MXPA97001783A - Proteinas c3 humanas modificadas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de trayectoria de complemento nativas modificadas, de tal manera que la proteína es capaz de formar una convertasa C3 estable. De preferencia, la proteína modificada es una proteína C3 humana modificada. También se proporcionan secuencias de ADN que codifican estas proteínas, junto con construcciones de ADN. También se describen conjugados que comprenden a estas proteínas y una fracción fijadora específica, por ejemplo un anticuerpo, asícomo usos de estas proteínas y/o conjugados en terapia.

Description

PROTEÍNAS C3 HUMANAS MODIFICADAS La presente invención se refiere a nuevas proteínas modificadas capaces de formar convertasas C3 estables, a secuencias de ADN que codifican dichas proteína y al uso de dichas proteínas como agentes terapéuticos, particularmente para su uso en niveles de agotamiento de proteínas de trayectoria del complemento. El sistema del complemento funciona en la respuesta inmune de humanos y otros vertebrados, siendo de gran importancia en las funciones de efectores como fagocitosis, citólisis y reclutamiento de cél?.las que inducen respuestas inflamatorias locales [15] . Estas propiedades son deseables para la eliminación de patógenos invasores, como bacterias, pero indeseables cuando se desencadenan para actuar contra tejidos huésped (por ejemplo en lesión por reperfusión post-isquémica [3] ) o contra material terapéutico extraño (por ejemplo, rechazo hiperagudo de xenoinj ertos [7] ) . Se han hecho intentos por eliminar estas propiedades indeseables mediante la explotación de derivados de proteínas reguladoras del complemento cuya función normal es suprimir la activación del complemento [10, 18] . El sistema del complemento comprende proteínas tanto en la superficie de células, (receptores y reguladores) así como en la fase de fluidos (plasma sanguíneo y otros ambientes extracelulares) . El paso crítico para la generación de respuestas en la conversión proteolítica de C3 a los fragmentos C3b y C3a. C3a es una anafilatoxina que, al igual que C5a, atrae células cebadas al sitio de estimulación, lo cual da como resultado la liberación local de histamina, vasodilatación y otros efectos inflamatorios. El C3b naciente tiene la capacidad de fijarse a las superficies circundantes al su sitio de generación. Así, este C3b enfoca el ataque por los componentes citolíticos del complemento (C5-C9) . El C3b fijado a superficie, asi como sus productos de degradación, también funcionan como ligandos para receptores C3 mediando, por ejemplo, la fagocitosis [15]. Existen dos distintas trayectorias de activación del complemento que resulta tanto en la conversión de C3 a C3b como en las respuestas' subsecuentes. La trayectoria clásica comúnmente es desencadenada por complejos de anticuerpo con antígeno, iniciando una cascada de enzimas que implican las proteínas Clq, Clr, Cls, C2 y C4. La trayectoria alternativa depende de un ciclo de activación que comprende a la propia C3 y que requiere los factores B y D. La conversión de C3 a C3b (o C3i) genera un producto que se puede combinar con el factor B, para obtener C2bB (o C3iB) . El factor D actúa sobre estos complejos para generar C3bBb, que es una convertasa C3 capaz de disociar más C3 a C3b, lo cual conduce a más C3bBb y a una conversión de C3 aún mayor.

Bajo ciertas circunstancias el complejo C3bBb es estabilizado por asociación con el regulador positivo properdin (P) . Sin embargo, este ciclo de retroalimentación positiva normalmente está limitado a una marcha lenta por las proteínas reguladoras, notablemente el factor H y el factor I. El factor H (y las moléculas asociadas a células estructuralmente relacionadas) (i) desplaza B y Bb de C3b, y (ii) actúa como un cofactor para el factor I que disocia C3b en iC3b, con lo cual impide cualquier recombinación con el factor B para formar más convertasas C3. La trayectoria es "disparada" a la generación amplificada de C3b en presencia de superficies, tal como muchas paredes celulares bacterianas, que fijan C3b naciente e impiden su regulación por medio de factores H e I. El C3b naciente también es capaz de fijarse a células endógenas. Por lo tanto, las superficies de células endógenas normalmente expuestas al complemento son protegidas adicionalmente por los reguladores fijados a membrana como MCP, DAF y CR1 que actúan de manera similar al factor H. Existen una reducida cantidad de condiciones que rara vez se presentan naturalmente en las que la regulación de fase fluido normal no puede ocurrir y la conversión espontánea de C- finalmente resulta en el agotamiento generalizado de C3 en la circulación: (i) deficiencias genéticas del factor H ó I [13], (ii) la presencia de anticuerpos (factores nefríticos) que se fijan a C3bBb e impiden la disociación [4] y (iii) contacto con una proteína en ponzoña de cobra, denominado factor de ponzoña de cobra (CVF) , que se combina con el factor B y forma una enzima convertasa C3 que no contiene C3b y no es afectada por los factores H e I [14]. Así se ilustra la importancia fisiológica normal de la regulación descendente del complemento en ausencia de activación específica. También existen circunstancias en las que ocurre activación específica, pero es indeseable, particularmente cuando es dirigida contra los tejidos del huésped (por ejemplo, tejido dañado por isquemia o cirugía) o contra material extraño administrado deliberadamente con propósitos terapéuticos (como un xenoinjerto, órgano artificial o una membrana de diálisis) . La activación del complemento da como resultado un ataque indeseable y mayor daño, por lo que en estos casos sería benéfico bloquear o inhibir la activación y respuesta. Los métodos existentes para evitar daño mediado por el complemento han tenido como objetivo el uso de proteínas de regulación descendente (CR1, MCP, DAF y factores H e I) para inhibir la activación del complemento. Los inhibidores del complemento como son el factor I, el factor H y los derivados solubles de las proteínas fijadas a membrana CR1, DAF, MCP suprimen el ciclo de amplificación de fase de fluido de la trayectoria alternativa. Por consiguiente, se han hecho intentos por usar estas moléculas, particularmente CR1 (que parece ser la más potente) para reducir el daños mediados por el complemento en modelos de situaciones fisiológicas [10, 18] . El factor H está presente endógenamente en el plasma sanguíneo en altas concentraciones (típicamente 0.3 - 0.5 mg/ml [15]), de manera que aunque los niveles aumentados de inhibidores efectivamente disminuye las reacciones de fase de fluido, su potencia es débil, por lo que sería necesario administrar in vivo grandes cantidades de proteínas purificadas (por ejemplo, probablemente más de 5 mg/kg de peso corporal de CR1 soluble) . Además, la trayectoria alternativa es activada por las superficies en la que el efecto del factor H ya ha sido impedido. Aunque esto no necesariamente reduce concomitantemente las actividades de otros inhibidores, los mismos factores sugieren que es poco probable que sean completa o universal ente eficaces. El Factor de Ponzoña de Cobra (CVF) tiene la propiedad de generar una convertasa C3 estable que se puede usar experimentalmente para agotar el complemento en animales in vivo, y en otras muestras (por ejemplo, plasma de sangre humano) in vitro. CVF es potente (por ejemplo 40 µg/kg pueden destruir la actividad del complemento de un ratón [16]). Sin embargo, existen desventajas que lo hacen inapropiado para uso terapéutico en humanos. En primer lugar, se obtiene de la ponzoña de cobra (una fuente difícil de obtener y peligrosa de manipular) y, por lo tanto, se debe purificar cuidadosamente a partir de neurotoxinas de ponzoña. También existe la dificultad obvia de obtener suministros. Este problema no se puede resolver rápidamente mediante la clonación y expresión del gen ex vivo, porque existen modificaciones post-translacionales que ocurren en la serpiente (procesamiento proteolítico específico) que pueden ser difíciles (o imposibles) de reproducir in vitro. Además, actualmente se desconocen las enzimas y condiciones de digestión que se requieren para este procesamiento. En segundo lugar, la proteína es de origen extraño (para los humanos) y, por consiguiente, inmunogénica. Esto impide su uso terapéutico repetido, como se requeriría para eliminar el complemento de un paciente durante muchas semanas (por ejemplo, para permitir la sobrevivencia de un xenoinjerto) . Aunque CVF presenta algunas homologías estructurales y funcionales con la C3 humana [17], también presenta importantes diferencias en ambos aspectos (por ejemplo, estructura de cadena, sitio de biosíntesis, insensibilidad a reguladores de complemento, formación de una convertasa C3 estable) . No se deriva del equivalente de cobra de C3 que se conoce, clonado y secuenciado, y en estructura general y función se asemeja a la C3 humana de una manera más estrecha que el CVF [8] . CVF es un producto específico de ponzoña de un animal que se encuentra a gran distancia evolutiva del homo sapiens. Por consiguiente, no es posible usar manipulación genética para modificar esta proteína en un producto que se pueda usar de manera no inmunogénica en humanos. Ahora hemos ideado una estrategia alternativa que se basa en omitir la regulación fisiológica y que, en vez de inhibir la activación del complemento, ocasiona la super-activación del sistema. Esto tiene dos aplicaciones. En primer lugar, se puede usar in vivo para activar el complemento hasta que uno o más componentes se agoten, resultando en la pérdida de la capacidad para producir respuestas locales a cualquier estimulación subsecuente (como un xenoinjerto) . En segundo lugar, se puede localizar deliberadamente la super-activación no regulada para un objetivo en particular (por ejemplo, un virus o una célula infectada viralmente) para incrementar la sensibilidad de ese objetivo a las respuestas destructivas mediadas por el complemento. El término "reguladores de activación del complemento" se usa en la presente para incluir a todas las proteínas que actúan para inhibir la amplificación de conversión C3 y no pretende restringir su significado a las proteínas cuyos genes se localizan en el lugar genético RCA. Sin embargo, no incluye "reguladores ascendentes" como properdin. "Conversión C3" se define como la conversión proteolítica de C3 en C3b y C3a, salvo que se indique de otra manera, y "convertasa C3" (o simplemente "convertasa") se define como una enzima (típicamente un complejo de dos o más componentes de proteínas; por ejemplo C3bBb, C3iBb, CVFBv o C4b2a) que cataliza la reacción. Por lo tanto, un primer aspecto de la invención proporciona una trayectoria del complemento nativo modificada por proteína de manera que la proteína es capaz de formar una convertasa C3 estable. El término "nativo" significa que se presenta naturalmente, es decir, que se obtiene en la naturaleza. Así, la definición comprende cualquier trayectoria del complemento que se presenta en la naturaleza modificada por proteínas, como se define previamente. No se pretende estar restringidos a proteínas específicas de especies. En otras palabras, una proteína humana modificada se puede usar como una convertasa C3 estable en otra especie de mamíferos, por ejemplo. Típicamente, se usarán proteínas modificadas de la trayectoria del complemento de la misma especie. La modificación de la secuencia de codificación del ADN C3 , por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, puede producir una variante de C3 que es resistente a proteínas reguladoras del complemento, mientras que retienen propiedades funcionales positivas (disociación a C3b por la convertasa C3) y características de integridad estructural (estructura correcta de cadena y presencia de un enlace tioléster) . La invención aquí descrita se refiere a formas genéticamente modificadas de proteínas nativas del complemento, por ejemplo C3 humano, cuyo fragmento C3b adquiere la propiedad de ser resistente a regulación fisiológica del complemento. Debido a esta resistencia, estas moléculas pueden generar formas estabilizadas de la convertasa C3 correspondiente que produce conversión amplificada de C3 a C3b y los posteriores productos de degradación, en ambientes fisiológicos (por ejemplo, in vivo) . En una modalidad preferida, la invención proporciona una proteína C3 humana modificada que es resistente a la disociación por el factor I. Lo anterior se puede lograr mediante la modificación de residuos de la proteína en sitios proteolíticos. Una modalidad particularmente preferida de la invención se relaciona con una proteína C3 humana modificada que se caracteriza porque la proteína es modificada por el reemplazo de Arg-1303, Arg-1320 o ambos por otro aminoácido. El otro aminoácido puede ser Tirosia, Cistina, Triptófano, Glutamina, Acido glutámico o Glicina. De preferencia, el Argl303 es reemplazado por Acido glutámico o Glicina (de menor preferencia por Glutamina) . El Arg-1320 se reemplaza de preferencia por Glutamina. Otras estrategias para producir proteínas modificadas apropiadas de la invención, incluyen: i) Susceptibilidad reducida a las acciones inhibidoras del factor H y proteínas relacionadas (por ejemplo, MCP, DAF, CR1) . Por ejemplo, en residuos C3 humanos 767-776 y 1209-1271 han sido implicados en la fijación del factor H [20, 24], y la sustitución de uno o más de estos residuos u otros residuos también asociados con la acción de estas proteínas, podría reducir la fijación de uno más de estas proteínas reguladoras. ii) Porcentaje reducido de disociación de C3bBb.

Se pueden introducir mutaciones que podrían fortalecer la interacción entre C3b y Bb. Esto daría como resultado tanto una reducción de la descomposición espontánea de la enzima como la disminución de la eficacia del factor H (y reguladores asociados) para desplazar Bb de C3b. Estas mutaciones son convenientes para reducir los porcentajes de la descomposión de C3bBb tanto espontánea como la mediada por el factor H. Aún en ausencia del factor H, el complejo C3bBb de la fase de fluido tiene una vida media de sólo alrededor de 10 minutos a 37°C en presencia de properdin [6]. iii) Los residuos 752-761 de C3 humana están implicados en la fijación del factor B. Es una región altamente conservada en C3, y en C4 se encuentra una secuencia estrechamente relacionada. Puesto que C4 fija C2 homólogo del factor B, la gran similitud de esta región entre C3 y C4 , junto con su alta conservación en C3 , soporta adicionalmente su papel en C3 como un sitio de fijación del factor B. Por lo tanto, cambios en esta región podrían tener efectos sobre la afinidad B y sobre la estabilidad de C3bBb. IV) También sería conveniente obtener resistencia a otros reguladores de la activación del complemento como CRl, DAF y MCP. Los modos de acción de estos reguladores son todos similares al del factor H, por lo que no se requeriría necesariamente mutagénesis adicional. De igual manera, algunos organismos patógenos expresan sus propios inhibidores de activación del complemento que con frecuencia son estructural y funcionalmente homólogos al factor H (por ejemplo, péptido de secreción de Vaccinia virus []). Estas moléculas protegen a invasores contra respuestas inmunes y sería conveniente poder atacarlos con enzimas de convertasa C3 dirigidas a un objetivo resistentes a estas defensas. v) Mutaciones que incrementan la estabilización de la convertasa C3 por parte de properdin. La actividad de properdin es estabilizar el complejo C3bBb, retardando la disociación espontánea y la dependiente del factor H. Esta estabilización no es efectiva en la fase de fluido, pero parece ser más importante en la amplificación del proceso una vez que ya ha iniciado sobre una superficie de activación apropiada [5]. Al incrementar su actividad (mediante el incremento de su afinidad) puede alterar el balance en La fase de fluido y, con ello, promover la conversión espontánea de C3. Esto sería particularmente útil en combinación con las demás modificaciones previamente descritas. vi) Las mutaciones que impiden que C3bBb posea actividad de convertasa C5. Cuando se usan para agotar en la circulación la C3 activa, un efecto secundario indeseable podría ser la generación de grandes cantidades de péptidos anafilácticos. El más potente de éstos es C5a, que es disociado a partir de C5 por algunas enzimas convertasa C3. Esta reacción probablemente depende de la afinidad de la convertasa por otra molécula de C3b [11] y, así, puede estar sujeta a supresión por mutaciones al C3 que elimina esta interacción. vii) Actividad mejorada de la convertasa C3. El sitio activo de la enzima convertasa C3 C3bBb reside en la porción Bb. Presumiblemente, el componente C3b funciona para imponer una conformación activa sobre Bb y/o para fijar y orientar el sustrato sobre el cual actuará Bb. Esto se desconoce, pero en cualquier caso debe haber posibilidad de mejorar la actividad de la convertasa a través de mutaciones en C3. viii) Expresión de manera funcional. La C3 tipo silvestre requiere conversión C3b antes de poderse combinar en un nuevo complejo de convertasa C3. Cuando se usa in vivo, el requerimiento de conversión a C3b (o C3i) retardaría la acción de la C3 modificada. Por consiguiente, sería conveniente administrar la proteína en una forma capaz de una formación inmediata de convertasa, o bien administrar complejos de convertasa pre-formados. Por lo que es conveniente generar ex-vivo un reactivo de funcionalidad similar a C3b. Esto se podría lograr in vitro (por ejemplo, por proteólisis) . ix) Modificaciones a la proteína nativa que sirven para introducir nuevos sitios de disociación de manera que se retienen las regiones de péptidos requeridas para la fijación del factor B, pero se pueden remover específicamente las que se requieren exclusivamente para fijar el factor H. Por ejemplo, se pueden introducir sitios de manera que la forma similar a C3b de la C3 modificada se pueda disociar adicionalmente a una forma que todavía fije el factor B pero que sea menos susceptible a la inactivación por parte de los factores H e I . x) Modificaciones en otras regiones que pueden afectar la interacción C3b con factor B y/o factor H. La invención se basa en la reversión del método tradicional mediante la promoción de conversión C3 para agotar C3 y, con ello, deshabilitar el sistema. Una aplicación adicional de la invención es el potencial para promover conversión C3 en un sitio en particular, y así reclutar los mecanismos del efector dependiente del complemento para atacar un objetivo específico. Por consiguiente, el efecto final sería incrementar la cantidad de conversión C3 cuando la proteína modificada sea administrada al medio fisiológico (por ejemplo, sangre) que contiene reguladores de activación del complemento. Esta actividad se puede usar para agotar el medio de C3 nativo o bien para localizar la conversión C3 en un objetivo deseado. El análogo de C3 cuyo fragmento C3b es resistente a las acciones del factor I (por ejemplo, el derivado que se describe en el ejemplo 1) fijaría el factor B, que entonces sería disociado por el factor D y finalmente disociado en una forma inactiva. En ausencia de inactivación por parte del factor I, la C3b modificada sería capaz de fijar repetidamente nuevas moléculas del factor B y con ello de promover su inactivación. Por lo tanto, otra aplicación potencial de las modificaciones descritas en la presente invención sería la inactivación de la trayectoria alternativa mediante el consumo de la actividad del factor B. También se podría usar un método análogo para modificar C4 para promover el consumo de C2 y con ello inhabilitar la trayectoria clásica de activación del complemento. La invención incluye cualquier otra proteasa usada de manera análoga para la enzima C3bBb que conduzca a la disociación de C3 en C3b, a pesar de la presencia de reguladores de activación del complemento.

Asimismo, la invención incluye secuencias de ADN que codifican para una proteina de la invención, así como construcciones de ADN que comprende dichas secuencias de ADN. "Secuencias de ADN" incluyen todas las demás secuencias de ácidos nucleicos que, por virtud de la degeneración del código genético, también codifican para la secuencia de aminoácidos determinada o que son sustancialmente homólogos a esta secuencia. Por lo que, estas secuencias también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Las secuencias de ácidos nucleicos que son "sustancialmente homologas" también están dentro del alcance de la presente invención. La "homología sustancial" se puede establecer tanto a nivel de ácidos nucleicos como a nivel de aminoácidos. A nivel de ácidos nucleicos, la secuencias que tienen homología sustancial se pueden considerar como aquellas que hibridizan a las secuencias de ácidos nucleicos de la invención bajo condiciones rigurosas (por ejemplo, de 35 a 65°C en una solución salina de alrededor de 0.9M) . A nivel de aminoácidos, una secuencia de proteínas se puede considerar como sustancialmente homologa a otra secuencia de proteínas si un número significativo de los aminoácidos constituyentes exhiben homología. Cuando menos el 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o hasta el 99%, en orden creciente de preferencia, de los aminoácidos pueden ser homólogos.

Co o se describe previamente, las proteínas de la invención pueden usarse para obtener efectos localizados de activación del complemento. Una forma de asegurar esto es conjugar la proteína a la fracción que se fijará en el objetivo deseado. Por lo que, en otro aspecto, la invención proporciona un conjugado que comprende una proteína de la invención enlazada a una fracción de fijación específica, por ejemplo una proteína de fijación específica. Un ejemplo de dicha proteína sería un anticuerpo o un fragmento de fijación de antígeno del mismo. Las proteínas de la invención tienen la intención de ser administradas a un sujeto para desarrollar un efecto terapéutico deseado. Por consiguiente, con tal fin la invención también proporciona: a) Una proteína de la invención para usarse en terapia; b) El uso de una proteína o un conjugado de la invención en la fabricación de un medicamento para usarse en niveles de agotamiento de proteína de trayectoria del complemento y, en particular, para usarse para impedir el rechazo de materia extraña; c) Una formulación farmacéutica que comprende una o más proteínas o conjugados de la invención junto con uno o varios portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables; y d) Un método para reducir la proteína de trayectoria del complemento en un mamífero que comprende la administración de una proteína de la invención al mamífero, de preferencia en forma de una formulación farmacéutica. Las formulaciones farmacéuticas se pueden presentar en formas de dosificación de unidades que contienen una cantidad predeterminada de ingrediente activo por dosis. Dicha unidad puede contener como mínimo, por ejemplo, 1 mg de ingrediente activo y, de preferencia, 2-3 mg. El límite superior que dicha dosis de unidad puede contener dependerá de muchos factores como la condición por tratar, la vía de administración y la edad, peso y condición del paciente, así como las consideraciones económicas. Como ejemplo, una forma de dosis de unidad puede contener tantos como 10 mg o más de 100 mg de ingrediente activo. Las proteínas de la invención se pueden usar in vivo para deshabilitar el sistema del complemento. Las circunstancias en las que esto puede ser deseable incluyen las siguientes: (a) Evitar la destrucción o daño mediado por el complemento a un transplante, particularmente un xenoinjerto (material transplantado de una especie de animal diferente) y especialmente un xenoinjerto discordante (en el que la especie donadora y la receptora están relacionadas discordantemente) . El complemento del receptor deberá ser inhabilitado antes de la operación y mantenido en este estado hasta que el transplante se haya adaptado o bien haya sido reemplazado por un órgano más compatible. El tratamiento inicial se haría unos días antes del transplante. Se podría requerir una eliminación adicional del complemento en casos de crisis de rechazo. Los tratamientos pueden ser acompañados por el uso de reactivos antihistamínicos para controlar las respuestas inflamatorias generales (por ejemplo, vasodilatación) que probablemente resultarán de la generación de C3a y/o C5a. La eliminación del complemento también puede ser benéfica en el uso de órganos o tejidos artificiales (por ejemplo, membranas de diálisis de ríñones artificiales) que activan el sistema del complemento. Como se describe previamente, la proteína se puede administrar en forma no activada, en una forma de funcionalidad similar a C3b o de una convertasa C3 activa preformada (como C3bBb) . Estas pueden ser administradas por cualquier vía mediante la cual la convertasa activa encuentre la C3 circulante (por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, etc.). Otra alternativa sería un tratamiento ex vivo, por ejemplo mediante transfusión a la circulación a través de una matriz que contenga la convertasa activa. Esto podría tener la ventaja de permitir la eliminación (por ejemplo, por diálisis) de péptidos anafilácticos (C3a y C5a) y de otros mediadores inflamatorios de bajo peso molecular (por ejemplo, histamina y óxido nítrico) antes de que la sangre (o plasma) sin complemento sea devuelta al paciente. (b) Evitar daños mediados por el complemento derivados de cirugía mayor. Se eliminaría el complemento del paciente, como se describe previamente, de preferencia antes de la operación (pero, en caso necesario, posteriormente) y se mantendría en este estado hasta que haya disminuido el peligro de daños internos adicionales debidos al ataque inmune dependiente del complemento. (c) Minimizar el daño mediado por el complemento derivado de lesión no quirúrgica. En estos casos la eliminación del complemento se debe realizar después de la lesión inicial, pero es probable que las formulaciones y métodos de administración sean similares a los previamente descritos. Esto podría ser particularmente útil cuando la recuperación implique reperfusión de un tejido isquémico por la circulación (por ejemplo, isquemia miocárdica, congelación, quemaduras , etc . ) . (d) Minimizar el daño mediado por el complemente resultante de interacciones anticuerpo-antígeno. Las respuestas defensivas mediadas por el complemento son particularmente indeseables en enfermedades autoinmunes que pueden incluir glomerulonefritis, anemia hemolítica, miastenia grave y artritis inducida por colágeno tipo II. La deshabilitación del sistema del complemento durante episodios severos de la enfermedad puede aliviar la condición. (e) Hacer que un objetivo patógeno específico sea más susceptible a mecanismos inmunes mediados por el complemento. En este método, la meta es no usar la convertasa C3 superactiva para producir agotamiento generalizado de C3 , sino que es usar la convertasa localmente para concentrar la conversión C3 a un objetivo deseado. El objetivo puede ser un organismo patógeno, como una bacteria, virus u otro parásito, o una célula o tejido huésped nocivo, como células de tumores o células infectadas viralmente. La convertasa C3 se puede localizar para el objetivo mediante una administración local (por ejemplo, inyección directa, posiblemente en un medio que retarde su dispersión en la circulación general) o mediante su combinación con una fracción del objetivo, por ejemplo, un anticuerpo. Por lo tanto, la proteína modificada se puede enlazar a una inmunoglobulina específica ya sea por enlace químico cruzado de proteínas o mediante la unión de secuencias de codificación de ADN y la expresión (y purificación) de la proteína de fusión (por ejemplo, en caso de IgG, la cadena pesada o bien la ligera se podría unir a C3 y co-expresarse con C3 , o ambas cadenas se podrían combinar dentro de un polipéptido de fusión completo) , o mediante la incorporación de secuencias de codificación específicas (por ejemplo, para dominios en forma de "cremallera de leucina") al ADN de ambos participantes de la fusión (por ejemplo, C3 modificada y anticuerpo específico) de manera que los productos expresados, al mezclarse, se auto-asocien para formar conjugados estables. Posteriormente la proteína de fusión podría administrarse localmente o en la circulación general. También se podrían usar liposomas (soportando el anticuerpo en la superficie con la proteína modificada ya sea en la superficie o dentro del liposoma) y/o viriones (por ejemplo, diseñados para expresar las proteínas sobre su superficie) para la co-entrega del anticuerpo y de la proteína modificada. Esta estrategia se podría usar directamente, sola o en combinación con otros tratamientos, en cualquier etapa del proceso de la enfermedad. Sería particularmente apropiado para usarse en la eliminación de cualquier célula cancerosa que haya quedado en la circulación después de la extirpación quirúrgica de un tumor. Los conjugados de proteína modificada por anticuerpos también se podrían usar ex vivo para eliminar tejido patógeno. Por ejemplo, para matar células leucémicas de una médula ósea extraída y después devolver al paciente las células sanas remanentes. Alternativamente los linfocitos que no son compatibles con los tipos MHC del receptor se podrían eliminar de una médula ósea antes del transplante. También, la proteína modificada se podría enlazar a un antígeno y su combinación podría usarse, ya sea in vivo o ex vivo, para atacar linfocitos de reactividades indeseables (por ejemplo, contra tejido del transplante o del propio tejido). La misma tecnología sería aplicable para el tratamiento de otras especies, usando un derivado de proteína humana modificada o bien un análogo similar confeccionado para dicha especie. Las características preferidas de cada aspecto de la invención, son como para cada otro aspecto mutatis mutandis . A continuación la invención se describirá a través de los siguientes ejemplos, que no deberán ser considerados de ninguna manera como limitantes de la invención. Los ejemplos se refieren a los dibujos acompañantes, en los que: Figura 1. Secuencia pronosticada de proteína de C3 humana como se codifica en PC3 ; (usando el código estándar de una letra para aminoácidos) . Figura 2. Ilustración de la secuencia de ADNc en PC3; (usando el código estándar de una letra para desoxinucleótidos para la cadena en sentido, escrita 5' -3'). Figura 3. Ilustración de una visualización de proteínas modificadas de la invención. Figura 4. Ilustración del efecto de diversas mutaciones a la C3 humana que reemplaza Arg 1303 o Arg 1320 en disociación medida por factoR I en estos sitios. N.B. 1. Muestras [35S] -biosintética ente marcadas. 2. Reacciones realizadas a una fuerza iónica normal. 3. Inmunoprecipitada con anti-C3. 4. SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. 5. Autorradiografía. Figura 5. Ilustración de resistencia mejorada de C3 humana incorporando la mutación Arg 1303 - > Gln 1303 a la inactivación por factores I y H. Figura 6. Ilustración de un análisis de la disociación de una convertasa C3 mutada en los residuos de aminoácidos 752-754 y 758-760. Esta es una fotografía de un Western Blot desarrollado de un gel SDS-PAGE de poliacrilamida al 7.5% (condiciones reductoras) , después de la transferencia electroforética en nitrocelulosa, sondeando con un anticuerpo C3 oveja, y el desarrollo con anticuerpo de inmunoglobulina anti-oveja acoplado a peroxidada de rábano y Quimioluminiscencia de Mejoramiento (método y reactivos de detección de Amersham, Reino Unido) registrado en película de rayos-X. Las reacciones de disociación y el procedimiento de detección se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 4 con referencia a los resultados que se ilustran en la Figura 3. Clave: Pistas 1-4: C3 tipo silvestre (expresado en células COS) Pistas 5-8: Mutante C3 (los residuos 752-754 cambiados a Gly-Ser-Gly y los residuos 758-760 también cambiados a Gly-Ser- Gly) (expresados en células COS) Pistas 1,5: sin adición Pistas 2,6: + CVFBb Pistas 3,7: + factores H + I Pistas 4,8: + CVFBb + factores H + I Las bandas indicadas por las flechas son: A: C3 cadena alfa B: C3 cadena alfa1 C: C3 cadena beta D: 68 kDa producto de disociación de C3 cadena alfa' E: IgG cadena pesada Figura 7. Ilustración del análisis de la disociación del factor B radiomarcado por el factor D, en presencia de C3 tipo silvestre y del mutante de C3 (C3i) Se ilustra la fotografía de la autorradiografía del gel SDS-PAGE. Todas las muestras contenían factor D y factor B marcado con 125I, y se incubaron durante 3 horas a 37°C.

También se incluyen las muestras en las pistas numeradas: 1. Regulador del pH solo 2. C3 tipo silvestre 1/125 3. C3 tipo silvestre 1/25 4. C3 tipo silvestre 1/5 5. C3 mutante 1/25 (residuos 1427 Gln, 1431 Asp y 1433 Gln) 6. C3 mutante 1/5 7. C3 mutante sin diluir Las bandas indicadas por las flechas son: A. Factor B (93 kDa) sin disociar marcado con 125I B. 60 kDa producto de disociación ("Bb") C. 33 kDa producto de disociación ("Ba") Figura 8. Ilustración de un estudio SDS-PAGE que muestra la formación de un conjugado entre C3i e IgG. Esta es una tinción de Coomassie de un gel SDS-PAGE de acrilamida al 4% corrido bajo condiciones no reductoras. Las pistas numeradas contienen muestras de: 1. PDP-IgG 2. C3i 3. PDP-IgG + mezcla de reacción C3i Se indican con flechas como sigue: A. Probablemente conjugado C3i-IgG (350 kDa) B. C3i (200 kDa) C. IgG (150 kDa) Figura 9. Demuestra que el conjugado dirige la actividad de la convertasa C3 contra los eritrocitos de oveja. (Esta gráfica muestra el % de eritrocitos de oveja lisados después de recubrir con diluciones del conjugado C3i-IgG, de PDP-IgG o de C3i seguido de lavado, generación de convertasa C3 con properdin y factores B y D, y finalmente desarrollo de lisis por NGPS en CFD/EDTA, según lo descrito en los métodos.

Sólo el conjugado produce lisis y esta lisis depende de la dosis) . Los siguientes métodos y definiciones estándar son aplicables a todos los ejemplos. Todos los componentes del complemento a los que se hace referencia son de origen humano, salvo que se especifique de otra manera, usando terminología estándar para todas las proteínas y sus fragmentos derivados (por ejemplo, como la contenida en la referencia [15]). Además, el término "C3i" se refiere a cualquier forma molecular de C3 sin un enlace tioléster intacto, pero reteniendo el polipéptido C3a en la cadena alfa. El ADNc de C3 humana y la secuencia de codificación se numeran como aparecen en la Figura 2, usando la numeración empleada en la base de datos de nucleótidos EMBL (derivada de la referencia [2]). La secuencia que se ilustra es la de nuestra construcción ('PC3'), que carece de los primeros 11 nucleótidos de la región 5 ' no transladada reportada en la referencia [2] y, por consiguiente, la primera base se numera 12. El codón que se denomina de iniciación corresponde a los nucleótidos número 61-63, el codón para el residuo de serina amino-terminal de la cadena beta corresponde a los nucleótidos 127-129, y el codón para el residuo de serina amino-terminal de la cadena alfa corresponde a los nucleótidos 2074-2076. La secuencia de proteínas se numera de conformidad con la secuencia del precursor como se ilustra en la Figura 1, que es una translación pronosticada de la secuencia ADN del Apéndice 1 (se espera que los aminoácidos 1-22 comprendan una secuencia de señal que se elimina durante la biosíntesis y se espera que los aminoácidos 668-671 sean eliminados cuando el precursor sea disociado en las cadenas alfa y beta) . Las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados; factor de ponzoña de cobra CVF; ELISA; ensayo de inmunoadsorbente enlazado por enzimas; E . coli , Escherichia coli ; kb, kilobase; HSV-1, virus de herpes simple tipo 1; PBS, solución salina con regulador de pH de fosfato. COS-1 es una línea de células derivada de células de riñon de mono. Las siguientes son endonucleasas de restricción: AflII, Dral, DralII, EcoRi, EcoRV, HindIII, Nael, Nhel, Xbal. Métodos Estándar En la referencia [21] se describen métodos para los procedimientos biológicos moleculares estándar como aislamientos de plásmidos, electroforesis en gel agarosa y ligaciones de ADN. Se formó una secuencia de ADN de doble cadena usando el estuche • Sequenase versión 2.0' suministrado por 'United States Biochemicals • . La expresión de C3 se midió a través de un ensayo ELISA usando placas de plástico precubiertas con C3 anti-humana ovina policlonada purificada por afinidad a las que se agregaron muestras de sobrenadante de cultivos. Se detectó C3 fija con un anticuerpo de rata monoclonado para C3 conjugado a fosfatasa alcalina y el sustrato cromógeno, fosfato p-nitrofenol. Los ensayos se calibraron con C3 de plasma humano purificado. Los métodos de purificación de las proteínas del complemento y CVF, y para la preparación de anticuerpos anti-C3 purificados por afinidad utilizados en el análisis, se pueden encontrar en la referencia [28]. Los reactivos equivalentes también se pueden comprar en Sigma Chemical Company LTD. secuencia de codificación ADNc C3 Nuestra secuencia de codificación de ADNc C3 se construyó a partir de dos segmentos aislados de una biblioteca de ADNc de hígado humano cebada aleatoriamente portados en el vector pGEM4 (Promega) . Cinco oligodesoxinucleótidos, correspondientes a segmentos conocidos en la secuencia del código C3 humano, fueron radiomarcados con quinasa de polinucleótido T4 y [?-32P]ATP y usados para sondear transferencias de filtros de la biblioteca de las placas de agarosa. Se aislaron dos clones que contenían insertos de aproximadamente 4 kb. Por medio de digestión de endonucleasas de restricción, de hibridización a sondas de oligodesoxinucleótidos específicos y de análisis de secuencias parciales se demostró que uno de estos ('Al3') incluyó el extremo 5' del mensaje 5.1kb, mientras que el otro ('B44') se extendió al extremo 3 • .

Por consiguiente, estos insertos se traslaparon aproximadamente en 3 kb, incluyendo un sitio único de enzima de restricción EcoRI. La sección incompleta 5' de A13 se cortó con EcoRI y Nhel, y se reemplazó con el segmento completo aislado de B44 por digestión con EcoRI y Xbal. Ambas fragmentos se purificaron mediante electroforesis de gel en agarosa de bajo punto de fusión antes de ligarse con ligasa ADN TG4 para producir un vector ( ' PGC3 ' ) que contiene 5.1 kb de ADN codificando la proteína completa del precursor C3. Las secuencias 5 ' del enlazador a la región de codificación de C3 contenía dos ATG que son sitios de inicio potenciales de translación falsa. Por lo tanto, se eliminaron por mutagénesis de plásmido hueco, conforme a lo descrito en el método del ejemplo 1, usando un oligodesoxinucleótido PL-ATC-3 (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t) que agotó aproximadamente 50 pares de bases del ADN enlazador/ adaptador, sin alterar la secuencia de codificación C3. Este vector mutado, 7.7 kb con 5.1 kb de secuencia de ADNc C3 más 2.6 kb de secuencia del vector PGEM4 (Promega) se denomina PC3. La región de codificación C3 del plásmido PGC3 se sometió a secuenciamiento completo y reveló sólo cuatro diferencias con respecto a una secuencia de ADN (alelo "S") C3 humana previamente publicada [2]. (i) los cambios C2481 ->G, y C2805->T no alteran la codificación; (ii) T100 ->C codifica la forma polimórfica HAV 4-1 -(Leucina314->Prolina) previamente descrita [20]; y (iii) G2716->A codifica Valina886->Isoleucina, que se ha reportado previamente en C3 humana, aunque lie se encuentra en esta posición en C3 de ratón y rata. Nuestra secuencia incluye codones de inicio y paro, con una secuencia completa de señales y, por consiguiente, debe codificar C3 funcional. Niveles de hasta 1.7 µg/ml expresaron C3 tipo silvestre en sobrenadantes de cultivos de células COS-1 (transfectados usando lipofectamina y el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen) ) han sido detectados por ELISA. El C3 no detectable fue producido por células transfectadas con vector pcDNA3 solo. Además, el análisis del producto expresado por reacciones de disociación seguidas por inmunoprecipitación, SDS-PAGE e inmunocorridas demostraron que: (i) el producto primario de translación había sido procesado correctamente en la forma madura de dos cadenas; (ü) este producto fue, al igual que el C3 nativo, disociable a C3b por medio de la convertasa C3 (CVFBb) ; y (iii) la proteína expresada fue, igual que el C3 nativo, no disociable por el factor H más I, pero se volvió disociable después de su conversión a C3b por medio de la enzima convertasa. Esto confirma que nuestro plásmido de partida puede ser transladado a C3 funcional. Para una descripción alternativa de una construcción y expresión de una secuencia de codificación C3, consultar la referencia [25] . Ejemplo 1; La producción de C3 que tiene los residuos de arginina en ambos sitios de disociación del factor I (posiciones de aminoácidos 1303 y 1320) se convirtió a residuos de glutamina para evitar que el factor I disociara el fragmento C3b. a) Mutagénesis Los oligodesoxinucleótidos mutagénicos utilizados fueron QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc) , QRI2 (gccagcctcctgcaatcag aagagaccaag) , y AFL4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac) , así como los oligodesoxinucleótidos anti-sentido correspondientes QRIln (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg) , QRI2n (cttgtctcttctgattgcaggaggctgggcagttg) , QRI2n (cttggtctctt ctgattgcaggaggctggc) y AFL4149n (gttttatggtgaccttaaggt cgaatttatta) . QRI1 y QRIln especifican el reemplazo de arginina por glutamina en el sitio de disociación del factor I en el residuo aminoácido 1303 en la secuencia del precursor C3 (cambiando G3968C3969 a AA en la secuencia ADNc) , y QRI2 y ARI2n efectúa la misma sustitución en el sitio de disociación del factor en el residuo aminoácido 1320 (cambiando el nucleótido G4109 a A) .

AFL4149 y AFL4149n introducen un sitio de disociación para la endonucleasa de restricción AflII en la posición 4149 en la secuencia ADNc (cambiando C4149 a T) sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada. Estos dos cebadores se usaron como marcadores, permitiendo identificar la mutagénesis eficaz en base a la disociación del producto de ADN por AflII. Se efectuó mutagénesis usando el método del 'plásmido con hueco1. Se preparó un lote de PGC3 ('UPGC3'), enriquecido en uridina en lugar de timidina, mediante crecimiento en E. coli cepa CJ236 en presencia de 0.25 µg/ml de uridina. Este plásmido fue digerido con Smal y se purificó el gel de agarosa del producto 7.2kb ('USl') para eliminar un fragmento 0.5kb de la secuencia C3 (residuos 1463-1947). El otro componente del plásmido con hueco ('DN2') se preparó mediante digestión de PGC3 con DralII más Nael y purificando dos veces la pieza 5.1kb por electroforesis en gel de agarosa. Se mezclaron 200 ng de DN2 con aproximadamente 500 ng de USl en 50 µl de H20, se calentaron a 100°C y se enfriaron lentamente hasta menos de 50°C, antes de agregar 20 µl a 25 µl de regulador de pH 2XT7 (100 mM Tris/HCl/pH 7.4/14 mM MgCl2 , 100 M NaCl, 2 mM ditiotreitol y 1 mM de cada uno de ATP, dATP, dCTP, dTTP y dGTP) más 10 nmol de cada uno de cebador mutagénico 5 ' -fosforilado (una reacción usó QRI1, QRI2 más AFL4149, otra reacción usó QRIln, QRI2n más AFL4149n) . Las mezclas se recalentaron a 70°C durante 5 minutos y se enfriaron lentamente (durante 30-60 min) a 20°C. A 0°C, se agregaron 10 unidades de T7 ADN polimerasa más 80 unidades de T4 ADN ligasa. La mezcla (volumen total 50 µl) se incubó primero a 0°C, durante 5 min, después a temperatura ambiente durante 5 min, y finalmente a 37 °C durante 3 horas. Se usó 1 µl de cada mezcla para transformar 100 µl de E. Coli XL1 supercompetente (Stratagene) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se investigaron las colonias resistentes a la ampicilina para determinar disociación AflII y se desarrollaron mutantes efectivos en cultivos de 100 mi de los cuales se aislaron y secuenciaron los plásmidos (usando un cebador de secuenciamiento C3pa-3876, cttcatggtgttccaagcct, nucleótidos de concordancia 3876-3895 del ADNc de C3) para caracterizar mutaciones en los sitios de disociación del factor I. Para un protocolo alternativo de la mutagénesis del "plásmido con hueco" consultar las referencias [26, 27]. b) Transferencia del ADN mutante al vector de expresión eucariótico. Los fragmentos de codificación de C3 de los plásmidos mutantes fueron escindidos por medio de doble digestión con HindIII y Nael. Dral también se incluyó para incapacitar el plásmido residual. La secuencia de codificación de C3 se purificó en gel de agarosa y se ligó en el vector pcDNA3 (Invitrogen) que había sido linealizado con HindIII y las enzimas EcoRV y desfosforilado con fosforilasa intestinal de becerro. Las mezclas de ligación se usaron para transforma E. coli XL1 supercompetente, que se colocaron en placas de cultivo que contenían ampicilina. Una selección aleatoria (tres o cuatro) de las colonias resistentes a la ampicilina se desarrolló en cultivos de 2-3 mi y se hizo un aislamiento a pequeña escala del ADN del plásmido. Los plásmidos que contenían el inserto correcto se identificaron por medio de digestión del ADN del plásmido con endonucleasas de restricción EcoRI, HindIII y AflII. Las colonias correspondientes se desarrollaron en cultivos de 100 mi y los plásmidos se purificaron por el procedimiento estándar. Estos mutantes fueron construidos originalmente a partir de PGC3 y así se retuvieron los dos 5' ATG's en la región de codificación. Por lo tanto, se hizo una escisión de esta región (más la 3kb 5' de la secuencia de codificación C3) con HindIII más EcoRI y se reemplazó por ligación del mismo corte del segmento de PC3. Estos vectores reconstruidos fueron preparados por el procedimiento estándar y se usaron para transfección de células COS. c) Expresión de C3 tipo silvestre y mutante C3 mutantes y tipo silvestre se expresaron temporalmente de plásmidos transfectados en células C0S-1 usando lipofectamine® (GIBCO) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Típicamente, se transfectaron 1-1.5 x 105 células por pozo de una placa de cultivo estándar de 6 pozos con 2-4 µg de plásmido usando 9 µl de reactivo de lipofectamina. Los sobrenadantes se analizaron para determinar secreción de C3 y se obtuvieron producciones típicas de sobrenadante de 0.3-1.7 µg por mi después de 3-6 días de la transfección. Resultados a) Generación de mutantes Los siguientes mutantes, que se denominan de conformidad con las secuencias de oligodesoxinucleótidos mutagénicos que han sido incorporadas, se han aislado hasta ahora: (i) 3 mutantes tanto con mutaciones QRI1 como QRI2 más AFL4149: C3M-26, C3M-58 y C3M-61; (ii) 1 mutante con QRI1 y QRI2 pero sin AFL4149; C3M-8 ; y (iii) 1 mutante con QR12 y AFL4149, pero sin QRI1: C3M-51 (usado en el ejemplo 3) b) La validación de esos efectos funcionales se debió a las mutaciones introducidas específicamente en los sitios de disociación del factor I. El secuenciamiento confirmó la ausencia de otras alteraciones en bases 178-350 alrededor de la región mutada de cada mutante. La secuencia de un mutante producido por este procedimiento, C3M-51 (véase ejemplo 3), se ha analizado a través de todo el 'hueco' (bases 2463-5067) usado en mutagénesis, y no se encontró alguna otra desviación de la secuencia del tipo silvestre. Además, el secuenciamiento representativo de un total de 2922 bases de todos los mutantes no hay revelado alguna mutación de un solo punto que hubiera podido ser causada por errores mediados por polimerasa. Los mutantes expresados también mostraron la estructura de dos cadenas y disociación por convertasas C3, característica de C3 nativo. En resumen, no es probable que los mutantes usados contengan algún cambio no deseado aunque no han sido completamente re-secuenciados. Ejemplo 2: Producción de C3 que tiene residuo de arginina en un sitio de disociación del factor I (posición de aminoácido 1303) convertido a un residuo de glutamina. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que sólo se usaron en mutagénesis los oligodesoxinucleótidos mutagénicos AFL4149 más QR11 o AFL4149n más QRIln (es decir, no se usaron QRI2 o QRI2n) .

Resultados a) Mutantes obtenidos Se aislaron 2 mutantes con QRI1 y AFL4149 pero sin QRI2 : C3M-123,27. El mutante C3M-I23 se expresó como se describe en el Ejemplo 1. Esta proteína puede ser disociada por CVFBb. El producto similar a C3b fue relativamente resistente (en comparación con el tipo silvestre) a la disociación en la posición 1303 por los factores I y H, pero aún pudieron disociarse en la posición 1320. Por consiguiente, este derivado C3b es parcialmente resistente al factor I. Ejemplo 3; Producción de C3 que tiene residuo de arginina en un sitio de disociación del factor I (posición de aminoácido 1320) convertido a un residuo de glutamina. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 excepto que sólo se usaron en la mutagénesis los oligodesoxinucleótidos mutagénicos AFL4149 más QRI2 o AFL4149n más QRI2n (es decir que no se usó QRI1 ni QRIln) . Además, el método empleado en el ejemplo 1 también produjo un mutante con QRI2 y AFL4149, pero sin QRI1. Resultados a) Mutantes obtenidos Se aislaron 3 mutantes con QR12 y AFL4149 pero sin QRI1: C3M-51, C3M-Q2 , C3M-Q13. Se expresó el mutante C3M-51 como se describe en el Ejemplo 1. Esta proteína fue disociable con CVFBb. El producto similar a C3b no se disoció rápidamente en la posición 1320 por los factores I y H, pero aún pudo ser disociado en la posición 1303. Por lo tanto, este derivado de C3b es parcialmente resistente al factor I.

Ejemplo 4: Análisis de los efectos funcionales de mutaciones. Los sobrenadantes (100-400 µl) de células COS transfectadas se incubaron a 37 °C durante 2 horas con: Se transfectaron células COS con pcDNA3 portador de insertos de: 1) la secuencia C3 sin mutar; 2) C3M-I23 mutante (codificando Arg1303 ->Gln) ; 3) C3M-26 mutante (codificando Arg1303 ->Gln, Arg1320->Gln) ; y 4) C3M-51 mutante (codificando Arg1320->Gln) . 200 µl de los sobrenadantes del cultivo, tomados 3 días después de la transfección, se sometieron a pretratamiento con 2 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (0°C, 15 min) y después se incubaron a 37°C durante 2 horas con lo siguiente: A) sin adición; B) convertasa C3 preformada, CVFBb (10 µl de 200 µl que contenían 6.6 µg CVF, 100 µg de factor B y 1.4 µg de factor D en solución salina con regulador de pH de fosfato (PBS) que contenía 10 mM de MgCl2, preincubados a 37 °C, 15 minutos) ; C) factores H (5 µg) e I (l µg) ; y D) CVFBb más factores H e I. Posteriormente éstos fueron inmunoprecipitados mediante la adición de 0.6 µg de inmunoglobulina C3 anti-humano oveja purificada por afinidad a temperatura ambiente y después de 1 hora agregando 20 µl de una suspensión al 5% de células de Streptococcus sp . Grupo C lavadas y fijadas con formalina (proteína G) (Sigma) . Después de 45 min a temperatura ambiente las partículas se lavaron una vez en PBS, 5 mM de NaN3 y una vez en 20 mM de Tris/HCl, 137 mM NaCl, 0.1% (v/v) de Tween 20, pH 7.6 antes de eluir en SDS 1%/2-mercap-toetanol al 2% (90-100°C, 5 min) . Estos eluatos se separaron por SDS-PAGE, se electrocorrieron sobre nitrocelulosa y se detectaron las bandas de C3 mediante sondeo con inmunoglobulina C3 anti-humana oveja purificada por afinidad seguida por inmunoglobulina anti-oveja asno acoplada a peroxidasa de rábano (Sigma) y detección usando sustratos de "Quimioluminiscencia Mejorada" suministrados por Amersham. Se ilustra una fotografía de una exposición de 2 minutos a película de rayos-X. Las bandas visibles derivadas de C3 se indican con flechas etiquetadas y las muestras individuales (1-4, A-D) son las que se describen inmediatamente antes. (La banda predominante de alrededor de 50 kDa (entre las bandas 46 y 68 kDa) presentes en todas las muestras es la cadena pesada del IgG usado en la in unoprecipitación y detectada por la inmunoglobulina anti-oveja asno acoplada a peroxidasa de rábano) . Resultados (véase Figura 3) 1. Todas las muestras no tratadas (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) contienen bandas de la migración correcta para cadenas alfa y beta de C3 , indicando que todos los mutantes son expresados y procesados correctamente post-translacionalmente. La presencia de las bandas 43 o 46 kDa en estas muestras indica la presencia de alguna actividad similar a la del factor H + factor I en el medio de cultivo. La hidrólisis espontánea de C3 durante el período biosintético de 3 días produce C3i que es disociado por esta actividad. En la C3 sin mutar, esto genera bandas de 43 kDa y 75 kDa (la banda 75 kDa es invisible porque (i) es ocultada por la cadena beta 75 kDa y (ii) el anticuerpo usado para desarrollar la corrida Western tiene muy poca actividad hacia esta porción de la cadena alfa de C3 : su presencia se confirmó subsecuentemente mediante un resondeo con un anticuerpo monoclonado de rata, "Clon-3", que es específico para esta región) . La adición de factores H e I sin CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C) , no disoció el C3 remanente, lo cual indica que representa C3 activo (tioléster intacto) . 2. El C3 sin mutar (1) es disociado por CVFBb y el producto C3b es disociado adicionalmente por enzimas endógenas en 1-B o por factores H e I agregados en 1-D. La banda 43 kDa indica disociación en Arg1320 y la banda 68 kDa (visible en exposiciones más prolongadas) indica disociación en Arg1303. 3. El mutante C3M-I23 (Arg1303->Gln) fue disociable por CVFBb y el producto fue relativamente resistente a la actividad endógena similar a la de los factores H e I (2-B) , persistiendo cantidades distintas de cadena alfa' (C3b) , pero aún era disociable al agregar factor H e I extra (2-D) . El producto 43 kDa indica disociación en Arg1320, (una banda débil a 71 kDa representando el otro fragmento de la cadena alfa' se podría ver en exposiciones más prolongadas) pero no estaba presente la banda 68 kDa, mostrando que este mutante es resistente a la disociación en la Gln1303 mutada. 4. El mutante C3M-26 (Arg1303->Gln, Arg1320->Gln) fue disociable por CVFBb y el producto similar a C3b (alfa') fue resistente a la actividad endógena similar a la del factor H e I (3-B) . También fue muy resistente a los factores adicionales H e I (3-D) en comparación con el C3 sin mutar (1) y otros mutantes (2 y 4) . Se observó una pequeña cantidad de producto 46 kDa indicando alguna disociación en la Gln1303 mutada (el fragmento 68 kDa acompañante también fue visible en exposiciones más prolongadas) . Se observó muy poco 43 kDa, o no fue detectable, que hubiera correspondido a la disociación en Gln1320. Por consiguiente, la mutación Arg->Gln en la posición 1303 fue menos efectiva que la de la posición 1320 para impedir la disociación por el factor I. (Esta lenta disociación residual también podría estar ocurriendo en el mutante C3M-I23 (Arg1303->Gln) , pero probablemente el intermediario 46 kDa está siendo procesado rápidamente a 43 kDa por medio de disociación adicional en el Arg1320 sin mutar) .

. El mutante C3M-51 (Arg1320->Gln) fue disociable por CVFBb y el producto fue disociado por medio de actividad endógena similar a la de los factores H e I (4-B) , y mediante factores H e I adicionales (4-D) . El producto 46 kDa (y una débil banda 68 kDa) indican disociación en Arg1303. Sin embargo, la ausencia de una banda 43 kDa indica que no se disocia en la Gln1320 mutada. Ejemplo 5: Comparación de diversas sustituciones de aminoácidos en posición 1303. 1. Introducción Los ejemplos previos describen mutaciones de arg 1303 y arg 1320 a residuos de glutamina. Ambas mutaciones impartieron resistencia a la disociación por factor I en esas posiciones. Sin embargo, se presentó una pequeño, pero detectable, grado de disociación en gln 1303. Por consiguiente, se ha hecho y probado una serie de sustituciones de otros aminoácidos en esta posición. La disociación ocurre, en orden decreciente de eficacia, cuando el residuos 1303 es: Arg > Tyr > [Cys o Trp] > Gln > [Glu o Gly] . Estos resultados son inesperados debido a que (i) todas las disociaciones conocidas que se presentan naturalmente mediadas por el factor I humano ocurren en C-terminal para residuos de arginina, por lo que se podría deducir que la enzima tiene un requerimiento de arginina; y (ii) si se disociaba en otros residuos uno podría predecir que tendrían que ser electrostáticamente similares a arg, es decir, un residuo básico (lys o his) , por ejemplo, la tripsina disocia selectivamente C-terminal para arg, lys o his) , por lo que no se podría haber pronosticado la disociación de la sustitución de tirosina. Por consiguiente, se prefiere la sustitución de arg 1303 con glicina o ácido glutámico para propósitos de crear un derivado de C3 resistente a la inactivación por el factor I. 2. Métodos 2.1 Mutagénesis: el cebador mutagénico degenerado que se utilizó fue: caactgcccagc (gt) (ag) (cg) agctccaagatcacc (las letras que aparecen entre paréntesis indican mezcla de bases en esa posición) . Los mutantes fueron construidos por el método del plásmido con huecos (conforme a lo descrito en los ejemplos previos) o bien por el "método del megacebador" (V. Picard y colaboradores, Nuc Acid Res 22:2587-91, (1994)), en donde el cebador corriente arriba era caccaggaactgaatctagatgtgtccctc y el cebador corriente abajo era gttttatggtgaccttaaggtcg aatttatta. Todas la mutaciones fueron realizadas en plantillas en las que el ADN codificador de C3 ya había sido mutado de manera que ese residuo de aminoácido 1320 era glutamina y se había introducido un sitio de restricción para AflIII en la posición 4149 (conforme a lo descrito en los ejemplos previos) y fueron confirmados por secuenciamiento de ADN . 2.2 Expresión: los mutantes se expresaron en células COS usando el vector pcDNA3 conforme a lo descrito en los ejemplos anteriores, marcado biosintéticamente con [35S]metionina en medio libre de suero. 2.3 Ensayo: los sobrenadantes fueron tratados con CVFBb (formado por reacción de CVF con factores B y D en un regulador de pH que contenía magnesio) y factores H e I, seguidos por inmunoprecipitación con anti-C3 y separación mediante electroforesis en gel SDS-poliacrilamida realizada bajo condiciones reductoras (conforme a lo descrito en los ejemplos previos) . El gel se fijó, trató con reactivo "Amplificador" Amersham, se secó y se expuso a película de autorradiografía para obtener el resultado que se ilustra en la figura. 3. Resultados La disociación mediada por el factor I en la posición 1303 (sitio 1) , sin disociación en 1320 (sitio 2) (cuando éste ha sido mutado a glutamina) produce bandas de 46 y 68 kDa. Se puede observar que ocurre disociación en el siguiente orden: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) y trp(W) > gln(Q) > gly(G) y glu(E) . El tipo silvestre (arginina en ambas posiciones) se disocia en ambas posiciones para producir fragmentos de 43 (demasiado pequeños para ser visibles en este gel) y 68 kDa. 4. Figura Los resultados se ilustran en la Figura 4. Los residuos en el sitio 1 (posición 1303) y en el sitio 2 (1320) se indican arriba de las respectivas pistas. Ejemplo 6: Demostración de resistencia mejorada a la inactivación por factores Ii y H después de la mutación de arg 1303 a gln 1. Introducción Los ejemplos anteriores demostraron que la conversión de arg 1303 o de arg 1320 a glutamina hacia el sitio resistente a disociación por el factor I. La mutación de ambos sitios hace una molécula que es resistente a disociación en cualquiera de los sitios. Aquí, demostramos además que la mutación de arg 1303 a gln solamente (sin alteración de arg 1320) da como resultado una considerable resistencia, en comparación con el tipo silvestre, para la inactivación funcional por los factores I y H. 2. Método 2.1 Expresión: La preparación de la mutación 1303->gln se describió en un ejemplo anterior. Esta se transfectó en CHO (una línea común de células de laboratorio de células de ovario de hámster chino) por el método del fosfato de calcio y los transfectantes estables seleccionados en base a la resistencia a G418 ("Geneticin" disponible en Sigma) . Se recolectaron los sobrenadantes del cultivo celular, y la C3 expresada se purificó parcialmente mediante precipitación de sulfato de sodio (fracción 10-20% (p/v) ) y cromatografía de intercambio iónico en Q-sefarosa y mono-Q-sefarosa (A W Dodds Methods Enzymnol 223: 46 (1993)). 2.2 Ensayo: Se recubrieron eritrocitos de oveja con anticuerpo monoclónico S016 (R A Harrison y P J Lachmann Handbook of Experimental Immunology 4 a Edición, capítulo 39 (1986)) y 4.4 mi de una suspensión al 5% (v/v) se incubó posteriormente con aproximadamente 10 µg C2 , 24 µ C4 y 1 µg Cl (componentes humanos purificados) durante 10 min a 37 °C en CFD (R A Harrison y P J Lachmann supra) . 0.8 mi de esta mezcla se incubaron entonces durante 105 min con 0.25 mi que contenían el C3 mutante semi-purificado o el tipo silvestre y EDTA hasta una concentración final de 12.4 mM. Posteriormente las células se lavaron en CFD y se usaron en CFD que contenía gelatina 0.1% (p/v) (CFD-gel) . Se usó fijación del radioligando con anticuerpo anti-C3 monoclonado clon 4 [135I]-marcado para confirmar que se depositaron cantidades similares de C3b tipo silvestre o mutante. Para el ensayo, 40 µl de una suspensión al 5% de células se diluyó en 150 µl de CFD-gel y se incubaron alícuotas de 50 µl con 50 µl de CFD-gel que contenían diluciones de los factores I y H a concentraciones finales de 100, 10, 1 y 0 µg/ml cada una, a 37°C durante 30 min. Entonces se agregaron 0.9 mi de CFD, las células se aglomeraron por centrifugación y se lavaron dos veces más con 1 mi de CFD cada vez. Subsecuentemente, las células se resuspendieron en 100 µl de CFD-gel que contenía 100 µg/ml de factor B, 100 µg/ml de properdin, 1 µg/ml de factor D y 0.3 mM de NiCl2. Después de 10 minutos a 37 °C, se agregaron 0.9 mi de CFD que contenía 10 mM de EDTA y suero al 2% (v/&v) de conejillo de indias normal. Después de 30 min adicionales a 37°C, se aglomeraron por centrifugación células sin lisar y se determinó el grado de lisis midiendo la absorbancia del sobrenadante a 412 nm. El equivalente de absorbancia del 100% de lisis se determinó en una alícuota de células lisadas en agua, y así se calculó el porcentaje de lisis. Este ensayo mide la capacidad de la C3b depositada para formar una convertasa C3bBbP funcional. La conversión a iC3b impide la formación de convertasa y la lisis subsecuente en suero/EDTA. 3. Resultados El resultado que aparece en la figura indica que se requiere más de diez veces del factor I y del factor H para eliminar la actividad hemolítica del mutante de arg 1303->gln, en comparación con el tipo silvestre. Por lo tanto, esta mutación es conveniente para la creación de un derivado de C3 cuyo producto C3b es resistente a la inactivación por parte de los factores H e I. El efecto puede deberse a la mayor resistencia a la disociación en la posición 1303 (cuando arg es mutado a gln) , o a la mayor resistencia a la disociación en la posición 1320 cuando la disociación puede llevarse a cabo primero en la posición 1303. 4. Figura Los resultados se ilustran en la Figura 5. El eje x indica la concentración de los factores H e I. Ql representa la mutación arg 1303->gln. El % de lisis se mide como se describe en los métodos. Discusión Las características esenciales de C3 Humana, con respecto a las variantes modificadas descritas en la presente son como sigue: (i) La molécula tiene un derivado funcionalmente similar a C3b en que puede combinarse con el factor B humano funcionalmente activo, que subsecuentemente se puede disociar en factor D humano para formar una enzima capaz de disociar C3 humano. (ii) Las secuencias de aminoácidos de derivados son más homologas a C3 de humanos que a C3 de cualquier otra especie para la cual actualmente se conozca una secuencia o para cualquier otra secuencia de proteínas actualmente conocida. Las características estructurales de C3 presentes en la proteína tipo silvestre, pero no necesariamente en derivados modificados, incluyen las siguientes: (a) La secuencia que codifica ADN y la secuencia de proteína transladada para la variante de C3 humana que se usan en los ejemplos de la invención aquí descrita se ilustran en las Figuras 2 y 1 respectivamente. Esta secuencia de proteína difiere de la secuencia publicada [2] sólo en dos aminoácidos (los detalles se muestran en los ejemplos). Se asume que muchas más variaciones son compatibles con la función C3, aún cuando la mayoría no estarán presentes en la población. (b) El producto primario de translación es procesado proteolíticamente en dos cadenas enlazadas por disulfuro, alfa (residuos 672-1663) y beta (residuos 23-667) , con remoción de la secuencia de señales (residuos 1-22) . (c) La proteína madura contiene un enlace tioléster entre los residuos CyslOlO y Glnl013. (d) Las convertasas C3 disocian C4 para eliminar C3a (residuos 672-748) . Esta reacción es seguida por la ruptura del enlace tioléster. (e) En presencia del factor H, el factor I disocia C3b entre los residuos Argl303 y Serl304, y entre Argl320 y Serl321.

Modificaciones a la molécula C3 nativa Reemplazo de Argl303 por Gln Esta modificación es efectuada por el factor I en un sitio de disociación de C3b. El efecto es reducir la velocidad de disociación por parte del factor I a su posición. Se seleccionó el cambio a glutamina para eliminar la carga positiva de la arginina, que probablemente es importante para la actividad de la proteasa de serina del factor I, mientras que se conservó un carácter hidrofílico y un tamaño similar de cadena lateral que debe minimizar cualquier interrupción a la estructura de la protelna terciaria. La evidencia que respalda esta suposición es que la mutación no impide el procesamiento en una estructura de dos cadenas, la formación de un tioléster o la disociación de C3 por la convertasa C3. La mutuación de Argl303 a otro aminoácido puede lograr un efecto similar o hasta superior, como se demuestra en el Ejemplo 5. También es posible reducir esta disociación mediante la mutación de Serl304 (el otro lado del sitio de disociación) u otros residuos implicados en la interacción enzima-sustrato.

Reemplazo de Argl320 por Gln Esta modificación es en el otro sitio de disociación de C3b por el factor I. El efecto consiste en reducir drásticamente (virtualmente anular) la velocidad de disociación por parte del factor I a su posición. El cambio a glutamina se hizo conforme a los mismos criterios antes descritos, y esta mutación tampoco impidió el procesamiento en una estructura de dos cadenas, la formación de un tioléster ni la disociación de C3 por parte de la convertasa C3. Nuevamente, la mutación a otro aminoácido puede lograr el mismo efecto, que la mutación de Serl321 u otros residuos implicados en la interacción enzima-sustrato. Cuando se combinan las dos mutaciones, Argl303-Gln y Argl320-Gln, protegen la C3b contra la desactivación y, por lo tanto, mantienen su capacidad para formar parte de una convertasa C3bBb activa. También se pueden usar otras mutaciones (incluyendo combinaciones de las mutaciones) que anulan ambas reacciones de disociación (por ejemplo Arg 1303 Glu ó Arg 1303 Gly se pueden usar en combinación con Arg 1320 Gln) . Ejemplo 7: Diversas mutaciones que reducen la interacción de C3b/C3i con el factor H 7. i Introducción Otros laboratorios han producido evidencia en base a los efectos de péptidos sintéticos (Ganu, V.S. y Muller-Eberhard, H.J. , 1985, Complement 2:27; Becherer, J.D. y colaboradores, 1992, Biochemistry 31: 1787-1794), o bien en base a mutagénesis limitada (Taniguchi-Sidle, A. e Isenman, D.E., 1994 J. Immunol. 153: 5285-5302) para sugerir que los residuos 752-761 en la secuencia primaria de la transcripción de C3 (véase Figura 1) podrían estar implicados en la interacción con el factor H. Sin embargo, otras evidencias publicadas sugieren que sólo los residuos 767-776 están involucrados en la interacción con el factor H, mientras que los residuos 752-761 son importantes para la interacción con el factor B (Fishelson, 1991, Mol. Immunol. 28:545-552).

Presumimos que una mutagénesis más extensiva de esta región podría reducir la afinidad por el factor H y, por consiguiente, que es conveniente para el objetivo de crear un derivado de C3 que sea resistente al factor H. Además, supusimos que los residuos importantes para mutar podrían ser los residuos ácidos prominentes (ácidos aspártico y glutámico) y que sería conveniente cambiarlos a residuos neutros que tienen menor probabilidad de mediar interacciones fuertes. En este ejemplo cambiamos el residuo 752-754 de Asp-Glu-Asp a Gly-Ser-Gly, en combinación con el cambio de residuos 758-760 de Glu-Glu-Asn a Gly-Ser-Gly. El producto obtenido redujo las características de disociación de manera consistente con una reducción en la susceptibilidad al factor H. Esto es evidencia de que C3 se puede modificar para reducir la fijación del factor H y, por lo tanto, la susceptibilidad a los factores H e I. Estas modificaciones son deseables para la creación de una convertasa C3 estable bajo condiciones fisiológicas. 7.2 Método En los ejemplos anteriores se describieron los métodos de mutagénesis, expresión y análisis. El oligonucleótido mutagénico que se sintetizó tenia la secuencia: agtaacctgggttcgggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc. 7.3 Resultados Los resultados de las reacciones de disociación se ilustran en la Figura 6. Estos indican que: 1. La adición de CVFBb a C3 tipo silvestre da como resultado la eliminación de la cadena alfa (pista 2) debido a que C3b que se forma es susceptible a las bajas concentraciones de los factores I y H en el sobrenadante del cultivo. La C3i formada durante la expresión de esta incubación subsecuente se descompone en iC3i de la misma forma. Por consiguiente, la adición de los factores I y H exógenos (pistas 3 y 4) no son diferentes a las pistas l y 2, respectivamente, debido a que el propio medio contiene suficiente actividad de los factores H e I para efectuar la disociación completa. 2. En contraste, el tratamiento de la C3 mutante con CVFBb (pista 6) no da como resultado la desaparición de la cadena alfa. Existe alguna generación de alfa', que corresponde a C3b, pero el total o alguna parte de ésta permanece, lo cual indica que la persistencia de la cadena alfa no es meramente el resultado de la falta de disociación por parte de CVFBb. La cadena alfa remanente no disociada en la pista 2, por consiguiente, puede representar C3i que no ha sido disociada por las actividades endógenas de los factores H e I, aunque también es posible que un poco de ésta represente la persistencia de C3 nativa si el mutante ha adquirido una resistencia parcial a CVFBb. La adición de altas concentraciones de factores H e I exógenos (pistas 7 y 8) produce el agotamiento de cadenas alfa y alfa', indicando que (i) el mutante no es completamente resistente a estos factores, y (ii) la cadena alfa no disociada por CVFBb en la pista 2 se deriva predominantemente de C3i (que puede ser disociada por los factores H e I, pero no por CVFBb) y no de C3 nativa (que puede ser disociada por CVFBb, pero no por los factores H e I) . Incluso no toda la cadena alfa es disociada, aún en la pista 8, probablemente debido a la resistencia a los factores H e I. Por consiguiente, la mutación de los residuos 752- 754 y de los residuos 758-760 puede generar una molécula de C3 que aún puede ser disociada por convertasas C3, pero que es parcialmente resistente a los factores H e I. En virtud de otros datos publicados, esto es más probable debido a que las mutaciones han modificado una región que está involucrada en la interacción con el factor H, y, por lo tanto, ha dado como resultado una afinidad reducida por el factor H. Ejemplo 8: Un sitio en C3 que puede mutarse para modificar la interacción de C3i con factor B. 8.1 Introducción Los ejemplos anteriores han demostrado que las mutaciones a C3 pueden modular las interacciones con los factores H e I. A fin de descubrir otros sitios en C3 que puedan interactuar con factor B, comparamos las secuencias conocidas de las moléculas C3 de diferentes especies, así como con secuencias disponibles para C4 y otras proteínas homologas. Identificamos la región correspondiente a los residuos 1427-1433 de la C3 humana que podrían estar involucrados en las funciones específicas de C3 y C4. Esto podría incluir interacción con el factor B (o su homólogo C2 , en el caso C4), pero no necesariamente debido a que otras funciones potenciales incluyen formación de tioléster, con versión en C3b (o forma C4b) , interacción con sustratos C3 y/o C5 en la actividad de convertasa y en la interacción con el factor I y sus cofactores. Por lo tanto, se mutaron los residuos seleccionados en los residuos correspondientes (con base en las alineaciones de secuencias) encontrados en otra proteína homologa, en este caso C5 humana. Así, el residuo 1427 se cambió de una Arg a una Gln, el residuo 1431 de una Lys a un Asp, y el residuo 1433 de Glu a una Gln. Se encontró que el mutante resultante era susceptible a ser disociado por la convertasa C3 (CVFBb) y el producto C3b podía ser disociado por los factores H e I. Sin embargo, este mutante no soportó la conversión del factor B a Bb más Ba, que depende de la fijación del factor B a C3i (o C3b) . Por lo tanto, tenemos evidencia de que la mutación de esta región disminuyó la interacción con el factor B. Aunque esto no es conveniente para la generación de una convertasa C3 super-activa, proporciona una indicación de que otras modificaciones a esta región de C3 también alterarán la interacción con el factor B, y probablemente algunas de éstas incrementarán la afinidad. Como consecuencia, dichas mutaciones pueden incrementar la estabilidad y actividad de la enzima convertasa bimolecular, C3bBb (o C3iBb) . 8.2 Métodos Las alineaciones que aparecen en la Tabla 1 ilustran la razón por la que consideramos que esta región era candidato para mutagénesis. Asumimos que los caracteres de ciertos residuos se conservaban bien en C3 y C4 , pero que eran muy diferentes en otras proteínas. Se seleccionaron los residuos 1427, 1431 y 1433 debido a que su naturaleza podría ser indicadora de grupos involucrados en las interacciones proteína-proteína. Se hicieron los cambios a los residuos correspondientes en C5 humana debido a que éstos mostraron propiedades electrostáticas muy diferentes, pero dentro del contexto de algunos otros de los residuos conservados que podrían indicar una estructura local similar.

Tabla l Alineaciones de secuencias de C3 y moléculas relacionadas para región de residuos 1427-1435 de C3 humana. RESIDUO (Humano) En los ejemplos anteriores (Ejemplos 1-4) se describieron métodos de mutagénesis, expresión y análisis de reacciones de disociación de C3. Se sintetizó oligonucleótido mutagénico con la siguiente secuencia: tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa . Ensayo para producción de factor B. Se purificó el producto expresado del medio de células COS mediante purificación por afinidad en una columna de Clon-3-Sefarosa según se describe en el Ejemplo 9. Este método da como resultado una conversión considerable de la forma fraccionada de tioléster, C3i. Se aisla C3 tipo silvestre mediante el mismo procedimiento. Se corrieron diluciones de C3 tipo silvestre (1/5, 1/25 y 1/125) en un gel SDS-PAGE (condiciones reductoras) junto con la C3 mutante, y la tinción con plata indicó que el mutante estaba presente a una concentración equivalente a una cantidad ligeramente inferior de 1/25, pero bastante superior de la dilución 1/125 del tipo silvestre. Se emplearon las mismas diluciones en el ensayo de producción de factor B. Se incubaron 5 µl de C3 con 25 µl de CFD-G conteniendo 5 µgl/ml de factor D y aproximadamente 1.6 µgl/ml de factor B marcado con I125 (aproximadamente 1000-2000 dpm/µl) para 3h a 37°C. Posteriormente se analizaron las muestras mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) con autorradiografía de gel seco. Los resultados se muestran en la Fig. 7. 8.3 Resultados Conforme se muestra en la Figura 7, la disociación diferente de factor B se presenta aún a una dilución de 1/125 de la C3 tipo silvestre (C3i) . En contraste, no se observó disociación significativa en presencia de C3 mutante, aun sin diluir el cual debería estar a una concentración superior a la muestra de 1/125 del tipo silvestre. Este mutante por consiguiente parece tener una capacidad deteriorada para soportar la disociación del factor B, más probablemente debido a una reducción en su afinidad de fijación para el factor B. Por lo tanto, esta es una región de C3 que puede ser mutada para modular la interacción entre C3i o C3b) y el factor B, y probablemente también la estabilidad de la convertasa (C3iBb o C3bBb) . Ejemplo 9: Purificación de moléculas de C3 mutante 9.1 Introducción El presente ejemplo demuestra la forma en que se pueden aislar moléculas C3 mutantes, de un medio de expresión como por ejemplo el medio de cultivo de células eucarióticas transfectadas. Mediante purificación por afinidad simple se obtienen moléculas de C3 con la pureza suficiente para pruebas funcionales y conjugación con anticuerpos por el método descrito en el Ejemplo 10. A pesar de que la elución de un anticuerpo va acompañada de hidrólisis de una proporción considerable del tioléster interno, el producto de C3i todavía es un precursor adecuado para la generación de una convertasa C3 activa, así como para la producción de conjugados de anticuerpo C3. Es probable que este método también sea útil como parte de la preparación requerida para uso in vivo. 9.2 Método Purificación por afinidad en Clon-3-Sefarosa. El clon-3 es un anticuerpo onoclónico de rata que es específico para C3 y sus derivados, incluyendo C3b y C3i (Lachmann, P. J. y colaboradores, 1980, J. Immunol. 41:503-515) . Están disponibles otros anticuerpos monoclónicos contra C3, y en algunos casos se han usado eficazmente para aislar C3 de cantidades pequeñas de plasma humano (Dodds, A. W. , 1993, Methods Enzymol. 223:46-61) y por lo tanto es probable que sean aplicables para el aislamiento de moléculas expresadas ex vivo. Se acopló la fracción IgG a Sefarosa CL-4B utilizando bromuro de cianógeno (se puede encontrar la metodología en Harrison y Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, Cuarta Edición, Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell y Herzenberg; Blackwell, Oxford) . Los sobrenadantes del cultivo se pasaron directamente a través de una columna de esta resina (recircularon) o primero se concentraron mediante precipitación con 35% (p/v) Na2S04, y resolubilización y diálisis en PBS, 5 mM NaN3. Posteriormente se lavó la columna sucesivamente con (i) PBS, 5 mM NaN3, y (ii) PBS con NaCl 1 M. La C3 fijada se eluye con 50 mM de regulador de borato de Na, pH 10.5, y se neutraliza inmediatamente mediante recolección de fracciones de 0.9 mi en 0.1. mi de Tris/HCl 1 M pH 7. El material posteriormente se dializa en PBS, 5 mM NaN3. Preparación de C3 portadora de una "Marca His" Una "Marca His" es una hilera de residuos de histidina que muestran afinidad por las columnas portadoras de iones de níquel. Se ha empleado este método para auxiliar en el aislamiento de proteínas expresadas. Consideramos que lo anterior podría ser útil para el aislamiento de moléculas C3 mutante expresadas de tal forma que hemos utilizado mutagénesis de inserción para generar un plásmido que codifica C3 con una cola de 6 residuos de histidina en la terminal carboxi (inmediatamente terminal carboxi para el residuo 1663) . Se seleccionó esta ubicación para la marca his para reducir al mínimo la interferencia con la síntesis, doblamiento, procesamiento y formación de ligaduras de disulfuro de C3 naciente. El residuo 1661 es un residuo de cisteína que participa en una ligadura de disulfuro a un residuo anterior en la secuencia (probablemente Cis 1537; Dol er, K. y Sottrup-Jensen, L. , 1993, FEBS-Lett 315: 85-90) y por lo tanto pareció prudente hacer la inserción más allá de esta característica estructural. Se introdujo la mutación empleando la técnica "Gapped-Plamis" que se utilizó en el Ejemplo 1, usando el oligonucleótido mutagénico sintetizado con la secuencia: tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacaccccc. Se confirmó la incorporación de la secuencia correcta mediante el secuenciamiento de ADN. Esta secuencia de ADN ahora puede ser transferida a un vector de expresión. Después de la transfección de células eucarióticas, debe ser posible aislar C3 expresada mediante afinidad a una columna portadora de iones de níquel, o mediante cualquier otra matriz con afinidad específica para la "Marca His". 9.3 Resultados Se purificó una cantidad de C3 mutante en Clon-3- Sefarosa, incluyendo las descritas en los Ejemplos 1 y 2 expresadas en células de ovario de hámster chino. Los productos conservaron la capacidad para soportar la disociación de factor B mediante factor D. Se utilizó el mismo método para aislar el mutante descrito en el Ejemplo B2 , expresado en células de COS. La tinción con plata de gel SDS-PAGE indicó que los productos aislados no eran 100% puros, pero a menudo parecían tener una pureza superior o igual al 50%. Esto proviene de materiales de partida que generalmente contienen menos de 10 µg/ml de C3 en suero vacuno fetal al 10% (v/v) más otras proteínas celulares. Además, no se degradaron C3s durante el aislamiento, y la actividad endógena de los factores H e I parecía haberse eliminado. La purificación en virtud de la "Marca His" involucra condiciones de elución más moderadas de una columna portadora de iones de níquel. Por ejemplo, se empleó EDTA. La aplicación de este método en C3 por consiguiente debería permitir el aislamiento sin ruptura de la ligadura interna tioléster. Ejemplo 10: Conjugación de C3i con anticuerpo y uso para la actividad de convertasa C3 objetivo contra una célula en particular. 10.1 Introducción Un aspecto de la invención es que convertasas C3 estables derivadas de moléculas C3 mutantes producirán una conversión mejorada de C3, la cual, en caso de localizarse en un sitio objetivo en particular, promoverá un ataque dependiente del complemento a ese objetivo. El método mejorado para dirigir la respuesta es acoplar la molécula C3 mutante, ya sea como el derivado de C3i o C3B, a un anticuerpo específico para el objetivo deseado. En este ejemplo, demostramos una metodología funcional para la formación de dichos conjugados, la cual es aplicable a moléculas C3i mutantes o C3b y puede emplearse en material purificado por afinidad de un sistema de expresión, aún cuando el tioléster de C3 no se haya fraccionado en el proceso. Al acoplar C3i a un anticuerpo que se ligue específicamente a eritrocitos de oveja, mostramos adicionalmente que el conjugado fija C3i en la superficie del eritrocito de tal manera que se pueda formar una convertasa, C3iBbP, que inicie la lisis de estas células cuando se suministren otros componentes del complemento en forma de suero normal de conejillo de Indias (en EDTA para evitar la nueva formación de convertasas C3) . En consecuencia, la conjugación con anticuerpos se puede emplear para dirigir una molécula C3 para iniciar un ataque dependiente del complemento de un tipo de célula en particular. En este ejemplo se emplea C3i de tipo silvestre, de plasma humano, que forma in vitro una convertasa C3. In vivo, la C3i de tipo silvestre y C3b se descomponen en factor H e I. Por consiguiente, una C3 mutante producida de conformidad con los planes de la presente patente, que sea resistente a los factores H e I y por lo tanto forme una convertasa C3 estable, sería útil en un contexto fisiológico. 10.2 Método (i) Generación y purificación de conjugado de anticuerpo C3i. El anticuerpo que se empleó fue la fracción IgG aislada de un antisuero policlonado de eritrocitos anti-oveja conejo. Se incubaron 1.1 mg con 75 nmol de SPDP en regulador de conjugación, pH 7.5 (20 mM de KH2P04, 60 mM de Na2HP04, NaCl 0.12 M) durante 2 h a temperatura ambiente. Se purificó PDP-IgG mediante filtración con gen en una columna de Superosa-6 (Pharmacia) (en un regulador de fosfato, pH 7.4, con NaCl 0.5 M) . Se empleó la reducción de una muestra con ditiotreitol para estimar 4 grupos PDP acoplados por molécula de IgG. Se preparó C3i mediante tratamiento de C3 purificada con metilamina 0.1 M, pH 7.2 (2h a 37°C). Se eliminó el exceso de metilamina mediante filtración con gel seguida de diálisis en regulador de conjugación. Se mezclaron 18 nmol de C3i con 1.7 nmol de PDP-IgG en 1.26 mi de regulador de conjugación y se incubaron durante 1 día a temperatura ambiente seguida por 1.5 días a 4°C. En la Figura 8 se muestra la tinción de Azul de Coomassie de gel SDS-PAGE de la mezcla de reacción de conjugación que muestra la apariencia de una especie de aproximadamente 350 kDa que no estuvo presente en PDP-IgG, ni en C3i. Esta especie se purificó parcialmente mediante filtración con gel en la columna de Superosa-6 en un regulador de fosfato, pH 7.4, que contenía NaCl 0.5 M y posteriormente se dializó en PBS. Eluyó antes de C3 , en un volumen cuyo peso peso molecular se estimó en 300-400 kDa mediante calibración con estándares globulares de peso molecular. Se estimaron las concentraciones de conjugado, C3 libre de anticuerpos y sin acoplar, de una tinción con Coomassie de gel. SDS-PAGE (condiciones no reductoras) . SDS-PAGE de dos dimensiones (la primera dimensión sin reducir, la segunda dimensión reducida) reveló un patrón compatible con un conjugado 1:1 entre IgG y C3i. (ii) Demostración de que el conjugado de anticuerpo C3 se puede emplear para dirigir la actividad de la convertasa contra una célula en particular.

Se incubaron 20 µl de diluciones del conjugado (0 (no conjugado), 1/100, 1/50, 1/10) con 100 µl de aproximadamente 1% (v/v) de eritrocitos de oveja (prelavados en CFD) durante una hora a 37 °C. Se llevaron a cabo incubaciones paralelas con cantidades equivalentes de PDP-IgG (no C3) y C3 solas. Posteriormente se lavaron las células cuatro veces en CFD y se resuspendieron en 100 µl de CFD-G. Se lisaron 50 µl de lo anterior con 150 µl de H20, seguido de la adición de 800 µl de CFD con 10 mM de EDTA y suero de conejillo de Indias normal al 2% (v/v) . Los otros 50 µl de las células recubiertas por conjugado se incubaron durante 15 minutos a 37°C con 50 µl de CFD-G con 190 µg/ml de factor B, 2 µg/1 de factor D, 20 µg/1 de properdin y 0.6 mM NiCl2, seguida de lisis con 900 µl de CFD con 10 M de EDTA y suero de conejillo de Indias normal al 2% (v/v) . Después de 30 minutos a 37 °C, las células se aglomeraron por centrifugación (2000 X g, aproximadamente 3 minutos) y se midió la absorbancia óptica del sobrenadante a 412 nm. Conforme se muestra en la Figura 9, se calculó el porcentaje de lisis utilizando las muestras tratadas con H20 como lisis al 100% y un blanco de regulador de pH sin células. El conjugado produjo lisis dependiente de la dosis, mientras que PDP-IgG o C3i solas no generaron alguna lisis significativamente superior a la observada en ausencia de algún tratamiento de ese tipo. .3 Resumen de Resultados Se comprobó que el método empleado es útil para acoplar C3i a IgG, según se muestra mediante: 1. La formación de una banda de tamaño adecuado (aproximadamente 350 kDa) para un conjugado de 1:1 C3 : IgG que se muestra mediante SDS-PAGE en la Figura 8. 2. SDS-PAGE de dos dimensiones (primera dimensión sin reducir, segunda dimensión reducida) indicó que esta especie contiene tanto IgG, como C3i. 3. La característica de elución de esta especie en filtración con gel es consistente con una molécula de aproximadamente 350 kDa. 4. El conjugado exhibe • una actividad hemolitica que PDP-IgG o C3i no exhiben. El ensayo hemolítico (Figura 9) además demuestra que: 1. El anticuerpo de eritrocito anti-oveja específico localizó la C3i en la membrana de la célula objetivo (eritrocito de oveja) , evitando que éste fuera eliminado mediante el lavado (en contraste con la C3i libre) . 2. El conjugado conserva la actividad de C3i debido a que todavía es capaz de formar una convertasa C3 por reacción con properdin y factores B y D. 3. Esta convertasa puede iniciar un ataque dependiente del complemento del objetivo, en este caso mediante la activa-ción de la trayectoria lítica (C5-9) para lisar el eritrocito.

Información adicional de otros laboratorios muestra que el factor de ponzoña de cobra puede acoplarse a un anticuerpo y que estos conjugados pueden dirigirse a la activación del complemento contra un tipo en particular de célula (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Ther. , 1:191-224; Muller, B. y Muller-Ruchholtz, W. , 1987, Leuk. Res. 11:461-468; Parker, C.J., White, V.F. y Falk, R. J. , 1986, Complement 3:223-235; Petrella, E. C. y colaboradores, 1987, J. Immunol. Methods 104:159-172). Conforme se describe en la presente invención, estos datos apoyan el argumento de que C3 modificada de manera que sea capaz de formar una convertasa C3 estable, al igual que el factor de ponzoña de cobra, podría utilizarse para dirigir la respuesta mediada por el complemento. Ejemplo 11: Demostración de que las moléculas C3 mutantes inducen la producción de factor B en suero humano normal. 11.1 Introducción Un propósito importante de la invención aquí descrita es el agotamiento de consumo de la actividad del complemento de fluidos biológicos. En la invención se describen métodos para la fabricación de moléculas C3 resistentes a la regulación descendente de los factores H e I. Así, éstas fijarán el factor B y generarán convertasas C3 activas. La actividad de estas convertasas se demuestra mediante el ensayo hemolítico empleado en el Ejemplo 6. Una convertasa de este tipo por consiguiente consumirá C3. Si la convertasa es inestable, se disociará sin una gran conversión de C3. Sin embargo, esto permitirá la fijación de factor B fresco y su conversión a Bb y Ba. Por lo tanto, la C3 mutante promoverá el consumo del factor B, finalmente provocando la deshabilitación de la trayectoria alterna, y su incapacidad para amplificar la estimulación de la trayectoria clásica. Si se forma una convertasa C3 estable, se reducirá la producción del factor B, pero se incrementará el consumo de C3. Por consiguiente, ambas situaciones puede ser deseables. En este ejemplo, demostramos que las moléculas C3 mutantes que son modificadas para hacerlas resistentes al factor I, pero sin alteración alguna para modificar la estabilidad de la convertasa, promueven la producción acelerada del factor B en suero humano. La C3 de tipo silvestre, en contraste, no ocasiona una producción significativa, probablemente debido a que la C3i de tipo silvestre es degradada rápidamente por los factores H e I. 11.2 Método Se prepararon los Mutantes de la manera siguiente: Q1R2 Argl303 cambió a Gln (Ejemplo 2) Q1Q2 Argl303 cambió a Gln, y Argl320 cambió a Gln (Ejemplo 1) E1Q2 Argl303 cambió a Glu, y Argl320 cambió a Gln (Ejemplo 5) Conforme se describe en el Ejemplo B3 , todos estos mutantes se expresaron en células de ovario de hámster chino y posteriormente se purificaron mediante precipitación con Na2S04, seguida de purificación por afinidad en Clon-3-Sefarosa. La C3 tipo silvestre. (R1R2) se aisló en forma similar. Mediante SDS-PAGE con tinción con plata, la concentración de Ql era de entre 1/5 y 1/25 del tipo silvestre, la concentración de Q1Q2 era aproximadamente de 1/5 con respecto a la del tipo silvestre, y la concentración de E1Q2 era de entre 1/25 y 1/25 con respecto a la del tipo silvestre. Todas las preparaciones probablemente contenían una mayoría de moléculas fraccionadas de tioléster (C3i) . Se incubaron 10 µl de estas preparaciones de C3 con 10 µl de una solución de suero humano normal al 20% (v/v) en PBS con 1 mM de MgCL2 y aproximadamente 300 ng de factor B marcado con 1 5I (aproximadamente 2-300,000 dpm) durante una hora a 37 °C. Posteriormente se analizaron 5 µl mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) . El gel seco fue expuesto a la película autorradiográfica para indicar las posiciones de las bandas correspondientes al factor B intacto y a sus productos de disociación. Posteriormente se escindieron y contaron para determinar en forma precisa los grados de disociación. Como antecedente, se restó el valor obtenido en el regulador de pH solo (abarcando no solamente la disociación esencial, sino también los productos de degradación y otras impurezas presentes en la preparación de radioligando) . 11.3 Resultados Los grados resultantes de la disociación de factor B aparecen a continuación: 1/25 de tipo silvestre 1.49% 1/5 de tipo silvestre 2.74% Q1R2 6.19% Q1Q2 7.41% E1Q2 6.42% Por lo tanto, todos los mutantes resistentes al factor I producen niveles de disociación de factor B superiores a las cantidades equivalentes de C3 de tipo silvestre (C3i) . Con dosis mayores o incubaciones prolongadas, se deberá producir la inhabilitación total de la trayectoria alterna. Las abreviaciones empleadas en los ejemplos anteriores incluyen: CFD, diluente de fijación del complemento (definido en Harrison y Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, Cuarta Edición, Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell y Herzenberg; Blackwell, Oxford) ; CFD-G, CFD con gelatina al 0.1% (p/v); PBS, solución salina con regulador de fosfato; NGPS, suero de conejillo de Indias normal; SDS-PAGE, electroforesis con gel SDS-poliacrilamida; SPDP, N-Succinimidil-3-[2-piridilditio]propionato.

REFERENCIAS: 1. Bermann, M. y Fruton, J.S. (1941) Adv. Enzymol., 1:63-98. 2. de Bruijn, MH y Frey, G.H. (1985) Prot. Nati. Acad. Sci. E.U. 82:708-702. 3. Crawford-MH y colaboradores (1988) Circulation. 78:1449-58. 4. Daha, M.R. y van Es.L.A. (1982) Immunol. 43:33-38.

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Chem. 267:635-643. 26. Hofer, B. y Kuhlein, B. (1993) Methods Enzymol. 217:173-189. 27. Morinaga, Y., Franceschini, T. , Inouye, S. y Inouye, M. (1984) Bio-Technology 2:636-639. 28. Harrison, R. A. y Lachmann, P.J. (1986) "Handbook of Experimental Inmunology" (eds Weir, Herzenberg, Blackwell y Herzenberg; Blackwell, Oxford) Cuarta Edición. 29. Kotwal, G. , J. , y Moss, B. , Nature (1988) 335 (6186): 176-8.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES 1. Una proteína nativa de trayectoria del complemento modificada de tal forma que la proteína es capaz de formar una convertasa C3 estable.
2. 2. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 que es una proteína modificada.
3. 3. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que es más resistente a la disociación por el factor I que la proteína nativa.
4. 4. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 , que es una proteína C3 modificada.
5. 5. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual la proteína se modifica mediante el reemplazo de Arg-1303 o Arg-1320, o ambos, mediante otro aminoácido.
6. 6. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 5, en la cual Arg-1303 o Arg-1320 es reemplazado por glutamina, tirosina, cistina, triptófano, ácido glutámico o glicina.
7. 7. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 6, en la cual Arg-1320 es reemplazado por glutamina.
8. 8. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en la cual Arg-1303 se reemplaza por ácido glutámico, glicina o glutamina.
9. 9. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores cuya susceptibilidad al factor H y/o Factor I se haya reducido en relación con la convertasa C3 humana, dicha proteína con uno o más cambios de aminoácidos relacionados con la convertasa C3 humana en la región correspondiente a los residuos amino 752-754 y/o residuos 758-780 de convertasa C3 humana nativa.
10. 10. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, en la cual uno o más cambios de aminoácidos son cambios de residuos ácidos de aminoácidos a residuos neutrales de aminoácidos.
11. 11. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en la cual los cambios de residuos de aminoácidos son cambios de Asp-Glu-Asp a Gly-Ser-Gly.
12. 12. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores con cambios de aminoácidos relacionados con convertasa C3 humana nativa en residuos de aminoácido correspondientes a los residuos 1427, 1431 y/o 1433 de la convertasa C3 humana nativa.
13. 13. Una secuencia de ADN codificada para una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. 14. Una construcción de ADN (por ejemplo, un vector) que se caracteriza por una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 13.
15. 15. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para su uso en terapia.
16. 16. Un conjugado que se caracteriza por ser una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 vinculado a una fracción de fijación específica.
17. 17. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 16, en la cual la fracción de fijación específica es una proteína de fijación específica.
18. 18. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 17, en la cual la fracción de fijación específica es un anticuerpo o un fragmento de fijación de antígeno de la misma.
19. 19. El uso de una proteina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones l a 12, o de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en la fabricación de un medicamento para su uso en niveles de agotamiento de la proteína de trayectoria del complemento.
20. 20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en la cual el uso del medicamento es para evitar el rechazo de partículas extrañas.
21. 21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, que se caracteriza por el uso del medicamento en la localización y/o ampliación de la conversión y deposición de la proteína endógena del complemento en un sitio específico.
22. 22. Una formulación farmacéutica que se caracteriza por una o más proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 incluyendo uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
23. 23. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22, que se usa en niveles de agotamiento de la proteína de trayectoria del complemento.
24. 24. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22, cuyo uso es para localizar y/o amplificar la conversión y deposición de la proteína del complemento en un sitio específico. 26. Un método para reducir la proteína de trayectoria del complemento en un mamífero que se caracteriza por la administración al mamífero de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 27. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual la proteína se administra como una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22.