MXPA02005087A - Mutaciones de intervalo de huesped de virus con membrana y su uso como substratos de vacunas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se dirige a virus cubiertos por membrana, modificados geneticamente con - mutaciones de eliminacion en los dominios transmembranales de proteina. Tambien se proporcionan vacunas virales en base a los virus modificados, metodos para producirlos y uso de las mismas.

Description

MUTACIONES DE INTERVALO DE HUÉSPED DE VIRUS CON MEMBRANA Y SU USO COMO SUBSTRATOS DE VACUNAS ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se relaciona generalmente a la virología y control de enfermedades. Específicamente, la presente invención se relaciona a virus mutados en vectores de artrópodos y sus usos como vacunas. Descripción de la técnica relacionada Los virus en vectores de artrópodos (Arbovirus) son agentes virales los cuales se transmiten en la naturaleza por insectos que succionan la sangre. Muchos de estos virus tienen bicapas de membrana con proteínas de membrana integrales asociadas las cuales forman la cubierta protectora de la partícula de virus (Togavirus) (Schlesinger, S. and M.J. Schlesinger, 1990). Colectivamente, los virus en vectores de artrópodos son secundarios solamente para la malaria como una fuente de enfermedad transmitida por virus y muerte en el hombre y los animales en todo el mundo (Berge A. 0. 1975) . Entre estos agentes virales están los virus de encefalitis equina Oriental, Occidental y Venezolana, fiebre del dengue, Encefalatis japonesa, Fiebre San Angelo, Fiebre del Nilo occidental, y fiebre amarilla. Además, las enfermedades REF: 139490 _-_&_£-£! provocadas por estos agentes están resurgiendo en Norteamérica (NIAID Report of the Task Forcé on Microbiology and Infectious Diseases 1992, NIH Publication No. 92-3320) como un resultado de la introducción del vector de mosquito Aedes ALbopictus en (Sprenger, and Wuithiranyagool 1985) . Por su naturaleza, los Arbovirus deben ser capaces de replicarse en los tejidos de tanto insectos invertebrados y el huésped mamífero (Brown, D.T., and L. Condreay, 1986, Bower et al. 1995) . Las diferencias en el ambiente genético y bioquímico de estos dos sistemas celulares del huésped proporcionan una base para la producción de virus los cuales pueden replicarse en un huésped pero no en otro (Mutantes de intervalo de huésped) . Actualmente, la Fiebre del Dengue y la Encefalitis equina Oriental y otros virus transportados en insectos están resurgiendo en los Estados Unidos. La armada de los Estados Unidos y otras agencias gubernamentales han estado tratando de hacer vacunas contra estos virus desde 1960 con poco éxito. De esta forma, la técnica anterior es deficiente en una vacuna contra la mayoría de los virus en vectores de artrópodos y otros virus recubiertos con membrana. La presente invención llena está necesidad y deseo en la técnica de hace mucho.

U SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad de la presente invención, se proporciona un virus cubierto por membrana, modificado genéticamente, en donde el virus codifica una proteína transmembranal la cual tiene una eliminación de uno o más aminoácidos de tal forma que la proteína transmembranal es capaz de expandirse o integrarse correctamente en la membrana viral cuando el virus modificado se replica en las células de insectos, pero es incapaz de expandirse o integrarse correctamente en la membrana viral cuando el virus se replica en las células de mamíferos. Preferentemente, el virus es un virus en vector de artrópodo seleccionado del grupo que consiste de Togavirus, Flavivirus, Virus de Bunya y todos los otros virus cubiertos los cuales pueden replicarse naturalmente en tanto células de mamíferos e insectos, así como también otros virus cubiertos los cuales pueden hacerse para replicarse en células de mamíferos e insectos por modificación genética de cualquiera el virus o la célula. Los ejemplos representativos de tales virus modificados son los virus ?K391 y virus TM16. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir una vacuna viral a partir de un virus cubierto por membrana, modificado genéticamente para vacunación de mamíferos, el cual comprende las etapas de producir eliminaciones en los dominios asociados con la membrana del virus las cuales restringen su capacidad de crecimiento en células de insectos, introducir el virus modificado descrito en la presente en las células de insectos y permitir que se replique el virus en las células de insectos para producir una vacuna viral. Los ejemplos representativos de los virus modificados son el virus ?K391 y virus TM16. En todavía otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para vacunar un individuo en necesidad de tal tratamiento el cual comprende la etapa de introducir la vacuna viral de la presente invención en el individuo para producir proteínas virales para vigilancia inmune y estimular el sistema inmune para producción de anticuerpos. En todavía otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir una vacuna viral a partir de un virus cubierto por membrana, modificado genéticamente para una enfermedad esparcida por una población de mosquitos silvestres a mamíferos, el cual comprende las etapas de modificar una eliminación de uno o más aminoácidos en una proteína transmembranal viral para producir un virus modificado, similar a TMlß o delta K391, en donde la proteína transmembranal es capaz de expandir la cubierta ! - membranal cuando el virus se replica en las células del mosquito, pero es incapaz de expandir la cubierta membranal cuando el virus se replica en las células de mamíferos, y en donde el virus permanece capaz de replicarse en células de mosquito silvestre; introducir el virus modificado en la población de mosquitos silvestres; y permitir al virus modificado replicarse en las células de la población del mosquito silvestre para producir una población de mosquitos los cuales alojan la cepa de vacuna del virus y excluir el virus del tipo silvestre (patogénico) de tal forma que la picadura del mosquito suministra la vacuna al mamífero picado. La presencia del virus mutado lleva al mosquito a ser incapaz de transmitir otros virus que contienen membrana (Karpf et al 1997) . Otros aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción de una de las modalidades actualmente preferidas de la invención. Se dan estas modalidades para el propósito de descripción. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Se han incluido en la presente los dibujos anexos de tal forma que las características, ventajas y objetos recitados anteriormente de la invención llegarán a ser claros y pueden ser entendidos en detalle. Estos dibujos forman una parte de la especificación. Se indica, sin embargo, que los dibujos anexos ilustran modalidades preferidas de la invención y no pueden ser considerados para limitar el alcance de la invención. La Figura 1 muestra los resultados de proteínas del virus Sindbis radioetiquetadas recuperadas a partir de células cultivadas en tejidos transfectados. Las células BHK-21 transfectadas de prueba (1), transfectadas con ARN de ?K391 mutante (2), y células de Aedes albopictus transfectadas con ARN de ?K391 (3) , se etiquetan con aminoácidos radioactivos como se describe en el Ejemplo 3. En 24 horas post producción, se precipitan las proteínas con antisuero específico al virus como se describe en el Ejemplo 4. La Figura muestra que tanto las células BHK-21 y las células de Aedes albopictus transfectadas con ARN del mutante de eliminación producen las tres proteínas estructurales virales El, E2 y C las cuales no se detectan en las células transfectadas de prueba. Las Figuras 2A y 2B son micrografías de electrones de las células BHK-21 (2A) y las células de Aedes albopictus (2B) transfectadas con el ARN del mutante ?391 de eliminación del virus Sindbis. Se transfectan las células como se describe en el Ejemplo 2. Las células BHK-21 (Figura 2A) muestran los glomérulos de estructuras de núcleo de virus ! en el citoplasma celular (A) a pesar de que estas células producen niveles muy bajos de virus maduro (Tabla 1) . Las células de Aedes albopictus (Figura 2B) también producen glomérulos de núcleos de virus; sin embargo, se descubren estos núcleos libres en el citoplasma celular similar a aquellos en las células BHK-21 (A) y también se encuentran asociados con las membranas celulares (B) . Este último caso no se encuentra en las células BHK-21, lo cual indica que las glicoproteínas El y El, aunque presentes, no funcionan para enlazarlas. La Figura 3 muestra la configuración de las glicoproteínas del virus Sindbis después de la integración en el ER. La proteína es una proteína de multipaso con 6 dominios de expansión de membrana (numerados 1-6). 1. La secuencia de señal para la integración inicial; 2. El primer dominio transmembranal E2 (TMD); 3. El segundo TMD E2; 4. El primer TMD 6k; 5. El segundo TMD 6k; y 6. El TMD El. S=punto de escisión por la peptidasa de señal. La Figura 4 muestra los aminoácidos eliminados en el dominio transmembranal E2. Se muestra la secuencia eliminada bajo el aminoácido apropiado, en el intervalo de 1 a 16 eliminaciones. Las secuencias de histidina y prolina que inician en nt 9717 están el lado lumenal de la proteína pero se usan para diseñar los cebadores mutagénicos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Será aparente para un experto en la técnica que varias substituciones y modificaciones pueden ser hechas a la invención descrita en la presente sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. Como se usa en la presente, el término "virus de membrana enlazada" se refiere a un virus el cual contiene una bicapa membranal lipídica como parte de su recubíerta exterior protectora. Como se usa en la presente el término "cubierta viral" se refiere al componente membranal lipídico del virus que contiene la membrana y sus proteínas asociadas. Como se usa en la presente, los términos "virus en vectores de artrópodos" o "Arbovirus" se refiere a agentes virales los cuales se replican y producen virus de progenie en células de artrópodos (insectos) o mamíferos. Esto incluye Togavirus, Flavivirus y Bunyavirus. Como se usa en la presente, el término "Togavirus" se refiere a una clasificación general de los virus que contienen membrana los cuales incluyen los Alfavirus. Como se usa en la presente, el término "bicapa membranal" se refiere a una estructura que consiste de fosfolípidos anfifáticos opuestos. La bicapa se organiza en sección transversal a partir de grupos de cabeza polar a 4 * J cadenas de carbono no polar a cadenas de carbono no polar a grupos de cabeza polar. Como se usa en la presente, el término "región transmembranal de glicoproteína" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la región de una proteína integrada en membrana la cual expande la bicapa membranal. Como se usa en la presente, el término "vacuna viral" se refiere a una cepa de virus o mutante de virus la cual tiene las propiedades antigénicas del virus pero no puede producir enfermedad. Como se usa en la presente el término "vigilancia inmune" se refiere a un proceso por el cual los linfocitos sanguíneos inspeccionan las células y tejidos de un mamífero para determinar la presencia de proteínas extrañas (virus) y estimula la producción de linfocitos capaces de objetivar células las cuales producen la proteína extraña para destrucción. Este proceso también lleva a la producción de anticuerpos circulantes contra la proteína extraña. Como se usa en la presente, el término "partículas virales infecciosas" se refiere a virus los cuales son capaces de entrar a una célula y producir proteína viral, ya sea que son capaces o no de producir progenie viral. Como se usa en la presente, el término "partículas virales no infecciosas" se refiere a los virus los cuales no son capaces de infectar o entrar a una célula. Como se usa en la presente, el término "células vertebradas" se refiere a cualquier célula de mamífero. Como se usa en la presente, el término "células de invertebrados" se refiere a cualquier célula de insecto. De acuerdo con la presente invención pueden ser empleadas técnicas de ADN recombinantes, biología molecular, microbiología convencional dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la literatura. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: a Practical Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. (1986)); "Im obilized Cells And Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984) . Por lo tanto, si aparecen en la presente, los siguientes términos deben tener las definiciones indicadas posteriormente. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual puede ser unido otro segmento de ADN *1 - para así llevar aproximadamente la replicación del segmento unido. Un vector es para ser "aceptable farmacéuticamente" si su administración puede ser tolerada por un animal receptor. Tal agente es para ser administrado en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si la cantidad administrada es significativa fisiológicamente. Un agente es significativo fisiológicamente si su presencia resulta en un cambio en la fisiología de un mamífero receptor. Por ejemplo, en el tratamiento de la infección viral, un compuesto el cual disminuye el grado de infección o de daño fisiológico debido a la infección, puede ser considerado terapéuticamente efectivo. Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de los deoxirribunucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) en tanto forma de cadena sencilla, o una hélice de doble cadena. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. De esta forma, este término incluye el ADN de doble cadena encontrado, inter alia, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos, y cromosomas. Se discute la estructura en la presente de acuerdo a la convención normal de dar solamente la secuencia en la dirección 5 ' a 3 ' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena tiene una secuencia homologa al ARNm) . La "secuencia de codificación" del ADN es una secuencia de ADN de doble cadena la cual se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en la terminal 5' (amino) y el codón de detención de traducción en la terminal 3' (carboxilo) . Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, las secuencias procarióticas, ADNc a partir de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por ejemplo mamífero), e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción será ubicada usualmente 3' a la secuencia de codificación. Las secuencias de control transcripcional y de traducción son secuencias regulatorias de ADN, tales como promotores, incrementadores, señales de poliadenilación, terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula huésped. Una "secuencia promotora" es una región regulatoria de ADN capaz de enlazar la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3'). Para propósitos de definición -íílfíí de la presente invención, se enlaza la secuencia promotora en su terminal 3' por el sitio de inicio de transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios la transcripción en niveles detectables arriba del antecedente. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de transcripción (definido convenientemente por mapear con la nucleasa SI), así como también los dominios de enlace de proteína (secuencias de consenso) responsables para el enlace de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre, contendrán cajas "TATA" y cajas "CAT". Pueden ser usados varios promotores para accionar los vectores. El término "oligonucleótido" o "sonda" como se usa en la presente, se refiere a una molécula comprendida de ribonucleótidos o deoxirribonucleótidos. El tamaño exacto del oligonucleótido o sonda dependerá de muchos factores los cuales, a su vez, dependen de la última función y uso del oligonucleótido. La longitud de la sonda no es crítica, pero usualmente comprenderá por lo menos aproximadamente 12 bases, más usualmente comprenderá por lo menos aproximadamente 16 bases, y la sonda es substancialmente complementaria a una porción del genoma bacteriano; sin embargo, la sonda no necesita tener complementaridad perfecta con el genoma. Las sondas pueden ser preparadas sintéticamente, con técnicas sintéticas adecuadas, y más probablemente incluyen una etiqueta detectable. Usualmente, las secuencias sintéticas son expandidas en vectores de clonación disponibles públicamente, comunes y huéspedes adecuados con el fin de obtener grandes cantidades de la sonda. Los vectores expandidos pueden por si mismos ser etiquetados para uso como sondas, o los fragmentos más cortos que contienen cadenas complementarias pueden ser escindidos y etiquetados. Los métodos para la preparación y utilización de sondas de nucleótidos para prueba de diagnóstico se describen en las referencias enlistadas anteriormente, supra, y en la Patente de los Estados Unidos No. 4,358,535 para Falkow, et al. El término "cebador" como se usa en la presente se refiere a un oligonucleótido, ya sea que se encuentre en forma natural como en una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión de cebador, la cual es complementaria a una cadena de ácido nucleico, se induce, es decir, en la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como una ADN polimerasa y una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser tanto de cadena sencilla o doble cadena y debe ser - •íJ suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseada en la presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, los cuales incluyen temperatura, la fuente del cebador y el método usado. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el cebador de oligonucleótido contiene típicamente 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener pocos nucleótidos. Los cebadores de la presente se seleccionan para ser "substancialmente" complementarios para diferentes cadenas de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridizar con sus cadenas respectivas. Por lo tanto, la secuencia de cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del templado. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede ser unido al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia de cebador que es complementario a la cadena. Alternativamente, las bases no complementarias o secuencias más largas pueden ser interesparcidas en el cebador, con la condición de que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia o hibridizar con la misma y por lo mismo formar el templado para la síntesis del producto de extensión. Como se usa en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a las enzimas bacterianas, cada una de las cuales cortan ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia específica de nucleótidos. Una célula ha sido "transfectada" por ADN exógeno o heterólogo cuando tal ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN de transfección puede o no puede ser integrado (enlazado covalentemente) en el genoma de la célula. Un "clon" es una población de células derivadas de una célula individual o un ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro para muchas generaciones. Una región "heteróloga" de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. De esta forma, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen será usualmente flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, la secuencia de codificación es una construcción donde la misma secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia de codificación genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes al gen nativo) .

La presente invención se dirige a un virus cubierto por membrana, modificado genéticamente, en donde el virus codifica una proteína transmembranal la cual tiene una eliminación de uno o más aminoácidos en la región transmembranal de la proteína de tal forma que la proteína transmembral es capaz de expandirse o integrarse correctamente en la membrana de una célula infectada cuando el virus modificado se replica en las células de insectos, pero es incapaz de expandirse o integrase en la membrana de una célula infectada cuando el virus se replica en células de mamíferos. Preferentemente, el virus es un virus en vector de artrópodos seleccionado del grupo que consiste de Togavirus, Flavivirus, Virus de Bunya y todos los virus cubiertos que pueden replicarse naturalmente en tanto células de mamíferos e insectos, así como también virus cubiertos que pueden ser hechos para replicarse en células de mamíferos e insectos por modificación genética de tanto los virus o de la célula. Ejemplos representativos de tales virus modificados son los virus ?K391 y virus TM16. Todavía preferentemente, las células de insectos son células de mosquito, tales como células de Aedes albopictus, y las células de mamíferos son células humanas. En una modalidad preferida, el virus cubierto por membrana, modificado genéticamente es el virus Sindbis, y la proteína transmembranal es la glicoproteína E2 viral. Sin embargo, una persona que tiene experiencia ordinaria en esta técnica puede predecir fácilmente que pueden ser instaladas exitosamente mutaciones similares en los dominios de expansión de membrana de otras proteínas membranales de ví-rus tales como El. En otra modalidad preferida, el virus cubierto por membrana, modificado genéticamente se selecciona del grupo que consiste de HSV, VIH, virus de conejo, hepatitis y virus respiratorio, y la proteína transmembranal se selecciona del grupo que consiste de la glicoproteína El, la glicoproteína E2, y la proteína G. En todavía otra modalidad preferida, el virus cubierto por membrana, modificado genéticamente son los virus de tumor de ARN, y la proteína transmembranal es Env. La presente invención también se refiere a un método para producir una vacuna viral a partir de un virus cubierto por membrana, modificado genéticamente descrito en la presente para la vacunación de mamíferos, el cual comprende las etapas de introducir el virus modificado en células de insectos y permitir al virus replicarse en las células de insectos para producir una vacuna viral. Los ejemplos representativos de los virus modificados son el virus ?K391 y virus TM16.

Además, la presente invención proporciona un método de vacunación de un individuo en necesidad de tal tratamiento, el cual comprende las etapas de introducir la vacuna viral de la presente invención en el individuo y permitir a la vacuna producir proteínas virales para vigilancia inmune y estimular el sistema inmune para la producción de anticuerpos en el individuo. Además, la presente invención proporciona un método para producir una vacuna viral para una enfermedad esparcida por una población de mosquitos silvestres a un mamífero, el cual comprende las etapas de modificar genéticamente una eliminación de uno o más aminoácidos en una proteína transmembranal viral para producir un virus modificado, en donde la proteína transmembranal es capaz de expandir la cubierta membranal cuando el virus se replica en células de mosquito, pero es incapaz de expandir la cubierta membranal cuando el virus se replica en células de mamíferos, y en donde el virus permanece capaz de replicarse en células de mosquito; introducir el virus modificado en una población de mosquitos silvestres; y permitir al virus replicarse en células de la población de mosquitos silvestres para producir una población de mosquitos la cual aloja la cepa de vacuna del virus y excluye el virus tipo silvestre (patogénico) de tal forma que la picadura de mosquito suministra la vacuna a un mamífero picado. Se contempla que las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas usando los virus mutados novedosos de la presente invención. En tal caso, la composición farmacéutica comprende el virus novedoso de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Una persona que tiene experiencia ordinaria en esta técnica puede fácilmente ser capaz de determinar, sin experimentación indebida, las dosis apropiadas y rutas de administración de este compuesto de vacunación viral. Cuando se usa in vivo para terapia, la vacuna de la presente invención se administra al paciente o un animal en cantidades terapéuticamente efectivas, es decir, cantidades que inmunizan al individuo que se trata de la enfermedad asociada con el virus particular. Normalmente se administrará parentalmente, preferentemente intravenosa o subcutáneamente, pero serán usadas otras rutas de administración como sea apropiado. La cantidad de la vacuna administrada estará típicamente en el intervalo de aproximadamente 10 aproximadamente 106 pfu/kg de peso del paciente. El programa continuará para optimizar la eficacia mientras equilibra los efectos negativos del tratamiento. Véase Remington's Pharmaceutical Science, 17a edición (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; y Goodman and Gilman's: The --** Pharmacological Basis of Therapeutics 8a edición (1990) Pergamon Press; las cuales se incorporan en la presente para referencia. Para administración parental, la vacuna será formulada típicamente en una forma inyectable de dosis de unidad (solución, suspensión, emulsión) en asociación con un vehículo parental farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos son preferentemente no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. Las vacunas de la presente invención se basan en mutaciones de eliminación en los dominios transmembranales de proteínas de virus cubiertos por membranas. La estrategia para la producción de estas mutaciones se basa en la siguiente información: a diferencia de las membranas celulares de mamíferos, las membranas de células de insectos no contienen colesterol (Clayton 1964, Mitsuhashi et al 1983) . La presencia del colesterol en las membranas en general hace a la membrana más gruesa, con el incremento en espesor que se incrementa en cuanto la cantidad del colesterol se incrementa (Bretscher, 1993) . Muchos virus recubiertos con membrana tienen glicoproteínas membranales en su superficie las cuales son responsables para identificar e infectar células objetivo (Schlesinger, S. and M.J.

Schlesinger, 1990) . Estas glicoproteínas membranales tienen dominios de expansión de membrana hidrofóbicos los cuales anclan las proteínas en la bicapa membranal (Rice et al 1982) . Los dominios de expansión de membrana de estas proteínas transmembranales deben ser suficientemente largas para alcanzar un lado de la bicapa a la otra con el fin de mantener o anclar las proteínas en las membranas. Los experimentos han mostrado que si los dominios se acortan por la eliminación de los aminoácidos dentro del dominio, las proteínas no se asocian apropiadamente con la membrana y fallan (Adams and Rose 1985) . Ya que los insectos no tienen colesterol en sus membranas, la membrana viral generada por insectos será más delgada en sección transversal que las membranas virales generadas a partir de mamíferos. Ya que las membranas de insectos son más delgadas, no necesitan estar los dominios de expansión de membrana de las proteínas integradas en membranas de insectos mientras estén integrados en las membranas de mamíferos. Es posible, por lo tanto, producir eliminaciones en virus modificados las cuales eliminan aminoácidos a partir del dominio transmembranal de la glicoproteína viral. Esto resulta en una glicoproteína la cual puede integrarse normalmente en la membrana de un virus ..¿¿i^-a-i en replicación en una célula de insecto, pero no en la membrana de un virus en replicación en un mamífero. De esta forma, se produce el virus mutado en la replicación de la célula de insecto así como también el virus progenitor del tipo silvestre en el huésped de insecto. Por otra parte, en los mamíferos, el virus mutante puede infectar el huésped el cual produce las proteínas virales; sin embargo ya que la glicoproteína del virus mutado no puede expandirse y ser anclada en la membrana de mamífero, el virus de progenie no puede ser producido en las células de mamífero. Un ejemplo de tal virus es TM16. Una ventaja adicional para el procedimiento de la presente invención es que los mutantes se modifican como mutantes de eliminación, por lo tanto no hay absolutamente oportunidad para reversión al fenotipo del tipo silvestre, un problema común con las vacunas virales. Las vacunas comprendidas por la presente invención trabajan para cualesquiera virus cubiertos por membrana los cuales crecen en células de vertebrados e invertebrados. En efecto, la presente invención es aplicable para virus cubiertos por membranas los cuales pueden ser tanto modificados para crecer en una célula de insecto, o a virus cubiertos por membranas los cuales crecen en células de insectos modificados genéticamente. Se dan los siguientes ejemplos para el propósito de ilustrar varias modalidades de la invención y no se proponen para limitar la presente invención en ninguna forma. EJEMPLO 1 Mutagénesis dirigida a sitio del Toto 1101 Usando el clon de longitud total del virus Sindbis Alfa descrito previamente (Liu et al 1996, Rice et al., 1987), se ha construido una eliminación que elimina 3 bases que codifican una lisina en la posición 391 en la secuencia de aminoácidos de la glicoproteína E2 viral. Esta lisina es parte del dominio de expansión de membrana putativo de esta proteína (Rice et al 1982) . Se usa la mutagénesis dirigida a sitio para generar un mutante de eliminación (Lys391) en Toto 1101, un plásmido que contiene ADNc de Sindbis de longitud completa y un promotor SP6 que puede ser usado para transcribir ARN infeccioso a partir del clon in vitro (Rice et al., 1987 Liu and Brown, 1993a) . Usando el método de megacebador de mutagénesis de PCR (Sarkar and Sommer, 1990) descrito previamente (Liu and Brown, 1993a) , se eliminan tres nucleótidos en el clon de ADNc de Toto 1101, nucleótidos (nts) 9801, 9802, 9803, lo cual resulta en la eliminación del codón AAA (K391) . Se usa un oligonucleótido de 30 bases de la secuencia, 5'CTCACGGCGCGCACAGGCACATAACACTGC3' (SEQ ID NO. 1) como el promotor de mutagénesis. Este cebador, junto con el "cebador hacia delante" 5'CCATCAAGCAGTGCGTCG3' (SEQ ID NO.: 2; 18mer) , genera un "megacebador" de 518 bases (nucleótidos 9295-9813). La segunda reacción de PCR consiste de 0.5 µg del megacebador, 100 µg del templado Toto 1101 y 0.5 µg del "cebador inverso" 5 'GGCAGTGTGCACCTTAATCGCCTGC 3' (SEQ ID NO: 3) . Todas las reacciones PCR emplean 30 ciclos en 95 grados por 1 minuto, 64 grados por 1 minuto, 72 grados por 1 minuto y una incubación final en 72 grados por 8 minutos. El producto de la PCR resultante (1149 nts) se escinde con BCL I y SPL y se inserta en el sitio correspondiente en Toto 1101, lo cual crea el mutante de eliminación K391. Después de que la eliminación se confirma por la secuencia de dideoxinucleótidos a través de la región subclonada total usando Sequenase TM (U. Biochemical, Cleveland, OH) , se transcribe el ARN infeccioso in vitro usando la SP€ polimerasa y se introduce en las células BHK-21. EJEMPLO 2 Transcripción in vitro y transfección de ARN Se lineariza el ADN de plásmido que contiene la copia de ADNc de longitud completa del virus Sindbis K391 o ARN del tipo silvestre con Xhol y se transcribe in vitro con la SP6 ARN polimerasa como se describe previamente (Rice et al., 1987). Se transcribe 1 µg de ADNc de K391 linearizado con Xho I o ADNc del virus Sindbis del tipo silvestre en amortiguador que consiste de 80 mM de Hepes pH 7.5, 12 mM de MgCl, 10 mM de DTT y 2 mM de espermidina y 100 µgm de BSA con 3 mM de cada ATP, UTP, CTP, 1.5 mM de GTP y 4.5 mM de m7 GpppG, 20 unidades de SP6 ARN polimerasa y 20 unidades de inhibidor de ARNasa en un volumen de reacción de 20 µl. Después de la incubación en 37 °C por 2 horas, se ensaya la producción del ARN por corrida de 2 µl del producto de ARN en un gel de agarosa al 1%. Las células de riñon de Hámster bebe (BHK21) y las células de Aedes albopictus (mosquito) se transfectan con ARN derivado a partir del mutante o clon del tipo silvestre. Las transfecciones de células de mosquito se realizan usando 5xl06 células resuspendidas en amortiguador de electroporación libre de ARNasa que consiste de 20 mM Hepes pH 7.05, 137 mM de NaCl, 0.7 mM de Na2HP04 y 6 mM de dextrano. Se vuelven a suspender las células lavadas en agua (HBS) tratada con pirocarbonato de dietilo (depc) a una concentración de 5 x 107 células/ml. Se agregan las transcripciones de ARN en 20 µl a 400 µl de células lavadas y se transfieren a una cubeta de longitud de espacio de 0.2 cm. Los parámetros de electroporación óptima para estas células se encuentran para ser 2 KV 25 µF, resistencia 8. Se incuban las células transfectadas en 37 °C hasta que se observa el efecto citopático (aproximadamente 24 horas) . Después de 24 horas de incubación, se recolecta el medio a partir de tanto líneas celulares infectadas así como también controles transfectados sin ARN. El medio a partir de cada línea celular se prueba para la presencia de virus infeccioso por ensayo de placa (como se describe por Renz and Brown 1976) en monocapas celulares de mosquito y BHK-21 (Tabla 1) . TABLA 1 Virus infeccioso producido por tranßfeccion de células de BHK21 o Aedes albopictus (AA) con virus Sindbis tipo silvestre (wt) o K391 mutante de prueba indica que el protocolo de transfección se realiza sin ARN Como se muestra en la Tabla 1, K391 mutante produce cantidades significativas de partículas infecciosas virales solamente cuando se replican en la célula de insecto. Las células BHK transfectadas con K391 producen niveles muy bajos de virus, 4 a 5 órdenes de magnitud inferior que la cantidad producida en células de insectos. EJEMPLO 3 Etiquetado radioactivo metabólico de proteínas virales Se transfectan las monocapas subconfluentes de células BHK21 en matraces de 25 cm2 con ARN del tipo silvestre o mutante K391 como se describe anteriormente. Se someten a inanición las monocapas por 30 minutos en medio libre de metionina y cisteína (MEM-E) que contiene FCS al 1%, 2 M de glutamina y 5% de TPB (medio de inanición) . En 16 horas post transfección, se etiquetan por impulso las células con medio de inanición que contiene mezcla de etiquetado de proteína 50 µCi/ml [35S] Met/Cys por 20 minutos. Se termina el etiquetado por lavar las monocapas con PBS que contiene 75 µg/ml de cicloheximida. Se agregan las capas por 45 minutos en medio que contiene 10 veces la concentración normal de metionina y cisteína y 75 µg/ml de cicloheximida . | - .»--- '-- i-Ü-í-i -•-- ¿ -. fl--j--fa, ¿¡»|?g^¿j^¡ EJEMPLO 4 Inmunoprecipitación y electrofóresis de gel de polaicrilamida Se inmunoprecipitan las proteínas virales radioetiquetadas con antisuero como se describe en (Knipfer and Brown, 1989) . Se lavan las células etiquetadas con [3SS] Met/Cys dos veces en PBS frío y se lisan en amortiguador de lisis: 0.5% de NP-40, 0.02 M de Tris HCl pH 7.4, 0.05 M de NaCl, 0.2 mM de PMSF, 0.2 mM de TPCK y 0.02 mM de TLC. Se granulan los núcleos por centrifugación y se descargan. Se preabsorbe el sobrenadante con 100 µl de perlas de proteína A/Sepharose (Sigma) suspendidas en amortiguador de lisis por 1 hora, y se granulan las perlas. Se trata el sobrenadante preabsorbido con 200 µl de perlas de proteína A/Sepharose acopladas a suero anti-SVHR de conejo o suero policlonal monoespecífico de cola E2 y se agita durante la noche en 4°C. Se lavan tres veces los complejos de perla anticuerpo proteína inmunoprecipitados con amortiguador de lisis y después se solubilizan en amortiguador de muestra SDS-PAGE que consiste de 12% de glicerol, 4% de SDS, 50 mM de Tris pH 6.8, 5% de mercaptoetanol y 0.02% de azul de bromofenol. Se calientan las muestras por 3 minutos en 95°C y se eliminan las perlas a partir de la muestra por centrifugación. Se realiza la electrofóresis en gel en un gel SDS-PAGE al 10.8% o Tricina al 16% como se describe previamente (Liu and Brown, 1993 a.b) . Se realiza la fluorografía como se describe (Bonner and Laskey, 1974) y se exponen los geles secos a la película Kodak XAR-5 (véase la Figura 1) . EJEMPLO 5 Microscopía de electrones de transmisión Las monocapas celulares de BHK-21 infectadas con K391 producidas a partir de células transfectadas de mosquito o transfectas con ARN de K391 se recogen de matraces por tratamiento de tripsina en puntos de tiempo deseados, y se granulan las células por centrifugación de baja velocidad. Se lavan los granulos celulares dos veces en PBS y se fijan en 4% de glutaraldehído en 4°C durante la noche. Se lavan entonces las células tres veces con amortiguador de cacodilato 0.2 M (pH 7.2), post fijados con tetróxido de osmio al 2% por 1 hora en temperatura ambiente, y se lavan tres veces en amortiguador de cacodilato. Se tiñen las células en bloc por 1 hora en temperatura ambiente con 0.5% de acetato de uranilo. Después de tres lavados, se embeben los granulos celulares en 1% de agarosa y se deshidratan a través de una serie de etanol/acetona graduada. El embebido final es en una mezcla epoxi de Epon-Araldita (1964) de Mollenhauer #1 en 70°C por dos días. Se cortan las secciones ultradelgadas en un microtomo Sorvall MT5000 y se recolectan en rejillas de cobre de malla 150. Se tiñen las secciones con . - 1% de acetato de uranilo y/o citrado de plomo y se fotografían en un microscopio de electrones de transmisión Jeol 100CX (véase la Figura 2). Aunque las células BHK infectadas con el virus K391 o transfectadas con el ARN de K391 no producen virus detectable por el ensayo de placa, se muestra por PAGE que no producen todas las proteínas estructurales virales (Figura 1) . Además, se muestra por microscopia de electrones que ensamblan los núcleos virales intracelulares (no infecciosos) (Figura 2) . EJEMPLO 6 Usos para la mutante K391 de eliminación de Sindbis y mutaciones similares producidas en otros Togavirus Delta K391 produce títulos muy altos de partículas de virus de Sindbis mutante cuando se permite replicar en células de mosquito. Las regiones expuestas de las proteínas (dominios ecto) son del tipo silvestre en secuencia. Estas proteínas del tipo silvestre permiten al virus entrar a las células de mamíferos y producen proteínas virales (véase la Figura 1) pero no se ensambla el nuevo virus como se muestra por microscopia de electrones en la Figura 2. Delta K391 es una cepa de vacuna. Se produce en una concentración muy alta en células de insectos cultivados. Sin embargo, cuando se inyecta el virus en un huésped de mamífero, el virus circula e infecta las células en un huésped de mamífero, estas células infectadas producen y presentan proteínas virales para vigilancia inmune, pero, debido al truncamiento en el dominio membranal, la infección será limitada principalmente a aquellas células infectadas inicialmente por el inoculo. Ya que la cepa de vacuna es el resultado de una mutación de eliminación, no es posible la reversión al fenotipo patogénico del tipo silvestre. Además, un mutante de eliminación modificado puede ser introducido en la poblción de mosquitos silvestres. Se ha mostrado que estos virus se dispersan a partir del progenitor femenino a la progenie por un proceso de transmisión transovárico (Leakey 1984) . Cuando estos mosquitos pican un vertebrado proporcionarán una dosis de inmunización (106 partículas infecciosas) de la cepa de vacuna (por ejemplo, Delta K391) . Karpf et al (1997) muestran que la infección de las células de insectos por un virus Alfa evita a las células ser infectadas por otra, incluso virus alfa distantemente relacionados por una cantidad indefinida de tiempo (sobre dos años en cultivo celular, donde la vida del mosquito es de 28 días) . De esta forma, la presencia de la cepa de vacuna (por ejemplo Delta K391 Sindbis o TM16) bloqueará el esparcimiento de virus patogénicos y otros relacionados por estos insectos.

EJEMPLO 7 Mutaciones de eliminación adicionales Se preparan las mutaciones de eliminación adicionales en el dominio de expansión membranal de la glicoproteína E2 del virus Sindbis. Se describe posteriormente el protocolo para la producción de estas mutaciones de eliminación. Se describe el procedimiento para el modelo del virus Sindbis que contiene la membrana, sin embargo, el procedimiento puede ser aplicado fácilmente a cualquier otra glicoproteína membranal del virus. Las glicoproteínas de cubierta del virus Sindbis se integran en las membranas del retículo endoplasmático como una proteína de multipaso con 6 dominios de expansión de membrana. Estos son, por lo tanto, 6 objetivos potenciales para la producción de mutaciones de eliminación que evitarán la integración correcta de un dominio transmembranal (TMD) (Véase la Figura 3) . Algunos de estos objetivos son menos satisfactorios para este procedimiento que otros. TMD #1 (Figura 3) es la secuencia de señal la cual se reconoce por la partícula de reconocimiento de señal y dirige la síntesis de proteína a las membranas del ER. Truncar este dominio puede perturbar similarmente el objetivar tanto en células de mamífero e insectos. TMD #3 contiene la secuencia de proteína de E2 la lili ¡Éi i ??i?ííi?i-?i?-ii?i? mi iniiiiii i cual reconoce y enlaza la proteína de la cápside. Se ha mostrado que esta interacción es muy específica en la naturaleza y requiere la secuencia que está en el dominio transmembranal (Liu et al., 1996; López et al., 1994). TMD #3, por lo tanto, como TMD #1 tiene un componente funcional así como también estructural. Una eliminación significativa en este dominio puede similarmente eliminar brotes en ambos sistemas celulares. Esto deja cuatro dominios transmembranales los cuales son objetivos para la producción de eliminaciones lo cual efectuará la integración membranal (Figura 3, TMD #2, #4, #5, y #6). La proteína 6k no es un componente del virus maduro y su función en el ensamble del virus no es claro. En la poli proteína la integración y orientación apropiada de 6k en la membrana ER es esencial para la integración correcta de El. Los dominios transmembranales de 6 k (TMD #4 y #5) son objetivos excelentes para mutación de eliminación ya que la falla para integrar uno de estos dominios puede provocar que la poliproteína se integre en la membrana en una configuración errónea o provocar la falla para integrar El. TMD #2 y #6 son los dominios de expansión membranal de E2 y El y son tanto objetivos obvios para la mutación de eliminación. Los dominios de expansión de membrana múltiple en esta poli proteína sugieren que si las mutaciones de eliminación en un dominio sencillo transmebranal no bloquean totalmente la producción del virus en células de mamíferos, entonces las eliminaciones en dominios de expansión membranal adicionales pueden además reducir la maduración a niveles 5 insignificantes. EJEMPLO 8 Diseño de cebadores mutagénicos para anclar la membrana hidrofobica E2 (TMD#2) Se dan los protocolos para probar los requerimientos colocados en el dominio transmbembranal de E2 (Figura 3, TMD #2) . Este protocolo puede ser replicado fácilmente por cualquier otro de los dominios de expansión membranal de Sindbis o los dominios de expansión membranal de cualquier otra glicoproteína de virus. Como es común con otros dominios de expansión de membrana se conserva poca homología de aminoácidos entre los alfavirus, aunque la longitud de esta región hidrofóbica está altamente conservada (Strauss y Strauss, 1994) . La carencia de la conservación de secuencia en este dominio sugiere que son las propiedades hidrofóbicas del dominio y no su secuencia la cual es crítica para integración. El dominio transmembranal de E2 comienza en el aminoácido 365 de la secuencia PE2. Esta región hidrofóbica consiste de la secuencia: VYTILAVASATVAM IGVTVAVLCAC (SEQ ID NO: 4) . Adams and Rose (1985) demuestra que son necesarios un mínimo de 14 aminoácidos en el dominio transmembranal de la proteína VSV G para anclaje apropiado en las células de mamíferos. Por lo tanto, se han diseñado los cebadores mutagénicos para crear un grupo alojado de eliminaciones en el dominio transmembranal E2. Comenzando con una eliminación de 16 aminoácidos (la cual deja 10 aminoácidos en la región hidrofóbica) , se construye un grupo de eliminaciones las cuales eliminan desde tanto como 16 aminoácidos, a unos cuantos como 1 aminoácido a partir del anclaje de membrana (Figura 4) . Se construyen las eliminaciones usando la mutagénesis de megacebador PCR para generar fragmentos eliminados que contienen sitios Bell y Spll únicos. Todas las construcciones resultantes se instalan en la construcción de ADNc de Sindbis wt Toto Y420 para generar los plásmidos mutantes. Después de la linearización con Xhol y transcripción usando la SP6 polimerasa, se transfectan las transcripciones en células BHK o Aedes albopictus por electroporación (como se describe anteriormente) . La producción de virus infecciosos a partir de estas transfecciones se titulan en tanto células BHK y de mosquito C710 para determinar el intervalo de huésped de estas construcciones. La Tabla 2 muestra las secuencias eliminadas y las secuencias de cebador usadas en su construcción. Para cada construcción se usa el mismo par de cebador para generar la región Bell a Spll completa. El cebador ElBcl21 hacia delante está comprendido de la secuencia a partir de 9306-9327 y se lee de 51-31 GCGTCGCCTATAAGAGCGACC (SEQ ID NO.: 5) El cebador inverso Splext está comprendido de la secuencia a partir del nucleótido 10420-10444 la cual es la secuencia complementaria que se lee de d1^1 CAGTGTGCACCTTAATCGCCTGC (SEQ ID NO.: 6). Se prueba el virus producido por transfección de células de insectos para su capacidad de producir placas en BHK y C7-10 células de mosquito como para el mutante E2 ?K391. Aquellos mutantes los cuales no producen placas en células BHK se prueban para su capacidad para infectar células BHK con relación al virus del tipo silvestre por ensayo de inmunofluorescencia de monocapas infectadas. Este último ensayo se compara con la proteína total en preparaciones purificadas del virus mutante y del tipo silvestre para establecer su capacidad de infección relativa de cada población mutante. La meta es truncar el dominio transmembranal tanto como sea posible y todavía obtener cantidades razonables de virus en C7-10 monocapas de células de mosquito las cuales infecten pero no produzcan virus maduro en células BHK. Si la circunstancia incrementa ese truncamiento de un dominio sencillo transmerab anal reduce pero no elimina el crecimiento de virus en células de BHK un segundo dominio será truncado y así sucesivamente hasta cuatro dominios. TABLA 2 Enlistado de las eliminaciones en E2 Sindbis y los cebadores usados Cebador- Nucleótidos Secuencia de oligonucleótido Diseñado por No. eliminados de cebador mutagénico de aminoácidos (cadena negativa) transmembranales E2 TM10 9734-9782 ACATAACACTGCGATGGTGTACAC (SEQ ID NO: 7) E2 TM12 9740-9782 ACATAACACTGCGGCTAAGATGG (SEQ ID NO:8) E2 TM1 9746-9782 ACATAACACTGCTGCGACGGCT (SEQ ID NO: 9) E2 TM16 9743-9773 GCAACAGTTACGACGGCT AG (SEQ ID NO: 10) E2 TM17 9743-9770 ACAGTTACGCCGACGGCTAAG (SEQ ID N0:11) E2 TM18 9743-9767 GTTACGCCAATGACGGCTAAG (SEQ ID NO: 12) E2 TM19 9743-9764 CGCCAATCATGACGGCTAAGA (SEQ ID NO: 13) E2 TM20 9755-9773 GCAACAGTTACGGTAGCTGA (SEQ ID NO:14) E2 TM21 9755-9770 AGTTACGCCGGTAGCTGA (SEQ ID NO: 15) E2 TM22 9761-9773 TGCAACAGTTACCGCCACGGT (SEQ ID NO:16) E2 TM23 9761-9770 ACAGTTACGCCCGCCACGGT (SEQ ID NO: 17) E2 TM24 9761-9767 GTTACGCCAATCGCCACGGT (SEQ ID NO:18) E2 TM25 9761-9764 ACGCCAATCATCGCCACGGT (SEQ ID NO:19) Este protocolo descrito por la presente invención trabaja para cualquier virus el cual se replica en insectos y mamíferos y tiene proteínas integrales membranales como parte de su estructura, es decir, Togavirus, Flavivirus y virus Bunya y todos los otros virus cubiertos los cuales pueden replicarse naturalmente en tanto células de mamíferos e insectos, así como también virus cubiertos los cuales pueden ser hechos para replicarse en células de mamíferos e insectos por modificado genético de tanto el virus o la célula.

Se hacen las vacunas contra cualquier virus que contiene membrana por eliminar aminoácidos a partir del dominio de expansión membranal de una proteína en la cubierta viral. Esto se hace por eliminar bases a partir del clon del ADNc del virus como se describe. Se transfecta el ARN transcrito a partir del clon alterado en las células de insectos. Se amplifica el virus producido por crecimiento repetido en células de insectos hasta que se obtienen cantidades grandes de virus mutantes. Se prueba este virus por su capacidad para infectar y producir progenie en células de mamíferos. Se prueban los virus los cuales no producen progenie en células de mamíferos para capacidad de producir inmunidad en animales de laboratorio. Aquellos los cuales producen inmunidad son candidatos para la producción de vacunas humanas y animales como es conocido en la técnica. Este protocolo se emplea con cualquier arbovirus u otros virus cubiertos. EJEMPLO 9 Bl crecimiento de mutantes de eliminación La Tabla 3 muestra el crecimiento de los mutantes de eliminación TM12, TM16 y ?K391 comparado con la cepa del tipo silvestre.

TABLA 3 Replicación de mutantes de dominio transmembranal de Sindfeis Se han hecho otros mutantes de eliminación, diferentes a TM12 y TM16, los cuales incluyen los mutantes TM10, TM14 y TM17. Los datos de infección se recolectan, TM10 no puede ser tan útil como TM12 ya que es muy corto para replicarse en cualquier tipo celular. TM14 puede ser interesante pero no puede ser mejor que TMlß. Probablemente no trabajará también. TM17 como TM14 puede o no puede producir el título diferencial observado. Como se describe en el Ejemplo 8, TM12 elimina 14 aminoácidos (nucleótidos 9740-9782 eliminados, Tabla 2) a partir del dominio de expansión membranal de la glicoproteína. TM16 elimina 10 aminoácidos (nucleótidos 9743-9773 eliminados, Tabla 2) a partir del dominio de expansión membranal, Los datos (Tabla 3) demuestran que TM12 crece deficientemente en tanto células de insectos y mamíferos, ¿ '31 mientras que TM16 crece a niveles muy altos en células de insectos pero deficientemente (4 órdenes de magnitud inferior) en células de mamíferos. En este aspecto, TM16 es como ?K391. Sin embargo, ya que TM16 tiene una eliminación de tamaño mayor (10 aminoácidos eliminados) comparado con el mutante ?K391 de eliminación sencilla, TM puede ser un mejor candidato de vacuna que ?K391 ya que la eliminación de mayor tamaño asegura que el virus mutante no puede revertir al fenotipo del tipo silvestre. Se citan las siguientes referencias en la presente: Adams G.A. y Rose J.K. (1985) Structural requirements of a membrane-spanning domain for protein anchoring and cell surface transport. Cell. 41 (3):1007-15. Berge, t.O. (ed.) (1975): International Catalogue of Arboviruses; 2a edición, DHEW Publ. No. (CDC) 75-8301 (U.S. government Office, Washington, D.C.). Bonner, W.M., and R. A. Laskey. 1974. A film detection method for tritium-labeled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46:83-88. Bowers, D.F., B.A. Abel and D.T. Brown (1995). Replication and Tissue Tropism of the Alphavirus Sindbis in the Mosquito Aedes Albopictus. Virology 212:1-12. Bretscher MS. (1993) Cholesterol and the Golgi apparatus. Science. 261 (5126) : 1280-1. i1! Brown, D.T. and L. Condreay (1986) . Replication of alphaviruses in mosquito cells. In The Togaviridae and Flaviviridae. S. Schlesinger (ed.), pág. 473-501. Clayton, R.B. 1964. The Utilization of sterols by insects. J. lipid res. 5:3-19. Karpf, A. R., E. Lenches, J.H. Strauss and D.T. Brown (1997) Superinfection Exclusión of Alphaviruses in Three Mosquito Cell Lines Persistently Infected with Sindibis Virus. J. virol. 71:7119- Knipfer, M.E., and D. T. Brown. 1989. Intracellular transport and processing of Sindbis virus glycoproteins. Virology 170:117-122. Leake, C.J. (1984). Transovarial transmission of arboviruses by mosquitoes. In Vectors in Virus Biology (Mayo and Harrap, eds.), pág. 63-92. Academic Press. Liu, N., and D.T. Brown (1993a). Transient translocation of the cytoplasmic (endo) domain of a type-I membrane glycoprotein intro cellular membranes, J. Cell Biol. 120:877-883. Liu, N., and D.T. Brown (1993b). Phosphorylation dephosphorylation events play critical roles in Sindbis virus maturation. J. Virol., 196:703-711. Liu N., H. Lee, R. Hernández and D.T. Brown (1996) Mutations in the Endo Domain of Sindbis Glycoprotein E2 Block Phosphorylation, Reorientation of the Endo Domain and Nucleocapsid Binding. Virology 222: 236-246. Mitsuhashi et al 1983. Sterol free eucaryotic cells from continuous cell lines of insects. Cell Biol. Int. Rep. 7:1057-1062. Mollenhauer, H.H. 1964. Plástic embedding mixture for use in electrón microscopy. Stain Techn. 39:111-114. NIAID Report of the Task Forcé on Microbiology and Infectious Diseases (1992). NIH Publication No. 92:3320. Renz, D., and D.T. Brown 1976. Characteristics of Sindbis virus temperature-sensitive mutants in cultured BHK- 21 and Aedes albopictus (mosquito) cells. J. Virol. 19:775- 781) . Rice C.M. et al 1982. Isolation and characterization of the hydrophobic COOH-terminal domains of Sindbis virus glycoproteins. J. Mol. Biol. 154:355-378. Rice., CM., R. Levis, J.H. Strauss, and H.V. Huang. 1987. Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDNA clones: mapping of lethal mutations, rescue of a temperature-sensitive marker, and in vitro mutagenesis to genérate defined mutants. J. Virol. 61:3809-3819. Sarkar, G., and S. S. Sommer. 1990. The " egaprimer" method of site-directed mutagenesis. BioTechniques. 8:404-407.

? J- Schlesinger, S. and M.J. Schlesinger (1990). "Replication of Togaviridae and Flaviviridae". (D.M. Knipe and B.N. Fields, eds.). In Virology Vol. I. Pág. 697-711. Raven Press, Ltd., Nueva York. Sprenger, D. and T. Wuithiranyagool (1985) . The discovery and distribution of Aedes albopictus in Harris County, Texas. J. am. Mosquito Control Assoc. 2:217-219. Cualesquiera patentes o publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas de los niveles de aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención. Además, estas patentes y publicaciones son incorporadas para referencia en la presente al mismo grado como si cada publicación individual se indica específica e individualmente para ser incorporada para referencia. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como también aquellos objetos, fines y ventajas inherentes a la presente. Los presentes ejemplos, junto con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos en la presente son representativos actualmente de modalidades preferidas, son ejemplos, y no se proponen como limitaciones en el alcance de la invención. Los cambios en la misma y otros usos se les ocurrirán a aquellos expertos en la técnica los cuales están comprendidos dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIA <110> Brown, Dennis T. Hernández, Raquel <120> MUTACIONES DE INTERVALO DE HUÉSPED DE VIRUS CON MEMBRANA Y SU USO COMO SUBSTRATOS DE VACUNAS <130> D6123CIPPCT <141> 2000/03/03 <150> 09/447,103 <151> 1999-11-22 <160> 34 <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> Usado como el cebador de mutagénesis con el "cebador hacia delante" para generar un "megacebador" de 518 bases el cual corresponde a los nucleótidos 9295-9813 <400> 1 ctcacggcgc gcacaggcac ataacactgc 30 <210> 2 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia artificial ^«JLfeJ-á-*-^ <220> <223> Usado como el "cebador hacia delante" con el cebador de mutagénesis para generar un "megacebador" de 518 bases el cual corresponde a los nucleótidos 9295-9813 <400> 1 ccatcaagca gtgcgtcg 18 <210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> Usado como el "cebador inverso" con el megacebador para el templado del plásmido Toto 1101 para crear un producto de 1149 nucleótidos usado para crear el mutante de eliminación K391 en Toto 1101. <400> 3 ggcagtgtgc accttaatcg cctgc 25 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> virus Sindbis <220> <221> dominio transmembranal de E2 en la secuencia PE2 <222> 365..390 *p <400> 4 Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met 5 10 15 He Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 25 <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <222> 9306-0327 <223> cebador hacia delante ElBcl21 a partir del megacebador usado con el cebador inverso para generar construcciones de eliminación que contienen sitios Bell y Spll únicos <400> 5 gcgtcgccta taagagcgac c 21 <210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <222> 10420-10444 <223> cebador inverso Spllext a partir del megacebador usado con el cebador hacia adelante para generar construcciones de eliminación que contienen sitios Bcll y Spll únicos <400> 6 cagtgtgcac cttaatcgcc tgc 23 <210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM10 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 7 acataacact gcgatggtgt acac 24 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM12 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 8 acataacact gcggctaaga tgg 23 <210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM14 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 9 acataacact gctgcgacgg ct 22 <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM16 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 10 gcaacagtta cgacggctaa g 21 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM17 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 11 acagttacgc cgacggctaa g 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM18 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 2 gttacgccaa tgacggctaa g 21 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM19 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 13 cgccaatcat gacggctaag a 21 <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM20 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 14 gcaacagtta cggtagctga 20 <210> 15 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM21 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 15 agttacgccg gtagctga 18 <210> 16 - 1-i <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM22 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 16 tgcaacagtt accgccacgg t 21 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM23 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 17 acagttacgc ccgccacggt 20 <210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM24 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 18 gttacgccaa tcgccacggt 20 <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> cebador mutagénico E2 TM25 (cadena negativa) usado para crear una eliminación en el dominio transmembranal E2 en la glicoproteína viral de Sindbis <400> 19 acgccaatca tcgccacggt 20 <210> 20 <211> 84 <212> ADN <213> virus Sindbis <220> <221> secuencia de nucleótidos del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis <222> 9717..9800 <400> 20 catcctgtgt acaccatctt agccgtcgca tcagctaccg tggcgatgat 50 gattggcgta actgttgcag tgttatgtgc ctgt 84 <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> virus Sindbis <220> <221> secuencia aminoácidos del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis <222> 363..390 <400> 21 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala 5 10 15 Met Met He Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 25 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar el aminoácido 378, el mutante de eliminación resultante es TM25. <400> 22 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala 5 10 15 Met He Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 25 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 378 y 379, el mutante de eliminación resultante es TM24. <400> 23 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala 5 10 15 He Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 25 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del d minio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 378 a 380, el mutante de eliminación resultante es TM23. <400> 24 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala 5 10 15 Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 25 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar loS aminoácidos 378 a 381, el mutante de eliminación resultante es TM22. <400> 25 Hís Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala 5 10 15 Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 376 a 380, el mutante de eliminación resultante es TM21. <400> 26 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Gly Val 5 10 15 Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 376 a 381, el mutante de eliminación resultante es TM20. <400> 27 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Thr 10 15 Val Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Smdbis después de eliminar los aminoácidos 372 a 378, el mutante de eliminación resultante es TM19. <400> 28 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Met He Gly Val Thr Val 5 10 15 Ala Val Leu Cys Ala Cys 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 372 a 379, el mutante de eliminación resultante es TM18. <400> 29 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val He Gly Val Thr Val Ala 5 10 15 Val Leu Cys Ala Cys 20 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 372 a 380, el mutante de eliminación resultante es TM17. <400> 30 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Gly Val Thr Val ala Val 5 10 15 Leu Cys Ala Cys <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 372 a 381, el mutante de eliminación resultante es TM16. <400> 31 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Val Thr Val Ala Val Leu 5 10 15 Cys Ala Cys <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 373 a 384, el mutante de eliminación resultante es TM14. <400> 32 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Val Ala Ala Val Leu Cys Ala 5 10 15 Cys <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 371 a 384, el mutante de eliminación resultante es TM12. <400> 33 His Pro Val Tyr Thr He Leu Ala Ala Val Leu Cys Ala Cys 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <221> secuencia del dominio transmembranal E2 de la glicoproteína viral Sindbis después de eliminar los aminoácidos 369 a 384, el mutante de eliminación resultante es TM10. <400> 34 His Pro Val Tyr Thr He Ala Val Leu Cys Ala Cys 5 10

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un virus cubierto por membrana, modificado genéticamente, caracterizado porque en donde el virus codifica para una proteína transmembranal la cual tiene una eliminación de uno o más aminoácidos, y en donde la eliminación proporciona una proteína transmembranal que es capaz de expandirse o integrarse correctamente en la cubierta membranal lo cual resulta en células las cuales producen partículas de virus infecciosos cuando el virus se replica en células de insectos, mientras que en donde la eliminación proporciona una proteína transmembranal que es incapaz de expandirse o integrarse correctamente en la cubierta membranal lo cual resulta en células que producen partículas virales no infecciosas cuando el virus se replica en células de mamíferos.
2. 2. El virus con cubierta de membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus es un virus en vector de artrópodo.
3. 3. El virus cubierto con membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, ' J 14 : caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de Togavirus, Flavivirus, virus de Bunya, virus cubiertos capaces de replicarse naturalmente en células de mamíferos e insectos, y virus cubiertos los cuales se replican en células de mamíferos e insectos como un resultado de modificar genéticamente tanto los virus o la célula.
4. 4. El virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado, porque las células de insectos son células de mosquito.
5. 5. El virus cubierto con membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las células de mosquito son células de Aedes albopictus.
6. 6. El virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de mamífero son células humanas .
7. 7. El virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus es el virus Sindbis, y la proteína transmembranal es la glicoproteína E2 viral.
8. 8. El virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo el cual consiste del virus ?K391 y el virus TM16.
9. 9. El virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo el cual consiste de HSV, VIH, virus de conejo, hepatitis y virus respiratorio, y en donde la proteína transmembranal se selecciona del grupo el cual consiste de la glicoproteína E2, glicoproteína E2 y la proteína G.
10. 10. El virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los virus son virus de tumor de ARN, y en donde la proteína transmembranal es Env.
11. 11. Un método para producir una vacuna viral a partir del virus cubierto por membrana, modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1 para la vacunación de mamíferos, caracterizado porque comprende las etapas de: introducir el virus cubierto por membrana, modificado genéticamente en células de insectos; y permitir al virus replicarse en las células de insectos para producir una vacuna viral.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el virus cubierto por membrana, modificado genéticamente es un virus en vector de artrópodo o cualquier virus capaz de replicarse.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de Togavirus, Flavivirus, Virus de Bunya, virus cubiertos capaces de replicarse naturalmente en tanto células de mamíferos e insectos, y otros virus cubiertos los cuales se replican en células de mamíferos e insectos como un resultado de la modificación genética de tanto los virus o la célula.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste del virus ?K391 y virus TM16.
15. 15. Un método para vacunar un individuo en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque comprende las etapas de: introducir la vacuna viral de conformidad con la reivindicación 11 en el individuo; y permitir a la vacuna viral producir proteínas virales para vigilancia inmune y estimular el sistema inmune para producción de anticuerpos en el individuo.
16. 16. Un método para producir una vacuna viral para una enfermedad esparcida por una población de mosquitos a un mamífero, caracterizado porque comprende las etapas de: Producir eliminaciones en los dominios asociados a membrana de los virus los cuales restringen su capacidad para crecer en células de insectos; introducir el virus modificado en una población silvestre de mosquitos; y permitir al virus modificado replicarse en células de la población silvestre de mosquitos para producir una población de mosquitos la cual aloja la cepa de vacuna del virus modificado y excluye el virus del tipo silvestre (patogénico) de tal forma que la picadura de mosquito suministra la vacuna al mamífero picado.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las eliminaciones en los dominios asociados con membrana del virus se producen por modificar genéticamente una eliminación de uno o más aminoácidos en una proteína viral transmembranal para producir un virus modificado, en donde la proteína transmembranal es capaz de expandir la cubierta membranal cuando el virus se replica en las células de la población de mosquitos, pero es incapaz de expandir la cubierta membranal cuando el virus se replica en las células del mamífero, y en donde el virus permanece capaz de replicarse en las células de mosquito.