MXPA02005235A

MXPA02005235A - Metodo para purificar proteinas.

Info

Publication number: MXPA02005235A
Application number: MXPA02005235A
Authority: MX
Inventors: Lindvald Johansen Claus
Original assignee: Danisco
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2002-11-07
Also published as: CN1425069B; EP1944373A3; PL206561B1; BRPI0015823B1; EP1232269B1; CA2391522C; CA2391522A1; AU783526B2; ATE494379T1; GB9927801D0; EP1944373A2; DE60041517D1; DK1232269T3; NZ518660A; PL356129A1; EP1232269A1; CN1425069A; JP4781588B2; DK1944373T3; AU1877001A

Abstract

Se describe un metodo para liberar a una proteina de interes (POI) intracelular soluble o asociada a la membrana que comprende los pasos de: proveer una celula de comprende una POI intracelular soluble o asociada a la membrana; poner en -contacto las celula con una composicion para extraccion de membrana; y ocasionar que la POI sea liberada a partir de las celula bajo condiciones suficientes para la liberacion especifica de la POI y en una forma soluble.

Description

MÉTODO PARA PURIFICAR PROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para liberar una proteína de interés (POI) intracelular. En particular la presente invención se refiere a un método para liberar una proteína de interés (POI) intracelular soluble o asociada a la membrana utilizando una composición para extraer membrana la cual ayuda en la liberación de la POI.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El modo tradicional para recuperar una POI ¡ntracelular, tal como una enzima, ha sido utilizar un método de fragmentación mecánica (Naglak et al., 1990) tal como un molino de glóbulos o un homogeneizador celular que opera con un principio de prensa francesa. Sin embargo, estos métodos de fragmentación mecánica padecen de la desventaja de que estos son métodos consumidores de energía con una baja capacidad y los homogeneizadores celulares o el equipo similar requerido para dirupción mecánica son costosos de adquirir. Además, los métodos electrónicos exponen las células, y por lo tanto la POI se extrae en condiciones muy severas, especialmente como la mayoría de las proteínas se desnaturalizarán por el calor generado a menos . ? ?rJ. . -.„-'- ??klXtí.?i? que el dispositivo mecánico y/o homogeneizador se enfríe eficientemente. Además, algunas células, tales como células de levadura (tales como aquéllas a partir de Hasenula) son difíciles de fragmentar mecánicamente y se necesita más de un paso a través de un homogeneizador celular. El homogeneizado celular puede entonces contener fragmentos de pared celular y ADN, lo cual resulta en una viscosidad elevada. Esto significa que la separación de desechos celulares a partir de la POI puede ser una operación muy difícil. Además, el homogeneizado resultante libre de célula puede contener no solamente la POI intracelular sino que también un gran número (algunas veces varios miles) de diferentes proteínas intracelulares y enzimas asociadas con el metabolismo celular general. Esto significa que el homogeneizado resultante libre de célula puede ser difícil no solamente de concentrar por ultrafiltración sino que también provee problemas con respecto a obtener la concentración comercial adecuada de una POI dada. Con el objeto de minimizar el efecto detrimental potencial de algunos métodos de fragmentación mecánica, los métodos químicos que utilizan, por ejemplo, detergentes han sido desarrollados para permeabilizar las células de levadura. A manera de ejenmplo, el detergente no iónico, octilfenoles polietoxilados, comercialmente disponibles como Tritón X-100, se han utilizado o bien solos o en combinación con ciclos de congelación-descongelación (referencia en Naglak et al., 1990). Además, la patente de E.U.A. No. 5124256 (Crahay et al., 1992) describe un método en donde las proteínas se extrajeron a partir de Saccharomyces cerevisiae por medio de tratar las levaduras en medio acuso con una sal mineral soluble en agua neutral y un agente tensioactivo de alquilfenol polietoxilado soluble en agua que tiene un balance lipófilo-hidrófilo (HLB) de entre 8 y 15. Sin embargo, los agentes tensioactivos de alquilfenol polietoxilado los cuales incluyen octifenoles polietoxilados, nonilfenoles y tributilfenoles, (particularmente aquellos comercialmente disponibles bajo los nombres registrados de Tritón X-100, Nonidet P-40 y Sapogenat T-080) padecen de las desventajas de que (i) estos pueden no tener un efecto de extracción significativo cuando se utilizan solos y (ii) estos agentes tensioactivos pueden interferir con las mediciones subsecuentes de la actividad enzimática de la POI. Varios solventes orgánicos también se han utilizado tanto para permeabilidad las células de levadura en ensayos enzimáticos in situ como para remover las proteínas a partir de las células de levadura. Los ejemplos de dicho solventes incluyen pero no se limitan a tolueno, acetato de etilo, dimetil sulfóxido, y benceno combinado con glicerol (Naglak et al., 1990). Sin embargo, estos solventes no son atractivos para utilizarlos en producción a escala industrial cuando se requieren volúmenes de fermentador superiores a 200 m3. La digitonina y otras saponinas que ocurren de manera natural también ha mostrado que permeabilizan varias células eucariontes (véase Joshi et al 1989). A pesar de que el mecanismo exacto de la permeabilización por digitonina no se conoce, se cree que la digitonina forma un complejo con el colesterol presente en la membrana celular y vuelve a la membrana débil.

* ?. IA i ~k ..j &fcl & ag & a I i La permeabilización por digitonina de las células de levadura también puede deberse a la formación de complejos de ergoesteroles de la membrana de levadura. Joshi et al. (1989) utilizaron digitonina (0.1%) para permeabilizar la levadura Kluyveromyces lo cual facilita la catálisis intracelular de la lactosa a glucosa y galactosa. El detergente no iónico saponina, a partir de corteza de quillay, es otro agente que forma complejos con colesterol, el cual se sabe que permeabilizan al menos células de mamífero (Naglak et al., 1990). De nuevo, de manera similar con los detergentes no iónicos que se describieron anteriormente, el uso de digitonina y de otras saponinas que ocurren de manera natural puede parecer de desventajas que cuando se utilizan solas, éstas pueden no tener un efecto de extracción significativo. Los agentes caotrópicos han sido utilizados para facilitar la extracción de enzimas intracelulares. A manera de ejemplo, la patente de E.U.A. No 3801461 (Miyake y Shiosaka, 1974) describe un procedimiento para extraer enzimas intracelulares producidas en los micelia o células de hongos o bacterias utilizando una solución caotrópica tal como una solución de urea. La patente de E.U.A. No. 4683293 (Craig, 1987) también escribió método para la extracción selectiva de proteínas lipófilas a partir de células transformadas del género Pichia mediante lisis celular en la presencia de sales caotrópicas tales como tioacetato de sodio, yoduro de sodio, hipoclorito de sodio, bromuro de litio, hidrocloruro de guanidina y urea. Sin embargo, los agentes caotrópicos padecen de la desventaja de que la exposición de la POI a un agente caotrópico, tal como urea puede resultar en una pérdida actual de actividad enizmática a través de la desnaturalización de la POI. Además de las desventajas citadas anteriormente, la técnica precedente anteriormente mencionada se refiere solamente a la permeabilización de las células hospederas a moléculas de bajo peso molecular mientras que la POI permanece sin cambios dentro de la célula. En particular, ninguna de las técnicas precedentes anteriormente citadas se refiere a la extracción de POI intracelular asociada a membrana bajo condiciones que no afectan la naturaleza y/o actividad de la POI. Más en particular, ninguna de las técnicas precedentes anteriormente mencionadas se refiere a un método para auxiliar en la liberación de una POI intracelular asociada a membrana la cual está atrapada y es incapaz de ser secretada a partir de una célula hospedera. La presente invención busca así sobreponerse a los problemas asociados con los métodos de extracción de la técnica precedente. La presente invención provee así un método para liberar una proteína de interés (POI) y ¡ntracelular asociada a la membrana a partir de un organismo hospedera.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere un método para auxiliar en la liberación de una POI intracelular soluble o asociada a membrana la cual está atrapada y/o es incapaz de ser secretada a partir de una célula hospedera. La extracción de una POI intracelular utilizando el método de la presente invención se comparó con un método de fragmentación tradicional de célula y con procedimientos de extracción utilizando otros detergentes iónicos/no iónicos y emulsificantes. La combinación de detergentes con proteasas y sales también se investigó. Los resultados de la presente invención indican que la extracción de una POI intracelular soluble o asociada a la membrana utilizando el método de la presente invención es ventajosa porque: (i) las técnicas tradicionales de fragmentación celular puede ser evitadas; (ii) la POI intracelular puede recuperarse libre a partir de ADN contaminante y fragmentos de pared celular; (iii) la POI intracelular puede recuperarse a partir de un organismo hospedero eucarionte, tal como levadura, antes de que la glucosilación tome lugar. La sobreglucosilación de las proteínas secretada es un problema bien conocido especialmente en organismos hospederos eucariontes tales como levadura. Esta desventaja asociada con los sistemas de expresión de levadura ha llevado al rechazo de usar levaduras como un sistema de producción incluso cuando los vectores de expresión de levadura son capaces de producir proteínas a elevados niveles de expresión con una gran cantidad de biomasa, y adicionalmente, las levaduras tienen uso aprobado en alimentos. Al expresar la POI intracelularmente y luego extraer la POI con el método de la presente invención, la POI estará no-glucosilada, debido a que la POI no ha pasado a través de la ruta de secreción en donde la glucosilación toma lugar; (iv) el procedimiento de fermentación que precede al método de la presente invención puede llevarse a cabo a cualquier pH que es adecuado para la célula hospedera. Se sabe bien en la técnica de una POI secretada puede afectarse por el pH de su medio de crecimiento extracelular. Hasta ahora, frecuentemente fue necesario mantener el pH de un medio de cultivo de un organismo hospedero a pH aproximadamente neutral debido a que las fermentaciones a dicho pH consideraban necesario mantener la estabilidad de una POI secretada incluso cuando éstas incrementaban usualmente el riesgo de contaminación bacteriana. Con el método de la presente invención, la POI no se secreta. Por lo tanto, el pH del medio de crecimiento del organismo hospedero no es relevante conforme el pH intracelular permanece constante encuentra el pH del medio. Por consiguiente, la presente invención permite el crecimiento de un organismo hospedero (como levadura) a un pH inferior (tal como pH 4.0) lo cual reduce el riesgo de contaminación bacteriana sin afectar ni la biomasa ni la producción de POI; y (v) el método de la presente invención puede ser utilizado para prevenir el contacto de la POI intracelular con el medio de crecimiento extracelular. Esto es ventajoso si la POI es inestable en medio extracelular, debido a, por ejemplo, sensibilidad a proteasa. Al expresar la proteína intracelularmente y luego extraerla con el método de la presente invención el contacto con el medio extracelular se evita.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a un método para liberar una proteína de interés (POI) a partir de una célula. El método comprende los pasos de: proveer una célula que comprende una POI soluble o asociada a la membrana; poner en contacto la célula con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la POI se libre a partir de la célula bajo condiciones suficientes para la liberación de la POI y en una forma soluble. Por lo tanto, la POI puede ser una proteína de interés ¡ntracelular y/o la POI puede ser una hexosa oxidasa (D-hexosa: 02-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con un aspecto de la presente invención, se provee un método para liberar una proteína de interés (POI) soluble o asociada a la membrana a partir de una célula transformada que comprende los pasos de: proveer una célula transformada que comprende una POI intracelular soluble o asociada a la membrana; poner en contacto la célula transformada con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la POI se libere a partir de las célula transformada bajo condiciones suficientes para la liberación especifica de la POI y en una forma soluble. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para liberar una enzima HOX a partir de una célula transformada que comprende los pasos de: proveer una célula transformada que comprende una enzima HOX; poner en contacto la célula transformada con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la enzima HOX se libere a partir de las célula transformada bajo condiciones suficientes para la liberación especifica de la enzima HOX y en una forma soluble. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para liberar un antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1 ra) a partir de una célula transformada que comprende los pasos de: proveer una célula transformada que comprende IL-1ra; poner en contacto la célula transformada con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la IL-1 ra se libere a partir de la célula transformada bajo condiciones suficientes para la liberación especifica que la IL-1ra y en una forma soluble. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para seleccionar para mutantes que produce niveles elevados de una POI intracelular soluble o asociada a la membrana que . ui t te-k ..i. comprende los pasos de: crecer las células modificadas por mutación a 30°C; incubar las células modificadas por mutación con la composición para extracción de membrana; recuperar el medio libre de célula; seleccionar el medio libre de célula para niveles elevados de la POI intracelular; tales como la presencia del medio intracelular libre de célula y POI es indicativo de que la POI intracelular ha sido liberada. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee una composición para extracción de membrana adecuada para liberar una POI intracelular soluble o asociada a la membrana en donde la composición se pone en contacto con las célula bajo las siguientes condiciones: un porcentaje en peso descompuesto de amonio cuaternario de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 0.6% (más especialmente de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, más especialmente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.45%, más especialmente aproximadamente 0.4%); y un pH óptimo de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 11.0 (más especialmente de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, más especialmente aproximadamente 6.3); una temperatura óptima de aproximadamente 4°C aproximadamente 40°C, (más especialmente de aproximadamente 20°C aproximadamente 30°C, más especialmente aproximadamente 25°C). De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee una composición para extracción de membrana que comprende un compuesto de amonio cuaternario adecuado para la liberación de una POI intracelular soluble o asociada a la membrana. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee una POI sustancialmente no-glucosilada liberar a partir de un organismo hospedero eucarionte. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se presentan en las reivindicaciones anexas y la siguiente descripción y discusión. Estos aspectos presentan bajo encabezados de secciones separadas. Sin embargo, se entiende que las enseñanzas bajo cada encabezado de sección no se limitan necesariamente a ese encabezado de sección particular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención demuestra el hallazgo altamente sorprendente de que una composición para extracción de membrana y comprende compuesto de amonio cuaternario puede ser utilizada para obtener una extracción rápida, especifica y económicamente eficiente de una POI intracelular soluble o asociada a la membrana, sin acudir al uso de técnicas tradicionales de fragmentación celular. Ventajosamente e inesperadamente, el extracto celular resultante contiene muy poca contaminación intracelular de ADN y está relativamente libre de fragmentos de pared celular por lo tanto simplificando cualquier pasos de purificación adicional al cual se somete la POI. Esto está en contraste con los métodos de extracción mecánica de la técnica precedente. Proteína intracelular Como se utiliza en la presente, el término POI "intracelular" significa una POI la cual se encuentra dentro o fuera de una célula o células. La POI ¡ntracelular puede localizarse dentro de una célula (tal como en el citoplasma de la célula) incluso cuando ésta tiene un mecanismo de señal de secreción. A este respecto, la POI intracelular puede ser una POI la cual no se secreta activamente a partir de una célula o es incapaz de ser decretada por las células incluso cuando ésta tiene un mecanismo de secreción mediante secuencia señal. En la alternativa, la POI puede ser una POI secretada de manera natural la cual se ha diseñado para prevenir su secreción a partir de una célula. Alternativamente, la POI puede ser una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a membrana. El método de la presente invención esté en contraste con el método descrito en Ahlstrom y Edebo ((1994) FEMS Microbiology Letters 119 7-12) quienes reportaron la liberación de la µ-lactamasa periplásmica a partir de E. coli con tetradecilo de betaína. El PRI plasma es la región de una celular bacteriana entre la membrana celular y la pared celular. Por lo tanto, la µ-lactamasa periplásmica a partir de E. coli se localiza por fuera de la membrana celular y no es una enzima citoplásmica. En contraste, la POI de la presente invención es una POI intracelular la cual se encuentra dentro o fuera de una célula o células.

POI asociada a membrana Como se utiliza en la presente, el término "POI asociada a membrana" significa una POI la cual puede localizarse en la proximidad de, pero no estar sustancialmente asociada con una célula o membrana plasmática. Por lo tanto, la enzima asociada a membrana no es una proteína única sustancialmente a membrana por la enzima asociada a membrana no está sustancialmente unida a una membrana celular. La POI asociada a membrana puede solubilizarse mediante un tratamiento mecánico como un homogeneizador celular.

POI unida a membrana Como se utiliza en la presente, el término "POI unida a membrana" significa una proteína que no se puede soluble mediante tratamiento mecánico con un homogeneizador celular.

Liberación específica El término "liberación específica" significa que la actividad enzimática de la POI es mayor que cuando ésta ha sido extraída mediante modos mecánicos - tales como mediante el uso de un molino o un homogeneizador celular operando con un principio de prensa francesa.

AA i Célula transformada El término "célula transformada" incluye las células que han sido transformadas mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. La transformación típicamente ocurre mediante la inserción de una o más secuencias nucleotídicas dentro de una célula que se va a transformar. Las secuencias nucleotídicas insertada puede ser una secuencia nucleotídica heteróloga (es decir es una secuencia que no es natural a las células que se va a transformar). Además, o en alternativa, la secuencias nucleotídicas insertada puede ser una secuencia nucleotídica homologa (es decir es una secuencia que es natural a la célula que se va a transformar) -de manera que la célula recibe una o más copias extras de una secuencia nucleotídica que ya está presente en ésta.

Composición para extracción de membrana Como se utiliza en la presente, el término "composición para extracción de membrana" significa una composición capaz de afectar a los componentes en una membrana celular tal como una POI intracelular unida a membrana y/o asociada a membrana que está suficientemente disociada y/o liberada a partir del componente de membrana y la POI se recupera fácilmente y/o se cosecha a partir de la composición para extracción de membrana. La POI puede ser una POI soluble. En una modalidad altamente preferida, la composición para extracción de membrana de la presente fcasfe 1 ~? J A, -xí ^ .. .... invención comprende uno o más compuestos de amonio cuaternario o combinaciones de los mismos.

Compuestos de amonio cuaternario Como se utiliza en la presente, el término "compuestos de amonio cuaternario" significa un compuesto que se deriva a partir de hidróxido de amonio o una sal de amonio mediante el reemplazo de todos los cuatro átomos de hidrógeno del ion NH4+ por grupos orgánicos los cuales pueden ser los mismos o diferentes. Típicamente uno de los grupos orgánicos es un grupo alquilo de cadena larga (Cß-C-iß) y los otros tres son grupos alquilo de cadena más corta u otros grupos. En una modalidad preferida, estos compuestos tienen la estructura: CH3-(CH2)n-N(CH3)+3 en donde n es el número de grupos metileno en la cadena y el donde el contraión puede ser un halógeno tal como ion cloro o bromo. Estos compuestos tienen las propiedades de detergentes catiónicos y son poderosos agentes antimicrobianos. Los ejemplos de estos compuestos de amonio cuaternario incluyen pero no se limitan a Bromuro de Lauroil Trimetil Amonio (LTAB), Cloruro de Miristil Trimetil Amonio (MTAC), Cloruro de Cetil Trimetil Amonio (CTAC), Bromuro de Cetil Trimetil Amonio (CTAB), Cetrimida (o Cetrimido en «t aviAd cual comprende una mezcla de bromuros de alcanolamonio, principalmente CTAB), Cloruro de Estearoil Trimetil Amonio (STAC), Bromuro de Estearoil Trimetil Amonio (STAB), Cloruro de Benzalconio (cloruro de alquildimetilbenzilamonio), Bromuro de N-Cetilpiridinio (bromuro de N- Hexadecilpiridinio), Cloruro de N-Cetilpiridinio (cloruro de N- Hexadecilpiridinio), Cloruro de Bencil Dimetil Tetradecil Amonio, y Cloruro de Bencil Dimetil Hexadecil Amonio. A manera de ejemplo, la estructura de algunos de estos compuestos se ilustra a continuación: Los compuestos se listan en el orden de grupos metileno en incremento: LTAB es H3C-(CH2)n-N(CH3)3Br MTAC es H3C-(CH2)?3-N(CH3)3CI CTAC es H3C-(CH2)i5-N(CH3)3CI CTAB es H3C-(CH2)i5-N(CH3)3Br STAC es H3C-(CH2)17-N(CH3)3CI STAB es H3C-(CH2)i7-N(CH3)3Br Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es cloruro de cetilpiridinio (CPC, C21 H38NCI). La estructura de CPC se ¡lustra a continuación: Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es bromuro de cetilpiridinio (CPB, C2.H38NBr). La estructura de CPB se ilustra a continuación: ^referiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Cloruro de Bencil Dimetil Tetradecil Amonio (BDTAC: C23H42NCI). La estructura de BDTAC se ilustra a continuación: C23H42NCI c?- Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Cloruro de Bencil Dimetil Hexadecil Amonio (BDHAC: C25H46NCI). La estructura de BSHAC se ilustra a continuación: C25H46NCI c?- C23H42NCI c?- Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es cloruro de benzalconio (cloruro de alquildimetilbencilamonio). La estructura del cloruro de benzalconio se ilustra a continuación: CH?2H25N(CH3)2C7H7CI Una comparación de la estructura de CTAB y cloruro de benzalconio (también conocido como cloruro de Alquildimetilbencilamonio -en delante referido bajo el nombre registrado de Rodalon) ilustra a continuación Rodalon: CH3 CTAB CH3 +Br " Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Bromuro de Lauroil Trimetil Amonio (LTAB). Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Cloruro de Cetil Trimetil Amonio (CTAC). Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Bromuro de Cetil Trimetil Amonio (CTAB). .. * -k .. ¡.A É-kí. t- ' .. . «tt.- .i ... .¿^. r. fff.

El detergente catiónico CTAB se ha mostrado que es capaz de alterar la permeabilidad de la levadura, probablemente al ocasionar la formación de poros transmembranales, similar al mecanismo sugerido para otros dos detergentes no ¡ónicos tales como Pluronic F-68 y Tritón X-100 (King et al., 1991). La alteración de la permeabilidad celular utilizando detergentes tales como CTAB ha facilitado la medición de actividades enzimáticas intracelulares en células completas (Sekhar et al., 1999). Además, el desarrollo de las células permeabilizadas mediante CTAB ha probado ser útil para catálisis enzimática intracelular en, por ejemplo, células a partir de cepas de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae (Gowda et al., 1991 ) y Kluyveromyces fragilis (Joshi et al., 1987). En estos estudios, es importante evidenciar que el detergente CTAB hace a las células de levadura permeables a moléculas de bajo peso molecular (tales como sustratos, productos, cofactores), mientras que las enzimas intracelulares y otras POI permanecen sin cambio dentro de la célula. En contraste con la presente invención, ninguno de los estudios anteriormente mencionados ha descrito o sugerido que el detergente CTAB (o compuestos relacionados de amonio cuaternario tales como LTAB o CTAC) pueden ser utilizados para ayudar a la liberación de POI intracelulares solubles o asociadas a membrana a partir de una célula hospedera. El detergente catiónico CTAB también ha sido comúnmente utilizados en métodos para alzamiento de moléculas de ADN/ARN. A manera de ejemplo, las moléculas de ADN pueden aislarse mediante el tratamiento de células con CTAB a elevadas temperaturas (aproximadamente 65°C) y a concentraciones bajas de sal (menores que NaCI 0.6 M) de tal manera que un precipitado de ADN/CTAB se forma y se recupera fácilmente. El detergente CTAB también se utiliza frecuentemente para extraer ácidos nucleicos a partir de plantas en donde la coprecipitación de polisacáridos neutrales, ya sea con etanol o isopropanol, puede considerarse como un problema principal. CTAB también se ha utilizado en la lisis directa y precipitación del ADN a partir del sobrenadante de cultivos de E. coli infectados con fagos filamentosos (véase CITAS 1 ). Todos estos métodos basados en CTAB para el aislamiento de moléculas de ADN recaen en la explotación de las propiedades de CTAB para precipitar ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos mientras que se mantienen las proteínas remanentes y polisacáridos neutrales en solución. Sorprendentemente e inesperadamente, el método de la presente invención facilita no solamente la precipitación sino también la retención del ADN intracelular. Consecuente, el método de la presente invención facilita la liberación selectiva de una POI ¡ntracelular.

Liberación De conformidad con el método de la presente invención, la POI intracelular solubles o asociada a la membrana se libera a partir de una célula o células hospederas mediante poner en contacto las células con una composición para extracción de membrana bajo condiciones suficientes para la liberación de la POI intracelular. *is Condiciones preferibles suficientes para liberar la POI (l)% de compuesto de amonio cuaternario Preferiblemente la composición para extracción de membrana comprende de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 0.6% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, preferiblemente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 0.5% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, preferiblemente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.45% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, más preferiblemente aproximadamente 0.4% en peso de un compuesto de amonio cuaternario. Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es LTAB. Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es CTAC. Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es CTAB. Preferiblemente el compuesto de amonio es Cloruro de Benzalconio (C?2H25N(CH3)2C7H7CI). Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Cloruro de Cetilpiridinio (CPC, C2.H38NCI). Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Bromuro de Cetilpiridinio (CPB, C2.H38NBr). Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Cloruro de Bencil Dimetil Tetradecil Amonio (BDTAC: C23H42NCI). Preferiblemente el compuesto de amonio cuaternario es Cloruro de Bencil Dimetil Hexadecil Amonio (BDTAC: C25H46NCI).

(II) Temperatura Preferiblemente la célula hospedera se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a temperaturas de aproximadamente 4°C a aproximadamente 40°C. Preferiblemente la célula hospedera se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a temperaturas de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C. Preferiblemente la célula hospedera se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a temperaturas de aproximadamente 25°C. Preferiblemente los intervalos de temperatura anteriormente mencionados son mayores si la POI es una POI termoestable.

?ID PH Preferiblemente la célula hospedera se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 11.0. Preferiblemente la célula hospedera se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0. Preferiblemente la célula hospedera se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a un pH de aproximadamente 6.3.

Es altamente ventajoso que el procedimiento de fermentación que precede al método de la presente invención pueda ser llevado a cualquier pH que sea adecuado para la célula hospedera. Se sabe bien en la técnica que una POI secretada puede afectarse por el pH de su medio de crecimiento extracelulares. Hasta ahora, frecuentemente fue necesario mantener el pH de un medio de crecimiento para organismo hospedero a aproximadamente un pH neutral debido que las fermentaciones en dicho pH se consideraron necesarias para mantener la estabilidad de una POI secretada incluso cuando esto usualmente incrementaba el riesgo de contaminación bacteriana. Con el método de la presente invención, la POI no se secreta. Por lo tanto, el pH del medio de crecimiento para el organismo hospedero es irrelevante puesto que el pH intracelular permanece constante sin importar el pH del medio. Por consiguiente, la presente invención permite el crecimiento de un organismo hospedero (tales como levadura) a un pH menor (tales como pH 4.0) lo cual reduce el riesgo de contaminación bacteriana sin afectar ni la biomasa ni la producción de POI. Una ventaja adicional del método de la presente invención es este puede ser utilizado para prevenir contacto de la POI intracelular con el medio de crecimiento extracelulares. Esto es ventajoso si la POI es inestable en el medio extracelular, debido a, por ejemplo, sensibilidad a proteasa. Al expresar la proteína intracelularmente y luego extraerla con el método de la presente invención se evita el contacto con el medio extracelular.

Recuperación de POI La POI intracelular la cual ha sido extraída de conformidad con el método de la presente invención puede tratarse adicionalmente al emplear técnicas conocidas por los expertos en la técnica para concentrar y purificar adicionalmente la POI. Por lo tanto, la POI intracelular extraída puede concentrarse por ejemplo mediante, ultrafiltración, pasó a través de resina en fase reversa seguido por elución con un volumen mínimo de solvente, precipitación, ultrafiltración y liofilización. Las técnicas disponibles para purificación adicional de la POI influyen pero no se limitan a fraccionamiento de tamaño empleando resinas por exclusión de tamaño, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba.

POI Como se utiliza en la presente, el término "POI" incluye pero no se limita a, una proteína, polipéptido o péptido que incluye, pero no se limita a, una proteína estructural, una enzima, una citocina (tales como un interferón y/o una interleucina), un antagonista de receptor de interleucina (tal como IL-1 ra), un antibiótico, un anticuerpo policlonal o monoclonal, o una parte efectiva del mismo, tal como un fragmento Fv, cuyo anticuerpo o parte del mismo puede ser natural, sintético o humanizado, una hormona peptídica, un antígeno (tales como un antígeno bacteriano/viral/de protozoo/de parásito), un antígeno tumoral, un receptor, un ligando, un factor regulador, una molécula • ..¿á.fc.t de señalización, un neurotransmisor, un factor de coagulación, o cualquier otra proteína que incluye pero no se limita a una proteína unida a membrana y/o una proteína asociada a membrana. En el método de la presente invención, la POI se expresa intracelularmente, es decir, es una POI ¡ntracelular. La POI puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante utilizando una secuencia nucleotídica de interés (NOI).

NOI Como se utiliza en la presente, el término "NOI" se define que abarca ADN y ARN tanto de origen sintético como natural cuyo ADN o ARN puede contener deoxi- o dideoxi- nucleótidos o ribonucleótidos modificados o no modificados o análogos de los mismos. El ácido nucleico puede existir como un ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra, un heterodúplex ARN/ADN o un copolímero ARN/ADN, en donde el término "copolímero" se refiere a una hebra sencilla de ácido nucleico que comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. La NOI puede incluso ser un codón optimizado para incrementar la expresión adicionalmente.

Sintético El término "sintético", como se utiliza en la presente, se define como aquello que se produce mediante síntesis química o enizmática in vitro. Esto incluye pero no se limita a NOI elaboradas con uso óptimo del codón ... SMt y-t fojA|-.yt para organismos hospederos tales como las levaduras metilotróficas Pichia y Hansenula.

Construcciones La NOI puede estar operativamente unida a elementos reguladores de la transcripción y de la traducción activos en una célula hospedera de interés. La NOI también puede codificar una proteína de fusión que comprende secuencias señal tales como, por ejemplo, aquellas derivadas a partir de gen de glucoamilasa de Schwanniomyces occidentalis, el gen tipo factor-ade apareamiento de Saccharomyces cerevisiae y la TAKA-amilasa a partir de Aspergillus oryzae. Alternativamente, la NOI puede codificar una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a membrana.

Vector de expresión La NOI puede expresarse a los niveles deseados en un organismo hospedero utilizando un vector de expresión. Un vector de expresión que comprende la NOI de conformidad con la presente invención puede ser cualquier vector que cual es capaz de expresar el gen que codificar la NOI en el organismo hospedero seleccionado, y la elección del vector dependerá de la célula hospedera dentro de la cual se va a introducir. Por lo tanto, el lector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir un vector que existe como una entidad episomal, la replicación del cual independiente de la replicación cromosomal, tal como, por l a i . ?, i ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento episomal, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector de conformidad con la invención es uno de cual, cuando se introduce dentro de una célula hospedera, se integra dentro del genoma de la célula hospedera y se replica junto con el cromosoma.

Componentes del vector de expresión El vector de expresión típicamente incluye los componentes de un vector de clonación, tales como, por ejemplo, un elemento que permite la replicación autónoma del vector en el organismo hospedero seleccionado uno o más marcadores fenotípicamente detectables para propósitos de selección. El vector de expresión normalmente comprende secuencias nucleotídicas control que codifica un promotor, operador, sitio de unión a ribosomas, señal de inicio de la traducción, y ocasionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia codificante para una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir la POI a un organelo de célula hospederas tal como un peroxisoma, o a un compartimiento particular de la célula hospedera. Dicha secuencia direccionadora incluye pero no se limita a la secuencia SKL. En el presente contexto, el término "señal de expresión" incluye cualesquiera de la secuencias control anteriormente mencionadas, secuencias represoras o activadoras. Para la expresión bajo la dirección de las secuencias control, la NOI que codifica la POI esta operativamente unida a las secuencias control de manera adecuada con respecto a la expresión.

Promotor En el vector, la NOI que codifica para la POI ésta operativamente combinada con una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que tiene actividad transcripcional en el organismo hospedero de elección y puede derivarse a partir de genes que son homólogos o heterólogos al organismo hospedero.

Promotores bacterianos Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia nucleotídica modificada de la invención en un hospedero bacteriano incluye el promotor del operón lac de E. coli, los promotores dagA del gen agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de a-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores del gen de a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y un promotor derivado a partir de un promotor derivado de Lactococcus sp. incluyendo el promotor P170. Cuando el gen que codifica la POI de la presente invención se expresa en especies bacterianas tales como E. coli, un promotor adecuado puede seleccionarse, por ejemplo, a partir un promotor de bacteriófago incluyendo promotor T7 y un promotor del fago lambda.

Promotores fúngales Para la transcripción en especies fúngales, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados a partir de genes que codifican la, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehi, a-amilasa neutra de Aspergillus niger, a-amilasa acida estable de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae o acetamidasa de Aspergillus nidulans.

Promotores de levadura Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en especies de levadura incluyendo pero no se limitan a los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores AOX1 o AOX2 de Picchia pastoris.

Organismos hospederos (I) Organismos hospederos bacterianos Los ejemplos de organismos hospederos bacterianos adecuados son especies bacterianas gram positivas tales como Bacillaceae incluyendo .J .áy-t-. y.

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium y Bacillus thuringiensis, las especies Streptomyces tales como Streptomyces murinus, especies 5 bacterianas de ácido láctico incluyendo Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis, Lactococcus spp. incluyendo Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp., Pediococcus spp. y Streptococcus spp. Alternativamente, las cepas de especies bacterianas gram negativas que pertenecen a las Enterobacteriaceae incluyendo E. coli, o a Pseudomonadaceae puede 10 seleccionarse como el organismo hospedero.

(II) organismos hospederos de levadura Un organismo hospedero de levadura adecuado puede seleccionarse a partir de especies de levaduras biotecnológicamente 15 relevantes tales como pero no limitadas a especies de levaduras tales como Pichia sp., Hansenula sp o Kluyveromyces, especies de Yarrowinia o especies de Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o especies que pertenecen a Schizosaccharomyce tales como, por ejemplo, especies S. pombe. 20 Preferiblemente una cepa de las especies de levadura metilotrófica Pichia pastoris se utiliza como el organismo hospedero. Preferiblemente el organismo hospedero es una especie Hansenula.

Es altamente ventajoso el utilizar el método de la presente invención para recuperar una POI intracelular a partir de un organismo hospedero eucarionte, tal como levadura, antes de que la glucosilación tome lugar. La sobreglucosilación de las proteínas secretadas es un problema bien conocido especialmente en organismos hospederos eucariontes tales como levaduras. Esta desventaja asociada con los sistemas de expresión de levadura ha llevado al rechazo para utilizar levadura como un sistema de producción incluso cuando los sectores de expresión de levadura son capaces de producir proteínas a elevados niveles de expresión con una gran cantidad de biomasa, y adicionalmente, la levaduras tienen uso aprobado en alimentos. Al expresar la POI intracelularmente y luego extraer la POI con el método de la presente invención, la POI no será glucosilada, debido a que la POI no ha pasado a través de la ruta de secreción en donde la glucosilación toma lugar. (lll) organismos hospederos fúngales Los organismos hospederos adecuados entre los hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori o Aspergillus nidulans. Alternativamente, las cepas de especies Fusarium, por ejemplo Fusarium oxysporum o una especie Rhizomucor tales como Rhizomucor miehei pueden ser utilizadas como el organismo hospedero. Otras cepas adecuadas incluyen especies Thermomyces y Mucor.

Aplicación a gran escala En una modalidad preferida de la presente invención, la POI se utiliza para aplicaciones a gran escala. Preferiblemente la POI se produce en una cantidad de 1 g por litro a aproximadamente 1 g por litro del volumen de cultivo de célula total después del cultivo del organismo hospedero. Preferiblemente la POI se produce en una cantidad de 100 mg por litro a aproximadamente 900 mg por litro del volumen de cultivo célula total después del cultivo del organismo hospedero, Preferiblemente la POI se produce en una cantidad de 250 mg por litro a aproximadamente 500 mg por litro del volumen de cultivo de célula total después del cultivo del organismo hospedero.

Aplicaciones alimenticias En una modalidad preferida, el método de la presente invención se utiliza para liberar una POI para uso en la elaboración de productos alimenticios, tales como bebidas. En otra modalidad preferida, el método de la presente invención se utiliza para liberar una POI para uso en la preparación de detergentes. En otra modalidad preferida, el método de la presente invención se utiliza para liberar una POI adecuada para uso en panadería.

En otra modalidad preferida, el método de la presente invención se utiliza para liberar una POI adecuada para uso como agente mejorador de masa. En otra modalidad preferida, el método de la presente invención se utiliza para liberar una POI adecuada para mejorar las propiedades de una masa de harina, una composición que mejora la masa de harina y productos alimenticios mejorados (véase WO 96/39851 y EP-B-0 833 563). En una modalidad preferida, la POI liberada es una hexosa oxidasa (D-hexosa: 02- oxidorreductasa, EC 1.1.3.5).

Enzima HOX La hexosa oxidasa (D-hexosa: 02- oxidorreductasa, EC 1.1.3.5) (también preferida como HOX) es una enzima que en la presencia de oxígeno es capaz de oxidar D-glucosa y varios otros azúcares reductores incluyendo maltosa, lactosa y celobiosa a sus lactonas correspondientes con hidrólisis subsecuente de los ácidos aldobiónicos respectivos. Por consiguiente, HOX difiere de otra oxidorreductasa, glucosa oxidasa, la cual puede convertirse solamente D-glucosa, en tanto en la enzima puede utilizar un ¡ntervalo más amplio de sus tratos de azúcar. La oxidación catalizada por HOX puede ¡lustrarse como sigue: D-glucosa + O2 ^?-D-gluconolactona + H2O2. o D-galactosa + O2 - ?-D-galactonolactona + H2O2 HOX se produce naturalmente en varias especies de algas marinas. Dichas especies encuentran entre otras en la familia Gigartinaceae.

Como se utiliza en la presente, el término "HOX" denota una enzima que es capaz de oxidar los sustratos seleccionados a partir del grupo que consiste en D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, maltosa, lactosa y celobiosa.

Producción de HOX El gen que codifica la enzima HOX se ha clonado a partir del alga Chondrus crispus (Stougaard y Hansen 1996, Hansen y Stougaard, 1977). La levadura metilotrófica Hansenula polymorpha (desarrollada en Rhein Biotech, Dusseldorf/Alemania como un sistema de expresión para proteínas heterólogas) también ha sido utilizado para producir la enzima HOX (la proteína nativa se purificó a partir del alga (Poulsen y Hostrup, 1998)). WO 96/40935 y WO 98/13478 también describen la clonación y expresión en organismos hospederos recombinantes de un gen que codifica una proteína con actividad HOX. En una modalidad preferida la enzima HOX comprende la secuencia establecida en SEQ ID No 22. En una modalidad preferida la enzima HOX comprende la secuencia establecida en SEQ ID No 22 o variantes, homólogos, derivados o fragmentos de la misma.

Variantes/homólogos/derivados (secuencia de aminoácidos) La secuencia de aminoácidos preferidas de la presente invención se establecen en SEQ ID No 22 o son secuencias obtenidas a partir del enzima HOX de la presente invención pero también incluyen secuencias homologas obtenidas a partir de cualquier fuente, por ejemplo proteínas virales/bacterianas relacionadas, homólogos celulares y péptidos sintéticos, así como variantes o derivados de las mismas. Por lo tanto, la presente invención abarca variantes, homólogos o derivados de la secuencia de aminoácidos presentes en la presente invención, así como variantes, homólogos o derivados de la secuencia nucleotídicas que codifica para aquellas secuencia de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, una secuencia homologas se toma para que incluya una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 75, 85 o 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 o 98% idéntica a nivel de aminoácidos sobre al menos, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID No 22 del listado de secuencias en la presente. En particular, la homología de ser considerada típicamente con respecto a aquellas regiones de la secuencia conocida como esencial para la actividad enzimática más que con las secuencias vecinas que no son esenciales. Estas regiones incluyen pero no se limitan a los dominios de unión a FAD putativos en HOX tales como SGGH79C, LGGH146I y LGGH320A. A pesar de que la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir crecido de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares, en el contexto de la presente invención se prefiere que expresen homología en términos de identidad de secuencia. Las comparaciones de homología pueden llevarse a cabo mediante visión directa, o más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencia fácilmente disponibles. Estos programas de computadora comercialmente disponibles pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, por ejemplo una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácidos en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Estos se denomina un alineamiento "sin espacios". Típicamente, dichos alineamientos sin espacios se llevan a cabo solamente sobre un número de residuos relativamente corto. Aunque éste su método muy simple y consistente, falla al tomar en cuenta que, por ejemplo, en otros pares de secuencias de otra manera idénticos, una inserción o deleción ocasionará que los residuos de aminoácidos siguientes estén fuera de alineamiento, resultando así potencialmente en una gran reducción en el % de homología cuando un alineamiento global se lleva a cabo. Consecuentemente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineamientos óptimos que toman en consideración inserciones y deleciones posibles sin llevar a cabo sanciones en la evaluación de homología general.

Esto se logra al insertar "espacios" en el alineamiento de secuencia para tratar de maximizar la homología local. Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "sanciones por espacio" a cada espacio que ocurre en el alineamiento de manera que, 5 para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con unos pocos espacios es posible - reflejando una mayor relación entre las dos secuencias comparadas - logrará una evaluación mayor que una con muchos espacios. "Costos afines al espacio" típicamente se utilizan de manera que cargan un costo relativamente alto por la existencia de un espacio 10 y una sanción menor por cada residuo subsecuente en el espacio. Este es el sistema de evaluación de espacios más comúnmente utilizado. Multas altas por espacio producirán obviamente alineamientos optimizados con menores espacios. La mayoría de los programas de alineamiento permiten que la sanciones por espacio se modifiquen. Sin embargo, se prefiere utilizar los 15 valores por omisión cuando se utiliza dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit (véase a continuación) la sanción por omisión de espacio para la secuencia de aminoácidos es -12 para un espacio y -4 para cada extensión. El cálculo del % de homología máximo por lo tanto primeramente 20 requiere la producción de un alineamiento óptimo, tomando en consideración las sanciones por espacio. Un programa de computadoras adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, E.U.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Los ejemplos de otros software que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid - capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990. J. Mol. Biol., 403-410) y el juego GENEWORKS de herramientas de 5 comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsqueda no en línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. A pesar de que el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el procedimiento de alineamiento mismo típicamente no ío se basa en un par de comparación todo o nada. En lugar de esto, una matriz de evaluación por similitud de escala generalmente se utiliza la cual asignan evaluaciones a cada par de comparación basándose en similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz comúnmente utilizada en la matriz BLOSUM62 - la matriz por omisión para el juego de programas BLAST. 15 Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan ya sea los valores por omisión públicos o una tabla de comparación de símbolos habituales si se proporciona (véase manual del usuario para detalles adicionales). Se prefiere utilizar los valores por omisión públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por omisión, tal como BLOSUM62. 20 Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencia y genera un resultado numérico.

El término "variante" o "derivado" en relación con la secuencia de aminoácidos de la presente invención incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de coalición de uno (o más) a aminoácidos a partir o de la secuencia que provee la secuencia resultante de aminoácidos que tiene una actividad enzimática, preferiblemente que tiene al menos la misma actividad enzimática que la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 22. La SEQ ID No 22 puede ser modificada para utilizarla en la presente invención. Típicamente, las mutaciones se elaboran las cuales mantienen la actividad enzimática de la secuencia. Las instituciones de aminoácidos puede elaborarse, por ejemplo a partir de 1 , 2 o 3 a 10 o 20 sustituciones con la condición de que la secuencia modificada retenga la actividad enzimática requerida. Las instituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que no ocurren de manera natural. La SEQ ID No 22 de la presente invención también puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuo de aminoácidos los cuales producen un cambio silencioso y resultante en una enzima funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de aminoácidos pueden elaborarse con base en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza amfipática de los residuos siempre y cuando la actividad enzimática de la enzima HOX se retenga. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyendo leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina. Las sustituciones conservativas pueden elaborarse, por ejemplo de conformidad con una tabla a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna puede sustituirse entre sí: Variantes/homólogos/derivados (secuencia nucleotídica) Se entenderá por un experto la técnica que numerosas secuencia nucleotídicas diferentes pueden codificar la misma enzima HOX como un resultado de la degeneración del código genético. Además, se debe entender que las personas expertas pueden, utilizando técnicas rutinarias, elaborar sustituciones nucleotídicas que no afectan la enzima HOX codificada por la secuencia nucleotídica de la invención para reflejar el uso del codón de cualquier organismo hospedero particular en el cual la enzima HOX de la presente invención se va a expresar. Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con la secuencia nucleotídicas establecida en SEQ ID No 22 de la presente ÍÍ-A?A ?Í?. y^ aj.-ü, J. . ..a-i-i—.,, ¿at-y-A . . - - ,y„jy. yá-yj. it J ? i.A«a¿Í?-'-'-" invención incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácidos nucleicos a partir o a la secuencia que provee la secuencia nucleotídica resultante que codifica para una enzima HOX que tiene una actividad enzimática, preferiblemente que tiene al menos la misma actividad que la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22 del listado de secuencias. Como se indicó anteriormente, con respecto a la homología de secuencia, preferiblemente hay al menos 75%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% de homología a las secuencias mostradas en la secuencia listada en la presente. Más preferiblemente hay al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, de homología. Las comparaciones de homología de nucleótidos pueden llevarse a cabo como se describió anteriormente. Un programa de comparación de secuencia preferido es el programa GCG Wisconsin Bestfit descrito anteriormente. La matriz de evaluación por omisión tiene un valor de coincidencia de 10 para cada nucleótidos idéntico y - 9 para cada no coincidencia. La sanción por creación de espacio de omisión es -50 y la sanción por extensión de espacio de omisión es -3 para cada nucleótido. La presente invención también abarca secuencia nucleotídicas que son capaces de hibridar selectivamente con las secuencias presentadas en la presente invención, o cualquier variante, fragmento o derivado de las mismas, o al complemento de cualesquiera de los anteriores. La secuencia nucleotídicas preferiblemente son de al menos 15 nucleótidos en longitud, más preferiblemente de al menos 20, 30, 40 o 50 nucleótidos en longitud.

Hibridación El término "hibridación" como se utiliza la presente debe incluir "el proceso mediante el cual una hebra de ácidos nucleicos se une con una hebra complementaria a través de apareamiento de bases" así como el procedimiento para la amplificación que se lleva a cabo mediante tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia nucleotídicas de la invención capaces de liquidar selectivamente a la secuencia nucleotídicas presentadas en la presente invención, o a su complemento, generalmente serán de al menos 75%, preferiblemente al menos 85 por 90% y más preferiblemente al menos 95 con 98% homologas a la secuencia nucleotídicas correspondientes presentadas en la presente invención sobre una región de al menos 20, preferiblemente al menos 25 o 30, por ejemplo al menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos. La secuencia nucleotídicas preferidas de la invención comprenderán regiones homologas a la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22 preferiblemente al menos 80 por 90% y más preferiblemente al menos 95% de homología con la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22. El término "selectivamente hibridable" significa que la secuencia nucleotídica utilizada como una sonda se utiliza bajo condiciones en donde una secuencia nucleotídica blanco de la invención se encuentra que se hibrida a la sonda a un nivel negativamente superior al fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir debido a otras secuencias nucleotídicas presentes, por ejemplo, en la librería de ADNc o de ADN genómico a ser seleccionada. En este evento, el fondo implica un nivel de señal generado por la interacción entre la sonda y un miembro de ADN no específico de la librería el cual es menor y 10 veces, preferiblemente menor a 100 veces tan intenso como la interacción específica observada con el ADN blanco. La intensidad de la interacción puede medirse, por ejemplo, mediante radio marcado de la sonda, por ejemplo con 32P. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión de ácidos nucleicos, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), y confiere una "severidad" definida como se explica a continuación. La severidad máxima típicamente ocurre a aproximadamente Tf -5°C (5°C por debajo de la Tf de la sonda); la severidad elevada de aproximadamente 5°C a 10°C por debajo de Tf; la severidad intermedia de aproximadamente 10°C a 20°C por debajo de Tf; y la severidad baja de aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de Tf. Como se entenderá por los expertos en la técnica, una hibridación a severidad máxima puede utilizarse para identificar secuencia nucleotídicas idénticas mientras que una hibridación intermedia (o baja) puede ser utilizada para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas similares o relacionadas. En un aspecto preferido, la presente invención abarca secuencias nucleotídicas que pueden hibrida con la secuencia nucleotídica de la presente invención bajo condiciones severas (por ejemplo 65°C y SSC 0.1x (SSC 1x = NaCI 0.15, Citrato de Na3 0.015 M pH 7.0). En donde la secuencia nucleotídicas de la invención está en doble hebra, ambas hebras del dúplex, ya sea individualmente o en combinación, están abarcadas por la presente invención. En donde la secuencia nucleotídica es de una sola hebra, se entiende que la secuencia complementaria de esa secuencia nucleotídica también está incluida dentro del alcance de la presente invención. La secuencia nucleotídicas que no son 100% homologas a las secuencias de la presente invención pero que caen dentro del alcance de la invención pueden obtenerse de varias formas. Otras variantes de la secuencias descritas en la presente pueden obtenerse por ejemplo al ensayar librerías de ADN elaboradas a partir de un intervalo de fuentes. Además, otros homólogos virales/bacterianos, o celulares particularmente homólogos celulares encontrados en células de mamíferos (por ejemplo células de rata, ratón, bovino y primate), pueden obtenerse y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar selectivamente con la secuencias mostradas en la secuencias listadas en la presente invención. Dicha secuencias pueden obtenerse al ensayar librerías de ADNc elaboradas a partir de librerías de ADN genómico a partir de otras especies animales, y ensayando dichas librerías con sondas que comprenden toda o una parte de la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22 bajo condiciones de medio para elevada severidad. Consideraciones similares se aplican para obtener especies homologas y variantes alélicas de la secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos de la presente invención. Las variantes y los homólogos de cepa/especies también pueden obtenerse utilizando PCR degenerado en cual utilizará iniciadores diseñados para secuencias blanco dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias conservadas de aminoácidos dentro de la secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden pronosticar si, por ejemplo, mediante alineación de las secuencias de aminoácidos a partir de varias variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencia pueden llevarse a cabo utilizando software de computadora conocidos en la técnica. Por ejemplo el programa GCG Wisconsin PileUp se utiliza ampliamente. Los iniciadores utilizados en el PCR degenerado contendrán una o más posiciones de generadas y se utilizarán en condiciones menores de severidad que aquéllas utilizadas para las secuencias de clonación con iniciadores de secuencia particulares en contra de secuencias conocidas. Alternativamente, dichas secuencias nucleotídicas pueden obtenerse mediante mutagénesis sitio dirigida de secuencias caracterizadas, tales como la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22. Esto puede ser útil en donde por ejemplo los cambios silenciosos en el codón se requieren para secuencias para optimizar las preferencias del codón para una célula hospedera particular en la cual las secuencias nucleotídicas se van a expresar. Otros cambios de secuencia pueden ser deseables con el objeto de introducir sitios de reconocimiento para enzima de restricción, o para alterar la actividad enzimática de la enzima HOX codificada por las secuencias 5 nucleotídicas. La secuencias nucleotídicas de la presente invención pueden ser utilizadas para producir un iniciador, por ejemplo un iniciador de PCR, un iniciador para una reacción alternativa de amplificación, una sonda por ejemplo marcada con una marca reveladoras mediante medios 10 convencionales utilizando marcas radioactivas o no radioactivas, o la secuencias nucleotídicas pueden clonarse dentro de vectores. Dichos iniciadores, sondas y otros fragmentos serán de al menos 15, preferiblemente de al menos 20, por ejemplo de al menos 25, 30 o 40 nucleótidos en longitud, y también estar abarcados por el término secuencia nucleotídica de la 15 invención como se utiliza en la presente. Las secuencias nucleotídicas tales como un polinucleótido de ADN y las sondas de conformidad con la invención pueden ser producidas recombinantemente, sintéticamente, o mediante cualesquiera medios disponibles a aquellos expertos en la técnica. Estas también pueden clonarse 20 mediante técnicas estándares. En general, los iniciadores producirán por medio sintéticos, implican una elaboración paso a paso de la secuencia deseada de ácido nucleico un nucleótido a la vez. Las técnicas para lograr esto utilizando técnicas automatizadas son fácilmente disponibles en la técnica. La secuencias nucleotídicas más largas generalmente serán producidas utilizando medios recombinante es, por ejemplo utilizando una técnica de clonación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará elaborar un par de iniciadores (por ejemplo de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la secuencia blanco la cual se desea clonar, poniendo los iniciadores en contacto con ARNm o ADNc, llevando a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bajo condiciones que llevan a la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo mediante purificación de la mezcla de reacción sobre un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los iniciadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento adecuados para enzimas de restricción de manera que el ADN amplificado puede clonarse dentro de un vector de clonación adecuado. Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de ADN las cuales codifican substancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente, pueden ser utilizadas para clonar y expresar la enzima HOX. Como se entenderá por los expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir la enzima HOX - codifican los secuencias nucleotídicas que poseen codón es que no ocurren de manera natural. Los codones preferidos para un hospedero procarionte o eucarionte particular (Murray E et al (1989) Nuc Acids Res 17:477-508) puede k?il.J Á- .a- i seleccionarse, por ejemplo, para incrementar la velocidad de la expresión de la enzima HOX o para producir transcritos de ARN recombinante que tienen propiedades deseables, tales como una vida media más largas, que los transcritos producidos a partir de la secuencia que ocurre de manera natural.

Selecciones El método de la presente invención puede ser utilizado para seleccionar niveles elevados de la POI intracelular en organismos con células hospederas modificadas mediante mutación. Las células empleadas en dicha selección pueden ser fijadas a un soporte sólido o un sustrato sólido, tal como proyecciones de plástico o alguna otra superficie. Las células pueden ponerse en contacto con la composición para extracción de membrana de la presente invención y el nivel de POI liberada puede medirse utilizando métodos conocidos en la técnica.

Selecciones de alta resolución (HTS) El método de la presente invención puede ser utilizado en sistemas de selección de alta resolución (HTS), en donde las células blanco se crecen y seleccionan en la placas de microtitulación (10,000 mutantes por elegir uno) mediante sistemas robot. A manera de ejemplo, cuando se elaboran nuevas cepas de producción recombinante, usualmente es necesario llevar a cabo una o varias rondas de mutagénesis tradicional con el objeto de incrementar la productividad. Esto se hace más eficientemente utilizando HTS de las células modificadas mediante mutación. El método de la presente invención es altamente ventajoso debido a que éste permite selección de alta resolución (HTS) para niveles incrementados de POI intracelular. Hasta ahora, estos sistemas fueron capaces solamente para selección de niveles superiores de POI secretada.

Introducción a la sección de ejemplos v las figuras La presente invención ahora se describirá solamente a manera de ejemplo en la cual se hace referencia a las siguientes figuras. La figura 1 provee una construcción genética; La figura 2A provee construcciones genéticas; La figura 2B provee una representación fotográfica; Las figuras 3A y 3B proveen representaciones fotográficas; La figura 4 provee una gráfica; La figura 5 provee un listado de secuencia; La figura 6 provee un listado de secuencia; Las figuras 7A-7D proveen una representación fotográfica; La figura 8 provee una gráfica; La figura 9 provee una gráfica; Las figuras 10A-10B proveen una representación fotográfica; Las figuras 11A-11 B proveen en una gráfica; Las figuras 12A-12B proveen una representación fotográfica; Las figuras 13A-13B proveen una representación fotográfica; y Las figuras 14A-14B proveen una representación fotográfica. Con un poco de mayor detalle: La figura 1 provee un mapa físico del vector de expresión para la producción de HOX en Hansenula polymorpha. Los fragmentos romos EcoRI/Notl que contienen la región codificante del gen sintético HOX fusionado a secuencias señal opcionales se clonaron dentro del sitio de clonación múltiple de un vector de expresión estándar de Hansenula. Los vectores de expresión que contienen el promotor del gen de formato deshidrogenasa (FMD) y el terminador (MOX-T) del gen de metanol oxidasa separado mediante el sitio de clonación múltiple para el fragmento de inserción, ori y bla (ampR) para la propagación y selección en E. coli, la secuencia ARS (HARS) para la replicación en H. polymorpha, el gen URA3 para selección. La figura 2A muestra un diagrama del gen FMD genuino de 1.4 kb (esquema superior) y el promotor FMD con el ADN heterólogo clonado (esquema inferior). Los sitios de restricción son Asp718, Ncol. La figura 2B muestra las copias del gen del gen HOX integrado. Las líneas 1-12 muestran diferentes aislados del recombinante y sus diluciones de ADN correspondientes. La línea 13 muestra una cepa hospedera no transformada y la línea 14 muestra un marcador de tamaño (M). Las figuras 3A y 3B proveen un análisis SDS-PAGE de la expresión de HOX. La figura 3A provee un análisis SDS-PAGE del filtrado de ?AÍ*.k. * '&**?^&**- cultivo a partir de la fermentación en glicerol de la cepa mutada DK8-27Kanll3-mut25. La línea 1 muestra una proteína marcadora, la línea 2 muestra un estándar de HOX (0.03 U/ml; 18 µl), la línea 3 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 3 (18 µl la línea 4 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 4 (18 µl la línea 5 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 5 (18 µl la línea 6 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 6 (18 µl la línea 7 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 7 (18 µl la línea 8 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 8 (18 µl la línea 9 muestra un sobrenadante a partir de la sonda 9 (18 µl) y la línea lOmuestra un sobrenadante a partir de la sonda 10 (18 µl). La figura 3B provee un análisis de Western blot de las cepas recombinantes que expresan HOX. Las muestras aplicadas en las líneas son las mismas que para la figura 3A. La membrana se ensayó con un anticuerpo policlonal para HOX. La figura 4 muestra el crecimiento y productividad de cultivo de fermentación de 10 litros de una cepa secretora DK8-27Kanll3-mut25. La fermentación se llevó a cabo a 25°C y a un pH de 5.0 con glicerol y pO control. La figura 5 provee los oligonucleótidos individuales utilizados para sintetizar el gen HOX con optimización del codón. La figura 6 provee una secuencia nucleotídica del gen sintético HOX y la secuencia correspondiente de aminoácidos.

Las figuras 7A-7D muestra la localización de la enzima HOX en H. polymorpha como se determina mediante inmunofluorescencia. La superposición de la localización de la enzima HOX (señal verde) con la localización nuclear (señal azul) se muestra. Véase A) cepa RB11 sin el gen HOX. B) DK8-27. C) DK8-27 mut25. D) DK2II-I. La figura 8 provee una gráfica que muestra la actividad de HOX como una función del número de ciclos a través de un homogeneizador celular. La figura 9 provee una gráfica que muestra células de Hansenula polymorpha extraídas con diferentes concentraciones de CTAB y Tritón X-100. La figura 10A muestra un análisis SDS-PAGE de los niveles de la enzima HOX en el sobrenadante celular (líneas 7-10) y concentrados (líneas 2-5) después de tratamiento con CTAB. La enzima HOX se liberó a partir de los concentrados mediante extracción mecánica. Las muestras se analizaron sobre geles de NuPAGE al 4-12% a partir de MES, Novex y 10 µl de las muestras se cargaron en cada línea en el siguiente orden: líneas 2-5: HOX residual en el concentrado celular; líneas 7-10: HOX liberada en el sobrenadante; línea 1 y 6: estándar Novex See Blue; línea 2: control, línea 3: CTAB al 0.1%; línea 4: CTAB al 0.2%; línea 5: CTAB al 0.4%, línea 7: control; línea 8: CTAB al 0.1 %; línea 9: CTAB al 0.2% y línea 10: CTAB al 0.4%. La figura 10B muestra un análisis Western blot de los niveles de enzima HOX en el sobrenadante celular (líneas 7-10) y concentrado (líneas 2- 5) después de tratamiento con CTAB. La enzima HOX se liberó a partir de los concentrados mediante extracción mecánica. Las muestras se analizaron sobre geles de NuPAGE al 4-12% a partir de MES, Novex y 5 µl de las muestras se cargaron en cada línea en el siguiente orden: líneas 2-5: HOX residual en el concentrado celular; líneas 7-10: HOX liberada en el sobrenadante; línea 1 y 6: estándar Novex See Blue; línea 2: control, línea 3: CTAB al 0.1 %; línea 4: CTAB al 0.2%; línea 5: CTAB al 0.4%, línea 7: control; línea 8: CTAB al 0.1%; línea 9: CTAB al 0.2% y línea 10: CTAB al 0.4%. La figura 11A muestra el perfil de elución para HOX extraída con CTAB. La figura 11 B muestra el perfil de elución para HOX extraída mecánicamente.

EJEMPLOS Materiales y métodos Químicos Todos los químicos utilizados fueron de grado reactivo analítico. La lecitina (3-sn-fosfatidilcolina) se obtuvo comercialmente como Stenpur PM a partir de Stern (Alemania). La Pronase A (un nombre comercial para una mezcla de varias exo- y endo- peptidasas, obtenida partir de Streptomyces griseus, que es capaz de hidrolizar virtualmente cualquier proteína casi completamente hasta aminoácidos libres). Lisolecitina (lisofosfatidilcolina), D-glucosa, o-dianisidina, peroxidasa (P- 8125), ácido cáprico (ácido decanoico), saponina (cualquier miembro de un gran grupo de glucósidos, ampliamente distribuidos en plantas, que son poderosos agentes tensioactivos) y CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio también conocido como bromuro de hexadeciltrimetilamonio) (H- 5882) fueron todos a partir de Sigma Chemical Co., E.U.A. El metanol (HPLC) fue a partir de Lab-Sean Ltd. El peróxido de hidrógeno y el Tritón X-100 (un nombre comercial para octifenol polietoxilado) fueron a partir de Merck, Alemania. El emulsificante YN también comercialmente conocido como Palsgaard 4445 fue a partir de Palsgaard, Dinamarca. Los compuestos de amonio cuaternario tales como LTAB (bromuro de lauroiltrimetilamonio), Cetrimida-40 (también conocida como cetrimido del cual es un desinfectante detergente que consiste de una mezcla de bromuro de alquilamonio, principalmente CTAB), CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio), STAB (bromuro de estearoil trimetil amonio), MTAC (cloruro de miristil trimetil amonio), CTAC (Cloruro de Cetil Trimetil Amonio), STAC (cloruro de estearoil trimetil amonio) fueron todos a partir de FeF, Dinamarca. Rodalon comprende aproximadamente 9.5% (95 g/l) de cloruro de alquildimetilbencilamonio (Ci2H25N(CH3)2C7H CI) se obtuvo a partir de Superfos Biosector, 2950 Vedbaek, Dinamarca. El cloruro de alquildimetilbencilamonio también se conoce como cloruro de benzalconio. El emulsificante Lactilato de Lauroil Sódico (SLL) fue a partir de Danisco Cultor, Grindsted, Dinamarca.

Fermentación de levadura El cultivo de levadura se llevó a cabo en un fermentador de 6 L o de 100 L de conformidad con el manual de fermentación de Rhein Biotech para una escala de 10 L.

EJEMPLO 1 Ensamblaje de un gen HOX sintético, con codón optimizado Diseño del gen La secuencia nucleotídicas del gen HOX nativo se alteró resultando en un gen sintético. El gen HOX sintético (figura 6) se diseño de manera que el uso del codón coincidió precisamente con las preferencias de codón conocidas de levaduras biotecnológicamente relevantes tales como Pichia sp., Hansenula sp., Kluyveromyces, Yarrowinia, S. pombe con el objeto de facilitar un elevado nivel de producción en estos organismos. El gen se dividió en tres fragmentos separadamente ensamblados y/o clonados. Los subensamblajes, designados como mitad proximal 5' estaban comprendidos de los siguientes oligonucleótidos como se establece la figura 5 como pares complementarios: HOX1a/HOX2b, HOX3a/HOX4b, HOX5a/HOX6b, HOX7a/HOX8b, HOX9a/HOX10b); mitad distal 3' A utilizando iniciadores 1-6 y mitad distal 3' B utilizando iniciadores 6-10.

Gen HOX proximal 5' sintético La mitad proximal 5' del gen HOX sintético se sintetiza utilizando diez oligonucleótidos HOX1A a HOX10B. Los oligonucleótidos que tienen longitudes con un intervalo a partir de 100-120 pares de bases se utilizaron como iniciadores (concentración = 0.1 µM cada uno) en una reacción de PCR de inicio caliente en 100 µL (utilizando la ADN polimerasa termoestable Pwo (Boehringer). El inicio caliente se llevó a cabo mediante el calentamiento de la mezcla de oligonucleótidos, amortiguador, MgS04 a 90°C antes de la adición de dNTP (250 µM) y Pwo polimerasa (2.5 unidades). 40 ciclo de PCR utilizando el perfil de PCR: 90°C por 30 segundos, 57°C por un minuto y 72°C por un minuto. Un paso de elongación de 10 minutos a 72°C se incluyó al término de los 40 ciclos. El análisis de los productos a partir de este PCR en electroforesis en gel de agarosa mostró una mancha de bandas de ADN con intervalos en tamaño de 100 a 850 pares de bases. El primer PCR se reamplificó utilizando 2 µl a partir de la reacción anteriormente mencionada como molde y los iniciadores flanqueantes (1 µM de cada uno) HOX1A y HOX1B. La reacción contenía dNTP 200 µM, MgCI2 2.5 mM y 2 unidades de AmpliTaq ® (Perkin-Elmer Cetus). Las condiciones de PCR fueron: 94°C por dos minutos, luego 30 ciclos de PCR con el perfil 94°C por 30 segundos, 60°C por un minuto y 72°C por 45 segundos. Un paso de elongación de 10 minutos a 72°C se incluyó al término de la reacción anteriormente mencionada. Los análisis del segundo producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa mostró la presencia de una banda de ADN de 850 pb la cual se purificó subsecuentemente a partir del gel y se clonó dentro del vector pCR ® (Invitrogen).

Gen HOX distal 3' sintético Diez iniciadores de longitudes con intervalos de 90-126 pares de bases se diseñaron para sintetizar la parte distal del gen HOX. Los iniciadores contenían regiones sobrepuestas (complementarias) de 16-21 pares de bases con una temperatura de fusión calculada de aproximadamente 60°C. La parte distal del gen HOX se sintetizó como dos fragmentos (A y B), cada uno con un tamaño de 530 pares de bases. Dos reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando 6 iniciadores a la vez: la reacción de PCR 1 contenía los iniciadores 1-6 y la reacción de PCR 2 contenía los iniciadores 5-10. La reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo utilizando 0.1 µM de cada uno de los iniciadores, 250 µM de cada uno de los dNTP, MgS04 2 mM y 2.5 unidades de Pfu ADN polimerasa a partir de Pyrococcus furiosus (Stratagene) en un volumen de reacción de 100 µl. Los parámetros de formación de ciclo para las dos reacciones de PCR utilizando Pfu ADN polimerasa incluyeron una desnaturalización de 1 minuto a 95°C seguida por 30 ciclos de PCR 220 por 2 por 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto. Esto se continuó por un paso de elongación a 72°C por 3 minutos. El análisis de los productos de PCR a partir de las dos reacciones de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa mostró en ambos casos, la síntesis de una banda específica de ADN del tamaño correcto de aproximadamente 530 pares de bases en longitud. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCR ®-Blunt (Invitrogen). Los genes HOX sintéticos parcialmente clonados se secuenciaron utilizando iniciadores que flanqueaban los sitios de clonación múltiple (iniciado reverso M13 e iniciador promotor T7). Los resultados de las secuenciación verificaron que los genes parcialmente sintetizados contenían la secuencia correcta.

Ensamblaje del gen HOX optimizado con el codón final Las tres partes del gen HOX sintético se combinaron mediante ligación de los fragmentos de ADN purificados mediante gel que comprenden HOX proximal 5' Ncol/Pvull, el fragmento A distal 3' Pvull/Spel y el fragmento B cortado con Spel/Notl. El gen HOX completo, sintético optimizado para el codón (figura 6) se ensambló dentro del vector de expresión de Hansenula, el cual se desarrolló para mediar la expresión y secreción de proteínas externas a partir de Hansenula. El vector de expresión se pasó en el promotor de formiato deshidrogenasa (FMD), el terminador MOX, con y sin una señal de secreción de levadura.

Resultados 1 Expresión del HOX recombinante en H. polvmorpha El cuadro 1 muestra diversas construcciones de fusión de HOX/secreción las cuales se insertaron como fragmentos romos EcoRI/Notl dentro del sitio de clonación múltiple del vector de expresión/integración de H. polymorpha. Las diferentes secuencias señal se derivaron a partir del gen de glucoamilasa a partir de Schwanniomyces occidentalis, del gen tipo factor ade apareamiento a partir de Saccharomyces cerevisiae y amilasa TAKA a partir de Aspergillus oryzae. Una construcción HOX Ncol/Notl sin una secuencia señal también se clonó dentro del vector. 10 15 El término mutantes sintético se refiere a un sitio de fragmentación R331-K332 a R331-P332 de la proteasa putativa KEX 2.

EJEMPLO 2 Transformación y resiembra 20 Los diferentes plásmido de expresión de HOX se utilizaron para transformar la cepa uracilo auxotrófica de H. polymorpha RB11 a uridina prototrófica. Los transformantes HOX que contienen los diferentes plásmido - - fíM ltiiiffiiri?í t „• >,....-,. *;,w¿---,-y,.-. de expresión se cultivaron bajo condiciones selectivas por 30 generaciones para amplificar el ADN plasmídico y permitir la integración dentro del genoma. Los transformantes se crecieron sobre medio no selectivo completo por 30 generaciones. Además de la selección, se utilizaron PCR y análisis de Southern para caracterizar a los transformantes.

Determinación del número de copias del ADN heterólogo integrado El ADN genómico de la cepa hospedera no transformada y varios aislado recombinantes de una construcción particular HOX se digirieron con las enzimas de restricción, Asp718/Ncol. El ADN restringido se separó sobre geles de agarosa al 0.8%, se transfirió a una membrana (nitrocelulosa) y se híbrido a un fragmento marcado con 32P del promotor FMD clonado. El patrón de hibridación reveló dos señales, una de la copia particular genuina del gen FMD de 1.4 kb y una que se origina a partir de una fusión heterogénea ligeramente menor. Una serie de diluciones permitieron la estimación de la intensidad de la señal del ADN integrado en comparación con la copia única intrínseca control.

Resultados 2 Selección de la expresión de HOX Los transformantes se crecieron en tubos de cultivo de 3 mL y se cultivaron bajo condiciones sin represión al suplementar el medio con glicerol al 1%. La expresión de HOX se analizó mediante análisis de SDS-PAGE de los cultivos a partir de la fermentación en glicerol. Los análisis Western blot utilizando un anticuerpo policlonales para HOX se utilizaron para detectar la presencia de proteína HOX.

CUADRO 2 Características de los transformantes seleccionados que expresan HOX.

EJEMPLO 3 Localización del HOX recombinante en H. Polymorpha Para microscopía por inmunofluorescencia de H. polymorpha recombinante, las células se precultivaron en base levadura nitrógeno (YNB) + glucosa a una densidad de 108 células/ml. Para introducir la expresión, 3 x 108 células se cambiaron a 100 mL de cultivos de botellas en agitación suplementados con YNB + glicerol al 1%. Después de 1, 2 o 3 días de crecimiento bajo condiciones sin represión 5 x 108 células se utilizaron mediante un tratamiento combinado de paraformadehído (4%) y glutaraldehído (0.2%) (Hagen y Hyman, 1988). Después de tres lavados con 1 mL de PEM (Pipes 100 mM, EGTA 1 mM, MgSO4 1 mM, pH 6.9), las paredes celulares se removieron parcialmente en PEMS (PEM + sorbitol 1 M) r t ril ?f - t suplementado con 0.5 mg/mL de Zymolasa-100T. Después de aproximadamente 60 minutos de digestión, las células se cambiaron a PEMS + Tritón X-100 al 1%, se incubaron 30 segundos y se lavaron tres veces con 0.5 mL de PEM. Para eliminar el glutaraldehído que no reaccionó las células se resuspendieron en PEM + 1 mg/mL de borohidruro de sodio. Inmediatamente después de esto, las células se lavaron dos veces en PEM, se resuspendieron en PEMBAL (PEM + BSA al 1% (libre de globulina), hidrocloruro de lisina 1 mM, NaN3 al 0.1%), y se incubaron sobre una rueda en rotación por 30 minutos. 25% de la suspensión celular, que es equivalente a 108 células, se suplemento con 10 µg/ML de anticuerpos policlonales anti-HOX purificados mediante afinidad y se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de tres lavados en 0.5 mL de PEMBAL, las células se suspendieron en PEMBAL, y se incubaron 5-20 horas en la oscuridad con anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con FITC al 0.5% (Sigma). Después del lavado en PEMBAL, las células se lavaron una vez en PBS, una vez en PBS + 0.2 µg/mL de diaminofenilindol (DAPI) y finalmente se resuspendieron en PBS + NaN3 al 0.1%. Para observación microscópica, pequeñas piezas de suspensiones celulares se secaron sobre cubreobjetos cubiertos con poli-L-lisina y se invirtieron dentro de cuotas de glicerol al 100% que contenían 1 mg/mL de para-fenilen diamina. Las células examinaron con los microscopio Zeiss equipado para inmunofluorescencia indirecta a 1.000 X y se capturaron imágenes mediante una cámara CCD (MicroMAX Kodak) y se procesaron utilizando software MetaMorph. «...j -J-J.. * . -¿. - - - Resultados 3 La microscopía por inmunofluorescencia de los transformantes DK8-27 reveló que la proteína recombinante HOX principalmente se localiza en la periferia de las células como agregados (figura 7b). En combinación con los datos bioquímicos, estos resultados indican que HOX hasta cierto grado puede ser una proteína asociada a membrana (en oposición a la proteína sustancialmente unida a membrana). Es más probable que HOX se localice en la membrana plasmática en H. polymorpha. También, en la cepa DK8-27 mut25, la cual deriva a partir de DK8-27, HOX está asociada con la membrana plasmática (figura 7c). La proteína, sin embargo, no se acumula en agregados sino que se distribuye más uniformemente. Cuando se fusiona a varios péptidos líder HOX se acumula en enormes agregados intracelulares (figura 7d).

EJEMPLO 4 Extracción de HOX a partir de células recombinantes de Hansenula por medio de diferentes detergentes y proteasas El experimento se llevó a cabo al utilizar 5.0 mL de suspensión celular (células + sobrenadante) en un tubo de centrífuga de 15 mL (HOX9926-7, 317 g células/L peso húmedo, 0.3 U/mL actividad HOX extracelular). Las células se separaron mediante centrifugación a 4000 g por diez minutos. Para los experimento de permeabilización, el sobrenadante nit 1 tBA'm^" suplemento ya sea con, CTAB, CTAB + Pronasa E, Pronasa E, Tween 20 (un nombre registrado para monolaurato de polioxietileno sorbitano) y Tween 80 (un nombre registrado para monooleato de sorbitano. Las células se resuspendieron entonces en 4.0 mL de sobrenadante y se incubaron por 23 horas a 25°C (500 fm). Con el objeto de examinar el efecto del tiempo con CTAB, las células en uno de los tubos se incubaron solamente por 7 minutos a 25°C en 4 mL de CTAB al 0.4%. Las células se separaron mediante centrifugación. Las células se resuspendieron entonces de nuevo en el sobrenadante original sin añadir CTAB y luego se incubaron por 23 horas como anteriormente se mencionó. Después de la incubación, la HOX extracelular en los extractos libres de célula se midió mediante ensayo de HOX.

Método de ensayo para determinación de actividad HOX (ensayo HOX) La actividad HOX se estimó mediante el ensayo de Sullivan e Ikawa (1973). El ensayo se escaló para llevarlo a cabo en placas de microtitulación.

Principio El ensayo HOX se basa en la medición del peróxido de hidrógeno generado en la oxidación de glucosa. El peróxido de hidrógeno fca-4 . ?i-i i^^ ?fliM¿-y-¿ tut oxida o-dianisidina en presencia de peroxidasa (POD) para formar un colorante.

HOX ß-D-glucosa + H2O + O2 . D-glucono-delta-lactona-H2?2 POD H2O2 + o-dianisidinared. ^ 2 H2O2 + 0-dianisidinaox.

Reactivos 1. Amortiguador de fosfato 100 mM, pH 6.3 2. D-glucosa 100 mM en amortiguador de fosfato 100 mM, pH 6.3 3. o-Dianisidina, 3.0 mg/mL en agua destilada 4. Peroxidasa, 0.10 mg/mL en amortiguador de fosfato 100 mM, pH 6.3 Ensayo 120 µl de reactivo 1 150 µl de reactivo 2 10 µl de reactivo 3 10 µl de reactivo 4 y 10 µl de solución de enzima (en dilución apropiada).

El ensayo se lleva cabo en una placa de microtitulación. La reacción se inicia mediante la adición de solución de enzima. La mezcla se incuba a 25°C por diez minutos con agitación. El blanco se corre el cual ^--^•" contiene todos los componentes con agua en lugar de solución de enzima. La formación del colorante se mide en un lector de placas de microtitulación a 405 nm. La linearidad de la reacción se monitorea al utilizar un programa de cinética en el lector de microplacas.

Curva estándar de peróxido de hidrógeno Una curva estándar de peróxido de hidrógeno se realiza al utilizar concentraciones variables de H2O2 fresco. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de H2O2 por minuto a 25°C.

Resultados 4 Los datos presentados en el cuadro 3 muestran que CTAB es muy eficiente para extraer HOX. CTAB también es mucho más eficiente que Tween 20 y Tween 80. No hay un beneficio significativo de la adición de una proteasa. De manera muy interesante CTAB ejerce su efecto positivo incluso cuando se utiliza solamente para una preincubación de 7 minutos, esto indica que CTAB se une muy rápidamente y permeabiliza la pared de la célula de Hansenula. Esto se apoya por el análisis del sobrenadante libre de célula para CTAB (véase a continuación) el cual muestra que solamente 50-100 ppm de las 4000 ppm de CTAB añadido están presentes en el sobrenadante libre de célula.

Una comparación del sedimento en los tubos de centrífuga para cada agente prueba también indica que el volumen de célula empaquetada de las células tratadas con CTAB es menor que el volumen de las células control o de las células tratadas con detergentes diferentes a CTAB. Este incumplimiento de las células indica que las células de hecho han sido permeabilizadas y vaciadas para algunos de sus contenidos solubles.

CUADRO 3 Efecto del detergente, detergente en combinación con proteasa y preincubación sobre la extracción de HOX intracelular EJEMPLO 5 Extracción de HOX utilizando CTAB v cloruro de benzalconio (BAO El experimento se llevó a cabo al utilizar 5.0 mL de suspensión celular (células + sobrenadante) en un tubo de centrífuga de 15 mL (HOX9959, Mut 45). La suspensión celular se suplemento entonces ya sea con CTAB (a partir de una solución de almacenamiento de CTAB al 10%) o cloruro de benzalconio (Rodalon, cloruro de benzalconio al 9.5%) y se incubó por 22 horas a 25°C (200 rpm). Después de la incubación, HOX extracelular (las células removieron mediante centrifugación por 10 minutos a 4000 rpm) se midió mediante ensayo HOX.

Resultados 5 Los datos presentados en el cuadro 4 indican que cloruro de benzalconio (BAC) es muy efectivo para liberar enzima HOX a partir de las células. CUADRO 4 Efecto de CTAB y cloruro de benzalconio (BAC) sobre HOX liberada de las células EJEMPLO 6 Extracción de HOX mediante CTAB en combinación con sales v a temperaturas diferentes Con el objeto de examinar el mecanismo del efecto de CTAB, CTAB se convino con sales caotrópicas y no caotrópicas. Cinco mL de la suspensión celular (células + sobrenadante) se añadieron a un tubo de centrífuga de 15 mL (HOX9926-7, 317 g células/litro peso húmedo, 0.3 U/mL de actividad HOX extracelular). El sobrenadante se suplemento entonces ya sea con CTAB, CTAB + NaCI, CTAB + urea, CTAB + sulfato de amonio, o el detergente no iónico, octil-glucósido. Las células se resuspendieron entonces en 4.0 mL de sobrenadante y se incubaron por 26 horas a 25°C (500 rpm). En este experimento, el efecto de agitación y temperatura no se investigó. Después de la incubación, extractos libres de célula se utilizó para estimar la actividad HOX utilizando el ensayo HOX como se describió en el ejemplo 4.

Resultados 6 Los resultados se muestran en el cuadro 5. Es claro que la agitación no es necesaria con el objeto de tener extracción de HOX en la presencia de CTAB. Hay un efecto claro de temperatura, que significa que la extracción a 4°C resulta en solamente la mitad de la actividad extraída a 25°C. La adición de cloruro de sodio y sulfato de amonio disminuyen ambos el efecto del tratamiento con CTAB, lo cual puede indicar que la naturaleza iónica de CTAB es importante. La adición de urea tiene un efecto menos dramático pero aún así reduce la cantidad de HOX extraída a aproximadamente la mitad de la cantidad extraída con CTAB al 0.4%. Aunque la urea es no iónica, ésta puede interferir con la interacción hidrófoba. La urea ha sido reportada en la técnica precedente como un medio para permeabilizar células de Pichia para la extracción de proteínas lipófilas (Craig 1987). El detergente no iónico octil glucósido no tiene un efecto de extracción significativo.

CUADRO 5 Efecto del detergente, detergente en combinación con sal, agitación, v temperatura sobre la extracción de HOX intracelular.

EJEMPLO 7 Determinación de CTAB y LTAB mediante LC-ESI-MS en extractos celulares gue contienen HOX Las muestras de HOX extraída a partir del ejemplo 5 se analizaron por su contenido de CTAB por medio de LS-ESI-MS sobre un sistema HPLC-MS Hewlett-Packard 1100 que consiste de las siguientes unidades: a) Bomba binaria de gradiente, HP 1100 b) Automuestra, HP 1100 c) Compartimiento para columna termoestablecida, HP 1100 d) Detector selectivo de masa, HP 1100 e) sSstema de datos cromatográficos, HP ChemStation, versión 6.01 El sistema estaba equipado con una columna Zorbax Eclipse(R) XDB-C8, 5 µM, 150 x 4.6 mM id. (Hewlett-Packard). La temperatura de columna fue de 25°C. Las condiciones cromatográficas fueron una fase móvil que consistía de dos solventes. Solvente A: NH4OAc 1 mM/agua, solvente B: NH4OAc 1 mM/metanol. La columna se corrió utilizando condiciones isocráticas (esto es, utilizando condiciones en donde la composición del eluyente se mantiene constantemente durante el periodo cromatográfico): 5% de A + 95% de B, con una velocidad de flujo del solvente de 0.80 mL/min y un volumen de inyección de 10 µL. Las muestras se inyectaron directamente. Las condiciones de espectrometría de masas fueron con las siguientes condiciones para cámara de aspersión: Modo de ionización: electroaspersión en modo positivo Temperatura de gas para secado (N2): 350°C Velocidad de flujo para gas de secado: 6.0 l/min Presión de nebulizador: 60 psi Voltaje capilar: - 4000 Volts Voltaje fragmentador: 100 Volts Las condiciones del detector fueron las siguientes: parámetros SIM: m/z 284.1 (catión hexadeciltrimetilamonio). Una solución de almacenamiento que contiene 500 µg de CTAB/mL de agua (índice de concentración 1000) se diluyó con agua para obtener soluciones estándares con los siguientes índice de concentración: 300 - 100 - 30 - 10. A las muestras se les añadió CTAB al 0.4% lo cual pudo dar 4000 µg/mL si todo el CTAB estaba presente en el extracto. El método de análisis para los compuestos de amonio cuaternario se optimizó al utilizar una columna diferente, y al utilizar diferentes fases móviles. A dos fermentaciones a escala de 90 L (Vest0002b con una concentración de biomasa de 314 g/L de células húmedas) se les añadió LTAB a una concentración de 0.20 % (p/v), y HOX se extrajo por 24 horas. Una muestra a partir de cada fermentación se centrifugó a 10,000 g por 10 tmÍZké¡Mm¿t?* i.yto-Jt.y minutos, y los sobrenadante resultantes se retiraron para análisis LTAB. El siguiente método se utilizó para cuantificar el contenido de LTAB en los sobrenadantes por medio de LC-ESI-MS sobre un sistema HPLC-MS Hewlett-Packard 1100 que consistió de las siguientes unidades: a) Bomba binaria de gradiente, HP 1100 b) Automuestra, HP 1100 c) Compartimiento para columna termoestablecida, HP 1100 d) Detector selectivo de masa, HP 1100 e) Sistema de datos cromatográficos, HP ChemStation, versión 6.01 El sistema estaba equipado con una columnaPLRP-S, 100 A, 5 µM, 250 x 4.6 mM id. (Polymer Laboratories). La temperatura de columna fue de 25°C. Las condiciones cromatográficas fueron una fase móvil que consistía de ácido heptafluorobutírico al 0.1% y metanol. La columna se corrió con una velocidad de flujo del solvente de 1.00 mL/min y un volumen de inyección de 5 µL. Las muestras se diluyeron 25 veces con metanol y se filtraron a través de Gelman GHP Acrodisco 13 mM Miniproyecciones de 0.45 µM antes de la inyección. Las condiciones de espectrometría de masas fueron con las siguientes condiciones para cámara de aspersión: Modo de ionización: electroaspersión en modo positivo Temperatura de gas para secado (N2): 350°C . -,t>-.m T? i -yirt-^^- fiíi-dat-éa-hi».

Velocidad de flujo para gas de secado: 13.0 l/min Presión de nebulizador: 60 psi Voltaje capilar: - 4000 Volts Voltaje fragmentador: 150 Volts Las condiciones del detector fueron las siguientes: parámetros SIM: m/z 228.1 (catión lauroiltrimetilamonio). Una solución de almacenamiento que contiene 250 µg de LTAB/mL de metanol (índice de concentración 1000) se diluyó con metanol para obtener soluciones estándares con los siguientes índice de concentración: 400 - 200 - 120 - 80 -36 - 10.8 - 5.4 - 2.16 - 0.864.

Resultados 7 Está claro a partir del cuadro 6 que el nivel de CTAB en extractos celulares que contienen la enzima HOX es mucho menor que la cantidad añadida a las células. Esto se explica por la unión y por lo tanto inmovilización del CTAB a las paredes celulares de levadura. Esto significa que la enzima HOX resultante contiene solamente un nivel muy bajo de CTAB.

^.MlAsí ? j -i -t?a»it ti-^.'tt-m CUADRO 6 Contenido de CTAB en los sobrenadantes de HOX extraída a partir del ejemplo 6 1 Analizado mediante el primer método. Los resultados obtenidos sobre LTAB en el sobrenadante (véase cuadro 6a) muestran que solamente aproximadamente 27% del LTAB añadido se encuentra en la fracción libre de células. Este resultado muestra la misma tendencia que los resultados con CTAB en el cuadro 6.

CUADRO 6a Contenido de LTAB en los sobrenadante extraídos a partir de la fermentación Vest0002b y Vest0003 a partir del ejemplo 6 EJEMPLO 8 Efecto de la temperatura sobre el tiempo y eficiencia de extracción de HOX mediante CTAB El efecto de la temperatura sobre el tiempo y eficiencia de la extracción de HOX mediante CTAB se examinó sobre una muestra de Hansenula: Mut 45, HOX9949, 282 g/L, 2.6 U/mL. A 5 mL del fermento (células + sobrenadante) en un tubo de centrífuga, se añadieron ya sea 0.2% o 0.4% de CTAB (a partir de una solución de CTAB al 10%). Los tubos incubaron a 25, 30, 35 y 40°C, respectivamente (200 rpm). A los tiempos indicados las muestras se tomaron y después de la centrifugación por 5 minutos a 10,000 g, el sobrenadante ensayó para actividad HOX. No resultados demuestran en el cuadro 7.

CUADRO 7 Transcurso en el tiempo de la extracción de HOX a partir de H. polvmorpha a diferentes temperaturas Resultados 8 Está claro que la extracción de CTAB es dependiente de la temperatura y que una extracción más rápida puede lograrse al utilizar una temperatura más elevada. Este es, sin embargo un parámetro el cual tiene que ser balanceado con la estabilidad de la proteína extraída. En este experimento no parecen existir diferencias significativas entre utilizar CTAB al 0.2% y CTAB al 0.4%. Sin embargo, esto depende de la concentración celular en el experimento específico.

. .. ^.?MA,. ?Mátíá,?íá*i EJEMPLO 9 Extracción de HOX con diferentes compuestos de amonio cuaternario Varios compuestos de amonio cuaternario se evaluaron con respecto a la extracción de la enzima HOX intracelular a partir de Hansenula polymorpha. Una muestra del caldo de fermentación se retiró a partir de una fermentación de escala de 6 L en donde la concentración de biomasa fue de aproximadamente 340 g de peso húmedo por L. Un mL de una solución al 4% (p/v) de cada uno de los compuestos de amonio cuaternario listados en el cuadro 8 se añadió a 9 mL del caldo de fermentación en tubos plásticos. Después de 24 horas de incubación a 25°C a 200 RPM los tubos se centrifugaron 10 minutos a 12,000 g. Los sobrenadante se analizaron para actividad HOX utilizando el ensayo HOX como se describió previamente. El transcurso de tiempo para la extracción HOX se estudió con CTAB, LTAB y CTAC. Una muestra de fermentación que contenían 280 g peso húmedo de Hansenula polymorpha por L se retiró a partir del fermentador. Una solución al 4% (p/v) de CTAB, LTAB y CTAC se añadió a una concentración final de 0.2 o 0.4 % (p/v) a tubos plásticos que contenían 9 mL del caldo de fermentación. Después de 0, 7, 17, 24, y 48 horas de incubación a 25°C a 200 RPM los tubos se centrifugaron 10 minutos a 12,000 x g. Los sobrenadante se analizaron para actividad HOX utilizando el ensayo HOX previamente descrito.

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El efecto de extracción de LTAB se evaluó sobre la cepa Pichia pastoris # 349 que produce HOX intracelularmente. Una muestra del caldo de fermentación se retiró a partir de la fermentación en escala de 6 L en donde la concentración de biomasa fue de aproximadamente 232 g peso húmedo por L. Nueve mL del caldo de fermentación se añadieron a tubos plásticos junto con 0 (control) a 180 µL de una solución al 10% (p/v) de LTAB. Después de 24 horas de incubación a 30°C a 20 RPM los tubos se centrifugaron 5 minutos a 9000 g. Los sobrenadante se analizaron para actividad HOX utilizando el ensayo HOX como se describió previamente.

Resultados 9 HOX pudo ser extraída con todos los compuestos de amonio cuaternario evaluados (véase cuadro 8) cuando se añadió a una muestra de fermentación en una concentración final de 0.4% (p/v). Después de 24 horas de incubación a 25°C, LTAB fue superior a los otros compuestos evaluados con respecto a la extracción de HOX. La cantidad de HOX extraída parece disminuir con una longitud de cadena en incremento del compuesto de amonio cuaternario. El transcurso de tiempo de la extracción de HOX con CTAB, LTAB o CTAC demuestran el cuadro 9. Está claro que tanto el tiempo de incubación como la concentración del reactivo de extracción influye la cantidad de actividad HOX extraída. LTAB se encontró que es el mejor reactivo de extracción en todos los tiempos de incubación analizados lo cual JÁCJ Á*. CÍÁÍÍ.*ím es consistente con lo resultados mostrados en el cuadro 8. La extracción de HOX con LTAB parece proceder a un ritmo más lento a una concentración de LTAb al 0.2% (p/v), que a una concentración de LTAB al 0.4% (p/v). Parece haber una pequeña diferencia entre el uso de CTAB al 0.2% a CTAB al 0.4% (p/v) en términos de extracción de la enzima HOX.

CUADRO 8 Extracción de HOX a partir de Hansenula polvmorpha con varios compuestos de amonio cuaternario Los niveles de HOX extracelular en el caldo de fermentación antes de la adición de los reactivos de extracción fue de aproximadamente 9% de la actividad HOX extraída con LTAB después de 24 horas. a los compuestos son todos de la estructura:CH3-(CH2)n-N(CH3)+3 con cloruro o bromuro como contraión. b todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado c no resultados a partir de Pichia pastoris se normalizaron con respecto a HOX extraída en el tubo control sin ningún LTAB añadido. El nivel de HOX extracelulares en la fermentación antes del inicio de la extracción fue 10 de aproximadamente 24% del nivel extraído en el control, es decir el tubo plástico sin ningún LTAB añadido.

CUADRO 9 Transcurso de tiempo para la extracción de la enzima HOX con CTAB. 15 LTAB. v CTAC 20 El nivel de HOX extracelulares en el caldo de fermentación antes de la adición de reactivos de extracción fue aproximadamente 4% de la «*_A. -éi-t . ,i,-.Vi ^.,.».:*,¡.-.-MÍ.¡M. --,-ÍÍt.. itS tAált? .ÍíJ-t,y. .1 J actividad HOX extraída con LTAB al 0.4% (p/v) después de 48 horas. Los valores eran como +/- 1 desviación estándar, n: el número de experimentos. Todos valores se normalizaron a los niveles extraídos con LTAB al 0.4% (p/v) después de 48 horas.

EJEMPLO 10 Comparación entre CTAB y otros emulsificantes para extracción de HOX Se sabe que la lisolecitina (lisofosfatidilcolina) puede permeabilizar al menos células de mamífero, con liberación selectiva de macromoleculas. Con el objeto de evaluar el efecto de la lisolecitina y un número de otros emulsificantes y ácidos grasos de cadena corta, su capacidad para extraer HOX se examinó y comparó con CTAB. Cinco mL de suspensión celular (células + sobrenadante) se añadió a un tubo de centrífuga de 15 mL (HOX9910B, 305 g células/litro peso húmedo, 1.6 U/ml de actividad HOX extracelulares). Las células se separaron mediante centrifugación a 4000 g por 10 minutos. Las células se resuspendieron entonces en 4. mL de ácido cítrico 25 mM, pH 6.3 suplementado ya sea con CTAB, emulsificantes SLL, YN, ácido cáprico, lisolecitina, o lecitina. Las células incubaron entonces por 20 horas a 25°C (500 rpm).

Resultados 10 Después de la incubación, el nivel de actividad de HOX en el extracto libre de células se midió mediante el ensayo HOX. Estos datos presentados en el cuadro 10 indican que los emulsificantes evaluados diferentes a CTAB solamente son capaces de liberar niveles muy bajos de actividad enzimática. No resultados también indican que CTAB es capaz de activar enzima latente en el sobrenadante, posiblemente mediante la liberación de la enzima a partir de los fragmentos unidos a la membrana.

CUADRO 10 Efecto del detergente, emulsificantes y fosfolípidos sobre la extracción de HOX _.Ü EJEMPLO 11 Comparación entre CTAB v saponina para la extracción de HOX Con el objeto de establecer si la saponina trabaja como la digitonina, se examinó el efecto de la saponina sobre la extracción de la enzima HOX a partir de Hansenula. El experimento se llevó a cabo con 5.0 mL de suspensión celular (células + sobrenadante) en un tubo de centrífuga de 15 mL (HOX190799, 340 g células/litro peso húmedo, 0.5 U/mL de actividad HOX extracelular). Las células se separaron mediante centrifugación a 4000 g por 10 minutos. Las células se resuspendieron entonces en 4.0 mL de sobrenadante el cual suplemento ya sea con CTAB, o saponina, o se resuspendió en ácido cítrico 25 mM, pH 6.3 suplementado con ya sea CTAB, o saponina. Con el objeto de confirmar que la actividad HOX medida en el extracto libre de células (después del tratamiento con CTAB) es actualmente el resultado de la extracción y no solamente el resultado de la activación de HOX en el sobrenadante (puede ser que HOX exista de hecho en el sobrenadante pero este inactiva), el sobrenadante libre de células (después de la suplementación con CTAB o saponina) también se incubó y se analizó para actividad HOX. Los tubos incubaron por 19 horas a 25°C (500 rpm). Después de la incubación, la HOX extracelular en el extracto libre de células se midió mediante el ensayo HOX.

Resultados 11 Los resultados en el cuadro 11 muestran que la saponina tiene una capacidad insignificante para extraer HOX a partir de las células. Además, no hay ninguna indicación de la activación de HOX ya sea mediante saponina ni mediante CTAB.

CUADRO 11 Extracción/activación comparativa de HOX al utilizar diferentes agentes permeabilizantes EJEMPLO 12 Extracción de HOX mediante CTAB en fermentador de 100 L Después de 120 horas de fermentación (FermID Vest9910b) una solución CTAB (360 g de CTAB disueltos en 3.6 L de agua a 40°C) se añadió directamente al caldo a través de un puerto de entrada en el fermentador de 100 L. La concentración final de CTAB en el caldo de fermentación fue aproximadamente 4 g/L, puesto que el volumen activo del fermentador fue aproximadamente 90 L. Simultáneamente, la agitación, aireación, control de pH y adición por alimentación se detuvieron. La temperatura se controló a 25°C, y después de 22 horas de tratamiento con CTAB el contenido de HOX en el caldo se había incrementado de 1.6 U/mL a 30 U/mL.

EJEMPL0 13 Homogeneización de HOX producida por Hansenula polvmorpha a escala de laboratorio Con el objeto de evaluar la eficiencia de la extracción de HOX como un resultado del tratamiento con CTAB, las células a partir de dos series de fermentaciones diferentes se fragmentaron al utilizar un equipo de fragmentación celular "Z Plus" 2.2 kW (Constant Systems Ltd, UK). Las células (5 mL) se fragmentaron utilizando una cabeza de bomba de un tiro a tZ?^& c^i? iiai^ai^m varias presiones. Después de abrir, los desechos celulares se separaron a partir el sobrenadante mediante centrifugación (5 minutos a 10,000 g) y el nivel de HOX ¡ntracelular en el sobrenadante libre de células se midió utilizando el ensayo HOX, previamente se describió. Las mismas células también habían sido tratadas con CTAB al 0.2% (25°C, 500 rpm, 20 horas) y el extracto libre de células se utilizó como un parámetro de comparación.

Resultados 13 Los datos presentados en el cuadro 12 indican que la cantidad total de HOX intracelular se extrae mediante tratamiento con CTAB al 0.2%.

CUADRO 12 Eficiencia del tratamiento con CTAB EJEMPLO 14 Homogeneización de HOX producida por Hansenula potvmorpha a gran escala 10 L de caldo de fermentación (FermID Vest9907b) se homogeneizaron en un homogeneizador APV Gaulin a elevada presión modelo 30 CD. El homogeneizador se operó mediante velocidad de flujo máximo (100 L/minuto) y mediante una presión de 1000 bars. Durante el procedimiento de homogeneización el caldo se enfrió con agua fría, y el producto de la temperatura nunca excedió 20°C. Un incremento rápido en la actividad HOX se observó durante los primeros tres ciclos, seguida por un nivel casi estacionario después de 5-7 ciclos.

Resultados 14 Los resultados se muestran en el cuadro 13 y en la figura 8 CUADRO 13 Extracción mecánica de HOX a partir de Hansenula polvmorpha « tfc «.«<>«, «i**. *^^^^^¿^^ ' a-rf- t ..

EJEMPLO 15 El efecto del Tritón X-100 sobre la extracción de HOX a partir de Hansenula polvmorpha CTAB o Tritón X-100 se añadieron a 5 mL del fermento, (muestra HOX0054, Mut 45, 18.10. 99, HVP) en un tubo de centrífuga. El agua se añadió al control. Las muestras incubaron a 25°C por 22 horas a 200 rpm. Después de la incubación las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se analizó para actividad HOX como previamente se describió.

Resultados 15 Los resultados se muestran en el cuadro 14 y figura 9. El detergente no iónico, Tritón X-100 había sido utilizado para permeabilizar células de levadura (véase Naglak et al., 1990 y patente de E.U.A. No. 5124256) pero está claro a partir este experimento que el Tritón X-100 no tiene efectos de extracción, contrario a CTAB el cual no había sido descrito en la técnica precedente como capaz de extraer una enzima intracelular tal como una enzima HOX, aunque había sido descrito que daba permeabilización de células. iitett-*- tAJi--»j &&&,&& CUADRO 14 Extracción de HOX con CTAB en comparación con Tritón X-100 EJEMPL0 16 Western blot El Western blot se utilizó para evaluar la eficiencia de la secreción de HOX mediante el análisis de las cantidades de enzima HOX residual (concentrado) y liberada (sobrenadante). Las células se trataron con CTAB al 0, 0.1 , 0.2, y 0.4%, respectivamente, por 20 horas. Después de la incubación las células se separaron mediante centrifugación a 4000 g por 10 minutos. El SDS-PAGE (Mes Nu-Page al 4-12%) de sobrenadante resultantes se muestra en la línea 7-10 de la figura 10A. Los concentrados se lavaron dos veces con amortiguador, y luego se resuspendieron en amortiguador y se fragmentaron en un fragmentador de células FastPrep. Los expertos de los concentrados también se aplicaron a un SDS-PAGE (véase líneas 2-5 en la figura 10A), utilizando geles pre elaborados Novex de conformidad con las instrucciones del fabricante (Novex, San Diego, E.U.A.). El gel SDS-Page se sometió a blot con una membrana de nitrocelulosa de conformidad con las instrucciones del fabricante (Novex, San Diego, E.U.A.). El blot se incubó con anticuerpos (antisuero de conejo # 4364 BI/OCH 190797) generado en contra 5 de la enzima HOX, la preparación del cual se describe a continuación.

Producción de anticuerpos específicos para HOX Una enzima HOX recombinante se produjo en Escherichia coli a partir del plásmido de expresión PUPO181 como se describe en WO ío 96/40935. El extracto crudo de células de E. coli expresan HOX recombinante se analizó mediante SDS-PAGE. Una banda prominente de proteína al peso molecular relativo (Mr) de 62 kD que corresponde a HOX se transfirió a una membrana de difluoruro de poliviniledo (PVDF) y se sometió a análisis de secuencia de aminoácido N-terminal como se describe en WO 96/40935. La 15 secuencia de aminoácidos identificada fue: Ala-Thr-Leu-Pro-GIn-Lys-Asp-Pro- Gly-Tyr-(SEQ ID NO: 1 ). Esta secuencia corresponde los aminoácidos números 2-11 en la secuencia publicada para HOX (Hansen y Stougaard, 1997). Por lo tanto, se concluyó que la proteína expresada de 62 kD fue HOX recombinante que carecía del aminoácido de metionina N-terminal, Metí . 20 La banda HOX de 62 kD observada en SDS-PAGE se purificó mediante SDS-PAGE preparativa y electroelución a partir de los geles como se describió por Hunkapiller et al (1983). La pureza de la banda HOX electroeluída de 62 kD se analizó mediante SDS-PAGE y mediante análisis de ' ^ «,* „. secuencia de aminoácidos como se describió anteriormente. La HOX purificada se utilizó para producción de anticuerpo en conejos. Las porciones de aproximadamente 50 µg se mezclaron con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund y se utilizaron para inmunización. Los anticuefos policlonales específicos a HOX producidos en los conejos se utilizaron a lo largo del estudio en análisis Western blot. Las proteínas a ser analizadas mediante análisis Western blot se sometieron a electroforesis como se describió anteriormente y se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa de conformidad con los procedimientos estándares. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó por un ahora en solución de TBS-T (Tris 50 mM, pH 7.5; NaCI 150 mM; Tween-20 0.1%) que contenía leche descremada en polvo al 3%. Los anticuerpos específicos a HOX diluidos 1 :10,000 en TBS-T que contenía leche descremada en polvo al 1.5% se añadieron y el blot se incubó durante toda la noche. El blot se lavó tres veces en TBS-T antes de la incubación (una a dos horas) con el anticuefo secundario (inmunoglobulinas de cabra anti-conejo conjugadas con fosfatasa alcalina, DAKO, número de catálogo D0487), diluido 1: 1000 en TBS-T que contenía leche descremada en polvo al 1.5%. El blot se lavó subsecuentemente en TBS-T (2 x 20 minutos) y en TBS (50 mM, pH 7.5; NaCI 150 mM; 1 x 5 minutos) antes de desarrollar en amortiguador Nitroazul tetrazolio/5-Bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (NBT/BCIP) de conformidad con los procedimientos estándares.

La especificidad de los anticuerpos se investigó en una serie de Western blot con extractos que contenían HOX a partir de Chondrus crispus, E. coli y Pichia pastoris, respectivamente. Los análisis Western blot de extractos que contenía en HOX de P. pastoris mostraron una fuerte banda específica para HOX a Mr de 62 kD además de dos o tres bandas más débiles a pesos moleculares menores.

Resultados 16 Los resultados del Western blot se muestran en la figura 10B. Este Western blot confirma que prácticamente ninguna HOX se mantiene en las células después del tratamiento con CTAB al 0.4%.

EJEMPLO 17 Descripción de la selección de alta resolución (HTS) para niveles incrementados de enzimas intracelulares Una cepa de Hansenula polymorpha que expresa la enzima HOX se modificó mediante mutación con luz UV a una longitud de onda de 254 nm. La cepa modificada mediante mutación se sembró sobre cajas de agar (1.4 g/L base levadura nitrógeno (YNB) a partir de Gibco, 5 g/L (NH4)2SO4) 1 g/L de glicerol y agar al 2% (p/v) y se incubó a 30°C hasta que las colonias se formaron. Las colonias inocularon con un aplicador de colonias robótico (Q- Pix, Genetix, Christchurch Dorsett, RU) dentro de placas de microtitulación de 96 pozos. Cada pozo de microtitulación contenía 200 µL de medio YNB (MES 100 mM pH 6.1 , 1.4 g/L de YNB a partir de Gibco, 5 g/L (NH4)2SO4 y 10 g/L de glicerol). Las placas de microtitulación se incubaron a 25°C con agitación por siete días en una incubadora con agitación IOC400.XX2.C (SANYO Gallenkamp BV, Breda, Países Bajos). Las actividades de HOX se midieron en 10 µL de caldo de fermentación con el ensayo HOX modificado para que contenga solamente 105 µL del reactivo 1 y 15 µL de CTAB al 0.4% (p/v) se añadieron al ensayo. El tiempo de reacción fue de 60 minutos a 30°C. El ensayo HOX se llevó a cabo con un robot para pipeteo Plato 7 (Rosys, Hombrechtikon, Suiza) y las absorbancias se midieron en un lector de microplacas Spectramax plus (Molecular Devices, RU). El crecimiento en cada pozo de microtitulación individual se midió a transferir 10 µL de caldo de fermentación a una nueva placa de microtitulación, añadiendo 100 µL de amortiguador de fosfato 100 mM, pH 6.3 y midiendo la absorbancia a 600 nm. Las mediciones de HOX se normalizaron con respecto a la absorbancia a 600 nm para tomar en cuenta el crecimiento escaso.

Resultados 17 Los resultados demuestran que es posible seleccionar para mutantes de Hansenula polymorpha que producen niveles elevados de enzima HOX ¡ntracelulares.

EJEMPLO 18 Comparación de actividad específica para HOX extraída mediante CTAB (véase por ejemplo cuadro 12) y enzimas HOX "mecánicamente extraídas" (véase por ejemplo cuadro 13 y figura 8).

Resultados 18 Los resultados demuestran que la actividad específica de HOX extraída mediante CTAB es mayor que la actividad específica de HOX "extraída mecánicamente". Estos resultados indican que CTAB no extrae todas las proteínas intracelulares localizadas en el organelo, sino principalmente las proteínas citosólicas.

EJEMPLO 19 Caracterización de HOX extraída mediante CTAB v extraída mecánicamente mediante cromatografía de intercambio iónico Con el objeto de analizar la pureza de la HOX extraída mediante CTAB, ésta se comparó a la HOX extraída utilizando fragmentación celular. La actividad específica se determinó y se comparó, y los contenidos de ácidos nucleicos de los extractos se compararon. Además la pureza se examinó mediante cromatografía de intercambio aniónico.

Siete mL de la suspensión celular (células + sobrenadante) se añadió a un tubo de centrífuga de 15 mL (HOX9957, Mut 45). Después de la adición de CTAB al 0.4% la suspensión celular se incubó por 23 horas a 30°C (200 rpm). Las células removieron mediante centrifugación (10,000 g y 10 minutos) y el sobrenadante libre de células se utilizó como una fuente de HOX extraída mediante CTAB. Otros 7 mL de la misma suspensión celular (sin añadir CTAB) se fragmento al utilizar una cabeza de bomba de un disparo a 2 X 2400 bar (Z Plus, 2.2 kW, Constant Systems Ltd, RU). Los desechos celulares se separaron entonces mediante centrifugación (10,000 g y 10 minutos) y sobrenadante se utilizó como una fuente de HOX mecánicamente extraída. Ambas muestras se desalificaron sobre una columna PD10 (Pharmacia Biotech.) en amortiguador TEA 20 mM (trietanolamina, Merck), pH 7.3. Las muestras se analizaron para actividad HOX y concentración de proteínas (ensayo de proteína basado en el método de ensayo descrito por Schleif y Wensik, 1981). El contenido de ácidos nucleicos se determinó al medir la absorción a 260 nm y 280 nm (Bollag y Edelstein, 1991). La cromatografía de intercambio iónico se llevó a cabo al utilizar un sistema de doble flujo biológico (Bio-Rad, CA. E.U.A.). 500 µL de la muestra desalificada se aplicaron a una columna fuente Q 15 (HR5/5, Pharmacia Biotech.) equilibrada en amortiguador TEA (amortiguador A, 20 mM, pH 7.3). La HOX se eluyó con un gradiente lineal de 20 mL a partir de NaCI 0-0.5 M en amortiguador A con una velocidad de flujo de 1.5 mL/minuto j -tAy-A durante el cual se colectaron fracciones de 1.5 mL y se ensayaron para actividad HOX.

Resultados 19 La determinación actividad específica muestra que HOX extraída mediante CTAB es mucho más pura en comparación con la HOX extraída mecánicamente (cuadro 15). También el contenido de ácidos nucleicos es mucho menor en la HOX extraída mediante CTAB que en la HOX extraída mecánicamente (cuadro 15).

CUADRO 15 Concentración de HOX y de proteínas en HOX extraída mediante CTAB v mecánicamente El análisis de cromatografía de intercambio aniónico en las figuras 11A y 11B que muestra cromatogramas del análisis de la fuente Q para la HOX extraída mediante CTAB y mecánicamente también confirman fuertemente este resultado. ll -t». i. -.y-» y-t-.-- -. --.-yiy --y.-i,.

Experimentos con CTAB EJEMPLO 20 1. Experimentos con botellas en agitación Los diferentes medios se eligieron para los experimentos con CTAB: - YP/glicerol aM% - YNB/glicerol al 1% + NaPi 0.1 M pH 6.0 a) cultivo en YP/glicerol al 1 % 50 mL de medio se inocularon con 2.5 mL de precultivo YPD y se cultivaron a 37°C, a 160 rpm. Después de 28 horas de cultivo, se añadió metanol al 1 % (v/v) y se incubó adicionalmente por 18 horas a 37°C, a 160 rpm. La DOßoonm se midió para calcular la cantidad de CTAB que fue necesaria. Las alícuotas del sobrenadante (SN) y el concentrado celular de un cultivo de 1.5 mL se tomaron. Después de la fragmentación mecánica de la células la fracción soluble (CX) se aisló. p- SN de estas condiciones se designó A CX de estas condiciones se designó D Los mismos volúmenes del cultivo (20 mL) se alicuotaron dentro de dos botellas en agitación. 20 mL de los cultivos se suplementaron con 0.005 g de CTAB. (CTAB -solución de almacenamiento: 0.02 g/mL; DANISCO: 0.4% en el cultivo de fermentador (DO600nm APROX 300). , experimentos de botella en agitación DO600nm APROX 20 0.027 g CTAB/100 mL de cultivo) Incubación del cultivo: 24 horas, 4°C sin agitación ** SN de estas condiciones se designó CX de estas condiciones se designó F La segunda botella en agitación sin CTAB se incubó bajo las mismas condiciones que la botella CTAB y sirvió como cultivo de referencia. " SN de estas condiciones se designó B CX de estas condiciones se designó E Se cultivaron las cepas, que contenían cinco diferentes construcciones IL-1ra. Las cepas 4-17, AL 9/2 y II 3-1 contenían tres diferentes construcciones sin una secuencia señal, mientras que las cepas MFa 2 y MFa AL7/1 representaron dos diferentes construcciones con la pre-pro-secuencia MFa. La cepa PFMT 8 se cultivo bajo las mismas condiciones que las cepas recombinantes. Está cepa es un integrante RB11 con cerca de 30 copias del vector vacío de Hansenula pFPMT121 y sirvió como control negativo.

Después de tratamiento con CTAB, un incremento de 40 veces (20 veces) a 110 veces en la concentración de IL-1ra se detectó en el sobrenadante de las cepas, que contienen construcciones sin secuencias señal. 5 Para las cepas MFa tratadas con CTAB, un incremento menor (2 a 5 veces) de la concentración de IL-1 ra se midió.

Resultados 20 Los resultados se resumen en el cuadro 16 10 CUADRO 16: Experimentos con CTAB en YP/qlicerol/metanol 15 20 A: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol B: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol, que se incubó por 24 horas sin CTAB 5 C: sobrenadante filtrado estéril después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol, que se incubó por 24 horas con CTAB *Comentarios: La concentración de IL-1ra en sobrenadante de la cepa AL 9/2 fue inusualmente baja. En experimentos adicionales se detectaron ío concentraciones entre 0.6 y 0.7 µg/mL. La razón para el bajo rendimiento se desconoce.

EJEMPLO 21 15 b) cultivo en YNB/qlicerol al 1% + NaPi 0.1 M pH 6.0 Para experimentos adicionales con CTAB, tres cepas que contienen tres diferentes construcciones sin secuencias señal se seleccionaron (cepas 4-17; AL 9/2; II 3-1 ). 45 mL de medio se inocularon con 5 mL de un precultivo YPD y 20 se cultivaron a 37°C, a 160 rpm. Después de 28 horas de cultivo, se añadió metanol al 1 % (v/v) y se incubó adicionalmente por 18 horas a 37°C, a 160 rmp.

La DOßoopm se midió para calcular la cantidad de CTAB que era necesaria. Las alícuotas del sobrenadante (SN) y el concentrado celular de 3 mL de cultivo se tomaron. Después de la fragmentación mecánica de la células la fracción soluble (CX) se aisló. ^ SN de estas condiciones se designó A CX de estas condiciones se designó D Los mismos volúmenes del cultivo (20 mL) se alicuotaron dentro de dos botellas en agitación. 20 mL del cultivo se suplemento con 0.003 g de CTAB. Incubación del cultivo: 24 horas, 4°C sin agitación ^ SN de estas condiciones se designó C CX de estas condiciones se designó F La segunda botella en agitación sin CTAB se incubó bajo las mismas condiciones que la botella de CTAB y sirvió como cultivo de referencia. ^ SN de estas condiciones se designó B CX de estas condiciones se designó E En todos casos, la incubación con CTAB lleva a un incremento significativo en la concentración de IL-1 ra en el sobrenadante (100 a 130 veces).

Resultados 21 Los resultados del ELISA de los experimentos con CTAB después del cultivo en dos diferentes medios se compararon en el siguiente cuadro 17. CUADRO 17: Comparación experimentos CTAB en YP/glicerol/metanol (o YNB/glicerol/metanol) A: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol B: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol (o YNB/glicerol/metanol), que se incubó por 24 horas sin CTAB C: sobrenadante filtrado estéril después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol (o YNB/glicerol/metanol), que se incubó por 24 horas con CTAB 5 EJEMPLO 22 Prueba para diferentes condiciones de incubación Para la cepa II 3/1 , cultivada en YP/glicerol/metanol (véase 1.a) se evaluaron diferentes condiciones de incubación después de la adición de ío CTAB. Condiciones: -24 horas CTAB, 4°C sin agitación (condición "estándar") -24 horas CTAB, 4°C agitación suave -24 horas CTAB, 37°C sin agitación 15 -24 horas CTAB, 37°C agitación suave Resultados 22 La concentración de IL-1ra en el sobrenadante se midió mediante ELISA. Los resultados se resumen en el cuadro 18.

A: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol B: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol, que se incubó por 24 horas sin CTAB C: sobrenadante filtrado estéril después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol, que se incubó por 24 horas con CTAB El mayor incremento de IL-1 ra en el sobrenadante se midió después de la incubación con CTAB a 37°C sin agitación (76 veces) y después de incubación con CTAB a 4°C sin agitación (49 veces). La mayor concentración de IL-1 ra se detectó a 37°C, pero la concentración en la muestra de referencia incubada sin CTAB también se incremento (16 veces). La mayor concentración en la muestra de referencia pudo ser ocasionada por la lisis celular. ^ Mejores condiciones: 4°C (para evitar lisis celular) sin agitación.

EJEMPLO 23 SDS-PAGE.Western blot y tinción con Coomassie El sobrenadante la fracción soluble del extracto sin purificar filtrado a partir de los experimentos con botellas en agitación se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Gel: gel Novex al 16% TG 1 mm; condiciones reductoras tinción coloidal Coomassie (BIO-SAFE Coomassie, Biorad). muestras: A: sobrenadante después del cultivo por 46 horas en YP/glicerol/metanol B: sobrenadante de referencia sin CTAB D: fracción soluble (CX) del extracto sin purificar dilución 1 :3 E: fracción soluble (CX) del extracto sin purificar cultivo de referencia dilución 1 :3 F: fracción soluble (CX) del extracto sin purificar después de tratamiento con CTAB dilución 1 :3 Resultados 23 WB 33 v Coo2 Cepas: 4-17 pFPMT icIL 1 ral AI 9/2pFPMT iclL 1ral + AI CTAB: incubación por 24 horas; 4°C sin agitación Los resultados de Western blot (WB 33) se presentan en la figura 12A. Las muestras prueba y cantidades añadidas se presentan en la siguiente leyenda de la figura 12A. 1. Marcador PM See Blue 10 µL (total) 2. 4-17 ASN 11 ,3 µL 3. 4-17 DCX il 1:3 11,3 µL 4.4-17 C SN CTAB 11,3 µL 5.4-17 FCXCTAB dil 1:3 11,3 µL 6. rhll-1ra- estándar (libre de BSA) 30 ng 7. AL 9/2 ASN 11,3 µL 8. AL 9/2 DCX dil 1:3 11,3 µL 9. AL 9/2 C SN CTAB 11,3 µL 10. AL 9/2 F CX CTAB dil 1 :3 11,3 µL Los resultados demuestran que ambas cepas tienen un incremento sobre IL-1ra en el SN (línea 4, línea 9) y una disminución en el CX (línea 5, línea 10) que se detectó después de tratamiento con CTAB. La tinción coloidal con azul Coomassie (Coo 2) se muestra en la figura 12B Las muestras prueba y cantidades añadidas se presentan en la siguiente leyenda de la figura 12B. 10 Cepas: MF a2 pFPMT MFa IL-1ral MFaAL 7/1pFPMT MFa IL 1 ral + Al CTAB: incubación por 24 horas; 4°C sin agitación Los resultados de Western blot (WB 34) se presentan en la figura 13A. Las muestras prueba y cantidades añadidas se presentan en la siguiente leyenda de la figura 13A. í??Májíi??*? .yl-.- i^».. ..*,.*. , &A.i .tm* 1. Marcador PM See Blue 10 µL (total) 2. MFa2 A SN 11 ,3 µL 3. MFa2 D CX dil 1 :3 11 ,3 µL 4. MFa2 C SN CTAB 11 ,3 µL 5. MFa2 F CX CTAB dil 1 :3 11 ,3 µL 6. rhll-1ra-estándar (libre de BSA) 30 ng 7. MFa AL 7/1 A SN 11,3 µL 8. MFa AL 7/1 D CX dil 1 :3 11 ,3 µL 9. MFa AL 7/1 C SN CTAB 11 ,3 µL 10. MFa AL 7/1 F CX CTAB dil 1 :3 11 ,3 µL Los resultados indican que después de tratamiento con CTAB una mezcla de IL-1 ra intracelular y secretada se detectó en los sobrenadantes C en la línea 4 y 9.

MFa 2: banda adicional de APROX 20 kDa y 34 kDa derivada a partir de IL-1ra intracelular.

MFa 7/1 : banda adicional de < 17 kDa derivada a partir de IL-1ra intensidad de 18 kDa de señal incrementada. La tinción coloidal con azul Coomassie (Coo 3) se muestra en la figura 13B Las muestras prueba y cantidades añadidas se presentan en la siguiente leyenda de la figura 13B.

WB 35 v Coo 4 Cepa: II 3/1 pFPMT iclL-1ra tipo II - 24 horas CTAB, 4°C sin agitación (condiciones "estándar") -24 horas CTAB, 37°C sin agitación Los resultados de Western blot (WB 35) se presentan en la figura 14A. Las muestras prueba y cantidades añadidas representan en la siguiente leyenda de la figura 14A. . .-. i .O .. a ÜS=l-. ... . - LmC MJ'kZí:* jfiBfei . - A J 1. Marcador PM See Blue 10 µL (total) 2. 113/1 SN 11,3 µL 3. II 3/1 CX dil 1:3 11,3 µL 4. II 3/1 SN CTAB 4°C 11,3 µL 5. II 3/1 CX CTAB 4°C dil 1:3 11,3 µL 6. rhll-1ra -estándar (libre de BSA) 30 ng 7. II 3/1 SN CTAB 37°C 11,3 µL 8. II 3/1 CX CTAB 37°C dil 1:3 11,3 µL 9. II 3/1 SN c/s CTAB 37°C 11,3 µL 10.113/1 CX c/s CTAB 37°C dil 1:3 11,3 µL La tinción coloidal con azul Coomassie (Coo 4) se muestra en la figura 14B Las muestras prueba y cantidades añadidas se presentan en la siguiente leyenda de la figura 14B.

Los resultados demuestran que después de incubación con CTAB a 4°C así como a 37°C, un incremento de IL-1 ra en el SN (WB 35: línea 4, línea 8) y una disminución en el CX (WB 35: línea 5, línea 9) se detectaron. En SN de CTAB a 37°C (línea 8) se obtuvo la cantidad mayor de IL-1 rall. Este resultado está de acuerdo con los resultados de ELISA (véase cuadro 3). En este sobrenadante no solamente se tiñó más IL-1 rall sino también otras proteínas (> 35 kDa) (Coo 4: línea 8). Esta observación confirma el supuesto de que una lisis celular significativa toma lugar a 37°C en comparación con 4°C.

Discusión El uso de codón del gen HOX de Chondrus crispus (Stougaard y Hansen, 1996, Hansen y Stougaard, 1997) se modificó a reemplazar los cordones de bajo uso con aquellos cordones más frecuentemente utilizados para el organismo hospedero Hansenula. Un sistema de expresión transformante de la levadura metilotrófica, Hansenula polymorpha, (desarrollado en Rhein Biotech, Dusseldorf/Alemania), que contenía un fragmento de ADN del codón optimizado para HOX se preparó. La optimización del codón del gen que codifica la enzima HOX resultó en niveles elevados de expresión (en términos de niveles elevados de actividad enzimática) de la enzima HOX en el organismo hospedero levadura Hansenula polymorpha. Cuando una secuencia señal no estaba presente, la . aí*?, enzima HOX se localizaba intracelularmente. Sin embargo, incluso cuando varias secuencias señal diferentes se utilizaron en diferentes construcciones, se pudo medir solamente poca o ninguna actividad HOX en el medio extracelular. Estos resultados indican que la enzima HOX es incapaz de ser secretada incluso a partir de cepas hospederas que expresan una enzima HOX que comprende una secuencia señal. Los Western blot también confirmaron que la enzima HOX puede estar localizada en una fracción asociada a membrana incluso cuando una secuencia señal está presente, indicando que a pesar de que hay transcripción y traducción del gen HOX, la enzima HOX no se secreta y se considera que se mantiene cargada en la ruta de secreción. La extracción de la enzima HOX intracelular enzimáticamente activa utilizando el método de la presente invención se comparó con un método de fragmentación celular tradicional y con procedimientos de extracción utilizando otros detergentes irónicos/no iónicos y emulsificantes. Las combinaciones de detergentes con proteasa y sales también se investigaron.

Resumen En un amplio aspecto de la presente invención, se provee un método para liderar una proteína de interés (POI) intracelular soluble o asociada a membrana que comprende los pasos de: proveer una célula que comprende una POI intracelular soluble o asociada a membrana; poner en contacto la célula con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la POI sea liderada a partir de la célula bajo condiciones suficientes para la liberación de la POI y en una forma soluble. En otro amplio aspecto de la presente invención se provee un método para liberar específicamente una proteína de interés (POI) intracelular soluble o asociada a membrana que comprende los pasos de: proveer una célula que comprende una POI intracelular soluble o asociada a membrana; poner en contacto la célula con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la POI se a liderada a partir de la célula bajo condiciones suficientes para la liberación de la POI pero insuficientes para la liberación de otras proteínas contaminantes. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anteriormente mencionada se incorporan en la presente, referencias. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y sistemas de la invención serán aparentes a los expertos en la técnica sin apartar del alcance y espíritu de la invención. A pesar de que la invención ha sido descrita en conexión con modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la invención cómo es reclamada no debe limitarse a dichas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los métodos descritos para llevar a cabo la invención los cuales son obvios a los expertos en biología molecular o campos relacionados se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

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LISTADO DE SECUENCIA <110> Danisco A/S Johansen, C Kjaerulff, S Marid, S Pedersen, H Horsmans , C <120> Método <130> p6775.wo <140> PCTlbOO/01886 <141> 2000-11-24 <150> GB 9927801.2 <151> 1999-11-24 <160> 23 <170> Patente en versión 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 3 cgaaatcgat gttggtacca atccatcttc tgttgaaacc ttgcttcatg gatggcaatc 60 ttgggtcagg cttgtctgga gtaccagcgt tgacgtcaat aacaatg 107 <210> 4 <211> 106 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 4 gattggtacc aacatcgatt tcgtttacgt cgtttacact ccacaaggtg cttgtactgc 60 tttggacaga gctatggaaa agtgttctcc aggtaccgtc agaatc 106 <210> 5 <211> 106 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 5 ttcaaccaaa ccagtaacgt tgataatagc cttgacacat tcgtcgaaaa cgaagtcttc 60 gtaacagtga ccaccagaaa cgattctgac ggtacctgga gaacac 106 tccggtgaca 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sintético <400> 11 ggaggtatac aagtacataa caaactcttc agctgcttgg tggaagattt ggaacttacc 60 15 aacagtattc ttccaatcac atctagccaa cttgaagtac ttagtcaaca aatcttgc 118 <210> 12 <211> 96 <212> ADN <213> Artificial 20 <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 12 atcttccatc aggcagctga agagtttgtt atgtacttgt atacatccta ctctaacgac 60 ctgttcaatg tcagcctcca aatgatagtg tctgtcttgg ge 102 <210> 14 <211> 90 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 14 gctggttggg ctcctttccc tgttagacct agacctagac acacatccaa gacttcttat 60 atgcatgacg agactatgga ctaccctttc 90 <210> 15 <211> 120 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 15 aatctggaag tctggaaagt ccttgatcat gtaagcagac ttgtacttac ctctctgatt 60 aggaccggaa ccgttgatag tetcagtcaa agcgtagaaa gggtagtcca tagtctcgtc 120 <210> 16 <211> 108 <212> ADN <213> Artificial i-A-AiAt-t..ti^.*- "*-.. <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 17 cttgtcttct tcctgccagt atgtctggta ctgcagtttg atgatgtact ctctctgagc 60 aactgcagta gcatcccaaa caaccttgtg aatctcacca ccgaacatat caacctgaag 120 aagagc 126 <210> 18 <211> 108 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 18 acatactggc aggaagaaga caaggatgca gttaacttga agtggattag agacttttac 60 gaggagatgt atgagcctta tggtggtgtt ccagacccta acactcag 108 <210> 19 <211> 111 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 19 ggcaccatac ttaccgttct tccagttgtt caagtcaaca tcagggtagt tgaagtagca 60 tccctcaaaa acacctttac cactctcaac ctgagtgtta gggtctggaa c 111 aagaacggta agtatggtgc cttggaactt tactttttgg gtaacctgaa cagattgatc 60 aaggccaaat ggttgtggga tcctaacgag atcttcacaa acaaacagtc tatccct 117 <210> 21 <211> 78 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Oligonucleótido sintético <400> 21 gaattccgcg gccgcctact atttagtctg cttaggctcc ttaagaggtt tagtagggat 60 agactgtttg tttgtgaa 78 <210> 22 <211> 1644 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Secuencia nucleotídica <400> 22 atggctactt tgccacaaaa ggacccaggt tacattgtta ttgacgtcaa cgctggtact 60 ccagacaagc ctgacccaag attgccatcc atgaagcaag gtttcaacag aagatggatt 120 ggtaccaaca tcgatttcgt ttacgtcgtt tacactccac aaggtgcttg tactgctttg 180 gacagagcta tggaaaagtg ttctccaggt accgtcagaa tcgtttctgg tggtcactgt 240 tacgaagact tcgttttcga cgaatgtgtc aaggctatta tcaacgttac tggtttggtt 300 tctgttctta agtacgttca caaggattcc gaaggtaacg acggtgagtt gttttgggct 600 cacactggtg gaggtggagg taacttcggt attatcacca aatactactt caaggatttg 660 ccaatgtctc caagaggtgt catcgcttct aacttacact tctcttggga cggtttcact 720 agagatgcct tgcaagattt gttgactaag tacttcaagt tggctagatg tgattggaag 780 aatactgttg gtaagttcca aatcttccac caagcagctg aagagtttgt tatgtacttg 840 tatacatcct actctaacga cgccgagaga gaagttgccc aagacagaca ctatcatttg 900 gaggctgaca ttgaacagat ctacaaaaca tgcgagccta ccaaagctct tggtggtcat 960 gctggttggg ctcctttccc tgttagacct agaaagagac acacatccaa gacttcttat 1020 10 atgcatgacg agactatgga ctaccctttc tacgctttga ctgagactat caacggttcc 1080 ggtcctaatc agagaggtaa gtacaagtct gcttacatga tcaaggactt tccagacttc 1140 cagattgatg ttatctggaa ataccttact gaggttcctg acggtttgac tagtgccgaa 1200 atgaaggatg ctcttcttca ggttgatatg ttcggtggtg agattcacaa ggttgtttgg 1260 15 gatgctactg cagttgctca gagagagtac atcatcaaac tgcagtacca gacatactgg 1320 caggaagaag acaaggatgc agttaacttg aagtggatta gagactttta cgaggagatg 1380 tatgagcctt atggtggtgt tccagaccct aacactcagg ttgagagtgg taaaggtgtt 1440 tttgagggat gctacttcaa ctaccctgat gttgacttga acaactggaa gaacggtaag 1500 20 tatggtgcct tggaacttta ctttttgggt aacctgaaca gattgatcaa ggccaaatgg 1560 ttgtgggatc ctaacgagat cttcacaaac aaacagtcta tccctactaa acctcttaag 1620 gagcctaagc agactaaata gtag 1644 <210> 23 <211> 546 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial Secuencia de aminoácidos <400> 23 Met Ala Thr Leu Pro Gln Lys Asp Pro Gly Tyr lie Val lie Asp Val 1 5 10 15 Asn Ala Gly Thr Pro Asp Lys Pro Asp Pro Arg Leu Pro Ser Met Lys 20 25 30 Gln Gly Phe Asn Arg Arg Trp lie Gly Thr Asn lie Asp Phe Val Tyr 35 40 45 Val Val Tyr Thr Pro Gln Gly Ala Cys Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met 50 55 60 Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg lie Val Ser Gly Gly His Cys 65 70 75 80 Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys Val Lys Ala lie lie Asn Val 85 90 95 Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Asp Asp Arg Gly Tyr Phe Val 100 105 110 Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp 115 120 125 His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly 130 135 140 Gly His He Val Gly Gly Gly Asp Gly He Leu Ala Arg Leu His Gly 145 150 155 160 Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val Glu Val Val Val Lys Pro Val 165 170 175 Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr Val His Lys Asp Ser Glu Gly 180 185 190 Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn 195 200 205 Phe Gly He He Thr Lys Tyr Tyr Phe Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro 210 215 220 Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys Phe Gln He Phe His Gln Ala 260 265 270 Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala 275 280 285 Glu Arg Glu Val Ala Gln Asp Arg His Tyr His Leu Glu Ala Asp He 290 295 300 Glu Gln He Tyr Lys Thr Cys Glu Pro Thr Lys Ala Leu Gly Gly His 305 310 315 320 Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg Pro Arg Lys Arg His Thr Ser 325 330 335 Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Glu Thr He Asn Gly Ser Gly Pro Asn Gln Arg Gly Lys Tyr 355 360 365 Lys Ser Ala Tyr Met He Lys Asp Phe Pro Asp Phe Gln He Asp Val 370 375 380 He Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu 385 390 395 400 Met Lys Asp Ala Leu Leu Gln Val Asp Met Phe Gly Gly Glu He His 405 410 415 Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val Ala Gln Arg Glu Tyr He He 420 425 430 Lys Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val 435 440 445 Asn Leu Lys Trp He Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr 450 455 460 Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gln Val Glu Ser Gly Lys Gly Val 465 470 475 480 Phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp 485 490 495 Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu 500 505 510 Asn Arg Leu He Lys Ala Lys Trp Leu Trp Asp Pro Asn Glu He Phe 515 520 525 Thr Asn Lys Gln Ser He Pro Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gln 530 535 540 Thr Lys 545

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para liberar una proteína de interés (POI) intracelular soluble o asociada a la membrana a partir de una célula que comprende los pasos de: proveer una célula que comprende una POI intracelular soluble o asociada a la membrana; liberar la POI a partir de una célula mediante poner en contacto la célula con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la POI sea liberada partir de la célula bajo condiciones suficientes para la liberación específica de la POI y en una forma soluble, en donde la POI liberada tiene una actividad específica mayor que cuando ésta ha sido extraída mediante métodos mecánicos.

2.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula es una célula transformada.

3.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2 para liberar una POI a partir de una célula transformada, caracterizado además porque dicha POI es una enzima HOX; dicho método comprendiendo los pasos de: proveer una célula transformada que comprende una enzima HOX; poner en contacto la célula transformada con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la enzima HOX sea liberada a partir de las célula transformada bajo condiciones -¿fl-sfciaf ti j suficientes para la liberación específica de la enzima HOX y en una forma soluble.

4.- Un método para liberar una POI a partir de una célula transformada; en donde dicha POI es un antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1ra) dicho método comprendiendo los pasos de: proveer una célula transformada que comprende una IL-1 ra; poner en contacto las célula transformada con una composición para extracción de membrana; y ocasionar que la IL-1 ra sea liberada a partir de la célula transformada bajo condiciones suficientes para la liberación específica de la IL-1ra y en una forma soluble.

5.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la célula se selecciona a partir del grupo que consiste de células de levadura, células fúngales, y células bacterianas, preferiblemente a partir de células de levadura y células fúngales.

6.- Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la POI intracelular se produce mediante técnicas de ADN recombinante.

7.- Un método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes en donde la composición para extracción de membrana comprende un compuesto de amonio cuaternario.

8.- Un método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el compuesto de amonio cuaternario se selecciona a partir del grupo que consiste de Bromuro á de Lauroil Trimetil Amonio (LTAB), Cloruro de Miristil Trimetil Amonio (MTAC), Cloruro de Cetil Trimetil Amonio (CTAC), Bromuro de Cetil Trimetil Amonio (CTAB), Cetrimida (o Cetrimido en cual comprende una mezcla de bromuros de alcanolamonio, principalmente CTAB), Cloruro de Estearoil Trimetil Amonio (STAC), Bromuro de Estearoil Trimetil Amonio (STAB), Cloruro de Benzalconio (cloruro de alquildimetilbenzilamonio), Bromuro de N-Cetilpiridinio (bromuro de N-Hexadecilpiridinio), Cloruro de N-Cetilpiridinio (cloruro de N-Hexadecilpiridinio), Cloruro de Bencil Dimetil Tetradecil Amonio, y Cloruro de Bencil Dimetil Hexadecil Amonio y una combinación de cualesquiera de uno o más de los mismos.

9.- Un método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la composición para extracción de membrana comprende de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 0.6% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, preferiblemente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 0.5% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, preferiblemente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.45% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, más preferiblemente aproximadamente 0.4% en peso de un compuesto de amonio cuaternario.

10.- Un método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque las célula se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a temperaturas de aproximadamente 4°C a 40°C, preferiblemente de aproximadamente 20°C aproximadamente 30°C, más preferiblemente aproximadamente 25°C. 11.- Un método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque las célula se pone en contacto con la composición para extracción de membrana a un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente

11.0 (más especialmente de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, más especialmente de aproximadamente 6.3).

12.- Un método para seleccionar células modificadas mediante mutación o células transformadas que produce niveles elevados de una POI intracelular soluble o asociada a la membrana que comprende los pasos de: (a) crecer las células modificadas mediante mutación a 30°C; (b) incubar las células modificadas mediante mutación o células transformadas con la composición para extracción de membrana como se definió en la reivindicación 7 o reivindicación 8; (c) recuperar el medio libre de célula; (d) seleccionar el medio libre de célula para niveles elevados de la POI intracelular; de tal manera que la presencia de la POI intracelular en el medio libre de célula es indicativo de que la POI intracelular ha sido liberada.

13.- Una composición para extracción de membrana adecuada para liberar específicamente una POI intracelular soluble o asociada a membrana en donde la composición se pone en contacto con la célula bajo las siguientes condiciones: (a) un porcentaje en peso de compuesto de amonio cuaternario de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 0.6% (más especialmente de aproximadamente 0.1% aproximadamente 0.5%, más especialmente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.45%, más especialmente aproximadamente 0.4%); (b) un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 11.0 (más especialmente de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, más especialmente aproximadamente 6.3); (c) una temperatura de aproximadamente 4°C aproximadamente 40°C, (más especialmente de aproximadamente 20°C aproximadamente 30°C, más especialmente de aproximadamente 25°C); de tal manera que se obtiene la POI intracelular sustancialmente libre de proteínas contaminantes.

14.- El uso de una composición para extracción de membrana que comprende un compuesto de amonio cuaternario para liberar selectivamente una POI intracelular soluble o asociada a la membrana.

15.- Un método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes en donde la POI es una enzima HOX.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la enzima HOX comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 22 o una variante, homólogo, derivado o fragmento de la misma.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 15 o reivindicación 16, caracterizado además porque la enzima HOX se codifica por una secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22 o una variante, homólogo, derivado o fragmento de la misma.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 15 o reivindicación 16 o reivindicación 17, caracterizado además porque la enzima HOX está codificada por una secuencia nucleotídica capaz de hibridar con la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID No 22 o una variante, homólogo, derivado o fragmento de la misma o una secuencia complementaria a la secuencia hibridable.

19.- Una enzima HOX producida por el método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes en donde la enzima HOX está codificada por una secuencia nucleotídica como se define en cualesquiera de la reivindicaciones 16-18 y en donde la secuencia nucleotídicas se sintetiza por los oligonucleótidos como se establece en SEQ ID No 1-11.

20.- La POI de conformidad con la reivindicación 1 o cualesquier reivindicación dependiente de la misma, caracterizada además porque la POI se libera en una forma sustancialmente no glucosilada a partir de un organismo hospedero eucarionte.

21.- Una POI sustancialmente no glucosilada liberada a partir de un organismo hospedero eucarionte.

22.- La POI sustancialmente no glucosilada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque la POI se libera mediante el método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones precedentes.

23.- Un método y una composición sustancialmente como se describe en la presente y con referencia a las figuras anexas.