MX2015002269A

MX2015002269A - Moleculas con actividad de union al antigeno y al receptor fc gamma polivalente.

Info

Publication number: MX2015002269A
Application number: MX2015002269A
Authority: MX
Inventors: Henrik Olsen; David Block
Original assignee: Gliknik Inc
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2015-07-06
Also published as: EP2885320A2; US20180094061A1; EP2885320A4; BR112015003459A2; JP2015527366A; CN104718223A; KR20150058236A; HK1210792A1; US20140072582A1; AU2013305885A1; CA2882296A1; US9683044B2; AU2013305885B2; RU2015109591A; WO2014031646A3; WO2014031646A2; IL237307A0

Abstract

La presente invención comprende proteínas biológicamente activas denominadas "stradobodies". Los stradobodies tienen dos o más dominios que crean multímeros de stradobodies. Los stradobodies tienen capacidad de unión al antígeno y la capacidad de unirse a receptores Fc (FcR), y son útiles para el tratamiento y la prevención de enfermedades.

Description

MOLÉCULAS CON ACTIVIDAD DE UNIÓN AL ANTÍGENO Y AL RECEPTOR FC GAMMA POLIVALENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en general, a los campos de la inmunología, la autoinmunidad, la inflamación, las enfermedades infecciosas y la inmunología tumoral. Más específicamente, la presente invención se refiere a moléculas biomiméticas biológicamente activas que comprenden dominios de inmunoglobulina Fe y dominios Fab, composiciones que comprenden los biomiméticos y métodos para fabricar y utilizar los biomiméticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia con anticuerpos monoclonales (mAb) es una parte importante de la medicina y que se encuentra en crecimiento. Se han aprobado más de 30 anticuerpos monoclonales para diversas enfermedades inmunológicas , enfermedades infecciosas y cánceres, ya sea en Estados Unidos o en Europa, y otras cientas se encuentran en investigación. Sin embargo, un problema común en el desarrollo de la terapia con anticuerpos monoclonales es la falta de eficacia adecuada a pesar de la unión Fab y FcR. Debido a las altas dosis que suelen ser necesarias para lograr la eficacia, los efectos secundarios adversos se asocian comúnmente con los anticuerpos terapéuticos. Además, una expresión baja o Ref.254621 alterada de los antígenos diana de tumores y de otro tipo, así como las mutaciones genéticas que afectan las dianas de anticuerpos o los efectos corriente abajo de la unión de anticuerpos, puede hacer que las terapias con anticuerpos sean ineficaces. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal trastuzumab es un mAb dirigido específicamente contra el antígeno del cáncer de mama HER2/neu que está disponible a nivel comercial con la marca Herceptin y está aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos para el tratamiento del cáncer de mama. El trastuzumab puede ser eficaz en pacientes con expresión alta de HER2/neu; sin embargo, aproximadamente el 90 % de los pacientes con cáncer de mama tienen tumores que no se clasifican como con alta expresión de HER2/neu. Como otro ejemplo, cetuximab, un mAb dirigido específicamente contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) que está disponible a nivel comercial con la marca Erbitux y está aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos para el tratamiento del cáncer de colon. Cetuximab bloquea la EGFR y detiene una vía de proliferación del tumor dependiente de la proteína KRAS corriente abajo. Desde una perspectiva clínica, cetuximab puede mejorar las tasas de respuesta generales así como la supervivencia libre de avance en los pacientes cuyos tumores tienen KRAS de tipo salvaje (WT). Lamentablemente, el 30-60 % de los pacientes con cáncer de colon tienen tumores con mutaciones en el codón 12 o 13 KRAS y los ensayos clínicos recientes sugieren que los pacientes con KRAS mutado no se benefician del tratamiento con cetuximab (resumido en Allegra et. al., Journal of Clinical Oncology, 20 abr 2009;27(12):2091-6). Por lo tanto, existe la necesidad de agentes terapéuticos basados en anticuerpos nuevos para el tratamiento de los cánceres, así como para el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios y las enfermedades inflamatorias.

La interacción y la agregación de receptores Fe, particularmente receptores con baja afinidad como FcyRIIIa, sobre células inmunitarias y especialmente sobre células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) por los anticuerpos produce la activación, desgranulación y lisis del tumor o célula diana, en un proceso conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). Las células tumorales y otras células a las que se dirige el sistema inmunitario también pueden ser destruidas a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés), en donde un anticuerpo se une al complemento, lo que produce la citotoxicidad celular; o a través de citotoxicidad directa (DC, por sus siglas en inglés) derivada de la unión del anticuerpo al antígeno directa sin células NK o complementos; o a través de otros mecanismos como la inducción de la apoptosis o la interferencia con el crecimiento o procesos celulares. Actualmente, existe la necesidad en la téenica de identificar medios para aumentar ADCC, CDC, DC y otros mecanismos para destruir las células tumorales u otras células, aumentando así la eficacia de las terapias de mAb. En particular, cuando las vías dependientes de complementos para la destrucción de las células son totalmente funcionales, la CDC pueden ser un método eficaz para destruir células cancerosas y otras células diana. Sin embargo, muchas células son resistentes a la CDC debido a los mecanismos de reparación de la membrana celular y las proteínas reguladoras como CD59, que inhibe la vía de complemento. Por ejemplo, a pesar de los altos niveles de expresión de CD20 en las células de linfoma de células B y de leucemia, muchos pacientes con neoplasias de células B no responden, o se vuelven resistentes, al tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-CD20 rituximab, al menos en parte debido a los mecanismos de inhibición de complemento (Harjunpaa et al., Scand. J. Immunol, 2000 51; 634-641). Por lo tanto, existe la necesidad particular de moléculas que sean capaces de aumentar la CDC.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moléculas biomiméticas biológicamente activas que comprenden dominios de inmunoglobulina Fe, dominios Fab y dominios de multimerización; composiciones que comprenden los biomiméticos; y métodos para fabricar y utilizar los biomiméticos. Estos biomiméticos tienen amplia aplicación para el tratamiento de cánceres, condiciones de enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias e infecciosas en donde se puede utilizar un anticuerpo monoclonal o ya se encuentra en uso clínico. Las biomiméticas de la presente invención tienen las ventajas de una citotoxicidad celular mediada por anticuerpos más potente, citotoxicidad celular mediada por complemento y unión a clq de complemento comparado con un mAb cuyo Fab es idéntico al Fab presente en los biomiméticos de la presente invención. Los biomiméticos de la presente invención también tienen la ventaja de una citotoxicidad celular dependiente de complemento y una citotoxicidad directa más potentes en comparación con un mAb cuyo Fab es específico para el mismo antígeno.

WO 2008/151088 describe el uso de moléculas biomiméticas que comprenden dos o más dominios Fe, preferentemente en el contexto de un "stradomero", al cual se une uno o más dominios Fab, para el tratamiento de afecciones patológicas incluidos cánceres, enfermedades autoinmunitarias y otras afecciones inflamatorias y enfermedades infecciosas. WO 2008/151088 se incorpora al presente mediante referencia en su totalidad. Las moléculas que comprenden un Fab descrito en WO 2008/151088 se denominan "stradobodies" y poseen las propiedades de unión al antígeno de la porción Fab de un anticuerpo monoclonal y las propiedades de unión al receptor Fe de los stradomeros. Por ende, estos stradobodies se unen, reticulan y activan múltiples receptores Fcy sobre células efectoras simultáneamente y crean una avidez que no se puede lograr mediante un mAb individual o una estructura principal de inmunoglobulina Fe que se une a un receptor Fcy individual, incluso si se optimiza a través de mutagénesis de Fe, desfucosilación u otros métodos que mejoran la afinidad entre un mAb individual y un receptor Fcy individual. La unión polivalente de los receptores Fcy sobre las células efectoras es particularmente importante en el entorno de la expresión de epítopos baja. La expresión de epítopos baja produce eventos de unión a Fab de mAb demasiado aislados como para provocar una densidad suficiente de los eventos de unión al receptor Fe - Fcy a una distancia lo suficientemente cercana a la célula efectora como para producir la activación corriente abajo de los receptores Fcy de baja afinidad sobre las células efectoras. Sin embargo, como se describe en la presente, la inclusión de uno o más dominios de multimerización además de los dominios Fab y Fe mejora la actividad de unión a FcyR de los stradobodies, lo que produce una disociación lenta característica de la avidez, así como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), citotoxicidad mediada por complemento (CDC), citotoxicidad directa (DC), unión a clq de complemento fuerte y/u otros mecanismos de toxicidad celular. En particular, los dominios de multimerización se ubican entre dos dominios Fe o en el Carboxi-terminal de la región Fe en los stradobodies descritos en la presente. Sorprendentemente, un stradobody que comprende dos dominios de multimerización particulares, una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2 produjeron una multimerización particularmente fuerte, toxicidad celular alta contra células diana y unión a clq alta.

Nagashima et al. (Journal of Bioscience and Bioengineering 111(4): 391-6 (2011) y Molecular Immunology 45 (10):2752-63 (2008)) describieron stradobodies seriados con repeticiones en tándem de dominios Fe, como lo anticipó WO 2008/151088, que produjo ADCC mejorada con respecto a los anticuerpos monoclonales padres de los cuales se derivaron, es decir, que comprenden la región Fab idéntica. Los stradobodies de la presente invención, sin embargo, en virtud de los dominios de multimerización, producen la multimerización de los homodímeros de stradobody que a su vez mejoran la cantidad de dominios Fe capaces de unirse simultáneamente a FcyR y, en última instancia, produce una unión y citotoxicidad muy superiores en comparación con los compuestos no multimerizantes, como los que se describen en Nagashima y en otras partes.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización. En otra modalidad, el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody. En una modalidad, al menos uno del o de los dominios de multimerización separa dos o más dominios Fe. En otra modalidad, el al menos uno del o de los dominios de multimerización se ubica en el Carboxi-terminal de la región Fe. En una modalidad preferida, uno o más dominios Fe es un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody. En otra modalidad, los dominios de multimerización se seleccionan independientemente del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina, una bisagra de IgG2 y una repetición de GPP. En otra modalidad, el stradobody comprende dos dominios de multimerización. En otra modalidad, los dos dominios de multimerización se seleccionan independientemente del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina, una bisagra de IgG2 y una repetición de GPP. En otra modalidad, los dos dominios de multimerización son una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2. En otra modalidad, los dos dominios de multimerización son una bisagra de IgG2. En otra modalidad, los dos dominios de multimerización son una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende tres dominios de multimerización. En otra modalidad, el stradobody comprende cuatro o más dominios de multimerización.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde al menos uno del o de los dominios de multimerización es una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, la al menos una cremallera de isoleucina es de acuerdo con SEQ ID NO: 32 y es capaz de multimerizar el stradobody. En otra modalidad, al menos uno del o de los dominios de multimerización es un dominio bisagra de IgG2. En otra modalidad, el al menos un dominio bisagra de IgG2 es de acuerdo con SEQ ID NO: 3 y es capaz de multimerizar el stradobody. En otra modalidad, al menos uno del o de los dominios de multimerización es un dominio GPP. En otra modalidad, el al menos un dominio GPP comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 26 y es capaz de multimerizar el stradobody.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody. En otra modalidad, al menos un dominio Fe es un dominio Fe de IgGl y el al menos un dominio Fe comprende un CH2 de IgGl y un CH3 de IgGl. En otra modalidad, el dominio Fe comprende una bisagra IgGl, un CH2 de IgGl y un CH3 de IgGl. En otra modalidad, el stradobody comprende más de un dominio Fe. En otra modalidad, cada uno de los dominios Fe es un dominio Fe de IgGl. En otra modalidad, cada uno de los dominios Fe es un dominio Fe de IgG3. En otra modalidad, cada uno de los dominios Fe es un dominio Fe de IgG2. En otra modalidad, cada uno de los dominios Fe es un dominio Fe de IgG4. En otra modalidad, los dominios Fe están compuestos por un dominio Fe de IgGl y un dominio Fe de IgG2, un dominio Fe de IgG3 o un dominio Fe de IgG4.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un primer dominio de multimerización, un segundo dominio de multimerización y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, al menos uno de los dominios Fe es un dominio Fe de IgGl. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una bisagra IgG2, una cremallera de isoleucina y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una cremallera de isoleucina, una bisagra IgG2 y un segundo dominio Fe. En una modalidad especialmente preferida, el primer dominio Fe, la cremallera de isoleucina, la bisagra IgG2 y el segundo dominio Fe juntos comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 69. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una bisagra IgG2, una segunda bisagra IgG2 y un segundo Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una cremallera de isoleucina, una segunda cremallera de isoleucina y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una cremallera de isoleucina y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una bisagra IgG2 y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un dominio G4S, una bisagra IgG2 y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una bisagra IgG2, un dominio G4S, un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un dominio G4S, una cremallera de isoleucina, un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una cremallera de isoleucina, un dominio G4S y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un dominio GPP y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un dominio GPP, una bisagra IgG2 y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una bisagra IgG2, un dominio GPP y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un dominio GPP, una cremallera de isoleucina y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, una cremallera de isoleucina, un dominio GPP y un segundo dominio Fe. El entendido en la téenica reconocerá que se pueden utilizar otros dominios de multierización en lugar de los dominios de multimerización descritos en la presente.

En otra modalidad, el primer y el segundo dominio Fe son dominios Fe de IgGl. En otra modalidad, al menos un dominio Fe de IgGl comprende un CH2 de IgGl y un CH3 de IgGl. En otra modalidad, el dominio Fe de IgGl comprende además una bisagra IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a una composición que comprende stradobodies multimerizados, en donde los stradobodies comprenden, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, un primer dominio de multimerización, un segundo dominio de multimerización y un segundo dominio Fe.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un único dominio Fe, un primer dominio de multimerización y un segundo dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un único dominio Fe, una cremallera de isoleucina y una bisagra IgG2. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una bisagra IgG2 y una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe y una bisagra IgG2. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una bisagra IgG2 y una segunda bisagra IgG2 . En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe y una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una cremallera de isoleucina y una segunda cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, un dominio G4S y una bisagra IgG2. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una bisagra IgG2 y un dominio G4S. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, un dominio G4S y una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una cremallera de isoleucina y un dominio G4S. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una unión de dominio y una bisagra IgG2. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi -terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una unión de dominio y una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una bisagra IgG2 y una unión de dominio. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una cremallera de isoleucina y una unión de dominio. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe y un dominio GPP. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, un dominio GPP y una bisagra IgG2. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una bisagra IgG2 y un dominio GPP. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, un dominio GPP y una cremallera de isoleucina. En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, una cremallera de isoleucina y un dominio GPP. El entendido en la téenica reconocerá que se pueden utilizar otros dominios de multimerización en lugar de los dominios de multimerización descritos en la presente.

En otra modalidad, el dominio Fe es un dominio Fe de IgGl . En otra modalidad, el dominio Fe de IgGl comprende un CH2 de IgGl y un CH3 de IgGl. En otra modalidad, el dominio Fe de IgGl comprende además una bisagra IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a una composición que comprende stradobodies multimerizados, en donde los stradobodies comprenden, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un dominio Fe, un primer dominio de multimerización y un segundo dominio de multimerización.

En otra modalidad, el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, dos o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización. En otra modalidad, el dominio Fe es un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe, uno o más dominios de multimerización y un segundo dominio Fe. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody comprende, de amino-terminal a Carboxi-terminal, un dominio Fab, un primer dominio Fe y uno o más dominios de multimerización. En otra modalidad, el stradobody comprende además uno o más dominios de multimerización en el C-terminal de la región Fe. En otra modalidad, uno o más de los dominios Fe es un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde el dominio Fab es específico para EGFR. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 31. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 31. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 31. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 31. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es SEQ ID NO: 31. En algunas modalidades, el o los dominios Fe son un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homóloga con SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homóloga con SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homóloga con SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 33.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homóloga con SEQ ID NO: 70. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 70. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 70. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 70. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 70. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 70.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde el dominio Fab es específico para el antígeno HER2/neu. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 34. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 34. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 34. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 34. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, el o los dominios Fe son un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 35. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 35. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 35. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 35. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 35. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 35. El entendido en la téenica comprenderá que los stradobodies y, en particular, los stradobodies multimerizantes se pueden producir con un Fab dirigido contra cualquier antígeno tumoral.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 91. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 91. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 91. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 91. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 91. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 91.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde el dominio Fab es específico para CD20. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 36. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 36. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 36. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 36. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es SEQ ID NO: 36. En algunas modalidades, el o los dominios Fe son un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 37. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 37. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 37. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 37. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 37. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 37.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 76. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 76. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 76. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 76. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 76. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 76.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde el dominio Fab es específico para un miembro de la superfamilia TNF. Los miembros de la superfamilia TNF incluyen, entre otros, TNF, TNF-a, TNF-b, linfotoxina (LT), 1?h?o^c?h3b (ETb), ligando 0X40, ligando CD40, ligando CD95/Fas, ligando CD27 (CD70), ligando CD30, ligando CD137/4-1BB, TRAIL, TRANCE/RANKL, TWEAK/Apo-3, APRIL, BAFF/Blys, LIGHT, TL1A/VEGI, ligando GITR, EDA-A1 y EDA-A2. En una modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para TNF (es decir, un stradobody anti-TNF; por ejemplo, el stradobody GB7542). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para Blys (es decir, un stradobody anti-Blys). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para TRAIL (es decir, un stradobody anti-TRAIL) . En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para OX40L (es decir, un stradobody anti-OX40L). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para 4-1BB (es decir, un stradobody anti-4-1BB). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para APRIL (es decir, un stradobody anti-APRIL). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para TRANCE (es decir, un stradobody anti-TRANCE). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para ETb (es decir, un stradobody anti-LTb). En otra modalidad, el stradobody comprende un dominio Fab que es específico para CD40L (es decir, un stradobody anti-CD40L). El entendido en la téenica comprenderá que los stradobodies y, en particular, los stradobodies multimerizantes se pueden producir con un Fab dirigido contra cualquier receptor de superficie de células inmunes.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde el dominio Fab es específico para TNF. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 67. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 67. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 67. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 67. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es SEQ ID NO: 67. En algunas modalidades, el o los dominios Fe son un dominio Fe de IgGl.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 66. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 66. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 66. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 66. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 66. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 66. El entendido en la téenica comprenderá que los stradobodies y, en particular, los stradobodies multimerizantes se pueden producir con un Fab dirigido contra cualquier receptor soluble o citocina.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 87. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 85 % homologa con SEQ ID NO: 87. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 87. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 87. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 87. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 87.

En una modalidad, el stradobody de la presente invención comprende un dominio Fab que es específico para IFNy, IFNa, IRNb, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 o IL-23. En una modalidad, el stradobody de la presente invención comprende un dominio Fab que es específico para una citocina, en donde el stradobody es útil para el tratamiento o la prevención de una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria. Por ejemplo, en una modalidad, el stradobody es un stradobody anti-IL-2, anti-IL-8 o anti-IL-17. El entendido en la téenica comprenderá que los stradobodies y, en particular, los stradobodies multimerizantes se pueden producir con un Fab dirigido contra cualquier interleucina o interferón.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody, en donde el stradobody comprende un Fab dirigido contra uno o más antígenos de enfermedades infecciosas. El entendido en la técnica comprenderá que los stradobodies y, en particular, los stradobodies multimerizantes se pueden producir con un Fab dirigido contra cualquier antígeno de enfermedad infecciosa. El entendido en la técnica también comprenderá que los stradobodies y, en particular, los stradobodies multimerizantes se pueden producir fácilmente con un Fab derivado de un anticuerpo monoclonal que se puede utilizar o que ya se encuentra en uso clínico para el tratamiento o la prevención de enfermedades infecciosas.

Por ejemplo, los stradobodies multimerizantes se pueden producir con un Fab derivado de un anticuerpo monoclonal que se puede utilizar o que ya se encuentra en uso clínico para la neutralización de virus, la neutralización de bacterias o toxinas bacterianas, el bloqueo del ingreso de virus en las células hospedadoras, el bloqueo de mecanismos inhibidores inmunitarios disparados por patógenos, bloqueo de respuestas inmunopatogénicas disparadas por patógenos u otros medios para tratar o prevenir la enfermedad infecciosa. Algunos anticuerpos monoclonales ejemplares en uso clínico o en desarrollo para uso clínico para el tratamiento o la prevención de la enfermedad infecciosa incluyen, entre otros, palivizumab y motavizumab, los cuales son específicos para el virus respiratorio sincitial (RSV) glicoproteína F; ibalizumab, un anticuerpo anti-CD4 para el bloqueo del ingreso del virus de inmunodeficiencia humana (V1H) en las células hospedadoras; Pro-140 y CCR5mAb004, anticuerpos anti-CCR5 para el bloqueo del ingreso del V1H en las células hospedadoras; F105, un anticuerpo anti-gpl20 para la neutralización de la glicoproteína de membrana gpl20 del VIH, que también se utiliza en el ingreso del virus; sevirumab, que es específico para la glicoproteína de membrana H del citomegalovirus (CMV); bavituximab, un anticuerpo anti-fosfatidil serina utilizado para la neutralización del virus de la hepatitis C (HCV); nivolumab (también denominado MDX1106/BMS936558/ONO-4538) y pidilizumab (también denominado CT-011), los cuales son específicos para la molécula inhibidora inmunitaria PD-1 sobre las células inmunes y también se utilizan como anticuerpos de inmunomodulación en la infección por HCV; BL-HCV1, un anticuerpo de neutralización de HCV específico para la proteína estructural E2 del HCV; foravirumab, un anticuerpo neutralizante del virus de la rabia específico para la glicoproteína G; ETI-204 (anthim), raxibacumab y AVP 21D9, los cuales son un anticuerpo de neutralización de la toxina Bacillus anthracis específico para el antígeno protector de B . anthracis; SAR279356 y otros anticuerpos anti-poli-N-acetil glucosamina (PNAG), que son útiles en las infecciones por Staphylococcus g otras infecciones bacterianas, particularmente infecciones resistentes a varios fármacos; pagibaximab, que es específico para anti-ácido lipoteicoico y se utiliza para la prevención de la infección por Staphylococcus; tefibazumab, que es específico para el factor de aglutinación A y que también es útil para la infección por Staphylococcus; urtoxazumab, un anticuerpo de toxina 2B similar a anti-Shiga para la infección por E. coli ; shigamabs, que es un cóctel de dos mAb, caStxl y caStx2, para la neutralización de las toxinas STEC de E. coli Stxl y Stx2; actoxumab (enterotoxino A anti-Clostridum difficile) y bezlotoxumab (enterotoxina B anti-C. difficile) , que se pueden administrar juntos como un cóctel de dos anticuerpos conocido como MK3415A; panobacumab, un anticuerpo anti-LPS utilizado en la infección por Pseudomonas aeruginosa; KB 001, un anticuerpo anti-sistema de secreción tipo 3 utilizado en la infección por P. aeruginosa) ; y 18B7, anticuerpo anti-polisacárido capsular para la infección por Cyptococcus neoformans.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody y en donde los dos o más dominios Fe son capaces de unirse a FCYR. En otra modalidad, el FcyR es FcYRIIIa. En otra modalidad, los FcYRIIIa se encuentran sobre células efectoras. En otra modalidad, los FcYRIIIa se encuentran sobre células NK. En otra modalidad, los FcYRIIIa se encuentran sobre macrófagos. En otra modalidad, el FCYR es FcyRIIb. En otra modalidad, los FcYRIIb se encuentran sobre células B. En otra modalidad, los FcYRIIb se encuentran sobre células dendríticas.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de los dos o más dominios Fe es al menos el 80 % homologa con SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de los dos o más dominios Fe es al menos el 90 % homologa con SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de los dos o más dominios Fe es al menos el 95 % homologa con SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de los dos o más dominios Fe es al menos el 99 % homologa con SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de los dos o más dominios Fe es SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz del stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa o un cáncer en un sujeto que lo necesita que comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz de un stradobody que comprende un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody. En otra modalidad, el sujeto tiene cáncer. En otra modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad mielodisplásica, enfermedad de la pesada cadena, tumores neuroendocrinos y schwanoma.

En otra modalidad, el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. En otra modalidad, la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia aloinmune/autoinmune, trombocitopenia inmune adquirida, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, aplasia eritrocitaria asociada a parvovirus B19, autoinmunidad antifactor VIII adquirida, enfermedad de von Willebrand adquirida, mieloma múltiple y gammapatía monoclonal de significado incierto, mal de Alzheimer, sepsis, anemia aplásica, aplasia pura de glóbulos rojos, anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad hemolítica del recién nacido, neutropenia mediada por el sistema inmunitario, refractariedad a la transfusión de plaquetas, púrpura postransfusión neonatal, síndrome urémico hemolitico, vasculitis sistémica, púrpura trombocitopénica trombótica, síndrome de Evans, síndrome de Guillain-Barré, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante de IgM paraproteinémica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatía motora multifocal, síndrome de la neurona motora inferior asociado con anti-/GMl, desmielinización, esclerosis múltiple, neuritis óptica, síndrome del hombre rígido, degeneración cerebelosa paraneoplásica con anticuerpos anti-Yo, encefalomielitis paraneoplásica, neuropatía sensorial con anticuerpos anti-Hu, epilepsia, encefalitis, mielitis, mielopatía especialmente asociada con virus 1 linfotrópico de células T humanas, neuropatía diabética autoinmune, neuropatía disautonómicos idiopática aguda, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoide, síndrome de Felty, vasculitis ANCA positiva, polimiositis espontánea, dermatomiositis, síndrome antifosfolípido, abortos espontáneos recurrentes, lupus eritematoso sistémico, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, uveítis, necrólisis epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, enfermedades ampollosas de la piel autoinmunes incluido pénfigo vulgar, penfigoide hulloso y pénfigo foliáceo, vitÍligo, síndrome de shock tóxico estreptocócico, esclerodermia, esclerosis sistémica incluido esclerosis sistémica difusa y cutánea limitada, dermatitis atópica (especialmente dependientes de esteroides), miositis con cuerpos de inclusión, fascitis necrotizante, miopatías inflamatorias, miositis, miopatía anti-Decorin (antígeno BJ), miopatía necrótica paraneoplásica, miopatía vacuolada vinculada a X, polimiositis inducida por penicilamina, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, miocardiopatía, anemia perniciosa, hepatitis activa crónica autoin une, cirrosis biliar primaria, enfermedad celiaca, dermatitis herpetiforme, cirrosis criptogénica, artritis reactiva, enfermedad de Crohn, enfermedad de Whipple, colitis ulcerosa, colangitis esclerosante, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo del injerto mediado por anticuerpos, rechazo de médula ósea después del trasplante, inflamación de la enfermedad posinfecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus tipo 1 con anticuerpos de células anti-beta, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, glomerulonefritis membranoproliterativa, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, micropoliarteritis, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa e insuficiencia multisistema orgánica.

La presente invención comprende además métodos y composiciones eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas, incluido entre otras, aquellas provocadas por agentes bacterianos, micológicos, parasitarios y virales. Algunos ejemplos de los agentes infecciosos incluyen los siguientes: staphylococcus, streptococcaceae, neisseriaaceae, cocci, enterobacteriaceae, pseudomonadaceae, vibrionaceae, campylobacter, pasteurellaceae, bordetella, francisella, brucella, legionellaceae, bacteroidaceae, clostridium, corynebacterium, propionibacterium, bacilos grampositivos, antrax, actinomyces, nocardia, mycobacterium, treponema, borrelia, leptospira, mycoplasma, ureaplasma, rickettsia, chlamydiae, otros bacilos grampositivos, otros bacilos gramnegativos, micosis sistémicas, otras micosis oportunistas, protozoa, nematodos, tremátodos, cestodos, adenovirus, herpesvirus (incluido, por ejemplo, virus del herpes simple y virus de Epstein Barr y virus del herpes zoster), poxvirus, papovavirus, virus de la hepatitis, virus del papillo a, ortomixovirus (incluido, por ejemplo, influenza A, influenza B e influenza C), paramixovirus, coronavirus, picornavirus, reovirus, togavirus, flavivirus, bunyaviridae, rhabdovirus, virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana y retrovirus. Algunas enfermedades infecciosas ejemplares incluyen, entre otras, candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía por estreptococos, afecciones de la piel y de la orofaringe por estreptococos, sepsis gram negativa, tuberculosis , mononucleosis, influenza, enfermedad respiratoria causada por el virus sincitial respiratorio, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis.

En otra modalidad, el stradobody se administra por vía intravenosa, subcutánea, oral, nasal, intraperitoneal , sublingual, bucal, transdérmica, implante subcutáneo o subdérmico, intraduodenal o intramuscular. En una modalidad, el stradobody se administra por vía intravenosa. Debido a la eficacia mejorada de los stradobodies de la presente invención, en algunas modalidades, se pueden administrar los stradobodies en una dosis inferior, por vía intravenosa, en comparación con los anticuerpos monoclonales específicos para el mismo antígeno. En una modalidad, el stradobody se administra por vía intravenosa en una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/Kg y aproximadamente 1000 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,1 mg/Kg y aproximadamente 100 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg/Kg y aproximadamente 50 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 1 mg/Kg y aproximadamente 25 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 5 mg/Kg y aproximadamente 15 mg/Kg IV. En una modalidad, el stradobody se administra por vía subcutánea. Debido a la eficacia mejorada de los stradobodies de la presente invención, en algunas modalidades, se puede administrar el stradobody en una dosis inferior, por vía subcutánea, en comparación con los anticuerpos monoclonales específicos para el mismo antígeno. En una modalidad, el stradobody se administra por vía subcutánea en una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/Kg y aproximadamente 1000 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg/Kg y aproximadamente 150 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg/Kg y aproximadamente 80 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 2 mg/Kg y aproximadamente 50 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 5 mg/Kg y aproximadamente 30 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra antes, de forma simultánea o después de un anticuerpo monoclonal . En otra modalidad, el stradobody administrado antes, de forma simultánea o después de un anticuerpo monoclonal tiene un Fab dirigido contra el mismo antígeno que el anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, el stradobody administrado antes, de forma simultánea o después de un anticuerpo monoclonal tiene un Fab dirigido contra un antígeno diferente que el anticuerpo monoclonal.

En otra modalidad, el stradobody se administra antes, durante o después de la administración de uno o más agentes farmacéuticos y/o terapéuticos adicionales. En otra modalidad, el agente farmacéuticamente activo adicional comprende un esteroide; un fármaco anti-autoinmune biológico como un anticuerpo monoclonal, una proteína de fusión o una anti-citocina; un fármaco anti-autoinmune no biológico; un inmunosupresor; un antibiótico; y una agente anti-viral; una citocina; o un agente de otro modo capaz de actuar como un modulador inmunitario. En otra modalidad, el esteroide es prednisona, prednisolona, cortisona, dexametasona, mometesona testosterona, estrógeno, oxandrolona, fluticasona, budesonide, beclametasona, albuterol o levalbuterol. En otra modalidad, el stradobody se administra antes, durante o después de la administración de un agente quimioterapéutico. En otra modalidad, el stradobody y el agente terapéutico adicional presentan sinergia terapéutica cuando se administran juntos. En una modalidad, el stradobody se administra antes de la administración del agente terapéutico adicional. En otra modalidad, el stradobody se administra al mismo tiempo que la administración del agente terapéutico adicional. En otra modalidad, el stradobody se administra después de la administración del agente terapéutico adicional. En una modalidad, el stradobody se administra antes de la administración de una señal de peligro. En otra modalidad, el stradobody se administra al mismo tiempo que la administración de una señal de peligro. En otra modalidad, el stradobody se administra después de la administración de una señal de peligro.

En otra modalidad, el stradobody se administra para tratar seres humanos, primates no humanos (p. ej., monos, babuinos y chimpancés), ratones, ratas, bovinos, caballos, gatos, perros, cerdos, conejos, cabras, ciervos, ovejas, hurones, jerbos, conejillos de indias, hámsters, murciélagos, aves (p. ej., pollos, pavos y patos), peces y reptiles con moléculas de stradobodies quiméricas o específicas de la especie. En otra modalidad, el ser humano es un adulto o un niño. En otra modalidad, el stradobody se administra para prevenir la enfermedad autoinmunitaria. En otra modalidad, el stradobody se administra para prevenir afecciones autoinmunitarias asociadas con vacunas en animales de compañía y en el ganado.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody presenta una destrucción celular mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En una modalidad, la destrucción celular mejorada es mediada por ADCC. En otra modalidad, el stradobody presenta una ADCC que es al menos 2 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una ADCC que es al menos 5 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una ADCC que es al menos 10 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una ADCC que es al menos 20 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, la destrucción celular mejorada es mediada por CDC. En otra modalidad, el stradobody presenta una CDC que es al menos 2 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una CDC que es al menos 5 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una CDC que es al menos 10 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una CDC que es al menos 20 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, la destrucción celular mejorada es mediada por DC. En otra modalidad, el stradobody presenta una DC que es al menos 2 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una DC que es al menos 5 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una DC que es al menos 10 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta una DC que es al menos 20 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno.

En una modalidad, el stradobody contiene dos o más dominios de multimerización y presenta una destrucción celular mejorada en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En una modalidad, la destrucción celular es mediada por ADCC. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una ADCC que es al menos 2 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una ADCC que es al menos 5 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una ADCC que es al menos 10 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una ADCC que es al menos 20 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, la destrucción celular mejorada es mediada por CDC. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una CDC que es al menos 2 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una CDC que es al menos 5 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una CDC que es al menos 10 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una CDC que es al menos 20 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, la destrucción celular mejorada es mediada por DC. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una DC que es al menos 2 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una DC que es al menos 5 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una DC que es al menos 10 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody con dos o más dominios de multimerización presenta una DC que es al menos 20 veces superior en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody presenta una inhibición de la proliferación celular mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En una modalidad, el stradobody inhibe la proliferación celular en al menos un 10 % más en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody inhibe la proliferación celular en al menos un 20 % más en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody inhibe la proliferación celular en al menos un 50 % más en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody que contiene dos o más dominios de multimerización y que presenta inhibición mejorada de la proliferación celular en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En una modalidad, el stradobody inhibe la proliferación celular en al menos un 10 % más en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody inhibe la proliferación celular en al menos un 20 % más en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización. En otra modalidad, el stradobody inhibe la proliferación celular en al menos un 50 % más en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un stradobody en donde el stradobody presenta una unión al complemento mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta unión al complemento mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En una modalidad, la unión al complemento mejorada es la unión con Clq. En una modalidad, el stradobody presenta unión al complemento mejorada que es al menos 2 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta unión al complemento mejorada que es al menos 5 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta unión al complemento mejorada que es al menos 10 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el stradobody presenta unión al complemento mejorada que es al menos 20 veces superior en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En una modalidad, la unión al complemento mejorada se mide por el valor de EC50. En una modalidad, el valor de EC50 para la unión al complemento es al menos 5 veces inferior para el stradobody en comparación con el anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el valor de EC50 para la unión al complemento es al menos 10 veces inferior para el stradobody en comparación con el anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el valor de EC50 para la unión al complemento es al menos 20 veces inferior para el stradobody en comparación con el anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno. En una modalidad, un stradobody multimerizante demuestra una unión al complemento aumentada con relación a un stradobody no multimerizante específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, un stradobody multimerizante demuestra un valor de EC50 inferior para la unión al complemento con relación a un stradobody no multimerizante específico para el mismo antígeno. En otra modalidad, el valor de EC50 para el stradobody multimerizante es al menos 2 veces inferior para el stradobody multimerizante en comparación con el stradobody no multimerizante. En otra modalidad, el valor de EC50 para el stradobody multimerizante es al menos 5 veces inferior para el stradobody multimerizante en comparación con el stradobody no multimerizante.

En una modalidad, el nivel de unión al complemento presentado por un stradobody varía según el Fab. Por lo tanto, en una modalidad, dos stradobodies que tienen dominios multimerizantes idénticos y regiones Fe idénticas, pero Fab diferentes, presentan un nivel diferente de unión al complemento. En una modalidad, un stradobody multimerizante que tiene un Fab anti-CD20 presenta una unión al complemento drásticamente superior en comparación con un stradobody multimerizante que tiene los dominios multimerizantes idénticos y las regiones Fe idénticas al Fab anti-CD20, pero que tiene un anti-TNF o un Fab anti-HER2/neu.

En una modalidad, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden stradobodies multimerizados. En otra modalidad, la composición comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o más stradobodies.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una ilustración esquemática de stradobodies seriados multimerizados y de C-terminal multimerizados y los componentes básicos que conforman los stradobodies.

La figura 2 es una ilustración esquemática de las estructuras generales de los stradobodies seriados.

La figura 3 es una ilustración esquemática de las estructuras de diversos stradobodies seriados que ilustran las construcciones con uno o más de los dominios de unión o de multimerización indicados.

La figura 4 es una ilustración de construcciones de stradobody seriadas.

La figura 5 es una ilustración esquemática de las estructuras de diversos stradobodies de C-terminal multimerizados que ilustran las construcciones con uno o más de los dominios de multimerización indicados.

La figura 6 es una ilustración de construcciones de stradobody de C-terminal multimerizados.

La figura 7 es una ilustración esquemática de la estructura de un stradobody preferido de la presente invención, que comprende dos dominios Fe de IgGl separados por una cremallera de isoleucina y una bisagra IgG2.

La figura 8 es un gel sin reducción SDS-PAGE que muestra la formación de multímeros de los stradobodies multimerizados de C-terminal indicados, en comparación con el anticuerpo GB2500 no modificado.

La figura 9 es un gel sin reducción SDS-PAGE que muestra la formación de multímeros de los stradobodies seriados indicados, en comparación con el anticuerpo GB2500 no modificado.

La figura 10 muestra la ADCC de los stradobodies indicados en comparación con el anticuerpo GB2500 HER2/neu no modificado, según lo medido por la destrucción porcentual de células diana en un intervalo de proporciones de células efectoras a células diana.

La figura 11 muestra la ADCC de respuesta a la dosis de los stradobodies indicados en comparación con el anticuerpo GB2500 HER2/neu no modificado, según lo medido por la destrucción porcentual de células diana en un intervalo de concentraciones de stradobody.

La figura 12 muestra los datos de resonancia de plasmón representativos (Biacore) que indican la unión y la disociación de FcyRIIIa para cada stradobody indicado o anticuerpo GB2500 no modificado.

La figura 13 muestra los datos de unión de FcyRIIIa para todos los stradobodies evaluados o el anticuerpo GB2500 no modificado.

La figura 14 ilustra la correlación entre la unión Biacore (RU) y la actividad de ADCC de los stradobodies indicados. La actividad ADCC se presenta como el promedio de diferencia en veces con respecto a GB2500 para cada stradobody.

La figura 15 muestra los resultados de la purificación de una construcción de stradobody mediante cromatografía de intercambio iónico sobre una columna Mono Q. El carril SB es el stradobody no fraccionado; se analizaron los picos 1, 2 y 3 en el cromatograma de elución (panel derecho) mediante gel no desnaturalizante (panel izquierdo).

La figura 16 muestra un gel sin reducción (panel superior) y con reducción (panel inferior) SDS-PAGE que muestra la formación de multímeros de los stradobodies seriados indicados, en comparación con el anticuerpo GB2500 no modificado.

La figura 17 muestra la unión de un anticuerpo GB2500 padre o el stradobody seriado indicado para FcYRIIIa. Se evaluó GB2500 (cultivado en células HEK o CHO) en concentraciones en el intervalo de 3333 - 208 nM. Se evaluaron los stradobodies seriados GB2524, GB2538, GB2540, GB2542, GB2554 y GB2555 en concentraciones en el intervalo de 200 - 12,5 nM.

La figura 18 es un diagrama esquemático del diagrama de flujo experimental para los estudios que comprenden ratones PBMC-SCID humanos (hu-PBMC SCID) tratados con stradobodies o sus anticuerpos monoclonales correspondientes.

La figura 19 muestra los niveles de suero de la IgM humana con el tiempo en los ratones SCID hu-PMBC tratados con PBS, GB4500, GB4563 o GB4542.

La figura 20 muestra la cantidad de células B humanas en la sangre periférica con el tiempo en ratones SCID hu-PBMC tratados con PBS, GB4500, GB4563 o GB4542.

La figura 21 muestra la cantidad de células B humanas en los bazos de ratones SCID hu-PBMC tratados con PBS, GB4500, GB4563 o GB4542.

La figura 22 muestra el porcentaje de inhibición de la proliferación celular mediado por GB4500 o GB4542 en las concentraciones indicadas de anticuerpo o stradobody, en pg/mL. Se calculó la significancia estadística de GB4500 contra GB4542 utilizando la prueba T; * p<0,05, **P<0,005.

La figura 23 muestra el porcentaje de inhibición de la proliferación celular mediado por GB4500 o GB4542 en las pmol/mL indicadas de anticuerpo o stradobody.

La figura 24 muestra el porcentaje de citotoxicidad dependiente del complemento mediada por GB4500, GB4596 o GB4542 en la concentración indicada de anticuerpo o stradobody, en mg/mL.

La figura 25 muestra el porcentaje de citotoxicidad dependiente del complemento mediada por GB4500 o GB4542 en las pmol/mL indicadas de anticuerpo o stradobody.

La figura 26 muestra el volumen tumoral promedio con el tiempo después de la inyección intratumoral de PBS, GB4500 o GB4542, con o sin CpG, en un modelo de linfoma en ratones Raji-SCID.

La figura 27 muestra la mediana del volumen tumoral con el tiempo después de la inyección intratumoral de PBS, GB4500 o GB4542, con o sin CpG, en un modelo de linfoma en ratones Raji-SCID.

La figura 28 muestra la unión del complemento Clq con el anticuerpo GB2500, stradobody GB2542, anticuerpo GB7500, stradobody GB7542, anticuerpo GB4500 y stradobody GB4542, según lo medido mediante la absorbancia (450nm) en la concentración de stradobodies o anticuerpos indicada.

La figura 29 muestra los valores de EC50 para la unión al complemento Clq para el anticuerpo GB2500, stradobody GB2542, anticuerpo GB7500, stradobody GB7542, anticuerpo GB4500 y stradobody GB4542.

La figura 30 muestra la unión del complemento Clq con el anticuerpo GB2500 y los stradobodies GB2542, GB2554 y GB2555. GB2542 es un stradobody multimerizante y GB2554 y GB2555 son stradobodies lineales que no contienen ningún dominio de multimerización.

La figura 31 muestra los valores de EC50 para la unión al complemento Clq para el anticuerpo GB2500, stradobody multimerizante GB2542 y los stradobodies no multimerizantes GB2554 y GB2555.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El enfoque al diseño molecular racional para los compuestos de unión al antígeno con capacidad de unión a FcR descrito en la presente incluye la creación recombinante y/o bioquímica de biomiméticos inmunológicamente activos que son, sorprendentemente, más eficientes en la inducción de la citotoxicidad incluida la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos, la citotoxicidad celular dependiente del complemento, la citotoxicidad celular directa y otros mecanismos de citotoxicidad celular en comparación con los mAb con especificidad para el mismo antígeno. Los compuestos son útiles para tratar, por ejemplo, el cáncer, las enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias y las enfermedades infecciosas. Cada modalidad se describe detalladamente a continuación junto con modalidades ejemplares específicas.

Según se emplea aquí, el uso de los términos "un" o "una", cuando se utilizan junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o memoria descriptiva, pueden referirse a "uno", pero también concuerdan con la definición de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

Según se utilizan aquí, los términos "biomimético", "molécula biomimética", "compuesto biomimético" y términos relacionados, se refieren a un compuesto realizados por el hombre que imita la función de otro compuesto, como la inmunoglobulina intravenosa humana agrupada ("hlVIG", por sus siglas en inglés), un anticuerpo monoclonal o el fragmento Fe o Fab de un anticuerpo. Los biomiméticos "biológicamente activos" son compuestos que poseen actividades biológicas que son iguales o similares a las de sus contrapartes de origen natural. "De origen natural" significa una molécula, o una parte de esta, que se encuentra, normalmente, en un organismo. De origen natural también significa sustancialmente de origen natural . Los biomiméticos "inmunológicamente activos" son biomiméticos que presentan actividad inmunológica igual o similar a las moléculas inmunológicamente activas de origen natural, como los anticuerpos, citocinas, interleucinas y otras moléculas inmunológicas conocidas en la téenica. En modalidades preferidas, los biomiméticos de la presente invención son stradobodies, como se definen en la presente.

"Homólogo" significa con identidad en la totalidad de la secuencia de una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos determinada. Por ejemplo, "80 % homólogo" significa que determinada secuencia comparte aproximadamente el 80 % de identidad con la secuencia reivindicada y que puede incluir inserciones, supresiones, sustituciones y cambios de marco. El entendido en la técnica comprenderá que las alineaciones de secuencias se pueden realizar para considerar inserciones y supresiones para determinar la identidad en la longitud total de una secuencia.

Los biomiméticos inmunológicamente activos de la presente invención son capaces de unirse a uno o más antígenos. En algunas modalidades, los biomiméticos inmunológicamente activos de la presente invención son capaces de unirse a dos antígenos diferentes, similares a los anticuerpos biespecíficos. En otras modalidades, los biomiméticos inmunológicamente activos de la presente invención son capaces de unirse a más de dos antígenos diferentes. Los biomiméticos de la presente invención también poseen una o más actividades moduladoras inmunitarias del dominio Fe de IgG y tienen al menos un primer dominio Fe capaz de unirse a FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 y/o un FcyR incluido FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcyRIV. En algunas modalidades, los biomiméticos de la presente invención poseen un segundo dominio Fe capaz de unirse a FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 y/o un FcyR incluido FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcyRIV. Por ende, cuando están multimerizados, los biomiméticos inmunológicamente activos contienen al menos dos estructuras diméricas, cada una de las cuales posee la capacidad de unirse a uno o más antígenos y la capacidad de unirse a uno o más de FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 y/o FCyR.

Los siguientes párrafos definen los componentes básicos de los biomiméticos de la presente invención, estructural y funcionalmente, y después definen a los biomiméticos en sí. Sin embargo, en primer lugar, resulta útil advertir que, como se indicó anteriormente, cada uno de los biomiméticos de la presente invención tiene al menos dos dominios Fe y al menos un dominio Fab. Como mínimo, un dominio Fe es un polipéptido dimérico (o una región dimérica de un polipéptido mayor) que comprende dos cadenas de péptidos o brazos (monómeros) que se asocian para formar un sitio de unión al receptor de Fcy funcional. Por lo tanto, la forma funcional de los fragmentos Fe individuales y los dominios Fe planteados en la presente existen, en general, en forma dimérica (o multimérica). Los monómeros de los fragmentos individuales y los dominios planteados en la presente son las cadenas simples o brazos que se deben asociar con una segunda cadena o brazo para formar una estructura dimérica funcional.

Regiones Fe y regiones Fab El "fragmento Fe" es un término de la téenica que se emplea para describir la región de proteínas o la estructura plegada de proteínas que se encuentra rutinariamente en el Carboxi-terminal de las inmunoglobulinas. El fragmento Fe consiste en las porciones del carboxi-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo. Cada una de las cadenas en un fragmento Fe tiene entre 220-265 aminoácidos de longitud y las cadenas se suelen conectar a través de un enlace disulfuro. El fragmento Fe suele contener uno o más pliegues estructurales independientes o subdominios funcionales. En particular, el fragmento Fe abarca un dominio Fe, definido en la presente como la estructura mínima que se une a un receptor Fcy. Un fragmento Fe aislado está compuesto por dos monómeros del fragmento Fe (p. ej., las dos porciones del Carboxi-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo; que se definen adicionalmente en la presente) que están dimerizados. Cuando dos monómeros del fragmento Fe se asocian, el fragmento Fe resultante tiene actividad de unión al receptor FCY.

El "fragmento Fab" es un término de la téenica que se emplea para describir la región de proteínas o la estructura plegada de proteínas que contiene el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo. Los fragmentos Fab están compuestos por una cadena pesada y una cadena ligera y tienen entre aproximadamente 200 - 250 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el fragmento Fab está compuesto por la región variable y la región CH1 del anticuerpo padre. El fragmento Fab se puede aislar del fragmento Fe de un anticuerpo monoclonal mediante el uso de la digestión enzimática, por ejemplo la digestión de papaína, que es un proceso incompleto e imperfecto (véase Mihaesco C y Seligmann M. Papain Digestión Frag ents Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431- 453 (1968)). El fragmento Fab y el fragmento Fe juntos constituyen el holo-anticuerpo, lo que significa en la presente el anticuerpo completo.

Un "fragmento Fe parcial" es un dominio que comprende menos del fragmento Fe completo de un anticuerpo, y que aún así retiene una estructura suficiente como para tener la misma actividad que el fragmento Fe, incluida la actividad de unión al receptor FCY. Un fragmento Fe parcial puede, por lo tanto, carecer de parte o de la totalidad de una región bisagra, parte o la totalidad de un dominio CH2, parte o la totalidad de un dominio CH3 y/o parte o la totalidad de un dominio CH4, según el isotipo del anticuerpo del cual se deriva el dominio Fe parcial. Un ejemplo de un fragmento Fe parcial incluye una molécula que comprende las regiones bisagra superior, central e inferior más el dominio CH2 de IgG3 (Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT y Morrison, SL, Influence of the hinge región on complement activation, CIq binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins, Proc Nati Acad Sci EUA. 1990 enero; 87(1): 162-166). Por ende, en el presente ejemplo, el fragmento Fe parcial carece del dominio CH3 presente en el fragmento Fe de IgG3. Otro ejemplo de un fragmento Fe parcial incluye una molécula que comprende los dominios CH2 y CH3 de IgGl. En el presente ejemplo, el fragmento Fe parcial carece del dominio bisagra presente en IgGl. Los fragmentos Fe parciales están compuestos por dos monómeros del fragmento Fe parcial. Como se define adicionalmente en la presente, cuando dos monómeros del fragmento Fe parcial se asocian, el fragmento Fe parcial resultante tiene actividad de unión al receptor Fcy.

El término "dominio Fab" describe la región mínima (en el contexto de un polipéptido mayor) o de la estructura plegada de la proteína más pequeña (en el contexto de una proteína aislada) que se puede unir a un antígeno. El dominio Fab es la región de unión mínima de un fragmento Fab que permite la unión de la molécula a un antígeno. "Dominio Fab" se utiliza indistintamente en la presente con "Fab".

Según se utiliza en la presente, "dominio Fe" describe la región mínima (en el contexto de un polipéptido mayor) o la estructura plegada de la proteína más pequeña (en el contexto de una proteína aislada) que se puede unirse a un receptor Fe (FcR) o estar unido por este. En un fragmento Fe y en un fragmento Fe parcial, el dominio Fe es la región de unión mínima que permite la unión de la molécula a un receptor Fe. Mientras que un dominio Fe se puede limitar a un polipéptido homodimérico discreto que se une a un receptor Fe, también está claro que un dominio Fe puede formar una parte o la totalidad de un fragmento Fe, así como parte o la totalidad de un fragmento Fe parcial. Cuando se utilice el término "dominios Fe" en la presente invención, los entendidos en la téenica reconocerán que significa más de un dominio Fe. Un dominio Fe está compuesto por dos monómeros del dominio Fe. Como se define adicionalmente en la presente, cuando dos monómeros del dominio Fe se asocian, el dominio Fe resultante tiene actividad de unión al receptor Fe. Por lo tanto, un dominio Fe es una estructura dimérica que se puede unir a un receptor Fe.

Según se utiliza en la presente, "dominio Fe parcial" describe una porción de un dominio Fe. Los dominios Fe parciales incluyen los dominios de región constante de cadena pesada individuales (p. ej., dominios CH1, CH2, CH3 y CH4) y las regiones bisagra de las diferentes clases y subclases de inmunoglobulina. Por lo tanto, los dominios Fe parciales humanos de la presente invención incluyen los dominios CHl de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD y IgE, los dominios CH2 de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD y IgE, los dominios CH3 de IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD y IgE, los dominios CH4 de IgM y IgE, y las regiones bisagra de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD y IgE. Los dominios Fe parciales correspondientes en otra especie dependerán de las inmunoglobulinas presentes en la especie y de su denominación. En una modalidad preferida, los dominios Fe parciales de la presente invención comprenden los dominios CHl, CH2 y bisagra de IgGl. En otra modalidad preferida, los dominios Fe parciales de la presente invención comprenden los dominios CHl, CH2 y bisagra de IgGl y el dominio bisagra de IgG2. El dominio Fe parcial de la presente invención puede comprender además una combinación de más de uno de estos dominios y bisagras. Sin embargo, los dominios Fe parciales individuales de la presente invención y sus combinaciones carecen de la capacidad de unirse a FcyR. Por ende, los dominios Fe parciales y sus combinaciones comprenden menos de un dominio Fe. Los dominios Fe parciales se pueden conectar para formar un péptido que tiene actividad de unión al receptor Fcy, formando así un dominio Fe. En la presente invención, los dominios Fe parciales se utilizan con dominios Fe como los componentes básicos para crear los biomiméticos de la presente invención, según se describen en la presente. Cada dominio Fe parcial está compuesto por dos monómeros de dominios Fe parciales. Cuando dos de los monómeros del dominio Fe parcial se asocian, se forma un dominio Fe parcial.

Como se indicó anteriormente, cada uno de los fragmentos Fe, los fragmentos Fe parciales, los dominios Fe y los dominios Fe parciales son dominios o proteínas diméricas. Por ende, cada una de estas moléculas está compuesta por dos monómeros que se asocian para formar el dominio o la proteína dimérica. Aunque las características y la actividad de las formas homodiméricas se planteó anteriormente, los péptidos monoméricos se plantean a continuación.

Según se utiliza en la presente, un "monómero de fragmento Fe" es una proteína de cadena simple que, cuando se asocia con otro monómero de fragmento Fe, comprende un fragmento Fe. El monómero de fragmento Fe es, por lo tanto, la porción de Carboxi-terminal de una de las cadenas pesadas del anticuerpo que conforman el fragmento Fe de un holo-anticuerpo (p. ej., la porción contigua de la cadena pesada que incluye la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de IgG). En una modalidad, el monómero de fragmento Fe comprende, como mínimo, una cadena de una región bisagra (un monómero bisagra), una cadena de un dominio CH2 (un monómero de dominio CH2) y una cadena de un dominio CH3 (un monómero de dominio CH3) unidas de forma contigua para formar un péptido. En otra modalidad, el monómero de fragmento Fe comprende al menos una cadena de una región bisagra, una cadena de un dominio CH2, una cadena de un dominio CH3 y una cadena de un dominio CH4 (un monómero de dominio CH4) unidas de forma contigua para formar un péptido. En una modalidad, los dominios CH2, CH3 y bisagra son de isotipos diferentes. En una modalidad particular, el monómero de fragmento Fe contiene un dominio bisagra de IgG2 y dominios CH2 y CH3 de IgGl.

Según se utiliza en la presente, "monómero de dominio Fe" describe la proteína de cadena simple que, cuando se asocia con otro monómero de dominio Fe, comprende un dominio Fe que se puede unir a un receptor Fcy. La asociación de dos monómeros de dominio Fe crea un dominio Fe. Un monómero de dominio Fe solo, que comprende solo un lado de un dominio Fe, no se puede unir a un receptor Fcy.

Según se utiliza en la presente, "monómero de dominio Fe parcial" describe la proteína de cadena simple que, cuando se asocia con otro monómero de dominio Fe parcial, comprende un dominio Fe parcial. La asociación de dos monómeros de dominio Fe parcial crea un dominio Fe parcial.

Str adomeros Los stradobodies de la presente invención están compuestos por stradomeros y un dominio Fab. En una modalidad, los stradobodies de la presente invención están compuestos por stradomeros multimerizantes y un dominio Fab. Los stradomeros son compuestos biomiméticos capaces de unir dos o más receptores Fe, preferentemente dos o más receptores Fcy y, más preferentemente, de demostrar una unión significativamente mejorada con respecto a un dominio Fe y, más preferentemente, de demostrar la disociación lenta característica de la avidez. En una modalidad, los stradobodies de la presente invención se utilizan para unirse a FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 y/o receptores Fcy sobre células efectoras como células NK y células derivadas de monocitos como células dendríticas inmaduras y macrófagos. En otra modalidad, los stradobodies de la presente invención se utilizan para unirse a receptores FcyRIIb sobre células B. En una modalidad, los receptores Fcy son receptores Fcy de baja afinidad como FcylIIa. Las conformaciones físicas de los stradomeros se han descrito anteriormente en la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2010/0239633 y la publicación PCT N.° WO 2012/016073, las cuales se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad.

Un "stradomero" es un polipéptido dimérico compuesto por dos monómeros de stradomeros lineales que, cuando se asocian, forman dos o más dominios Fe capaces de unir dos o más receptores Fcy. LOS stradomeros seriados tienen, preferentemente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más dominios Fe, así como dominios Fe parciales. Los dominios Fe y/o los dominios Fe parciales pueden estar unidos por uniones de dominios, como se define adicionalmente en la presente.

Como resultará evidente, los fragmentos Fe, fragmentos Fe parciales, dominios Fe y dominios Fe parciales planteados anteriormente se utilizan en la construcción de las diversas conformaciones de stradomeros. Son los monómeros de dominio Fe individuales y los monómeros de dominio Fe parciales, que también se plantean en la presente, los que se autoasocian para formar las estructuras diméricas que son los stradomeros que comprenden los stradobodies descritos en la presente. Además, los stradomeros se asocian con un dominio Fab para formar los stradobodies de la presente invención.

Según se utiliza en la presente, el término "monómero de stradomero" o "unidad de stradomero" se refiere a una molécula de péptidos contiguos única que, cuando se asocia con al menos un segundo monómero de stradomero, forma un polipéptido que comprende al menos dos dominios Fe. Los monómeros de stradomero se pueden asociar para formar stradomeros mediante uniones ínter-monómeros de stradomero o pueden formar stradomeros mediante autoensamblaje mediante enlaces covalentes y no covalentes.

Un monómero de stradomero puede tener una secuencia de aminoácidos que formará uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más dominios Fe cuando se asocian con otro monómero de stradomero para formar un stradomero. Un monómero de stradomero puede tener además una secuencia de aminoácidos que formará uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más dominios Fe parciales cuando se asocian con otro monómero de stradomero para formar un stradomero.

Las regiones de los monómeros de stradomero que formarán dominios Fe y dominios Fe parciales en el contexto de un stradomero se pueden disponer simplemente de Carboxi-terminal a amino-terminal de regiones sucesivas de la molécula de monómero de stradomero. La disposición de los monómeros de dominios Fe particulares y los monómeros de dominios Fe parciales permite la formación de dos dominios Fe funcionales tras la asociación de dos monómeros de stradomero.

Un dominio Fe se puede definir funcionalmente por su capacidad de unirse a FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 y/o un receptor Fcy. Los compuestos de la presente invención se unen a receptores Fe canónicos cognados incluido FcyRIIIa, FcyRIIb y/o SIGN-R1 con mayor afinidad y/o avidez mucho mayor que el control Fe de IgGl humana. Alternativamente, los compuestos de la presente invención se unen, preferentemente, al receptor neonatal FcRn sobre los receptores Fe canónicos como consecuencia de una mutación puntual en la posición 297 del Fe de IgGl. Como consecuencia, la secuencia de aminoácidos particular de un dominio Fe variará según los dominios Fe parciales que comprenden el dominio Fe. Sin embargo, en una modalidad de la presente invención el dominio Fe comprende la región bisagra y un dominio CH2 de una molécula de inmunoglobulina. En otra modalidad preferida, el dominio Fe comprende la región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina. En otra modalidad, el dominio Fe comprende la región bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4 de una molécula de inmunoglobulina. En otra modalidad, el dominio Fe comprende la región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH4 de una molécula de inmunoglobulina. En otra modalidad preferida, el dominio Fe comprende un dominio CH2 y un dominio CH3. En una modalidad preferida, el dominio Fe contiene el dominio bisagra, CH2 y CH3 de IgGl (SEQ ID NO:2). En otra modalidad preferida, el dominio Fe contiene el dominio CH2 y CH3 de IgGl (SEQ ID NO:19).

Unión de dominios Como se indicó anteriormente, una "unión de dominios" es una unión de péptidos entre monómeros de dominio Fe y/o monómeros de dominio Fe parcial que comprenden cada uno de los monómeros de stradomero individuales de los stradobodies de la presente invención. La unión de dominios puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos. Una unión de dominios no se produce entre monómeros de dominio Fe parcial que se encuentran en su secuencia natural. Es decir, cuando se utilizan porciones naturalmente contiguas unidas de monómeros de dominio Fe, como la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de IgG, estos monómeros de dominio Fe parcial comprenden una secuencia contigua y no se requiere ninguna unión de dominio entre estos elementos. Contrariamente, por ejemplo, cuando dos o más monómeros de dominio Fe o monómeros de dominio Fe parcial se unen de un modo que no es natural para formar un monómero de stradomero individual, se pueden utilizar uniones de dominios. Un ejemplo sería la unión entre dos péptidos bisagra/CH2/CH3, para crear un monómero de stradomero individual de un stradomero que comprende: bisagra/CH2/CH3/L/bisagra/CH2/CH3, en donde "L" es la unión de dominio. En los diversos casos descritos, la unión de dominio puede ser una de las porciones naturales de la cadena pesada que une la bisagra y los dominios CH en el monómero de dominio Fe de un anticuerpo. Alternativamente, la unión de dominio puede ser cualquier otra secuencia de aminoácidos que proporciona la separación y la flexibilidad necesarias entre los monómeros de dominio Fe y los monómeros de dominio Fe parcial de un monómero de stradomero individual y que permite que los monómeros de stradomero individuales formen parejas para formar los stradomeros que conforman los stradobodies de la presente invención. Una unión de dominio ejemplar es una secuencia ligadora GS . La secuencia ligadora GS puede comprender 1, 2, 3, 4 o más repeticiones de GGGGS . Preferentemente, una secuencia ligadora GS comprende 3 (G3S) o 4 (G4S) repeticiones de GGGGS.

En algunas modalidades, cada compuesto biomimético inmunológicamente activo contendrá, preferentemente, al menos una unión de dominio en cada monómero de stradomero del stradobody que funcionará para mantener los dominios Fe del biomimético inmunológicamente activo dentro de una región espacial restringida y que facilitará la actividad de activación de FcyR, por ejemplo, mediante la agregación de FcyR mediante la counión con los dominios Fe dentro del biomimético inmunológicamente activo. Preferentemente, las uniones de dominio permitirán el mismo grado o un grado mayor de variabilidad conformacional que proporciona el dominio bisagra de las moléculas IgG. Todas las uniones anteriores son conocidas en la téenica.

Unión ínter -monómeros de stradomero Una unión separada que se encuentra en los compuestos biomiméticos de la presente invención es la "unión inter-monómero de stradomero" que se produce entre dos o más monómeros de stradomero individuales que comprenden los stradobodies de la presente invención. Aunque las uniones de dominio son secuencias de aminoácidos cortas que sirven para unir los monómeros de dominio Fe y los monómeros de dominio Fe parciales que comprenden monómeros de stradomero individuales de los compuestos biomiméticos entre sí, las uniones ínter-monómero de stradomero sirven para unir dos o más monómeros de stradomero individuales que comprenden los compuestos biomiméticos. La unión inter-monómero de stradomero puede ser cualquier unión capaz de asociar de forma estable los monómeros de stradomero individuales. En algunas modalidades, la unión inter-monómero de stradomero puede ser un enlace covalente entre los monómeros de stradomero. Alternativamente, la unión inter-monómero de stradomero entre los monómeros de stradomero se puede realizar mediante reticulación química directa. En modalidades preferidas, las estructuras de monómero de stradomero aprovechan las propiedades de autoensamblaje naturales entre los monómeros de dominio Fe para crear stradomeros autoensamblantes que comprenden los stradobodies de la presente invención. El entendido en la téenica comprenderá que las uniones inter-monómero de stradomero permiten que dos o más monómeros de stradobody individuales formen los compuestos biomiméticos del stradobody que comprenden el presente stradobody multimerizante de la invención y que los compuestos resultantes tienen la capacidad de reticular más de un FcyR.

Como se planteó anteriormente, en una modalidad preferida, la unión inter-monómero de stradomero que forma un stradomero es una unión que se deriva del autoensamblaje de los monómeros de stradomero. En una modalidad, los dos monómeros de stradomero que comprenden el stradomero son péptidos idénticos, de modo que los dos monómeros de stradomero individuales que comprenden el stradomero son idénticos en cuanto a la secuencia. Sin embargo, el entendido en la téenica comprenderá que otras modalidades incluyen stradomeros en donde los monómeros de stradomero difieren entre sí en la secuencia de aminoácidos.

Dos monómeros de stradomero pueden formar un stradomero, por ejemplo, mediante la alineación en paralelo de modo que el agrupamiento en parejas se produzca entre monómeros de dominio Fe parcial idénticos en los monómeros de stradomero. Sin embargo, la presente invención también incluye modalidades en donde la formación de parejas se produce entre monómeros de dominio Fe parcial no idénticos y modalidades en donde la formación de parejas se produce entre monómeros de dominio Fe parcial idénticos en los monómeros de stradomero, pero en donde la alineación de los dos monómeros de stradomero está desviada.

Dominios de mu ltimerización El dominio de multimerización puede comprender una secuencia de péptidos que provoca que las proteínas diméricas se multimericen adiciomalmente. La "multimerización", según se emplea en la presente, se refiere a la unión o enlace de múltiples (es decir, dos o más) homodímeros de stradobody individuales. Por ejemplo, los stradobodies se multimerizan cuando al menos un homodímero de stradobody (es decir, al menos un polipéptido homodimérico que comprende uno o más dominios Fe y uno o más dominios Fab) está unido a al menos otro homodímero de stradobody a través de un dominio de multimerización. Algunos ejemplos de dominios de multimerización de péptidos incluyen la bisagra de IgG2, la cremallera de isoleucina, la repetición glicina-prolina-prolina de colágeno ("GPP") y los dedos de zinc. La influencia de la glicosilación sobre la multimerización de péptidos se ha descrito ampliamente en la téenica (p. ej., Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams y Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.80, No. 9, [Part 1: Biological Sciences] (mayo 1, 1983), pp. 2771-2774; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka y Haruko Ogawa. International Congress Series volumen 1223, diciembre 2001, páginas 97-101).

En una modalidad preferida, el dominio de multimerización es una bisagra de IgG2. Como se conoce en la téenica, la región bisagra de IgG2 humana puede formar dímeros covalentes (Yoo, E.M. et al. J. Immunol.170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). La formación de dímeros de IgG2 está mediada potencialmente a través de la estructura de bisagra de IgG2 mediante enlaces C-C (Yoo et al 2003), lo que sugiere que la estructura bisagra sola puede mediar la formación de dímeros. La cantidad de dímeros de IgG2 que se encuentran en el suero humano, sin embargo, es limitada. No existen pruebas cuantitativas de la multimerización de IgG2 más allá del dímero del homodímero. (Yoo et al.2003). Es decir, no se ha descubierto que la IgG2 nativa forme multímeros de orden superior en el suero humano.

La secuencia de aminoácidos del monómero de bisagra de IgG2 humana es del siguiente modo: ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 3). La mutación de cualquiera de las 4 cisternas en SEQ ID NO: 3 se puede asociar con la multimerización enormemente disminuida del stradobody. Existen dos porciones C-X-X-C del monómero de bisagra de IgG2. Por ende, los stradobodies de la presente invención pueden comprender la secuencia de 12 aminoácidos completa del monómero de bisagra de IgG2 o uno o ambos de los núcleos de cuatro aminoácidos, junto con los monómeros de dominio Fe. Aunque el X-X de las estructuras nucleares puede ser cualquier aminoácido, en una modalidad preferida, la secuencia X-X es V-E o P-P. El entendido en la téenica comprenderá que el monómero de bisagra de IgG2 puede estar compuesto de cualquier porción de la secuencia bisagra además de la estructura de cuatro aminoácidos nuclear, incluida la totalidad de la secuencia bisagra de IgG2 y la totalidad o parte de las secuencias de monómeros de los dominios CH2 y CH3 de IgG2. Sin limitarse por la teoría, el dominio de multimerización de bisagra de IgG2 de un homodímero de stradobody puede formar multímeros mediante la interacción con cualquier porción de otro homodímero de stradobody. Es decir, la bisagra de IgG2 de un homodímero de stradobody puede multimerizarse mediante la unión con la bisagra de IgG2 de otro homodímero de stradobody, formando así un dímero del homodímero, o multímeros de orden superior manteniendo a su vez una unión funcional aumentada con los receptores Fe con respecto al Fe de IgGl natural . Alternativamente, el dominio bisagra de IgG2 de un homodímero de stradobody puede unirse a la bisagra de IgGl de otro homodímero de stradobody, formando así un dímero del homodímero, o multímeros de orden superior manteniendo a su vez una unión funcional aumentada con los receptores Fe con respecto al Fe de IgGl natural. También es posible que el dominio bisagra de IgG2 de un homodímero de stradobody se una a otra porción del dominio Fe de IgGl, es decir el dominio CH2 o CH3 de otro homodímero de stradobody para formar el dímero del homodímero, o multímeros de orden superior manteniendo a su vez una unión funcional aumentada con los receptores Fe con respecto al Fe de IgGl natural.

En otra modalidad preferida, se pueden utilizar cremalleras de leucina como dominios de multimerización.

En otra modalidad preferida, se pueden utilizar cremalleras de isoleucina como dominios de multimerización. Se sabe que las cremalleras de leucina e isoleucina (dominios de superhélice) facilitan la formación de dímeros, trímeros y tetrámeros de proteínas (Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993); O'Shea et al. Science 243:538 (1989)).

Aunque el entendido en la téenica comprenderá que se pueden utilizar diferentes tipos de cremalleras de leucina e isoleucina, en una modalidad, se utiliza la cremallera de isoleucina del regulador transcripcional GCN4 modificada como se describe (Morris et al., Mol. Immunol. 44:3112-3121 (2007); Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993)): GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGG (SEQ ID NO: 5). En otra modalidad, la secuencia de la cremallera de isoleucina utilizada es: GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHDI (SEQ ID NO: 32).

Las secuencias de cremalleras de isoleucina son solo dos de diversas secuencias posibles que se pueden utilizar para la multimerización de los monómeros de dominio Fe. Aunque se puede utilizar la secuencia completa que se muestra en SEQ ID NO: 5 o 32, la parte subrayada de la secuencia representa la secuencia nuclear de la cremallera de isoleucina que se puede utilizar en los stradobodies de la presente invención. Por ende, los monómeros de stradomero que comprenden los stradobodies de la presente invención pueden comprender la secuencia de aminoácidos completa de la cremallera de isoleucina o el núcleo de 28 aminoácidos, junto con uno o más monómeros del dominio Fe. El entendido en la téenica también comprenderá que la cremallera de isoleucina puede estar compuesta por cualquier parte de la cremallera además de la estructura de 28 aminoácidos nuclear y, por lo tanto, puede estar compuesta por más de 28 aminoácidos, pero menos que la secuencia completa de SEQ ID NO: 5 o 32.

En otra modalidad preferida, se pueden utilizar repeticiones de GPP como dominios de multimerización. GPP es una secuencia de aminoácidos que se encuentra en el colágeno humano que provoca la unión proteína de colágeno: proteína. Aunque el entendido en la técnica comprenderá que se pueden utilizar diferentes tipos de repeticiones de GPP como un dominio de multimerización, en una modalidad preferida, se utilizan las repeticiones de glicina- prolina-prolina según se describen (Fan et al FASEB Journal 3796 vol 222008) : (SEQ ID NO:26). La secuencia de la repetición glicina-prolina-prolina es solo una de diversas secuencias posibles que se pueden utilizar para la multimerización de los stradobodies. Aunque se puede utilizar la secuencia completa que se muestra en SEQ ID NO:26, también son posibles repeticiones de diferente longitud para multimerizar los monómeros de dominio Fe. Asimismo, las repeticiones que contienen diferentes aminoácidos dentro de las repeticiones de GPP también se pueden sustituir.

Stradobody La presente invención se refiere a stradobodies y a métodos para fabricar y utilizar los stradobodies. Según se emplea en la presente, "stradobody" se refiere a una molécula que comprende dos o más dominios Fe, a los cuales se unen uno o más dominios Fab. Por lo tanto, en virtud de los dominios Fab y dominios Fe, los stradobodies tienen capacidad de unión al antígeno y actividad de unión al receptor Fcy. En algunas modalidades, la actividad de unión al receptor Fcy se puede deber a una capacidad de unión y reticulación de FcyR igual o mayor que la porción Fe de un holo-anticuerpo de estructura nativa. La porción Fab del stradobody puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera. La cadena pesada variable y la cadena ligera pueden ser, iinnddeeppeennddiieenntteemmeennttee,, de cualquier inmunoglobulina compatible como IgAl, lgA2, IgM, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 y pueden ser del mismo isotipo de Ig o diferente, pero preferentemente son del mismo isotipo de Ig. Las cadenas ligeras kappa o lambda también pueden ser de isotipos de Ig diferentes. En algunas modalidades, los stradobodies, al igual que los stradomeros, se pueden unir a dos o más FcyR y modular la función inmunitaria. En una modalidad, los stradobodies de la presente invención comprenden un dominio Fab, uno o más dominios Fe y uno o más dominios de multimerización, en donde al menos uno de los dominios de multimerización separa dos o más dominios Fe o se ubica en el Carboxi-terminal de la región Fe. El término "región Fe" se utiliza en la presente para referirse a la región del stradobody que comprende dominios Fe, uniones de dominios y dominios de multimerización. Por ende, la región Fe es la región del stradobody que no comprende el dominio Fab. Los dominios de multimerización se describen anteriormente y son secuencias de aminoácidos que se sabe que producen la multimerización de las proteínas en las proteínas en donde se encuentran naturalmente. En una modalidad, los dominios de multimerización pueden ser bisagras de IgG, cremalleras de isoleucina o una combinación de estos. En una modalidad particular, el stradobody está compuesto por un Fab, un primer dominio Fe, una cremallera de isoleucina, una bisagra de IgG2 y un segundo dominio Fe. Fab comprende una cadena pesada y una cadena ligera como se muestra en las estructuras de inmunoglobulina nativas.

Los stradobodies de la presente invención se pueden clasificar como stradobodies seriados o stradobodies de C-terminal . Las estructuras generales de estos stradobodies se muestran en la figura 1. Los stradobodies seriados y de C-terminal de la presente invención comprenden, preferentemente, un dominio Fab; uno o más dominios Fe; y uno o más dominios de multimerización. Por ejemplo, los stradobodies seriados y de C-terminal de la invención comprenden, preferentemente, un dominio Fab; 1, 2, 3, 4 o 5 dominios Fe; y 1, 2, 3, 4 o 5 dominios de multimerización. En algunas modalidades, los stradobodies seriados y de C-terminal de la presente invención comprenden además uno o más espaciadores o enlazadores flexibles. Los stradobodies seriados comprenden, preferentemente, 2 o más dominios Fe. Por ejemplo, los stradobodies seriados comprenden, preferentemente, 2, 3, 4, 5 o 6 dominios Fe.

Se diseñaron stradobodies seriados para unir y reticular simultáneamente múltiples FcyR de baja afinidad mediante la incorporación de dos o más dominios Fe en una cadena pesada quimérica. Los dominios Fe están separados por uno o más dominios de multimerización, espaciadores y/o enlazadores flexibles iguales o diferentes. Los stradobodies seriados pueden ser stradobodies seriados multimerizantes o stradobodies seriados no multimerizantes . Los stradobodies seriados multimerizantes que comprenden al menos un dominio de multimerización están asociados con la formación de multímeros. Los dominios de multimerización se describieron anteriormente e incluyen bisagras de IgG2, cremalleras de isoleucina, GPP de colágeno y dedos de zinc. Los stradobodies seriados no multimerizantes pueden no comprender un dominio de multimerización, pero pueden comprender una o más uniones de dominio, como un enlazador G4S. En algunas modalidades, un stradobody seriado multimerizante comprende uno o más dominios de multimerización y una o más uniones de dominio. Las estructuras generales de los stradobodies seriados se muestran en la figura 2. Se muestran estructuras más específicas de construcciones de stradobodies seriados ejemplares que comprenden uno o más de los dominios de multimerización y/o dominios de enlazadores indicados (ILZ se refiere a la cremallera de isoleucina; 2H se refiere a la bisagra de IgG2; y G4S se refiere a una secuencia de aminoácidos Gly4Ser) en la figura 3. Las construcciones de stradobodies seriados que comprenden una región Fab específica para EGFR se muestran a continuación en la tabla 1. Las construcciones de stradobodies seriados que comprenden una región Fab específica para HER2/neu o una región Fab específica para CD20 se muestran en la figura 4 y, a continuación, en la tabla 1.

Se diseñaron los stradobodies multimerizados de C-terminal para unirse y reticular simultáneamente múltiples FcyR de baja afinidad mediante la incorporación de uno o más dominios de multimerización en el C-terminal de la región Fe y promover así la formación de complejos de stradobodies capaces de interactuar simultáneamente con múltiples receptores de Fe. Las estructuras ejemplares de los stradobodies de C-terminal se muestran en la figura 5. Los stradobodies multimerizados de C-terminal que comprenden un Fab anti-EGFR se muestran en la figura 6 y a continuación en la tabla 1. Las construcciones de stradobodies multimerizados de C-terminal que comprenden un Fab anti-CD20 también se muestran en la figura 6 y a continuación en la tabla 1. En los stradobodies de C-terminal, la región Fe de la cadena pesada tiene uno o más dominios de multimerización, espaciadores o enlazadores flexibles del lado del C-terminal iguales o diferentes. Los stradobodies de C-terminal que se muestran también incluyen una construcción que contiene un dominio de multimerización y una etiqueta de purificación.

Tabla 1 Construcciones de stradobody y anticuerpo monoclonal no modificado ¾lfffg¾l¥¾ Anticuerpos ntendido en la téenica reconocerá que los ies específicos descritos anteriormente son ejemplares y que es posible realizar stradobodies seriados con diversas estructuras y combinaciones de stradomeros y componentes básicos de stradomero, por ejemplo, stradobodies de C-terminal muí timer izados seriados que comprenden uno o más dominios de muí timerizac ion y dos o más dominios Fe. Los stradobodies de C-terminal muí timerizados seriados pueden comprender uno o más dominios de multimerización entre dos dominios Fe y uno o más dominios de multimerización en el C-terminal de la región Fe .

Los stradobodies poseerán las propiedades de unión al antígeno de la porción Fab y las propiedades de stradomero descritas anteriormente. La combinación servirá para unir, reticular y activar los receptores Fcy sobre las células efectoras a una velocidad superior que la que puede lograr una estructura principal de Fe de un holo-ant icuerpo, particularmente en el entorno de la expresión de epítopos baja (p. ej., el 90 % de los pacientes con cáncer de mama cuyos tumores no se clasifican como con alta expresión de HER2/neu), induciendo la ADCC, CDC y/o DC en un mayor porcentaje de pacientes. Como se indicó anteriormente, se puede añadir uno o más dominios Fab de unión al antígeno a los stradomeros para formar stradobodies .

Se ha descubierto, sorprendentemente, que los stradobodies con uno o más dominios de mult imerización entre dos dominios Fe (p. ej ., GB2542, GB3542, GB4542 y GB7542 correspondientes a SEQ ID No 35, 33, 37 y 66, respectivamente) o ubicados en el Carboxi- terminal de la región Fe (p. ej ., GB2547, GB3547, GB4547 y GB7547, correspondiente a SEQ ID No 91, 70, 76 y 87, respectivamente), presentaron no solo muí timer ización superior, sino que también unión y citotoxi cidad superiores en comparación con el mAb padre y con los stradobodies sin dominios de mult imeri zación o con uno o más dominios de multimerización ubicados en el N-terminal de la región Fe, incluido en ADCC, CDC, DC y otros mecanismos de citotoxicidad . En particular, un stradobody que comprende una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2 produjeron una ADCC, CDC y DC particularmente fuertes y unión a clq particularmente fuerte. Inesperadamente, cuando estos dos dominios de mult imerización se ubicaban entre dos dominios Fe, los resultados de la muítimerización , la unión a FcyR y ADCC, CDC y DC, así como los de la unión a clq, fueron particularmente sólidos.

Se descubrió, sorprendentemente, que la presencia de un Fab puede modificar drásticamente la capacidad del stradobody resultante de multimerizarse con respecto al stradomero aislado que comprende el stradobody. Más específicamente, los stradomeros con dominios de multimerización de N-terminal se pueden multimerizar bien y funcionar bien, pero un stradobody compuesto por el mismo stradomer, como se describió en WO 2008/151088, se puede multimerizar poco o nada. En cambio, es posible que los stradobodies seriados con uno o más dominios de multimerización o los stradobodies con uno o más dominios de multimerización de C-terminal se multimericen mejor que el stradomero que comprende el stradobody.

En algunas modalidades, el stradobody de la invención comprende además una señal de peligro o una señal de daño. En algunas modalidades, el stradobody de la invención se administra a los pacientes simultáneamente, o en el mismo ciclo de tratamiento, que una señal de peligro o una señal de daño. Pradeu y Cooper (Front Im unol .3 : Article 287, 1- 9 (2012) ) estudiaron recientemente las señales de peligro o de daño. En una modalidad, las señales de peligro o las señales de daño que pueden estar comprendidas dentro o que se pueden administrar con el stradobody de la invención incluyen las señales endógenas que incluyen CD40-L, TNF-a, IL-Ib, IFNa, los nucleótidos intracelulares ATP o UTP, secuencias CpG no metiladas largas, proteínas de choque térmico, intermedios de oxígeno reactivo, péptido intestinal vasoactivo, metaloproteinasa- 9 , productos de degradación de sulfato de heparan, productos de degradación pequeños del ácido hialurónico, fosfolípidos derivados de LDL 0 LOX-1. En otra modalidad, las señales de peligro o las señales de daño que pueden estar comprendidas dentro o que se pueden administrar con el stradobody de la invención incluyen ácido úrico, cuadro 1 de grupo de alta movilidad, una inflamasoma (un complejo de muí tiprot eína que contiene un receptor de reconocimiento de patrones), IL-1 a; proteínas S100; factor de crecimiento derivado de hepatoma, IL-1 a; concentraciones altas de adenosina 5 '-trifosf atasa, b-D-glucopiranosilceramida , IL-33, nanopa r tículas como nanopart ículas de oro o F-actina. En una modalidad especialmente preferida, el stradobody de la invención comprende una señal de peligro o señal de daño de péptido en el Carboxi -terminal del stradobody, incluido péptido intestinal vasoactivo, met aloprot einasa -9, proteína de choque térmico, grupo 1 de alta movilidad, S-100, IL-la, factor de crecimiento derivado de hepatoma, péptidos que comparten una similitud de secuencia de aminoácidos de al menos el 70 % con estos péptidos y péptidos que son fragmentos de estos péptidos.

En algunas modalidades, el stradobody de la invención comprende un Fab que es específico para EGFR. En algunas modalidades, el Fab específico de EGFR se deriva del anticuerpo monoclonal cetuximáb. En algunas modalidades, el Fab es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO: 31 .

En algunas modalidades, el stradobody de la invención comprende un Fab que es específico para HER2/neu. En otras modalidades, el stradobody comprende un Fab que se deriva del anticuerpo monoclonal anti -HER2 /neu trastuzumab. En algunas modalidades, el Fab es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO 34.

En algunas modalidades, el stradobody de la invención comprende un Fab que es específico para CD20. En otras modalidades, el stradobody comprende un Fab que se deriva del anticuerpo monoclonal anti-CD20 rituximab. En algunas modalidades, el Fab es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO 36.

En algunas modalidades, el stradobody de la invención comprende un Fab que es específico para TNF. En otras modalidades, el stradobody comprende un Fab que se deriva del anticuerpo monoclonal anti-TNF adalimumab. En algunas modalidades, el Fab es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO 67.

En algunas modalidades, el stradobody de la invención comprende más de un Fab. En otras modalidades, cada uno de los más de un Fab es específico para un antígeno diferente. Por ejemplo, un stradobody puede comprender Fab específicos para EGFR y HER2/neu ; CD3 y CD19 ; CD3 y CD20; CD3 y el antígeno carc inoembrionar io ; CD3 y EGFR; y combinaciones de estos .

En determinadas modalidades, los stradobodies comprenden, de amino -terminal a Carboxi -terminal , un dominio Fab, un primer CH2 de IgGl, un primer CH3 de IgGl, una cremallera de isoleucina, una bisagra de IgG2 , un segundo CH2 de IgGl y un segundo CH3 de IgGl (figura 7).

En una modalidad particular, el stradobody de la invención comprende una secuencia de aminoácidos líder de acuerdo con SEQ ID NO: 1, una región variable específica de EGFR y una secuencia de aminoácidos de la región CH2 de acuerdo con SEQ ID NO: 31, un dominio Fe de IgGl de acuerdo con SEQ ID NO: 2, una cremallera de isoleucina de acuerdo con SEQ ID NO: 32 y una bisagra de IgG2 de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody completo es de acuerdo con SEQ ID NO: 33 (construcción GB3542 en la tabla 2). En una modalidad, el stradobody es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO: 33.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody completo es de acuerdo con SEQ ID NO: 35 (construcción GB2542 en la tabla 2). En una modalidad, el stradobody es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO: 35.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody completo es de acuerdo con SEQ ID NO: 37 (construcción GB4542 en la tabla 2). En una modalidad, el stradobody es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 ¾, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO: 37.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del stradobody completo es de acuerdo con SEQ ID NO: 66 (construcción GB7542 en la tabla 2). En una modalidad, el stradobody es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % homólogo con SEQ ID NO: 66.

Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de las construcciones de stradobodies GB2542, GB3542, GB4542 y GB7542, y componentes de las construcciones GB2542, GB3542 GB4542 y GB7542.

Se entiende que los stradobodies descritos en la presente se pueden derivar de cualquiera de diversas especies. De hecho, los dominios Fe, o los dominios Fe parciales en cualquier molécula biomimética de la presente invención se pueden derivar de la inmunoglobulina de más de una (p. ej., de dos, tres, cuatro, cinco o más) especie. Sin embargo, se derivarán, más comúnmente, de una única especie. Además, se apreciará que cualquiera de los métodos descritos en la presente (p. ej., los métodos de tratamiento) se puede aplicar a cualquier especie. En general, todos los componentes de un biomimético aplicado a una especie de interés se derivarán de la especie. Sin embargo, también se pueden utilizar biomiméticos en los cuales todos los componentes son de especies diferentes o son de más de una especie (incluida o no la especie a la cual se aplica el método pertinente).

Los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4 específicos y las regiones bisagra que comprenden los dominios Fe y los dominios Fe parciales de los stradobodies de la presente invención se pueden seleccionar independientemente, tanto en términos de la subclase de inmunoglobulina, como en el organismo del cual se derivan. En consecuencia, los stradobodies descritos en la presente pueden comprender dominios Fe y dominios Fe parciales que son, independientemente, de diversos tipos de inmunoglobulina como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgAl, IgD, IgE e IgM humana, IgG2a de ratón o IgGa o IgGb de perro. Preferentemente, para los agentes terapéuticos humanos, los dominios Fe de la presente invención son del isotipo IgGl humano. De forma similar, cada dominio Fe y dominio Fe parcial se puede derivar de diversas especies, preferentemente una especie mamífera, incluido primates no humanos (p. ej., monos, babuinos y chimpancés), seres humanos, murinos, rattus, bovinos, equinos, felinos, caninos, porcinos, conejos, cabras, ciervos, ovejas, hurones, jerbos, conejillos de indias, hámsters, murciélagos, aves (p. ej., pollos, pavos y patos), peces y reptiles para producir moléculas de stradobodies quiméricas o específicas de la especie.

Fab puede ser una estructura quimérica compuesta por regiones constantes humanas y regiones variables no humanas como la región variable de un anticuerpo de ratón, rata, conejo, mono o cabra. Los entendidos en la téenica serán capaces de fabricar diversas estructuras quiméricas Fab para incorporar en stradobodies utilizando las metodologías disponibles actualmente y que se describen en la bibliografía científica para las construcciones. Los dominios Fab, los dominios Fe y los dominios Fe parciales individuales también pueden ser humanizados. Por ende, los stradobodies "humanizados" se pueden diseñar de forma análoga a los anticuerpos monoclonales "humanizados".

Los entendidos en la técnica notarán que diferentes dominios Fe y dominios Fe parciales proporcionarán diferentes tipos de funcionalidades. Por ejemplo, los FcyR se unen específicamente a las inmunoglobulinas IgG y no se unen bien a otras clases de inmunoglobulinas. Por lo tanto, los entendidos en la téenica que pretendan diseñar un stradobody con capacidad de unión al receptor Fcy múltiple, diseñarán dominios Fe de stradomero que incorporen, al menos, las secuencias de unión al receptor Fcy de IgG bien caracterizadas, incluido aquellas en la región bisagra de IgG inferior y/o los dominios CH2 y CH3 de IgG. Los entendidos en la técnica también comprenderán que diversas consecuencias perjudiciales se pueden asociar con el uso de dominios de Ig particulares, como la anafilaxis asociada con las infusiones de IgA. Los biomiméticos descritos en la presente se deben diseñar, en general, para evitar los efectos, aunque en circunstancias particulares los efectos pueden ser deseables.

La presente invención también comprende stradobodies que comprenden dominios Fe y dominios Fe parciales que tienen aminoácidos que difieren de las secuencias de aminoácidos de origen natural del dominio Fe o del dominio Fe parcial. Los dominios Fe preferidos para incluir en los compuestos biomiméticos de la presente invención tienen una afinidad de unión específica medible a un receptor holo-Fcy o a una porción de un dominio extracelular soluble de un FcyR. Las secuencias de aminoácidos primarias y las estructuras de cristalografía de rayos X de múltiples dominios Fe y monómeros de dominios Fe están disponibles en la técnica. Véase, p. ej., Woof JM, Burton DR. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. 2004 Feb;4(2):89-99. Los dominios Fe representativos con capacidad de unión al receptor Fcy incluyen los dominios Fe de la IgGl humana (SEQ ID NO: 2). Estas secuencias nativas se han sometido a análisis de estructura-función extensos incluido el mapeo de mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias funcionales. Basándose en estos estudios anteriores de estructura-función y en los datos de cristalografía disponibles, los entendidos en la téenica pueden diseñar variantes de secuencia de dominio Fe funcionales, conservando a su vez la capacidad de unión al receptor FcyR del dominio Fe. Por ejemplo, se pueden añadir residuos de cisteína para mejorar el enlace sulfuro entre los monómeros o se puede eliminar para modificar la interacción entre los homodímeros de stradomero que comprenden el homodímero de stradobody.

Además, la presente invención abarca stradobodies que comprenden dominios Fab que tienen aminoácidos que difieren de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del cual se deriva el dominio Fab. Los dominios Fab para incluir en los compuestos biomiméticos de la presente invención tienen una afinidad de unión específica medible a un antígeno particular. Preferentemente, los compuestos biomiméticos tienen una afinidad de unión que es mayor que la afinidad de unión de los anticuerpos no modificados correspondientes.

Los cambios de aminoácidos pueden disminuir, aumentar o dejar inalterada la afinidad de unión del stradobody al receptor Fcy o al antígeno. Preferentemente, los cambios de aminoácidos serán sustituciones de aminoácidos conservadoras, sin embargo, los cambios incluyen supresiones, adiciones y otras sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, típicamente, cambios dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Además, el cambio de aminoácidos puede mejorar la fuerza de multimerización, por ejemplo, mediante el añadido de residuos de cisteína.

Los cambios de aminoácidos pueden ser de origen natural o se pueden introducir, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. Los cambios de aminoácidos se pueden producir en cualquier lugar dentro del dominio Fe o del dominio Fab siempre que el dominio Fe mantenga la función de unión al receptor y la actividad biológica y el dominio Fab mantenga la función de unión al receptor y la actividad biológica. En una modalidad preferida, el polimorfismo o la mutación produce unión al receptor/antígeno mejorada y/o multimerización o función biológica mejorada. Para los dominios Fe, el polimorfismo/mutación se produce, preferentemente, en una o más de las posiciones de aminoácidos 233-435 de acuerdo con el índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los polimorfismos/mutaciones específicos en estas posiciones de aminoácidos son conocidos en la téenica y se pueden encontrar, por ejemplo en Shields, et al. (2001) "High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for FcyRI, FcyRII, FcyRIII and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the FcyR", J. Biol. Chem., 276(9):6591-6601, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

A partir de lo anterior, se apreciará que los stradobodies de la presente invención incluyen stradobodies que tienen: (a) solo dominios Fab y dominios Fe de origen natural; (b) una mezcla de dominios Fab y Fe de origen natural y dominios Fab y Fe con secuencias de aminoácidos modificadas; y (c) solo dominios Fab y Fe con secuencias de aminoácidos modificadas. Lo único que se necesita es que los stradobodies que contienen secuencias de aminoácidos modificadas tengan la menos el 25 %; el 30 %,- el 40 %; el 50 %; el 60 %; el 70 %; el 80 %; el 90 %; el 95 %; el 96 %; el 97 %; el 98 %; el 99 %; el 99,5 %; o el 100 % o incluso más de la capacidad de un stradobody correspondiente que comprende los dominios Fab y Fe con secuencias de origen natural para unirse a un antígeno y a los receptores FcyR.

Los receptores Fcy y los sitios de unión al antígeno mencionados anteriormente que se encuentran en los stradobodies de la presente invención se pueden modificar en cuanto a la secuencia mediante ingeniería genética para derivar de forma predecible los sitios de unión con capacidades y afinidades de unión modificadas con respecto a una secuencia nativa. Por ejemplo, se pueden modificar residuos específicos que reducen la unión del dominio Fe de los compuestos biomiméticos a FcyRIIb y que aumentan, a su vez, la unión a FcyRIIIa o viceversa o que reducen la unión del dominio Fe de los compuestos biomiméticos a FcyRIIb y que aumentan, a su vez, la unión a FcRn o viceversa. Un ejemplo de un análisis de estructura-función basado en la mutagénesis extenso para las secuencias de unión al receptor Fcy de IgG humana es Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for FcyRI, FcyRII, FcyRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the FcyR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604. Se han realizado estudios similares sobre Fe de IgG murina (Fe de mlgG). Basándose en las homologías de secuencia primaria y estructurales de los dominios Fe de IgG nativos entre las especies, los entendidos en la téenica puede traducir el conocimiento de la estructura-función extenso del Fe de IgG humana y del Fe de IgG de ratón a la mutagénesis racional de todas las secuencia del sitio de unión al receptor Fcy nativas en los compuestos biomiméticos de la presente invención para diseñar sitios de unión con especificidades del receptor Fcy y afinidades de unión particulares.

Además de la composición de la secuencia de aminoácidos, se sabe que el contenido de carbohidratos del dominio Fe cumple una función importante sobre la estructura del dominio Fe y las interacciones de unión con FcyR. Véase, p. ej., Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcyRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Jul 2002; 277: 26733 - 26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright y Sherie L. Morrison. Effect of C2- Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgGl Antibodies in Glycosylation Mutants of Chínese Hámster Ovary Cells. J. Immunol, abr 1998; 160: 3393 - 3402. De forma similar, se sabe que el grado de fucosilación de los anticuerpos cumple una función en la unión al antígeno y en la ADCC. Véase, p. ej., Yamane-Ohnuki y Satoh, Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation. Mabs. 2009 May-Jun; l(3):230-236. El contenido de carbohidratos se puede controlar utilizando, por ejemplo, sistemas de expresión de proteínas particulares incluido líneas celulares particulares o modificación enzimática in vitro. En algunas modalidades, los stradobodies están desfucosilados. Se sabe que la desfucosilación mejora la afinidad de Fe de IgGl por FcYRIIIa. Por ende, la presente invención incluye stradobodies con el contenido de carbohidratos nativos de holo-anticuerpo de los cuales se obtuvieron los dominios, así como aquellos compuestos de stradobody con un contenido de carbohidratos modificado. En otra modalidad, se utiliza una línea celular modificada para generar un patrón de glicosilación preferido. En otra modalidad, se utiliza la glicosilación quimioenzimática para generar un patrón de glicosilación preferido incluido con azúcares no naturales. En otra modalidad, los componentes de multímero del stradobody se caracterizan por un patrón de glicosilación diferente en comparación con el componente de homodímero del mismo stradobody. En una modalidad preferida, el stradobody está enriquecido para los multímeros que comprenden un patrón de glicosilación que mejora la unión al receptor Fe.

La adición a la cadena de polipéptidos de cambios en la glicosilación, el dominio Fe parcial o una región de multimerización puede crear un cambio conformacional en el dominio Fe que permite una unión mejorada del dominio Fe con un receptor Fcy. Por lo tanto, los cambios al polipéptido que parecen muy menores también pueden crear un stradobody capaz de tener una unión mejorada a múltiples receptores Fcy o receptores FcRn o un stradobody con menor capacidad de unirse a múltiples receptores Fcy o receptores FcRn.

Los entendidos en la téenica reconocerán además que no es necesario que los dominios Fe y los dominios Fe parciales utilizados en las modalidades de la presente invención sean versiones de longitud completa. Es decir, la presente invención abarca el uso de los monómeros de dominio Fe y los monómeros de dominio Fe parcial que carecen de aminoácidos del amino-terminal, del Carboxi-terminal o del medio de los monómeros de dominio Fe y de los monómeros de dominio Fe parcial particulares que comprenden los stradobodies de la presente invención.

Por ejemplo, el sitio de unión sobre las inmunoglobulinas de IgG humanas para los receptores Fcy se ha descrito (p. ej., Radaev, S., Sun, P., 2001. Recognition of Immunoglobulins by Fcy Receptors. Molecular Immunology 38, 1073 - 1083; Shields, R.L. et. al., 2001. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for FcyRI, FcyRII, FCYRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the FCYR. J. Biol. Chem. 276 (9), 6591-6604). Basándose en el conocimiento, se pueden retirar aminoácidos del dominio Fe de estas inmunoglobulinas y determinar los efectos sobre la interacción de unión entre el dominio Fe y el receptor. Por lo tanto, la presente invención comprende dominios Fe de IgG que tienen al menos aproximadamente el 90 % de los aminoácidos que abarcan las posiciones de 233 a 338 de la bisagra inferior y CH2 como se define en Radaev, S., Sun, P., 2001.

Los dominios Fe parciales de las inmunoglobulinas IgG de la presente invención pueden incluir la totalidad o parte de la región bisagra, la totalidad o parte del dominio CH2 y la totalidad o parte del dominio CH3.

Los dominios Fe parciales de IgG que tienen solo una parte de la región bisagra, parte del dominio CH2 o parte del dominio CH3 se construyen a partir de monómeros de dominio Fe parcial. Por ende, la presente invención incluye los monómeros de la región bisagra de IgG derivados del N-terminal de la región bisagra o del C-terminal de la región bisagra. Por lo tanto, pueden contener, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 o 62 (hasta 15 para IgGl, hasta 12 para IgG2, hasta 62 para IgG3, hasta 12 para IgG4) aminoácidos de la región bisagra.

La presente invención también incluye los monómeros de dominio CH2 de IgG derivados del N-terminal del dominio CH2 o del C-terminal del dominio CH2. Por lo tanto, pueden contener, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110 (hasta 110 para IgGl y IgG3, hasta 109 para IgG2 y IgG4) aminoácidos del dominio CH2.

La presente invención incluye además los monómeros de dominio CH3 de IgG derivados del N-terminal del dominio CH3 o del C-terminal del dominio CH3. Por lo tanto, pueden contener, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 o 107 (hasta 106 para IgGl y IgG3, hasta 107 para IgG2 y IgG4) aminoácidos del dominio CH3.

El término polipéptido o péptido "aislado", según se emplea en la presente, se refiere a un polipéptido o a un péptido que, o bien no tiene una contraparte de origen natural o que se ha separado o purificado de los componentes que lo acompañan naturalmente, p. ej., en tejidos como el páncreas, hígado, bazo, ovarios, testículos, músculos, tejido de las articulaciones, tejido neuronal, tejido gastrointestinal o tejido mamario o tejido tumoral (p. ej tejido de cáncer de mama) o fluidos corporales como sangre, suero u orina. Típicamente, el polipéptido o péptido se considera "aislado" cuanto está al menos el 70 % libre, en peso seco, de las proteínas y otras moléculas orgánicas de origen natural con las cuales se asocia naturalmente. Preferentemente, una preparación de un polipéptido (o péptido) de la invención es al menos el 80 %, más preferentemente, al menos el 90 % y, más preferentemente, al menos el 99 %, en peso seco, el polipéptido (péptido), respectivamente, de la invención. Como un polipéptido o péptido que se sintetiza químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que naturalmente lo acompañan, el polipéptido o péptido sintético está "aislado".

Un polipéptido (o péptido) aislado de la invención se puede obtener, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural (p. ej., de tejidos o fluidos corporales); mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido o péptido; o mediante síntesis química. Un polipéptido o péptido que se produce en un sistema celular diferente de la fuente de la cual se origina naturalmente está "aislado" porque necesariamente carecerá de los componentes que lo acompañan naturalmente . El grado de aislamiento o pureza se puede medir a través de cualquier método adecuado, p. ej., cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis HPLC.

Composiciones farmaceuticas La administración de las composiciones de stradobodies descritas en la presente se realizará a través de cualquier vía común, por vía oral, parenteral o tópica. Las vías ejemplares incluyen, entre otras, oral, nasal, bucal, rectal, vaginal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intratumoral, espinal, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaraenoidea, sublingual, mucosa oral, bronquial, linfática, intrauterina, subcutánea, intratumoral, integrada en un dispositivo implantable como una sutura o en un dispositivo implantable como un polímero implantable, intradural, intracortical o dérmica. Las composiciones se administrarán normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables según se describen en la presente. En una modalidad preferida, el stradobody aislado se administra por vía intravenosa o subcutánea.

El término "portador f rmacéuticamente aceptable", según se emplea en la presente, incluye cualesquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retardan la absorción y similares. El uso de los medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células de la presente invención, su uso en composiciones terapéuticas se considera. También se pueden incorporar ingrediente activos complementarios en las composiciones.

Las composiciones de stradobodies de la presente invención se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de las bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el stradobody en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los ingredientes adicionales enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables esteriles, los métodos de preparación preferidos son las téenicas de secado al vacío y liofilizado que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo.

Además, una modalidad es una composición de stradobodies adecuada para la administración oral y se proporciona en un portador farmacéuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El portador debe ser asimilable o comestible e incluye portadores líquidos, semisólidos, es decir, pastas o sólidos. Salvo que algún medio, agente, diluyente o portador convencional sea perjudicial para el receptor o para la eficacia terapéutica de una preparación de stradobodies contenida allí, su uso en una composición de stradobodies administrable por vía oral para utilizar en la práctica de los métodos de la presente invención es adecuado. Algunos ejemplos de portadores o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, lípidos, liposomas, resinas, aglutinantes, rellenos y similares, o combinaciones de estos. El término "administración oral", según se emplea en la presente, incluye la administración oral, bucal, enteral o intragástrica.

En una modalidad, la composición de stradobodies se combina con el portador de cualquier manera conveniente y práctica, es decir, mediante solución, suspensión, emulsificación, mezcla, encapsula iento, microencapsulamiento, absorción y similares. Estos procedimientos son de rutina para los entendidos en la téenica.

En una modalidad específica, la composición de stradobodies en forma de polvo se combina o se mezcla bien con un portador semisólido o sólido. La mezcla se puede realizar de cualquier manera adecuada, como la molienda. También se pueden añadir agentes estabilizadores en el proceso de mezcla para proteger la composición de la pérdida de la actividad terapéutica, es decir, la desnaturalización en el estómago. Algunos ejemplos de estabilizadores para utilizar en una composición administrable por vía oral incluyen amortiguadores, antagonistas de la secreción de ácidos estomacales, aminoácidos como glicina y lisina, carbohidratos como dextrosa, mañosa, galactosa, fructosa, lactosa, sucrosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc., inhibidores de la enzima proteolítica y similares. Más preferentemente, para una composición administrada por vía oral, el estabilizador también puede incluir antagonistas de la secreción de ácidos estomacales.

Además, la composición de stradobodies para administración oral que se combina con un portador semisólido o sólido se puede formular, adicionalmente, en cápsulas de gelatina duras o blandas, comprimidos o píldoras. Más preferentemente, las cápsulas de gelatina, los comprimidos o las píldoras tienen recubrimiento entérico. Los recubrimientos entéricos impiden la desnaturalización de la composición en el estómago o en el intestino superior cuando el pH es ácido. Véase la patente estadounidense N.° 5.629.001. Al llegar al intestino delgado, el pH básico disuelve el recubrimiento y permite que la composición se libere para interactuar con las células intestinales, p. ej., células M de parche de Pcyer.

En otra modalidad, la composición de stradobodies en forma de polvo se combina o se mezcla bien con materiales que crean una nanopartícula que encapsulan el biomimético inmunológicamente activo o a los cuales el biomimético inmunológicamente activo está unido. Cada nanopartícula tendrá un tamaño igual o inferior a 100 micrones . La nanopartícula puede tener propiedades mucoadhesivas que permiten la absorción gastrointestinal de un biomimético inmunológic mente activo que de otro modo no estaría biodisponible en forma oral.

En otra modalidad, se combina una composición en polvo con un portador líquido como, por ejemplo, agua o una solución salina, con o sin un agente estabilizador.

Una formulación de stradobodies específica que se puede utilizar es una solución de proteína biomimética inmunológicamente activa en un amortiguador basado en fosfato hipotónico que carece de potasio en donde la composición del amortiguador es la siguiente: 6 mM de fosfato de sodio monobásico monohidrato, 9 mM de fosfato de sodio dibásico heptahidrato, 50 mM de cloruro de sodio, pH 7,0.+/- 0,1. La concentración de proteína biomimética inmunológicamente activa en un amortiguador hipotónico puede oscilar entre 10 microgramos/ml y 100 miligramos/ml. Esta formulación se puede administrar a través de cualquier vía de administración, por ejemplo, entre otros, administración intravenosa.

Además, una composición de stradobodies para administración tópica que se combina con un portador semisólido se puede formular adicionalmente en una crema o ungüento en gel. Un portador preferido para la formación de un ungüento en gel es un polímero en gel. Los polímeros preferidos que se utilizan para fabricar una composición de gel de la presente invención incluyen, entre otros, carbopol, carboximetilcelulosa y polímeros plurónicos. Específicamente, se combina una composición de stradobodies en polvo con un gel acuoso que contiene un agente de polimerización como Carbopol 980 en concentraciones de entre el 0,5 % y el 5 % p/volumen para aplicación a la piel para el tratamiento de enfermedades en la piel o debajo de esta. El término "administración tópica", según se emplea en la presente, incluye la aplicación a una superficie dérmica, epidérmica, subcutánea o de la mucosa.

Además, una composición de stradobodies se puede formular en un polímero para implante subcutáneo o subdérmico. Una formulación preferida para el polímero de infusión por fármaco implantable es un agente que generalmente se considera como seguro y puede incluir, por ejemplo, dextrano reticulado (Samantha Hart, Master of Science Thesis, "Elution of Antibiotics from a Novel Cross-Linked Dextran Gel: Quantification" Virginia Polytechnic Institute and State University, 8 de junio de 2009) dextrano-tiramina (Jin, et al. (2010) Tissue Eng. Part A.16 (8):2429-40), dextrano-polietilenglicol (Jukes, et al. (2010) Tissue Eng. Part A., 16(2):565-73) o dextrano-gluteraldehído (Brondsted, et al. (1998) J. Controlled Release, 53:7-13). Los entendidos en la téenica sabrán que se pueden formar muchos polímeros e hidrogeles similares mediante la incorporación del stradobody fijado dentro del polímero o el hidrogel y el control del tamaño del poro hasta el diámetro deseado .

Tras la formulación, las soluciones se administran de un modo compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que resulte terapéuticamente eficaz para producir una mejora o alivio de los síntomas. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación como soluciones ingeribles, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Se puede producir algo de variación en la dosificación según la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración puede, en cualquier caso, determinar la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para la administración a seres humanos, las preparaciones cumplirán con los estándares de esterilidad, seguridad y pureza general, como lo requieren los estándares del Centro para la Evaluación e Investigación Biológica de la FDA.

La vía de administración variará, naturalmente, según la ubicación y la naturaleza de la enfermedad que se esté tratando, y puede incluir, por ejemplo, administración intradérmica, transdérmica, subdérmica, parenteral, nasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, perfusión, lavado, inyección directa y oral.

El término "administración parenteral", según se emplea en la presente, incluye cualquier forma de administración en la cual el compuesto sea absorbido por el sujeto, excepto la absorción a través de los intestinos. Algunas vías de administración parenteral ejemplares que se emplean en la presente invención incluyen, entre otras, la administración intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intraocular, nasal o intraarticular.

Además, el stradobody de la presente invención se puede administrar, opcionalmente, antes, durante o después de otro agente farmacéutico.

A continuación se presentan ejemplos específicos de diversas categorías de formulaciones farmacéuticas y las vías de administración preferidas, según se indican, para algunas enfermedades ejemplares específicas: Comprimido soluble sublingual o bucal: angina, poliarteritis nodosa.

Intravenosa: púrpura trombocitopénica idiopática, miositis con cuerpos de inclusión, polineuropatía desmielinizante de IgM paraproteinémica, fascitis necrotizante, pénfigo, gangrena, dermatomiositis, granuloma, linfoma, sepsis, anemia aplástica, falla orgánica multisistémica, mieloma múltiple y gammapatía monoclonal de significado incierto, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, miopatías inflamatorias, púrpura trombocitopénica trombótica, miositis, anemia, neoplasia, anemia hemolítica, encefalitis, mielitis, mielopatía especialmente asociada con virus 1 linfotrópico de células T humanas, leucemia, esclerosis múltiple y neuritis óptica, asma, necrólisis epidérmica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatía, uveítis, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome del hombre rígido, degeneración cerebelosa paraneoplásica con anticuerpos anti-Yo, encefalomielitis paraneoplásica y neuropatía sensorial con anticuerpos anti- Hu, vasculitis sistémica, lupus eritematoso sistémico, neuropatía diabética autoinmune, neuropatía disautonómica idiopática aguda, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, neuropatía motora multifocal, síndrome de la neurona motora inferior asociado con anti-/GMl, desmielinización, glomerulonefritis membranoproliferativa, miocardiopatía, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoide y síndrome de Evan IM - ITP, CIDP, MS, dermatomiositis, miastenia gravis, distrofia muscular. El término "administración intravenosa", según se emplea en la presente, incluye todas las téenicas para suministrar un compuesto o composición de la presente invención a la circulación sistémica a través de una inyección o infusión intravenosa.

Gel, loción, crema o parche dérmico: vitÍligo, herpes zoster, acné, quelitis, psoriasis.

Supositorio, gel o infusión rectal: colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, inflamación hemorroidal.

Oral como píldora, pastilla, encapsulada o con recubrimiento entérico: enfermedad de Crohn, esprúe celíaco, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del hígado, esófago de Barrett.

Intracortical: epilepsia, mal de Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntingdon.

Infusión o implante intraabdominal: endometriosis.

Gel o supositorio intravaginal: vaginitis bacteriana, tricomonal o fúngica.

Dispositivos médicos: recubiertos sobre un stent de arteria coronaria, articulaciones prostéticas.

Los stradobodies descritos en la presente se pueden administrar al menos una vez al día, semanalmente, cada dos semanas o una vez por mes o posiblemente con menor frecuencia. Se puede utilizar un régimen de dosificación bifásica en donde la primera fase de dosificación comprende entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 300 % de la segunda fase de dosificación. Debido a la eficacia mejorada de los stradobodies de la presente invención, en algunas modalidades, se pueden administrar los stradobodies en una dosis inferior, por vía intravenosa, en comparación con los anticuerpos monoclonales específicos para el mismo antígeno. La dosis de stradobody eficaz es, en general, de entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 500 % del anticuerpo monoclonal eficaz cuyo Fab es el mismo que el del stradobody, más preferentemente, entre aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 100 % de la dosis de anticuerpo monoclonal eficaz. La dosis de anticuerpo monoclonal eficaz en el tratamiento clínico del cáncer varía. Para el anticuerpo monoclonal Her-2/neu, la dosis se encuentra, en general, en el intervalo de entre aproximadamente 2 mg/Kg y aproximadamente 4 mg/Kg, administrada cada 7-21 días. Para el anticuerpo monoclonal EGFR, la dosis se encuentra, en general, en el intervalo de aproximadamente 250-400 mg/metro cuadrado que es aproximadamente 5 mg/Kg - 25 mg/Kg, administrada cada 7-21 días.

En una modalidad, el stradobody se administra por vía intravenosa en una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/Kg y aproximadamente 1000 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,1 mg/Kg y aproximadamente 100 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg/Kg y aproximadamente 50 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 1 mg/Kg y aproximadamente 25 mg/Kg IV. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 5 mg/Kg y aproximadamente 15 mg/Kg IV. En una modalidad, el stradobody se administra por vía subcutánea. Debido a la eficacia mejorada de los stradobodies de la presente invención, en algunas modalidades, se puede administrar el stradobody en una dosis inferior, por vía subcutánea, en comparación con los anticuerpos monoclonales específicos para el mismo antígeno. En una modalidad, el stradobody se administra por vía subcutánea en una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/Kg y aproximadamente 1000 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg/Kg y aproximadamente 150 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg/Kg y aproximadamente 80 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 2 mg/Kg y aproximadamente 50 mg/Kg SQ. En otra modalidad, el stradobody se administra en una dosis de entre aproximadamente 5 mg/Kg y aproximadamente 30 mg/Kg SQ.

Aplicaciones terapéuticas de los stradobodies Basándose en el diseño racional y en las validaciones in vitro e in vivo, los stradobodies de la presente invención actuarán como biofarmacéuticos importantes para el tratamiento del cáncer y para modular la función inmunitaria en diversos contextos diferentes como la bioinmunoterapia para las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias e infecciones. Las afecciones médicas adecuadas para el tratamiento con los biomiméticos inmunológicamente activos descritos en la presente incluyen aquellos cánceres u afecciones de enfermedades inflamatorias en donde se puede utilizar un anticuerpo monoclonal o ya se encuentra en uso clínico .

Además, algunas afecciones médicas ejemplares que tienen un componente inflamatorio que se beneficiarán del tratamiento con los stradobodies incluyen la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, mal de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, aterogénesis, infarto de miocardio, apoplejía, hepatitis B, hepatitis C, inflamación asociada con el virus de inmunodeficiencia humana, adrenoleucodistrofia y trastornos epilépticos especialmente aquellos que se cree que están asociados con la encefalitis posviral incluido el síndrome de Rasmussen, síndrome de West y síndrome de Lennox-Gastaut.

El enfoque general de la terapia que utiliza los stradobodies aislados descritos en la presente es administrarle a un sujeto que tiene una enfermedad o afección, una cantidad terapéuticamente eficaz del biomimético inmunológicamente activo aislado para efectuar un tratamiento. En algunas modalidades, las enfermedades o afecciones se pueden categorizar ampliamente como enfermedades inflamatorias con un desequilibrio de las redes de citocinas, un trastorno autoinmune mediado por autoanticuerpos patogénicos o células T autoagresivas o una fase aguda o crónica de una enfermedad o proceso recidivante crónico.

"Actividades moduladoras inmunitarias ", "respuesta inmunitaria moduladora", "que modula el sistema inmunitario" y "modulación inmunitaria" significan la modificación de los sistemas inmunitarios mediante el cambio de las actividades, capacidades y cantidades relativas de una o más células inmunes, incluida la maduración de un tipo de célula dentro de su tipo de célula o en otros tipos de células. Por ejemplo, la modulación inmunitaria de los monocitos inmaduros puede producir mayores poblaciones de monocitos más maduros, células dendríticas, macrófagos u osteoclastos, los cuales se derivan de los monocitos inmaduros. Como otro ejemplo, la modulación inmunitaria de las células B de la memoria puede producir apoptosis selectiva de determinadas células B de memoria con disminuciones concomitantes de la producción de anticuerpos específicos. Como otro ejemplo, la modulación inmunitaria de las células NK puede producir mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Como otro ejemplo, las actividades de modulación inmunitaria pueden producir mayores poblaciones de células con fenotipos que de otro modo no se expresarían en niveles altos, como células CD8 beta + / CDllc +. Como otro ejemplo, las actividades de modulación inmunitaria pueden producir disminuciones de las citocinas proinflamatorias o de las citocinas que se elevan comúnmente en las enfermedades autoinmunitarias como IL-6 e IL-8. Como otro ejemplo, las actividades de modulación inmunitaria pueden producir la activación de las células NKT con posterior secreción y escisión de TGF-beta. Por ejemplo, los receptores de células inmunes se pueden unir a los biomiméticos inmunológicamente activos y activar la señalización intracelular para inducir diversos cambios de las células inmunes, denominados, separadamente, como modulación inmunitaria activadora". El bloqueo de los receptores de células inmunes para evitar la activación del receptor también está comprendido dentro de la "modulación inmunitaria" y también se puede denominar, separadamente, como "modulación inmunitaria inhibidora".

Los términos "tratar" y "tratamiento", según se emplean en la presente, se refieren a la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un stradobody de la presente invención de modo que el sujeto tenga una mejora en una enfermedad o afección, o en un síntoma de la enfermedad o afección. La mejora es cualquier mejora o alivio de la enfermedad o afección, o de los síntomas de la enfermedad o afección. La mejora es una mejora observable o medible, o puede ser una mejora en la sensación general de bienestar del sujeto. Por ende, los entendidos en la téenica advierten que un tratamiento puede mejorar la condición de enfermedad, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad. Específicamente, las mejoras en los sujetos pueden incluir uno o más de: disminución de la inflamación; disminución de marcadores inflamatorios de laboratorio como la proteína C reactiva; disminución de la autoinmunidad comprobada por uno o más de: mejoras en los marcadores autoinmunitarios como el recuento de autoanticuerpos o plaquetas, recuento de glóbulos blancos o recuento de glóbulos rojos, disminución del sarpullido o púrpura, disminución de la debilidad, entumecimiento u hormigueo, aumento de los niveles de glucosa en los pacientes con hiperglicemia, disminución del dolor, inflamación, hinchazón o degradación de las articulaciones, disminución de la frecuencia y el volumen de cólicos y diarreas, disminución de la angina, disminución de la inflamación de los tejidos o disminución de la frecuencia de las apoplejías; disminuciones de la carga tumoral cancerosa, aumento del tiempo para el avance del tumor, disminución del dolor por cáncer, aumento de la supervivencia o mejoras en la calidad de vida; o retraso del avance o mejora de la osteoporosis.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", según se emplea en la presente, se refiere a una cantidad que produce una mejora o alivio de los síntomas de la enfermedad o afección.

Según se emplea en la presente, "profilaxis" puede significar la prevención completa de los síntomas de una enfermedad, un retraso en la aparición de los síntomas de una enfermedad o una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad desarrollados posteriormente.

El término "sujeto" se utiliza indistintamente con el término "paciente" en la presente y significa cualquier sujeto mamífero al cual se le administran los stradobodies de la presente invención de acuerdo con los métodos descritos en la presente. En una modalidad específica, los métodos de la presente descripción se emplean para tratar a un sujeto humano. Los métodos de la presente descripción también se pueden utilizar para tratar a primates no humanos (p. ej., monos, babuinos y chimpancés), ratones, ratas, bovinos, caballos, gatos, perros, cerdos, conejos, cabras, ciervos, ovejas, hurones, jerbos, conejillos de indias, hámsters, murciélagos, aves (p. ej., pollos, pavos y patos), peces y reptiles.

En particular, los stradobodies de la presente invención se pueden utilizar para tratar afecciones que incluyen, entre otras, insuficiencia cardíaca congestiva (CHF), vasculitis, rosácea, aené, eczema, miocarditis y otras afecciones del miocardio, lupus eritematoso sistémico, diabetes, espondilopatías, fibroblastos sinoviales y estroma de médula ósea; pérdida ósea; enfermedad de Paget, osteoclastoma; mieloma múltiple; cáncer de mama; osteopenia por desuso; desnutrición, enfermedad periodontal, enfermedad de Gaucher, histiocitosis celular de Langerhans, lesión de la médula espinal, artritis séptica aguda, osteomalacia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrucción periodontal y fracturas óseas; sarcoidosis; cánceres óseos osteolíticos, cáncer de pulmón, cáncer de riñón y cáncer rectal; metástasis ósea, tratamiento del dolor de hueso, hipercalcemia maligna humoral, espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías; rechazo de trasplantes, infecciones virales, neoplasias hematológicas yy afecciones tipo neoplásicas, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; linfomas no Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos pequeños/leucemia linfocítica crónica, micosis fungoide, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de la zona marginal, leucemia de células peludas y leucemia linfoplasmacítica), tumores de células precursoras de linfocitos, incluido linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células B y linforna/leucemia linfoblástica aguda de células T, timoma, tumores de células T y NK maduras, incluido leucemias de células T periféricas, leucemia de células T adultas/linfornas de células T y leucemia linfocítica granular grande, histiocitosis de células de Langerhans, neoplasias mieloides como leucemias mielógenas agudas, incluida AML con maduración, AML sin diferenciación, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloproliferativos crónicos, incluido leucemia mielógena crónica, tumores del sistema nervioso central, p. ej ., tumores cerebrales (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimo a y retinoblastoma), tumores sólidos (cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células básales, cáncer de páncreas, cáncer de la vía biliar, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, cánceres uterino, vaginal o del cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado primario o cáncer endo etrial, tumores del sistema vascular (angiosarcoma y hemangiopericitoma)) u otro cáncer.

Los stradobodies de la presente invención se pueden utilizar para tratar enfermedades autoinmunitarias. El término "enfermedad autoinmunitaria", según se emplea en la presente, se refiere a un grupo variado de más de 80 enfermedades y afecciones. En todas estas enfermedades y afecciones, el problema subyacente es que el sistema inmunitario del cuerpo ataca al propio cuerpo. Las enfermedades autoinmunitarias afectan a todos los sistemas principales del cuerpo incluido el tejido conectivo, los nervios, los músculos, el sistema endocrino, la piel, la sangre y los sistemas respiratorio y gastrointestinal. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la iastenia grave y la diabetes tipo 1.

La enfermedad o afección tratable utilizando las composiciones y los métodos de la presente invención puede ser un proceso hematoinmunológico, incluido, entre otros, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia aloinmune/autoinmune, trombocitopenia inmune adquirida, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, aplasia eritrocitaria asociada a parvovirus B19, autoinmunidad antifactor VIII adquirida, enfermedad de von illebrand adquirida, mieloma múltiple y gammapatía monoclonal de significado incierto, sepsis, anemia aplásica, aplasia pura de glóbulos rojos, anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad hemolítica del recién nacido, neutropenia mediada por el sistema inmunitario, refractariedad a la transfusión de plaquetas, púrpura postransfusión neonatal, síndrome urémico hemolítico, vasculitis sistémica, púrpura trombocitopénica trombótica o síndrome de Evans.

La enfermedad o afección también puede ser un proceso neuroinmunológico, incluido, entre otros, síndrome de Guillain-Barré, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante de IgM paraproteinémica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatía motora multifocal, síndrome de la neurona motora inferior asociado con anti-/GMl, desmielinización, esclerosis múltiple, neuritis óptica, síndrome del hombre rígido, degeneración cerebelosa paraneoplásica con anticuerpos anti-Yo, encef lomielitis paraneoplásica, neuropatía sensorial con anticuerpos anti-Hu, epilepsia, encefalitis, mielitis, mielopatía especialmente asociada con virus 1 linfotrópico de células T humanas, neuropatía diabética autoinmune, mal de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntingdon o neuropatía disautonómicos idiopática aguda.

La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad reumática, incluido, entre otros, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoide, síndrome de Felty, vasculitis ANCA positiva, polimiositis espontánea, dermatomiositis , síndrome antifosfolípido, abortos espontáneos recurrentes, lupus eritematoso sistémico, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST o uveítis.

La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad dermatoinmunológica, incluido, entre otros, necrólisis epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, enfermedades ampollosas de la piel autoinmunes incluido pénfigo vulgar, penfigoide hulloso y pénfigo foliáceo, vitÍligo, síndrome de shock tóxico estreptocócico, esclerodermia, esclerosis sistémica incluido esclerosis sistémica difusa y cutánea limitada, dermatitis atópica (especialmente dependientes de esteroides).

La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad inmunológica musculoesquelética, incluido, entre otros, miositis con cuerpos de inclusión, fascitis necrotizante, miopatías inflamatorias, miositis, miopatía anti-Decorin (antígeno BJ), miopatía necrótica paraneoplásica, miopatía vacuolada vinculada a X, polimiositis inducida por penicilamina, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria o miocardiopatía.

La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad inmunológica gastrointestinal, incluido, entre otros, anemia perniciosa, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, enfermedad celiaca, dermatitis herpetiforme , cirrosis criptogénica, artritis reactiva, enfermedad de Crohn, enfermedad de Whipple, colitis ulcerosa o colangitis esclerosante.

La enfermedad o afección también puede ser enfermedad de injerto contra huésped, rechazo del injerto mediado por anticuerpos, rechazo de médula ósea después del trasplante, inflamación de la enfermedad posinfecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus tipo 1 con anticuerpos de células anti-beta, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, glomerulonefritis membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, micropoliarteritis, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa e insuficiencia multisistema orgánica.

Además de tener utilidad clínica para tratar trastornos inmunológicos, los stradobodies tienen utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas, cánceres y enfermedades inflamatorias. Los stradobodies se pueden utilizar esencialmente siguiendo los protocolos conocidos para cualquier anticuerpo terapéutico correspondiente. Los stradobodies se diseñarán, en general, para mejorar el efecto demostrado sobre una célula efectora por un anticuerpo monoclonal, como la ADCC en el cáncer o la disminución de la maduración de DC y monocitos con disminución de la liberación de citocinas en enfermedades autoinmunitarias, y potenciarán así la respuesta inmunitaria contra el cáncer con respecto a la que se produciría utilizando, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de origen para la porción Fab del stradobody.

Las enfermedades infecciosas incluyen, entre otras, aquellas provocadas por agentes bacterianos, micológicos, parasitarios y virales. Algunos ejemplos de los agentes infecciosos incluyen los siguientes: staphylococcus , streptococcaceae, neisseriaaceae, cocci, enterobacteriaceae, pseudomonadaceae, vibrionaceae, campylobacter , pasteurellaceae, bordetella, francisella, brucella, legionellaceae, bacteroidaceae, clostridium, corynebacterium, propionibacterium, bacilos grampositivos , antrax, actinomyces, nocardia, mycobacterium, treponema, borrelia, leptospira, mycoplasma, ureaplasma, rickettsia, chlamydiae, otros bacilos grampositivos, otros bacilos gramnegativos, micosis sistémicas, otras micosis oportunistas, protozoa, nematodos, tremátodos, cestodos, adenovirus, herpesvirus (incluido, por ejemplo, virus del herpes simple y virus de Epstein Barr y virus del herpes zoster), poxvirus, papovavirus, virus de la hepatitis, virus del papilloma, ortomixovirus (incluido, por ejemplo, influenza A, influenza B e influenza C), paramixovirus, coronavirus, picornavirus, reovirus, togavirus, flavivirus, bunyaviridae, rhabdovirus, virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana y retrovirus. Algunas enfermedades infecciosas ejemplares incluyen, entre otras, candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía por estreptococos, afecciones de la piel y de la orofaringe por estreptococos, sepsis gram negativa, tuberculosis, mononucleosis, influenza, enfermedad respiratoria causada por el virus sincitial respiratorio, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis.

"Cáncer" se refiere o describe la afección fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por un crecimiento celular sin regular. Algunos ejemplos de cánceres incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluido liposarcoma, sarcoma osteogénico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, condrosarcoma), osteoclastoma, tumores neuroendócrinos , mesotelioma, cordoma, sinovioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Ejemplos más específicos de los cánceres incluyen cáncer de células escamosas (p. ej., cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluido cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluido cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal o de riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer de esófago, tumores del tracto biliar, tumor de Ewing, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de ilms, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblas toma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad mielodisplásica, enfermedad de la pesada cadena, tumores neuroendocrinos y schwanoma y otros carcinomas, cáncer de cabeza y cuello, neoplasias mieloides como leucemias mielógenas agudas, incluida AML con maduración, AML sin diferenciación, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloproliferativos crónicos, incluido leucemia mielógena crónica, tumores del sistema nervioso central, p. ej., tumores cerebrales (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma y retinoblastoma), tumores sólidos (cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células básales, cáncer de páncreas, cáncer de la vía biliar, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, cánceres uterino, vaginal o del cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado primario o cáncer endometrial, tumores del sistema vascular (angiosarcoma y hemangiopericitoma) , neoplasias hematológicas y afecciones tipo neoplásicas, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; linfomas no Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos pequeños/leucemia linfocítica crónica, micosis fungoide, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de la zona marginal, leucemia de células peludas y leucemia linfoplasmacítica), tumores de células precursoras de linfocitos, incluido linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células B y linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células T, timoma, tumores de células T y NK maduras, incluido leucemias de células T periféricas, leucemia de células T adultas/linfomas de células T y leucemia linfocítica granular grande, cánceres óseos osteolíticos y metástasis ósea.

Los anticuerpos comprenden dominios Fab a partir de los cuales se puede diseñar un stradobody. Los anticuerpos monoclonales ejemplares incluyen, entre otros, 3F8, 8H9, abagovomab, abciximab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ALD518, alemtuzumab, altumomab pentetate, amatuximab, anatumomab mafenatox, anrukinzumab (IA-638), apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atinumab, atlizumab (tocilizumab), atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, biciromab, bivatuzumab mertansine, blinatumomab, blosozumab, brentuximab vedotin, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansine, cantuzumab ravtansine, capromab pendetide, carlumab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, Ch.14.18, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetan, conatumumab, crenezumab, CR6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enokizumab, ensituximab, epitumomab cituxetan, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, FBTA05, felvizumab, fezakinumab, fielatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavi1imomab, gemtuzumab ozogamicin, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotin, golimumab, gomiliximab, GS6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetan, icrucumab, igovomab, imciromab, indatuximab ravtansine, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, lintuzumab, lorvotuzumab mertansine, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavri1imumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab , mitumomab, mogamulizumab, orolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-CD3, nacolomab tafenatox, namilu ab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nimotuzumab, nofetumomab merpentan, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, o alizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, otelixizumab, oxelumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, pascolizumab, pateclizumab, pemtu omab, pertuzu ab, pexelizumab, pintumomab, ponezumab, priliximab, pritumumab, PRO 140, racotumomab, radretumab rafivirumab, ramucirumab ranibizumab raxibacumab regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetide, secukinumab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, TGN1412, ticilimumab (tremeliraumab), tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab (=atlizumab), toralizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vatelizumba, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, ziralimumab y zolimomab aritox.

El stradobody de la presente invención puede ser específico para una citocina. Por ejemplo, el stradobody de la presente invención puede ser específico para un interferón (como, por ejemplo, IFNy, IFNa o IRNb), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 o IL-23. En una modalidad, el stradobody de la presente invención es específico para una citocina y es útil para el tratamiento o la prevención de una o más enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias. Por ejemplo, en una modalidad, el stradobody es un stradobody anti-IL-2, anti-IL-8 o anti-IL-17.

El término "enfermedad autoinmunitaria", según se emplea en la presente, se refiere a un grupo variado de más de 80 enfermedades crónicas. En todas estas enfermedades, el problema subyacente es que el sistema inmunitario del cuerpo ataca al propio cuerpo. Las enfermedades autoinmunitarias afectan a todos los sistemas principales del cuerpo incluido el tejido conectivo, los nervios, los músculos, el sistema endocrino, la piel, la sangre y los sistemas respiratorio y gastrointestinal.

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser un proceso hematoinmunológico, incluido, entre otros, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia aloinmune/autoinmune, trombocitopenia inmune adquirida, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, aplasia eritrocitaria asociada a parvovirus B19, autoinmunidad antifactor VIII adquirida, enfermedad de von Willebrand adquirida, mieloma múltiple y gammapatía monoclonal de significado incierto, sepsis, anemia aplásica, aplasia pura de glóbulos rojos, anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad hemolítica del recién nacido, neutropenia mediada por el sistema inmunitario, refractariedad a la transfusión de plaquetas, púrpura postransfusión neonatal, síndrome urémico hemolítico, vasculitis sistémica, púrpura trombocitopénica trombótica o síndrome de Evans.

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser un proceso neuroinmunológico, incluido, entre otros, síndrome de Guillain-Barré, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante de IgM paraproteinémica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatía motora multifocal, síndrome de la neurona motora inferior asociado con anti-/GMl, desmielinización, esclerosis múltiple, neuritis óptica, síndrome del hombre rígido, degeneración cerebelosa paraneoplásica con anticuerpos anti-Yo, encefalomielitis paraneoplásica, neuropatía sensorial con anticuerpos anti-Hu, epilepsia, encefalitis, mielitis, mielopatía especialmente asociada con virus 1 linfotrópico de células T humanas, neuropatía diabética autoinmune o neuropatía disautonómicos idiopática aguda.

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser un proceso de enfermedad reumática, incluido, entre otros, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoide, síndrome de Felty, vasculitis ANCA positiva, polimiositis espontánea, dermatomiositis, síndrome antifosfolípido, abortos espontáneos recurrentes, lupus eritematoso sistémico, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST o uveítis.

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser un proceso de enfermedad dermatoinmunológica, incluido, entre otros, necrólisis epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, enfermedades ampollosas de la piel autoinmunes incluido pénfigo vulgar, penfigoide hulloso y pénfigo foliáceo, vitÍligo, síndrome de shock tóxico estreptocócico, esclerodermia, esclerosis sistémica incluido esclerosis sistémica difusa y cutánea limitada, dermatitis atópica (especialmente dependientes de esteroides).

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser un proceso de enfermedad inmunológica musculoesquelética, incluido, entre otros, miositis con cuerpos de inclusión, fascitis necrotizante, miopatías inflamatorias, miositis, miopatía anti-Decorin (antígeno BJ), miopatía necrótica paraneoplásica, miopatía vacuolada vinculada a X, polimiositis inducida por penicilamina, aterosclerosis , enfermedad de la arteria coronaria o miocardiopatía.

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser un proceso de enfermedad inmunológica gastrointestinal, incluido, entre otros, anemia perniciosa, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, enfermedad celiaca, dermatitis herpetiforme, cirrosis criptogénica , artritis reactiva, enfermedad de Crohn, enfermedad de Whipple, colitis ulcerosa o colangitis esclerosante.

La enfermedad o afección autoinmunitaria puede ser enfermedad de injerto contra huésped, rechazo del injerto mediado por anticuerpos, rechazo de médula ósea después del trasplante, inflamación de la enfermedad posinfecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus tipo 1 con anticuerpos de células anti-beta, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, glomerulonefritis membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, micropoliarteritis, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa e insuficiencia multisistema orgánica.

En otra modalidad, los stradobodies descritos en la presente se pueden utilizar en un sistema de cebado en donde se extrae sangre de un paciente y se pone en contacto transitoriamente con los stradobodies durante un período de entre aproximadamente media hora y aproximadamente tres horas antes de introducirse nuevamente en el paciente. En esta forma de terapia celular, las células efectoras del paciente se exponen a los stradobodies que se fijan en una matriz ex vivo para modular las células efectoras a través de la exposición de las células efectoras a los stradobodies. La sangre que incluye las células efectoras moduladas se infunde nuevamente en el paciente. El sistema de cebado puede tener numerosas aplicaciones clínicas y terapéuticas.

Los stradobodies descritos en la presente también se pueden aplicar fácilmente para modificar las respuestas del sistema inmunitario en diversos contextos para afectar los cambios específicos en los perfiles de respuesta inmunitaria. La modificación o modulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto se refiere a aumentar, disminuir o cambiar la proporción o los componentes de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede aumentar o disminuir la producción de citocinas o los niveles de secreción según se desee dirigiéndose a la combinación adecuada de FcyR con un stradobody diseñado para interactuar con los receptores. La producción de anticuerpos también se puede aumentar o disminuir; la proporción de dos o más citocinas o receptores de células inmunes se puede cambiar; o se puede provocar la producción de tipos adicionales de citocinas o anticuerpos. La respuesta inmunitaria también puede ser una función efectora de una célula inmune que expresa FcyR, incluido el aumento o la disminución del potencial fagocítico de las células derivadas de macrófagos monocitos, el aumento o la disminución de la función de los osteoclastos, el aumento o la disminución de la presentación de antígenos mediante células presentadoras de antígenos (p. ej., células dendríticas), el aumento o la disminución de la función de las células NK, el aumento o la disminución de la función de las células B, en comparación con una respuesta inmunitaria que no está modulada por un biomiméticos inmunológicamente activo descrito en la presente.

En una modalidad preferida, a un sujeto con cáncer o con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria o con una enfermedad infecciosa se le modifica la respuesta inmunitaria con las etapas de administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un stradobody descrito en la presente a un sujeto, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del stradobody modifica la respuesta inmunitaria en el sujeto. Idealmente, esta intervención trata la enfermedad o la afección en el sujeto. La respuesta inmunitaria modificada puede ser un aumento o una disminución de la respuesta y puede comprender la modificación de los niveles de citocinas incluido los niveles de cualquiera de IL-6, IL-10, IL-8, IL- 23, IL-7, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, TNF-alfa y IFN-alfa. En una modalidad preferida, 11-6 o IL-8 disminuyen en respuesta a la terapia. En una modalidad especialmente preferida, IL-6 y IL-8 disminuyen en una respuesta sostenida a la terapia. Sin embargo, la invención no se limita por ningún mecanismo de acción particular de los biomiméticos descritos. La respuesta inmunitaria modificada puede ser un nivel de autoanticuerpos modificado en el sujeto. La respuesta inmunitaria modificada puede ser un nivel de células T autoagresivas modificado en el sujeto.

Por ejemplo, la reducción de la cantidad de producción de TNF-alfa en las enfermedades autoinmunitarias puede tener efectos terapéuticos. Una aplicación práctica de esto es la terapia con anticuerpos anti-TNF-alfa (p. ej., Remicade®) que está probado clínicamente para tratar la psoriasis en placas, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y espondilitis anquilosante. Estas enfermedades autoinmunitarias tienen diferentes etiologías pero comparten componentes inmunológicos clave de los procesos de enfermedad relacionados con la inflamación y la actividad de las células inmunes. Un stradobody diseñado para reducir la producción de TNF-alfa será igualmente eficaz en estas y muchas otras enfermedades autoinmunitarias. El perfil de respuesta in unitaria modificado también puede ser la modulación directa o indirecta para efectuar una reducción en la producción de anticuerpos, por ejemplo autoanticuerpos dirigidos a los tejidos del propio sujeto o niveles de células T autoagresivas modificados en el sujeto. Por ejemplo, la esclerosis múltiple es un trastorno autoinmunitario que comprende células T autorreactivas que se pueden tratar mediante terapia con interferón beta. Véase, p. ej ., Zafranskaya M, et al., Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in múltiple sclerosis, Immunology 2007 May;121(1):29-39-Epub 18 dic 2006. Un diseño de stradobody para reducir los niveles de células T autorreactivas será igualmente eficaz en la esclerosis múltiple y en muchas otras enfermedades autoinmunitarias que comprenden las células T autorreactivas.

Los stradobodies descritos en la presente se pueden utilizar para modular la expresión de las moléculas coestimuladoras de una célula inmune, incluido una célula dendrítica, un macrófago, un osteoclasto, un monocito o una célula NK o para inhibir en estas mismas células inmunes la diferenciación, maduración o secreción de citocinas, incluido interleucina-12 (IL-12) o aumentar la secreción de citocinas, incluido interleucina-10 (IL-10) o interleucina-6 (IL-6) . Los entendidos en la téenica también pueden validar la eficacia de un biomimético inmunológicamente activo mediante la exposición de una célula inmune al biomimético inmunológicamente activo y la medición de la modulación de la función de la célula inmunitaria, en donde la célula inmunitaria es una célula dendrítica, un macrófago, un osteoclasto o un monocito. En una modalidad, la célula inmune se expone al biomimético inmunológicamente activo in vitro y que además comprende la etapa de determinar la cantidad de un receptor de superficie de células o de una producción de citocinas, en donde un cambio en la cantidad de receptor de superficie de células o en la producción de citocinas indica una modulación de la función de las células inmunes. En otra modalidad, la célula inmune se expone al biomimético inmunológicamente activo in vivo en un animal modelo para una enfermedad autoinmunitaria que además comprende una etapa de evaluar un grado de mejora en la enfermedad autoinmunitaria. Los stradobodies descritos en la presente se pueden utilizar para modular la expresión de las moléculas coestimuladoras de una célula B.

Los métodos de la invención se pueden aplicar a cualquier especie animal y las moléculas IgG de las cuales están hechas las porciones derivadas de IgG de los reactivos Fe pueden ser de cualquier especie animal. Naturalmente, las especies animales pertinentes son aquellas en las cuales hay IgG o moléculas similares a IgG. Generalmente, la especie a la cual se le aplican los métodos y la especie de la cual se utilizan las porciones derivadas de IgG de los reactivos Fe en los métodos son la misma. Sin embargo, no necesariamente tienen que ser la misma. Las especies de animales pertinentes son, preferentemente, mamíferos y estos incluyen, entre otros, seres humanos, primates no humanos (p. ej., monos, babuinos y chimpancés), caballos, animales bovinos (p. ej., toros, vacas o bucyes), cerdos, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, jerbos, hámsters, ratas y ratones. Las especies no mamíferas incluyen, por ejemplo, aves (p. ej., pollos, pavos y patos) y peces.

Los stradobodies descritos en la presente tienen múltiples aplicaciones y usos adicionales.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Producción y purificación de stradobodies íflcos de HER2/neu Se obtuvo una construcción de ADN sintético codificante de la región variable y CH1 de trastuzumab de Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) y se fusionó mediante PCR a una región Fe correspondiente que contenía las regiones bisagra, CH2 y CH3 de IgGl humana para generar un marco de lectura codificante de la cadena pesada del anticuerpo trastuzumab completa. Se clonó ADNc en el vector de expresión pOptiVec (Invitrogen) para la expresión en células mamíferas. Simultáneamente, se obtuvo una construcción sintética similar que contenía la cadena ligera de trastuzumab y se clonó en el vector pcDNA3.3 (Invitrogen). Se generaron construcciones de cadena pesada de stradobody mediante PCR superpuesta utilizando la cadena pesada de trastuzumab como una plantilla con cebadores codificantes de los dominios de multimerización y las regiones ligadoras. Se clonaron los productos de PCR en el vector de expresión pOptiVec mediante clonación TA para generar las construcciones de expresión de stradobodies. Después de la clonación TA, se confirmaron todas las construcciones mediante secuenciación del marco codificante completo, así como las secuencias circundantes. Para la expresión de proteínas de stradobodies, se realizó aislamiento de plásmido de ADN a gran escala mediante kits de purificación de plásmido sin endotoxinas (Machercy Nagel) y se produjeron las proteínas en células 293-T HEK o CHO mediante expresión de proteínas transitoria. Se expresó la proteína de stradobody mediante cotransfección de construcciones de ADN de cadena ligera y cadena pesada. Se purificó la proteína de stradobody mediante FPLC en un AKTAxpress utilizando cromatografía de afinidad de proteína G seguida de desalado en una columna de desalado HiPrep (GE life Sciences). Las construcciones de stradobodies se muestran en la tabla 3.

Para observar la formación de multímeros de stradobody, se analizaron los stradobodies purificados mediante gel sin reducción SDS-PAGE. Las bandas de mayor peso molecular con respecto al anticuerpo GB2500 no modificado indicaron la formación de multímeros en diversas construcciones. Como se muestra en la figura 8, diversos stradobodies de C-terminal presentaron bandas de mayor peso molecular con respecto a la proteína no modificada. En particular, se detectaron diversas bandas de peso molecular alto tras el análisis de la construcción GB2547. También se evaluaron construcciones de stradobodies seriados. Como se muestra en la figura 9, diversas construcciones de stradobodies seriados, particularmente el stradobody seriado multimerizante GB2542, presentaron bandas de mayor peso molecular con respecto al anticuerpo GB2500 no modificado.

Otros stradobodies dirigidos contra dianas diferentes de HER2/neu se produjeron, purificaron y analizaron de forma análoga. Estos otros stradobodies incluyen la serie GB3500 dirigida contra EGFR, la serie GB4500 dirigida contra CD20 y la serie GB7500 dirigida contra TNF.

Ejemplo 2. Citotoxicidad y actividad de unión de stradobodies específicos de HER2/neu Se determinó la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo para diversos stradobodies en comparación con el anticuerpo GB2500 no modificado. Se realizó el ensayo de ADCC a células NK recién aisladas como células efectoras con la línea celular tumoral de baja expresión de HER2/neu MDA-MB-231 como línea celular diana. Se marcaron radiactivamente células MDA-MB-231 con Cr-51, seguido de una hora de incubación con una de las cinco soluciones siguientes: solo medio, medio que contenía una IgGl humana que no es de unión, medio que contenía el anticuerpo monoclonal GB2500 y medio que contenía el stradobody que se evaluará. Las células se colocaron en placas con células NK humanas recién aisladas con diversas proporciones de NK a células tumorales durante cuatro horas y se determinó la cantidad de destrucción mediante la cantidad de Cr-51 liberado libre hacia el medio después de que las células se habían sedimentado.

Se evaluaron de uno a cuatro lotes de proteínas expresadas independientemente y purificadas de cada uno de un total de 18 proteínas, incluido GB2500. Las proporciones de células efectoras a dianas evaluadas fueron 50:1, 25:1, 12,5:1 y 6,5: 1. Cuando el rendimiento NK lo permitió, se utilizó una proporción de 100:1. La figura 10 muestra un ejemplo representativo de los datos de ADCC, que demuestra el aumento de ADCC observado con GB2542 con respecto a GB2500 en un intervalo de células efectoras a células diana. La figura 10 también demuestra la variabilidad de dos lotes diferentes, purificados independientemente, de GB2500.

Los datos de ADCC compilados sobre los 12 stradobodies anti-HER2/neu y GB2500 se muestran en la tabla 3. Cada fila de la tabla 3 representa un lote de stradobodies purificado y evaluado (p. ej., se produjeron y se evaluaron cuatro lotes de GB2542). Los datos se presentan como porcentaje de destrucción por células NK aisladas del donante indicado, a la proporción indicada de célula efectora a célula diana.

Los resultados del estudio mostraron, sorprendentemente, que aunque los stradobodies novedosos y el anticuerpo GB2500 de trastuzumab comparten el Fab idéntico, varios stradobodies fueron significativamente más potentes en la respuesta de ADCC. GB2542 fue particularmente potente en los ensayos de ADCC. El orden clasificado de la respuesta de ADCC en este experimento particular fue el siguiente: GB2542 (stradobody seriado multimerizante con dos dominios de multimerización) > GB2547 (stradobody de C-terminal multimerizante con dos dominios de multimerización) > GB2550 (stradobody de C-terminal multimerizante con un dominio de multimerización) > GB2500 > control de isótopo humano y control de medio.

Tabla 3. Datos de ADCC de stradobody específico de HER/2-neu compilados.

Además de la ADCC de respuesta a la proporción de células efectoras a células diana, se realizó un análisis de la ADCC de respuesta a la concentración de stradobody. El ensayo de ADCC se realizó con concentraciones de stradobodies y anticuerpo HER2/neu que oscilan entre 0,4 y 4000 ng/mL para evaluar la respuesta a la dosis de los stradobodies. La proporción de células NK a células diana MDA-MB-231 se mantuvo constante en 25:1 para estos experimentos. Los resultados del estudio se muestran en la figura 11. El análisis dependiente de la concentración confirmó el aumento de la avidez de ADCC de los stradobodies, particularmente GB2542, con respecto al anticuerpo trastuzumab (GB2500). Basándose en este experimento, se calculó que el stradobody seriado multimerizante GB2542 era más de 2-log más potente en el ensayo de ADCC que GB2500, a pesar del hecho de que las dos moléculas comparten el mismo Fab.

Se evaluó la fuerza de unión de los stradobodies en comparación con GB2500 según lo medido por resonancia de plasmón, utilizando un sistema Biacore 3000. Se diluyó FcyRIIIa humano recombinante hasta 3 ug/ml en 10 mM de acetato de sodio pH 5,0 y se inmovilizó manualmente sobre una celda de flujo de un chip CM5. Se diluyeron stradobodies o GB2500 hasta 1 mM con HBS-EP (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,005 % tensioactivo P20) y se perfundieron sobre el FcyRIIIa humano inmovilizado del siguiente modo. Después de la activación de la celda de flujo, se inyectaron 3 ug/ml de la proteína en incrementos de 1 ml a una velocidad de flujo de 5 ml/min hasta alcanzar una RU (unidad de resonancia) de 400. Se bloqueó la celda de flujo con 1M de etanolamina. Se utilizó otra celda de flujo como un control en blanco. Típicamente, se inyectaron 20 m? de las muestras diluidas a una velocidad de flujo de 20 ml/min. La regeneración de la celda de flujo se realizó mediante un lavado extendido con amortiguador de corrida HBS-EP a 20 mL/min.

Ejemplos de los datos de unión se muestran en la figura 12. Se muestra la curva de unión para el anticuerpo parental GB2500, los stradobodies GB2542 (seriado multimerizante) y GB2547 (C-terminal multimerizante) con aglutinante alto/ADCC alta y el stradobody GB2554 (seriado no multimerizante) con aglutinante bajo/ADCC baja. Como comparación, se incluye una curva de unión para el anticuerpo MB2500 basado en Fe de ratón como un ejemplo de un no aglutinante/aglutinante bajo. El orden clasificado de fuerza de unión se indica en la figura 13. Varios de los stradobodies presentaron una RU máx. superior a GB2500. Además, GB2542 en este ensayo presentó la mayor RU máx. y entre las velocidades de disociación más lentas.

A continuación, se evaluó la correlación entre la actividad de ADCC y la unión medida mediante Biacore. Se calculó la actividad de ADCC como la diferencia en veces con respecto a la actividad de ADCC del anticuerpo monoclonal GB2500. Cuando se midieron dos lotes de GB2500 en el mismo experimento para el mismo donante, se utilizó la ADCC promedio para calcular el promedio de diferencia en veces en la ADCC. Se midió la unión como RU máx. y los datos se presentan en la figura 14. Para varios de los stradobodies, hubo un promedio de aumento en veces en la ADCC superior que en el anticuerpo parental (GB2500=1). Aunque el conjunto de datos fue algo limitado en cantidad y se observó algo de variación en la actividad de ADCC, pareció haber una correlación general entre la unión y la actividad de ADCC. Cabe destacar que para varios de los stradobodies con ADCC alta/unión alta, incluido GB2542 (seriado multimerizante con dos dominios de multimerización) , GB2524 (seriado multimerizante con un dominio de multimerización y un enlazador), GB2547 (C-terminal multimerizante con dos dominios de multimerización) y GB2540 (seriado multimerizante con un dominio de multimerización), se observaron fácilmente formas de orden superior en los geles no desnaturalizantes que indican una correlación entre la formación de multímeros, la unión al receptor y la actividad de ADCC.

En general, los resultados del estudio indicaron que varias de las construcciones de stradobodies presentaron mayores ADCC y actividad de unión más fuerte en comparación con el anticuerpo monoclonal GB2500, que comparte el mismo Fab que todos los stradobodies evaluados. La construcción de stradobodies que presentó mayor ADCC y actividad de unión más fuerte fue GB2542, que comprende un dominio de multimerización de cremallera de isoleucina y un dominio de multimerización de bisagra IgG2 ubicado entre los dos dominios Fe. Además, hubo un grado significativo de correlación entre la unión medida mediante resonancia de plasmón y la actividad de ADCC.

Otros stradobodies dirigidos contra dianas diferentes de HER2/neu se evaluaron en cuanto a la toxicidad y la unión de forma análoga. Estos otros stradobodies incluyen la serie GB3500 dirigida contra EGFR, la serie GB4500 dirigida contra CD20 y la serie GB7500 dirigida contra TNF.

Ejemplo 3. Purificación adicional de los stradobodies Para determinar si se pueden separar con éxito los monómeros y multímeros de los stradobodies, se purificó GB2054 mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna Mono Q.

Los resultados del estudio, que se muestra en la figura 15, demostraron que se pudieron separar multímeros de mayor orden de los monómeros. Los picos de multímeros no se identificaron fácilmente en el pico no fraccionado (carril SB), pero se pudieron detectar fácilmente después del intercambio iónico. Sin pretender limitarse por la teoría, se cree que la purificación de los multímeros de stradobodies aumentará la potencia de los compuestos.

Ejemplo 4. Muítimerización y unión a FcYRIIIa mejoradas de los stradobodies con dominios de multimerización Para evaluar más rigurosamente los compuestos de stradobodies seriados, se utilizó un método de gel SDS- PAGE sensible para comparar la multimerización de las construcciones de stradobodies entre sí y con la construcción del anticuerpo monoclonal GB2500 HER2 . Se utilizaron geles de 4-12 % para el SDS-PAGE sin reducción y se utilizaron geles de 12 % para el SDS-PAGE reducido. Se cargaron todas las muestras a 2 mg y se ejecutaron a 150V durante aproximadamente 2,3 horas antes de la tinción con Coomassie.

Como se muestra en la figura 16, el mAb de control GB2500 (carril 1) y la construcción de stradobody seriado no multimerizante GB2555 (carril 7), que tiene un enlazador no multimerizante entre las dos regiones Fe de IgGl, no se multimerizó. De forma similar, la construcción de stradobody seriado no mult imerizante GB2554 (carril 6), que tiene un dominio enlazador G4S entre las dos regiones Fe de IgGl, presentó mult imerización baja. Se observó algo de multimerización para las construcciones de stradobodies seriados mult imerizantes GB2538 (carril 3) y GB2540 (carril 4), que tienen un dominio de multimerización de bisagra de IgG2 o una cremallera de isoleucina, respectivamente, entre las dos regiones Fe de IgGl. La construcción de stradobodies seriada multimerizante GB2524 (carril 2) tiene un dominio enlazador G4S y un dominio de multimerización bisagra de IgG2 entre las dos regiones Fe de IgGl, pero la multimerización fue baja. En contraste con el menor grado de multimerización de GB2538, GB2540 y GB2524, la construcción de stradobody seriado multimerizante GB2542, que tiene una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2 entre las dos regiones Fe de IgGl, presentó multimerización elevada (carril 5).

Para analizar la unión del anticuerpo padre GB2500 y cada una de las construcciones de stradobodies seriados para FcyRIIIa, se realizó un análisis de unión en el cual se cargó FcYRIIIa-His purificado en un sensor anti-penta-His ForteBio (Cat # 18-5077) a 10 mg/ml. Se incubaron GB2500 (producido en células HEK) , GB2524, GB2538, GB2540, GB2542, GB2554 o GB2555 con el receptor en amortiguador cinético lx (ForteBio Cat # 18-5032) para medir la tasa encendida (Kon) y la punta del sensor se transfirió posteriormente al amortiguador de unión para medir la tasa apagada (Kdis). Se evaluaron los anticuerpos GB2500 en concentraciones que oscilan entre 3333-208 nM y se evaluaron los stradobodies en concentraciones que oscilan entre 200 - 12,5 nM. Se calculó KD a partir de las tasas encendida y apagada utilizando el software de análisis ForteBio. Como se muestra en la tabla 4 y en la figura 17, los stradobodies seriados mult imerizantes GB2542 y GB2538 presentaron la KD más baja y, por lo tanto, la mejor capacidad de unión.

Tabla 4. Compendio de datos de unión cinética Se generaron todos los compuestos en el mismo sistema de transfección transitoria de CHO.

Los datos de unión de otros stradobodies dirigidos contra dianas diferentes de Her2/neu fueron análogos. Estos otros stradobodies incluyen la serie GB3500 dirigida contra EGFR, la serie GB4500 dirigida contra CD20 y la serie GB7500 dirigida contra TNF.

Los resultados del estudio confirmaron que GB2542 presentó multimerización superior en comparación con el mAb de control y todas las demás construcciones de stradobodies seriados evaluadas, como se indicó anteriormente. Además, GB2542 y GB2538 presentaron la unión a FcyRIIIa más sólida. Juntos, los datos que muestran multimerización superior y capacidad de unión a FcyRIIIa de GB2542 apoyaron los datos presentados anteriormente con respecto a la ADCC superior observada con GB2542.

Ejemplo 5. Los stradobodies multimerizantes redujeron la IgM serica y las células B en la sangre periférica en un modelo de ratón in vivo Se inyectaron ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) por vía intraperitoneal con 5 x 107 de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en la semana 0. En las semanas de 2 a 10, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal con PBS, GB4500 (10 nM semanalmente), GB4563 (1,7 nM semanalmente) o GB4542 (1,4 nM semanalmente) . Se inyectó GB4500 tres veces por semana, mientras que PBS, GB4563 y GB4542 se inyectaron, cada uno, una vez por semana. Por ende, los stradobodies se administraron no solo con menor frecuencia con respecto al anticuerpo monoclonal, sino que también se administraron en una dosis molar inferior. La molaridad se basó en los pesos moleculares calculados a partir de SDS-PAGE sin reducción. Se recogieron muestras de sangre en las semanas 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 16 y 20 con respecto a la transferencia adoptiva de PBMC humanas y se evaluaron en cuanto a las cantidades de células B y IgM humana sérica. En el final del estudio (es decir, en la semana 21), se sometieron a eutanasia los ratones y se recolectaron los bazos y se evaluaron en cuanto a las cantidades de células B. El diagrama de flujo experimental se muestra esquemáticamente en la figura 18.

Se evaluó la IgM humana en el suero de los ratones tratados con PBS, GB4500, GB4563 o GB4542 mediante ELISA.

Los stradobodies GB4563 y GB4542 fueron tan eficaces como el anticuerpo monoclonal GB4500 en la disminución de los niveles de IgM humana (figura 19).

Se evaluó la cantidad de células B humanas por mL de sangre periférica recolectada de los ratones tratados con PBS, GB4500, GB4563 o GB4542 mediante citometría de flujo.

Los stradobodies GB4563 y GB4542 fueron al menos tan eficaces como el anticuerpo monoclonal GB4500 en la disminución de las células B humanas en la sangre periférica (figura 20).

Al final del estudio, se sometieron a eutanasia los ratones y se enumeraron las células B en el bazo mediante citometría de flujo. El stradobody GB4563 fue tan eficaz como el anticuerpo monoclonal GB4500 en la disminución de la cantidad de células B humanas presentes en el bazo. El stradobody GB4542 fue más eficaz que el anticuerpo monoclonal GB4500 en la disminución de la cantidad de células B humanas presentes en el bazo (figura 21).

Los resultados del estudio mostraron que a pesar de que los stradobodies GB4563 y GB4542 se administraron en dosis inferiores en comparación con el anticuerpo monoclonal GB4500, los stradobodies fueron al menos tan eficaces tanto para la reducción de los niveles de IgM humana sérica y la reducción de las cantidades de células B humanas. Además, el stradobody anti-CD20 GB4542 indujo la supresión de las células B mejor que el anticuerpo monoclonal anti-CD20 correspondiente GB4500.

E emplo_ 6_. Los_ stradobodies uíti erizantes inhibieron la proliferación de las líneas celulares de linfoma de células B Se cultivaron células de linfoma de células B (líneas celulares Daudi, Ramos, 454B y 924B) en presencia de las diversas concentraciones de IgG humana (control negativo), el anticuerpo monoclonal GB4500 o el stradobody GB4542 durante 3 días. Se añadieron 0,5 pci 3H-TdR a los cultivos y se midió la incorporación de 3H-TdR en cuentas por minuto corregidas (CCPM) 16 horas después. Se calculó la inhibición de la proliferación celular utilizando la fórmula: (1 - CCPM de condición experimental/CCPM sin tratamiento) x 100 %. Los resultados del estudio se muestran en las figuras 22 y 23, que representan 3 experimentos independientes. GB4542 fue al menos tan eficaz en la inhibición directa de la proliferación celular como GB4500 en todas las líneas celulares de linfocitos B en todas las concentraciones según lo medido por mg/mL (figura 22) o en moles (figura 23). GB4542 fue significativamente más eficaz en la inhibición directa de las células Ramos, las células 454B y las células 924B en un intervalo de concentraciones en mg/mL y en un intervalo de pmol/mL (figuras 22 y 23).

Los resultados del estudio mostraron que el stradobody anti-CD20 GB4542 medió la inhibición mejorada de la proliferación de las líneas celulares de linfoma de células B en comparación con el anticuerpo monoclonal anti-CD20 correspondiente GB4500.

Ejemplo 7. Los stradobodies muitimerizantes mediaron la CDC de las líneas celulares de linfoma de células B Se cultivaron células de linfoma de células B (líneas celulares Daudi, Ramos, 454B y 924B) en presencia de las diversas concentraciones de IgG humana (control negativo), el anticuerpo monoclonal GB4500 o el stradobody GB4542 o GB4596, y con o sin complemento de conejo durante 1 hora. El grado de citotoxicidad se midió mediante análisis de citometría de flujo de tinción con anexina V/7-AAD. Los resultados del estudio se muestran en las figuras 24 y 25, que representan 2 experimentos independientes. El stradobody GB4596 fue tan eficaz como el anticuerpo monoclonal GB4500 en la CDC en todas las concentraciones, según lo medido en pg/mL (figura 24) o en moles (figura 25). Sorprendentemente, el stradobody GB4542 fue más eficaz que el anticuerpo monoclonal GB4500 en todas las concentraciones evaluadas, según lo medido en pg/mL (figura 24) o en moles (figura 25).

Los resultados del estudio indicaron que las líneas celulares de linfoma de células B presentaron mayor susceptibilidad a la CDC en presencia del stradobody anti-CD20 GB4542, en comparación con su anticuerpo monoclonal anti-CD20 correspondiente, GB4500. Estos efectos se producen en concentraciones de stradobodies que son al menos de un orden logarítmico inferior que las concentraciones de anticuerpo monoclonal tradicionales.

Juntos, los datos mostraron que los stradobodies inducen ADCC, CDC, DC e inhibición de la proliferación de las líneas celulares de linfoma de células B equivalentes o superiores en comparación con el anticuerpo monoclonal correspondiente. La actividad superior de los stradobodies estuvo presente incluso cuando los stradobodies se evaluaron en una concentración inferior con respecto a la concentración del anticuerpo monoclonal. Estos resultados indicaron que los stradobodies de la presente invención ofrecen un beneficio terapéutico sobre los anticuerpos monoclonales tradicionales u otras moléculas de unión al antígeno .

Ejemplo 8. Los stradobodies multimerizantes redujeron el volumen tumoral promedio en un modelo de ratón in vivo Se realizaron estudios para evaluar el grado en el cual un stradobody específico de CD20 exhibe destrucción de células tumorales in vivo con respecto a un anticuerpo monoclonal anti-CD20 que comparte el Fab idéntico. Se inyectaron ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) por vía subcutánea con 5 x 107 células Raji en el día 0. En el día 10, el volumen del tumor alcanzó 100 mm3 y se inició el tratamiento con el stradobody específico de CD20 (GB4542) o con el anticuerpo monoclonal (GB4500). Se administró GB4542 (13,5 mg/kg) o GB4500 (10 mg/kg) equimolar 4 veces al día mediante inyección intratumoral con CpG (100 mg por inyección) o sin CpG (PBS). Los ratones de control recibieron PBS solo o PBS con CpG. Se midió el tamaño del tumor cada 1-3 días. Se calculó el tamaño del tumor como ancho2 x longitud/2. Cuando el volumen del tumor alcanzó 2000 m3, se sometieron a eutanasia los ratones.

Los resultados del estudio se muestran en las figuras 26 y 27. Para los grupos de GB4542 con CpG y GB4500 con CpG, el tamaño del tumor promedio (figura 26) y la mediana (figura 27) se mantuvo en los niveles iniciales o cercano a estos durante el estudio (es decir, hasta al menos el día 23) . El tratamiento con GB4500 sin CpG produjo aproximadamente la mitad del volumen tumoral que el grupo de PBS en el último momento en que se midió a los grupos de PBS, antes de la eutanasia (día 18 de las figuras 26 y 27). Además, el tratamiento con GB4500 sin CpG produjo un volumen del tumor promedio (figura 26) y de mediana (figura 27) igual en comparación con el grupo PBS/CpG en el día 18 y un volumen del tumor promedio (figura 26) apenas inferior o aproximadamente la mitad de la mediana del volumen tumoral (figura 27) con respecto al grupo de PBS/CpG en el último momento (día 23). En cambio, el tratamiento con GB4542 sin CpG produjo una reducción drástica del volumen tumoral promedio así como en la mediana del volumen tumoral hasta el día 23 con respecto al volumen tumoral en los ratones tratados con GB4500 solo (figuras 26 y 27, respectivamente) . Por lo tanto, los resultados del estudio demuestran que GB4542 presenta resultados superiores con respecto al anticuerpo monoclonal correspondiente con respecto al volumen tumoral promedio in vivo.

Ejemplo 9. Los stradobodies redujeron la inflamación en un modelo de ratón de artritis in vivo Se empleó un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (CIA) para determinar la eficacia de los stradobodies para inhibir la inflamación, la formación del pannus, la destrucción de los cartílagos y la resorción ósea asociada con la artritis de colágeno tipo II en ratones .

Se anestesiaron ratones machos con isoflurano y se les administraron por vía intradérmica 150 ml de colágeno bovino tipo II en adyuvante completo de Freund (con M. tuberculosis complementario, 4 mg/mL; Difeo) en los días 0 y 21 del estudio. En este modelo, la aparición de la artritis se produjo en los días del estudio 18-35. Se monitorizaron los ratones en cuanto a los signos clínicos de enfermedad utilizando la siguiente escala de puntaje clínico : 0 = normal 1 = 1 articulación de pata delantera o trasera afectada o hinchazón y eritema difuso mínimo 2 = 2 articulaciones de patas delanteras o traseras afectadas o hinchazón y eritema difuso leve 3 = 3 articulaciones de patas delanteras o traseras afectadas o hinchazón y eritema difuso moderado 4 = eritema difuso notorio e hinchazón o 4 articulaciones de los dedos afectadas 5 = pata entera con eritema difuso grave e hinchazón grave, incapaz de flexionar los dedos Un grupo de ratones (n=4) permaneció sin tratamiento (es decir, no recibió colágeno). El resto de los grupos de ratones fueron aleatorizados después de la administración de colágeno para recibir inyecciones intravenosas de PBS, GB7500 (anticuerpo monoclonal anti-TNF), GB7542 (stradobody multimerizante anti-TNF), GB4500 (anticuerpo monoclonal anti-CD20) o GB4542 (stradobody multimerizante anti-CD20) en las dosis indicadas a continuación en la tabla 5.

Tabla 5. Grupos de ratones en estudio de artritis inducida por colágeno Se aleatorizaron los ratones en uno de los cinco grupos de tratamiento después de que la hinchazón se había establecido de forma evidente en al menos una pata (es decir, puntaje clínico de al menos 1; el primer día que el animal se calificó con un puntaje clínico de 1 se designó el día 1 de artritis).

Se inició el tratamiento con PBS, GB7500, GB7542, GB4500 o GB4542 después de la aleatorización y se continuó durante 10 días. Se determinó el peso corporal en los días de artritis 1, 3, 5, 7, 9 y 11; y se determinó el puntaje de la pata en cada uno de los días de artritis de 1 a 11. Se recogieron plasma, suero y sangre completa en diversos días del estudio para medir la farmacocinética y/o las respuestas anti-colágeno, por ejemplo, utilizando ensayos ELISA anti colágeno. Se les practicó necropsia a los animales en el día de artritis 11. Se recogieron y se analizaron histológicamente tejidos, incluido articulaciones.

Los datos clínicos para los puntajes de las patas se analizaron mediante la determinación del área bajo la curva de dosificación (AUC) para los días de artritis. Para el cálculo del AUC, se ingresaron los puntajes promedio diarios para cada ratón en Microsoft Excel y se calculó el área entre los días de tratamiento después de la aparición de la enfermedad hasta el día de finalización. Se determinaron los promedios para cada grupo y se calculó el % de inhibición a partir de los controles de artritis utilizando la siguiente fórmula: % de inhibición = A - B/A X 100 A = promedio control de enfermedad - promedio normal B = promedio tratados - promedio normal Se analizaron los datos utilizando una prueba t de Student o prueba U de Mann-Whitncy (no paramétrica). Si resultaba pertinente, se analizaron los datos adicionalmente entre todos los grupos, utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA de 1 vía) o prueba de Kruskal-Wallis (no paramétrica), junto con los datos en bruto múltiples adecuados (no transformados) solamente. Las pruebas estadísticas realizan determinadas suposiciones relacionadas con la normalidad y la homogeneidad de la varianza de los datos y puede ser necesario un análisis más detallado si las pruebas producen violaciones de estos supuestos. Para todas las pruebas, la significancia se establecerá en p£0,05.

Los resultados del estudio demostraron que los stradobodies proporcionan un tratamiento superior de la CIA con respecto a los anticuerpos monoclonales que comparten un Fab idéntico al del stradobody. Específicamente, el estudio mostró que el tratamiento con los stradobodies anti-CD20 multimerizantes y los stradobodies anti-TNF multimerizantes produce una reducción en el desarrollo y/o el avance de la CIA con respecto a los anticuerpos monoclonales anti-CD20 o los anticuerpos monoclonales anti-TNF, respectivamente. El estudio mostró que el tratamiento de la CIA con stradobodies es superior al anticuerpo monoclonal correspondiente a pesar de que el stradobody y su anticuerpo monoclonal correspondiente comparten un Fab idéntico.

Ejemplo 10. Los stradobodies multimerizantes exhiben unión al complemento Clq superior con respecto al anticuerpo monoclonal correspondiente o a los stradobodies no multimerizantes que comparten el mismo Fab.

Se realizó un ensayo de unión al complemento para comparar la unión a Clq de tres stradobodies multimerizantes con respecto a los anticuerpos monoclonales correspondientes que tienen los mismos Fab que los stradobodies multimerizantes.

Se -recubrieron placas de ELISA con 1 mg/mL en PBS a 100 mL de volumen de componente complemento de suero humano Clq (Sigma Cat#:C1740-0,5MG) durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas 3 veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contenía 0,05 % de Tween. Se bloqueó la unión no específica utilizando PBS que contenía solución de 1 % de BSA y 0,05 % de Tween durante 2 h a temperatura ambiente. Se incubaron los pocilios recubiertos con los compuestos experimentales en diferentes concentraciones durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas 3 veces con PBS que contenía 0,05 % de Tween y se incubaron con 1:5000 de IgGl anti-humana de ratón biotinilada (Cat#555869, BD Biosciences) y strepdavidin-HRP (Cat#: 7100-05 SouthernBiotech) como reactivo de detección durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron los pocilios 3 veces y se detectaron con el método de detección ELISA TMB estándar y se lcyó la absorbancia a 450 nm.

Se evaluaron GB4542 y el mAb correspondiente que compartía el mismo Fab (GB4500), GB7542 y el mAb correspondiente que compartía el mismo Fab (GB7500) y GB2542 y el mAb correspondiente que compartía el mismo Fab (GB2500) en cuanto a la unión a Clq complemento. Sorprendentemente, los tres anticuerpos multimerizantes evaluados (GB4542, GB7442 y GB2542) presentaron unión a Clq complemento exponencialmente superior con respecto a sus mAb correspondientes (figura 28). En particular, GB4542 presentó un nivel extremadamente alto de unión a Clq complemento. GB4542, GB7542 y GB2542 comparten los dominios de multimerización idénticos y las regiones Fe y difieren solamente en que cada uno tiene un Fab diferente. Por ende, inesperadamente, el Fab en el stradobody multimerizante afecta el nivel de unión a Clq complemento.

Se transformaron logarítmicamente los datos con un ajuste de curva utilizando GraphPad prism 5, un software disponible en el mercado y se calculó la EC50 (en ug/ml) para cada molécula evaluada. La EC50 es la concentración eficaz máxima media y se refiere a la concentración de una molécula que proporciona la respuesta máxima media. Sorprendentemente, la EC50 para cada stradobody fue 10-20 veces inferior que la EC50 para el anticuerpo correspondiente (figura 29) . Específicamente, la EC50 para el stradobody GB7542 fue 8,69, mientras que la EC50 para el mAb correspondiente GB7500 fue 202,0; la EC50 para el stradobody GB4542 fue 3,25, mientras que la EC50 para el mAb correspondiente GB4500 fue 34,5; y la EC50 para el stradobody GB2542 fue 11,0, mientras que la EC50 para el mAb correspondiente GB2500 no se pudo determinar debido al nivel extremadamente bajo de unión a Clq presentado por esta molécula (figura 29). Por lo tanto, la concentración de stradobody necesaria para proporcionar una respuesta de unión al complemento máxima media fue al menos 10-20 veces inferior que la necesaria para un anticuerpo monoclonal que tiene el mismo Fab para lograr una respuesta de unión al complemento máxima media. Además, la concentración de stradobody necesaria para proporcionar una respuesta de unión al complemento máxima media se vio afectada por el Fab del stradobody y no solo por las regiones multimerizantes y Fe. Se realizaron ensayos de unión al complemento adicionales para evaluar la capacidad de unión a Clq complemento de los stradobodies no multimerizantes con respecto a su contraparte multimerizante o al anticuerpo monoclonal correspondiente que comparte el mismo Fab. Para evaluar la unión a Clq complemento, se realizaron ensayos de complemento como se describió anteriormente utilizando GB2500, GB2542 y los stradobodies no multimerizantes lineales GB2554 y GB2555, los cuales comparten el mismo Fab anti Her2/neu. Los stradobodies no multimerizantes GB2554 y GB2555 presentaron unión a Clq complemento superior con respecto al anticuerpo monoclonal GB2500 (figura 30); sin embargo, el stradobody multimerizante GB2542 presentó unión a Clq complemento muy superior en comparación con cualquiera de los stradobodies no multimerizantes (figura 30). Además, el valor de EC50 para el stradobody multimerizante GB2542 fue 2,5-7,0 veces inferior que los valores de EC50 para GB2554 y GB2555. Específicamente, el valor de EC50 para la unión a Clq complemento para GB2542 fue 3,83, mientras que el valor de EC50 para la unión a Clq complemento para GB2554 y GB2555 fue 26,4 y 9,45, respectivamente (figura 31).

Los resultados del estudio indicaron que, inesperadamente, los stradobodies multimerizantes presentaron unión al complemento drásticamente superior con respecto al anticuerpo monoclonal correspondiente que compartía el mismo Fab. Los resultados también indicaron que aunque los stradobodies no multimerizantes presentaron unión al complemento superior con respecto al anticuerpo monoclonal correspondiente que compartía el mismo Fab, los stradobodies multimerizantes presentaron unión al complemento muy superior con respecto a los stradobodies no multimerizantes que compartían el mismo Fab. Por último, el estudio mostró que el Fab en el stradobody multimerizante afecta drásticamente la cantidad de unión a Clq.

Todos los documentos, patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de productos y protocolos citados en la presente solicitud se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad a todos los efectos.

Las modalidades ilustradas y descritas en la presente memoria descriptiva solo pretenden enseñarles a los entendidos en la téenica la mejor manera conocida por los inventores de realizar y utilizar la invención. Se pueden realizar modificaciones y variaciones a las modalidades de la invención descritas anteriormente sin apartarse de la invención, según lo consideren los entendidos en la téenica, a la luz de los principios anteriores. Por lo tanto, se entiende que, dentro del alcance de las reivindicaciones y de sus equivalentes, la invención se puede llevar a la práctica de un modo diferente del descrito específicamente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un stradobody caracterizado porque comprende un dominio Fab; uno o más dominios Fe; y uno o más dominios de multimerización, en donde el o los dominios de multimerización son capaces de multimerizar el stradobody.

2. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende dos dominios Fe y en donde el o los dominios de multimerización separan los dos dominios Fe.

3. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno del o de los dominios de multimerización se ubica en el Carboxi-terminal de la región Fe.

4. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el o los dominios de multimerización se seleccionan independientemente del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina, una bisagra de IgG2 y una repetición de GPP.

5. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos un dominio bisagra de IgG2, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio bisagra de IgG2 es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 3 y en donde la bisagra de IgG2 es capaz de multimerizar al stradobody.

6. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una cremallera de isoleucina, en donde la secuencia de aminoácidos de la cremallera de isoleucina es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 32 y en donde la cremallera de isoleucina es capaz de multimerizar al stradobody.

7. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende dos dominios de multimerización.

8. El stradobody de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los dos dominios de multimerización son una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2.

9. El stradobody de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los dos dominios de multimerización separan dos dominios Fe.

10. El stradobody de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los dos dominios de multimerización se ubican en el Carboxi-terminal de la región Fe.

11. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende tres dominios de multimerización.

12. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende cuatro dominios de multimerización.

13. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el al menos un dominio Fe es un dominio Fe de IgGl.

14. El stradobody de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dominio Fe de IgGl comprende una bisagra de IgGl, CH2 de IgGl y CH3 de IgGl.

15. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno del o de los dominios Fe comprende una bisagra de IgG2.

16. El stradobody de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el dominio Fe comprende una bisagra de IgG2, CH2 de IgGl y CH3 de IgGl.

17. El stradobody de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de al menos un dominio Fe de IgGl es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 2.

18. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una cremallera de isoleucina; (d) una bisagra de IgG2; y (e) un segundo dominio Fe.

19. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una bisagra de IgG2; (d) una cremallera de isoleucina; y (e) un segundo dominio Fe.

20. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una cremallera de isoleucina; y (e) un segundo dominio Fe.

21. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una bisagra de IgG2; y (e) un segundo dominio Fe.

22. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fc; (c) un dominio G4S; (d) una bisagra de IgG2; y (e) un segundo dominio Fe.

23. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una bisagra de IgG2; (d) un dominio G4S; y (e) un segundo dominio Fe.

24. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) un dominio G4S; (d) una cremallera de isoleucina; y (e) un segundo dominio Fe.

25. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una cremallera de isoleucina,- (d) un dominio G4S; y (e) un segundo dominio Fe.

26. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) un dominio GPP; y (d) un segundo dominio Fe.

27. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) un dominio GPP; (d) una bisagra de IgG2; y (e) un segundo dominio Fe.

28. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una bisagra de IgG2; (d) un dominio GPP; y (e) un segundo dominio Fe.

29. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) un dominio GPP; (d) una cremallera de isoleucina; y (e) un segundo dominio Fe.

30. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un primer dominio Fe; (c) una cremallera de isoleucina; (d) un dominio GPP; y (e) un segundo dominio Fe.

31. El stradobody de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30, caracterizado porque el primer y el segundo dominio Fe son dominios Fe de IgGl.

32. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 33.

33. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 35.

34. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del stradobody es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 37.

35. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) una cremallera de isoleucina; y (d) una bisagra de IgG2.

36. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) una bisagra de IgG2; y (d) una cremallera de isoleucina.

37. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; y (c) una bisagra de IgG2.

38. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; y (c) una cremallera de isoleucina.

39. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) un dominio G4S; y (d) una bisagra de IgG2.

40. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) un dominio G4S; y (d) una cremallera de isoleucina.

41. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (d) una bisagra de IgG2; y (d) una unión de dominios.

42. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fc; (c) una unión de dominios; y (d) una bisagra de IgG2.

43. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (c) un dominio Fe; (d) una cremallera de isoleucina; y (e) una unión de dominios.

44. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (c) un dominio Fe; (d) una unión de dominios; y (e) una cremallera de isoleucina.

45. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; y (c) un dominio GPP.

46. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) un dominio GPP; y (d) una bisagra de IgG2.

47. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) una bisagra de IgG2; y (d) un dominio GPP.

48. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) un dominio GPP; y (d) una cremallera de isoleucina.

49. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende de amino-terminal a Carboxi-terminal: (a) un dominio Fab; (b) un dominio Fe; (c) una cremallera de isoleucina; y (d) un dominio GPP.

50. El stradobody de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-49, caracterizado porque el dominio Fe es un dominio Fe de IgGl.

51. El stradobody de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el dominio Fe de IgGl comprende una bisagra de IgGl, CH2 de IgGl y CH3 de IgGl.

52. El stradobody de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-49, caracterizado porque el dominio Fe comprende una bisagra de IgG2.

53. El stradobody de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el dominio Fe comprende una bisagra de IgG2, CH2 de IgGl y CH3 de IgGl.

54. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio Fab es específico para EGFR.

55. El stradobody de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 31.

56. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio Fab es específico para HER2/neu.

57. El stradobody de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 34.

58. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio Fab es específico para CD20.

59. El stradobody de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 36.

60. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dos o más dominios Fe son capaces de unirse a FcyR.

61. El stradobody de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque FcyR es FcyRIIIa.

62. Un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz del stradobody de conformidad con la reivindicación 1.

63. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa o un cáncer en un sujeto que lo necesita, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz de un stradobody de conformidad con la reivindicación 1.

64. El método de conformidad con la reivindicación 62 o 63, caracterizado porque el sujeto es un ser humano.

65. El método de conformidad con la reivindicación 62 o 63, caracterizado porque el stradobody se le administra al sujeto por vía intravenosa, subcutánea, oral, nasal, intraperitoneal, sublingual, bucal, transdérmica, implante subcutáneo o subdérmico o intramuscular.

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el stradobody se administra por vía intravenosa en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg/Kg y aproximadamente 50 mg/Kg.

67. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sujeto tiene cáncer.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarco a, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad mielodisplásica, enfermedad de la pesada cadena, tumores neuroendocrinos y schwanoma.

69. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria y en donde la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Guillain-Barre, miastenia gravis, esclerosis múltiple, neuritis óptica, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatitis atópica, aterosclerosis, enfermedad coronaria, miocardiopatía, artritis reactiva, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de injerto contra huésped y diabetes mellitus tipo 1.

70. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sujeto tiene una enfermedad infecciosa y en donde la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía por estreptococos, afecciones de la piel y de la orofaringe por estreptococos, sepsis gram negativa, tuberculosis, mononucleosis, influenza, enfermedad respiratoria causada por el virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana, hepatitis B, hepatitis C, malaria, esquistosomiasis, estafilococos aureus resistente a la meticilina, enterococcus resistente a la vancomicina, enterobacterias productoras de carbapenemasas y resistentes a carbapenem, enfermedad por micobacterias y tripanosomiasis.

71. El método de conformidad con la reivindicación 62 o 63, caracterizado porque el stradobody se administra antes, durante o después de la administración de uno o más agentes farmacéuticos y/o terapéuticos adicionales.

72. El stradobody de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el stradobody presenta toxicidad celular mejorada en comparación con los stradobodies que contienen uno o más dominios de multimerización en ubicaciones que no sean separando dos o más dominios Fe.

73. El stradobody de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el stradobody presenta toxicidad celular mejorada en comparación con los stradobodies que contienen uno o más dominios de multimerización en ubicaciones que no sean en el Carboxi-terminal de la región Fe de IgGl.

74. El stradobody de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el stradobody presenta una destrucción celular mejorada en comparación con los stradobodies que contienen un dominio de multimerización.

75. El stradobody de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el stradobody presenta una destrucción celular mejorada en comparación con los stradobodies que contienen dos dominios de multimerización que no son una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2 .

76. El stradobody de conformidad con la reivindicación 72 o 73, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por ADCC.

77. El stradobody de conformidad con la reivindicación 72 o 73, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por CDC.

78. El stradobody de conformidad con la reivindicación 72 o 73, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por DC.

79. Un stradobody caracterizado porque comprende un dominio Fab; dos o más dominios Fe; y dos dominios de multimerización en donde los dos dominios de multimerización separan los dos o más dominios Fe en donde el stradobody presenta una destrucción celular mejorada en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización.

80. El stradobody de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque al menos uno de los dos o más dominios Fe es un dominio Fe de IgGl.

81. Un stradobody caracterizado porque comprende un dominio Fab; uno o más dominios Fe; y dos dominios de multimerización en donde los dos dominios de multimerización se encuentran en el Carboxi-terminal de la región Fe y en donde el stradobody presenta una destrucción celular mejorada en comparación con un stradobody que contiene un dominio de multimerización.

82. El stradobody de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque al menos uno del o de los dominios Fe es un dominio Fe de IgGl.

83. El stradobody de conformidad con la reivindicación 79 u 81, caracterizado porque los dos dominios de multimerización son una cremallera de isoleucina y una bisagra de IgG2.

84. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el stradobody presenta una destrucción celular mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno.

85. El stradobody de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por ADCC.

86. El stradobody de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por CDC.

87. El stradobody de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por DC.

88. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el stradobody presenta inhibición de la proliferación celular mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno.

89. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una o más señales de peligro .

90. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la señal de peligro se selecciona del grupo que consiste en CD40-L, TNF-o¡, IL-Ib, IFN , nucleótidos intracelulares ATP o UTP, secuencias CpG no metliadas largas, proteínas de choque térmico, intermedios de oxígeno reactivo, péptido intestinal vasoactivo, metaloproteinasa-9, productos de degradación de sulfato de heparan, productos de degradación pequeños del ácido hialurónico, fosfolípidos derivados de LDL, LOX-1, ácido úrico, cuadro 1 de grupo de alta movilidad, una inflamasoma, IL-1 a; proteínas S100; factor de crecimiento derivado de hepatoma, IL-1 OÍ; concentraciones altas de adenosina 5 '-trifosfatasa, b-D-glucopiranosilceramida, IL-33, nanopartículas como nanopartículas de oro y F-actina.

91. El método de conformidad con la reivindicación 62 o 63, caracterizado porque comprende la administración del stradobody de conformidad con la reivindicación 89.

92. El método de conformidad con la reivindicación 62 o 63, caracterizado porque comprende la administración, antes, durante o después del tratamiento, de un stradobody adicional que comprende una señal de peligro.

93. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el dominio Fab es específico para EGFR.

94. El stradobody de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 31.

95. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el dominio Fab es específico para Her2/neu.

96. El stradobody de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 34.

97. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el dominio Fab es específico para CD20.

98. El stradobody de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 36.

99. El stradobody de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el dominio Fab es específico para EGFR.

100. El stradobody de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 31.

101. El stradobody de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el dominio Fab es específico para Her2/neu.

102. El stradobody de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 34.

103. El stradobody de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el dominio Fab es específico para CD20 .

104. El stradobody de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 36.

105. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 35.

106. El stradobody de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 35.

107. El stradobody de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 35.

108. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 33.

109. El stradobody de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 33.

110. El stradobody de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 33.

111. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 37.

112. El stradobody de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 37.

113. El stradobody de conformidad con la reivindicación 112, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 37.

114. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 66.

115. El stradobody de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 66.

116. El stradobody de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 66.

117. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 91.

118. El stradobody de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 91.

119. El stradobody de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 91.

120. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO:70.

121. El stradobody de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 70.

122. El stradobody de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 70.

123. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 76.

124. El stradobody de conformidad con la reivindicación 123 caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 76.

125. El stradobody de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 76.

126. Un stradobody caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 87.

127. El stradobody de conformidad con la reivindicación 126, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos el 95 % homologa de SEQ ID NO: 87.

128. El stradobody de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 87.

129. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio Fab es específico para un miembro de la superfamilia TNF.

130. El stradobody de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque el miembro de la superfamilia TNF se selecciona del grupo que consiste en TNF, linfotoxina (LT), linfotoxina (IGb), ligando 0X40, ligando CD40, CD95, ligando CD27, ligando CD30, ligando 4-1BB, TRAIL, TRANCE, TWEAK, APRIL, Blys, LIGHT, TL1A, ligando GITR, EDA-A1 y EDA-A2.

131. El stradobody de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque el miembro de la superfamilia TNF es TNF.

132. El stradobody de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 67.

133. El stradobody de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el dominio Fab es específico para TNF.

134. El stradobody de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 67.

135. El stradobody de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el dominio Fab es específico para TNF.

136. El stradobody de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del Fab es al menos el 80 % homologa de SEQ ID NO: 67.

137. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio Fab es específico para una citocina.

138. El stradobody de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-2, IL-8 y IL-17.

139. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el stradobody presenta una unión al complemento mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno.

140. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el stradobody presenta una unión al complemento mejorada en comparación con un anticuerpo monoclonal que comparte el Fab idéntico.

141. El stradobody de conformidad con la reivindicación 139 o 140, caracterizado porque el valor de EC50 para la unión al complemento es al menos 10 veces inferior para el stradobody en comparación con el anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno.

142. El stradobody de conformidad con la reivindicación 139 o 140, caracterizado porque el valor de EC50 para la unión al complemento es al menos 20 veces inferior para el stradobody en comparación con el anticuerpo monoclonal específico para el mismo antígeno.

143. El stradobody de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el stradobody presenta destrucción celular y en donde la cantidad de destrucción celular varía según el Fab.

144. El stradobody de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por ADCC.

145. El stradobody de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por CDC.

146. El stradobody de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque la destrucción celular es mediada por DC.

147. Una composición caracterizada porque comprende stradobodies multimerizados, en donde los stradobodies se seleccionan de los stradobodies de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 - 30.

148. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 stradobodies.