MXPA01007148A - Uso de anticuerpos para vacunacion anti-cancer. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de anticuerpos dirigidos contra antigenos de membrana celular humanos para vacunaciones contra cancer.

Description

USO DE ANTIC U ERPOS PARA VACUNACIÓN ANTI-CAN C ER La presente invención se refiere al uso de anticuerpos, los cuales son d irigidos contra antígenos de membrana celular humanos para la preparación de una composición farmacéutica para la vacunación contra el cáncer. Con el descubrimiento de la tecnología de hibridoma , se hizo posible generar anticuerpos monoclonales (MAB) contra los antígenos más variados. Esta tecnología, la cual generalmente puede ser aplicada a todos los problemas biológicos también juega un papel importante en la investigación del cáncer. Durante los últimos veinte años, se han producido MAB dirigidos contra una multitud de antígenos asociados a tumor (TAA). Los TAA son estructuras que se expresan predom inantemente en la membrana celular de células de tumor y las cuales, de esta manera , permiten la diferenciación de tejido no maligno. Por lo tanto, son consideradas como objetivos para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas en base a MAB específicos o derivados de estos MAB . Las aplicaciones terapéuticas directas de MAB, los cuales se dirigen contra TAA, se basan en inm unoterapias pasivas, es decir, un MAB o un derivado es aplicado de manera sistémica a pacientes de cáncer en una cantidad adecuada y tiene un efecto terapéutico único siempre y cuando la concentración en el organismo sea suficientemente alta. La vida media biológica de tales agentes depende de su estructura y varía de solo unas cuantas horas hasta varios d ías. En consecuencia, es necesario repetir las aplicaciones. Sin embargo, si se usan anticuerpos xenogénicos (por ejemplo , MAB de murino) , esto conduce a reacciones inmunes no deseadas, las cuales pueden conducir a la neutralización de un posible efecto terapéutico y a efectos laterales peligrosos (choque anafiláctico). Por lo tanto, tales inmunoterapéuticos solo pueden ser administrados du rante u n periodo lim itado. Otra aproximación para la inmunoterapia de cáncer se basa en la activación selectiva del sistema inmune de pacientes de cáncer, con el fin de combatir células malignas para las cuales se usan los tipos más variados de vacunas contra cáncer. Estas incluyen vacunaciones con cél ulas de tumor autólogas o alogénicas, vacunaciones con células de tumor autólogas o alogénicas, las cuales han sido modificadas q u ím icamente, o las cuales han sido modificadas mediante técnicas de genes, vacunaciones con TAA aislados o TAA que han sido producidos usa ndo métodos químicos o de genes, con péptidos derivados de los m ism os , y recientemente, también vacunaciones con DNAs que codifican TAA o estructuras derivadas de los mismos, etc. Un método alterno se basa en el uso de anticuerpos anti-idiotípicos para la vacunación contra cáncer. Los anticuerpos anti-idiotípícos pueden imitar inmunológicamente un TAA. Como proteínas xenogeneicas (por ejemplo, anticuerpos de murino, anticuerpos de cabra, etc. ), inducen una fuerte respuesta inmune en humanos después de la vacunación - en contraste con los antígenos de tumores humanos apropiados, los cuales, como estructuras de los mismos, frecuentemente son inmunogénicos a un bajo grado solamente. P.or lo tanto, los anticuerpos anti-idiotípicos pueden ser usados para vacunación como un substituto ¡nmunogénico para un antígeno de tumor. En contraste, la inmunoterapía pasiva con anticuerpos anti-tumor en la inmunoterapia de cáncer específica, incluye cantidades muy pequeñas de una vacuna adecuada, son suficientes, en principio, para inducir una i nmunidad que dure meses o años, y la cual pueda ser reforzada mediante vacunaciones repetidas si se debilita. Más aún, la inmunización activa perm ite inducir una inm unidad humoral, así como, celular, la cooperación de las cuales puede conducir a una protección efectiva. En resumen, el uso de anticuerpos o sus derivados para inmunoterapia contra el cáncer, que se ha descrito hasta ahora, se basa esencialmente en dos principios: - terapia pasiva con anticuerpos o sus derivados, los cuales se dirigen contra TAA. - inmunización activa (vacunación) con anticuerpos o sus derivados, los cuales se dirigen contra el idiotipo de anticuerpos teniendo una especificidad contra TAA. En el curso del descubrimiento y la caracterización subsecuente de los TAA más variados, se ha descubierto que tienen importantes funciones con respecto a las células de cáncer. Habilitan las células degeneradas para mostrar propiedades características del fenotipo maligno, tal como una capa cidad incrementada para la adhesión, las cuales juegan un importante papel para establecer la metástasis. Sin embargo, tales antígenos, en ciertas etapas, también pueden ser expresados en células normales, donde son responsables de las funciones normales de estas células. Sin reclamar a integridad, algunos ejemplos de tales antígenos son listados en los siguientes: - N-CAM (Molécula de adhesión a células neuronales), que frecuentemente se espresa en tumores de origen neuronal y que afecta la adhesión homofílica (J. Cell Biol. 1 18 ( 1 992), 937). - El antígeno de carbohidrato de Y de Lewis, el cual ocurre en la mayoría de tumores de origen epitelial , pero el cual también juega un papel im portante durante el desarrollo fetal de tejidos epiteliales. Se ha mostrado que la expresión de este antígeno en cáncer de pulmón está asociado fuertemente con una prognosis desfavorable, debido a que las células de cáncer positivas Y de Lewis obviamente tienen un mayor potencial metastático (N . Engl. J. Med. 327 ( 1 992), 14). - CEA (antígeno carcino-embriónico), el cual frecuentemente ocurre en tumores epiteliales del tracto gastrointestinal y el cual ha sido identificado como una molécula de auto-adhesión (Cell 57 (1 989), 327). - Ep-CAM (molécula de adhesión de células epiteliales) , la cual es expresad a en casi todos los tumores de origen epitelial, pero que también ocurre en un gran número de epitelios normales. Se ha caracterizado como una molécula de auto-adhesión y por lo tanto, puede ser clasificada como un antígeno de adhesión pan-epitelial (J. Cell Biol. 1 25 (1 994) , 437). El problema técnico subyacente a la presente invención, es proporcio nar medios adicionales y métodos que permitan una profilaxis eficiente contra o terapia de enfermedades de cáncer. Este problema ha sido resuelto mediante la provisión de las modalidades según se caracteriza en las reivindicaciones.

De acuerdo con esto, la invención se refiere al uso de anticuerpos, los cuales se dirigen contra antígenos de membrana celular humanos para la preparación de una composición farmacéutica para la vacunación profilática y/o terapéutica contra el cáncer. En este contexto, el término 5 "antígenos de membrana celular" se refiere a estructuras, las cuales se presentan en la membrana celular. En particular, estas incluyen receptores, tales como el receptor de transferrina, u otras moléculas, tales como cadherina E o Ep-CAM . En una modalidad preferida, tal antígeno de membrana celular es un 10 antígeno asociado a tumor. En este contexto, el término "antígeno asociado a tumor" significa una estructura la cual se presenta predom inantemente por células de tumor y con ello permite una diferenciación de tejido no maligno. De preferencia, tal antígeno asociado a tumor está ubicado sobre o en la membrana celular de una célula de 15 tumor. Sin embargo, esto no excluye la posibilidad de que tales antígenos también ocurran en células no degeneradas. Los antígenos asociados a tumor pueden ser, por ejemplo, polipéptidos, en particular proteínas glicosiladas, o patrones de glicosilación de polipéptidos. Otras estructuras que pueden representar un antígeno asociado a tumor son, por ejemplo, 20 g licol ípidos . Estas incluyen , por ejemplo, gangliósidos, tales como GM2. Más aún , los antígenos asociados a tumor pueden ser representados por cambios en la composición de lípidos de la membrana celular, los cuales pueden ser característicos de células de cáncer. Ejemplos de antígenos asociados a tumor son N-CAM , el antígeno de 25 carbohidrato Y de Lewis, CEA y Ep-CAM, los cuales ya han sido í?tn-?í_?i? í ni- -1-- mencionados antes. Ejemplos adicionales son carbohidrato de Sialil Tn, carbohidrato de Globo H , ganglósidos, tales como, G D2/GD3/GM2, antígeno específico de próstata (PSA), CA 1 25, CA 19-9, CA 1 5-3, TAG-72, receptor EGF, receptor Her2/Neu, p97, CD20 y CD21 . Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra todos estos antígenos están disponibles. Antígenos asociados a tumor adicionales son descritos, por ejemplo, en DeVita et al. (Eds. , " Biological Therapy of Cáncer" (Terapia biológica de cáncer), 2a edición, capítulo 3: Biology of Tumor Antigens (Biolog ía de antígenos de tumor), Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6 (1995)). El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos de todos los tipos posibles , en particular a anticuerpos policlonales o monoclonales, o también a anticuerpos producidos mediante métodos qu ím icos, bioqu ímicos o tecnológ icos de genes. Los métodos para producir tales moléculas son conocidos para la persona experta en la técnica. La manera de producir el a nticuerpo no es importante. Solo es importante su especificidad de unión para un epitope relevante de un antígeno de membrana celular. De preferencia , se usan anticuerpos monoclonales, muy preferiblemente anticuerpos monoclonales de origen animal , en particular de origen de murino. Se prefiere particularmente, que se use el anticuerpo monoclonal de murin o HE-2, el cual puede ser producido como se describe, o un anticuerpo que tenga la misma buena especificidad de unión como HE2. Dentro del significado de la presente invención , el término "anticuerpo" también incluye fragmentos y derivados de anticuerpos, en donde estos fragmentos o derivados reconocen un TAA. La respuesta inmune terapéuticamente efectiva, la cual es inducida por la vacunación con anticuerpos adecuados dirigidos contra TAA, es determinada mediante la región de unión de estos anticuerpos, es decir, por su idiotipo. En consecuencia, en principio, también es posible usar, en lugar de anticuerpos intactos, fragmentos o derivados de estos anticuerpos, para una vacunación exitosa siempre y cuando estos derivados todavía contengan el idiotipo del anticuerpo inicial respectivo. Como ejemplos, sin ser li itanes, pueden listarse: fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)', fragmentos Fv, los cuales pueden ser producidos ya sea mediante métodos bioqu ím icos conocidos (corte enzimático) o mediante métodos conocidos de biolog ía molecular. Ejemplos adicionales son derivados de anticuerpos, los cuales pueden ser producidos de acuerdo con métodos químicos, bioquímicos o tecnológicos de genes. En este contexto, el término "derivado" , en particular, también incluye productos que pueden ser producidos mediante enlace químico de anticuerpos (fragmentos de anticuerpos) con moléculas que pueden intensificar la respuesta inmune, tal como toxoide de tétanos, exotoxina de Pseudomonas, derivados de l ípido A, GM-CS F, I L-2 o mediante enlace químico de anticuerpos (fragmentos de anticuerpos) con l ípidos para una mejor incorporación en una formulación de liposomas. El término "derivado" también incluye prote ínas de fusión de anticuerpos (fragmentos de anticuerpos), las cuales ha n sido producidas mediante tecnolog ía de genes, con polipéptidos que pueden intensificar la respuesta inmune, tales como, GM-CSF, IL-2, r L- 12, C3d , etc. De acuerdo con la invención , los anticuerpos también pueden ser apl icados, por supuesto, en combinación unos con otros. Esto significa que pueden administrarse dos o más anticuerpos que reconocen diferentes antígenos de membrana o diferentes epitopes del mismo antígeno de membrana. Los diferentes anticuerpos pueden ser administrados de manera simultánea (juntos o por separado) o subsecuente. Las células de cáncer frecuentemente expresan varios TAA al mismo tiempo, contra los cuales anticuerpos adecuados para vacunación ya sea están disponibles o pueden ser generados. Con el fin de obtener un efecto intensificado o posiblemente sinerg ístico de la respuesta inmune inducida y para m inim izar el peligro potencial de la selección de variantes negativas de antígeno, y con el fin de contrarrestar una posible heterogeneidad de células de tumor, puede ser ventajoso usar una combinación de dos o más anticuerpos adecuados o sus fragmentos o derivados, de manera sim ultáne a para la vacunación . En el contexto de la presente invención, el término "vacunación" significa u na inmunización activa, es decir, una inducción de una respuesta in m une es pecífica debido a la administración (por ejemplo , subcutánea, intradérmica , intramuscular, posiblemente también oral, nasal) de peq ueñas cantidades de un antígeno (una substancia que es reconocida por el individuo vacunado como extraña y por lo tanto, inmunogénica) en una form ulación inmunogénica adecuada. El antígeno es usado de esta manera como un "disparador" para el sistema inmune, con el fin de formar una respuesta inmune específica contra el antígeno. En principio, las cantidades requeridas del antígeno pueden ser muy pequeñas (algunas vacunas solo contienen aproximadamente 5-10 µg de antígeno por dosis de vacunación) .

Es una característica de una inmunización activa que la curva de dosis-efe cto depende, sobre un amplio rango, solo un poco de la cantidad de antígeno administrada. Esto significa que la respuesta inmune es más o menos idéntica en un amplio rango de dosis. Como consecuencia, en el caso de vacunación, el efecto deseado, es decir, la inducción de una respuesta inmune, ya puede alcanzarse con cantidades m uy pequeñas de a ntígeno. Sin embargo, también puede alcanzarse en una manera comparable usando cantidades substancialmente mayores de antígeno. Por supuesto, es deseable usar, en general, una dosificación tan baja como sea posible, en particular en vista de los efectos laterales, costos de m ateria l , etc. , los cuales son de importancia con respecto a la vacunación .

En el sentido de la presente invención, una vacunación puede, en principio, ya sea ser realizada en el sentido terapéutico, así como en el sentido profiláctico (como es el caso con todas las vacunas a ntim icrobianas) . Esto significa que la vacunación contra cáncer de acuerdo con la presente invención, puede entenderse tanto como una aplicación terapéutica como profiláctica. De acuerdo con esto, opcionalmente pudiera ser posible alcanzar una protección profiláctica contra el brote de una enfermedad cancerosa mediante vacunación de ind ividuos , q uienes no sufren de cáncer. Los individuos a quienes puede aplicarse tal vacunación profiláctica, son individuos que tienen un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad cancerosa, aunque esta aplicación no está limitada a tales individuos. El uso de acuerdo con la presente invención difiere substancialmente de las pos ibilidades básicas de la aplicación terapéutica de anticuerpos para el tratamiento de cáncer, que han sido conocidas hasta ahora y han sido descritas anteriormente, y permite un tratamiento inesperadamente eficiente . La región de unión de un anticuerpo contra un TAA puede 5 representar una imagen complementaria estructural del epitope de unión del TAA respectivo, de acuerdo con el principio de "cerradura y llave". Esto significa que tal anticuerpo tiene, en su idiotipo, una información estructural del epitope del TAA contra el cual es dirigido. De esta manera, si un paciente de cáncer es vacunado con un anticuerpo inmunogénico 10 adecuado contra TAA (es decir, por ejemplo, con un MAB de murino contra un TAA) , se producen anticuerpos en el paciente los cuales, en parte, se dirigen contra el idiotipo del anticuerpo usado como vacuna, y los cuales pueden imitar estructuralmente el epitope del TAA de acuerdo con el principio de "cerradura y llave". Esto significa que debido a tal 15 vacunación , por decirlo así, variantes solubles del epitope del TAA se generan en el paciente de cáncer, las cuales pueden ser efectivas como anticuerpos autólogos activamente inducidos durante un periodo largo y el título de los cuales puede reforzarse en intervalos adecuados mediante vacunaciones repetidas. 20 En una modalidad preferida , el antígeno de membrana celular humano es una estructura que juega un papel en procesos de adhesión. En este contexto, los procesos de adhesión de preferencia son interacciones célula-célula , en donde están involucrados ligandos o receptores en la superficie celular. De esta manera, las moléculas de 25 adhesión son ligandos o receptores en la superficie celular, las cuales — -3U¿-i"- ' . -.-*,«........ sirvan la función de interacción célula-célula. Un subgrupo de tales moléculas de adhesión son las moléculas de auto-adhesión. Estas poseen la propiedad de ser capaces de unirse a ellas mismas. El efecto fisiológico de una respuesta inmune inducida por vacunación, con un anticuerpo dirigido contra un TAA depende naturalmente de la función del TAA respectivo. Si el TAA tiene, por ejemplo, la función de un receptor para la adhesión de células de tumor, en particu lar para un ligando en células endoteliales del sistema vascular (tal propiedad es importante por la capacidad de las células de tumor disem inadas para salir del sistema vascular y para asentarse en el tejido con el fin de formar una metástasis), esta capacidad de adhesión es reducida mediante vacunación con un anticuerpo adecuado dirigido contra este TAA, debido a que los anticuerpos inducidos, los cuales competirán por la interacción del TAA con su ligando conforme imiten el TAA en forma sol u ble, e starán permanentemente presentes en la circulación y el tejido. Hablando de manera general, es posible, de acuerdo con las explicacion es dadas antes, para alcanzar una vacunación con anticuerpos adecuados contra TAA, los cuales tienen una función con respecto a la malig nidad de células de tumor, q ue la respuesta inmune inducida interfiera con la función del TAA en su interacción con su ligando y entorpezca o evite esta interacción . Esto significa que las células de cáncer no pueden expresar, o no de manera suficiente, propiedades que son importantes para el fenotipo maligno, lo cual hace posible retardar o parar el desarrollo de la enfermedad y suprimir el desarrollo de metástasis, en particular, en una etapa temprana.

^S ^?iaa ?^ En una modalidad preferida adicional, el antígeno de membrana celular es capaz de auto-adhesión, es decir, ciertos epitopes del antígeno son resp onsables de la unión homofílica al mismo antígeno en otra célula. Ejemplos de tales antígenos son, inter alia, N-CAM (molécula de adhesión celular neuronal), CEA (antígeno carcino-embriónico) y Ep-CAM (molécula de adhesión de células epiteliales) . Los anticuerpos dirigidos contra epitopes de antígenos de auto-adhesión, los cuales están involucrados en esta función, pueden contener, como se describe antes, información estructural complementaria para tal epitope. Mediante vacunación con tales anticuerpos, es posible de esta manera, como se describe antes, ind ucir la formación de anticueros, los cuales tienen la propiedad de esta auto-adhesión en la reacción de unión. Esto significa que tales anticuerpos inducidos pueden unirse, a su vez, al antígeno de auto-adhesión , debido a que en tal caso, el receptor y el ligando son idénticos. De esta manera , es posible inducir una respuesta inmune mediante va cunación de pacientes de cáncer con anticuerpos adecuados dirigidos contra antígenos de auto-adhesión, en donde dicha respuesta inmune, a su vez, se une directamente a células de tumor y por ello dispara varios efectos terapéuticos. Por otra parte, la capacidad de auto-adhesión, la cua l es importante para células malignas, es bloqueada y, por otra parte, las funciones efectoras humanas, tales como lisis dependiente de com plemento y/o lisis debida a la activación de células efectoras citotóxicas , pueden dispararse mediante la unión de los anticuerpos inducidos a las células de tumor, lo cual conduce a la destrucción de las células de tumor.

Mediante todos los mecanismos y efectos antes mencionados, la formación de metástasis nueva puede suprimirse y la diseminación de la enfermed ad puede ser, al menos, retardada gracias a la vacunación de pacientes de cáncer con anticuerpos adecuados contra TAA. En etapas tempranas de la enfermedad, por ejemplo, después de una operación exitosa de un tumor primario (etapa auxiliar), se evita que células de tumor diseminadas restantes se establezcan a sí mismas como metástasis nueva debido a tales vacunaciones. Esto permite prolongar el periodo de supervivencia libre de recaída y, por lo tanto, el tiempo de vida global de tales pacientes. Opcionalmente, puede ser posible obtener una protección de larga vida contra la formación de metástasis debido a tales vacunaciones y vacunaciones de refuerzo, las cuales se realizan en intervalos adecuados. Son de particular interés vacunaciones de pacientes de cáncer con anticuerpos adecuados dirigidos contra un TAA de auto-adhesión, debido a que en estos casos, como se describe antes, es posible alcanzar un efecto terapéutico intensificado debido a un ataque directo adicional de la respuesta inmune inducida en las células de tumor.

En una modalidad adicional preferida, la composición farmacéutica preparada de acuerdo con el uso de la presente invención, contiene al menos un auxiliar comúnmente usado en la formulación de vacunas aparte del anticuerpo. Es posible intensificar la respuesta inmune por tales auxiliares. Como ejemplos de auxiliares, pero sin estar limitados a éstos, se pueden listar los siguientes: hidróxido de aluminio (gel Alu), derivados de lipopolisacáridos, Bacillus Calmette Guerin (BCG), preparaciones de liposomas, formulaciones con antígenos adicionales contra los cuales el sistema inmune ya ha producido una fuerte respuesta inmune, tal como, por ejemplo, toxoide de tétanos, exotoxina de Pseudomonas, o constituyentes de virus de influenza , opcionalmente en una preparación de liposomas, auxiliares biológicos, tales como, factor estimulante de 5 macrófago de granulocitos (GM-CSF), interleucin 2 (IL-2) o gama interferón (I FN?) . En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica preparada de acuerdo con el uso de la invención, es adecuada para administración para vacunación en una dosificación de 0.01 a 4 mg de anticuerpo, de 10 preferencia de 0.5 mg. La vacunación puede ser realizada mediante una sola aplicación de la dosificación mencionada antes. Sin embargo, de preferencia, la vacunación es realizada mediante aplicaciones repetidas. El número de repeticiones está en el rango de 1 a 12 por año, más preferiblemente en el 15 rango de 4 a 8 por año. La dosificación puede permanecer igual o puede disminuir Las vacunaciones de refuerzo pueden ser realizadas en intervalos regulares , en principio, a lo largo de la vida. Intervalos adecuados están en el rango de 6 a 24 meses y pueden ser determ inados al monitorear el 20 título de los anticuerpos inducidos (una vacunación de refuerzo debería ser realizada tan pronto como el título de los anticuerpos inducidos haya ca ído significativamente). La administración del anticuerpo puede ser realizada de acuerdo con métodos conocidos para la persona experta en la técnica. De preferencia, --*— "* - • - * * < * la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo es adecuada para una administración subcutánea, intradérmica o intramuscular. La presente invención se refiere además al uso de anticuerpos, los cuales reconocen un antígeno asociado a tumor para la vacunación contra enfermedades de cáncer, así como a un método para tratar enfermedades de cáncer por vacunación, en donde uno o más anticuerpos, los cuales reconcen un TAA, son administrados a un paciente en una cantidad suficiente para vacunación. Para las definiciones y las modalidades preferidas, se sostiene lo mismo como ya se describió antes en relación al uso de acuerdo con la invención. El uso de anticuerpos dirigidos contra TAA o de sus derivados o fragmentos como vacunas, difiere substancialmente de las aplicaciones conocidas de tales anticuerpos anti-TAA para la inmunoterapia pasiva. Algunas ventajas esenciales del uso de acuerdo con la invención, en com paración con la inm unoterapia de anticuerpos pasiva se resumen como sigue: Anticuerpos dirigidos contra TAA para la inmunoterapia pasiva de cá ncer: - alta dosificación (> 100 mg/infusión intavenosa) - corto efecto debido a la eliminación del agente efectivo - anticuerpo xenogéníco indeseable debido a la ¡nmunogenidad - la duración de la terapia es limitada, en particular en el caso de anticuerpos xenogénicos, debido a la inducción de una respuesta inm une y el peligro de reacciones anafilácticas provocadas por ella en el caso de aplicaciones repetidas Anticuerpos dirigidos contra TAA para la vacunación profiláctiva y/o terapéutica contra cáncer: baja dosificación (< 1 mg/vacunación; inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular) - efecto de larga duración de la respuesta inmune inducida directamente - anticuerpos xenogénicos deseables debido a que el efecto se basa en la inm unogenicidad duración del tratam iento sin l ímites (siempre son posibles las vacunaciones de refuerzo) A continuación, se describirán experimentos que muestran que la vacunación con un cierto MAB de murino (HE2) , el cual se dirige contra TAA Ep-CAM de auto-adhesión, o la vacunación con su fragmento F(ab)'2 conduce directamente a la inducción de anticuerpos, los cuales se unen de maenra selectiva en células de tumor humanas que expresan este ant ígeno. Esto muestra , como un ejemplo pero sin limitación alguna, que u na respuesta inm une que puede tener un efecto terapéutico en enfermedades de cáncer, es inducida por vacunación con anticuerpos adecuados dirigidos contra un TAA de auto-adhesión o con sus derivados, los cuales comprenden al menos el idiotipo del anticuerpo inicial . Para este fin , el anticuerpo monoclonal de murino HE2 se generó de acuerdo con procedimientos estándares descritos de la tecnología de hibridoma (ver, por ejemplo, H. Zola. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniq ues (Anticuerpos monoclonales: un manual de técnicas) , CRC Press, Inc. ISBN 0-8193-6479-0; 1 988). Los ratones Balb/c fueron inmunizados con células de cáncer colorrectal humanas de acuerdo con protocolos estándares. Las células de bazo se fusionaron con la l ínea de melanoma de ratón P3X63Ag8 y se seleccionaron hibridomas, los cuales producen anticuerpos , los cuales se unen de manera selectiva a células de cáncer colorrectal humanas pero no a células de melanoma. Finalmente, se seleccionó un hibridoma , el cual secretó un anticuerpo lgG2a/kappa. Este anticuerpo (H E2) se une a Ep-CAM como puede mostrarse, por ejemplo, mediante análisis Western Blot con preparaciones de membranas de células de cáncer de estómago KATO lll , usando un anticuerpo anti-Ep-CAM conocido (KS 1 -4) como una comparación . Las secuencias de am inoácidos de las regiones variables de MAB HE2 son como sigue: Cadena pesada: QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVIN PGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARDGPWF AYWGQGTLVTVSA (SEQ I D NO: 1 ) Cadena lig era: N IVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGAS NRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKL EI K (S EQ I D NO: 2) Las figuras muestran: La Figura 1 muestra la inhibición de la auto-adhesión de la l ínea de cáncer de pulmón de células pequeñas SW2 por MAB HE2 in vitro. La Figura 2 muestra la auto-adhesión de la línea de cáncer de pulmón de células pequeñas humanas SW2 sin la influencia de MAB HE2 in vitro como un control para el experimento mostrado en la Figura 1 . La Figura 3 muestra la inducción de una respuesta inmune de anticuerpo contra HE2 después de la vacunación de cabras con el fragmento F(ab)'2 de H E2, como se determina en un ELISA. La Fig ura 4 muestra la inducción de una respuesta inmune de anticuerpo contra células de cáncer de estómago humanas (Kato l l l) positivas de Ep-CAM después de la vacunación de cabras con el fragmento F(ab)'2 de HE2, como se determina en un ELISA de células. La Figura 5 muestra la ausencia de una respuesta inmune de anticuerpo contra células de melanoma humanas (WM9) negativas de Ep-CAM después de la vacunación de cabras con el fragmento F(ab)'2 de H E2 , como se determina en un E LISA de células, el cual se realizó como un control para el experimento mostrado en la Figura 4. La Figura 6 muestra la unión de una fracción de anticuerpo purificado por afinidad de suero de cabras, las cuales fueron vacunadas con el fragmento F(ab)'2 de H E2, a células de cáncer de estómago 1 humanas (Kato lll) positivas de Ep-CAM, como se determina en un ELISA de células. La Figura 7 muestra la ausencia de la unión de una fracción de anticuerpo purificada por afinidad de suero de cabras, las cuales fueron vacunadas con el fragmento F(ab)'2 , a células de melanoma humanas (WM9) negativas de Ep-CAM , como se determina en un ELISA de células, el cual se realizó como control para el experimento mostrado en la Figura 6. La Figura 9 muestra la inducción de una respuesta inmune de anticuerpo contra células de cáncer de estómago humanas (Kato ll l) positivas de Ep-CAM después de la vacunación de monos rhesus con 0.5 mg de HE2 adsorbido a hidróxido de aluminio, como es determinado en un ELISA de células. La Figura 10 muestra la inducción de una respuesta inmune de anticuerpos contra HE2 detectada en relación al estudio de toxicidad con monos rhesus después de la vacunación de un grupo de monos rhesus con 0.5 mg de HE2 adsorbido a hidróxido de aluminio, así como la ausencia de una respuesta inmune contra HE2 después del tratamiento de otro grupo de monos rhesus con una formulación de hidróxido de aluminio sin antígeno (placebo), como se determina en un ELISA. La Figura 1 1 muestra de manera ejemplar, la inducción de una respuesta inmune de anticuerpos contra células de cáncer de estómago humanas (Kato l l l) positivas de Ep-CAM detectada en relación al estudio de toxicidad de monos rhesus con HE2, como se determina en un ELISA de células. 2 La Figura 1 2 muestra la inducción de una respuesta inmune de anticuerpos contra células de cáncer de estómago humanas positivas de Ep-CAM (Kato lll) después de vacunación repetida de un paciente que sufre de cáncer intestinal con 0.5 mg de HE2 adsorbido a hidróxido de aluminio, como se determina en un ELISA de células. La Figura 13 muestra la inducción de una citotoxicidad de suero contra células de cáncer de estómago humanas positivas de Ep-CAM (Kato l l l ) después de vacunación repetida de un paciente que sufre de cáncer intestinal con 0.5 mg de HE2 adsorbido a hidróxido de aluminio, como se determina en un experimento de lisis celular. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención pero no para limitarla: Con el fin de mostrar que MAB H E2 de murino se une a un epitope del antíg eno de auto-adhesión Ep-CAM, el cual está involucrado en la unión homofílica, se investigó la influencia de HE2 sobre la capacidad de auto-adhesión de la línea de células humanas SW2. Esta l ínea de carci noma de pulmón de cél ulas pequeñas, tiende a formar racimos de células en cultivo in vitro dentro de varias horas después sembrando simple precedente. La descripción del experimento puede encontrarse en el Ejemplo 1 . Como es evidente a partir de las Figuras 1 y 2, la formación de racimos de células es evitada en un buen grado mediante la adición de HE2. Esto prueba que HE2 se une a un epitope de Ep-CAM , el cual está involucrado en la unión homofílica de esta proteína de membrana. Con el fin de ser capaces de investigar la respuesta inmune humoral directa a la vacunación con el fragmento F(ab)'2 del MAB H E2 de murino, se inmunizaron cabras con este fragmento. El fragmento se preparó de acuerdo con métodos que son conocidos y descritos por corte de HE2 con pepsina y se purificó. La inmunización de las cabras se describe en el Ejem plo 2. Primero se investigó el inmunosuero de cabra que fue recuperado y depositado, en comparación con un pre-suero, por inmunoglobulinas, las cuales son dirigidas contra el MAB HE2, con el fin de determinar la respuesta inmune total de las cabras vacunadas. Esta investigación se realizó con la ayuda de un ensayo ELISA, cuya descripción experimental está dada en el Ejemplo 3. El resultado de este experimento se muestra en la Figura 3: las cabras, debido a la vacunación con el fragmento F(ab)'2 del MAB HE2, han desarrollado una fuerte respuesta inmune al mismo, m ientras q ue no se pudieron encontrar anticuerpos contra HE2 en el pre-suero. A continuación, se investigó si es posible detectar inmunoglobulinas en el inmunosuero de cabra, el cual se une a células de cáncer humanas, las cuales expresan el TAA contra el cual se dirige el MAB H E2 (Ep-CAM). Para este fin, se usó la línea de células de cáncer de estómago KATO l l l . También se probó la unión a una línea de células humanas, la cual no expresa Ep-CAM (células de melanoma WM9) , como un control. Estas investigac iones se realizaron con la ayuda de ensayos de ELISA de células, cuya descripción está dada en el Ejemplo 4. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 4 y 5: el inmunsuero de cabra contiene inmunoglobulinas, las cuales se unen fuertemente a las cél ulas KATO positivas de Ep-CAM , m ientras que no se puede detectar unión en las células WM9 negativas de Ep-CAM. El pre-suero no contiene anticuerpos que se unan a estas células. Este resultado muy sorprendente muestra que los anticuerpos generados por la vacunación con el fragmento HE2-F(ab)'2 son en realidad capaces de unirse ellas mismas nuevamente a células que expresan el TAA reconocido por H E2. En consecuencia, la función del TAA de auto-adhesión podría ser transferida a los anticuerpos, los cuales se generaron por la vacunación con HE2, como se describe previamente con detalle. Con el fin de probar que los anticuerpos producidos en las cabras debido a la vacunación con el fragmento F(ab)'2 de H E2 y los cuales son dirigidos contra el idiotipo de este MAB, son en realidad aquéllos que se unen a las células KATO, la porción anti-idiotípica de estos anticuerpos ind ucidos fue purificada específicamente del inmunosuero de cabra con la ayuda de una secuencia de cromatografías de inmunoafinidad como se describe de manera principal (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 ( 1 984), 21 6). La secuencia de los pasos de purificación es resumida nuevamente en el Ejemplo 5. Estos anticuerpos de cabra purificados por afinidad se probaron nuevamente por su unión a las células KATO positivas de Ep-CAM , así como a las células WM9 negativas de Ep-CAM. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 6. El resultado de estos experimentos se muestra en las Figuras 6 y 7: la IgG de cabra, la cual es dirigida contra el idiotipo de HE2, se une fuertemente a las células KATO positivas de Ep-CAM , mientras que la IgG de cabra no específica difícilmente se une. Sin embargo, la unión de la IgG de cabra específica, purificad a por afinidad, para las células WM9 negativas de Ep-CAM, no difiere de aquélla de la IgG de cabra no específica. De esta manera, se prueba que la fracción de los anticuerpos que se desarrollan directamente debido a la vacunación con el fragmento F(ab)'2 de HE2 y los cuales se unen contra el idiotipo de este anticuerpo, contiene los anticuerpos que se unen a las células de cáncer, las cuales expresan el TAA reconocido por H E2. Mediante este experimento, también se muestra de manera concluyente que los anticuerpos contra células positivas de Ep-CAM inducidas por la vacunación con H E2 no son el resultado de una doble cascada de red idíotípica autóloga, como fue postulado en varias publicaciones (ver, por ejemplo: Cáncer Immunol . Immunother. 42 (1996), 81 -87) , porque tales anticuerpos anti-idiotípicos (Ab3) no pudieron ser purificados en absoluto mediante cromatografía por afinidad en una col umna Ab 1 (= HE2) ya que, de acuerdo con la red idiotípica, no pueden unirse a Ab 1 sino solo a Ab2. En vista de los resultados antes descritos de la inmunización de cabras con el fragmento F(ab)'2 de HE2, también se realizaron estudios de vacunación con monos rhesus, con el fin de confirmar los resultados inm unológicos en una especie estrechamente relacionada a humanos. Para estos experimentos, se usó MAB HE2 de murino completo como inmunógeno. Se asumió que la parte de Fc de murino como una proteína xenogeneica grande también intensificaría la respuesta inmune contra el idiotipo (efecto portador) . Con el fin de evitar posibles efectos laterales locales, se usó hidróxido de aluminio como un auxiliar suave. La preparación de la form ulación para estos experimentos de vacunación se describe en el Ejemplo 7. La formulación descrita en el Ejemplo 7 se inyectó de manera subcutánea en la espalda de cuatro monos rhesus (0.5 mg de HE2 = 0.5 ml por vacunación, administrados dos veces en un intervalo de cuatro semanas). Para la recuperación de suero, se tomó sangre en varios puntos en el tiempo. Ppmero, la respuesta inmune contra HE2 se determinó en un ELISA. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 8. Como se muestra en la Figura 8, ya pueden medirse títulos significativos de anticuerpos contra H E2 en el día 29. Adicionalmente, se investigó si los anticuerpos son inducidos por la vacunación , los cuales se unen a células KATO lll . Para estas pruebas, se usó un ELISA de células. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 9. Como se muestra en la Figura 9, los anticuerpos que se unen a células de tumor Kato lll positivas de Ep-CAM ya son inducidos en el día 29 en todos los animales. A continuación, se vacunaron cuatro animales con HE2 adsorbido a hidróxido de aluminio en relación con un estudio de toxicidad con monos rhesus. Otros cuatro monos rhesus recibieron hidróxido de alum inio como un placebo. La preparación de las formulaciones se describe en los Ejemplos 10 y 1 1 . En total, los monos rhesus se inyectaron de manera subcutáne a en la espalda cuatro veces con 0.5 ml de la formulación respectiva (agente efectivo o placebo) (días 1 , 15, 29 y 57). Para la recuperación de suero, se tomó sangre antes del inicio del estudio y a diferentes tiempos durante el tratamiento. Nu evamente, la respuesta inm une contra H E2 se determinó primero en un ELISA. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 8. Como se m uestra en la Figura 1 0, los cuatro monos rhesus del grupo H E2 desarrollaron una respuesta inmune humoral significativa contra HE2 ya después de una vacunación, la cual fue intensificada adicionalmente por la segunda vacunación, mientras que los monos rhesus del grupo de placebo no mostraron ningún incremento en el título de anticuerpos contra HE2. Estos hallazgos fueron confirmados de manera adicional mediante purificación por inmunoafinidad de los sueros del día 43 de los monos rhesus del grupo de HE2. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 1 2. Com se muestra en la sig uiente tabla, los cuatro monos han desarrollado una fuerte respuesta inm unede IgG contra HE2 (respuesta inmune secundaria) en su suero en el día 43, mientras que la porción de IgM es co mparable con aquélla de los pre-sueros.

También se investigó la inducción de anticuerpos contra células Kato l l l positivas de Ep-CAM. Nuevamente, se usó un ELISA de células para estas pruebas. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 9. Como se muestra de manera ejemplar en la Figura 1 1 , los monos rhesus del grupo de HE2 desarrollaron anticuerpos contra células Kato l l l ya en el d ía 29. En vista de los resultados descritos antes de la vacunación de cabras y monos rhesus, un paciente que sufre de cáncer intestinal con metástasis (Dukes D) se vacunó a continuación con MAB HE2, adsorbido a hidróxido de aluminio, en un caso anecdótico. La preparación de la formulación se describe en el Ejemplo 7. En total, el paciente fue inyectado cuatro veces (día 1 , 50, 78, 1 14) de manera subcutánea en las extrem idades superiores con 0.5 ml de esta formulación (corresponde a 0.5 mg de H E2) . Se tomó sangre para la recuperación de suero antes de cada vacunación y en el día 128. Primero, se investigó si los anticuerpos fueron inducidos por la vacunación, los cuales se unen a las células KATO l l l . Nuevamente se usó un ELISA de células para estas pruebas. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 9. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 12. Obviamente se indujeron altos títulos de anticuerpos, los cuales se unen a células KATO l l l , en este paciente de cáncer debido a la vacunación . Adicionalmente, se investigó si los anticuerpos inducidos por la vacunación con H E2 mediaron un efecto citotóxico contra células de cá ncer KATO l l l ex vivo. Para este fin, se incubaron células KATO l l l con pre- e inm unosueros de este paciente de cáncer, con el fin de demostrar una lisi s dependiente del complemento mediada por los anticuerpos inducidos. La descripción experimental está dada en el Ejemplo 1 3. Los resultados se muestran en la Figura 1 3. Los anticuerpos inducido s por la vacunación con HE2 son obviamente capaces de destruir células KATO l l l positivas de Ep-CAM vía lisis dependiente de complemento en suero de paciente autólogo. Los experimentos antes descritos de manera ejemplar, muestran que la vacunación con anticuerpos adecuados contra un TAA de auto-adhesión, tal como Ep-CAM, o sus derivados con el mismo idiotipo como los anticuerpos iniciales respectivos, dispara una respuesta inmune humoral, la cual se une selectivamente en células de tumor que expresan este TAA de auto-adhesión. Los anticuerpos inducidos pueden exhibir un potencial citotóxico contra tales células de tumor. Por lo tanto, una vacunación con tales anticuerpos puede conducir a un efecto terapéutico en enfermedades cancerosas.

Ejem plos Materiales usados: Placas de microtítulo: Immuno Píate F96 MaxiSorp (N unc) para ELISA Cell Culture Cluster (Costar; Cat. No. 3598) para ELISA de células Líneas de células: SW2: línea de carcinoma de pulmón de células pequeñas humana, positivas de Ep-CAM KATO l l l : l ínea de células de cáncer de estómago humana, positivas de Ep-CAM (ATCC HTB 103) WM9: línea de células de melanoma humana, negativas de Ep-CAM Amortiguador de acoplamiento: NaHCO3 0.1 M NaCI 0.5 M Valor de pH 8.0 Amortiguador de purificación A: PBS def NaCI 0.2 M Valor de pH 7.2 Amortiguador de purificación B: Glicina/HCI 0.1 M NaCI 0.2M Valor de pH 2.9 Medio A: RPMI 1640 + 2 g/l de NaHCO3 100 U/ml de penicilina G 1 00 µg/ml de sulfato de estreptomicina glutamina 4 mM suero de ternera fetal 1 0% (inactivado con calor) Amortiguador de unión: Na2CO3 15 mM NaHCO3 35 mM NaN3 3 mM Valor de pH: 9.6 PBS deficiente: NaCI 1 38 mM KH2PO4 1 .5 m M KCl 2.7 m M Na2HPO4 6.5 mM Valor de pH: 7.2 Solución fijadora: glutardialdeh ído 0.1 % en solución de NaCI fisiológica Amortiguador de lavado A: NaCI 2% Tritón X- 1 00 0.2% en PBS deficiente Amortig uador de lavado B: Tween 20 0.05% en PBS deficiente Amortig uador de bloqueo A: suero de ternera fetal 5% (inactivado con calor) en PBS deficiente Amortigu ador de bloqueo B: albúmina de suero bovino 1 % NaN3 0. 1 % en PBS deficiente Amortiguador de dilución A: suero de ternera fetal 2% (inactivado con calor) en PBS deficiente Amortiguador de dilución B: PBS deficiente Amortiguador de manchado: ácido cítrico 24.3 m M Na2HPO4 51 .4 mM Valor de pH : 5.0 Substrato 40 mg de dihidrocloruro de o-fenilen diamina 100 ml de amortiguador de manchado 20 µl de H2O2 (30%) Solución de paro: H2SO4 4 N Ejem plo 1 : Se centrifugan células SW2 cultivadas in vitro y la pella es suspendida en Medio A y se ajusta a 7x104 células/ml. En las cámaras de un LabTek, ya sea se mezcla 0. 1 ml de PBS def con 0.3 ml de la suspensi ón celular, o 0.1 ml de PBS def se mezcla con 40 µg de HE2 y 5 entonces, con 0.3 ml de la suspensión ceular (concentración final de HE2 1 00 µg/ml). Justo antes de que se adicione la suspensión celular como el último constituyente, las células se separan con la pipeta. I nmediatamente después del mezclado, las suspensiones de células respectivas son fotografiadas en el microscopio invertido (aumento de 1 00 veces). I O Subsecuentemente, las suspensiones de células se cultivan durante 4 horas a 37°C / CO2 5% y entonces son fotografiadas nuevamente.

Ejemplo 2: Dos cabras son vacunadas de manera intradérm ica en múltiples I5 sitios con 1 .5 mg del fragmento F(ab)'2 en 3 ml de PBS deficiente, junto con 3 ml de auxiliar completo de Freund (Difco) . En el día 8, se proporciona una primera vacunación de refuerzo, pero con auxiliar incompleto de Freund (Difco). En el d ía 29, se proporciona una segunda vacunación de refuerzo en la misma manera. Sin embargo, no se adiciona 0 auxiliar. La sangre es tomada antes del inicio de la vacunción y en el día 54 para la recuperación de suero para el análisis de la respuesta inmune desarrollada .

Ejemplo 3: Al ícuotas de 100 µl de MAB HE2 (solución con 10 µg/ml de amortig u ador de unión) son incubadas en las cavidades de una placa de microtítu lo durante 1 hora a 37°C. Después de lavar la placa con amortiguador de lavado A seis veces, se adicionan 200 µl del amortiguador de bloq ueo A a cada cavidad y la placa es incubada durante 30 minutos a 37°C. Después de lavar la placa como se describe antes, se incuban al ícuotas de 1 00 µl de los sueros de cabra a ser probados en diluciones de 1 : 100 hasta 1 : 1 000 000 en amortiguador de dilución A durante 1 hora a 37 °C. Después de lavar la placa como se describe antes, se adicionan 100 µl del anticuerpo Ig anti-cabra de conejo, conjugado con peroxidasa (Zymed) a cada cavidad en una dilución de 1 : 1000 en amortiguador de dilución a y se incuban durante 30 minutos a 37°C. La placa se lava con amortiguador de lavado A durante cuatro veces y dos veces con amortiguador de manchado. La unión del anticuerpo es detectada mediante adición de 1 00 µl del substrato específico para cada cavidad y la reacción de manchado es detenida después de aproximadamente 10 minutos mediante adición de 50 µl de solución de paro. La evaluación es real izada al medir la densidad óptica (OD) a 490 nm (longitud de onda de la medición de referencia es 620 nm).

Ejem plo 4: Las cavidades de una placa de microtítulo fueron incubadas a +4°C durante la noche con 1 00 µl de una suspensión de células de la línea de base a ser probada a una concentración de 2x106 células/ml en medio A. Después d e succionar el sobrenadante, la placa es incubada con 50 µl de solución fijadora por cavidad durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de succionar el sobrenadante, se adicionan 200 µl de amortig uador de bloqueo B a cada cavidad y la placa es incubada durante 1 hora a 37°C. Después de lavar dos veces con 200 µl de amortiguador de lavado B, se incuban alícuotas de 1 00 µl de los sueros de cabra a ser probados durante 1 hora a 37°C a diluciones de 1 : 1 0 hasta 1 : 1 00 000 en amortiguador de dilución B. Después de lavar la placa dos veces con 1 00 µl de amortiguador de lavado B helado, se adicionan 1 00 µl del anticuerpo de Ig anti-cabra de conejo conjugado con peroxidasa (Zymed) a una di lución de 1 : 1 000 en amortiguador de dilución A, y se incuban durante 45 m inutos a 37°C. La placa se lava tres veces con 1 00 µl de amortiguador de lavado B helado. La unión del anticuerpo es detectada mediante la adición de 1 00 µl del substrato específico por cavidad y la reacción de manchado es detenida después de aproximadamente 10 minutos mediante la adición de 50 µl de solución de paro. La evaluación es realizada al medir la densidad óptica (OD) a 490 nm (la longitud de onda de la medición de referencia es 620 nm).

Ejemplo í¡ : La purificación es descrita principalmente en Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 81 :21 6, 1 984 y se resume como sigue: en un primer paso, una purificación de la IgG total contenida en el suero de cabra es realizada de acuerdo con métodos conocidos en una columna de intercambiador de aniones DEAE. Subsecuentemente, los anticuerpos de cabra que son dirigidos contra regiones constantes del fragmento F(ab)'2 de HE2, están unidos a una columna de inmunoafinidad (CH-Sepharose 4B, Pharmacia) a la cual se acopló lgG2a de murino irrelevante, mientras que la fracción de los antic uerpos de cabra anti-idiotípicos no se une a esta columna. Por lo tanto, en un último paso, el flujo a través de esta cromatografía por inmunoafinidad se une a una columna de inmunoafinidad (CH-Sepharose 4B, Pharmacia) a la cual se acopló HE2. La fracción unida de manera específica a esta columna es levigada con un pH amortiguador de 2.8 (glicina/HCI 0. 1 M) y es neutralizada. La fracción de IgG de cabra obtenida en esta forma es dirigida contra el idiotipo de HE2.

Ejemplo 6: Este ELISA de células se realiza básicamente en la misma manera que como se describe en el Ejemplo 4. En lugar de diluciones de suero, se usan concentraciones de 100 µg/ml a 0.031 µg/ml de la IgG de cabra purificada por inmunoafinidad y de la IgG de cabra purificada no específica , respectivamente.

Ejemplo 7: Se agita cuidadosamente 0.83 ml de una suspensión de Alu-Gel (Alu-Gel S por Serva , suspensión al 2% , grado de calidad: auxiliar para la preparación de vacunas), durante 1 hora a temperatura ambiente bajo condiciones estériles con 0.5 ml de una solución de 10 mg/ml de HE2 en PBS pH 5.5 , junto con 3.67 ml de PBS def. (concentración final de H E2: 1 mg/ml; Alu-Gel S: 0.33%). Entonces, la suspensión es llenada de manera estéril en f rascos de inyección en alícuotas de 0.5 ml. 3 Ejemplo 8: Este ELISA se realiza básicamente en la misma manera como se describe en el Ejemplo 3, con la excepción de que se usa un anticuerpo de Ig humana anti-cabra, conjugado con peroxidasa (Zymed), para la detección de los anticuerpos de monos rhesus unidos. Con este reactivo, los anticuerpos de monos rhesus pueden ser detectados en la misma manera que anticuerpos humanos, debido a que la homología de secuencia de ias regiones constantes de anticuerpos humanos y anticuerpos de monos rhesus es aproximadamente 98% .

Ejem plo 9: Este ELISA de células se realiza básicamente en la misma manera como se describe en el Ejemplo 4, con la excepción de que se usa un anticuerpo de Ig humano anti-cabra, conjugado con peroxidasa (Zymed) para la detección de ios anticuerpos de monos rhesus (o los anticuerpos humanos) , los cuales se unen a las células. Un anticuerpo de IgG antiratón de cabra, conjugado con peroxidas (Zymed) se usa para la detección de HE2 de murino como un control Ejem plo 10: 3.5 ml de una solución de HE2 (1 0 mg/ml en PBS def. pH = 5.5), se mezcla n bajo condiciones estériles con 0.35 ml de una solución acuosa de timerosal (10 mg/ml; Sigma), así como con 27.25 ml de solución salina fisiológica y se adicionan a 3.9 ml de una suspensión de hidróxido de aluminio (3% en agua; Alhydrogel, Superfos Biosector, Dinamarca) bajo agitación cuidadosa. Entonces, 0.6 ml de la suspensión obtenida de esta manera se llenan en tubos de vidrio depirogenado bajo condiciones estériles, los cuales son sellados con un tapón de hule con una tapa de aluminio.

Ejemplo 1 1 : La formulación de placebo es preparada en la misma manera como se descpbe en el Ejemplo 1 0, con la excepción de que se usa 0.35 ml de solución de NaCI fisiológica en lugar de la solución de anticuerpo y 3.5 ml de PBS def, pH = 5.5 en lugar de la solución de timerosal.

Ejemplo 12: Se suspende 1 g de CH-Sepharose 4B (Pharmacia) en 30 ml de HCl 1 M durante 15 minutos. Entonces el gel es lavado en un filtro de vidrio sinterizado AG3 con 1 litro de HCl 1 mM y subsecuentemente con 200 ml de amortiguador de acoplamiento. Se someten a diálisis 10 mg de HE2 (solución madre de 10 mg/ml) contra aproximadamente 0.5 I de amortiguador de acoplamiento. Esta solución se mezcla con la suspensión de gel en un recipiente sellado. Una proporción de gel: amortiguador de 1 :2 , conduce a una suspensión adecuada para el acoplamiento. Esta suspensión es agitada durante 5.5 horas a temperatura ambiente.

Subsecuentemente, el exceso del ligando es removido al lavar con 3 x 30 m l de amortiguador de acoplam iento. Los grupos reactivos restantes son bloq ueados por una incubación de 1 hora a temperatura ambiente con etanolamina 1 M. El gel es agitado entonces durante 1 hora a temperatura ambiente con amortiguador Tris-HCl 0.1 M, pH = 8. Finalmente, el gel es lavado con 3 ciclos de amortiguadores con pH alternante. Cada ciclo consiste de amortigaudro de acetato de sodio 0.1 M, pH 4, con NaCI 0.5 M, y subsec uentemente amortiguador Tris-HCl 0.1 M, pH 8, con NaCI 0.5 M. El gel es mantenido a 4°C. La purificación por inmunoafinidad de la fracción de anticuerpo dirigida contra HE2 del suero de los monos rhesus, se realiza de acuerdo con las siguientes instrucciones: la purificación por inmunofinidad es realizada en el sistema FPLC (Pharmacia). 1 ml del gel obtenido de acuerdo con las instrucciones anteriores se llena en una columna HR5/5 de Pharmacia . 0.5 ml de suero se diluye 1 : 1 0 con amortiguador de purificación A. Esta solución es bombeada sobre la columna a una velocidad de 1 ml/minuto y se lava con amortiguador de purificación A hasta que la línea de base de UV del detector es alcanzada nuevamente (280 nm) . Las inmunoglobulinas unidas son levigadas entonces con amortiguador de purificación B y la fracción es neutralizada inmediatamente después de la desorción con Na2HPO4 0.5 M y se adiciona 0.02% de NaN3. 50 µl de ia fracción de anticuerpo purificada en esta manera se analizan en una columna de fraccionamiento de tamaño (SEC, Zorbax 250 GF) y las porciones de IgG e IgM son cuantificadas. Para el S EC, se usa amortiguador de fosfato 220 mM, pH 7 + 1 0% de acetonitrilo, como un levigante. IgG humana e IgM humana sirven como estándar para SEC , las cuales fueron cromatografiadas cada una en varías concentraciones para estabilizar una curva de calibración estándar (área pico vs. concentración). El cálculo de las concentraciones de IgG e IgM en las fracciones de anticuerpo purificadas por afinidad de monos rhesus, se realizó mediante regresión lineal usando las curvas estándares. Las concentraciones son indicadas como µg/ml del suero de mono usado.

Ejemplo 13: Un día antes de realizar la prueba, se transfirieron células KATO lll a medio A fresco y se mantuvieron a 37°C/CO2 5% en un matraz de cultivo celular. Al siguiente día, las células se marcaron primero con 51 cromo. 5x 106 células se incubaron en 800 µl de medio A a 37°C/CO2 5% con 100 µCi de Na251CrO4. Subsecuentemente, las células se lavaron con medio a y se ajustaron a una densidad de 2.5x105 células/ml. Alícuotas de 100 µl de esta suspensión celular son pipeteadas en las cavidades de una placa de microtítulo. Alícuotas de 100 µl de los sueros del paciente a ser probados son adicionadas e incubadas durante 3 horas a 37°C/CO2 5% (los sueros son almacenados a -80°C y entonces se descongelaron solo una vez para este ensayo, con el fin de evitar dañar la actividad del complemento). Los sobrenadantes son recuperados al usar una Skatron-Harvesting-Press y se miden en un contador gamma. Como resultado, se obtienen los valores para la "liberación experimental". Para la determinación de la "liberación total", las células son tratadas como se describe antes, en donde el suero es reemplazado por una solución de SDS al 2% , Na2CO3 50 mM y EDTA 10 mM . Los valores para la "liberación espontánea" son obtenidos al reemplazar suero por medio A. El resultado es calculado como sigue: % de lisis = liberación experimental - liberación espontánea x 100 liberación total - liberación espontánea La prueba es realizada 3 veces y se indican el valor promedio y la desviación estándar de los resultados simples.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> IGENEON GmbH <120> USO DE ANTICUERPOS PARA VACUNACIÓN ANTI-CANCER <130> I) 2923 PCT <140> <141> <160> 2 <170> Patente en liberación Ver. 2.1 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu lie Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Val lie Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 107

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1 . El uso de un anticuerpo, el cual es dirigido contra el antígeno de membrana celular Ep-CAM para la preparación de una composición farmacéutica para la vacunación profiláctica y/o terapéutica contra el cáncer.

2. El uso de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo es de origen animal.

3. El uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. El uso de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de murino, en donde la región variable de la cadena pesada es la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 , y en donde la región variable de la cadena ligera es la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:2.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo tiene la misma buena espeficidad de unión que el anticuerpo como se define en la reivindicación 4.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dos o más anticuerpos, los cuales son dirigidos contra diferentes epitopes del antígeno de membrana, se usan en combinación unos con otros.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición farmacéutica comprende además también al menos un auxiliar de vacuna .

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la composición farmacéutica es adecuada para la administración del anticuerpo a una dosificación en el rango de 0.01 a 4 mg de anticuerpo.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composición farmacéutica es adecuada para la administración mediante inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular.