones de bioensayo, difiere en un factor de no más de 2 del valor medio de LC50 obtenido para la proteína con la que se la compara {calculado también a partir de tres bioensayos independientes realizados usando las mismas condiciones de bioensayo que aquellos que involucran la proteína con la que se realiza la comparación). Los valores de LC50 se calculan con un análisis Probit, usando el programa POLO PC (de LeOra Software, 1987, Berkely, California). Se comprende que se calculan límites de confianza al 95% (o 90%) (un parámetro asociado calculado con el análisis Probit) para los valores de LC50 de cada una de las dos proteínas a comparar, con el fin de determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en los valores de LC50. En general, se observa que la toxicidad de ambas proteínas es sustancialmente la misma si se superponen los límites de confianza, y es sustancialmente diferente si los no se superponen los límites de confianza. El término "dominio" de una toxina ISP3 (o proteína ISP3), como se lo usa en la presente documentación, significa cualquier parte o dominio de la toxina (o proteína ISP3) con una estructura o función específica que puede transferirse a otra proteína para obtener una nueva proteína híbrida con al menos una característica funcional (p.ej., las características de unión y/o toxicidad) de la toxina ISP3 (o la proteína ISP3) de la invención (Ge et al., 1991 ). Dichas partes pueden formar una característica esencial de la proteína híbrida con las características de unión y/o toxicidad de las proteínas ISP3 de esta invención. Dicha proteína híbrida puede tener un mayor rango de huéspedes, una mejor toxicidad y/o puede usarse en una estrategia para prevenir el desarrollo de resistencia en los insectos (EP 408 403; Visser et al., 1993). Las secuencias de ADN que codifican estos dominios están abarcadas por esta definición. Se usa una proteína híbrida o una proteína de fusión en la presente documentación para representar una proteína compuesta por distintos dominios proteicos, que forman una proteína quimérica funcional con las características de los dominios individuales. Otro dominio que puede estar contenido en una proteína híbrida o quimérica puede ser, p.ej., un dominio de estabilización. Se han descripto los dominios de estabilización como presentes en el extremo C de proteínas VIP3(a), y se cree que proveen estabilidad a la proteína tóxica en el ambiente del intestino de los insectos susceptibles. Además de crear proteína híbridas, puede analizarse la función de los dominios específicos por medio de la introducción de deleciones específicas en todos o parte de los dominios, o por medio de la introducción de mutaciones en el dominio y el análisis del efecto resultante de la toxicidad sobre los insectos, la estabilidad de la proteína, la sensibilidad a la proteólisis enzimática, los cambios de temperaturaja unión a ADN/proteínas/células específicas, etcétera. Es una modalidad de la invención proveer un método de "mejoramiento" a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ISP3, particularmente ISP3-1099E o ISP3-327D o ISP32245J, para obtener una nueva secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad insecticida. La secuencia de ácido nucleico mejorada preferiblemente tiene actividad insecticida potenciada, en comparación con la secuencia no mejorada. El término "mejorar",como se lo usa en la presente documentación, se refiere a un método para mejorar secuencias por medio de la recombinación de secuencias, como se describe en US 581 1238, WO97/20078 y US 6180406, incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. En la presente documentación, se usa el "barajado" de ácidos nucleicos para indicar una recombinación in vitro o in vivo entre las secuencias de ácidos nucleicos de una población o reserva de ácidos nucleicos, barajado que puede realizarse como se conoce en la técnica y se describe en US 581 1238.WO97/20078, US 6180406, US 6117679,todas incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. El método para mejorar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ISP3 comprende los siguientes pasos: (a) proveer una población de secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 2 y/o 4 y/o 6, o variantes o fragmentos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 2 y/o 4 y/o 6, donde dichas variantes o fragmentos tienen una identidad de secuencia de al menos 91 % con SEQ ID N° 2 o 4 y al menos 88% con SEQ ID N° 6 (b) barajar dicha población de variantes o fragmentos para formar moléculas recombinantes de ácidos nucleicos (c) seleccionar o analizar las moléculas recombinantes de ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen actividad insecticida; repetir los pasos (a) a (c) con las moléculas recombinantes de ácidos nucleicos seleccionadas en el paso (c) hasta que se halla una molécula recombinante de ácido nucleico en el paso (c), donde la proteína codificada por dicha molécula de ácido nucleico tiene la propiedad insecticida deseada.

Un ácido nucleico no mejorado es un ácido nucleico provisto como material inicial en el paso (a), mientras que un correspondiente ácido nucleico mejorado, como se lo usa en la presente documentación, se refiere a un ácido nucleico recombinante obtenido en el paso (d), cuando se lleva a cabo el método usando el ácido nucleico no mejorado del paso (a). Los ácidos nucleicos usados en el paso (a) son secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos ISP3-1099E (SEQ ID N° 2) y/o ISP3-327D (SEQ ID N° 4) y/o ISP3-2245J (SEQ ID N° 6), o variantes o fragmentos de las mismas. La población de moléculas de ácidos nucleicos y/o variantes y/o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos en el paso (a) pueden comprender el ADN que codifica una única proteína ISP3 y/o variantes y/o fragmentos del ácido nucleico que codifica una única proteína ISP3 de la invención, o una mezcla de ácidos nucleicos que codifica distintas proteínas ISP3 de la invención, y/o fragmentos y/o variantes de las mismas. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 2 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 91 %, preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, 94%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos con SEQ ID N° 2. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 4 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 91 %, preferiblemente al menos 92 o 93%, más preferiblemente al menos 94%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos con SEQ ID N° 4. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 6 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 88%, preferiblemente al menos 89 o 90%, más preferiblemente al menos 91 %, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos con SEQ ID N° 6. Una secuencia de ácido nucleico mejorada obtenida en el paso (d) preferiblemente codifica una proteína con actividad insecticida potenciada, es decir, la proteína tiene, p.ej., una mayor toxicidad que la proteína codificada por las secuencias no mejoradas usadas en el paso (a) como material inicial, o tiene actividad contra un espectro diferente de insectos blanco que las secuencias no mejoradas, o se une a un sitio de unión a blanco distinto en un insecto blanco. La selección o la búsqueda de la mayor toxicidad deseada y/o de un distinto espectro de toxicidad (paso (c)) puede realizarse llevando a cabo bioensayos en insectos y comparando la actividad insecticida de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos mejoradas y no mejoradas. Pueden realizarse otros ensayos funcionales alternativos o adicionales, dependiendo de la propiedad insecticida deseada. P.ej., si una unión mejorada es la propiedad deseada, puede realizarse un ensayo de unión antes de llevar a cabo un bioensayo en insectos. Las secuencias de ADN de ¡sp3 de la invención, preparadas a partir de ADN total, pueden unirse en vectores de expresión adecuados y pueden transformarse en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli o de Bt, y pueden analizarse luego los clones empleando métodos convencionales de inmunosondeo de colonias (French et al., 1986) para determinar la expresión de la toxina con anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra las proteínas ISP3. Puede analizarse la producción de proteínas ISP3 en los clones de Bt o E. coli (puede emplearse un sobrenadante libre de células o lisado celular en geles de SDS-PAGE usando métodos comunes y procedimientos convencionales de transferencia western), o puede evaluarse en las bacterias la actividad insecticida, en comparación con las bacterias control. Puede analizarse también en los clones la presencia de ARNm que codifica proteína ISP3, usando procedimientos comunes de PCR, tales como RT-PCR. Los genes que codifican las proteínas ISP3 de esta invención pueden secuenciase de forma convencional (Maxam y Gilbert, 1980; Sanger, 1977) para obtener la secuencia de ADN. Las comparaciones de secuencia indicaron que los genes son diferentes de los genes antes descriptos que codifican toxinas con actividad contra lepidópteros. Puede prepararse una parte efectiva como insecticida de las secuencias de ADN, que codifica una porción efectiva como insecticida de las nuevas proteínas ISP3 identificadas, de una forma convencional, después de realizar un análisis de secuencia del gen. Puede determinarse la secuencia de aminoácidos de las proteínas ISP3 a partir de la secuencia de ADN de las secuencias de ADN aislada. Por "parte efectiva como insecticida (o porción o fragmento)" de las secuencias de ADN que codifican la proteína ISP3, también conocidas en la presente documentación como "gen truncado" o "ADN truncado", se interpreta una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene menos aminoácidos que la forma completa de la proteína completa ISP3, pero que es insecticida. Con el fin de expresar toda o una parte efectiva como insecticida de la secuencia de ADN que codifica una proteína ISP3 de esta invención en E. coli, en otras cepas de Bt y en plantas, pueden introducirse sitios de restricción adecuados alrededor de la secuencia de ADN. Esto puede realizarse a través de mutagénesis dirigida al sitio, usando procedimientos bien conocidos (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). Con el fin de obtener una expresión mejorada en plantas, puede modificarse el uso de codones del gen ¡sp3 o de una parte efectiva como insecticida del gen isp3 de esta invención para formar un gen o una parte del gen equivalente, modificada o artificial.de acuerdo con las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218, y las publicaciones EP 0 385 962, EP 0 359 472 y US 5689052,0 pueden insertarse los genes o las partes de genes isp3 en el genoma del plástido, la mitocondria o el cloroplasto.y puede expresárselos allí usando un promotor adecuado(p.ej., c Bride et al.,1995;US 5693507). Para obtener una expresión mejorada en plantas monocotiledóneas tales como maíz o arroz, puede agregarse también un intrón, preferiblemente un intrón de monocotiledónea, al gen quimérico. P.ej., se ha demostrado que la inserción del intrón del gen de maíz Adh1 en la región reguladora 5' mejora la expresión en maíz (Callis et. al., 1987). Del mismo modo, puede usarse el intrón HSP70, como se describe en US 5859347, para mejorar la expresión. Puede alterarse adicionalmente la secuencia de ADN del gen ¡sp3, o su parte insecticida, de una forma neutra para la traducción, para modificar secuencias de ADN posiblemente inhibidoras presentes en la parte del gen, por medio de una inserción de intrones dirigida al sitio y/o por medio de la introducción de cambios en el uso de codones, p.ej., adaptando el uso de codones a aquél más preferido por las plantas, preferiblemente el género vegetal relevante (Murray et al., 1989), sin cambiar significativamente, preferiblemente sin cambiar en lo absoluto, la secuencia de aminoácidos codificada. De acuerdo con una modalidad de esta invención, se prefiere que se dirijan las proteínas a organelas ¡ntracelulares tales como plástidos, preferiblemente cloroplastos, mitocondrias, o se seleccionan entre las células, optimizando potencialmente la estabilidad y/o la expresión de las proteínas. Con este propósito, en una modalidad de esta invención, los genes quiméricos de la invención comprenden una región codificante que codifica un péptido señal o blanco, unido a la proteína ISP3 que codifica una región de la invención. Los péptidos particularmente preferidos a incluir en las proteínas de esta invención son los péptidos de tránsito para cloroplastos u otras regiones de péptidos de direccionamiento a plástidos, especialmente regiones de genes vegetales cuyo producto génico se dirige a los plástidos, el péptido de tránsito optimizado de Capellades et al. (US 5635618), el péptido de tránsito de la ferredoxina-NADP+oxidorreductasa de la esp¡naca(Oelmuller et al., 1993), el péptido de tránsito descripto por Wong et al. (1992) y los péptidos de direccionamiento descriptos en la solicitud dpublicada de patente PCT WO 00/26371. También se prefieren los péptidos que señalan la secreción de una proteína conectada con dicho péptido fuera de la célula, tal como la señal de secreción del inhibidor de la proteinasa de papa II (Keil et al., 1986),la señal de secreción del gen de alfa-amilasa 3 gene de arroz(Sutliff et al., 1991 ) y la señal de secreción de la proteína PR1 de tabaco (Maízelissen et al., 1986). Los péptidos señal particularmente útiles de acuerdo con la invención incluyen el péptido de tránsito a cloroplastos (p.ej., Van Den Broeck et al. ,1985), o el péptido de tránsito a cloroplastos de US 5510471 y US 5635618, que provoca el transporte de la proteína a los cloroplastos, un péptido señal de secreción o un péptido que dirige la proteína a otros plástidos, las mitocondrias, el ER u otra organela. Las secuencias señal para lograr un direccionamiento a organelas intracelulares o una secreción fuera de la célula vegetal o hacia la pared celular se hallan en proteínas naturalmente dirigidas o secretadas, preferiblemente aquellas descriptas por Klósgen et al. (1989), Klósgen y Weil (1991 ), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999), Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki et al. (1998), Terashima et al. (1999), Park et al. (1997), Shcherban et al. (1995), todos los cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia, particularmente las secuencias de los péptidos señal de proteínas dirigidas o secretadas de maíz, algodón, soya o arroz.

Para permitir la secreción de las proteínas ISP3 hacia el exterior de la célula huésped transformada, puede fusionarse un péptido de secreción apropiado con el extremo aminoterminal (extremo N terminal) de la proteína ISP3. También, puede eliminarse cualquier probable secuencia de péptido señal de secreción nativa de Bacillus o se la puede rememplazar por un péptido señal apropiado, tal como un péptido señal de secreción eucariota, como se describió previamente. Particularmente, los aminoácidos 1 a 54 de las proteínas ISP3 de la invención comprenden un probable péptido señal de Bacillus. Los aminoácidos 1 a 10, preferiblemente 1 a 50, más preferiblemente 1 a 54, pueden eliminarse de las proteínas ISP# o reemplazarse por un péptido señal apropiado, particularmente un péptido señal de secreción eucariota, como se describió previamente. Pueden detectarse los probables péptidos señal usando un análisis basado en computadora, usando programas tales como el programa de búsqueda de péptidos señal (SignalP V1.1 o 2.0), usando una matriz para bacterias procariotas gram positivas y una puntuación umbral de menos de 0.5, especialmente una puntuación umbral de 0.25 o menos (Von Heijne, Gunnar, 1986 y Nielsen et al. ,1996). Además, las propiedades de unión de las proteínas ISP3 de la invención pueden evaluarse usando métodos conocidos en la técnica (p.ej., Van Rie et al., 1990), para determinar si las proteínas ISP3 de la invención se unen a sitios en el intestino del insecto, tal como el mesenterón, que no son reconocidos (o compartidos competitivamente) por otras proteínas Bt. Las proteínas insecticidas Bt con distintos sitios de unión, para las cuales no hay competición de unión en insectos susceptibles relevantes, son muy valiosas para reemplazar las péptidos Bt conocidas a las cuales han desarrollado resistencia los insectos, o para usar en combinación con las proteínas insecticidas Bt que tienen un modo de acción diferente, para prevenir o demorar el desarrollo de resistencia en los insectos contra proteínas Bt, particularmente cuando se expresan en una planta. Debido a las características de las toxinas de Bt recientemente aisladas, son extremadamente útiles para transformar plantas, p.ej., monocotiledóneas tales como maíz y arroz, y dicotiledóneas tales como algodón y soya, para proteger estas plantas del daño causado por los insectos. Se espera que las propiedades de unión de las proteínas ISP3 de la presente invención sean diferentes, en comparación con aquellas de las toxinas Cry. Dichas propiedades de unión diferentes pueden medirse a través de ensayos de unión de rutina, como se describió previamente o en US 6291156 y US 6137033. Especialmente con propósitos de manejo de resistencia en insectos en una plaga de insectos, se prefiere combinar una proteína ISP3 de esta invención con otra proteína de control de insectos, particularmente una proteína Bt Cry o una proteína VIP o tipo VIP, preferiblemente una proteína que no reconoce al menos un sitio de unión reconocido por dicha proteína ISP3. Las proteínas preferidas de control de insectos para combinar con las proteínas ISP3 de esta invención, particularmente por medio de una expresión simultánea en plantas, preferiblemente plantas de maíz, algodón, arroz o soya, incluyen las proteínas Cry, tales como la proteína CryI F o los híbridos derivados de una proteína CryI F (p.ej., las proteínas híbridas Cry1A-Cry1 F descriptas en US 6326169; US 6281016; US 6218188, o fragmentos tóxicos de las mismas), las proteínas tipo CryIA o fragmentos tóxicos de las mismas, preferiblemente la proteína CryIAc o híbridos derivados de la proteína CryIAc (p.ej., la proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descripta en US 5880275) o la proteína CryIAb o Bt2, o fragmentos insecticidas de la misma, como se describe en EP451878, las proteínas Cry2Ae, Cry2Af o Cry2Ag descriptas en WO02/057664, las proteínas Cry descriptas en WO01/47952, la proteína VIP3Aa o un fragmento tóxico de la misma, como se describe en Estruch et al. (1996) y US 6291156, proteínas insecticidas de cepas de especies de Xenorhabdus (como se describe en WO98/50427), Serratia (particularmente de S. entomophUa) o Photorhabdus, tales como las proteínas Tcde Photorhabdus, como se describe en WO98/08932 (p.ej., Waterfield et al., 2001 ; Ffrench-Constant y Bowen, 2000). En una modalidad, dicha coexpresión se obtiene fácilmente transformando una planta que ya expresa una proteína de control de insectos con una secuencia ISP3 de esta invención, cruzando plantas transformadas con la proteína de control de insectos y plantas transformadas con una o más proteínas ISP de esta invención. Para las plantas de maíz, arroz, algodón o soya, se usa preferiblemente la proteína ISP3-327D, la proteína ISP3-1099E o la proteína ISP3-2245J como primera proteína de control de insectos, y, como segunda proteína de control de insectos, las proteínas CryIAb, CryIAc, Cry2Ae o VIP3Aa, o derivados de las mismas. Los métodos para obtener la expresión de distintas proteínas insecticidas Bt (o, en forma semejante, para otras proteínas de control de insectos) en la misma planta, en un esfuerzo para minimizar o prevenir el desarrollo de resistencia en plantas transgénicas resistentes a insectos, se describen en EP 0 408 403. Se comprende que las distintas proteínas pueden expresarse en la misma planta, o cada una puede expresarse en una planta diferente y luego pueden combinarse en la misma planta, al cruzar plantas individuales entre sí. P.ej., en la producción de semillas híbridas, cada planta progenitora puede expresar una única proteína. Al cruzar las plantas progenitoras para producir híbridos, se combinan ambas proteínas en la planta híbrida. Es bien conocido que las proteínas Bt Cry se expresan como protoxinas, que se convierten en el núcleo tóxico mediante una proteólisis en el intestino del insecto. Cuando se combinan las proteínas ISP3 de la invención con proteínas Bt Cry, se comprende que pueden usarse los genes Bt Cry que codifican la protoxina completa, el núcleo tóxico o cualquier forma intermediaria. Preferiblemente, para propósitos de selección, pero también para incrementar las opciones de control de malezas, se transforman también las plantas transgénicas de la invención con un ADN que codifica una proteína que confiere resistencia a un herbicida de amplio espectro, p.ej., herbicidas basados en glufosinato o glifosato. La parte del gen isp3 efectiva como insecticida o su equivalente, preferiblemente el gen quimérico isp3, que codifica una porción efectiva como insecticida de la proteína ISP3, puede insertarse en forma estable de una forma convencional en el genoma nuclear de una célula vegetal individual, y la célula vegetal transformada de este modo puede usarse de forma convencional para producir una planta transformada que es resistente a insectos. Respecto de esto, puede usarse un vector de ADN-T, que contiene una parte de un gen ¡sp3 efectiva como insecticida, en Agrobacteríum tumefaciens, para transformar la célula vegetal, y, a partir de allí, puede regenerarse una planta transformada a partir de la célula vegetal transformada usando los procedimientos que se describen, p.ej., en EP 0 1 16 718, EP 0 270 822, la publicación PCT WO 84/02913 y la solicitud publicada de patente europea EPO 242 246, y en Gould et al. (1991 ). La construcción de un vector de ADN-T para la transformación mediada por Agrobacteríum de células vegetales es bien conocida en la técnica. El vector de ADN-T puede ser un vector binario, como se describe en EP 0 120 561 y EP 0 120 515, un vector de co-integración, que puede integrarse en el plásmido Ti de Agrobacteríum por recombinación homologa, como se describe en EP 0 1 16 718. Los vectores de ADN-T preferidos contienen cada uno un promotor unido operativamente a la parte del gen isp3 efectiva como insecticida, entre las secuencias borde del ADN-T, o al menos localizado a la izquierda de la secuencia de borde derecho. Se describen secuencias borde en Gielen et al. (1984). Por supuesto, pueden usarse otros tipos de vectores para transformar la célula vegetal, usando procedimientos tales como la transferencia directa de genes (como se describe, p.ej., en EP O 223 247), transformación mediada por polen (como se describe, p.ej., en EP 0 270 356 y WO 85/01856), transformación mediada por protoplastos, como se describe, p.ej., en US 468461 1 , transformación mediada por virus de ARN vegetal (como se describe, p.ej., en EP 0 067 553 y US 4407956), transformación mediada por liposomas (como se describe, p.ej., en US 4536475), y otros métodos, tales como los métodos recientemente descriptos para transformar determinadas líneas de maíz (p.ej., US 6140553; Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990) y arroz (Shimamoto et al., 1989; Datta et al. 1990) y el método para transformar monocotiledóneás en general (publicación PCT WO 92/09696). Para la transformación de algodón, se prefiere especialmente el método descripto en la publicación de patente PCT WO 00/71733. Para la transformación de arroz, puede hacerse referencia a los métodos descriptos en WO92/09696, WO94/00977 y WO95/06722. El término "maíz" se usa en la presente documentación para hacer referencia a Zea mays. Algodón, como se lo usa en la presente documentación, se refiere a Gossypium spp., particularmente G. hirsutum y G. barbadense. El término "arroz" se refiere a Oryza spp., particularmente O. sativa. "Soya" se refiere a Glycine spp, particularmente G. max. Además de la transformación del genoma nuclear, también se incluye en la invención la transformación del genoma de plástidos, preferiblemente el genoma de los cloroplastos. Kota et al. (1999) describieron un método para sobreexpresar una proteína Cry2Aa en cloroplastos de tabaco. Puede usarse la planta transformada resultante en un esquema convencional de cultivo de plantas, para producir más plantas transformadas con las mismas características, o para introducir la parte del gen isp3 efectiva como insecticida en otras variedades de la misma especie de planta, o en especies relacionadas. Las semillas, que se obtienen de las mismas plantas transformadas, contienen la parte del gen isp3 efectiva como insecticida como un inserto estable en el genoma. Pueden cultivarse las células de la planta transformada de forma convencional para producir la porción efectiva como insecticida de la toxina o proteína ISP3, que pueden recuperarse para usare en composiciones insecticidas convencionales contra lepidópteros (US 5254799). Se inserta la parte del gen isp3 efectiva como insecticida en el genoma de una célula vegetal, de modo que el gen insertado queda río abajo (es decir, 3') y bajo el control de un promotor que puede dirigir la expresión de la parte del gen en una célula vegetal. Esto se logra preferiblemente insertando el gen quimérico isp3 en el genoma de la célula vegetal, particularmente en el genoma nuclear o de los plástidos (p.ej., cloroplastos). Los promotores preferidos incluyen: los promotores constitutivos fuertes 35S (los "promotores 35S") del virus en mosaico de la coliflor (CaMV) obtenidos a partir de formas aisladas de CM 1841 (Gardner et al., 1981 ), CabbB-S (Franck et al., 1980) y CabbB-JI (Hull y Howell, 1987); el promotor 35S descripto por Odell et al. (1985), los promotores de la familia de las ubiquitinas (p.ej., el promotor de ubiquitina de maíz de Christensen et al., 1992, EP 0 342 926, véase también Cornejo et al., 1993), el promotor gos2 (de Pater et al., 1992), el promotor emú (Last et al., 1990), los promotores de actina de Arabidopsis tal como el promotor descripto por An et al. (1996), los promotores de actina de arroz tal como el promotor descripto por Zhang et al. (1991 ) y el promotor descripto en la Patente de EE.UU. N°: 5.641.876; los promotores del virus en mosaico de Cassava (WO 97/48819, Verdaguer et al. (1998)), la serie de promotores pPLEX del virus enano de trébol subterráneo (WO 96/06932, en particular el promotor S7), un promotor de alcohol deshidrogenasa, p.ej., pAdhI S (GenBank N° de acceso X04049, X00581 ), y los promotores TR1 ' y TR2' (el "promotor TR1 '" y "promotor TR2'", respectivamente) que dirigen la expresión de los genes 1' y 2', respectivamente, del ADN-T (Velten et al., 1984). Como alternativa, se puede usar un promotor que no sea constitutivo, sino que sea específico para uno o varios tejidos u órganos de la planta (p.ej., hojas y/o raíces) por lo cual la porción insertada del gen isp3 solamente se expresa en las células de uno o más tejidos u órganos específicos. P.ej., la porción del gen isp3 eficaz como insecticida se podrá expresar selectivamente en las hojas de una planta (p.ej., maíz, algodón, arroz, soya) al ubicar dicha porción del gen eficaz como insecticida bajo el control de un promotor inducible por luz, tal como el promotor del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa de la misma planta o de una planta diferente, tal como haba, como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 5.254.799. El promotor se puede elegir, p.ej., de manera tal que el gen isp3 de la invención solamente se exprese en aquellos tejidos o células de las que se alimenta la plaga de insecto, de modo que la alimentación por el insecto blanco susceptible dará como resultado una reducción en los daños ocasionados por los insectos en la planta huésped, en comparación con las plantas que no expresan dicho gen isp3. Por consiguiente, se podrá controlar eficazmente una plaga ocasionada por insectos lepidópteros que afectan principalmente las raíces por medio de la expresión del gen isp3 bajo un promotor específico de raíces. En la publicación WO 00/29566Un se describe un promotor preferencialmente activo en raíces. Un promotor preferido para una expresión preferencia en raíces es el promotor ZRP (y las modificaciones del mismo) que se describe en la Patente de EE.UU. N°: 5.633.363. Otra alternativa comprende el uso de un promotor cuya expresión sea inducible.p.ej.un promotor inducible por lesiones, tal como p.ej. el promotor MPI descripto por Cordera et al.(1994), que es inducido por las lesiones (tal como las causadas por la alimentación de insectos), o un promotor inducible por una sustancia química, tal como dexametasona como describieron Aoyama y Chua (1997) o un promotor inducible por temperatura, tal como el promotor de shock de calor que se describe en la Patente de EE.UU. N°: 5.447.858, o un promotor inducible por otros estímulos externos. La porción del gen isp3 eficaz como insecticida se inserta en el genoma vegetal, de modo que la porción insertada del gen se encuentre en posición 5' de señales reguladoras de la transcripción del extremo 3' adecuadas (es decir, señales de formación del transcripto y de poliadenilación). Esto se logra preferentemente por inserción del gen quimérico isp3 en el genoma de las células vegetales. Las señales de poliadenilación y de formación del transcripto preferidas incluyen las del gen 35S CaMV, del gen de la nopalina sintetasa (Depicker et al., 1982), del gen de la octopina sintetasa (Gielen et al., 1984) y del gen 7 del ADN-T (Velten y Schell, 1985), que actúan como secuencias de ADN no traducidas 3' en las células vegetales transformadas. La introducción del vector de ADN-T en Agrobacteríum se puede llevarse a cabo usando métodos conocidos, tal como electroporación o conjugación. La porción del gen isp3 eficaz como insecticida se puede insertar optativamente en el genoma vegetal como un gen híbrido (Patente de EEUU N°5.254.799; Vaeck et al. ,1987) bajo el control del mismo promotor que un gen marcador seleccionable o calificable, tal como el gen neo (EP 0 242 236) que codifica resistencia a kanamicina, de modo que la planta expresa una proteína de fusión que es fácilmente detectable. También se puede usar transformación de células vegetales para producir grandes cantidades de las proteínas de la invención en los cultivos de células vegetales, p.ej., para producir una proteína ISP3 que luego se podrá aplicar sobre los cultivos después de una formulación apropiada. Cuando aquí se hace referencia a una célula vegetal transgénica, se relaciona con una célula vegetal (o también un protoplasto vegetal), ya sea aislada o en cultivo de tejidos, o a una célula vegetal (o protoplasto) contenida en una planta o en un órgano o tejido diferenciado, y ambas posibilidades están incluidas específicamente en este documento. Por lo tanto, la referencia a una célula vegetal en la memoria descriptiva o en las reivindicaciones no se relaciona solamente con células aisladas en cultivo, sino a cualquier célula vegetal, cualquiera sea su ubicación o tipo de tejido u órgano vegetal en que se encuentra. Todo o parte del isp3 gen, que codifica una proteína anti-Lepidóptero.también se puede usar para transformar otros microorganismos, p.ej., bacterias, tal como B. thuringiensis que posee actividad insecticida contra Lepidópteros o Coleópteros. De esa manera se puede producir una cepa Bt transformada que es de utilidad para combatir un amplio espectro de plagas por insectos Lepidópteros y/o Coleópteros o para combatir otras plagas de insectos Lepidóptero. La transformación de bacterias, tal como bacterias de los géneros Pseudomonas, Agrobacterium, Badil us o Escherichia, con todo o parte del gen isp3 de esta invención, incorporado en un vehículo de clonación adecuado, se puede llevar a cabo de manera convencional, preferentemente usando las técnicas convencionales de electroporación como se describe en ahillon et al. (1989) y en la publicación de Patente PCT WO 90/06999. Las cepas de las especies de Bacillus transformadas que contienen el gen isp3 de esta invención se pueden utilizar en fermentaciones con métodos convencionales (Dulmage, 1981 ; Bernhard y Utz, 1993) con el fin de proveer altos rendimientos de células. Bajo las condiciones de crecimiento apropiadas, que son bien conocidas, estas cepas secretan proteínas ISP3 con grandes rendimientos. Los microorganismos huésped adecuados alternativos en los cuales se puede expresar el gen isp3s son hongos, algas o virus,en particular, especies que son colonizadoras de plantas(p.ej..especies (endo)simbióticas o patógenos de insectos. La composición insecticida, en particular anti-Lepidóptera, de esta invención se puede formular de manera convencional usando los microorganismos transformados con el gen isp3, o preferentemente sus respectivas proteínas ISP3 o toxinas ISP3, o una porción de toxina eficaz como insecticida como ingrediente activo, junto con vehículos, diluyentes, emulsionantes y/o dispersantes adecuados (p.ej., como describen Bernhard y Utz, 1993). Esta composición insecticida se puede formular como un polvo, pelets, gránulos o polvos humectables o como una formulación líquida con solventes acuosos o no acuosos, tal como una espuma, gel, suspensión, concentrado, etc.. Los ejemplos de composiciones que comprenden esporas insecticidas de Bt se describen en la publicación WO96/10083. Un método para controlar insectos, en particular Lepidópteros, acorde con esta invención comprende la aplicación (p.ej., por rociado), a un locus (área) a proteger, de una cantidad insecticida de las proteínas ISP3 o composiciones que comprenden las proteínas ISP3 o que comprenden células huésped transformadas con el gen isp3s de esta invención. Los locus a proteger incluyen, p.ej., el hábitat de las plagas de insecto o la vegetación de cultivo (p.ej., una aplicación al follaje) o al área donde se cultivará la vegetación (p.ej., una aplicación al suelo o al agua). Una composición preferida comprende una cantidad insecticida de al menos una de las proteínas ISP3 de la invención, producidas preferentemente por un huésped bacteriano, y las aplicaciones preferidas de la composición comprenden aplicación a las hojas, aplicación a la tierra o como recubrimientos de semillas. El término "contacto" como se utiliza aquí significa "por en contacto físico con". Poner una planta en contacto con una proteína insecticida significa que la proteína insecticida se pone en contacto físico con las células de la planta, ya sea internamente (p.ej., por expresión en la planta) o externamente (p.ej., por aplicación externa sobre la planta de composiciones que comprenden la proteína insecticida). Se considera que el término no indica el tiempo de contacto, pero comprende cualquier período de tiempo de contacto (p.ej., un contacto breve, un contacto prolongado). Cuando se hace referencia a un método de protección de una planta contra daños causados por insectos que comprende poner dicha planta (o células o tejidos de la misma) en contacto con una proteína insecticida de la invención, se prefiere que dicho contacto sea suficientemente prolongado y extenso (con una cantidad suficiente de proteína que toma contacto con una gran cantidad de células) como para impedir o reducir los daños ocasionados por insectos. Esta invención se relaciona además con un método para controlar plagas de insectos Lepidópteros en algodón, en particular orugas, gusanos cogolleros, orugas de la espiga, preferentemente una plaga de insectos Lepidópteros en algodón seleccionada del grupo formado por Helicoverpa zea (oruga de la espiga de maíz), Helicoverpa armígera (oruga del algodón), Helicoverpa punctigera (oruga de los retoños de tabaco), Heliothis virescens (gusano cogollero de tabaco), Spodoptera frugiperda (oruga militar tardía) y Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), comprendiendo dicho método la aplicación a un área o planta a proteger, de una proteína ISP3 definida en este documento, preferentemente una proteína ISP3-1099E y/o una proteína ISP3-327D y/o proteína ISP3-2245J, todas definidas en este documento, (es decir, el contacto de una planta de algodón @con una proteína ISP3 de esta invención, p.ej. mediante la siembra de una planta de algodón transformada con un gen isp3 de esta invención, o rociado con una composición que contiene una proteína ISP3 de esta invención). La invención también se relaciona con el uso de las proteínas ISP3 de esta invención, en particular la proteína ISP3-1099E y/o la proteína ISP3-327D y/o la proteína ISP3-2245J, contra Plagas de insectos Lepidópteros en algodón con el fin de minimizar los daños ocasionados en plantas de algodón. Esta invención se relaciona además con un método para controlar plagas de insectos Lepidópteros en maíz, en particular orugas de la espiga, orugas militar, barrenador de maíz, preferentemente una plaga de insectos en maíz seleccionada del grupo formado por Helicoverpa zea (oruga de la espiga de maíz), Agrotis ípsilon (gusano cortador negro), Ostrínia nubilalis (barrenador de maíz europeo) y Spodoptera frugiperda (oruga militar tardía), comprendiendo dicho método la aplicación a un área o planta a proteger, de una proteína ISP3 definida en este documento, preferentemente una proteína ISP3-1099E y/o una proteína ISP3-327D y/o una proteína ISP3-2245J, todas definidas en este documento, (es decir, el contacto de una planta de maíz con una proteína ISP3 de esta invención, p.ej. mediante la siembra de una planta de maíz transformada con un gen isp3 de esta invención, o el rociado con una composición que contiene una proteína ISP3 de esta invención). La invención también se relaciona con el uso de las proteínas ISP3 de esta invención, en particular la proteína ISP3-1099E y/o la proteína ISP3-327D y/o la proteína ISP3-2245J, contra plagas de insectos Lepidópteros en maíz con el fin de minimizar los daños ocasionados en plantas de maíz. Esta invención se relaciona además con un método para controlar plagas de insectos Lepidópteros en arroz, en particular barrenadores del tallo de arroz, gusano saltador de arroz, gusanos cortadores de arroz, orugas militares de arroz, orugas de arroz, dobladores de hojas o envainados de arroz, preferentemente una plaga de insectos en arroz seleccionada del grupo formado por barrenador del tallo amarillo (Scirphophaga incertulas), gusano doblador de hojas o envainado {Cnaphalocrocis medinalis), barrenador del tallo rosa {Sesamia inferens) y barrenador moteado del tallo de maíz (Chilo partellus), comprendiendo dicho método la aplicación a un área o planta a proteger, de la proteína ISP3 definida en este documento, preferentemente una proteína ISP3-1099E y/o una proteína ISP3-327D y/o una proteína ISP3-2245J, todas definidas en este documento, (es decir, el contacto de una planta de arroz con una proteína ISP3 de esta invención, p.ej. mediante la siembra de una planta de arroz transformada con un gen isp3 de esta invención, o rociado con una composición que contiene una proteína ISP3 de esta invención). La invención también se relaciona con el uso de las proteínas ISP3 de esta invención, en particular la proteína ISP3-1099E y/o la proteína ISP3-327D y/o la proteína ISP3-2245J, contra plagas de insectos Lepidópteros en arroz con el fin de minimizar los daños ocasionados en plantas de arroz. Esta invención se relaciona además con un método para controlar plagas de insectos Lepidópteros en soya, preferentemente una plaga de insectos en soya seleccionada del grupo formado por oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), gusano falso medidor de soya (Pseudoplusia includens), oruga militar {Spodoptera exigua), oruga militar de manchas amarillas (Spodoptera ornithogalli), oruga de la espiga de maíz (Helicoverpa zea), barrenador de vainas (Epm' otia aporema) y Rachiplusia nu, comprendiendo dicho método la aplicación a un área o planta a proteger, de la proteína ISP3 definida en este documento, preferentemente la proteína ISP3-1099E y/o la proteína ISP3-327D y/o la proteína ISP3-2245J,todas definidas en este documentóles decir.el contacto de una planta de soya con una proteína ISP3 de esta invención.p.ej. mediante la siembra de una planta de soya transformada con un gen isp3 de esta invención, o rociado con una composición que contiene una proteína ISP3 de esta invención), a invención también se relaciona con el uso de las proteínas ISP3 de esta invención, en particular la proteína ISP3-1099E y/o la proteína ISP3-327D y/o la proteína ISP3-2245J .contra plagas de insectos Lepidópteros en soya con el fin de minimizar los daños ocasionados en plantas de soya. Para obtener la toxina o proteína ISP3, se pueden cultivar células de los huéspedes recombinantes que expresan la proteína ISP3 de manera convencional sobre un medio de cultivo adecuado. La toxina secretada se puede separar y purificar a partir del medio de crecimiento. Como alternativa, si no se secretan las proteínas, se pueden lisar las células usando medios convencionales, tal como degradación enzimática o detergentes o semejantes. Después se puede separar y purificar la toxina utilizando técnicas estándar, tal como cromatografía, extracción, electroforesis o semejantes. El término "gen" se refiere a cualquier fragmento de ADN o ARN que comprende una región (la "región transcripta") que se transcribirá en una molécula de ARN (p.ej., un ARNm) en una célula, ligado operativamente a regiones reguladoras adecuadas, p.ej., un promotor de expresión en plantas. El gen puede entonces comprender varios fragmentos ligados operativamente, tal como un promotor, una secuencia directriz 5', una región de codificación y una secuencia no traducida 3', que comprenden un sitio de poliadenilación. Un gen endógeno para un organismo particular (tal como una especie vegetal o una cepa bacteriana) es un gen que habitualmente se encuentra en dicho organismo en la naturaleza. Un gen quimérico, con referencia al ADN isp3 de esta invención, se refiere a una secuencia de ADN isp3 que posee secuencias reguladoras 5' y/o 3' diferentes de las secuencias reguladoras 5' y/o 3' bacterianas naturales, que dirigen la expresión del gen isp3 en su célula huésped nativa. El término "expresión de un gen" se refiere a un proceso en el cual una región de ADN o ARN que está ligada operativamente a regiones reguladoras apropiadas, en particular a un promotor, es transcripto en un ARN que es biológicamente activo, es decir, que puede interactuar con otro ácido nucleico o que puede ser traducido en un polipéptido o una proteína biológicamente activo. Se dice que un gen codifica un ARN cuando el producto final de la expresión del gen es un ARN biológicamente activo, tal como p.ej. un ARN antisentido, una ribozima o un intermediario de replicación. Se dice que un gen codifica una proteína cuando el producto final de la expresión del gen es una proteína o un polipéptido biológicamente activo. A los efectos de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere a la cantidad de posiciones en las dos secuencias alineadas de forma óptima que poseen residuos idénticos (x100) dividida por la cantidad de posiciones comparadas. Una falta de coincidencia o hueco, es decir una posición en la alineación donde hay un residuo en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición que no contiene residuos idénticos. Para calcular la identidad de secuencia entre dos secuencias a los efectos de esta invención, se utiliza el programa GAP, que emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) y que es provista con el Wisconsin Package, Versión 10.2, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 5371 1 , EE.UU.. Los parámetros de GAP utilizados son: una restricción para la creación de huecos = 50 (nucleótidos) / 8 (aminoácidos), una restricción de extensión de huecos = 3 (nucleótidos) / 2 (aminoácidos) y una matriz de puntuación "nwsgapdna" (nucleótidos) o "blosum62" (aminoácidos). El programa GAP emplea el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizar la cantidad de coincidencias y minimizar la cantidad de huecos. Los parámetros predeterminados son una restricción para la creación de huecos = 50 (nucleótidos) / 8 (proteínas) y una restricción para la extensión de huecos = 3 (nucleótidos) / 2 (proteínas). Para nucleótidos, la matriz de puntaje predeterminada que se utiliza es "nwsgapdna" y para proteínas, la matriz de puntaje predeterminada que se utiliza es "blosum62" (Henikoff & Henikoff, 1992). Estas y/u otras formas de modalidad de esta invención están reflejadas en los términos de las reivindicaciones, que forman parte de la memoria descriptiva de la invención. Los siguientes Ejemplos ilustran la invención y no pretenden limitar la invención o la protección solicitada. El listado de secuencias a la cual se hace referencia en los ej.Jas reivindicaciones y la memoria descriptiva comprende: SEQ ID N°: 1 : Secuencia de ADN isp3-1099E SEQ ID N°: 2: Secuencia de aminoácidos ISP3-1099E SEQ ID N°: 3: Secuencia de ADN isp3-327D SEQ ID N°: 4: Secuencia de aminoácidos ISP3-327D SEQ ID N°: 5: Secuencia de ADN de isp3-2245J SEQ ID N°: 6: Secuencia de aminoácidos de ISP3-2245J A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos estándar que se describen en Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Tercera Edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EEUU y en los Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda edición.Academic Press (Reino Unido). Los materiales y métodos estándar utilizados para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D.Croy, publicada conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackweii Scientific Publications, Reino Unido.Los materiales y métodos estándar utilizados para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden consultar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer.A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, Primera edición, Springer Verlag, Alemania.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Caracterización de las cepas bacterianas Se aisló una cepa bacteriana, aquí denominada BTS01099E, a partir de polvo de granos de Bélgica. Se aisló otra cepa bacteriana, aquí denominada BTS00327D, de excremento de caballo de España. También se aisló otra cepa bacteriana, aquí denominada BTS02245J, a partir de polvo de granos de las Filipinas. Cada cepa se cultivó durante la noche sobre placas de agar LB (medio LB con adición de agar 1.5%; medio LB: triptona 10 g/l, NaCI 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, pH 7.3) a 28°C. Para los cultivos a pequeña escala, se inocularon 20 mi de medio TB (Caldo Terrifíc: triptona 12 g/l, extracto de levadura 24 g/l, KH2P04 3.8 g/l, K2HP04 12.5 g/l, glycerol 5 ml/l, pH 7.1 ) y se cultivaron durante 65 horas a 28°C sobre una plataforma rotatoria con aproximadamente 70 rotaciones por minuto. Después de 65 horas, se agregó una mezcla de inhibidores de proteasas al cultivo. Este cóctel posee los siguientes ingredientes (los volúmenes indicados son los requeridos para un cultivo de 20 mi): 200 µ? de PMSF (100 mM), 200 µ? de una mezcla de benzamidina.HCI (100 mM) y ácido épsilon-amino-n-caproico (500 mM), 400 µ? de EGTA (0.5 M), 40 µ? de antipaína (0.5 mg/m!)/leupeptina (0.5 mg/ml) y 20 µ? de beta-mercapto etanol (14 M).

Posteriormente se centrifugó el medio de cultivo al cual se le había agregado la mezcla de inhibidores de proteasas durante 20 minutos a 3000 rpm. En algunos casos, el sobrenadante se concentró aproximadamente 4 veces usando dispositivos de filtro de centrífuga Centriprep YM-10 ( illipore N° Cat. 4305). Para el almacenamiento a largo plazo, se agregó el contenido de una asa de células esporuladas a 0.5 mi de glicerol 25% y, después de vortexeo, se guardó todo a -70 °C. Las células esporuladas se obtuvieron por crecimiento de la cepa sobre placas de agar LB hasta la etapa de esporulación (visible con microscopio óptico). Después del cultivo de colonias de células individuales sobre placas de agar LB, el análisis microscópico de los cultivos de las cepas BTS01099E, BTS00327D y BTS02245J confirmó la presencia de células vegetativas individuales, móviles, con forma de bastón y de esporangios que contenían una espora de forma ovalada. Se detectaron cristales parasporales en los cultivos de BTS00327D, BTS01099E y BTS02245J. Se considera que estas 3 cepas son cepas de la especie B. thuringiensis basado en la forma de bastón, el crecimiento aeróbico y la presencia de cristales parasporales. Cada cepa puede ser cultivada sobre medios estándar convencionales, preferentemente medio T3 (triptona 3 g/l, triptosa 2 g/l, extracto de levadura 1.5 g/l, 5 mg de MnCI2, Na2HP04.2H20 0.05 , NaH2PO4.H20 0.05 M, pH 6.8 y agar 1.5%), preferentemente a 28 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, se prefieren mezclar volúmenes iguales de una suspensión de esporas-cristales y glicerol 50% y guardar esta mezcla a -70 °C o liofilizar la suspensión de esporas-cristales. Para la esporulación, se prefiere el crecimiento sobre medio T3 durante 72 horas a 28 °C.

EJEMPLO 2 Bioensayos en insectos con cepas de Bacillus (usando un sobrenadante de cultivo que contiene proteínas insecticidas) Los bioensayos se llevaron a cabo con larvas neonatas de Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda y Agrotis ípsilon. Se usó un sobrenadante libre de células de cultivos bacterianos de diferentes cepas de Bacillus en los bioensayos con insectos ("ensayo de contaminación de superficie") dirigidos contra diversos insectos lepidópteros. Se cultivaron las cepas BTS01099E, BTS00327D o BTS02245J a 28°C en medio TB. Se cosechó un sobrenadante de cultivo libre de células 65 horas después de haber iniciado el cultivo, se obtuvieron diluciones del mismo y se aplicaron sobre la superficie de un alimento artificial solidificado (20 g de agar, 1000 mi de agua, 96 g de harina de maíz, 30 g de levadura, 64 g gérmen de trigo, 7.5 g de sales de Wesson, 15 g caseína, 2 g ácido sórbico, 0.3 g de aureomicina, 1 g de nipagina, 4 mi de aceite de gérmen de trigo, 15 g sacarosa, 1 g colesterol, 3.5 g ácido ascórbico, 12 g de mezcla de vitaminas Vanderzand modificada) (basada en Vanderzand 1962), dispuesto en cavidades de placas de 48 cavidades Costar, y se dejó solidificar. Se aplicaron 25 µ? de solución de sobrenadante sobre la superficie de cada cavidad (1 cm2). Se colocó una larva de insecto neonata (L1 ; primer instar) en cada cavidad y se usaron 18-20 larvas por muestra. Los discos se mantuvieron a 25 ± 1 °C y se registraron los índices de mortalidad (porcentaje de larvas muertas versus larvas vivas) después de 7 días. Como control negativo se usó dieta estándar y TB. Los resultados (se muestran en el siguiente cuadro 1 ) muestran que los sobrenadantes libres de células de las cepas BTS01099E, BTS00327D y BTS02245J presentaban toxicidad para larvas de Heliothis virescens, Helicoverpa zea y Ostrínia nubilalis. Además, el sobrenadante de la cepa BTS02245J también mostró toxicidad para larvas de Spodoptera frugiperda y el sobrenadante de BTS00327D mostró toxicidad para larvas de Agrotís ípsilon.

CUADRO 1 Hv: Heliothis virescens, Hz: Helicoverpa zea; On: Ostrínia nubilalis, Sf: Spodoptera frugiperda; Ai: Agrotís ípsilon; Ne: no evaluado Controles negativos (dieta estándar): BTS02245J - Hv 9%, Hz 0%, On 0%, Sf 0% BTS00327D - Hv 10%, Hz 6%, On 4%, Ai 0% BTS01099E - Hv 10%, Hz 0%, On 0% Observaciones adicionales: ic: inhibición del crecimiento de las larvas (larvas todavía vivas en la etapa de instar L1/L2 después de 7 días) ir: crecimiento irregular de las larvas (una proporción de larvas vivas en la etapa de instar L1/L2, una proporción de larvas vivas en la etapa de instar L3/L4 después de 7 días) El sobrenadante libre de células de la cepa BTS02245J causó un 1 1% y 33% de mortalidad de larvas de H. virescens, un 94% y 50% de mortalidad de larvas de H. zea, un 50% de mortalidad de larvas de O.nubilalis y un 78% de mortalidad de larvas de S. frugiperda, lo cual muestra que el sobrenadante de esta cepa posee actividad insecticida, en particular contra H.zea y S.frugiperda. La toxicidad se debe probablemente a la presencia de una proteína secretada por esta cepa hacia el medio de cultivo. El sobrenadante libre de células de la cepa BTS00327D causó un 70% de mortalidad de larvas de H. virescens, un 35% a 78% de mortalidad de larvas de H. zea, un 100% de mortalidad de larvas de O.nubilalis y un 100% de mortalidad de larvas de Agrotis Ípsilon. Por consiguiente, el sobrenadante de esta cepa mostró una fuerte toxicidad para al menos cuatro especies diferentes de insectos lepidópteros. La toxicidad probablemente se deba a la presencia de una proteína con actividad insecticida secretada por esta cepa hacia el medio de cultivo. El sobrenadante libre de células de la cepa BTS01099E causó un 25% de mortalidad de larvas de H. virescens, un 10% de mortalidad de larvas de H. zea y un 46% de mortalidad de larvas de O. nubilalis, lo cual es indicativo de que el sobrenadante de esta cepa posee actividad tóxica contra especies diferentes de insectos lepidópteros. La toxicidad probablemente se deba a la presencia de una proteina con actividad insecticida secretada por esta cepa hacia el medio de cultivo.

EJEMPLO 3 Clonación de genes ¡sp3 Clonación de la secuencia de nucleótidos codificadora de ISP3- 1099E de la cepa BTS01099E Se preparó ADN total de la cepa BTS01099E y se digirió parcialmente con Sa¿/3A.EI ADN digerido se fraccionó por tamaño sobre gradiente de sacarosa.Los fragmentos del rango entre 7kb y 10kb fueron ligados al vector de clonación pUC19l (un derivado del pUC19;Yannisch-Perron et al. 1985), después de digestión con BamHI y tratamiento del vector de clonación con TsAP (fosfatasa alcalina sensible al calor). La mezcla de ligación fue sometida luego a electroporación en células XL1-Blue de E.coli. Los transformantes fueron plaqueados sobre placas LB-thacil¡na que contenían X-gal e IPTG y posteriormente se seleccionaron las colonias blancas para los experimentos de hibridación sobre filtro. A continuación.se utilizaron los clones recombinantes de E.coli que contenían el vector en pruebas con sondas marcadas con DIG que fueron preparadas de la siguiente manera. Primero se llevó a cabo una PCR usando como templado las células de la cepa BTS01099E.EI producto resultante de la amplificación se purificó sobre gel y se clonó en el pGEM-T.EI plásmido resultante se utilizó como templado en una reacción de PCR usando dNTP marcados con DIG y los mismos cebadores que en la primera reacción de PCR.Se utilizó una cantidad apropiada de este producto de amplificación en las reacciones de hibridación. Después de identificar una colonia positiva que contenia el plásmido con el gen isp3 de longitud completa, se determinó la secuencia de este gen usando el método de marcación con terminador colorante y un secuenciador de ADN Perkin Elmer ABI Prism-377. Se secuenciaron las dos cadenas, codificadora y no codificadora. La secuencia del marco de lectura encontrado en el fragmento de ADN clonado proveniente de una colonia positiva se muestra en la SEQ ID N°: 1 (¡sp3-1099E). Se encontró que esta secuencia de ADN codifica la nueva proteína que se muestra en la SEQ ID N°: 2 (ISP3-1099E). Para demostrar que esta secuencia de ADN es la causa de la actividad insecticida observada, se expresó dicha secuencia en una cepa bacteriana y luego se evaluó la actividad insecticida del sobrenadante o lisado celular de la cepa recombinante en bioensayos con insectos.

Clonación de la secuencia de nucleótidos que codifica ISP3-327D de la cepa BTS00327D Se preparó ADN total de la cepa BTS00327D y se digirió parcialmente con Sau3A. El ADN digerido se fraccionó por tamaño sobre un gradiente de sacarosa. Los fragmentos en el rango entre 7kb y 10kb fueron ligados al vector de clonación pUC19l (un derivado del pUC19; Yannisch-Perron et al. 1985), después de digestión con 6amH1 y tratamiento del vector de clonación con TsAP (fosfatasa alcalina sensible al calor). La mezcla de ligación fue sometida luego a electroporación en células XL1-Blue de E.coli. Los transformantes fueron plaqueados sobre placas LB-triacilina que contenían X-gal e IPTG y posteriormente se seleccionaron las colonias blancas para los experimentos de hibridación sobre filtro. A continuación, se utilizaron los clones recombinantes de E. coli que contenían el vector en pruebas con sondas marcadas con DIG que fueron preparadas de la siguiente manera. Primero se llevó a cabo una PCR usando como templado las células de la cepa BTS00327D. El producto resultante de la amplificación se purificó sobre gel y se clonó en el pGEM-T. El plásmido resultante se utilizó como templado en una reacción de PCR usando dNTP marcados con DIG y los mismos cebadores que en la primera reacción de PCR. Se utilizó una cantidad apropiada de este producto de amplificación en las reacciones de hibridación. Después de identificar una colonia positiva que contenía el plásmido con el gen ¡sp3 de longitud completa, se determinó la secuencia de este gen usando el método de marcación con terminador colorante y un secuenciador de ADN Perkin Elmer ABI Prism-377. Se secuenciaron las dos cadenas, codificadora y no codificadora. La secuencia del marco de lectura encontrado en el fragmento de ADN clonado proveniente de una colonia positiva se muestra en la SEQ ID N° 3 (isp3-327D). Se encontró que esta secuencia de ADN codifica la nueva proteína que se muestra en la SEQ ID N° 4 (ISP3-327D). Para demostrar que esta secuencia de ADN es la causa de la actividad insecticida observada, se expresó dicha secuencia en una cepa bacteriana y luego se evaluó la actividad insecticida del sobrenadante o lisado celular de la cepa recombinante en bioensayos con insectos.

Clonación de la secuencia de nucleótidos que codifica ISP3-2245J de la cepa BTS02245J Se preparó ADN total de la cepa BTS02245J y se digirió parcialmente con Sau3A. El ADN digerido se fraccionó por tamaño sobre un gradiente de sacarosa. Los fragmentos en el rango entre 7kb y 10kb fueron ligados al vector de clonación pUC19l (un derivado del pUC19; Yannisch-Perron et al. 1985), después de digestión con SamH1 y tratamiento del vector de clonación con TsAP (fosfatasa alcalina sensible al calor). La mezcla de ligación fue sometida luego a electroporación en células XL1-Blue de E. coli. Los transformantes fueron plaqueados sobre placas LB-triacilina que contenían X-gal e IPTG y posteriormente se seleccionaron las colonias blancas para los experimentos de hibridación sobre filtro. A continuación, se utilizaron los clones recombinantes de E. coli que contenían el vector en pruebas con sondas marcadas con DIG que fueron preparadas de la siguiente manera. Primero se llevó a cabo una PCR usando como templado las células de la cepa BTS02245J. El producto resultante de la amplificación se purificó sobre gel y se clonó en el pGEM-T. El plásmido resultante se utilizó como templado en una reacción de PCR usando dNTP marcados con DIG y los mismos cebadores que en la primera reacción de PCR. Se utilizó una cantidad apropiada de este producto de amplificación en las reacciones de hibridación. Después de identificar una colonia positiva que contenía el plásmido con el gen isp3 de longitud completa, se determinó la secuencia de este gen usando el método de marcación con terminador colorante y un secuenciador de ADN Perkin Elmer ABI Prism-377. Se secuenciaron las dos cadenas, codificadora y no codificadora. La secuencia del marco de lectura encontrado en el fragmento de ADN clonado proveniente de una colonia positiva se muestra en la SEQ ID N° 5 (isp3-2245J). Se encontró que esta secuencia de ADN codifica la nueva proteína que se muestra en la SEQ ID N° 6 (ISP3-2245J). Para demostrar que esta secuencia de ADN es la causa de la actividad insecticida observada, se expresó dicha secuencia en una cepa bacteriana y luego se evaluó la actividad insecticida del sobrenadante o lisado celular de la cepa recombinante en bioensayos con insectos.

EJEMPLO 4 Expresión recombinante de las proteínas ISP3 en E. coli Las SEQ ID N° 1 (isp3-1099E), SEQ ID N° 3 {isp3-327D) y SEQ ID N° 5 (isp3-2245J) fueron subclonadas en un vector de expresión, bajo el control del promotor cryIAb, y expresadas en la cepa WK6 de E.coli. Durante la subclonación, se introdujo un sitio de restricción A/col en el codón de inicio ATG, con lo cual cambiaba el segundo aminoácido de las SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 y SEQ ID N° 6 de asparagina (Asn) por Aspartato (Asp). El análisis por SDS-PAGE de los lisados de células transformadas de E. coli mostró que se producían las proteínas del peso molecular esperado (± 88 kDa) para cada uno de los tres genes. Como controles negativos se usaron lisados celulares de la cepa WK6 no transformada de E. coli. Se utilizó el lisado de cultivos de células recombinantes de E. coli, que expresan isp3-327D e ¡sp3-1099E, en bioensayos con insectos (ensayos de contaminación de superficie) que se describen en el Ejemplo 5. Los resultados se resumen en el siguiente cuadro 2. Los símbolos de suma (+)indican una mortalidad significativa de insectos con respecto al control negativo.

CUADRO 2 Hz: Helicoverpa zea, Hz: Heliothis virescens, Sf: Spodoptera frugiperda, Dvv: Diabrotica virgifera virgifera, Ag: Anticarsia gemmatalis Bioensavos Hz: Contaminación de superficie sobre alimento de Heliothis en placas de 48 cavidades Costar, 25 pl/cavidad (1 cm2), 18 x 1 L1 por concentración Hv: Contaminación de superficie sobre alimento de Heliothis en placas de 24 cavidades Costar, 50 pl/cavidad (2 cm2), 20 x 1 L1 por concentración Sf: contaminación de superficie sobre alimento de Littoraíis en placas de 48 cavidades Costar; 25 pl/cavidad (1 cm2); 18 x 1 L1 por concentración Ag: contaminación de superficie sobre alimento de Littoralis en placas de 24 cavidades Costar, 50 µ?/cavidad (2 cm2), 12 x 2L1 por concentración Incubación a T: 25 ± 1 °C;Calificación después de 7 días Para la proteína ISP3-327D y la proteína ISP3-1099E, se encontró una mortalidad significativa en los ensayos de contaminación de superficie con Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Spodoptera frugiperda y Anticarsia gemmatalis. Además, el lisado celular no diluido de E. coli recombinante que expresaba ISP3-327D o ISP3-1099E mostró una mortalidad significativa contra Ostrinia nubilalis (50% (ic) de mortalidad para ISP3-327D, 26% (ic) de mortalidad para ISP3-1099E en comparación con 0% de mortalidad para el control WK6).

EJEMPLO 5 Expresión recombinante de proteínas ISP3 en Bt Se subclonaron las SEQ ID N°: 1 (isp3-1099E) y SEQ ID N°: 5 en un vector ambivalente y se expresaron en una cepa cristal menos de Bt (IPS 78/1 o Berliner 1715cry"). En los bioensayos, se utilizó el sobrenadante de la cepa no transformada de Bt como control negativo. Se evaluó el sobrenadante del cultivo libre de células de la cepa recombinante Bt por su toxicidad contra larvas de insectos Lepidópteros, en particular contra H. virescens, H. zea, H. armígera, O. nubilalis, S. frugiperda, Agrotis ípsilon, Pectinophora gossypiella y A. gemmatalis, usando un ensayo de contaminación de superficie como el que se describió previamente (Ejemplo 2) y más adelante (para determinar los valores de LC5o). El sobrenadante de la cepa recombinante Bt se obtuvo de la siguiente manera.

Se cultivó la cepa Bt durante la noche sobre placas de agar LB que contenían eritromicina (20 pg/ml) a 28 °C. Para los cultivos a pequeña escala, se inocularon 20 mi de medio TB que contenía eritromicina (20 pg/ml) y se dejó crecer durante 65 horas a 28 °C sobre una plataforma rotatoria de aproximadamente 70 rotaciones por minuto. Después de 65 horas, se agregó una mezcla de inhibidores de proteasas al cultivo. Este cóctel tiene los siguientes ingredientes (los volúmenes indicados son los requeridos para la adición en 20 mi de cultivo): 200 µ? de PMSF (100 mM), 200 µ? de una mezcla de benzamidina.HCI (100 mM) / ácido épsilon-amino-n-caproico (500 mM), 400 µ? EGTA (0.5 M), 40 pl antipaína (0.5 mg/ml) / leupeptina (0.5 mg/ml) y 20 µ? de beta-mercaptoetanol (14 M). A continuación, se centrífugo el medio de cultivo al cual se había agregado la mezcla de inhibidores de proteasas durante 20 minutos a 3000 rpm. En algunos casos, el sobrenadante se concentró aproximadamente 4 veces usando los dispositivos de filtro centrífuga Centriprep YM-10 (Millipore, N° Cat. 4305). Para Helicoverpa zea y Heliothis virescens se usó la siguiente dieta artificial en el ensayo de contaminación de superficie: agua, 1 litro; agar, 20 g; harina de soya, 81 g; gérmen de trigo, 36 g; mezcla de sales de Wesson, 10 g; sacarosa, 4.7 g; Nipagina, 1 g; ácido sórbico 1.1 g; mezcla de vitaminas Vanderzant, 9.5 g; aceite de maíz, 5 mi; Nistatina, 0.06 g; Aureomicina, 0.17g. En los ensayos de contaminación de superficie con los demás insectos lepidópteros, se usó la siguiente dieta artificial: agua, 1 litro; agar, 20 g; harina de maíz 112 g; gérmen de trigo, 28 g; levadura, 30 g; ácido sórbico, 1.2 g; Nipagina 1 g; Aureomicina, 0.06 g; Nistatina, 0.03 g; ácido ascórbico, 4.8 g. La dieta artificial se dispuso en las cavidades de placas Costar de 24 cavidades y se dejó solidificar. Se aplicaron 50 µ? de sobrenadante diluido sobre la superficie de cada cavidad (2 cm2). Se colocaron uno o dos larvas neonatas (L1 ; primer instar) sobre cada cavidad (según la especie, p.ej. para O. nubilalis 2 larvas/cavidad) y se usaron entre 20 y 24 larvas por dilución de sobrenadante. Se evaluaron entre seis y ocho diluciones de sobrenadante (con un factor de dilución de 3 aproximadamente), que variaban en un rango entre 4050 y 0.21 ng/cm2 aproximadamente. Las placas se mantuvieron a 25 ± 1 °C y se registraron los índices de mortalidad (porcentaje de larvas muertas versus vivas) después de 7 días. Como control negativo se usó la dieta estándar y TB. Los valores de LC50 y/o LC90 se calcularon con el análisis Probit usando el programa POLO PC (de LeOra Software, 1987, Berkely, California). El valor LC50 es la concentración total de proteína en el sobrenadante cuando muere el 50% de las larvas de insecto evaluadas. Los bioensayos muestran que las proteínas codificadas por las secuencias clonadas ¡sp3-1099E e isp3-2245J causaban, cada una, una actividad insecticida significativa contra los insectos Lepidópteros seleccionados. Se subclonó la SEQ ID N°: 3 (isp3-327D) en un vector ambivalente y se expresó en la cepa de Bt cristal menos IPS78/11. En los bioensayos, se usó el sobrenadante de la cepa de Bt no transformada como control negativo. El análisis por SDS-PAGE mostró que el sobrenadante del cultivo contenía una proteína con un peso molecular cercano al peso molecular calculado de la proteína ISP3-327D (± 88 kDa). En el ensayo de contaminación de superficie que se describió en el Ejemplo 2, el sobrenadante de cultivo libre de células de la cepa IPS78/11 de Bt que expresaba la SEQ ID N° 3 {isp3-327D) mostró una actividad insecticida significativa contra Ostrínia nubilalis (On),Pectinophora gossypiella (Pg) y Helicoverpa zea (Hz .como se muestra en el cuadro 3.

CUADRO 3 ic: inhibición del crecimiento de larvas / Dvv: Diabrotica virgifera virgifera Bioensayos Se utilizaron los ensayos de contaminación de superficie, descriptos previamente, usando sobrenadante concentrado después de 26 hs de cultivo en TB y adición del cóctel de inhibidores de proteasas. Se empleó la dieta artificial para Heliothis (indicada previamente) para H. zea y la dieta artificial de Littoralis para O. nubilalis y P. gossypiella. Para H. zea y O. nubilalis se usaron placas de 48 cavidades Costar, 25 µ?/cavidad (1 cm2), 18 cavidades con una larva L1 por cavidad. Para P. gossypiella se usaron placas de 24 cavidades Costar, 50 µ?/cavidad (2 cm2) y 12 cavidades con dos larvas L1 por cavidad. Se utilizó la dieta artificial de Dvv (indicada antes) para Dvv en placas de 24 cavidades, 50 µ?/cavidad (2 cm2), 6 cavidades con 4 L1 /cavidad. El bioensayo mostró que la proteína codificada por la secuencia clonada isp3-327D presenta una actividad insecticida significativa contra los insectos Lepidópteros seleccionados.

EJEMPLO 6 Caracterización adicional de 1SP3-327D Se utilizó el sobrenadante de la cepa de Bt cristal menos IPS78/1 1 que expresaba la SEQ ID N°: 3 (isp3-327D) a fin de evaluar la capacidad de digestión por tripsina de la proteína ISP3-327D y la toxicidad de los fragmentos resultantes. El tratamiento con tripsina del sobrenadante del cultivo transformado IPS78/1 1 dio como resultado dos bandas principales de aproximadamente 65 kDa y aproximadamente 23 kDa, determinadas mediante análisis por SDS-PAGE. Se utilizó tanto sobrenadante tratado con tripsina (4 horas de tratamiento; la reacción se detuvo con PMSF a una concentración final de 0.1 mM) como sobrenadante no tratado con tripsina en los ensayos de contaminación de superficie contra Helicoverpa zea. El ensayo de contaminación de superficie se llevó a cabo con alimento para Heliothis en placas de 48 cavidades (25 µ?/cavidad; 1 cm2). Se evaluaron seis diluciones de sobrenadante. Por dilución, se usaron 18 cavidades y una larva L1 por cavidad. La mortalidad se calificó después de incubación a 25 ± 1 °C después de 7 días. Los valores de LC50 para la proteína ISP3-327D no tratada y tratada con tripsina mostraron intervalos de confianza superpuesto del 90, indicativo que la proteína tratada con tripsina retiene su actividad tóxica con H. zea.

EJEMPLO 7 Bioensayos con insectos utilizando proteínas ISP3 recombinantes en arroz Se expresaron las secuencias para isp3-1099E (SEQ ID N°: 1 ), isp3-327D (SEQ ID N°:3) e ¡sp3-2245J (SEQ ID N°: 5) en E. coli como se describió previamente. Los lisados celulares de E. coli recombinante fueron evaluados en bioensayos con insectos por su actividad contra cuatro plagas de Lepidópteros en arroz. Se evaluaron cinco a seis dosis por proteína. (a) Bioensavo con barrenador de tallo amarillo (Scirphophaqa incertulas) Se recolectaron adultos de barrenadores de tallo amarillo en campos de arroz. Se recogieron los huevos que pusieron los adultos y se mantuvieron en cajas de Petri para su eclosión a 30°C. Se usaron larvas recién eclosionadas en los bioensayos. Se usaron hojas envainadoras de tallos de arroz de 6 cm. Se recortaron segmentos de seis centímetros de longitud de las hojas envainadoras de tallos de arroz recién cortadas de la variedad susceptible TN1. La porción más interna del segmento, junto con una cubierta de vainas, se sumergieron por separado en las diferentes dosis de proteínas durante 30 segundos. Las hojas envainadoras de los tallos tratadas se inmovilizaron verticalmente sobre 2 cm de gel de agar en los recipientes adecuados (7 cm de longitud; 2.5 cm de diámetro). Se ubicaron 10-15 larvas neonatas de barrenador de tallo amarillo a cada tallo tratado y los tubos se sellaron e incubaron durante cinco días. Después de 5 días, se efectuó un recuento de la cantidad de larvas muertas y sobrevivientes. (b) Bioensavo con gusano doblador de hojas o envainado (Cnaphalocrocis medinalis) Se recolectaron insectos de campos de arroz del norte de la India. Las larvas de insecto se criaron sobre plantas de arroz en invernadero. Los adultos emergentes fueron confinados a la cámara de oviposición y las plantas con huevos se mantuvieron en bandejas de agua para la eclosión de las larvas. En los bioensayos se usaron larvas de un día. Los bioensayos se llevaron a cabo en cámaras cilindricas, usando hojas recién cortadas de plantas de arroz en la etapa de macollaje. Se recortó una lámina foliar de 8 cm del verticilo central del retoño de arroz. La lámina foliar se colocó en la cámara y se aplicaron diferentes dosificaciones de proteína. Después de 30 minutos, se agregaron cinco a diez larvas por hoja. Se utilizaron al menos tres hojas por dosis de proteína. Cinco días después de la incubación, se efectuó un recuento de la cantidad de larvas muertas y sobrevivientes. (c) Bioensavo con barrenador de tallo rosa (Sesamia inferens) Los insectos fueron recolectados en campos de arroz del norte de la India y criados sobre plantas de arroz. Los bioensayos se llevaron a cabo en viales de vidrio (7.5 cm x 2.5 cm de diámetro) usando una dieta artificial elaborada con frijoles en polvo seco, levadura de cerveza, ácido sórbico, ácido ascórbico, metil parabeno, agar y agua. La dieta se dispuso en los viales hasta una profundidad de 2 cm. Se prepararon al menos tres viales por dosis de proteína. Se dispersaron 40 µ? de dosis de prueba de manera uniforme sobre la superficie de la dieta en cada vial y se dejaron secar durante una hora. Se agregaron diez a quince larvas en el primer instar de barrenador de tallo rosa por vial. Después de siete días, se efectuó un recuento de la cantidad de larvas muertas y sobrevivientes. (d) Bioensayos con barrenador de tallo moteado de maíz (Chilo partellus) Los insectos se mantuvieron sobre una dieta artificial elaborada con frijoles rojos en polvo, levadura de cerveza, ácido sórbico, hojas de sorgo en polvo, ácido ascórbico, ácido metil-para-hidroxibenzoico, vitaminas, aceite de gérmen de trigo, mezcla de sales de Wesson, agar, formaldehído y agua. Se usaron larvas neonatas de estos cultivos en los bioensayos. Los bioensayos se llevaron a cabo como se describió para el barrenador de tallo rosa (Sesamia inferens). (e) Resultados de los bioensavos con insectos en arroz Los resultados de los bioensayos con insectos, que se resumen en el cuadro 4, mostraron que ISP3-327D y ISP3-1099E eran muy tóxicas para cuatro plagas de Lepidópteros en arroz, a saber, barrenador de tallo amarillo (Scirphophaga incertulas), gusano doblador de hojas o envainado (Cnaphalocrocis medinalis), barrenador de tallo rosa (Sesamia inferens) y barrenador de tallo moteado de maíz (Chilo partellus). Además, la proteína ISP3-2245J mostró una toxicidad significativa hacia estas tres plagas de lepidópteros en arroz, a saber, barrenador de tallo amarillo (Scirphophaga incertulas), gusano doblador de hojas o envainado (Cnaphalocrocis medinalis) y barrenador de tallo rosa (Sesamia inferens), en tanto no se detectó toxicidad de la proteína ISP3-2245J contra el barrenador de tallo moteado de maíz (Chilo partellus).

CUADRO 4 YSB: barrenador de tallo amarillo, LF: gusano doblador de hojas o envainado, PSB: barrenador de tallo rosa, SSB: barrenador de tallo moteado; el símbolo de adición (+) indica una mortalidad significativa con respecto al control negativo.

EJEMPLO 8 Producción de proteínas ISP3 en plantas transformadas Se construyeron Vectores de expresión vegetales que comprenden un promotor que se expresa en plantasjigado operativamente a una secuencia de ADN que codifica ya sea ISP3-1099E, ISP3-327D o ISP3-2245J (o un fragmento tóxico o variante del mismo) y una señal de poliadenilación 3'. Se insertó una secuencia directriz.tal como la del gen de la proteina de unión a clorofila a/b de Petunia (Harpster et al. 1988) en posición 5' con respecto al ADN de isp3. Preferentemente, se adapta la utilización de codones de isp3-1099E, ¡sp3-327D y isp3-2245J a la de la planta huésped (p.ej., maíz, algodón o arroz),p.ej. como se describe en W094/24264. Los promotores usados para dirigir el gen isp3s se seleccionan entre los promotores constitutivos 35S CaMV (Hull y Howell, 1987), el promotor de ubiquitina de maíz, el promotor de actina de arroz y el promotor del virus en mosaico de Cassava. Como señal de poliadenilación y terminación de la transcripción 3', se puede utilizar 35S 3', nos 3' (Depicker et al. 1982), oes 3' o gen7 3". Para la transformación mediada por Agrobacterium, el cásete de expresión se inserta en un vector de ADN-T, entre la secuencia de los bordes derecho e izquierdo. Transformación de plantas de maíz (Zea mays), algodón (Gossypium hirsutum o Gossypium barbadense) y arroz (Oryza sativa). Se transformaron de forma estable células de maíz por transformación mediada por Agrobacterium como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 6.140.553, incorporada en este documento a modo de referencia. Se transformaron de forma estable células de algodón por transformación mediada por Agrobacterium como se describe en WO 00/71733, incorporada en este documento a modo de referencia. Se transformaron de forma estable células de arroz como se describe en WO92/09696. Las células y plántulas transformadas son regeneradas como se describe en las referencias citadas. En el caso de construcciones que además comprenden un gen marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a un herbicida, p. ej.2mEPSPS (EP0 508 909 y EP 0 507 698, incorporadas a modo de referencia) que confiere resistencia a glifosato o el gen bar o PAT que confiere resistencia a glufosinato de amonio (EP 0 242 236 y EP 0 242 246, incorporadas a modo de referencia),las células transformadas se cultivan sobre un medio de selección que contiene al agente selectivo.de modo que se selecciona la mayoría de los regenerantes transformados. Entre los regenerantes, se seleccionan los transformantes que expresan el gen isp3 mediante ELISA, transferencia Southern, transferencia Northern y/o análisis con PCR. Los eventos de transformación, en particular los eventos de una sola copia, se seleccionan luego por su actividad insecticida hacia las plagas de insectos Lepidópteros (utilizando los bioensayos). Las plantas de la progenie que contienen el gen quimérico isp3-1099E, isp3-327D o isp3-2245J muestran una mayor resistencia a insectos Lepidópteros en comparación con las plantas control no transformadas. En particular, las plantas con altos niveles de tolerancia a insectos expresan niveles altos de proteína ISP3 y ARNm isp3. Los transformantes fueron seleccionados además por sus características agronómicas (fenotipo normal, rendimiento, arquitectura de las plantas, etc.). Después de incrementos en semillas, se llevan a cabo pruebas a campo con plantas transformadas de maíz, algodón o arroz en diferentes regiones donde están presentes las plagas de insectos susceptibles, con lo cual se demuestra que las plantas que expresan proteínas ISP3 poseen una mayor tolerancia a insectos bajo las condiciones de campo en diferentes entornos. En particular, después de la infestación (artificial o natural) del campo por plagas de insectos, se redujeron las pérdidas de rendimiento de las plantas transformadas en comparación con las plantas control no transformadas.

Para generar plantas con una amplia actividad insecticida, los eventos que expresan ISP3 se cruzan entre sí y con otras plantas transgénicas, que expresan proteínas insecticidas con un espectro insecticida diferente, preferentemente complementario. La progenie de dichos cruzamientos es evaluada luego por la actividad insecticida usando bioensayos para un rango de plagas de insectos diferentes. De esta manera se generan plantas con actividad insecticida contra el rango de insectos deseado. Esta invención no se limita a las plantas de maíz, algodón, soya o arroz indicadas, a los métodos de transformación, construcciones de vectores (promotores, extremos 3', etc.) o las proteínas ISP3 o secuencias de ADN particulares utilizados en la misma. La invención incluye variantes o equivalentes de las proteínas ISP3 que retienen la actividad insecticida.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Bayer BioScience N.V. <120> Nuevas proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis <130> isp3 <150> US 50/366276 <151> 22-03-2002 <150> US 60/423999 <151> 06-11-2002 <160> 6 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 2364 <212> ADN <213> artificial <220> <223> secuencia de nucleótidos de isp3-1099E de Bacillus thuringiensis < <440000>> 11 aattggaaaaccaattggaa aattaaaattaaccttaaaa aattttaaaaaaccggccaa aaggggggccccttttaacc ccaaaaggttttttttaatt ttggaattttaatttttttt 60 aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120 gatacaggtg gtaatctaac cctagacgaa atcttaaaga atcagcagtt actaaatgag 180 atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240 ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300 aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360 attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagcct gcaaatagaa 420 tacttaagta aacaattgca agaaatttcc gataagttag atattattaa cgtaaatgtt 480 cttattaact 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atttggcaag gtgacaataa ggaattctcg tgaagtatta 2220 tttgaaaaga acttttccca gctttcgcct aaagattatt ctgaaaaatt tacaactgca 2280 gccaataata ccggattcta tgtagagctt tctcgcggaa cgcagggtgg taatataact 2340 ttccgagatt tttcaattaa gtaa 2364 <210> 2 <211> 787 <212> PRT <213> artificial <220> <223> secuencia de aminoácidos de ISP3-1099E de Bacillus thuringi nsis <400> 2 Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 20 25 30 lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu lie Ser Gly Lys 50 55 SO Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Thr 100 105 110 Met Leu His lie Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln lie Glu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Gln Glu lie Ser Asp Lys Leu Asp lie lie Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu lie Asn Ser Thr Leu Thr Glu lie Thr Pro Ala Tyr Gln Arg lie 165 170 175 Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Thr Leu Lys Val Lys Glu Asp Gly Ser Pro Ala Asp lie Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Glu Val 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu lie 245 250 255 Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu lie Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp lie Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser lie Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320 Asn lie Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Val 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Ser Asp Arg Asp Ala Lys Met lie Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Met Thr 355 360 365 Val Leu Lys Ala Tyr Gln Ala Lys Leu Lys Gln Asp Tyr Gln Val Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu lie Val Tyr Gly Asp Met Asn Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Ala Phe 405 410 415 Pro Arg Glu Tyr Val lie Thr Lys Leu Thr Phe Thr Lys Lys Met Asn 420 425 430 Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Asp Met Asp Leu Asn Lys Thr Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Ser Arg Leu Ser Ala Ser Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Leu 465 470 475 480 lie Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Val Val 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu lie Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 515 520 525 Val Pro Pro Asn Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Asn Leu 530 535 540 Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 lie Asp His Thr Gly Gly Val Lys Gly Thr Lys Val Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe lie Gly Tyr Lys Leu Lys Ser Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val lie Gln Tyr lie Val Lys Gly Lys Ala Val lie Tyr 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Lys Asn Gly Asp Tyr lie Tyr Glu Glu lie Asn Asn 610 615 620 Glu Leu Glu Asp Phe Gln Thr Val Thr Lys Arg Phe lie Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Ser Ser Gly Val His Leu lie Phe Thr Ser Gln Asn Gly Glu Glu 645 650 655 Ala Phe Gly Gly Asn Phe lie lie Ser Glu lie Arg Pro Ser Glu Glu 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Lys Ser Asp Ala Trp Val Gly Thr Gln 675 680 685 Gly Ala Trp Asn Ser Gly Asn Ser Leu Thr lie Tyr Thr Asn Thr Asn 690 695 700 Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Pro Leu Glu Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser 705 710 715 720 Met Asn Phe Asn lie Thr Gly Phe Gly Lys Val Thr lie Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Asn Phe Ser Gln Leu Ser Pro Lys Asp 740 745 750 Tyr Ser Glu Lys Phe Thr Thr Ala Ala Asn Asn Thr Gly Phe Tyr Val 755 760 765 Glu Leu Ser Arg Gly Thr Gln Gly Gly Asn lie Thr Phe Arg Asp Phe 770 775 780 Ser lie Lys 785 <210> 3 <211> 2367 <212> ADN <213> artificial <220> <223> secuencia de nucleótidos de isp3-327D de Bacillus thuringiensis <400> 3 atgaatatga ataatactaa attaaacgca agggccctac cgagttttat tgattatttt 60 aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120 gatacaggtg gtaatctaac cttagacgaa atcctaaaga atcagcagtt actaaatgag 180 atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240 ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300 aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360 attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420 tacttaagta agcaattgca agaaatttct gataaattag atattattaa cgtaaatgtt 480 cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtgaat 540 gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactt taaaagtaaa aaaggatagc 600 tcgcctgctg atattcttga tgagttaact gaattaactg aactagcgaa aagtgttaca 660 aaaaatgacg ttgatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720 aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcag aattaattgc taaagaaaat 780 gtgaaaacaa gtggcagtga agtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840 ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900 attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960 aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga 1020 agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt ggttgggttt 1080 gaaatgagca atgattcaat cacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1140 tatcaagttg ataaggattc cttatcggag gttatttatg gtgatacgga taaattattt 1200 tgtccagatc aatctgaaca aatatattat acaaataaca tagtattccc aaatgaatat 1260 gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg 1320 aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1380 gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatggag tgtatatgcc attaggtgtc 1440 atcagtgaaa catttttgac tccgataaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500 agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta 1560 agcaataaag aaactaaatt gatcgtccca ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag 1620 aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat 1680 gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga 1740 ttttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact 1800 gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa 1860 gatacaaata ataatttaaa agattatcaa actattacta aacgttttac tacaggaact 1920 gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980 aaatttacaa ttttagaaat taagcctgcg gaggatttat taagcccaga attaattaat 2040 ccgaattctt ggattacgac tccaggggct agcatttcag gaaataaact tttcattaac 2100 ttggggacaa atgggacctt tagacaaagt ctttcattaa acagttattc aacttatagt 2160 ataagcttta ctgcatcagg accatttaat gtgacggtaa gaaattctag ggaagtatta 2220 tttgaacgaa gcaaccttat gtcttcaact agtcatattt ctgggacatt caaaactgaa 2280 tccaataata ccggattata tgtagaactt tcccgtcgct ctggtggtgg tggtcatata 2340 tcatttgaaa acgtttctat taaataa 2367 <210> 4 <211> 788 <212> PRT <213> artificial <220> <223> secuencia de aminoácidos de ISP3-327D de Bacill s thuringiensis <400> 4 Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 20 25 30 lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu He Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu He Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu He Leu Lys He Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala He Asn Thr 100 105 110 Met Leu His He Tyr Leu Pro Lys He Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln He Glu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Gln Glu He Ser Asp Lys Leu Asp He He Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu He Asn Ser Thr Leu Thr Glu He Thr Pro Ala Tyr Gln Arg He 165 170 175 Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp He Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His 'Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu He 245 250 255 Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu He Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp He Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser He Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320 Asn He Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 325 330 335 Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met lie Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser lie Thr 355 360 365 Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lie Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Val Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Glu lie Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 lie Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu lie Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 515 520 525 Val Pro Pro Ser Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Ser lie 530 535 540 Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val lie Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lie His 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lie His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 615 620 Asn Leu Lys Asp Tyr Gln Thr lie Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu lie Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Lys Phe Thr lie Leu Glu lie Lys Pro Ala Glu Asp 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Asn Pro Asn Ser Trp lie Thr Thr Pro 675 680 685 Gly Ala Ser lie Ser Gly Asn Lys Leu Phe lie Asn Leu Gly Thr Asn 690 695 700 Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Th Tyr Ser 705 710 715 720 lie Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His 740 745 750 lie Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val 755 760 765 Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His lie Ser Phe Glu Asn 770 775 780 Val Ser lie Lys 785 <210> 5 <211> 2361 <212> ADN <213> artificial <220> <223> secuencia nucleótidos de isp3-2245J de Bacillus thuringiensis <400> 5 atgaacatga ataatgctaa attaaatgca agggccttac caagttttat tgattatttt 60 aatggtattt atggatttgc cactggtatt aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120 gatacaggtt ctaatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgaa 180 atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240 ttaaatacag aattagctaa gcaaatctta aaagttgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300 aatgatgtta ataacaaact agatgcgata aattcgatgc ttaaaatata tctacctaaa 360 attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg tgctaagctt gcaaatagaa 420 tacttaagta aacaattgca agaaatctcc gacaagctag atattattaa cgtaaatgtg 480 cttattaact ctacgcttac tgaaattaca cctgcgtatc aacgaatgaa atatgtgaat 540 gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactt taaaagtaaa aaaggatagc 600 cctcctgctg atattcttga cgaattaact gaattaactg aactagcgaa aagtgttaca 660 aaaaatgacg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720 aataatttat tcggtcgttc agctttaaaa actgcttcgg aattaattgc taaagaaaat 780 gtgaaaacaa gtggcagtga agtaggaaac gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840 ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900 attgattata cttctatcat gaatgagcat ttaaataagg aaaaagaaga atttagagta 960 aacatccttc ccacactttc taataccttt tctaatccta attatgcaaa agctaaggga 1020 agtaatgaag atacaaagat gattgtggaa gctaaaccag gatatgtttt ggttggattt 1080 gaaatgagca atgattcaat tacagtatta aaagcatatc aagctaagct aaaaaaagat 1140 tatcaaattg ataaggattc gttatcagaa ataatatata gtgatacgga taaattatta 1200 tgtccggatc aatctgaaca aatatattat acaaagaaca tagcatttcc aaatgaatat 1260 gttattacta aaattgcttt tacaaaaaaa atgaacagtt taaggtatga ggcgacagcg 1320 aatttttatg attcttctac aggggatatt gatctaaata agacaaaagt agaatcaagt 1380 gaagcggagt atagtatgct aaaagctagt gatgatgaag tttacatgcc gctaggtctt 1440 atcagtgaaa catttttgaa tccaattaat ggatttaggc ttgcagtcga tgaaaattcc 1500 agactagtaa ctttaacatg tagatcatat ttaagagaga cattgttagc gacagattta 1560 aataataaag aaactaaatt gattgtccca cctaatgttt ttattagcaa tattgtagag 1620 aatggaaata tagaaatgga caccttagaa ccatggaagg caaataatga gaatgcgaat 1680 gtagattatt caggcggagt gaatggaact agagccttat atgttcataa ggatggtgaa 1740 ttctcacatt ttattggaga caagttgaaa tctaaaacag aatacttgat tcgatatatt 1800 gtaaaaggaa aagcttctat ttttttaaaa gatgaaaaaa atgaaaatta catttatgag 1860 gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattacta aacgttttac tacaggaact 1920 gattcgacag gagtttattt aatttttaat agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980 aactttatta ttttggaaat tagtccgtgt gaaaagttat taagtccaga attaattaaa 2040 acagataaat ggaatagtac gggatcaact tatattagcg atgatagact cactctttat 2100 cggggaggac gaggaatttt aaagcaaaac cttcaattag acggtttttc aacttataga 2160 gtcaattttt ctgtggacgg agatgctaat gtaaggattc gtaattctag ggaagtgtta 2220 cttgaaaaaa gatatttgaa ccgtaaaggt gtttctgaaa tgtttactac aaaatttgat 2280 aaagataact tttatgtaga gctttctcaa ggggataatc ttggtactat tgtacatttt 2340 tatgatttct ctattaaata a 2361 <210> 6 <211> 786 <212> PRT <213> artificial <220> <223> secuencia de aminoácidos de ISP3-2245J de Bacillus th ringi <400> 6 Met Asn Met Asn Asn Ala Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 20 25 30 lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Ser Asn Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu lie Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ala Lys Gln lie Leu Lys Val Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Ser 100 105 110 Met Leu Lys lie Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr Val Leu Ser Leu Gln lie Glu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Gln Glu lie Ser Asp Lys Leu Asp lie lie Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu lie Asn Ser Thr Leu Thr Glu lie Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Met 165 170 175 Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Pro Pro Ala Asp lie Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu lie 245 250 255 Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu lie Val Leu Thr Alá Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp lie Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser lie Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320 Asn lie Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Ser Asn Glu Asp Thr Lys Met lie Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly Tyr Val Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser lie Thr 355 36Ó 365 Val Leu Lys Ala Tyr Gln Ala Lys Leu Lys Lys Asp Tyr Gln lie Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu lie lie Tyr Ser Asp Thr Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln lie Tyr Tyr Thr Lys Asn lie Ala Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Ala Phe Thr Lys Lys Met Asn 420 425 430 Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Asp lie Asp Leu Asn Lys Thr Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Ser Met Leu Lys Ala Ser Asp Asp Glu Val Tyr et Pro Leu Gly Leu 4S5 470 475 480 lie Ser Glu Thr Phe Leu Asn Pro lie Asn Gly Phe Arg Leu Ala Val 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Thr Leu Leu Ala Thr Asp Leu Asn Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 515 520 525 Val Pro Pro Asn Val Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Asn lie 530 535 540 Glu Met Asp Thr Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Glu Asn Ala Asn 545 550 555 560 Val Asp Tyr Ser Gly Gly Val Asn Gly Thr Arg Ala Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Glu Phe Ser His Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Ser Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Leu lie Arg Tyr lie Val Lys Gly Lys Ala Ser lie Phe 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Lys Asn Glu Asn Tyr lie Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 615 620 Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr lie Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Ser Thr Gly Val Tyr Leu lie Phe Asn Ser Gln Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Asn Phe lie lie Leu Glu lie Ser Pro Cys Glu Lys 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Lys Thr Asp Lys Trp Asn Ser Thr Gly 675 680 685 Ser Thr Tyr lie Ser Asp Asp Arg Leu Thr Leu Tyr Arg Gly Gly Arg 690 695 700 Gly lie Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Gly Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720 Val Asn Phe Ser Val Asp Gly Asp Ala Asn Val Arg lie Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Leu Glu Lys Arg Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Val Ser 740 745 750 Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Asp Lys Asp Asn Phe Tyr Val Glu Leu 755 760 765 Ser Gln Gly Asp Asn Leu Gly Thr lie Val His Phe Tyr Asp Phe Ser 770 775 780 lie Lys 785

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una proteína insecticida aislada caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91 % de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4.

2. - Una proteína insecticida aislada caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 88% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 6.

3. - Una proteína insecticida aislada caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91 % de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2.

4. - Una proteína insecticida aislada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 2 o el fragmento tóxico más pequeño de la misma.

5. - Una proteína insecticida aislada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 4 o el fragmento tóxico más pequeño de la misma.

6.- Una proteína insecticida aislada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 6 o el fragmento tóxico más pequeño de la misma.

7.- La proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha proteína es insecticida contra al menos una especie de insecto seleccionada del grupo que consiste en Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrínia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotis ípsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis. 8.- Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 9.- Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha proteína es insecticida contra al menos una especie de insecto seleccionada del grupo que consiste en Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrínia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotis ípsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis. 10.- Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1. 1 1.- Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 94% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 3. 2.- Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 97% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5. 13.- Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende los nucleótidos 1 a 2364 de SEQ ID N° . 14.- Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende los nucleótidos 1 a 2367 de SEQ ID N° 3. 15. - Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende los nucleótidos 1 a 2361 de SEQ ID N° 5. 16. - Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína insecticida, la cual comprende una secuencia de aminoácidos que es el producto de traducción de una secuencia de ácido nucleico, que hibridiza con SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 3 o SEQ ID N° 5, bajo condiciones estrictas de hibridización. 17. - Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia sintética que ha sido optimizada para expresarse en plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas. 18. - Un gen quimérico caracterizado porque comprende una secuencia promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17. 19. - Un gen quimérico caracterizado porque comprende una secuencia promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 2, o el fragmento tóxico más pequeño de la misma. 20. - Un gen quimérico caracterizado porque comprende una secuencia promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 4, o el fragmento tóxico más pequeño de la misma. 21. - Un gen quimérico caracterizado porque comprende una secuencia promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 6, o el fragmento tóxico más pequeño de la misma. 22. - Un vector caracterizado porque comprende el gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21. 23. - Una célula huésped transgénica caracterizada porque comprende el gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21. 24.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicha célula huésped es una célula vegetal. 25. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicha célula huésped es un microorganismo. 26. - Una planta transgénica caracterizada porque comprende el gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21. 27. - La planta de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz, algodón, arroz o soya. 28.- Un método para proteger una planta contra el daño causado por insectos caracetrizado porque comprende poner en contacto dicha planta con una proteína insecticida, donde dicha proteina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 2. 29.- Un método para proteger una planta contra el daño causado por insectos caracetrizado porque comprende poner en contacto dicha planta con una proteína insecticida, donde dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 4. 30. - Un método para proteger una planta contra el daño causado por insectos caracetrizado porque comprende poner en contacto dicha planta con una proteína insecticida, donde dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 6 31. - Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque dicha proteína insecticida está codificada por un gen quimérico integrado en el genoma de dicha planta. 32. - Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque dicha proteína se aplica por vía externa a dicha planta. 33. - Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque dicha planta es una planta de maíz, algodón, soya o arroz. 34. - Una cepa de Bacillus thuringiensis caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación

8. 35. - Una composición insecticida caracterizada porque comprende una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que, cuando se aplica por vía externa a la planta, incrementa la resistencia al daño causado por insectos, en comparación con plantas control sobre las cuales no se aplica dicha composición. 36. - Un método para mejorar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ISP3 caracterizado porque comprende los siguientes pasos: (a) proveer una población de secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 2 y/o 4 y/o 6, o variantes o fragmentos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 2 y/o 4 y/o 6, donde dicha variantes o fragmentos tienen una identidad de secuencia de al menos 91 % con SEQ ID N° 2 o 4, y al menos 88% con SEQ ID N° 6; (b) barajar dicha población de variantes o fragmentos para formar moléculas recombinantes de ácidos nucleicos; (c) seleccionar o analizar las moléculas recombinantes de ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen actividad insecticida; (d) repetir los pasos (a) a (c) con las moléculas recombinantes de ácidos nucleicos seleccionadas en el paso (c) hasta que se halla una molécula recombinante de ácido nucleico en el paso (c), donde la proteína codificada por dicha molécula de ácido nucleico tiene la propiedad insecticida deseada.