MXPA99006453A - Metodo de purificacion de adn en una centrifuga de flujo cruzado - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para purificar ADN extracromosómico al hacer pasar un ADN eztracromosómico y un fluido que contiene componentes celulares adicionales a través de una centrífuga de flujo cruzado bajo condiciones dadas, dando como resultado la separación del ADN extracromosómico a partir de los otros componentes celulares tal que se obtiene el ADN extracromosómico purificado. L a invención se refiere además al uso del ADN extracromosómico purificado para la clonación, transformación, transfección y microinyección dentro de células, para el uso en procesos de terapia génica, vacunación con ADN y/o para la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La invención se refiere finalmente al uso de una centrífuga de flujo cruzado para purificar ADN extracromosómico.

Description

MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE ADN EN UNA CENTRIGUGA DE DE FLUJO CRUZADO Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un proceso para la purificación de ADN extracromosómico utilizando una centrifuga de flujo continuo. El aislamiento de los ácidos nucleicos y en particular del ADN plasmídico es de importancia principal en la biología molecular y en la medicina moderna. El ADN plasmídico se refiere a las moléculas dobles de ADN extracromosómico las cuales usualmente tienen un tamaño de 1 kb hasta as de 200 kb, y están presentes en las células huésped en uno a varios cientos de copias. El ADN plasmídico es usualmente amplificado en células por ejemplo en bacterias gram-negativas, en particular en E. coli. Después de lo cual las células son. lisadas y el ADN plasmídico es aislado de ellas. El ADN plasmídico aislado puede ser luego utilizado para aplicaciones de biología molecular o aplicaciones médicas, por ejemplo para construir vectores de clonación, para transformar células procarióticas y para transfectar células eucarióticas. Son conocidos diversos métodos REF.: 30716 para lisar las células y para aislar el ADN plasmídico (ver J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) . En un proceso desarrollado por Birnboim y Doly para el aislamiento de ADN plasmídico a partir de células (Birnboim y Doly, Nucí. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523) la biomasa es lisada con una solución de NaOH/detergente y subsecuentemente el valor del pH es ajustado a_ aproximadamente 5.0 con acetato de potasio. Se forma un precipitado en este proceso que contiene principalmente ADN genómico y fragmentos de la pared celular. Con el fin de separar estas impurezas, la suspensión es transferida hacia cubetas de centrífuga. El precipitado es luego centrifugado con una centrífuga de cubetas con el fin de obtener el sobrenadante que contiene el ADN plasmídico. Las centrífugas son también comúnmente utilizadas en procesos de fermentación con el fin de separar por ejemplo los sobrenadantes del fermentador a partir de las células y los fragmentos celulares. Las centrífugas con tamiz y centrífugas de pared fija son usualmente utilizadas para este propósito (ver Gerhartz W., Enzymes in industry: production and applications, 1990, VHC, Weinheim, Alemania, capítulo 3.2.1) . Con las centrífugas comunes para laboratorio el volumen que puede ser procesado es limitado por el volumen del rotor y las cubetas o tubos del rotor, a menos de diez litros (por ejemplo la centrífuga Sorvall, rotor GSA, 6 x 250 ml ) . De aquí que este proceso pueda ser únicamente utilizado para aislar el ADN plasmídico en pequeñas cantidades. Una aplicación del método a procesos a gran escala es muy problemático, debido al volumen limitado de la centrífuga . Se pueden procesar grandes volúmenes por medio de centrífugas de flujo continuo. La Patente Internacional WO92/12780 describe un diseño técnico de una centrífuga de flujo continuo y su uso para la separación de mezclas de macromoléculas. En este proceso se preparan por ejemplo cuatro proteínas estándares en un sistema acuoso de dos fases a un máximo de 1,000 rpm, dependiendo de los coeficientes de distribución respectivos de las proteínas. Los componentes de la mezcla son obtenidos y separados uno del otro como resultado de las diferencias en los tiempos de elución.

No obstante, la demanda para el ADN plasmídico purificado para aplicaciones analíticas y terapéuticas en la investigación y medicina, es cada vez mayor debido al uso muy difundido de los métodos de biología molecular. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención fue el proporcionar un proceso que haga posible una purificación eficiente y rápida del ADN plasmídico en grandes cantidades. Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un proceso para la purificación de ADN extracromosómico, el cual está caracterizado porque un ADN extracromosómico que contiene líquido y otros componentes celulares, se hace pasar a través de una centrífuga de flujo continuo bajo condiciones que conducen a una separación del ADN extracromosómico, a partir de los componentes celulares insolubles y el ADN extracromosómico purificado, es aislado. En la técnica anterior, han sido utilizadas centrífugas de flujo continuo únicamente para la separación de células. Se encontró ahora soprendentemente que las centrífugas de flujo continuo pueden también ser utilizadas para purificar ADN extracromosómico en grandes cantidades, sin daño al ADN extracromosómico por las fuerzas de corte resultantes. Fue también sorprendente que el ADN cromosómico presente en la suspensión de las células lisadas no sea fragmentado durante la centrifugación de flujo continuo, y pueda de este modo ser separado de manera cuantitativa del ADN extracromosómico. El ADN extracromosómico que es purificado por el método de acuerdo a la invención puede ser lineal o circular, de hebra simple o de hebra doble. El ADN es preferentemente un ADN plasmídico circular y de doble hebra. La célula que contiene el ADN extracromosómico puede ser una célula procariótica o eucariótica; ésta es preferentemente una célula bacteriana y en particular una célula gram-negativa tal como una célula de E. coli. Opcionalmente, pueden ser utilizadas células que contienen los denominados cromosomas artificiales como ADN extracromosómico. Los cromosomas artificiales son moléculas de ADN lineales de doble hebra, las cuales son en general llamadas YAC (cromosoma artificial de levadura) y son amplificadas en células de levadura. El líquido que contiene el ADN extracromosómico que es utilizado en el proceso de acuerdo a la invención es preferentemente un lisado celular. El lisado celular es particularmente y de manera preferida preparado mediante lisis alcalina de las células que contienen el ADN extracromosómico y la acidificación subsecuente. No obstante, es también posible utilizar otros métodos comunes de lisis celular tales como una combinación de enzima (lisozima) y tratamiento térmico. Puede ser utilizada cualquier cantidad deseada de biomasa celular como un material inicial para el proceso de acuerdo a la invención. Una biomasa de 100 g a 50 kg es preferentemente lisada por lote . - El líquido que contiene el ADN extracromosómico se hace pasar usualmente hacia una centrífuga de flujo continuo por un gradiente y/o bombas. En el proceso de acuerdo a la invención se utiliza una centrífuga de flujo continuo con un volumen adaptado a la preparación de lisis. Se utiliza preferentemente un volumen de al menos 0.1 a 50 litros y un volumen de 0.2 a 4 litros es particularmente preferido. El recipiente para centrífuga es preferentemente cilindrico. La centrífuga de flujo continuo es operada a un número g adecuado, preferentemente a 10,000 hasta 40,000 x g. Los ejemplos de centrífugas de flujo continuo comercialmente disponibles son las centrífugas rápidas CEPA o las centrífugas de alto rendimiento de Carr Company (Estados Unidos), las cuales a la fecha tienen una capacidad de hasta 9,000 litros/hora. El proceso de acuerdo a la invención es en general llevado a cabo de manera continua. La suspensión de la biomasa lisada se hace pasar hacia la centrífuga de flujo continuo desde abajo. Como resultado de la rotación del recipiente de la centrífuga (10,000 - 40,0000 x g) los componentes sólidos tales como los componentes de la pared celular y el ADN genómico acoplado a ésta son depositados sobre la pared del recipiente para centrífuga. La solución que contiene el ADN extracromosómico purificado pasa usualmente fuera "de la parte superior de la centrífuga de flujo continuo, aunque es también concebible que la solución que contiene el ADN extracromosómico fluya fuera de los lados, el fondo u otras posiciones. La centrífuga de flujo continuo puede ser operada a diferentes temperaturas; el proceso es preferentemente llevado a cabo a 4°C hasta la temperatura ambiente. En el presente proceso es posible purificar el ADN extracromosómico de diferentes tamaños; preferentemente, se purifica ADN extracromosómico con un tamaño de 1 kpb hasta 200 kpb. El ADN extracromosómico es preferentemente ADN plasmídico lineal, circular o superenrollado . Después de abandonar la centrífuga el ADN extracromosómico puede ser adicionalmente purificado. Por lo tanto, se lleva a cabo opcionalmente un tratamiento con ARNasa, con el fin de eliminar el ARN de la solución. Además, es también posible llevar a cabo los pasos de purificación cromatográfica tales como la cromatografía de intercambio aniónico, la cromatografía de afinidad o la cromatografía con hidroxiapatita. Los ejemplos de materiales adecuados para la cromatografía de intercambio aniónico son polímeros orgánicos o inorgánicos y copolímeros tales como el polimet-acrilato (Macroprep-Biorad, Alemania), poliestireno-divinilbenceno (Poros-Perseptive, HyperD-Biosepra, Source Pharmacia) o gel de sílice sobre la superficie del cual se enlazan grupos cargados positivamente tales como dietilaminoetilo (DEAE) o dimetilaminoetilo (DMAE) . Un material particularmente preferido para la cromatografía de intercambio aniónico es Q-Sepharose. Un material particularmente preferido para la cromatografía de afinidad es la hidroxiapatita. Además, la solución de ADN que es obtenida puede ser sujeta a una filtración de flujo cruzado para la purificación adicional, concentración y/o reamortiguamiento. En esta filtración de flujo cruzado es también posible lograr una eliminación substancial de las endotoxinas provenientes de la preparación de ADN. Para esto la solución de ADN es guiada tangencialmente más allá de una o varias membranas semipermeables cuyo tamaño de exclusión es elegido tal que las moléculas de ADN son retenidas por las membranas y las substancias con un peso molecular más bajo pueden pasar a través de las membranas para obtener una solución de ADN libre de endotoxinas . El ADN extracromosómico obtenido mediante el proceso de acuerdo a la invención permanece esencialmente sin daño y no tiene esencialmente rompimiento de hebra simple o de doble hebra. En particular, un ADN plasmídico purificado de acuerdo a la invención muestra únicamente una banda dominante después de la separación mediante electroforesis en gel, la cual corresponde a la conformación del 'circulo covalentemente cerrado". Además, no existen otras bandas además de las bandas correspondientes al circulo abierto y a las conformaciones del circulo linearizado .

El ADN obtenido mediante el proceso de acuerdo a la invención puede ser utilizado directamente para aplicaciones estándares de biología molecular y aplicaciones médicas, tales como para la clonación, para la transformación, para la transfección, para la microinyección de células, para el uso en métodos de terapia génica, para vacunación con ADN y/o para la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una centrífuga de flujo continuo para purificar ADN extracromosómico.

Ej emplo En el experimento se utiliza una centrífuga para laboratorio CEPA, LE (diseño abierto) con un cilindro de clarificación elaborado de acero inoxidable (1.4571, V4A) . Se lisan aproximadamente 2000 g de biomasa mediante el método de lisis alcalina (método modificado de acuerdo a Birnboim y Doly, Birnboim y Doly, Nucí. "Acid Res. 7 (1979) 1513-1523) . 1. Lisis de la biomasa E. coli 2000 g de biomasa de E. coli húmeda proveniente del fermentador es llenada dentro de los recipientes despirogeni zados . Se agregan 22.5 litros de amortiguador de resuspensión (50 mmol/1 Tris-HCl, 10 mmol/l de EDTA-Na2, pH 8 + 0.2) y se agita lentamente (aproximadamente 35 rpm) por al menos 24 horas 5 ± 4°C hasta que la biomasa está completamente suspendida. Luego la temperatura de la suspensión se incrementa lentamente hasta 25°C. Se agregan a la suspensión 22.5 litros 0.2 mol/1 de NaOH, SDS al 1%, mientras que se agita a aproximadamente a 80 rpm, y se incuba por 5 minutos a 25°C. Se agregan 22.5 litros de amortiguador de acetato de potasio (3 mol/1 de amortiguador de acetato de potasio pH 5.5) mientras que se mantiene la agitación, y la temperatura de la biomasa se reduce tan rápidamente como sea posible hasta 4°C. El lisado que se obtiene se aclara por filtración con la ayuda de una centrífuga de flujo continuo en el modo continuo de flujo de lado a lado. 2. Centrifugación a flujo continuo La suspensión viscosa es bombeada hacia la centrífuga de flujo continuo a través de la abertura de entrada. Durante este periodo la centrífuga es operada a un número g de 10,000 - 18,000 x g. Tan pronto como el líquido que fluye hacia afuera se vuelve turbio, el precipitado debe ser retirado del cilindro y la centrifugación es continuada después de la inserción del cilindro limpio. La solución clara de ADN plasmídico que ha sido liberada de las impurezas celulares emerge de la parte superior de la centrífuga de flujo continuo y es recolectada en un recipiente . 3. Pasos de purificación adicional: Cromatografía en Q-sepharose, cromatografía en hidroxiapatita y filtración de flujo cruzado En un paso subsecuente se lleva a cabo una cromatografía sobre Q-sepharose e hidroxiapatita. El sobrenadante decantado de la centrífuga es ajustado a una conductividad de 49 - 50 mS/cm mediante la adición de amortiguador TE (10 mmol/1 de Tris-HCl, 1 mmol/1 de EDTA pH 8.5 ± 0.2) y se enfría a 5 ± 4°C. La cromatografía completa es llevada a cabo a esta temperatura. El sobrenadante de la centrifugación es absorbido sobre la columna equilibrada. Subsecuentemente, la columna se lava con aproximadamente 8 CV 10 mmol/1 de Tris-HCl, 1 mmol/1 de EDTA, 0.65 mol/1 de NaCl pH 8.5 ± 0.2. Para la elución se aplica un gradiente (amortiguador A 5 CV (10 mmol/1 de Tris-HCl, 1 mmol/1 de EDTA, 0.65 mmol/1 de NaCl, pH 8.0 ± 2 ) , 5 CV de amortiguador B (10 mmol/1 de Tris-HCl, 1 mmol/1 de EDTA, 0.85 mol/1 de NaCl pH 8.0 ± 0.2 ) ) a la columna y el eluido se fracciona, la detección se lleva a cabo a 254 nm. El prepico (impurezas) se separa del pico principal (ADN plasmídico) mediante recolección del pico principal en un recipiente separado, comenzando a partir del flanco ascendente. Subsecuentemente, se lleva a cabo una cromatografía sobre hidroxiapatita (cerámica HA) a 5 ± 4°C. Amortiguador de equilibrio: 0.1 mol/1 de fosfato de potasio, 6 mol/1 de urea pH 7.0 ± 0.2. Amortiguador 1 de lavado: 0.15 mol/1 de fosfato de potasio, 6 mol/1 de urea pH 7.0 ± 0.2.

Amortiguador 2 de lavado: 0.02 mol/1 de amortiguador de fosfato de potasio pH 7.0 ± 0.2. Amortiguador de elución: 0.5 mol/1 de fosfato de potasio pH 7.0 ± 0.2. La detección se lleva a cabo a 254 nm utilizando una unidad detectora/regis tradora de UV . Se utiliza una solución de 1% de producto (ADN plasmídico) como una solución de calibración que fue medida con un fotómetro calibrado. El combinado de Q-sepharose se ajusta a una concentración final de 1.1 mmol/1 de cloruro de calcio y se absorbe sobre la columna equilibrada. Luego la columna es sucesivamente lavada con : 1. 0.1 mol/1 de fosfato de potasio, 6 mol/1 de urea pH 7.0 ± 0.2 hasta que la absorbancia ya no es detectable en el detector. 2-4 CV, 0.15 mol/1 de fosfato de potasio, 6 mol/1 de urea pH 7.0 ± 0.2 5 CV, 0.02 mol/1 de fosfato de potasio pH 7.0 ± 0.2. Ésta se eluye con 0.5 mol/1 de amortiguador de fosfato de potasio pH 7.0 ± 0.1 después de los pasos de lavado a una velocidad de flujo de 5-6 CV/hora . El pico es combinado y concentrado hasta aproximadamente 50 ml con una filtración de flujo cruzado. Se lleva a cabo la CFF a una velocidad de flujo del retenido de 100-200 l/h»m2, una presión transmembranal de aproximadamente 0.8 barias y una presión de flujo cruzado de aproximadamente 1.2 barias. El retenido es subsecuentemente diafiltrado por flujo contra el amortiguador TE (10 mmol /l de Tris-HCl, 1 mmol/1 de EDTA, pH 8.0 hasta que los valores para el pH y la conductividad del retenido y del amortiguador de TE están en concordancia. Después de la terminación del proceso de diafiltración, el retenido es ajustado a una concentración de ADN plasmídico de 1 mg/ml mediante dilución con amortiguador de diafiltración. 4. Electroforesis en gel La calidad de intacto del ADN plasmídico que fue obtenido se verifica por medio de electroforesis en gel de agarosa. Para esto se aplica una alícuota del ADN plasmídico a diversas concentraciones a un gel de agarosa. El gel de agarosa ilustrado en la figura 1 muestra la longitud del ADN estándar No. II (tamaños de fragmentos: 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 pb) en las bandas 1 y 10 y el estándar No. III de longitud de ADN (tamaños de fragmentos: 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3530, 4268, 4973, 5148, 21226 pb ) en las bandas 2 y 9. pBR322 (4162 pb) se aplica como un plásmido de referencia en la banda 3, la cual se purificó mediante un método convencional de gradiente en cloruro de cesio. Se sabe que el ADN plasmídico purificado mediante este método contiene esencialmente ADN plasmídico que corresponde a la conformación en círculo covalentemente cerrado (banda superenrollada dominante) . El ADN plasmídico (pCMV-CAT) purificado mediante el método de acuerdo a la invención es aplicado a diferentes cantidades en las bandas 4, 5 y 6. Este ADN plasmídico fue posteriormente purificado después del proceso de acuerdo a la invención, por medio de cromatografía en Q-sepharose e hidroxiapatita, y mediante filtración por flujo cruzado .

Leyenda : Gel de agarosa al 1% Banda 1: Estándar de longitud de ADN II (Boehringer Mannheim GmbH; Cat. No. 236250) Banda 2: Estándar de longitud de ADN III (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 528552) Banda 3: pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 481238) (0.4 µg) Banda 4: pCMV-CAT después de CFF, 0.19 µg (solución de substancia activa a granel) Banda 5: pCMV-CAT después de CFF, 0.45 µg (solución de substancia activa a granel) Banda 6: pCMV-CAT después de CFF, 0.71 µg (solución de substancia activa a granel) Banda 7: amortiguador TE Banda 8: pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 481238) (0.4 µg) Banda 9: estándar de longitud de ADN III (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 528552) Banda 10: estándar de longitud de ADN II (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 236250) .

El ADN plasmídico purificado de acuerdo a la invención, como el ADN plasmídico de referencia (banda 3), muestra esencialmente una banda dominante. Esto muestra que el ADN plasmídico, aislado de acuerdo a la invención, no es dañado y conserva su conformación original. Además de la ausencia de bandas adicionales en el gel de agarosa, muestra que el ADN cromosómico contenido en la suspensión de células usadas no es fragmentado durante la centrifugación de flujo continuo, pero puede ser completamente separado como una macromolécula precipitada proveniente del ADN plasmídico.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (12)

1. RE I INDI CACI ONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: .- Proceso para la purificación de ADN extracromosómico, caracterizado porque un líquido que es un lisato celular, que contiene AD? extracromosómico y otros componentes celulares, se hace pasa a través de una centrifuga de flujo continuo operada a una aceleración de 10,000 a 40,000 x g sin pasos de centrifugación anteriores en un proceso continuo y se mantienen las condiciones que tienden a la separación de AD? extracromosómico de componentes celulares insolubles y el AD? extracromosómico purificado se aisla. 2.- Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la lisis es una lisis alcalina. 3. - Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores , caracterizado porque la célula que contienen AD? extracromosómico es una célula bacteriana, preferentemente una célula de E.Coli. 4.- Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase líquida en la centrifuga se obtiene al lisar de lOOg- 50 kg de biomasa. 5._ Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el liquido que contiene AD? extracromosómico se hace pasar en la centrífuga de flujo continuo por medio de un gradiente y/o de bombas . ß . - Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usa una centrífuga de flujo continuo cuyo recipiente centrífugo tiene un volumen de cuando menos 0.1-50 1. 7. - Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usa una centrífuga de flujo continuo cuyo recipiente centrífugo tiene un volumen de cuando menos 0.2-4 1. 8. - Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tamaño del ADN extracromosómico es de 1 pba 200 pb. 9. - Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ADN extracromosómico es ADN de plásmido lineal, circular o superespiral . 10.- Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución que contiene ADN extracromosómico purificado puede purificarse adicionalmente. 11.- Proceso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque una etapa de purificación adicional consiste de una cromatrografia de intercambio aniónico, una cromatografía de afinidad, una cromatografía de hidroxiapatita, un tratamiento con RNasa y/o una filtración de flujo cruzado. 12.- Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se aisla un ADN extracromosómico que no tiene rupturas en las librasr esenciales . Uso de un ADN extracromosómico de acuerdo con una de flas reivindicaciones anteriores para clonar, transformar, transinfectar, microinyección en células, para usarse en métodos de terapia génica y/o para la reacción en cadana d polimerasa (PCR) . Uso de una centrífuga de flujo continuo para purificar ADN extracromosómico .