MXPA03006651A - Anticuerpos monoclonales para la proteina clfa y metodos para el uso en el tratamiento o prevencion de infecciones. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales que se pueden unir a la proteina ClfA y los cuales se generan a partir de subdominios de union o fragmentos activos de la proteina ClfA a partir de Staphylococcus aureus, incluyendo las proteinas de fragmentos activos a partir de su dominio de union a fibrinogeno tal como proteina ClfA, la proteina Clf33 o ClfA N3, las cuales pueden ser utiles en el tratamiento y proteccion contra infeccion a partir de bacteria por estafilococo tal como Staphylococcus aureus. Ademas, los instrumentos medicos pueden ser tratados utilizando los anticuerpos monoclonales de la invencion con el fin de reducir o eliminar la posibilidad de ser infectados o esparcir la infeccion. En particular, los anticuerpos de la presente invencion son ventajosos porque pueden prevenir la adherencia de la bacteria a las celulas huesped deteriorando o inhibiendo la habilidad de S. aureus ClfA a unirse a fibrinogeno, y de esta manera se puede utilizar en metodos o tratamiento o prevencion de infecciones por estafilococo.

Description

ANTICUERPOS O ÑOCLO NALES PARA LA PROTEÍNA CLFA Y MÉTODO PARA EL USO EN EL TRATAMIENTO O PREVENCION PE INFECCIONES Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de las solicitudes provisionales de E.U.A. Serie No. 60/308,116, presentada el 30 de julio de 2001, Serie No. 60/298,413 presentada el 18 de junio del 2001, Serie No. 60/274,611 presentada el 12 de marzo del 2001, y Serie No. 60/264,072 presentada el 26 de junio del 2001.

Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a anticuerpos que han sido generados contra el factor de aglutinación A (o CIfA), una proteína localizada en la superficie expresada en Staphyloooccus aureus y otra bacteria de estafilococo, y en particular para anticuerpos monoclonales contra la proteína CIfA y sus fragmentos activos o proteínas a partir de su dominio de unión fibrinogeno tal como Clf40, Clf33, o CIfA N3, y su uso en la inhibición de la unión de la proteína CIfA a fibrinogeno o fibrina y tratamiento o prevención de infecciones S. aureus.

Antecedentes de la Invención La colonización exitosa del huésped es un proceso requerido por la mayoría de los microorganismos para causar infecciones en animales y humanos. La adhesión microbiana es el primer paso crucial en una serie de eventos que pueden eventualmente conducir hacia la enfermedad. Los microorganismos patogénicos colonizan el huésped adhiriéndose a los tejidos del huésped o biomateriales implantados condicionados por suero, tal como catéteres, uniones artificiales, e injertos vasculares, a través de adhesinas presentes específicas en la superficie de la bacteria. MSCRSMM™ (Componentes de Superficie Microbianos que Reconocen Moléculas de Matriz Adhesivas) son una familia de adhesinas de superficie que reconocen y específicamente se unen a distintos componentes en la matriz extracelular del huésped. Una vez que la bacteria se ha adherido exitosamente y colonizado tejidos del huésped, su fisiología es dramáticamente alterada y daña componentes tales como las toxinas y son secretadas enzimas proteolíticas. Además, la bacteria adherente a menudo produce una biopelícula y rápidamente se vuelve más resistente al efecto de aniquilación de la mayoría de los antibióticos. S. aureus causa un espectro de infecciones que está en la escala de lesiones cutáneas tales como infecciones de heridas, impétigo, y furúnculos de condiciones tratadas de por vida que incluyen neumonía, artritis séptica, sepsis, endocarditis, e infecciones relacionadas con biomaterial. S. aureus se sabe que expresa un repertorio de diferentes MSCRA Ms que pueden actuar individualmente o en concierto para facilitar adhesión microbiana a componentes de tejido de huésped específicos. MSCRAMMs proporcionan un objetivo excelente para el ataque inmunológico mediante anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. La presencia de anticuerpos de alta afinidad anti-MSCRAMM apropiados puede tener un ataque de doble filo, primero los anticuerpos pueden prevenir la adherencia microbiana y segundo los niveles incrementados de anticuerpos MSCRAMM facilitan una liquidación rápida del organismo desde el cuerpo a través de aniquilación opsonofagocítica. Sin embargo, aún permanece el problema para identificar y utilizar la información concerniente a los MSCRAMM™s a partir de S. aureus tal como la proteína CIfA para generar anticuerpos monoclonales efectivos debido a la variabilidad en las propiedades de unión de los diferentes MSCRAMM™s y su papel en la inefectividad y dispersión de infecciones bacterianas. En particular, ha sido un problema desarrollar anticuerpos monoclonales que se puedan unir a CIfA y que puedan ser utilizados para inhibir o deteriorar la unión de CIfA por estafilococo a fibrinogeno o fibrina y de esta forma ser útiles en métodos para la prevención o tratamiento de infecciones por estafilococo. Por lo tanto aún queda una meta altamente deseable en el campo de las enfermedades infecciosas para desarrollar anticuerpos monoclonales y otras composiciones que son exitosas en el tratamiento y prevención de una amplia variedad de infecciones por estafilococo, particularmente mediante la inhibición o deterioro de la habilidad de unión de la bacteria a fibrinógeno o fibrina.

Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales que pueda unirse a la proteína CIfA S. aureus y de esta manera ser útiles en métodos para tratar o prevenir infecciones por estafilococo. Es también un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales que sean capaces de unirse a CIfA, y los cuales se generan a partir de la unión a subdominios de la proteína CIfA S. aureus, incluyendo las proteínas Clf40, Clf33 y CIfA N3, o proteínas activas de las mismas, para ser utilizadas en métodos para el tratamiento o protección contra infecciones por estafilococo. También es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales a las proteínas Clf40, Clf33 y CIfA N3 que puedan ser útiles en la prevención de la adherencia de la bacteria relacionada con Estafilococo mediante la inhibición o deterioro de la unión de la proteína CIfA a fibrinógeno o fibrina. Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos y antisueros que puedan reconocer el dominio A unido a fibrinógeno de la proteína CIfA y el cual de esta forma puede ser útil en métodos para tratar, prevenir, identificar o diagnosticar infecciones por estafilococo. Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar secuencias de aminoácido y las secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia ligera variable y la secuencias pesadas variables de los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal a CifA el cual es protector contra infección a partir de S. aureus, y el cual puede ser logrado en reactividad cruzada contra otros tipos de infecciones por estafilococo. Estos y otros objetos son proporcionados en virtud de la presente invención, la cual comprende el asilamiento y uso de anticuerpos monoclonales para la proteína CifA y/o sus dominios de unión, incluyendo las proteínas Clf40, Clf33, y CifA N3, para la prevención y el tratamiento de infecciones por Estafilococo. La presente solicitud de esta manera describe el descubrimiento, producción, caracterización y evaluación ¡n vivo de anticuerpos monoclonales contra CifA, una proteína localizada en la superficie expresada a través de virtualmente cada cepa S. aureus. Los datos presentados aquí claramente demuestran que los anticuerpos monoclonales contra CifA y sus subdominios activos tales como Clf40, Clf33 y N3 pueden ser utilizados para tratar o proteger contra infecciones por S. aureus. El descubrimiento y aislamiento de anticuerpos monoclonales anti-CifA de acuerdo con la presente invención pueden de esta manera ser utilizados para deteriorar o inhibir la unión de la proteína CIfA a fibrinógeno o fibrina y de esta manera ser útiles en métodos o tratamientos o prevención de infecciones por estafilococo. De acuerdo con la invención, también de contemplan las composiciones y vacunas adecuadas con base en los subdominios de la proteína CIfA aislada y anticuerpos surgidos de la misma, así como métodos para su uso. Estas modalidades y otras alternativas y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita y/o las referencias citadas en la presente, todas las cuales se incorporan por referencia.

Breve Descripción de las Figuras de Dibujo La Figura 1 es una gráfica de un análisis biacore utilizado para medir la unión de CIfA y unión/inhibición subsecuente de fibrinógeno cuando los anticuerpos monoclonales 13-1 o 13-2 de acuerdo con la presente invención se unen a un chip utilizando anticuerpo de antiratón de conejo (RAM-Fc). La Figura 2 es una gráfica de un análisis biacore del anticuerpo monoclonal Quimérico 12-9 de acuerdo con la presente invención. La Figura 3 es una gráfica de un análisis citométrico del flujo del anticuerpo monoclonal Quimérico 12-9 mostrando la unión a S. aureus (Strain Newman). La Figura 4 es una gráfica mostrando la afinidad de unión a CIfA del anticuerpo monoclonal Quimérico y Humanizado 12-9 de acuerdo con la invención. La Figura 5 es una gráfica mostrando la protección contra el modelo de desafío letal de Estafilococo aureus de murino. La Figura 6 es una gráfica mostrando la inhibición de célula completa de adherencia de S. aureus para inmovilizar fibrinógeno utilizando los anticuerpos monoclonales de la presente invención. La Figura 7 es una gráfica mostrando la unión comparativa de S. aureus utilizando los anticuerpos monoclonales murino 12-9, quimérico 12-9 y humanizado 12-9 de acuerdo con al presente invención. La Figura 8 es una descripción de la cadena pesada variable y las secuencias ligeras variables de los anticuerpos monoclonales de la presente invención mostrando las secuencias conservadas en las regiones CDR1, CDR2, y CDR3.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas De acuerdo con la presente invención, se proporcionan anticuerpos monoclonales que se pueden unir a la proteína CIfA de S. aureus, y estos anticuerpos monoclonales han sido construidos contra proteínas del subdominio de unión activas incluyendo las regiones Clf40, Clf33 y CIfA N3 las cuales han sido aisladas y purificadas a través de los presentes inventores. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención han sido mostrados para tratar y proteger contra infecciones S. aureus.

Previamente, McDevitt y otros (McDevitt y otros, 1994, Mol. icrobiol. 11, 237-248) identificaron una proteína de superficie de 92 kDa, a partir de la cepa S. aureus Newman, se demostró que fue responsable de la aglomeración dependiente de fibrinógeno de bacteria, y esto ahora se describe en la patente de E.U.A. No. 6,177,084, incorporada aquí por referencia. El gen, designado ClfA, se clonó y se secuenció, y esto se describe en la patente de E.U.A. No. 6,008,341, también incorporada aquí por referencia, y esta región, representando una proteína de aminoácido 896 según predicho por la secuencia de ADN, media la adherencia de la bacteria a superficies cubiertas con fibrinógeno, por lo tanto identificando ClfA como un MSCRAMM™. El gen ClfA consiste de un dominio citoplásmico, un dominio de transmembrana, un dominio de anclaje a la pared de la célula y una región (designada R) que conecta los dominios de anclaje de la célula con la región NH2-terminal (compuesta de un único segmento de residuo 520). El dominio de unión a fibrinógeno de este MSCRAMM ha sido localizado a un segmento del resido 218 dentro de la región A. McDevitt y otros (McDevitt y otros, 1995, Mol. Microbiol. 16, 895-907) han mostrado que la región A de ClfA es suficiente para el fenotipo de aglomeración. Sin embargo, previamente, nadie ha sido capaz de generar anticuerpos monoclonales a la proteína ClfA de S. aureus. Por consiguiente, la presente invención se relaciona con un anticuerpo monoclonal aislado y/o purificado que se puede unir a la proteína ClfA o sus dominios de unión, incluyendo las proteínas Clf40, Clf33, y ClfA N3, y las cuales de esta manera pueden se útiles en métodos para prevenir y tratar infección relacionada con estafilococo cuando se utiliza en cantidades efectivas para prevenir o tratar dichas infecciones. Estos anticuerpos monocionaíes pueden ser producidos utilizando, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein, Nature 256;495-497 (1975), u otras formas adecuadas conocidas en el campo, y además pueden ser preparadas como anticuerpos monocionaíes quiméricos, humanizados o humanos en formas que serían bien conocidas en este campo. Aún además, los anticuerpos monocionaíes pueden ser preparados a partir de una cadena individual, tales como las cadenas ligera o pesada, y además pueden ser preparados a partir de fragmentos activos de un anticuerpo que retiene las características de unión (por ejemplo, especificidad y/o afinidad) del anticuerpo completo. Por fragmentos activos significa un fragmento de anticuerpo que tiene la misma especificidad de unión como un anticuerpo completo el cual se une a la proteína ClfA, y el término "anticuerpo" como se utiliza aquí, quiere decir que Incluye dichos fragmentos. Adlcionalmente, el antisuero preparado utilizando anticuerpos monocionaíes o policlonales de acuerdo con la invención también se contempla y puede ser preparado en un número de maneras adecuadas como podría ser reconocido por uno con experiencia en la técnica. Como se indicó anteriormente, los anticuerpos ClfA pueden ser preparados en un número de formas adecuadas que serían bien conocidas en la técnica, tales como el método bien establecido de Kohler y ilstein descrito anteriormente el cual puede ser utilizado para generar anticuerpos monoclonales. En dicho método, los ratones son inyectados intraperitonealmente una vez por semana durante un período prolongado con una proteína CIfA recombinante purificada, o proteína de subdominio aislada tal como Clf40, Clf 33, o CIfA N3, o una porción activa de las mismas, seguido por una prueba de la sangre obtenida de los ratones inmunizados para determinar la reactividad a la CIfA purificada. Después de la identificación de los ratones que reaccionar a CIfA, se fusionaron linfocitos aislados de bazos de ratón a células de mieloma de ratón para producir hibridomas positivos para los anticuerpos contra CIfA, los cuales después se aislaron y se cultivaron, seguido por purificación e isotipificación. Con el fin de generar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención, de esta manera es preferido que estos sean generados utilizando proteínas CIfA, Clf40, Clf33 o N3 recombinantemente preparadas utilizando métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno de dichos métodos emplea el uso de el vector de expresión pQE-30 de E. col¡ como un vector de expresión para clonar y expresar proteínas y péptidos recombinantes. Al utilizar PCR, el dominio A de CIfA (CIfA representando AA 40-559 o Clf33 representando AA 221-550) se amplificó a partir de ADN genómico de S. aureus Newman y se subclonó en el vector de expresión PQE-30 de E. cotí (Qiagen), lo cual permite la expresión de una proteína de fusión recombinante conteniendo seis residuos de histidina. Este vector fue subsecuente transformado en la cepa ATCC 55151 de E. coli, crecido en un termentador de 15 litros a una densidad óptica (ODSOQ) de 0.7 y licuado con 0.2 mM de galactosida de isopropil-12-beta-D (IPTG) durante 4 horas. Las células de cosecharon utilizando un ensamble de fibra ahuecada de Tecnologías AG (tamaño de poro de 0.45 µ?t?) y la pasta de célula se congeló a -80°C. Las células se lisaron en 1X de PBS (10 mi de regulador de pH/1 g de pasta de célula) utilizando dos pasadas a través de una prensa French Press a 77.33 kg/cm2. Las células lisadas se hicieron girar a 17,000 rpm durante 30 minutos para remover los fragmentos de célula. El sobrenadante se hizo pasar a través de una columna de Quelación HiTrap de 5 mi (Pharmacia) cargada con 0.1 de N i C 12 · Después de cargarla, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de 10 mM de Tris, pH 8.0, 100 mM de NaCI (regulador de pH A). La proteína se eluyó utilizando un gradiente de 0-100% de 10 mM de Tris, pH 8.0, 100 mM de NaCI, 200 mM de imidazol (regulador de pH B) sobre 30 volúmenes de columna. Clf40 o Clf33 se eludieron en aproximadamente 13% de regulador de pH B (aproximadamente 26 mM de imidazol). La absorbancia 280 nm se monitoreó. Las fracciones conteniendo Clf40 o Clf 33 se dializaron en 1X de PBS. La proteína entonces se puso a través de un protocolo de remoción de endotoxina. Los reguladores de pH utilizados durante este protocolo se hicieron libres de endotoxina haciéndolos pasar sobre una columna de sepharose Mono-Q de 5 mi (Pharmacia). La proteína se dividió uniformemente entre 4 tubos de 15 mi. El volumen de cada tubo se trajo a 9 mi con regulador de pH A. Se agregó 1 mi de 10% de Tritón X-114 a cada tubo y se incubaron con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos se hicieron girar a 2,000 rpm durante 10 minutos y la fase acuosa superior a partir de cada tubo se recolectó y la extracción del detergente de repitió. Las fases acuosas a partir de la segunda extracción se combinaron y se hicieron pasar sobre una columna de quelación IDA de 5 mi (Sigma), se cargaron con 0.1 M de NiCI2 para remover el detergente restante. La columna se lavó con 9 volúmenes de columna de regulador de pH A antes de que la proteína fuera eluida con 3 volúmenes de regulador de pH B. El eluyente se hizo pasar sobre una columna Detoxigel (Sigma) de 5 mi y el flujo directo se recolectó y se reaplicó a la columna. El flujo directo a partir de la segunda pasada se recolectó y se dializó en 1x de PBS. El producto purificado se analizó para el nivel de concentración, pureza y endotoxina antes de la administración en los ratones. La secuencia de aminoácido para la Clf40 obtenida en esta forma se muestra en la presente como SEC ID NO: 2, y está codificada por ácidos nucleicos que tienen la secuencia establecida en SEC ID NO:1, o degenerados de la misma. Además, las secuencia de aminoácido para Clf33 obtenida en esta forma se muestra en la presente en SEC ID NO: 4, y está codificada por los ácidos nucleicos teniendo la secuencia establecida en SEC ID NO: 3 o degenerados de la misma. De acuerdo con la invención, después del aislamiento de la proteína ClfA o sus subdominios activos tales como los anticuerpos monoclonales Clf40, Clf33 o ClfA N3 a estas proteína pueden ser producidos a través de un número de formas. Por ejemplo, en un método preferido, las proteínas Clf40 y Clf33 purificadas se utilizaron para generar un panel de anticuerpos monoclonales murino. Brevemente, un grupo de ratones Balb/c recibieron series de inmunizaciones subcutáneas de 50 g de proteína Clf40 o C If 33 en solución o mezclada con un auxiliar como se describe a continuación: Inyección Día Cantidad (µ9) Ruta Auxiliar Primaria 0 50 Subcutánea Freund Completo Fortalecida^ 14 5(Clf40) Intravenosa PBS 10(Clf33) Tres días después del fortalecimiento final, se removieron los bazos, se inhibieron en una suspensión de célula individual y los linfocitos de cosecharon. Los linfocitos después de fundieron a una línea de célula de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC#1581). La fusión de célula, subsecuente colocación en placas y alimentación se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de Producción de Anticuerpos Monoclonales de Current Protocols in Immunoloqy (Capítulo 2, Unidad 2.). Cualesquiera clones que fueron generados a partir de la fusión después se clasificaron para la producción de anticuerpo anti-Clf40 específico utilizando un ensayo ELISA estándar. Además se expandieron y probaron los clones positivos. Se identificaron originalmente quince clones positivos y se clonaron limitando la dilución para caracterización adicional. Los clones de célula individual se probaron para actividad en una unión ELISA directa, ELISA modificada para medir la inhibición de la unión de fibrinógeno a CLF40, la unión de célula bacteriana total a través de citometría de flujo y afinidad para la unión a Clf40 a través de análisis Biacore. Las muestras bacterianas de S. aureus (cepas Barnett, 67-0, ATCC #25923 y ATCC #49230) se recolectaron, se lavaron y se incubaron con Mab 13-2, 12-9, 13-1, o PBS solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios A de proteína con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con FITC-Anti-Ratón-F(ab')2-Cabra-F(ab')2 el cual sirvió como el anticuerpo de detección. Después de la marcación del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través de un cítómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana, se recolectaron 10,000 eventos y se midieron. Las placas de 96 cavidades de alta unión se revistieron con 1 mg/ml de solución de Clf40 en PBS (pH 7.4), se cubrieron, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas después se lavaron con PBS, 0.05% de Tween 20 y se bloquearon con 1% de solución de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el sobrenadante de anticuerpo monoclonal se agregó y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después de lavaron y se agregó 0.1 mg/ml de solución de fibrinógeno humano a cada cavidad. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se agregó conjugado AP anti-fibrinógeno de oveja a una dilución de 1:750 en PBS, 0.05% de Tween 20, 0.1% de BSA y se dejó en incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después de lavaron y se agregó pNPP (solución desarrolladora) a una concentración final de 1 mg/ml. Las placas se incubaron 15-30 minutos a 37°C y los resultados se leyeron a 405 nm y se analizaron utilizando un lector de Bio-ensayo Perkin Elmer HTS 7000. El análisis cinético se llevó a cabo sobre un Biacore 3000 utilizando el método de captura de Ligando incluido en el software. Un anticuerpo anti-ratón-Fc de conejo (Biacore) se acopló a amina a un chip C 5. El anticuerpo monoclonal que se está analizando después se hizo pasar sobre el chip, permitiendo la unión a la porción Fe. Diversas concentraciones de la proteína Clf40 o Clf33 después se hicieron pasar sobre la superficie del chip y se recolectaron los datos. Al utilizar el software de Evaluación provisto por Biacore (Versión 3.1), se midieron ken.end¡do y kapagad0 y se calcularon kA y KD. Como se muestra en los datos a continuación, la inmunizaciones para generar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención dirigidos a Clf40 o porciones activas de CIÍ40 (N2N3 o regiones N3) han producido anticuerpos monoclonales con diferente y diversa reactividad y perfiles de reactividad cruzada.

Aunque la producción de anticuerpos utilizando formas recombinantes de la proteína CIfA es preferida, los anticuerpos pueden ser generados a partir de proteínas CIfA naturales aisladas o purificadas así como de regiones, y los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden ser generados utilizando las proteínas CIfA naturales o regiones activas en la misma forma como se describió anteriormente para obtener dichos anticuerpos. Aún otras formas convencionales están disponibles para generar proteínas CIfA o sus regiones activas, como se reconocerá por uno con experiencia en la técnica. Como se reconocerá por aquellos con experiencia en la técnica, los anticuerpos de la presente invención también se pueden formar en composiciones farmacéuticamente adecuadas para la administración de un paciente ser humano o animal con el fin de tratar o prevenir una infección causada por bacteria por estafilococo. Las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos efectivos de los mismos, pueden ser formuladas en combinación con cualquier vehículo, excipiente o portador farmacéuticamente adecuado que comúnmente se utilizaría en esta técnica, incluyendo tales como salina, dextrosa, agua, glicerol, etanol, otros compuestos terapéuticos, y combinaciones de los mismos. Uno con experiencia en la técnica reconocerá, que el vehículo, excipiente o portador particular utilizado variará dependiendo del paciente y de la condición del paciente, y de una variedad de modos de administración serían adecuados para las composiciones de la invención, como se reconocerá por uno con experiencia en la técnica. Los métodos adecuados de administración de cualquier composición farmacéutica descritos en esta solicitud incluyen, pero no se limitan a, administración tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica. Para administración tópica, la composición se formula en la forma de un ungüento, crema, gel, loción, gotas (tales como gotas para los ojos y gotas para las oídos), o solución (tales como enjuagues bucales). Los vendajes de heridas o quirúrgicos, suturas, y aerosoles pueden ser impregnados con la composición. La composición puede contener aditivos convencionales, tales como conservadores, solventes para promover la penetración, y emolientes. Las formulaciones tópicas también pueden contener portadores convencionales tales como bases de crema o ungüento, etanol o alcohol oleílico. Formas adicionales de composiciones de anticuerpo, y otra información concerniente a composiciones, métodos y aplicación con respecto a otros SCRAMM™ en general también serán aplicables a la presente invención involucrando anticuerpos a MSCRAMM™ ClfA y se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,288,214 (Hook y otros), incorporada aquí por referencia.

Las composiciones de anticuerpo de la presente invención que son generados contra la proteína ClfA o sus subdominios efectivos tales como Clf40, Clf33, o N3 también pueden ser administrados con un auxiliar adecuado en una cantidad efectiva para reforzar la respuesta inmunogénica contra el conjugado. Por ejemplo, los auxiliares adecuados pueden incluir (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), el cual se utiliza ampliamente en seres humanos, y otros auxiliares tales como saponina y su componente purificado Quil A, auxiliar completo de Freund, auxiliar RIBBI, y otros auxiliares utilizados en aplicaciones de investigación y veterinaria. Aún otras preparaciones definidas químicamente tales como dipéptido de muramilo, lípido A de monofosforilo, conjugados fosfolípidos tales como aquellos descritos por Goodman-Snitkoff y otros, J. Immunol. 147:410-415 (1991) e incorporados aquí por referencia, encapsulación de los conjugados dentro de un proteoliposoma como se describe por iller y otros, J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992) y se incorpora aquí por referencia, y encapsulación de la proteína en vesículas de lípido tales como vesículas de lípido Novasome™ (Micro Vascular Systems, Inc., Nahua, NH) también pueden ser útiles. En cual caso, las composiciones de anticuerpo de la presente invención serán de esta manera útiles para interferir con, modular, inhibir las interacciones de unión entre ClfA en la bacteria por estafilococo y fibrinógeno en células huésped y tejidos, o en el desplazamiento de bacteria por estafilococo que se ha convertido en una unión a fibrinógeno asociada con células huésped y tejidos. Por consiguiente, la presente invención tendrá aplicabilidad particular en el desarrollo de composiciones y métodos para prevenir o tratar infección por estafilococo, e inhibir la unión de la bacteria por estafilococo con tejido y/o células huésped. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir o tratar una infección por estafilococo que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo a la proteína ClfA o sus subregiones activas tales como Clf40, Clf33 o N3 como se describió anteriormente en cantidades efectivas para tratar o prevenir la infección. Además, estos anticuerpos monoclonales han sido mostrados como siendo útiles en el deterioro de la unión de bacteria por estafilococo a fibrinógeno o fibrina, y de esta manera han probado ser efectivos en el tratamiento o prevención de infección de bacteria por estafilococo tal como S. aureus. Aún además, los anticuerpos de acuerdo con la invención son doblemente efectivos en que han sido mostrados como reactivos cruzados a lo largo de una amplia variedad de cepas S. aureus lo cual de esta manera mejorarán la efectividad y eficiencia de las composiciones basadas en los monoclonales de la presente invención. Por consiguiente, de acuerdo con la invención, la administración de los anticuerpos de la presente invención en cualquiera de las formas convencionales descritas anteriormente (por ejemplo, tópicamente, parenteralmente, intramuscular, etc.) y de esa manera proporcionarán un método de tratamiento o prevención extremadamente útil en infecciones por estafilococo en pacientes seres humanos o animales. Por cantidad efectiva se quiere dar a entender que el nivel de uso, tal como concentración de anticuerpo, que será suficiente ya sea para prevenir la adherencia de la bacteria, para inhibir la unión de la bacteria de estafilococo a células huésped y de esta manera ser útil en el tratamiento o prevención de infección por estafilococo. Como se reconocerá por uno con experiencia en la técnica, el nivel de concentración de anticuerpo necesario para ser efectivo en tratar o prevenir infección por estafilococo variará dependiendo de la naturaleza y condición del paciente y/o severidad de la infección por estafilococo pre-existente.

Además del uso de anticuerpos a la proteína ClfA y la regiones el dominio A de esa proteína para tratar o prevenir infección S. aureus como se describió anteriormente, la presente invención contempla el uso de estos anticuerpos en una variedad de formas, incluyendo la detección de la presencia de S. aureus para diagnosticar una infección por estafilococo, ya sea en un paciente o un equipo médico que también se puede volver infectado. De acuerdo con la invención, un método para detectar la presencia de infecciones por estafilococo involucra los pasos de obtener una muestra que se sospecha que está siendo infectada por una o más especies o cepas de bacterias por estafilococo, tales como un muestra tomada de un individuo, por ejemplo, de la sangre, saliva, tejidos, hueso, músculo, cartílago o piel de uno individuo. Las células pueden entonces ser lisadas, y el ADN extraído, precipitado y amplificado. Después del aislamiento de la muestra, los ensayos de diagnóstico utilizando los anticuerpo de la presente invención pueden ser llevados a cabo para detectar la presencia de S. aureus y dichas técnicas de ensayo para determinar dicha presencie en una muestra son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica e incluyen métodos tales como radioinmunoensayos, análisis de tinción Western y ensayos ELISA. En general, de acuerdo con la invención, un método para diagnosticar una infección S. aureus está contemplada en una muestra que se sospecha de estar infectada con infección S. aureus se le ha agregado un anticuerpo de proteína ClfA de acuerdo con la presente invención, y S. aureus está indicado a través de la unión de anticuerpo a las proteínas ClfA en la muestra.

Por consiguiente, los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados para la detección específica de proteínas de mapas por estafilococo, para la prevención de infección de bacteria de estafilococo, par el tratamiento de una infección en progreso, o para el uso como herramientas de investigación. El término "anticuerpos" como se utiliza en la presente incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena individual, biespecíficos, simianizados, y humanizados o primatizados así como fragmentos Fab, tales como aquellos fragmentos que mantienen la especificidad de unión de los anticuerpos a las proteínas ClfA, incluyendo los productos de una colección de expresión de inmunoglobulina Fab. Por consiguiente, la invención contempla el uso de cadenas individuales tales como las cadenas pesada y ligera variables de los anticuerpos como serán establecidas más adelante.

La generación de cualquiera de estos tipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo es bien conocida por aquellos con experiencia en la técnica. En el presente caso, los anticuerpos monoclonales de proteínas CIfA han sido generados y aislados y se muestra que protegen contra infección por estafilococo. Cualquiera de los anticuerpos anteriormente descritos puede se etiquetado directamente con una etiqueta detectable para identificación y cuantificación de bacteria estafilococo. Las etiquetas para uso en inmunoensayos por lo general son conocidas por aquellos con experiencia en la técnica e incluyen enzimas, radioisótopos, y substancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas, incluyendo partículas coloreadas tales como oro coloidal o camas de látex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos de inmunoabsorbencia enlazados por enzima (ELISA). Alternativamente, el anticuerpo puede ser etiquetado directamente a través de la reacción con substancias etiquetadas que tiene una afinidad por inmunoglobulina. El anticuerpo puede ser conjugado con una segunda substancia y detectado con una tercera substancia etiquetada que tiene una afinidad para la segunda substancia conjugada al anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar conjugado a biotina y el conjugado de anticuerpo-biotina detectado utilizando avidina o estreptavidina etiquetada. Similarmente, el anticuerpo puede estar conjugado a un haptén y el conjugado de anticuerpo-haptén detectado utilizando anticuerpo anti-haptén etiquetado. Estos y otros métodos para etiquetar anticuerpos y conjugados de ensayo son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Los anticuerpos a ClfA como se describió anteriormente también pueden ser utilizados en instalaciones de producción o laboratorios para aislar cantidades adicionales de las proteínas, tales como a través de cromatografía de afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención también pueden ser utilizados para aislar cantidades adicionales de la proteína ClfA o sus fragmentos activos.

Los anticuerpos aislados de la presente invención, o fragmentos activos de los mismos, también se pueden utilizar en el desarrollo de vacunas para inmunización pasiva contra infecciones de estafilococo. Además, cuando se administran como composición farmacéutica a una herida o se utilizan para cubrir dispositivos médicos o biomateriales poliméricos in vitro e in vivo, los anticuerpos de la presente invención, pueden ser útiles en aquellos casos en donde existe una* infección por estafilococo previa debido a la habilidad de este anticuerpo para además restringir e inhibir la unión de S. aureus a fibrinógeno o fibrina, y se esta manera limita la extensión y dispersión de la infección. Además, el anticuerpo puede ser modificado según sea necesario para así, en ciertos casos, es menos inmunogénico en el paciente al cual se le administra. Por ejemplo, si el paciente es un ser humano, el anticuerpo puede ser "humanizado" transplantando la complementaridad determinando regiones del anticuerpo derivado de hibridoma dentro de un anticuerpo monoclonal humano como se describe, por ejemplo, por Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986) o Tempest y otros, Biotechnology 9:266-273 (1991) o "revestido", cambiando los residuos de marco de trabajo de murino expuestos de superficie en las regiones variables de inmunoglobulina a contrapartes de marco de trabajo humano de mímico a homólogos como se describe, por ejemplo, por Parlan, Molecular Imm. 28:489-498 (1991), estas referencias se incorporan aquí por referencia. Aún adicionalmente, cuando se desea, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser administrados en conjunción con un antibiótico adecuado para además mejorar la habilidad de las presentes composiciones para combatir infecciones bacterianas. Los dispositivos médicos o biomateriales poliméricos que van a ser revestidos con los anticuerpos, proteínas y fragmentos activos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, grapas, suturas, reemplazo de válvulas cardiacas, dispositivos de asistencia cardiaca, lentes de contacto duros y suaves, implantes de lentes intraoculares (cámara anterior o cámara posterior), otros implantes tales como incrustaciones en la córnea, q uerato-proteasas, moldes vasculares, dispositivos de epiceratofalia, desviadores de glaucoma, grapas para la retina, hebillas escleroticales, prótesis dentales, dispositivos tiroplásticos, dispositivos laringoplásticos, grapas vasculares, prótesis de tejido suave y duro, pero no se limitan a, bombas, dispositivos eléctricos incluyendo estimuladores y registradores, prótesis de auditoría, marcapasos, laringe artificial, implantes dentales, implantes mamarios, implantes en el pene, tendones cráneo/faciales, costuras artificiales, tendones, ligamentos, meniscos y discos, huesos artificiales, órganos artificiales incluyendo páncreas artificial, corazones artificiales, limbos artificiales, y válvulas cardiacas; moldes, cables, cables guiados, catéteres intravenosos y venosos centrales, dispositivos de angioplastía láser y de globo, dispositivos vasculares y del corazón (tubos, catéteres, globos), asistentes ventriculares, componentes de diálisis de sangre, oxigenadores sanguíneos, dispositivos uretrales/ureterales/urinarios (catéteres Foley, moldes, tubos y globos) catéteres de vía aérea (tubos y anillos endotraqueales y de traqueotomía), tubos de alimentación del intestino (incluyendo tubos nasogástricos, intragástricos y del yeyuno) tubos de drenaje de heridas, tubos utilizados para drenar las cavidades del cuerpo tales como las cavidades pleural, craneal, y pericardial, bolsas de sangre, tubos de ensayo, tubos de recolección de sangre, contenedores al vacío, jeringas, agujas, pipetas, puntas de pipetas y entubados sanguíneos.

• Se entenderá por aquellos con experiencia en la técnica que el término "revestido" o "revestimiento" como se utiliza aquí, significa aplicar el anticuerpo o fragmento activo, o composición farmacéutica derivada del mismo, a una superficie del dispositivo, preferiblemente una superficie externa que estaría expuesta a infección de bacteria por estafilococo. La superficie del dispositivo no necesita estar completamente cubierta por la proteína, anticuerpo o fragmento activo. En una modalidad preferida, los anticuerpos también se pueden utilizar como una vacuna pasiva que sería útil en proporcionar anticuerpos adecuados para tratar o prevenir una infección por estafilococo. Como se reconocerá por aquellos con experiencia en la técnica, una vacuna puede ser empacada para la administración en un número de formas adecuadas, tales como administración parenteral, (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o administración nasofaríngea (es decir, intranasal). Uno de dichos modos en donde la vacuna es inyectada intramuscularmente, por ejemplo, dentro del músculo deltoideo, sin embargo, el modo particular de administración dependerá de la naturaleza de la infección bacteriana a ser negociada con la condición del paciente. La vacuna está preferiblemente combinada con un portador farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración, y el portador usualmente es agua o salina regulada en su pH, con o sin un conservador. La vacuna puede ser liofilizada en el momento de la administración o en solución. La dosis preferida para administración de una composición de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es que la cantidad será efectiva en la prevención o tratamiento de una infección por estafilococo, y uno fácilmente reconocerá que esta cantidad variará enormemente dependiendo de la naturaleza de la infección y la condición de un paciente. Como se indicó anteriormente, una "cantidad efectiva" de anticuerpo o agente farmacéutico para ser utilizada de acuerdo con la invención pretende significar una cantidad no tóxica pero suficiente del agente, tal como el efecto profiláctico o terapéutico deseado es producido. Cornos se señalará más adelante, la cantidad exacta del anticuerpo o un agente particular que es requerido variará de sujeto a sujeto, dependiendo de las especies, edad, y condición general del sujeto, la severidad de la condición que se está tratando, del portador particular o auxiliar que se está utilizando y de su modo de administración, y similares. Por consiguiente, la "cantidad efectiva" de cualquier composición de anticuerpo particular variará con base en las circunstancias particulares, y una cantidad efectiva apropiada puede ser determinada en cada caso de aplicación a través de uno con experiencia en la técnica utilizando solamente experimentación de rutina. La dosis debería ser ajustada para adecuarse al individuo al cual la composición de administra y variará con la edad, peso y metabolismo del individuo. Las composiciones pueden adicionalmente contener estabilizadores o conservadores farmacéuticamente aceptables, tales como timerosal (sal de sodio de til(2-mercaptobenzoato-S) de mercurio) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Cuando se utilizan con etiquetas adecuadas u otras biomoléculas o químicos detectables apropiados, los anticuerpos monoclonales descritos aquí son útiles para propósitos tales como diagnósticos in vivo e in vltro de infecciones por estafilococo o detección de bacteria de estafilococo. La investigación de laboratorio también puede ser facilitada a través del uso de dichos anticuerpos. Varios tipos de etiquetas y métodos de conjugación de etiquetas para los anticuerpos de la invención son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, tales como los establecidos a continuación. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar conjugado (directamente o a través de quelación) a una radiomarcación tal como, pero no restringido a 32P, 3H, 14C, 35S, 125l o 131l. La detección de una etiqueta puede ser ha través de métodos tales como conteo de cintilación, espectrometría de rayos gama o autoradiografía. La substancia bioluminiscente está covalentemente unida a la proteína a través de medios convencionales, y la proteína etiquetada es detectada cuando una enzima, tal como luciferasa, cataliza una reacción con ATP causando que la molécula bioluminiscente emita fotones de luz. Los fluorógenos también pueden ser utilizados para etiquetar proteínas. Ejemplos de fluorogénos incluyen fluoresceína y derivados, fiocoeritrina, alo-ficocianina, fiococianina, rodamina y Rojo de Texas. Los fluorógenos generalmente se detectan mediante un detector fluorescente. La localización de un ligando en células puede ser determinado a través de marcación de un anticuerpo como se describió anteriormente y detectando la etiqueta de acuerdo con métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, tales como microscopio inmunofluorescente utilizando procedimientos tales como aquellos descritos por Warren y Nelson (Mol. Cell. Biol., 7: 1326-1337, 1987). Como se indicó anteriormente, los anticuerpos monoclonales de la presente invención, o porciones activas o fragmentos de los mismos, son particularmente útiles para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno por estafilococo responsable por infección y un huésped mamífero, tal como la adhesión de la bacteria a proteínas de matriz extracelulares de mamífero tales como fibrinógeno, y esta interferencia con la interacción física puede ser útil tanto en tratar pacientes como en la prevención o reducción de infección de bacteria en residentes en dispositivos médicos para hacerlos más seguros en el uso. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un equipo que puede ser útil en el aislamiento e identificación de bacteria por estafilococo e infección, que comprende los anticuerpos de la presente invención en una forma adecuada, tal como liofilizados en un recipiente individual en cual después se convierte en activo a través de la adición de una muestra acuosa que se sospecha que contiene la bacteria por estafilococo. Dicho equipo típicamente incluirá un contenedor adecuado para alojar los anticuerpos en una forma adecuada junto con un reactivo de inmunodetección adecuado que permitirá la identificación de complejos uniéndose a los anticuerpos ClfA de la invención. Por ejemplo, el reactivo de inmunodetección puede comprender una señal o etiqueta detectable adecuada, tal como una biotina o enzima que produce un color detectable, etc., la cual normalmente puede estar enlazada al anticuerpo o que puede ser utilizada en otras formas adecuadas para de esta manera proporcionar un resultado detectable cuando el anticuerpo se une al antígeno. En resumen, los anticuerpos de la presente invención que se unen a la proteína ClfA o fragmentos activos de la misma, son de esta manera extremadamente útiles en tratar o prevenir infecciones por estafilococo en pacientes seres humanos o animales y en dispositivos médicos u que habitan dentro de otros dispositivos. Por consiguiente, la presente invención se refiere a métodos para identificar y aislar anticuerpos que se pueden unir a ClfA y los cuales pueden ser utilizados en métodos de tratamiento de infecciones por estafilococo que involucran aniquilación opsonofagocítica de la bacteria. Los anticuerpos que son identificados y/o aislados utilizando el presente método, tal como el anticuerpo ClfA que se puede unir a la proteína ClfA y que puede prevenir o tratar una infección por estafilococo de está manera son parte de la presente invención.

EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos, los cuales ejemplifican aspectos de las modalidades preferidas de la presente invención. Se debe apreciar por aquellos con experiencia en la técnica que la técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención, y de esta forma están se considera que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos, con experiencia en la técnica, en luz de la presente descripción, aprecian que muchos cambios se pueden hacer en las modalidades específicas que se describen y aún obtener un resultado similar o parecido sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1. Aislamiento y Secuenciación de Clf40 y Clf33 Utilizando PCR, se amplificó el dominio A de ClfA (Clf40 representando AA 40-559 o Clf33 representando AA 221-550) a partir de ADN genómico S. aureus Newman y se subclonó en el vector de expresión PQE-30 de E. coli (Qiagen), lo cual permite la expresión de una proteína de fusión recombinante conteniendo seis residuos de histidina. Este vector fue subsecuentemente transformado en la cepa ATCC 55151 de E. coli, crecida en un fermentador de 15 litros a una densidad óptica (OD60o) de 0.7 e inducida con 0.2 mM de galactosida de isopropil- -beta-D (IPTG) durante 4 horas. Las células se cosecharon utilizando un ensamble de hueco-fibra de AG Technologies (tamaño de poro de 0.45 µp?) y la pasta de célula se congeló a -80°C. Las células se lisaron en 1X de PBS (10 mi de regulador de pH/1g de pasta de célula) utilizando dos pasadas a través de la prensa Press French a 77.33 kg/cm2. Las células lisadas se hicieron girar a 17,000 rpm durante 30 minutos para remover los fragmentos de célula. El sobrenadante se hizo pasar a través de una columna de Quelación HiTrap de 5 mi (Pharmacia) cargada con 0.1 M de N¡CI2- Después de cargarla, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de 10 mM de Tris, pH 8.0, 100 mM de NaCI (regulador de pH A). La proteína se eluyó utilizando un gradiente de 0-100% de 10 mM de Tris, pH 8.0, 100 mM de NaCI, 200 mM de imidazol (regulador de pH B) sobre 30 volúmenes de columna. Clf40 o Clf33 se eludieron en aproximadamente 13% de regulador de pH B (aproximadamente 26 mM de imidazol). La absorbancia 280 nm se monitoreó. Las fracciones conteniendo Clf40 o Clf33 se dializaron en 1X de PBS. La proteína entonces se puso a través de un protocolo de remoción de endotoxina. Los reguladores de pH utilizados durante este protocolo se hicieron libres de endotoxina haciéndolos pasar sobre una columna de sepharose Mono-Q de 5 mi (Pharmacia). La proteína se dividió uniformemente entre 4 tubos de 15 mi. El volumen de cada tubo se trajo a 9 mi con regulador de pH A. Se agregó 1 mi de 10% de Tritón X-1 4 a cada tubo y se incubaron con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos se hicieron girar a 2,000 rpm durante 10 minutos y la fase acuosa superior a partir de cada tubo se recolectó y la extracción del detergente de repitió. Las fases acuosas a partir de la segunda extracción se combinaron y se hicieron pasar sobre una columna de quelación IDA de 5 mi (Sigma), se cargaron con 0.1 M de NiCI2 para remover el detergente restante. La columna se lavó con 9 volúmenes de columna de regulador de pH A antes de que la proteína fuera eluida con 3 volúmenes de regulador de pH B. El eluyente se hizo pasar sobre una columna Detoxigel (Sigma) de 5 ml y el flujo directo se recolectó y se reaplicó a la columna. El flujo directo a partir de la segunda pasada se recolectó y se dializó en 1x de PBS. El producto purificado se analizó para el nivel de concentración, pureza y endotoxina antes de la administración en los ratones. La proteína y las secuencias de ácido nucleico se incluyen a continuación. La secuencia de aminoácido Clf40 se incluye a continuación como SEC ID NO: 2, y está codificada, a través de la secuencia de ácido nucleico SEC ID NO: 1, y también será codificada por degenerados del mismo. La secuencia de aminoácido C If 33 está incluida más adelante como SEC ID NO: 4, y esta está codificada pro la secuencia de ácido nucleico SEC ID NO:3 y también será codificada por degenerados de la misma.

Ejemplo 2. Producción de Anticuerpo Monoclonal Utilizando CIf40 v Clf33 La proteína Clf40 o Clf33 purificada se utilizó para generar un panel de anticuerpos monoclonales murino. Brevemente, un grupo de ratones Balb/c recibieron series de inmunizaciones subcutáneas de 50 µg de proteína Clf40 o Clf33 en solución o mezclada con el auxiliar como se describe más adelante en el Cuadro I: Cuadro 1 Inyección Día Cantidad g) Ruta Auxiliar 50 Subcutánea Freund Completo 5(Clf40) Intravenosa PBS 10(Clf33) Tres días después del fortalecimiento final, se removieron los bazos, se inhibieron en una suspensión de célula individual y los linfocitos de cosecharon. Los linfocitos después de fundieron a una línea de célula de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC#1581). La fusión de célula, subsecuente colocación en placas y alimentación se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de Producción de Anticuerpos onoclonales de Current Protocols in Immunoloqy (Capítulo 2, Unidad 2.). Cualesquiera clones que fueron generados a partir de la fusión después se clasificaron para la producción de anticuerpo anti-Clf40 específico utilizando un ensayo ELISA estándar. Además se expandieron y probaron los clones positivos. Se identificaron originalmente quince clones positivos y se clonaron limitando la dilución para caracterización adicional. Los clones de célula individual se probaron para actividad en una unión ELISA directa, ELISA modificada para medir la inhibición de la unión de fibrinogeno a CLF40, la unión de célula bacteriana total a través de citometría de flujo y afinidad para la unión a Clf40 a través de análisis Biacore. Los resultados de la prueba se incluyen en el Cuadro II a continuación: CUADRO II Unión a la Bacteria Completa Las muestras bacterianas de S. aureus (cepas Benett, 67-0, ATCC#25923 Y ATCC#49230) se recolectaron, se lavaron y se incubaron con Mab 13-2, 12-9, 13-1 o PBS solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios de la proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con FITC-Anti-Ratón-F(ab.)2-Cabra-F(a ')2 el cual sirvió como el anticuerpo de detección. Después de la marcación del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través de un citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana, se recolectaron 10,000 eventos y se midieron.

Inhibición (ELISA) Las placas de 96 cavidades de alta unión se revistieron con 1 mg/ml de solución de Clf40 en PBS (pH 7.4), se cubrieron, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas después se lavaron con PBS, 0.05% de Tween 20 y se bloquearon con 1% de solución de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el sobrenadante de anticuerpo monoclonal se agregó y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después de lavaron y se agregó 0.1 mg/ml de solución de fibrinógeno humano a cada cavidad. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se agregó conjugado AP anti-fibrinógeno de oveja a una dilución de 1:750 en PBS, 0.05% de Tween 20, 0.1% de BSA y se dejó en incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después de lavaron y se agregó pNPP (solución desarroiiadora) a una concentración final de 1 mg/ml. Las placas se incubaron 15-30 minutos a 37°C y los resultados se leyeron a 405 nm y se analizaron utilizando un lector de Bio-ensayo Perkin Elmer HTS 7000.

Análisis Cinético El análisis cinético se llevó a cabo sobre un Biacore 3000 utilizando el método de captura de Ligando incluido en el software. Un anticuerpo anti-ratón-Fc de conejo (Biacore) se acopló a amina a un chip C 5. El anticuerpo monoclonal que se está analizando después se hizo pasar sobre el chip, permitiendo la unión a la porción Fe. Diversas concentraciones de la proteína Clf40 o Clf 33 después se hicieron pasar sobre la superficie del chip y se recolectaron los datos. Al utilizar el software de Evaluación provisto por Biacore (Versión 3.1), se midieron kencend¡do y kapagado y se calcularon kA y KD.

EJEMPLO 3. Estudios Adicionales de CIf40 y Clf33 Utilizando PCR, se amplificó el dominio A de ClfA (Clf40 representando AA 40-559, el dominio Clf33-N2N3 representando AA 221-550 o el dominio Clf-N3 representando AA370-559) a partir de ADN genómico S. aureus Newman y se subclonó en el vector de expresión PQE-30 de E. coli (Qiagen), lo cual permite la expresión de una proteína de fusión recombinante conteniendo seis residuos de histidina. Este vector fue subsecuentemente transformado en la cepa ATCC 55151 de E. coli, crecida en un fermentador de 15 litros a una densidad óptica (OD6oo) de 0.7 e inducida con 0.2 mM de galactosida de isopropil-1 -beta-D (IPTG) durante 4 horas. Las células se cosecharon utilizando un ensamble de hueco-fibra de AG Technologies (tamaño de poro de 0.45 µ??) y la pasta de célula se congeló a -80°C. Las células se Usaron en 1X de PBS (10 mi de regulador de pH/1g de pasta de célula) utilizando dos pasadas a través de la prensa Press French a 77.33 kg/cm2. Las células lisadas se hicieron girar a 17,000 rpm durante 30 minutos para remover los fragmentos de célula. El sobrenadante se hizo pasar a través de una columna de Quelación HiTrap de 5 mi (Pharmacia) cargada con 0.1 de NiClz. Después de cargarla, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de 10 mM de Tris, pH 8.0, 100 mM de NaCI (regulador de pH A). La proteína se eluyó utilizando un gradiente de 0-100% de 10 mM de Tris, pH 8.0, 100 mM de NaCI, 200 mM de imidazol (regulador de pH B) sobre 30 volúmenes de columna. Clf40 o Clf 33 se eludieron en aproximadamente 13% de regulador de pH B (aproximadamente 26 mM de imidazol). La absorbancia 280 nm se monitoreó. Las fracciones conteniendo Clf40 o Clf33 se díalizaron en 1X de PBS. La proteína entonces se puso a través de un protocolo de remoción de endotoxina. Los reguladores de pH utilizados durante este protocolo se hicieron libres de endotoxina haciéndolos pasar sobre una columna de sepharose Mono-Q de 5 mi (Pharmacia). La proteína se dividió uniformemente entre 4 tubos de 15 m!. El volumen de cada tubo se trajo a 9 mi con regulador de pH A. Se agregó 1 mi de 10% de Tritón X-114 a cada tubo y se incubaron con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos se hicieron girar a 2,000 rpm durante 10 minutos y la fase acuosa superior a partir de cada tubo se recolectó y la extracción del detergente de repitió. Las fases acuosas a partir de la segunda extracción se combinaron y se hicieron pasar sobre una columna de quelación IDA de 5 ml (Sigma), se cargaron con 0.1 M de NiCI2 para remover el detergente restante. La columna se lavó con 9 volúmenes de columna de regulador de pH A antes de que la proteína fuera eluida con 3 volúmenes de regulador de pH B. El eluyente se hizo pasar sobre una columna Detoxigel (Sigma) de 5 ml y el flujo directo se recolectó y se reaplicó a la columna. El flujo directo a partir de la segunda pasada se recolectó y se dializó en 1x de PBS. El producto purificado se analizó para el nivel de concentración, pureza y endotoxina antes de la administración en los ratones.

Producción de Anticuerpo Monoclonal La proteína Clf40, Clf33 o N3 purificada se utilizó para generar un panel de anticuerpos monoclonales murino. Brevemente, un grupo de ratones Balb/c o SJL recibieron series de inmunizaciones subcutáneas de 1-10 mg de proteína en solución o mezclada con el auxiliar como se describe más adelante en el Cuadro III: CUADRO RIMMS Invección Día Cantidad Ruta Auxiliar #1 0 Subcutánea FCA/RIBI #2 2 Subcutánea FCA/RIBI #3 4 Subcutánea FCA/RIBI #4 7 Subcutánea FCA/RIBI #5 9 Subcutánea FCA/RIBI Convencional Invección Día Cantidad Ruta Auxiliar Primaria 0 5 Subcutánea FCA Fortalecida#1 14 1 Intraperitoneal RIBI Fortalecida#2 28 1 I ntraperitoneal RIBI Fortalecida#3 42 1 Intraperitoneal RIBI En el momento del sacrificio (RIM S) o siete días después de que un suero de fortalecimiento (convencional) se recogió y se tituló con ensayos de ELISA contra MSCRAMMs o sobre células completas (S. aureus y S. epidermis). Tres días después de la último fortalecimiento, se removieron los bazos o nodos de linfa, se alborotaron en una suspensión de célula individual y los linfocitos se cosecharon. Los linfocitos después se fundieron a una línea de célula de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC#1581). La fusión de célula, subsecuente colocación en placas y alimentación se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de Producción de Anticuerpos Monoclonales de Current Protocols in Immunoloqy (Capítulo 2, Unidad 2.). Cualesquiera clones que fueron generados a partir de la fusión después se clasificaron para la producción de anticuerpo anti-Clf40, SdrG o FnbpA específico utilizando un ensayo ELISA estándar. Los clones positivos se expandieron y se probaron adicionalmente. Los candidatos además se probaron para actividad en una unión directa a ELISA, una ELISA modificada para medir la inhibición de unión de fibrinógeno a CLF40, unión de célula bacteriana completa a través de citometría de flujo y unión/inhibición de Clf40 de unión fibrinógeno-Clf40 a través de análisis Biacore.

Análisis Biacore A lo largo del análisis, la velocidad de flujo permaneció constante a 10 ml/minuto. Antes de la inyección de CIfA 40, se adsorbió el anticuerpo de prueba en e chip a través de unión RAM-Fc. En el tiempo 0, CIfA 40 a una concentración de 30 mg/ml se inyectó sobre el chip durante 3 minutos seguido por dos minutos de disociación. Esta fase del análisis midió la asociación relativa y disociaciones cinéticas de la interacción Mab/CIfA. En la segunda fase del análisis, se midió la habilidad de la unión de Mab a CIfA para interactuar y unir fibrinógeno. El fibrinógeno a una concentración de 100 mg/ml se inyectó sobre el chip y después de 3 minutos se tomó un punto de reporte.

Unión a la Bacteria Completa Las muestras bacterianas (Newman) se recolectaron, se lavaron y se incubaron con Mab o PBS solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios de la proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con FITC-Anti-Ratón-F(ab')2-Cabra-F(ab')2 lo cual sirvió como la detección del anticuerpo. Después de la marcación del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través de un citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana, se recogieron 10,000 eventos y se midieron.

Inhibición ELISA Las placas de 96 cavidades de alta unión se revistieron con 1 ug/ml de solución de Clf40 en PBS (pH 7.4), se cubrieron, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas después se lavaron con PBS, 0.05% de Tween 20 y se bloquearon con 1% de solución de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el sobrenadante de anticuerpo monoclonal se agregó y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después de lavaron y se agregó 0.1 mg/ml de solución de fibrinógeno humano a cada cavidad. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se agregó conjugado AP anti-fibrinógeno de oveja a una dilución de 1:750 en PBS, 0.05% de Tween 20, 0.1% de BSA y se dejó en incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después de lavaron y se agregó pNPP (solución desarrolladora) a una concentración final de 1 mg/ml. Las placas se incubaron 15-30 minutos a 37°C y los resultados se leyeron a 405 nm y se analizaron utilizando un lector de Bio-ensayo Perkin Elmer HTS 7000.

EJEMPLO 4. Inmunización con todos o porciones de los anticuerpos monoclonales generados CIf40 con diferentes patrones de reactividad El cuadro IV a continuación muestra los resultados de pruebas de inmunización con las regiones activas de la presente invención, incluyendo Clf40, Clf 33 (el cual constituye la región N2N3 del dominio ClfA A), y la región sola de ClfA N3.

CUADRO IV Y = un resultado positivo N = un resultado negativo Nt = no probado Los resultados presentados en este cuadro muestran que las inmunizaciones para generar anticuerpos monoclonales con Clf40 o porciones de Clf40 (N2N3 o N3) producen anticuerpos monoclonales con perfiles de reactividad amplios y diversos y que exhiben reactividad cruzada substancial a través de una amplia variedad de cepas de estafilococo.

EJEMPLO 5. Uso del Biacore para seleccionar abs de alta afinidad que bloquean la unión de ClfA a Fibrinógeno Análisis Biacore A lo largo del experimento representado en la Figura 1, la velocidad de flujo permaneció constante a 10 ml/minuto. Antes de la inyección de ClfA 40, se adsorbieron 946 RU de Mab 13-1 y 768 RU de Mab 13-2 en el chip a través de la unión RAM-Fc. En el tiempo 0 en la gráfica, ClfA 40 a una concentración de 30 mg/ml se inyectó sobre el chip durante 3 minutos seguido por dos minutos de disociación. Mab 13-1 se une a RU de ClfA y Mab 13-2 se une a 168 RU de ClfA al final del tiempo de inyección de ClfA. Esta fase del experimento midió la relación de cinéticos de asociación y disociación de la interacción Mab/CIfA. En la segunda fase del experimento se mide la habilidad de la unión de Mab a ClfA para interactuar y unir fibrinógeno. El fibrinógeno a una concentración de 100 mg/ml se inyectó sobre el chip y después de 3 minutos 64 RU de fibrinógeno se une a la unión de ClfA a Mab 13-1, pero 0 Rus de fibrinógeno se une a la unión de Clfa a Mab 13-2.

EJEMPLO 6. Comparación de Mab 13.2 contra la cepa S.aureus Barnett y S. aureus ATCC 25923 Aumento gradual del Anticuerpo y Purificación Las células de hibridoma se hicieron crecer en RMPI/DMEM, 1X de medio Nutridota-SP conteniendo 2 mM de piruvato de sodio, 4 mM de L-glutamina y 2 X de penicilina-estreptomicina para 2-3 litros de volúmenes de cultivo. Los sobrenadantes de hibridoma después se cosecharon a través de centrifugación. Los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0.45 µ? y el IgG se purificó por afinidad utilizando cromatografía de proteína G. Los anticuerpos monoclonales se eludieron utilizando 0.1 M de glicina, pH 2.7 e inmediatamente se neutralizaron con un décimo del volumen de 2M de Tris, pH 8.0 El IgG purificado después de dializó contra 1X de salina regulada en su pH con D-fosfato, pH 7.4. Si es necesario, el anticuerpo purificado se concentró y los alícuotas se congelaron.

Cepas de Estafilococo aureus Las células S. aureus se tomaron a partir de material de abastecimiento de glicerol congelado y se inocularon en una placa de agar de sangre individual y se hicieron crecer durante 24 horas a 37°C. Después se transfirieron colonias individuales a nuevas placas de agar de sangre. Se inocularon ochenta placas para preparar 50 mis del material de abastecimiento congelado final. Las placas después se incubaron durante 24 horas a 37°C. Después de la incubación, las colonias se rasparon de la superficie de cada placa en cuatro tubos de 50 mi conteniendo 10 mis de 1X de PBS (20 placas por tubo) mientras se agitaban en forma espiral ligeramente para remover la bacteria del raspador. Después se agregaron 10 mis adicionales de 1X PBS a los 10 mis de suspensión bacterial, mientras de agitaba en forma espiral vigorosamente para facilitar la separación de cualesquiera restos de agar de la bacteria. La suspensión se aglomeró a través de centrifugación, 3500 xg a 4°C durante 10 minutos. La bacteria se lavó en D-PBS y se volvió a suspender en 50 mi s de medio de congelación. El material de abastecimiento bacterial se colocó en 1 mi de alícuotas mediante congelación rápida en un baño de etanol/hielo ceso y se colocó en un congelador a -80°C. La concentración (CFU/m) del material de abastecimiento congelado se determinó descongelando 1 mi de alícuota del material de abastecimiento, y preparando diluciones seriales de 10"5 a 10"11. Las diluciones se colocaron en placas por duplicado sobre placas de agar de sangre y se incubaron a 37°C durante 16-18 horas. El CFU/ml se determinó (CFU/ml = (# de colonias promedio X factor de dilución)/0.050 mis) y se promedió para cada dilución para determinar el CFU/ml promedio. En el día de la inyección, los alícuotas de cada cepa se descongelaron, se combinaron en un tubo por cepa, y se agitaron en forma espiral.

Animal, Sexo, Especies, Número, Edad y Fuente Se compraron ratones Balb/c hembras (5-6 semanas de edad) de Taconic Quality Laboratory Animáis and Services for Research (Germantown, NY). Los animales se dejaron aclimatar durante por lo menos 14 días antes de la iniciación del tratamiento. Una vez que llegaron, los ratones se examinaron, se alojaron en grupos (5 / jaula) en jaulas de caja de zapato de policarbonato con camas absorbentes. Todos los ratones se colocaron en un ciclo de luz-obscuridad de 12 horas bajo estándares de conservación requeridos encontrados en la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Identificación y Aleatorización Todos los animales fueron únicamente identificados utilizando tatuajes en la cola antes de la dosificación. Antes de la iniciación del tratamiento, los animales fueron individualmente pesados y se evaluó su salud. Los ratones fueron aleatorizados y asignados a grupos de tratamiento utilizando pesos del cuerpo estratificados.

Anticuerpos Monoclonales Específicos CIfA (Mab), Isotipo Los anticuerpos monoclonales murino específicos CIfA se isotipificaron utilizando un Isotipificador Dickenson Cytometric Bead Array for Murine Isotyping. El isotipo se determinó utilizando citometría de flujo de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. 13.1 Clf40 Mab, IgGi 13.2 Clf40 Mab, IgG-, 12.9 Clf40 Mab, \gG Controles ATTC 1771, IgG! La salina reguláda en su pH de fosfato, pH 7.4 (PBS) se compró en Life Technologies, Inc. (No. de catálogo 10010-023; No. de lote 1078749).

Diseño Experimental Datos del animal in vivo Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal (IP; 0.5 mi) con 0.5 mg de anticuerpo monoclonal 13-2, anticuerpo monoclonal de control de isotipo CRL-1771, o PBS. Los ratones se estimularon 18 horas después de la administración IgG con una inyección intravenosa individual (IV) de cepa S. aureus Barnett o S. aureus ATCC 25923. Los ratones se siguieron durante 12 días, punto en el cual todos los ratones restantes se sacrificaron. Se detectaron diferencias importantes en los tiempos de supervivencia relativos entre los grupos de tratamiento. Dieciocho por ciento (10/12) de los ratones que recibieron Mab 13-2, 13% (2/15) de los animales recibiendo CRL-1771 y 0% (0/15) de los que recibieron PBS sobrevivieron el estimulo bacterial con S. aureus Barnett (13-2 contra PBS, p<0.0001; 13-2 contra CRL-1771, p = 0.0009). El análisis estadístico de los datos de los animales se condujo utilizando un Análisis de Supervivencia Kaplan-Meler con una prueba Mantel-Cox (logrank). En el experimento en donde S. aureus ATCC 25923 fue el estimulo bacterial , 67% (8/12) de los ratones a los que se les administró Mab 13-2 sobrevivieron, 27% (4/12) sobrevivieron en el grupo de tratamiento CRL-1771, y solamente 7% (1/15) sobrevivió en el grupo de PBS (13-2 contra CRL-1771, p = 0.02; 13-2 contra PBS, 0.0002). Estos resultados claramente indican que los anticuerpos monoclonales específicos MSCRAMM proporcionan un nivel importante de protección contra infección letal con cepas S. aureus.

EJEMPLO 7. Aislamiento y Secuenciación de Secuencias de Región Variable A. Anticuerpo Monoclonal 13-2 ARIN Mensajero se aisló a partir de células de hibridoma 13-2 CIfA utilizando el equipo Fast Track 2.0 (Invitrogen; # catálogo 4500). Brevemente, las células de hibridoma 1.4x108 cultivadas en medio DMEM-10 con 10% de FBS se lavaron con PBS, se aglomeraron a través de centrifugación después se Usaron en detergente conteniendo Degradador de Proteína/RNase. Se aisló ARNm PoliA+ a través de purificación por afinidad sobre celulosa oligo-dT. La síntesis de la primera rama de ADNc se logró utilizando 5 g de ARNm y transcriptasa inversa en un equipo de síntesis de ADNc (Novagen; # de catálogo 69001-3) conteniendo 20 pmoles de iniciadores específicos de ratón de 3' oligonucleótido (Novagen # de catálogo 69796 y 69812) para cada cadena pesada variable y ligera variable. Una porción (5 a 50 ng) del ADNc se amplificó a través de reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando el Sistema Reactivo PCR (Life Technologies; cat # 10198-018) y un juego de iniciadores específicos de cadena pesada variable y ligera variable (Novagen; cat # 70081-3, 5 pmoles cada una) durante 30 ciclos (se inició a 94 C y después ciclos de 94 C durante 1 minuto, 50 C durante 1 minuto y 72 C durante 1 minuto). Los productos PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa ultra puro al 1% en regulador de pH de acetato de sodio y se visualizaron a través de tinción de bromuro de etidio. Los fragmentos PCR que coincidieron con el tamaño predicho se extirparon del gel y se purificaron utilizando columnas de giro BIO 101 Geneciean (cat # 1101-400) para ligación en plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por transformación en TOP 10 competente de E. coíi (Invitrogen; cat # 4500). Después de aislar el ADN de plásmido utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN; cat # 27106), los clones positivos con insertos se identificaron a través digestión de endonucleasa de restricción y eiectroforesis de gel de agarosa, seguido por secuenciación en un secuenciador automatizado ABI utilizando iniciadores M13 Hacia Delante y 13 en Reversa.

Las secuencias resultantes fueron como sigue: 13-2VLA-1 (secuencia ligera variable) AACATTATGATG CACAGTCFCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGC AGGAGAAAA GGTCACTATFAFCTFTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTC AAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAFCAGAAACCAGGGCAGTC TCCTAAACTACTGATC TAC TGGG CATC CACTAGGGAATCTGGTFTCCC TGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCAT CAADAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATA CCTCTCCTCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA NI MMTQSPSSLAVSAGEKVTMSKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQLP GQSPKLLI YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTI SVQAEDLAVYYCHQ YLSSHTFGGGTKLEIK • Los aminoácidos representando un CRD están subrayados. 13-2VCH-3 (secuencia pesada variable) CAGGTGCATCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCT CACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTTCTCTGGATTCTCATTATCC AGATATAATATACACTGGGTTCGACCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGA GTGGCTGGGAATGATATGGGTGGTGAAACACAGACTATAATTCAGCTC TAAATCCAGACTGAGCATCAGCAACACAGCCATGTACTACTGTGCCAG CGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCT GGTCACTGTCTCTGCA QVHLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSFGSLSRYNIHWVRQPPGKGL EWLGMIWGGENTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFMNSLQTDDTAMYYCA SAYYGNSWFAYWGQGTLVTVSA • Los aminoácidos representando una CDR están subrayados.

B. Anticuerpo Monoclonal 12-9.

ARN mensajero se aisló a partir de células de hibridoma ClfA 12-9 utilizando el equipo Fast Track 2.0 (Invitrogen; # catálogo 4500). Brevemente, las células de hibridoma 1.4x108 cultivadas en medio DME - 0 con 10% de FBS se lavaron con PBS, se aglomeraron a través de centrifugación después se lisaron en detergente conteniendo Degradador de Proteína/RNase. Se aisló ARNm PoliA+ a través de purificación por afinidad sobre celulosa oligo-dT. La síntesis de la primera rama de ADNc se logró utilizando 5 µg de ARNm y transcriptasa inversa en un equipo de síntesis de ADNc (Novagen; # de catálogo 69001-3) conteniendo 20 pmoles de iniciadores específicos de ratón de 3' oligonucleótído (Novagen # de catálogo 69796 y 69812) para cada cadena pesada variable y ligera variable. Una porción (5 a 50 ng) del ADNc se amplificó a través de reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando el Sistema Reactivo PCR (Life Technologies; cat # 10198-018) y un juego de iniciadores específicos de cadena pesada variable y ligera variable (Novagen; cat # 70081-3, 5 pmoles cada una) durante 30 ciclos (se inició a 94 C y después ciclos de 94 C durante 1 minuto, 50 C durante 1 minuto y 72 C durante 1 minuto). Los productos PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa ultra puro al 1% en regulador de pH de acetato de sodio y se visualizaron a través de tinción de bromuro de etidio. Los fragmentos PCR que coincidieron con el tamaño predicho se extirparon del gel y se purificaron utilizando columnas de giro BIO 101 Geneclean (cat # 1101-400) para ligación en plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por transformación en TOP 10 competente de E. coli (Invitrogen; cat # K4500). Después de aislar el ADN de plásmido utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (Ql AGEN; cat # 27106), los clones positivos con insertos se identificaron a través digestión de endonucleasa de restricción y electroforesis de gel de agarosa, seguido por secuenciación en un secuenciador automatizado ABI utilizando iniciadores 13 Hacia Delante y M13 en Reversa. secuencias resultantes fueron como sigue 13-2VLA-1 (secuencia ligera variable) AACATTATGATGACACAGTCFCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGC AGGAGAAAAGGTCACTATFAFCTFTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATAC AGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAFCAGAAACCAGGG CAGTCTCCTAAACTACTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGT FTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTT ACCATCAADAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAT CAATACCTCTCCTCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAA I MTQSPSSLAVS AGE VTMSKSSQSVLYSSNQ N YLAWYQQLP GQSPKLLI YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTI NSVQAEDLAVYYCHQ YLSSHTFGGGTKLE1K • Los aminoácidos representando un CRD están subrayados. 12-9VHC-1 (secuencia pesada variable) CAGGTGCATCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCT CACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTTCTCTGG ATTCTCATTATCC AGATATAATATACACTGGGTTCGACCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGA GTGGCTGGGAATGATATGGGTGGTGAAACACAGACTATAATTCAGCTC TAAATCCAGACTGAGCATCAGCAACACAGCCATGTACTACTGTGCCAG CGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCT GGTCACTGTCTCTGCA QVQLKESGPGLAVAPSQSLSITCAISGFSLSRYSVH.WVRQPPGKG LEWLGMIWGGGNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFKMNSLQTDDTAMYY CARKGEFYYGYDGFVYWGQGTLVTVSA • Los aminoácidos representando un CRD están subrayados.

C. Anticuerpo Monoclonal 35-220 Aislamiento y Secuenciación de Secuencias de Región Variable: ARN mensajero se aisló a partir de células de hibridoma ClfA 35-220 utilizando el equipo Fast Track 2.0 (Invitrogen; # catálogo 4500). Brevemente, las células de hibridoma 1.4x108 cultivadas en medio DMEM-10 con 10% de FBS se lavaron con PBS, se aglomeraron a través de centrifugación después se Usaron en detergente conteniendo Degradador de Proteína/RNase. Se aisló ARNm Pol¡A+ a través de purificación por afinidad sobre celulosa ollgo-dT. La síntesis de la primera rama de ADNc se logró utilizando 5 µg de ARNm y transcriptasa inversa en un equipo de síntesis de ADNc (Novagen; # de catálogo 69001-3) conteniendo 20 pmoles de iniciadores específicos de ratón de 3! oligonucleótido (Novagen # de catálogo 69796 y 69812) para cada cadena pesada variable y ligera variable. Una porción (5 a 50 ng) del ADNc se amplificó a través de reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando el Sistema Reactivo PCR (Life Technologies; cat # 10198-018) y un juego de iniciadores específicos de cadena pesada variable y ligera variable (Novagen; cat # 70081-3, 5 pmoles cada una) durante 30 ciclos (se inició a 94 C y después ciclos de 94 C durante 1 minuto, 50 C durante 1 minuto y 72 C durante 1 minuto). Los productos PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa ultra puro al 1% en regulador de pH de acetato de sodio y se visualizaron a través de tinción de bromuro de etidio. Los fragmentos PCR que coincidieron con el tamaño predicho se extirparon del gel y se purificaron utilizando columnas de giro BIO 101 Geneclean (cat # 1101-400) para ligación en plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por transformación en TOP 10 competente de E. coli (Invitrogen; cat # K4500). Después de aislar el ADN de plásmido utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN; cat # 27106), los clones positivos con insertos se identificaron a través digestión de endonucleasa de restricción y electroforesis de gel de agarosa, seguido por secuenciación en un secuenciador automatizado ABI utilizando iniciadores 13 Hacia Delante y 13 en Reversa.

Las secuencias resultantes fueron como sigue: 35-220VLD-4 (ADN de secuencia ligera variable) AACATTATGATGACACAGTCFCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGC AGGAGAAAAGGTCACTATFAFCTFTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATAC AGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAFCAGAAACCAGGG CAGTCTCCTAAACTACTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGT FTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTT ACCATCAADAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAT CAATACCTCTCCTCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAA 35-220VLD-4 (secuencia ligera variable) N I M M T Q S P S S L A V S A G E K V T S C R S S Q S V L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q S P T L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S V Q A E D L A V Y Y H Q Y L S S Y T F G G G T K L W I K Los aminoácido representando CDR están subrayados. 35-220VHC-1 (ADN de secuencia pesada variable) CAGGTGCATCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCT CACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTTCTCTGGATTCTCATTATCC AGATATAATATACACTGGGTTCGACCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGA GTGGCTGGGAATGATATGGGTGGTGAAACACAGACTATAATTCAGCTC TAAATCCAGACTGAGCATCAGCAACACAGCCATGTACTACTGTGCCAG CGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCT GGTCACTGTCTCTGCA 35-220VHC-1 (secuencia pesada variable) Q V Q L K E S G P G L V A P S Q S L S I T C T V S G F S L S R Y S V H W V R Q P P G K G L E W L G M I W G G G N T D Y N S A L K S R L S I T K D N S K S Q F L K M N S L Q T D D T A Y Y C A T A Y Y G N S W F A W G Q G T L V T V S A Los aminoácido representando CDR están subrayados.

D. Anticuerpo Monoclonal 35-006 ARN mensajero se aisló a partir de células de hibridoma ClfA 35-006 utilizando el equipo Fast Track 2.0 (Invitrogen; # catálogo 4500). Brevemente, las células de hibridoma 1.4x10a cultivadas en medio DMEM-10 con 10% de FBS se lavaron con PBS, se aglomeraron a través de centrifugación después se lisaron en detergente conteniendo Degradador de Proteína/RNase. Se aisló ARNm PoliA+ a través de purificación por afinidad sobre celulosa oligo-dT. La síntesis de la primera rama de ADNc se logró utilizando 5 mg de ARNm y transcriptasa inversa en un equipo de síntesis de ADNc (Novagen; # de catálogo 69001-3) conteniendo 20 pmoles de iniciadores específicos de ratón de 3' oligonucleótido (Novagen # de catálogo 69796 y 69812) para cada cadena pesada variable y ligera variable. Una porción (5 a 50 ng) del ADNc se amplificó a través de reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando el Sistema Reactivo PCR (Life Technologies; cat # 10198-018) y un juego de iniciadores específicos de cadena pesada variable y ligera variable (Novagen; cat # 70081-3, 5 pmoles cada una) durante 30 ciclos (se inició a 94 C y después ciclos de 94 C durante 1 minuto, 50 C durante 1 minuto y 72 C durante 1 minuto). Los productos PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa ultra puro al 1% en regulador de pH de acetato de sodio y se visualizaron a través de tinción de bromuro de etidio. Los fragmentos PCR que coincidieron con el tamaño predicho se extirparon del gel y se purificaron utilizando columnas de giro BIO 101 Geneclean (cat # 1101-400) para ligación en plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por transformación en TOP 10 competente de E. coli (Invitrogen; cat # K4500). Después de aislar el ADN de plásmido utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN; cat # 27106), los clones positivos con Insertos se identificaron a través digestión de endonucleasa de restricción y electroforesis de gel de agarosa, seguido por secuenciación en un secuenciador automatizado ABI utilizando iniciadores M13 Hacia Delante y M13 en Reversa.

Las secuencias resultantes fueron como sigue: 35-006VLD-1 (ADN de secuencia ligera variable) AACATTATGATGACACAGTCFCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGC AGGAGAAAAGGTCACTATFAFCTFTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATAC AGTTCAAATCAG AAGAACTACTTGGCCTGGTACCAFCAGAAACCAGGG CAGTCTCCTAAACTACTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGT FTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTT ACCATCAADAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAT CAATACCTCTCCTCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAA 35-006VLD-1 (secuencia ligera variable) N I M T Q S P S S L A V S A G E K V T M S C K S S Q S V L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q S P K L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S V Q A E D L A V Y Y H Q Y L S S Y T F G G G T E L E I K Los aminoácido representando CDR están subrayados. 35-006VHC-1 (ADN de secuencia pesada variable) CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCT CACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTATCCA GATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAG TGGCTGGGAASTGATATGGGGTTGGTGGAAGCACAGACTATAATTCAG CTCTCAAATCCAGACTGAACATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAG TTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGACAAACTGATGACACAGCCATGTACT ACTGTGCCAGAAGGCTCTGGTACTTCGATGRCTGGGGCGCAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCA 35-006VHC-1 (secuencia pesada variable) Q V Q L K E S G P G L V A P S Q S L S I T C T V S G F S L S R Y S V H W V R Q P P G K G L E W L G M I W G G G N T D Y N S A L K S R L N I S K D N S K S Q V F L K M N S L Q T D D T A M Y Y C A R R L W F Y F D V W G A G T T V T V S S Los aminoácido representando CDR están subrayados.

EJEMPLO 8. Generación de Quimérico 12-9 con Equivalencia en Cinéticos de Unión y Reactividad de Célula Completa a Murino 12-9 Se generó el quimérico 12-9 utilizando regiones constantes humanas (cadena ligera: kapa; cadena ligera; G1, 3 o 4) aisladas de sangre completa de voluntarios seres humanos (selección a través de ARN Poli A y amplificación de PCR de la primera rama de ADNc). Para la expresión en células de mamífero, se agregó un único sitio de restricción Bsm 1 al extremo 5' de ambas secuencias de región de cadenas variables, pesada y ligera. En el extremo 3' (la unión de empalme a la región constante respectiva) se agregó un sitio Bsiwl a la región variable de cadena ligera y un se agregó un sitio Apa1 a la región variable de cadena pesada. Esto se logró a trabes del diseño de iniciadores de oligonucleótido y amplificación de PCR a la plantilla de ADN 12-9 apropiada seguido por secuenciación de ADN de confirmación. La expresión de las versiones quiméricas de la proteínas 12-9 se logró utilizando el vector de expresión de mamífero pCEP4 (Invitrogen, cat # V044-50) conteniendo una secuencia de secreción líder de inmunoglobulina humana (Bsm1 como el sitio de clonación) con una región constante kapa para la expresión de cadena ligera o región constante gama (1,3 o 4) para la expresión de la cadena pesada. El plasmido de expresión de mamífero fue diseñado para expresión en ambas cadenas ligera y pesada con promotores hCMV separados en el mismo plasmido o la expresión de las cadenas ligera y pesada sobre plásmidos pCEP4 separados a través de co-transfección . El quimérico funcional 12-9 se expresó después de la transfección del ADN de plásmido conteniendo las cadenas ligera y pesada de 12-9 en células HEK293 EBNA con Fugeno (Roche Diagnostics, cat # 1814443) bajo selección de higromicina (300 µg/ml). Los sobrenadantes se cosecharon y se analizaron mediante Biacore para la unión de cinéticos y citometría de flujo para unión a células de S. aureus . Los resultados representados en las Figuras 2 y 3 con quiméricos recombinantes 12-9 confirman que la secuencia de las cadenas ligera y pesada de 12-9 replican la unión de cinéticos y especificidad de 12-9 original caracterizados por un sobrenadante de hibridoma.

EJEMPLO 9. Humanización de las Regiones Variables de Cadena Pesada y Ligera de 12-9 Este proceso de humanización se enfoca en cambiar solamente los residuos expuestos del solvente a las regiones variables de ratón que no están involucradas en la especificidad y afinidad de molécula para el antígeno objetivo ClfA. La información para estas determinaciones utilizó las determinaciones de disponibilidad de solvente publicadas por Parlan (A molecular procedure por reducing the immunogencity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties. Molecular Immunology, 28(4); 489-498, 1991) y moldeado molecular en silicio o algoritmos para determinar epítopos de célula T cuando no se utilizan para estas determinaciones. El método representa un proceso a través del cual los residuos de región variable de ratón de la cadena ligera y pesada son cambiadas a través de mutagénesis dirigida al sitio para reflejar la arquitectura expuesta de superficie de la mayoría de las regiones variables humanas homologas para la base de datos pública. Específicamente, los aminoácidos definiendo las cadenas variables pesada y ligera se asignaron a un número de posición Kabot y designación de "exposición" con base de Parlan, permitiendo la alineación de los aminoácidos a partir de cada sub-grupo de marco de trabajo humano (l-lll para la cadena pesada y l-IV para la cadena ligera). Para soportar este análisis, una búsqueda BLAST se llevó a cabo en la base de datos de inmunoglobulina humana así como la base de datos de la proteína entera en donde la región variable con la homología más alta a la secuencia de ratón (ambas, línea de germen y madura) se seleccionaron y alinearon con la secuencia murino de interés. Una vez alineada, se identificó el subgrupo humano con la homología más alta a la secuencia de ratón. Los residuos de aminoácidos expuestos se mutaron a mímicos del subgrupo humano más homólogo. En casos en donde se encontró más de un aminoácido en el subgrupo en esa posición, el aminoácido representado en la línea de germen humano con la homología más alta a 12-9 se utilizó. Estos cambios se lograron con oligonucleótidos mutagénicos a través de PCR seguido por secuenciación de ADN conformacional. 12-9VL-Hu (ADN de secuencia ligera variable humanizada) GACATTGTGATGACACATCGCCAGACTCTCTGGCTGTGTCTCTG GGAGAAAGGGTCACTATGAACTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATAC AGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGG CAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGT GTCCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTT ACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAT CAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAA 12-9VL-Hu (secuencia ligera variable humanizada) DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQK PGQSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFFTLTISSVQAEDLAVYYC HQYLSSYFGGGTKLEIK Los aminoácidos representando un CDR están subrayados, los aminoácido en negritas representan cambios de humanización. 12-9VH-Hu (ADN de secuencia pesada variable humanizada) CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTTGGTGAAGCCC TCACAGACCCTGTCCATRCACATGCACCATCTCTGGGTTCTCATTATC CAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGG AGTGGCTGGGAASTGATATGGGGTGGTFAAACACAGACTATAATTCAG CTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAACCAAG TTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGACCGCCGCTGACACAGCCGTGTATT ACTGTGCCAGAAAAGGGGAATTCTACTATGGTTACGACGGGTTTGTTT ACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC 12-9VH-Hu (secuencia pesada ligera humanizada) QVQLKESGPGLVKPSQTLSITCTISG FSLSRYSVHWVRQPPG GL EQLGMIWGGGNTDYNSALKSRLSISKDNSKNQVFLK NSLTAADTAVYY CARKGEFYYGYDGFVYWQGGTLVTVSS Los aminoácidos representando un CDR están subrayados, los aminoácido en negritas representan cambios de humanización.

EJEMPLO 10. Comparación de los anticuerpos monoclonales ClfA, 12-9 (INH-M010001) y 35-052.1 (INH-M01016), con el anticuerpo CRL11771 de control comparado de isotipo, INH-M000029, en un modelo de sepsis de ratón utilizando la Cepa S. aureus Resistente a Meticilina 67-0 (MRSA).

El propósito de este ejemplo es caracterizar los efectivos protectivos de los anticuerpos monoclonales ClfA, 12-9A (INH- 010001) y 35-052.1 (INH-M01016) comparados con el anticuerpo CRL1771 de control comparado con isotipo (I N H- 000029) utilizando una dosis de 0.3 mg de anticuerpo y la cepa S. aureus 67-0 en un modelo sepsis de ratón.

Rango estimado a a iniciación del estudio.

La dosificación fue realizada mediante la administración de una inyección intraperi.toneal (i.p.) del anticuerpo monoclonal a los animales adecuados (ver abajo). La administración del anticuerpo fue efectuada aproximadamente 1.8 horas antes de la inyección del S. aureus por vía intravenosa (i.v.). Se mide la infección sistémica utilizando un parámetro simple (mortalidad).

* Los puntos en el tiempo reflejan las horas después del estimulo bacterial.

Preparación, Almacenamiento y Manejo: Sthaphylococcus aureus Se tomaron células RS de la cepa 67-0 de un material de abastecimiento de glicerol congelado y se inocularon en un placa de agar de sangre individual durante 24 horas a 37°C. Después se transfectaron colonias individuales de nuevas placas de agar de sangre. Se inocularon ochenta placas para preparar 50 mi de material de abastecimiento congelado final. Las placas después se incubaron durante 24 horas a 37°C. Después de la incubación, las colonias se rasparon de la superficie de cada placa en cuatro tubos de 50 mi conteniendo 10 mis de 1X de PBS (20 placas por tubo) con agitación en espiral ligera para remover la bacteria del raspador. Después se agregaron 10 mis adicionales de 1X PBS a los 10 mis de suspensión bacterial, mientras de agitaba en forma espiral vigorosamente para facilitar la separación de cualesquiera restos de agar de la bacteria. La suspensión se aglomeró a través de centrifugación, 3500 xg a 4°C durante 10 minutos. La bacteria se lavó en D-PBS y se volvió a suspender en 50 mi s de medio de congelación. El material de abastecimiento bacterial se colocó en 1 mi de alícuotas mediante congelación rápida en un baño de etanol/hielo ceso y se colocó en un congelador a -80°C. La concentración (CFU/m) del material de abastecimiento congelado se determinó descongelando 1 mi de alícuota del material de abastecimiento, y preparando diluciones seriales de 10~5 a 10"11. Las diluciones se colocaron en placas por duplicado sobre placas de agar de sangre y se incubaron a 37°C durante 16-18 horas. El CFU/ml se determinó (CFU/ml = (# de colonias promedio X factor de dilución)/0.050 mis) y se promedió para cada dilución para determinar el CFU/ml promedio. En el día de la inyección, los alícuotas de cada cepa se descongelaron, se combinaron en un tubo por cepa, y se agitaron en forma espiral. Después se prepararán la diluciones para cada material de abastecimiento.

Anticuerpo Monoclonal ClfA 12-9A, INH-M010001 (LN: IAA2E1354) El anticuerpo monoclonal 12-9A (subtipo I g G ) se purificó a partir de medio de cultivo de hibridoma libre de suero utilizando cromatografía de afinidad de proteína G. El material se reportó estando a una concentración de 7.0 mg/ml con una concentración de endotoxina de 1.0 EU/mg de proteína. El material se almacenó refrigerado a 4°C. En el día de la inyección, el material será diluido a 0.6 mg/ml y será administrado a 0.5 mi a través de una inyección intraperitoneal al grupo apropiado de animales. La dosis final que será administrada será de 0.3 mg de IgG.

Anticuerpo Monoclonal ClfA 35-052.1, INH-M01016 IAA2H1422) El anticuerpo monoclonal 35-052 (subtipo IgG!) se purificó a partir de medio de cultivo de hibridoma libre de suero utilizando cromatografía de afinidad de proteína G. El material se reportó estando a una concentración de 4.2 mg/ml con una concentración de endotoxina de 1.0 EU/mg de proteína. El material se almacenó refrigerado a 4°C. En el día de la inyección, el material será diluido a 0.6 mg/ml y será administrado a 0.5 mi a través de una inyección intraperitoneal al grupo apropiado de animales. La dosis final que será administrada será de 0.3 mg de IgG.

Anticuerpo Monoclonal de Control CRL 1771, INH-M000029 (LN: IAA2E1337) El anticuerpo monoclonal CRL 1771 (subtipo IgG!) se purificó a partir de medio de cultivo de hibridoma libre de suero utilizando cromatografía de afinidad de proteína G. El material se reportó estando a una concentración de 5.0 mg/ml con una concentración de endotoxina de 0.2 EU/mg de proteína. El material se almacenó refrigerado a 4°C. En el día de la inyección, el material será diluido a 0.6 mg/ml y será administrado a 0.5 mi a través de una inyección intraperitoneal al grupo apropiado de animales. La dosis final que será administrada será de 0.3 mg de IgG.

Alojamiento, Alimento, Agua, y Ambiente: Después de la recepción, todos los animales se examinaron y el grupo de alojó (5/jaula) en jaulas estilo caja de zapatos de policarbonato con camas de paja estilo caja de zapato absorbentes. Todos los animales tienen libre acceso a la alimentación (Harlan/Teklad Mouse Pelleted Diet #7012) y un grifo de agua con un ciclo de luz-obscuridad de 12 horas. Todos los aspectos del cuidado del animal y las condiciones de conservación requeridas será de acuerdo con la guía NIH Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Identificación y Aleatorización: Todos los ratones fueron excepcionalmente identificados mediante tatuajes en la cola antes del tratamiento. Antes del tratamiento, los ratones fueron individualmente pesos y su salud re-evaluada. Los ratones fueron asignados a grupos de tratamientos con base en aleatorización mediante pesos de cuerpo estratificados.

Los datos demuestran el valor terapéutico de un anticuerpo anti-ClfA tal como 12-9 que interactua con adhesión ClfA-fibrinógeno con un control de isotipo específico ClfA (CRL 1771) así como un control específico (35-052) que reconoce ClfA en el sitio independiente de la unión ClfA-fibrinógeno.

EJEMPLO 11. Reconocimiento de la Cepa S. aureus de 12-9 y 35-052 Comparada con el Control de Isotipo (CRL 1771) Se recolectaron muestras bacterianas S. aureus (cepas Newman- WT, 67-0, 560 Sal 1, 203 Sal 2, 451 Sal 4, 206 Sal5, 397 Sal 6, 49, 189, 203 y 4046) en 3 horas y durante la noche, se lavaron y se incubaron con Mab 12-9, 15.52 o 1171 solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquea los sitios de proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Las cepas S. aureus conteniendo una designación Sal representan 5 linajes distintos contabilizados para 65.68% de todos los aislados clínicos (Booth y otros, Infecí. Immun. 69, 345-353, 2001). Así como, ClfA::emr Newman (aniquilación de ClfA) y Newman Spa::kan (Aniquilación de Proteína A) se analizaron en la misma forma que los controles de especificidad. Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con FITC-Anti-Ratón-F{ab')2-Cabra-F(ab )2 lo que sirvió como el anticuerpo de detección. Después de la marcación del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través del citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana, se recolectaron 10,000 eventos y se midieron. CUADRO IV O Indica actividad positiva Los datos hacen sobresalir la importancia de seleccionar un anticuerpo anti-CIfA (tal como 12-9) que es capaz de reconocer un epítopo funcional en la molécula ClfA: es decir el sitio de unión para f ibrinógeno. Otro juego de aislados S. aureus, una representación de 11 diferentes complejos de genotipo clonal diferentes identificados como desproporcionalmente comunes según son causas enfermedades, derivados a través de digitalización de secuencia multi-lugares (Day, y otros, 2001. A link between virulence and ecological abundante in natural populations of Staphylococcus aureus. Science, 292:114-116). Cada cepa se probó para reactivad contra 12-9 mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.

CUADRO VII. Reactividad de 12-9 con aislados de S. aureus Esta reactividad además demuestra la conservación del epítopo 12-9 en cepas aisladas cruzadas ClfA de S. aureus, sugiriendo que la unión ClfA-fibrinógeno está funcionalmente conservada.

EJEMPLO 12. Homología de Región Variable en Anticuerpos Anti-ClfA que Inhiben la Unión de la Célula Completa S. aureus Un resultado inesperado a partir de la selección de anticuerpos anti-CIfA con base en su habilidad para inhibirla unión de ClfA a fibrinógeno fue la similitud en las secuencias de amino de región de determinación complementaria (CDR) de las regiones de cadena variable pesada y ligera. Para perfilar esto, los anticuerpos anti-CIfA se seleccionaron sobre las bases de inhibición de la célula completa S. aureus de unión a placas cubiertas con fibrinógeno utilizando el siguiente procedimiento: Los anticuerpos de interés se diluyeron serialmente iniciando a 4 µg/ml en regulador de pH de ensayo.

Concurrentemente, un cultivo durante la noche de S. aureus (Newman spa::kan) se lavó, se bloqueó con IgG de conejo después se tiñó con tinte de ADN fluorescente permeable de célula Syto 13 y se incubó durante 10 minutos. Iguales volúmenes de células teñidas y anticuerpo diluido se mezclaron y se incubaron a 4°C durante 30 minutos, después cada muestra se agregó a células duplicadas de una placa de microtilulación de fibrinógeno humano cubierto/bloqueado. Las placas se incubaron a 4°C durante una hora, se lavaron, se agregó regulador de pH a cada cavidad y se leyó en un lector de placas fluorescente.

Las cadenas variables ligera y pesada de los monoclonales anti-ClfA, 12-9, 13-2, 35-006 y 35-220 así como CRL 1771 (control no específico) se clonaron y se secuenciaron para derivar una secuencia de aminoácido predicha en la siguiente forma: Brevemente, 1.4x108 células de hibridoma cultivadas en medio DMEM-10 con 10% de FBS se lavaron con PBS, se aglomeraron a través de centrifugación, después se lisaron en detergente conteniendo conteniendo Degradador de Proteína/RNase. Se aisló ARNm PoliA+ a través de purificación por afinidad sobre celulosa oligo-dT. La síntesis de la primera rama de ADNc se logró utilizando 5 µg de ARNm y transcriptasa inversa en un equipo de síntesis de ADNc (Novagen; # de catálogo 69001-3) conteniendo 20 pmoles de iniciadores específicos de ratón de 3' oligonucleótido (Novagen # de catálogo 69796 y 69812) para cada cadena pesada variable y ligera variable. Una porción (5 a 50 ng) del ADNc se amplificó a través de reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando el Sistema Reactivo PCR (Life Technologies; cat # 10198-018) y un juego de iniciadores específicos de cadena pesada variable y ligera variable (Novagen; cat # 70081-3, 5 pmoles cada una) durante 30 ciclos (se inició a 94 C y después ciclos de 94 C durante 1 minuto, 50 C durante 1 minuto y 72 C durante 1 minuto). Los productos PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gei de agarosa ultra puro al 1% en regulador de pH de acetato de sodio y se visualizaron a través de tinción de bromuro de etidio. Los fragmentos PCR que coincidieron con el tamaño predicho se extirparon del gei y se purificaron utilizando columnas de giro BIO 101 Geneclean (cat # 1101-400) para ligación en plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por transformación en TOP 10 competente de E. coli (Invitrogen; cat # K4500). Después de aislar el ADN de plásmido utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN; cat # 27106), los clones positivos con insertos se identificaron a través digestión de endonucleasa de restricción y electroforesis de gel de agarosa, seguido por secuenciación en un secuenciador automatizado ABI utilizando iniciadores M13 Hacia Delante y M13 en Reversa. Como se muestra en la Figura 7, los datos muestran que existen una conservación considerable de la mayoría de la porción variable de la cadenas de inmunoglobulina que definen la especificidad de unión para monoclonales anti-CIfA con inhibición de la unión de S. aureus a fibrinógeno. Esta homología está representada a partir de tres diferentes fusiones generando hibridoma (12, 13 y 15); bajo condiciones variables tales como la estructura del antígeno Clf-A, el método y secuencia de las inmunizaciones antes de la fusión. In particular, estos datos revelan regiones conservadas de consenso en las regiones CDR1 y CDR2 de la cadena pesada variable de anticuerpos monoclonales unidos a ClfA así como regiones conservadas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligeras variables de los anticuerpos de la presente invención. Estos datos de esta manera muestran que la preparación de anticuerpos con las secuencias conservadas podría tener las mismas propiedades de unión y así caerán dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos que se unirán a ClfA pueden ser preparados utilizando cadenas variables ligera o pesada que tienen las mismas regiones CDR clave como se indica en el consenso de la Figura 8. En particular, estos anticuerpos incluirán aquellos que tienen una cadena pesada en donde la región CDR1 incluye la secuencia RYSVH, y/o una región CDR2 que incluye la secuencia MIWGGGNTDYNSALKS, y una cadena ligera variable que tiene una región CDR1 que incluye la secuencia KSSQSVLYSSNQKNYLA, una región CDR2 que incluye la secuencia WASTRES y/o una región CDR3 que incluye la secuencia HQYLSSYT.

EJEMPLO 13. Expresión de 12-9 Humanizado para Uso Pre-clínico y Clínico Para expresión simultánea de las cadenas de polipéptido de inmunoglobulina pesada y ligera, los dos genes se clonaron e un plásmido individual con cada gen bajo el control de un promotor hCMV-??? separado. Este vector de gen doble mantiene una copia individual del marcador seleccionable GS (Lonza; Slough, UK) para la introducción dentro de la célula huésped en un evento de transfección individual. Las células se transfectaron utilizando Fugeno-6 (Roche) bajo condiciones sugeridas por el fabricante. Los sobrenadantes se probaron a partir de líneas de células transitorias o estables y se compararon con derivados de murino y quiméricos 12-9. Este ejemplo demuestra que 12-9 humanizado puede ser humanizado, clonado y expresar un cásete de expresión individual capaz de producir soporte para cualidad y pureza a escala comercial.

Claims (37)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que se une a la proteína ClfA a partir de S. aureus.

2. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es cultivado contra una proteína seleccionada del grupo que consiste de proteína S. aureus Clf40, la proteína S. aureus C If 33 , y la proteína S. aureus ClfA N3.

3. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo trata o previene infección por S. aureus en un ser humano o animal.

4. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo inhibe la unión de bacterial por estafilococo a fibrinógeno o fibrina.

5. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo es adecuado para administración parenteral, oral, intranasal, subcutánea, en aerosol o administración intravenosa en un ser humano o animal.

6. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es de un tipo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales murino, quiméricos, humanizados y humanos.

7. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cadena individual.

8. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, el cual comprende un fragmento de anticuerpo que tiene la misma especificidad de unión de un anticuerpo que se une a la proteína S. aureus CIfA.

9. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que es cultivado contra una proteína que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 4.

10. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína tiene una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico de conformidad con SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3, o degenerados de la misma.

11. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una cadena ligera variable teniendo una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 18.

12. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una secuencia ligera variable codificada por una secuencia de ácido nucleico de conformidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 9; SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 17 y degenerados de las mismas.

13. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 20.

14. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una cadena pesada ligera codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 19 y degenerados de las mismas.

15. Antisuero aislado que contiene un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

16. Un equipo de diagnostico que comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y medios para la detección de la unión a través de ese anticuerpo.

17. Un equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque dichos medios para detectar la unión comprenden una etiqueta detectable que está enlazada a dicho anticuerpo.

18. Un método para diagnosticar una infección de S. aureus que comprende agregar un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, a una muestra con sospecha de estar infectada con S. aureus, y determinar si los anticuerpos se han unido a la muestra.

19. Una composición farmacéutica para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende una cantidad efectiva del compuesto de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

20. Un método para tratar o prevenir una infección por S. aureus que comprende administrar a un paciente ser humano o animal una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

21. Un método para inducir una respuesta inmunológica que comprende administrar a un ser humano o animal una cantidad inmunogénica de una proteína ClfA aislada de S. aureus seleccionada del grupo que consiste de proteína S. aureus Clf40, proteína S. aureus Clf 33 y la proteína S. aureus N3.

22. Un método para identificar anticuerpos monoclonales a la proteína ClfA que comprende agregar una proteína aislada seleccionada del grupo que consiste de S. aureus Clf40, S. aureus Clf33 y S. aureus N3 a una muestra con sospecha de contener anticuerpos anti-CIfA, y determinar si los anticuerpos se han unido a la proteína aislada agregada a la muestra.

23. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la habilidad de unirse a la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2.

24. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la habilidad de unirse a una secuencia de aminoácido codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1 o degenerados de la misma.

25. Un fragmento activo aislado a partir del dominio A de la proteína ClfA de S. aureus seleccionada del grupo que consiste de proteína Clf40, proteína Clf33 y la región ClfA N3.

26. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende además un antibiótico fisiológicamente aceptable.

27. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena pesada variable tiene una región CDR1 que incluye una secuencia RYSVH.

28. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena pesada variable tiene una región CDR2 que incluye la secuencia MI WGGGNTDYNSALKS.

29. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena pesada variable tiene una región CDR1 que incluye la secuencia KSSQSVLYSSNQKNYLA.

30. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena ligera variable tiene una región CDR2 que incluye la secuencia WASTRES.

31. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena ligera variable tiene una región CDR3 que incluye la secuencia HQYLSYT.

32. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, que tiene reacción cruzada a múltiples cepas de S. aureus.

33. Un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cadena ligera variable tiene la secuencia de aminoácido de conformidad a SEC ID NO: 18.

34. Un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cadena ligera variable está codificada por un ácido nucleico que tiene la secuencia de conformidad con SEC ID NO: 17 o degenerados de la misma.

35. Un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cadena pesada variable tiene una secuencia de aminoácido de conformidad con SEC ID NO: 20.

36. Un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cadena pesada variable está codificada por un ácido nucleico que tiene la secuencia de conformidad con SEC ID NO: 19 o degenerados de la misma.

37. Un anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, el cual reconoce el dominio A de la proteína S. aureus ClfA.