MX2014012867A

MX2014012867A - Separacion liquido / liquido de biomasa lignocelulosica para producir jarabes de azucar y fracciones de lignina.

Info

Publication number: MX2014012867A
Application number: MX2014012867A
Authority: MX
Inventors: Thomas P Binder
Original assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2015-07-14
Also published as: US20150051385A1; BR112014026267A2; EP2841582A4; WO2013162881A1; EP2841582A1; CA2870829A1; CN104245946A

Abstract

Se describe un proceso para la producción de jarabes enriquecidos en azúcar C5 y C6 a partir de biomasa lignocelulósica y productos de fermentación derivados de esta. La biomasa lignocelulósica se trata con ácido acético con lavado de la misma con un solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 (por ejemplo, acetato de etilo). La fracción enriquecida en hemicelulosa y lignina soluble se obtiene de forma separada a partir de una fracción enriquecida en pulpa de celulosa y la lignina se quita de la fracción de hemicelulosa soluble. La fracción enriquecida en hemicelulosa y lignina soluble se somete a separación líquido/líquido para obtener una fase acuosa nriquecida en azúcares C5 y azúcares C6 y con un contenido reducido en ácido acético. El jarabe es adecuado para la fermentación. El proceso también produce fracciones de lignina insoluble en solvente orgánico, lignina soluble en solvente orgánico y sales de acetato.

Description

SEPARACIÓN LÍQUIDO/ LÍQUIDO DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA PARA PRODUCIR JARABES DE AZÚCAR Y FRACCIONES DE LIGNINA REFERENCIA CRUZADA A LA[S] SOLICITUD[ES] RELACIONADA [S] La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Tratado de Cooperación de Patente No.

PCT/US12/56593, presentada el 21 de setiembre de 2012, actualmente pendiente, que reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional 61/638,544, titulada C1-C2 Organic Acid Treatment of Lignocellulosic Biomass to Produce Acylated Cellulose Pulp, Hemicellulose, Lignin and Sugars and Fermentation of the Sugars, presentada el 26 de abril de 2012. Las solicitudes de patente identificadas anteriormente se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad para proporcionar continuidad a la divulgación.

DECLARACIÓN DE INVESTIGACIÓN FEDERAL PATROCINADA La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno según subvención No.: DE-EE0002870 del departamento de energía. El gobierno federal tiene ciertos derechos sobre la presente invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hidrólisis de celulosa y hemicelulosas en azúcares monoméricos es un requisito previo clave para la conversión comercial de las materias primas lignocelulósicas como rastrojo de maíz, cáscaras de fibra de maíz, cáscaras de soja, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera y otras formas de biomasa vegetal derivadas de cultivos energéticos que consisten en pastos perennes como pasto varilla o miscanthus, maderas blandas y/o duras asi como residuos de pulpa y papel de desecho para azúcares monoméricos.

Gran parte de la hidrólisis de celulosa se centró en la producción de una corriente de pulpa adecuada para las aplicaciones de la industria de celulosa y papel en lugar de recuperar los azúcares C5 y C6 fermentables. El proceso de Acetosolv utiliza ácido acético concentrado y ácido clorhídrico para la reducción a pulpa, lo que permite la degradación hidrolítica de la lignina y las hemicelulosas en condiciones de rigurosidad baja. En los procesos de Acetosolv, la biomasa como madera, se deslignifica mediante la cocción durante un tiempo y a una temperatura dada en una mezcla acuosa que contiene más de un 50% de ácido acético. Después de la cocción, la pulpa residual se separa de los sólidos disueltos y la pulpa se lava de forma adicional con ácido acético/agua y después finalmente con agua, lo que produce en última instancia pulpa, lignina libre de azufre y una fracción enriquecida en azúcares y oligosacáridos pero contaminada con ácidos orgánicos.

No obstante, la conversión de biomasa lignocelulósica a azúcares monoméricos, representa muchos desafíos téenicos para los usos económicos de los azúcares monoméricos, especialmente como materias primas para preparar productos, como etanol, mediante fermentación de los azúcares. En la Solicitud Provisional de Estados Unidos 61/638,544, titulada C1-C2 Organic Acid Treatment of Lignocellulosic Biomass to Produce Acylated Cellulose Pulp, Hemicellulose, Lignin and Sugars and Fermentation of the Sugars, presentada el 26 de abril de 2012 y en la Solicitud de Tratado de Cooperación de Patente No. PCT/US12/56593, presentada el 21 de setiembre de 2012, actualmente pendiente, se presentaron soluciones a estos problemas. La presente divulgación se refiere a mejoras en los procesos y composiciones de dicha divulgación. Los procesos de dicha divulgación se llevan a cabo mediante el uso de un exceso de solvente agregado a una fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina para precipitar la hemicelulosa y la lignina, seguido por filtración para recuperar la hemicelulosa/lignina. En la presente se hace referencia a esto como el proceso de filtración.

Por consiguiente, aún existe la necesidad en la téenica de desarrollar un enfoque integrado y más económico para la recuperación y purificación de azúcares C5 y C6 fermentables sin subproductos tóxicos y para la recuperación de fracciones de lignina, mientras que se reduzca la cantidad de agua y solvente utilizados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los métodos y materiales preparados de ese modo descritos en la presente superan muchos de los desafios téenicos anteriores. Los métodos incluyen el uso de un ácido acético suave conjuntamente con un solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 en rondas iniciales de hidrólisis para separar la hemicelulosa y lignina soluble en ácido de la pulpa de celulosa. El uso de ácido acético resulta en la esterificación de la hemicelulosa y celulosa, que es superada por la desesterificación enzimática y/o química antes o conjuntamente con hidrólisis adicional de estas fracciones con una mezcla adecuada de enzimas celuloliticas y hemicelulolíticas. En realizaciones preferidas se incluye una enzima estearasa. El uso de un detergente no iónico en la hidrólisis enzimática aumenta de forma sustancial la tasa de conversión catalítica a jarabes de azúcar enriquecido C5 y C6 adecuados. Además, estos se utilizan en procesos de fermentación en etapas para lograr una producción de etanol superior al 8% en el caldo de fermentación. Estos resultados obtenidos fueron sorprendentes en el sentido que contrariamente a los artículos publicados, la hidrólisis de celulosa a glucosa puede proceder sin inhibición perceptible de la actividad de la enzima celulasa y que las concentraciones de etanol superiores al 5% no son perjudiciales para las actividades enzimáticas en la mezcla probada. Esto sugiere que no existe o existe una inhibición reducida de la retroalimentación con las nuevas mezclas comerciales mixtas y que la precipitación de las proteínas no es significativa. Lo que antecede puede explicarse con base en un mayor equilibrio en la actividad enzimática en las nuevas mezclas comerciales y una posible pureza superior en el producto mezclado lo que mitiga la coprecipitación con otras proteínas no esenciales.

Otro aspecto incluye métodos de separación líquido/líquido eficaces para la purificación de los azúcares derivados de hemicelulosa soluble en ácido derivada de biomasa lignocelulósica. Los métodos de separación líquido/ líquido permiten la separación de una fase acuosa enriquecida en azúcares C5 y C6 y lignina insoluble en solvente orgánico de una fase de sobrenadante orgánico enriquecida en lignina soluble en solvente orgánico y sales de acetato. La lignina insoluble en solvente orgánico y el jarabe de azúcar enriquecido en azúcares C5 y C6 se recuperan de la fase acuosa mediante coagulación inducida con agua, calentamiento y filtración. La acidificación del jarabe de azúcar enriquecido en azúcares C5 y C6 permite etapas de separación líquido/ líquido adicionales llevadas a cabo mediante la aplicación de solvente al jarabe de azúcar enriquecido en azúcares C5 y C6. En este proceso, el ácido acético se elimina del jarabe de azúcar enriquecido en azúcares C5 y C6 para proporcionar azúcares C5 + C6 reducidos en ácido acético enriquecidos en azúcares C5 y C6 y una solución de ácido recuperado. En una realización alternativa, después de la coagulación inducida con agua y el calentamiento, la lignina insoluble en solvente orgánico se pone en contacto con una segunda cantidad de agua y se filtra para proporcionar lignina insoluble en solvente orgánico. En realizaciones adicionales, la fase de sobrenadante orgánico enriquecida en lignina soluble en solvente orgánico y sales de acetato se somete a evaporación para recuperar el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 y el ácido acético de forma separada del jarabe de sobrenadante acuoso enriquecido en lignina soluble en solvente orgánico y sales de acetato. El solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 y el ácido acético pueden condensarse para recuperar solvente y ácido. En realizaciones adicionales, la separación liquido/ liquido del jarabe de sobrenadante acuoso se lleva a cabo al ponerlo en contacto con agua suficiente para inducir la separación de fases, lo que proporciona una fase acuosa enriquecida en sales de acetato y una fase enriquecida en lignina soluble en solvente orgánico. En aún otra realización, puede ponerse en contacto una o más corrientes de proceso enriquecidas en azúcares C5 y C6 con un microorganismo para producir un producto de fermentación. En una realización alternativa, el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 no es un solvente halogenado.

En aún otra realización, se presenta la lignina insoluble en solvente orgánico obtenida mediante los métodos presentados en la presente. En otra realización, se presenta la lignina soluble en solvente orgánico obtenida mediante los métodos presentados en la presente. En realizaciones seleccionadas, la lignina insoluble en solvente orgánico o la lignina soluble en solvente orgánico comprende lignina derivada de madera blanda como coniferas, picea, cedro, pino y secoya; lignina derivada de madera dura como arce, álamo, roble, eucalipto y tilo; lignina derivada de cañas como paja, maíz, cañóla, avena, arroz, sorgo, trigo, soja, cebada, espelta y algodón; lignina derivada de grama como bambú, miscanthus, caña de azúcar, pasto varilla, pasto cinto, gramíneas y cualquiera de sus combinaciones. En otras realizaciones, la biomasa lignocelulósica tiene un contenido de agua no mayor a un 40% p/p, no mayor a un 20% p/p o no mayor a un 10% p/p. En aún otra realización, las sales de acetato adecuadas para fertilizantes se obtienen a partir de biomasa celulósica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un esquema de una realización general de una biorrefineria para el procesamiento de biomasa lignocelulósica para formar pulpa de celulosa, una fracción de hemicelulosa y una fracción de lignina y la formación posterior de azúcares C5 y C6 para su uso en la preparación de etanol u otros productos mediante fermentación.

La figura 2 ilustra una realización de un método que incorpora ácido acético y solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 para la preparación de una pulpa de celulosa, una fracción de hemicelulosa y una fracción de lignina a partir de biomasa lignocelulósica.

La figura 3 es un diagrama del espectro FTIR e ilustra la diferencia en la pulpa de celulosa del rastrojo de maíz (traza superior) y la pulpa de rastrojo de maíz tratada con hídróxido de amonio (traza inferior).

La figura 4 es un diagrama del espectro FTIR que confirma la ausencia de ácido acético esterificado en la pulpa de rastrojo de maíz tratada con hidróxido de amonio.

La figura 5 es una gráfica que muestra la cantidad de glucosa liberada del rastrojo de maíz desacetilado mediante tratamiento con celulasa.

La figura 6 es una gráfica que muestra los resultados de la agitación de los matraces de fermentación con levadura cepa 424a de enzima hidrolizada a un 20% de sólidos de pulpa de celulosa 218 con adición de tensioactivo.

La figura 7 es un esquema que ilustra un método óptimo para una hidrólisis semisimultánea de dos etapas y un proceso de fermentación para producir etanol a partir de biomasa lignocelulósica.

La figura 8 es una gráfica que ilustra el lapso de tiempo para la producción de etanol y el uso simultáneo de xilosa de azúcar C5 durante una fermentación ejemplar de una primera etapa de la levadura cepa 424a llevada a cabo en matraces de agitación de laboratorio por duplicado. EFT = Tiempo de fermentación transcurrido (horas).

La figura 9 es un esquema de una realización general de una biorrefineria para el procesamiento de biomasa lignocelulósica mediante separación liquido/ liquido para reducir de forma sustancial los volúmenes de solvente y evitar la formación de una emulsión, para formar una fracción de lignina soluble en solvente orgánico, una fracción de lignina insoluble en solvente orgánico y azúcares C5 y C6 para su uso en la preparación de etanol u otros productos mediante fermentación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN "Biomasa lignocelulósica" significa un material de planta donde la mayoría de los carbohidratos se encuentran en forma de celulosa y hemicelulosa diferente del almidón y azúcares. Para que la invención sea más práctica la biomasa lignocelulósica debe tener un contenido de humedad menor a un 40% y en realizaciones típicas el contenido de humedad debe ser menor a un 30%, preferentemente menor a un 20% y más preferentemente menor a un 10%. Asimismo se prefiere el uso de biomasas que tengan un contenido de proteínas relativamente bajo dado que mayores cantidades de proteína interfieren con las etapas de procesamiento y contaminan las fracciones de hemicelulosa y lignina recuperadas en última instancia. El contenido de proteínas debe ser menor a un 10% p/p de la biomasa. Se prefiere que sea menor a un 5% en la mayoría de las realizaciones. Los ejemplos adecuados incluyen madera, pastos, tallos de los granos de cereal como trigo (paja), maíz (rastrojo), cebada, mijo y arroz, así como el desecho de la planta residual de la cosecha de cultivos dicotiledóneos que incluyen cáscaras de legumbres y granos. Las biomasas lignocelulósicas no adecuadas que tienen demasiada proteína incluyen, por ejemplo, cáscaras de maíz (también conocida como la corriente de "fibra de maíz" de una operación de procesamiento de maíz con molienda húmeda).

El ácido acético puede incluir hasta un 30% de agua. A pesar de que el ácido acético se utiliza como el ácido preferido en la presente divulgación, el ácido fórmico también sería adecuado.

Un "solvente orgánico miscible en ácido C1-C2" es un solvente orgánico no ácido que es miscible con ácido acético y es capaz de formar un precipitado de hemicelulosa y lignina a partir de una solución de ácido acético que lo contiene, con la condición de que el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 no sea un solvente halogenado. El solvente orgánico utilizado tiene las siguientes características: la solubilidad de los azúcares en el solvente debe ser baja, y al menos una subfracción de lignina debe ser parcialmente soluble en el solvente. Dichos solventes son levemente polares. Preferentemente, la solubilidad del agua en el solvente orgánico debe ser baja. Asimismo, la polaridad del solvente no debe ser demasiado baja para extraer de forma eficaz el ácido acético del agua. Los ejemplos adecuados incluyen alcoholes de bajo peso molecular, cetonas y ésteres, como alcoholes C1-C4, acetona, acetato de etilo, acetato de metilo y metil etil cetona y tetrahidrofurano.

"Acilar" y "ad iado" significa la formación de un enlace de éster entre un azúcar o un residuo de azúcar de un polisacárido y un ácido orgánico.

"Extracción liquido/ liquido" y "separación liquido/ liquido" significa métodos para separar los compuestos con base en su solubilidad relativa en dos líquidos inmiscibles diferentes.

"Partición" significa el comportamiento de un compuesto o de una mezcla de compuestos en la presencia de dos fases inmiscibles. Se dice que el compuesto o mezcla de compuestos se particiona en una fase dada cuando entra en contacto con dos fases inmiscibles, la concentración del compuesto o de la mezcla de compuestos en una de las fases es mayor que la concentración de dicho compuesto o mezcla de compuestos en la otra fase.

Una mejora de la presente divulgación con respecto al proceso de filtración descrito en la Solicitud de Tratado de Cooperación de Patente No. PCT/US12/56593 es un aumento en el nivel de hidrólisis de biomasa lignocelulósica que puede llevarse a cabo. El nivel de monosacáridos liberados en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica para el proceso de filtración debe ser relativamente bajo debido al uso de solventes que precipitan hemicelulosa y lignina, y extraen simultáneamente el agua atrapada en la hemicelulosa. Niveles más altos de hidrólisis tornan el uso del solvente difícil y costoso, dado que la afinidad de los monosacáridos por el agua es mucho más alta que la afinidad de los oligosacáridos por el agua. Por consiguiente, son necesarios niveles excesivamente altos de solvente, solventes más polares o una cizalla muy alta.

Una mejora adicional de la presente divulgación con respecto al proceso de filtración es que los procesos de la presente divulgación requieren menos solvente. Por tanto, las corrientes de proceso se operan con concentraciones más altas de los componentes deseados. Dado que la presente divulgación hace uso de la separación líquido/ líquido en lugar de la filtración en ciertas etapas, se obvian las limitaciones de viscosidad inherentes al proceso de filtración. La viscosidad de las corrientes de proceso se ve influenciada por el grado de hidrólisis inicial de la biomasa lignocelulósica. Un problema téenico del proceso de filtración es que la concentración de sólidos del jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina 268 (ver figura 2) mediante evaporación de la mezcla de ácido C1-C2/ solvente orgánico 257 se ve limitada dada la visocidad alta que se desarrolla a medida que se lleva a cabo la evaporación. Cuando la filtración se utiliza para la separación, la evaporación únicamente puede llevarse a cabo para formar una concentración de aproximadamente un 40% de sólidos en el jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina dado que la etapa de filtración posterior se vuelve poco práctica debido a la viscosidad alta. En la presente divulgación, el uso de la separación liquido/ liquido permite que la evaporación se lleve a cabo hasta que se alcanza una concentración de al menos un 52% de sólidos en el jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina 268. Un nivel más alto de concentración de sólidos permite el uso de cantidades más pequeñas de ácido y solvente en etapas de purificación posteriores.

Una mejora adicional de la presente divulgación con respecto al proceso de filtración es la reducción en la cantidad de agua utilizada en el proceso. Dado que el proceso de filtración utiliza cantidades significativas de agua para el lavado y la separación, la separación posterior de ácido acético es difícil y costosa debido a la formación bien conocida de mezclas zeotrópicas de ácido acético y agua. A pesar de que estas mezclas no son verdaderamente azeotrópicas, la recuperación de ácido acético de una mezcla zeotrópica de ácido acético y agua es poco práctica a nivel económico. Los procesos de la presente divulgación utilizan cantidades sustancialmente reducidas de agua. Consecuentemente, los costos de recuperación de ácido y solvente, especialmente la separación de agua y mezclas ácidas, son menos gravosos.

Una mejora adicional de la presente divulgación con respecto al proceso de filtración es la reducción del volumen de solvente utilizado para entrar en contacto con el jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina 268. Cuando se llevó a cabo la precipitación de hemicelulosa y lignina del jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina 268 que tenia un contenido de sólidos disueltos de un 40%, se agregaron de 3 a 4 partes de acetato de etilo a una parte de jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina 268 para extraer el agua y producir un precipitado filtrable. En la presente divulgación, únicamente una parte de acetato de etilo se agrega a una parte de jarabe concentrado de hemicelulosa y lignina 268 que tiene un contenido de sólidos disueltos de un 52%. La división de fases posterior provocó la separación deseada de hemicelulosa y lignina insoluble en solvente orgánico de las sales de acetato acuosas y la lignina soluble en solvente orgánico con mucho menos acetato de etilo. La presente divulgación supera un costo mayor al obviar la dilución del ácido acético con agua y los costos elevados en energía y equipamiento asociados con la recuperación del ácido acético de esta corriente en concentraciones adecuadas para el recielaje. Además, cuando se emplea la etapa de precipitación en agua del proceso de filtración para recuperar la hemicelulosa para hidrólisis que será utilizada para la fermentación, la concentración de ácido acético en la corriente de hemicelulosa resultante puede hacer que la hemicelulosa sea inadecuada para la fermentación debido a concentraciones inhibidoras de ácido acético. Este problema se mitiga con los presentes métodos.

Una mejora adicional de la presente divulgación sobre el proceso de filtración es que obvia la formación de emulsión en la recuperación a base de solvente de ácido acético a partir de una fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar 322. En el proceso basado en la filtración, un mayor contenido de agua en la fracción enriquecida en hemicelulosa/ azúcar provoca la formación de una emulsión insoluble si se realiza el intento de extraer ácido acético con un solvente. La presente divulgación utiliza un contenido reducido de agua por lo que la formación de emulsión no tiene lugar.

Otra mejora de la presente divulgación sobre el proceso de filtración es la recuperación de dos fracciones de lignina, lignina soluble en solvente orgánico y lignina soluble en solvente no orgánico. Puede esperarse que estas nuevas fracciones de lignina tengan diferentes propiedades; de hecho, puede esperarse gue las fracciones de lignina correspondientes de cualquier biomasa lignocelulósica tengan propiedades únicas con respecto a la biomasa fuente.

Hidrólisis de ácido acético. La figura 2 ilustra un aspecto de la invención que se refiere a la separación y recuperación de hemicelulosa y lignina de una biomasa lignocelulósica 10 que utiliza ácido acético y solvente orgánico miscible en ácido C1-C2. Este proceso se ilustra con ácido acético como el ácido C1-C2 y acetato de etilo como el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 como un proceso preferido, no obstante, también puede utilizarse ácido fórmico o mezclas de ácido fórmico y acético como sustitutos para el ácido acético y también pueden utilizarse otros solventes orgánicos .miscibles en ácido C1-C2 como sustitutos para el acetato de etilo.

La biomasa lignocelulósica 10, ejemplificada por rastrojo de maíz se mezcla con el ácido acético en la etapa 200. La relación final del ácido acético con respecto a la biomasa lignocelulósica debe encontrarse preferentemente en el intervalo de 3:1 a 5:1 en una base p:p de sólidos ácido:seco que excluye el contenido de agua del ácido acético y la biomasa lignocelulósica. Las relaciones bajas y altas de ácido acético con respecto a sólidos secos funcionarán pero no son tan económicas. La concentración de ácido acético que debe utilizarse varia en función del contenido de humedad de la biomasa lignocelulósica 10 mientras se logre la relación mencionada anteriormente de ácido acético con respecto a sólidos secos. Con la biomasa lignocelulósica de rastrojo de maíz 10 secada hasta un contenido de humedad de aproximadamente un 8%, 4.5 litros de ácido acético al 70% por kilogramo de biomasa fueron adecuados.

Cuando se utiliza ácido fórmico, el contenido de agua debe ser menor para lograr una solubilización eficaz de lignina. Las concentraciones de ácido fórmico de un 80 a un 90% funcionan bien mientras que contenidos mayores de agua no lo hacen. Dado que el ácido acético es más hidrófobo tolera más agua para solubilizar la misma cantidad de lignina. En la etapa 205 la biomasa lignocelulósica acidificada 10 se calienta a una temperatura y durante un tiempo suficiente para solubilizar hidroliticamente una primera fracción de hemicelulosa y lignina a partir de la biomasa 10 lo que forma una primera mezcla de hidrólisis 206. Preferentemente, el calentamiento 205 se realiza con agitación o con agentes de agitación físicos para aplicar fuerza mecánica a la biomasa lignocelulósica 10 durante el proceso de calentamiento e hidrólisis 200/205. Opcionalmente, en ciertas realizaciones, el ácido acético utilizado en la hidrólisis inicial 200/205 puede complementarse con no más de un 0.25% a un 1% p/v de un ácido mineral como HCl o ácido sulfúrico. La inclusión de pequeñas cantidades de ácido mineral resulta en una hidrólisis y solubilización mejorada de hemicelulosa, no obstante, también conduce a una degradación de algunos de los azúcares C5 solubilizados y a un contenido de productos inorgánicos (cenizas) superior, especialmente de la fracción de hemicelulosa que será obtenida. Además, si se desea complementar el ácido acético con ácido sulfúrico, además es necesario neutralizar el ácido sulfúrico y recuperarlo como sal de sulfato. El azufre residual no es compatible con ciertos catalizadores que pueden utilizarse para la conversión química de azúcares que pueden ser deseables en ciertas operaciones de biorrefinería, y además pueden provocar la formación de ésteres de sulfato que pueden interferir con etapas enzimáticas posteriores mediante el uso de enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas y estearasas como se describe a continuación en la solicitud provisional pendiente No. 61/538,211 titulada Cellulolytic Enzyme Compositions and Uses Thereof. Por consiguiente, en algunas realizaciones el ácido sulfúrico se excluye específicamente de las etapas de hidrólisis ácida 205 y 215.

La temperatura y condiciones de tiempo para la liberación hidrolítica de hemicelulosa y lignina son críticas. Si la temperatura es demasiado baja o el tiempo es demasiado corto, habrá una liberación hidrolítica de hemicelulosa y lignina insuficiente. Se descubrió de forma inesperada que la sobrehidrólisis es perjudicial para la recuperación de materiales útiles. Si la temperatura es demasiado alta o el tiempo es demasiado prolongado, puede ocurrir una hidrólisis indeseada de celulosa y hemicelulosa a monosacáridos y se formarán otros productos de reacción que interfieren con la precipitación posterior de la hemicelulosa y lignina, lo que conduce a la formación de un precipitado gomoso cuando las temperaturas y/o tiempos de reacción son excesivos. La temperatura debe encontrarse en el intervalo de 120 a 280°C y el tiempo debe encontrarse en el intervalo de 5 a 40 minutos. En una realización de laboratorio con ácido acético al 70%, la temperatura se elevó a 165°C en 10 minutos seguida por una reducción rápida a una temperatura de 150°C durante 3 minutos con enfriamiento gradual a partir de entonces a 100°C durante un periodo de 30 minutos. En una realización de planta industrial, se utiliza una temperatura de 165°C durante un periodo de 1 a 10 minutos.

La primera etapa de hidrólisis 200/205 forma la primera mezcla de hidrólisis 206 que contiene un primer hidrolizado soluble 207 enriquecido en hemicelulosa y lignina y una fracción de residuo lignocelulósico insoluble. En la etapa 210 estos se separan mediante una téenica adecuada como filtración o centrifugación. El material sólido se recupera como una primera torta lignocelulósica 208 que se encuentra al menos parcialmente reducida en hemicelulosa y lignina y que contiene celulosa al menos parcialmente acilada (por ejemplo, ásteres de acetil celulosa o ásteres de for il celulosa para el ácido acético y fórmico, respectivamente). En la etapa 215, la primera torta lignocelulósica recuperada 208 se lava meticulosamente con ácido acético para liberar de forma adicional la hemicelulosa y lignina unidas. Preferentemente, el ácido acético utilizado para el lavado se calienta a una temperatura de aproximadamente 40 a 50°C. Opcionalmente, pero no necesariamente, el lavado con ácido de la primera torta lignocelulósica 208 puede incluir una segunda ronda de tratamiento con calor mediante el uso de las mismas condiciones de ácido y calor que se utilizaron en la primera ronda en las etapas 200/205 mencionadas anteriormente en la presente. El hecho de que el lavado con ácido 215 deba realizarse a temperaturas elevadas o no depende del contenido de hemicelulosa y lignina y de la estructura en la biomasa lignocelulósica 10. Cuando la biomasa lignocelulósica 10 tiene un contenido alto de lignina o hemicelulosa como en el caso de fuentes leñosas, entonces se prefiere una segunda ronda de calentamiento 220. La concentración de ácido acético es preferentemente más alta en esta etapa de lavado 215 que en la etapa de hidrólisis 200 debido a la dilución con el agua liberada por la hidrólisis y del agua liberada por la torta lignocelulósica 208 del tratamiento inicial con el ácido acético utilizado en la etapa 200. En el caso del rastrojo de maiz como biomasa lignocelulósica 10, se utilizó ácido acético al 90% en la etapa de lavado con ácido 215. El lavado con ácido produce una mezcla de lavado ácida 209 que en la etapa 225 se recupera mediante centrifugación o filtración en una fracción de lavado ácida liquida 212 que contiene hemicelulosa y lignina adicional separadas de la torta lignocelulósica lavada con ácido 214, a la que se le redujo la mayor parte de hemicelulosa y lignina y que contiene celulosa acilada de forma adicional.

En un proceso preferido, en la etapa 230 la primera fracción de hidrolizado 207 y la fracción de lavado ácida 212 se mezclan para formar una solución combinada de solubles de ácido acético 219. Esta solución combinada de solubles de ácido acético 219 después preferentemente se evapora en la etapa 250 para lograr un contenido de sólidos disueltos de al menos un 30% p/vol., lo que forma un hidrolizado concentrado soluble 221.

Por separado, en la etapa 240, la segunda torta lignocelulósica 214 se lava con acetato de etilo u otro solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 para eliminar el ácido acético y la hemicelulosa y lignina restantes de la segunda torta lignocelulósica 214. La cantidad total de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 que se debe utilizar en el lavado 240 de la segunda torta lignocelulósica 214 es preferentemente aproximadamente la misma cantidad que la segunda cantidad de ácido C1-C2215 utilizado en la segunda etapa de hidrólisis 220. El lavado puede realizarse con el volumen total en el lote, o preferentemente el volumen total se aplica en incrementos separados para aximizar la eliminación del ácido acético y la hemicelulosa y lignina retenidas. La cantidad de solvente orgánico miscible en ácido acético que debe utilizarse para el lavado debe ser suficiente para lavar profundamente el ácido acético de la pulpa de celulosa acetilada. Un lavado total de al menos 3 volúmenes (litros) de solvente orgánico miscible en ácido acético por peso (kg) de pulpa es adecuado. Preferentemente el lavado total se realiza en tres o más etapas separadas sucesivas para la administración de la cantidad de lavado total.

El lavado resulta en una fracción de lavado liquida de solvente orgánico/ácido acético 216 que se separa en la etapa 245 de la segunda torta lignocelulósica 214 mediante filtración. El medio de filtración empleado en la etapa 245 debe tener poros lo suficientemente grandes para permitir el pasaje de la hemicelulosa y lignina insolubles con el lavado orgánico, y suficientemente pequeños para retener la masa sólida de fibras de celulosa de peso molecular más alto en la torta lavada con ácido 214 que después de la filtración queda retenida como la pulpa de celulosa de acilo lavada con solvente orgánico 218. Un medio de filtración adecuado para esta etapa de filtración 245 fue uno con tamaños de poro correspondientes a un filtro de malla 60 (diámetro de tamiz nominal de 250 micrones).

En la etapa 255 la fracción de lavado de solvente orgánico/ácido acético 216 se combina en volúmenes más o menos iguales con el hidrolizado concentrado 221 lo que forma una mezcla de ácido C1-C2/ solvente orgánico 257, que se agita durante un tiempo suficiente para disolver cualquier hemicelulosa y lignina insoluble obtenidas en el lavado de solvente orgánico 216. La mezcla de ácido C1-C2/ solvente orgánico 257 después se evapora en la etapa 265 hasta un contenido de sólidos disueltos de un 40% p/vol. para formar una fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268.

En un primer proceso preferido para el procesamiento adicional de la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268, se agrega una segunda cantidad de solvente orgánico miscible en C1-C2 a la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 en una cantidad suficiente para precipitar la hemicelulosa y la lignina. A un contenido de sólidos disueltos de un 40% con una mezcla de ácido acético y acetato de etilo como el sistema de solvente para la fase acuosa 268, una relación de 1 parte de fase acuosa 268 a 3 a 4 partes de acetato de etilo fue suficiente para producir un precipitado filtradle. En la etapa 275 este precipitado de hemicelulosa y lignina 277 se separa del filtrado de acetato de etilo 278. Opcionalmente, el precipitado de hemicelulosa y lignina 277 puede lavarse con cantidades adicionales de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 para eliminar los ácidos C1-C2 residuales.

El precipitado de hemicelulosa y lignina después se mezcla con agua tibia en la etapa 280 para disolver la hemicelulosa lo que forma una fracción acuosa de hemicelulosa 289, y una fracción de lignina insoluble 287, que se separan mediante filtración o centrifugación en la etapa 285. Opcionalmente, la fracción de lignina insoluble 287 puede lavarse con una segunda ronda de agua tibia para extraer más hemicelulosa del precipitado. De forma sorprendente, se descubrió que la temperatura y enfriamiento del agua utilizada para la solubilización de la hemicelulosa y la separación de la lignina del precipitado es de critica importancia. El calentamiento del precipitado de hemicelulosa y lignina con agua a 95°C y el enfriamiento posterior a 60°C permitió que la lignina se fundiera en partículas más grandes que son mucho más fáciles de filtrar y lavar. En contraste, el calentamiento a 120°C hizo que la lignina formara una masa sólida que causó problemas con el manejo y la recuperación de la hemicelulosa.

En la realización global descrita en la figura 2 el ácido Ci—C2 (ácido acético) y el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 (acetato de etilo) se recuperó del proceso y se recieló para el uso continuado. Por tanto, por ejemplo, el filtrado de acetato de etilo recuperado 278 se evapora en la etapa 290 para recuperar el acetato de etilo, dejando atrás un residuo oscuro 291. En la etapa 295 el acetato de etilo y el ácido acético recuperados mediante evaporación en la etapa 290 se combinan con el filtrado de ácido acético/acetato de etilo 261 y el ácido acético recuperado de la evaporación del hidrolizado en la etapa 250. Estos materiales combinados después se separan mediante destilación en la etapa 298 para recuperar el ácido acético fuera del acetato de etilo.

Casi todo el ácido acético utilizado en el proceso descrito en la figura 2 se utiliza en las corrientes que pueden separarse fácilmente mediante destilación simple del solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 en lugar de agua. La combinación de ácido acético y acetato de etilo fue particularmente eficaz. Los solventes miscibles en ácido C1-C2 utilizados en el proceso se seleccionan por su capacidad de precipitar la lignina y los oligosacáridos asi como algunos monosacáridos del ácido acético. También pueden separarse fácilmente del ácido acético mediante destilación simple. Los procesos de la téenica anterior donde el ácido acético o ácido fórmico se utilizan en combinación con agua para separar la hemicelulosa y la lignina de la pulpa de celulosa sufren la desventaja de crear mezclas azeotrópicas acuosas ácidas que son más difíciles de recuperar y reciclar para un uso continuado. Los procesos de la presente invención dependen principalmente de la combinación del ácido acético con un solvente orgánico iscible.

La figura 9 ilustra un segundo proceso preferido para procesar de forma adicional la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 de la invención que se refiere a la separación y recuperación de azúcares C5 y C6, lignina soluble en solvente orgánico, lignina insoluble en solvente orgánico y sales de acetato a partir de una biomasa lignocelulósica, particularmente cuando se utiliza ácido acético como el ácido C1-C2. En una realización ejemplar del segundo proceso preferido, el rastrojo de maíz que contiene un 8% de humedad se hidrolizó a 163-171 °C durante 10 minutos en un reactor giratorio con solución de ácido acético al ~70%. El reactor se enfrió y el rastrojo hidrolizado se prensó y filtró hasta proporcionar el primer hidrolizado 207 (Figura 2) y la torta de lignocelulosa acetilada 208. La torta de lignocelulosa acetilada 208 se puso en contacto con una segunda cantidad de ácido acético a 60 °C y se filtró para proporcionar la torta de lignocelulosa acetilada lavada con ácido 214 y el lavado ácido 212. La torta de acetil celulosa lavada con ácido 214 se puso en contacto dos veces con acetato de etilo y se filtró para producir pulpa de acetil celulosa lavada con acetato de etilo 218 y lavado de acetato de etilo 216. El primer hidrolizado ácido se combinó con el lavado ácido para formar solubles acéticos combinados 209. El ácido acético se recuperó a partir de solubles acéticos combinados mediante evaporación, lo que formó el Evaporado (concentrado) 221. Este se combinó con lavado de acetato de etilo 216 para formar una mezcla de acetato de etilo:ácido acético 50:50 257. El acetato de etilo se recuperó mediante evaporación 265, lo que formó la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 enriquecida en hemicelulosa y lignina.

En la segunda realización preferida 300 mostrada en la figura 9 para efectuar la separación de la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 mediante separación liquido/liquido, la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 se puso en contacto con la primera cantidad de acetato de etilo 310 de forma tal que de 5 a 7.5 partes por volumen de acetato de etilo u otro solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 se agregaron a 5 partes por volumen de la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 para eliminar el ácido acético mediante separación liquido/liquido De forma sorprendente, se descubrió que a estas relaciones de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 con respecto a la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268, tuvo lugar una separación de fases sin la formación de un precipitado. Además, se descubrió que la cantidad de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 es de critica importancia en la provocación de una separación de fases y en la prevención de la formación de un precipitado. Para la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268, una relación de 1 a 1.5 partes por volumen de acetato de etilo a 1 parte por volumen de fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 fue suficiente para inducir la separación de fases sin la formación de un precipitado. De forma importante, en estas condiciones se utilizó mucho menos solvente que para la primera realización ilustrada en la figura 2. El uso de una cantidad menor de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 para la extracción de ácido acético no solo resultó en una separación liquido/liquido, sino que redujo el gasto de recuperación de solvente posterior debido al volumen más pequeño de solvente utilizado.

La mezcla se separó rápidamente en dos fases: una fase acuosa pesada gomosa que contenía la mayoría de los azúcares y la lignina insoluble en solvente orgánico (aproximadamente la mitad de la lignina); y una fase de sobrenadante orgánico que contenía la lignina soluble en solvente orgánico, la fracción de sales de acetato, el acetato de etilo y el ácido acético. La fase de sobrenadante orgánico se decantó de una fase acuosa pesada. La fase acuosa pesada (una parte) se puso en contacto (lavó) con acetato de etilo u otro solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 (aproximadamente una parte) y se mezcló a 50 °C. La mezcla se separó nuevamente, lo que formó un segundo sobrenadante orgánico sobre la fase acuosa pesada; el segundo sobrenadante se decantó. El acetato de etilo (aproximadamente una parte) se puso en contacto nuevamente con la fase acuosa pesada con mezcla a 50 °C. La mezcla se separó nuevamente, lo que formó un tercer sobrenadante orgánico y una primera fase que comprende una fase acuosa pesada lavada 312. El tercer sobrenadante orgánico se decantó. Finalmente, la fase acuosa pesada lavada 312 contenia la mayor parte de los azúcares C5 y C6 y aproximadamente la mitad de la lignina se redujo en ácido acético. La fase de sobrenadantes orgánicos ricos en solvente contenia las ligninas orgánicas solubles, las sales de acetato, el ácido acético y el acetato de etilo. Opcionalmente, la fase acuosa pesada lavada 312 puede lavarse con cantidades adicionales del solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 para eliminar el ácido acético residual. Casi todo el ácido acético utilizado en el proceso descrito en la figura 9 se utilizó en las corrientes que pueden separarse fácilmente mediante destilación simple del solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 en lugar de agua. La combinación de ácido acético y acetato de etilo fue particularmente eficaz. El solvente miscible en ácido C1-C2 utilizado en el proceso se seleccionó por su capacidad para inducir la separación de fases. Puede obtenerse una ganancia económica sustancial mediante la partición del acetato de etilo y el ácido acético fuera de la fase acuosa rica en azúcar.

Aún con referencia a la figura 9, los sobrenadantes orgánicos se combinaron y mezclaron para formar la fase de sobrenadantes orgánicos (segunda fase) 316; se formó una pequeña cantidad de precipitado alquitranado, que se separó y agregó a la fase acuosa pesada lavada 312. El ácido acético se particionó con acetato de etilo en los sobrenadantes orgánicos, lo que resultó en una disminución de la cantidad de ácido acético en la fase acuosa pesada lavada que contiene azúcar y lignina 312 (primera fase).

Fraccionamiento de lignina. La separación de fases en una primera fase (fase acuosa pesada lavada) y una segunda fase (fase de sobrenadantes orgánicos) resulta en el fraccionamiento de la lignina en fracciones de lignina soluble en solvente orgánico y lignina insoluble en solvente orgánico. El fraccionamiento de la lignina de rastrojo de maíz en lignina soluble en solvente orgánico y lignina insoluble en solvente orgánico proporcionó fracciones de lignina de las que puede esperarse que tengan ciertas propiedades con base en el rastrojo de maíz. Dado que la lignina es un polímero heterogéneo que carece de una estructura principal definida, la caracterización de las ligninas se basa en las propiedades o fuente en lugar de la estructura. El presente proceso no utiliza ácido sulfúrico, por lo que las fracciones de lignina que se producen no tienen azufre. Etapas de proceso similares pueden aplicarse a las ligninas a partir de otras fuentes. Puede esperarse que las propiedades de la lignina soluble en solvente orgánico y la lignina insoluble en solvente orgánico de cada fuente, asi como las cantidades relativas y enlaces de alcohol de p-hidroxifenilo, alcohol de guaiacilo y alcohol de siringilo, tengan ciertas propiedades con base en y quizá de forma única con respecto a la fuente de lignina. Las fuentes de lignina incluyen ligninas de madera blanda de coniferas como picea, cedro, pino y secoya; ligninas de madera dura como ligninas de arce, álamo, roble, eucalipto y tilo; ligninas de cañas como ligninas de paja, maíz, cañóla, avena, arroz, sorgo, trigo, soja, cebada, espelta y algodón; ligninas de grama como ligninas de bambú, miscanthus, caña de azúcar, pasto varilla, pasto cinto, gramíneas.

Recuperación de lignina insoluble en solvente orgánico. El contacto de la fase acuosa pesada lavada (primera fase) con agua indujo la coagulación de la lignina donde una fase enriquecida en azúcares C5 y C6 (fase de hemicelulosa soluble) se separó de la lignina insoluble en solvente orgánico coagulada. La fase acuosa pesada lavada 312 (parte 1) se puso en contacto con agua 320 (2 partes), después de lo cual se formó un precipitado mullido de lignina insoluble en solvente orgánico. La mezcla se dejó asentar después de lo cual se observó un líquido marrón claro (aproximadamente 2.5 partes) y un precipitado (aproximadamente 0.4 partes). La fase superior puede decantarse y el precipitado lavarse con 0.6 partes de agua. El precipitado puede filtrarse y el agua de lavado combinarse con el líquido marrón claro. En una práctica preferida, después de la etapa de contacto de la fase acuosa pesada lavada 312 (1 parte) con agua 320 (2 partes), la mezcla se calentó a 95 °C con mezcla, lo que facilitó la coagulación de la lignina precipitada. La mezcla se dejó enfriar a 50 °C con mezcla y después se filtró 328. La temperatura y enfriamiento del agua utilizada para la solubilización de la hemicelulosa y la separación de la lignina del precipitado es de crítica importancia. El calentamiento del precipitado de hemicelulosa y lignina con agua a 95 °C y después el enfriamiento a 50 °C permitió que la lignina se fundiera en partículas más grandes que eran mucho más fáciles de filtrar y lavar que el precipitado mullido de lignina insoluble en solvente orgánico que se formó cuando la fase acuosa pesada lavada 312 (1 parte) se puso en contacto con agua 320 (2 partes). Después de la etapa de filtración 328, se obtuvo una fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar 322 (3.3 partes) y se obtuvo una torta de lignina. La torta de lignina se lavó con 0.8 partes de agua 325 y se secó para proporcionar la lignina insoluble en solvente orgánico 326.

Recuperación de monosacáridos C5 y C6 y ácido acético.

Parte de la pequeña cantidad de ácido acético en la fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar 322 se encontró presente en la forma de sales de acetato. Las sales de acetato en la fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar 322 se convirtieron en ácido acético mediante la adición de ácido sulfúrico a la fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar 322 para convertir las sales de acetato en ácido acético libre. La mezcla después se puso en contacto con el mismo volumen de solvente orgánico miscible en ácido acético (acetato de etilo) en la etapa 340. Se formaron dos fases liquidas y se separaron fácilmente sin formación de emulsión. Se formó una fase acuosa que comprendía azúcares C5 + C6 reducidos en ácido acético 342 (tercera fase) y una fase orgánica que comprendía acetato de etilo con ácido acético recuperado 346 (cuarta fase). En la presencia de grandes cantidades de agua, esta separación de fases sería poco práctica debido a la formación de emulsión. La fase de azúcar C5 + C6 reducida en ácido acético 342 puede volverse a extraer con acetato de etilo. La fase de azúcar C5 + C6 reducida en ácido acético 342 se encontraba en forma de una píldora termoplástica enriquecida en azúcares C5 y C6 y que era adecuada para la fermentación como SHF. El ácido acético y el acetato de etilo en 346 pueden recuperarse fácilmente por separado para el recielaje en el proceso.

Separación de la segunda fase que comprende los sobrenadantes orgánicos La segunda fase que comprende los sobrenadantes orgánicos 316 se sometió a evaporación 330 para recuperar el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 y el ácido acético en una corriente 336 separada de una fase acuosa que comprende jarabe de sobrenadante acuoso 332. El ácido acético y el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 se recuperaron del proceso y se recielaron para el uso continuado como se explica en la realización global ilustrada en la figura 2. El solvente miscible en ácido C1-C2 se separó fácilmente del ácido acético mediante destilación simple. Los procesos de la téenica anterior donde el ácido acético o ácido fórmico se utilizan en combinación con agua para separar la hemicelulosa y la lignina de la pulpa de celulosa sufren la desventaja de crear mezclas azeotrópicas acuosas ácidas que son mucho más difíciles y costosas de recuperar y reciclar para un uso continuado. Los procesos de la presente invención dependen principalmente de la combinación de ácido acético con solvente orgánico miscible en ácido C1-C2, por lo que se obvia los azeótropos acuosos y facilitan una recuperación y reciclaje mucho más económico del ácido y del solvente.

El jarabe de sobrenadante acuoso 332 (una parte) se puso en contacto con agua 350 (una parte) para inducir la separación de fases para formar la quinta fase que comprende la fase acuosa enriquecida en sales de acetato y con un contenido reducido en lignina soluble en solvente orgánico 352 y la sexta fase que comprende una fase enriquecida en lignina soluble en solvente orgánico 356. La mezcla de dos fases se calentó a 90 °C con agitación para evaporar el acetato de etilo. El calentamiento también promovió la extracción de los componentes solubles en agua, como sales de acetato en la quinta fase acuosa. La mezcla de dos fases se enfrió a 40 °C y la quinta fase acuosa 352 se eliminó y concentró mediante evaporación para enriquecer las sales de acetato como acetato de potasio. En una realización preferida, la fase de lignina soluble en solvente orgánico se puso en contacto con agua nuevamente y se calentó. En esta realización, los lavados de agua se combinaron con la quinta fase acuosa y se evaporaron. Esta fase acuosa puede secarse y utilizarse como fertilizante. La sexta fase de lignina soluble en solvente orgánico lavada con agua se enfrió, molió y secó para proporcionar lignina insoluble en solvente orgánico 356. La fracción de lignina obtenida mediante extracción con acetato de etilo se caracterizó por tener un indice de depurador radical (RSI) alto, lo que hace que esta lignina sea útil como un agente estabilizador.

Al llevar a cabo las separaciones liquido/liquido en la forma descrita en la presente divulgación, el rastrojo de maíz cortado u oottrraa bbiioommaassaa lignocelulósica pueden fraccionarse en productos que comprenden azúcares C5 + C6 reducidas en ácido acético 342, una lignina insoluble en solvente orgánico 326, una lignina soluble en solvente orgánico 356 y una solución de sal de acetato acuosa 352. Además, se evitó la formación de emulsión, se utilizaron volúmenes de acetato de etilo sustancialmente reducidos y el acetato de etilo y el ácido acético se recuperaron fácilmente. Casi todo el ácido acético utilizado en el proceso descrito en la figura 9 se utilizó en las corrientes que pueden separarse fácilmente mediante destilación simple del solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 en lugar de agua.

La combinación de ácido acético y acetato de etilo fue particularmente eficaz. Los solventes miscibles en ácido C1-C2 utilizados en el proceso se seleccionan por su capacidad de precipitar la lignina y los oligosacáridos asi como algunos monosacáridos del ácido acético y por su facilidad de separación del ácido acético mediante destilación simple.

Análisis composicional de la fracción de hemicelulosa soluble. La muestra de la fracción de hemicelulosa soluble 289 obtenida mediante el método que antecede se sometió a análisis químico detallado para determinar el contenido de azúcar monomérico, azúcar hidrolizable en ácido, lignina y ácido acético, así como otros sustituyentes elementales (véase la tabla 21, ejemplo 1). De los carbohidratos totales en forma de oligómeros hidrolizables en ácido y azúcares monoméricos, aproximadamente un 19% fueron azúcares C5 y C6 monoméricos y aproximadamente un 81% se encontraban en forma de oligómeros hidrolizables (oligómeros de hemicelulosa). Juntos estos representaron un 68% de la masa total de la muestra. El contenido de lignina fue únicamente de un 0.28% de la masa. Una pequeña cantidad de ácido acético se retuvo mediante el proceso, lo que representa aproximadamente un 1.2% de la masa. La mayoría de los organismos en la fermentación para producir etanol pueden tolerar hasta un 1% p/v de ácido acético, pero tienen preferencia por concentraciones muy por debajo de un 0.5% p/v a pH de aproximadamente 6. Si se desea, el contenido de ácido acético puede reducirse mediante el lavado del precipitado de hemicelulosa/lignina 277 con acetato de etilo u otro solvente orgánico miscible en ácido acético antes de su disolución en agua en la etapa 280. En este caso, se prefiere el uso de un solvente miscible en ácido acético menos polar, como metil etil cetona, propanol y similares de forma tal de evitar la eliminación de los azúcares monoméricos de la fracción de hemicelulosa soluble 289.

A partir de una práctica ejemplar de lo que antecede, la distribución de masa fue la siguiente: De 1.5kg de rastrojo de maíz cortado a un 92% de contenido de sólidos (1380 g de material de partida de sólidos) se recuperaron aproximadamente 810 gramos en la pulpa lavada con acetato de etilo 218 de los cuales aproximadamente un 80% se encontraba en forma de celulosa y también contenia un 10% de pentosas. La fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina 268 fue de aproximadamente un 50% de sólidos disueltos y contenia aproximadamente un 10% de azúcares y un 60% de lignina. A partir de esta, aproximadamente 525g del material de partida de sólidos se recuperó en la fracción de precipitado de hemicelulosa y lignina 277, de los cuales aproximadamente un 45% se encontraba en forma de hemicelulosa 289 y el resto en forma de lignina 287.

Análisis composicional de la pulpa celulósica El contenido de celulosa y lignina de la pulpa de celulosa 218 se analizó con el método de análisis de fibras ANKOM™ (Vogel etal 1999) y el método estándar definido por el Laboratorio Nacional de Energía Renovable (NREL), análisis composicional de materias primas lignocelulósicas (Sluiter etal 2010). El análisis de varias fracciones húmedas y secas de la pulpa de celulosa 218 obtenida a partir del procesamiento de la biomasa de rastrojo de maíz 10 como se describe anteriormente se proporciona en las tablas 1 y 2. El análisis mediante el método ANKOM™ (tabla 1) indica que la celulosa representó de un 85.5 a un 88.4% de la materia seca total con hemicelulosa presente en el intervalo de un 0.7 a un 3.5% y lignina en el intervalo de un 1.0 a un 2.3%. En las muestras tratadas con una combinación de ácido acético y ácido sulfúrico, se obtuvo una concentración mayor de celulosa con un aumento en el ácido sulfúrico mientras que la hemicelulosa se redujo, consecuentemente con una mayor hidrólisis de hemicelulosa. Por comparación, las muestras analizadas con el método NREL (tabla 2), indican la presencia de una concentración inferior de celulosa en el intervalo de un 62.2 a un 77.3%, mientras que la hemicelulosa y la lignina fueron superiores con este método (de un 3.2 a un 15.8% y de un 1.0 a un 5.8%). Cuando las muestras se trataron con una combinación de ácido acético y sulfúrico, también se observó un aumento en el contenido de celulosa con una reducción en paralelo en la hemicelulosa. Mientras que los análisis con el método ANKOM™ indicaron alguna variabilidad en la pulpa y un contenido menor en la composición de celulosa global cuando se comparó con el método NREL, las mediciones de equilibrio de material indicaron consistencia para la mayoría de los sólidos mediante ambos métodos (intervalo de un 94.1 a un 108.8% con un promedio de un 99.1%).

Tabla 1 Análisis composicional de pulpa de celulosa 218 por el metodo de análisis de fibra Tabla 2 Análisis composicional de pulpa de celulosa 218 por el método NREL Tratamiento de la hemicelulosa soluble 289 o la pulpa de celulosa 218 para preparar un jarabe enriquecido en C6 o C5. La pulpa de celulosa 218 es principalmente celulosa (de un 62.2% a un 88.4% en peso en función del método de análisis y la muestra analizada) que al digerirse por un cóctel de enzimas celuloliticas adecuadas debería producir un jarabe enriquecido en azúcares C6, principalmente glucosa. La fracción enriquecida en hemicelulosa solubilizada 289 es una corriente de hemicelulosa casi carente de lignina y está compuesta por una mezcla de monómeros y oligómeros de xilosa con rastros de arabinosa, glucosa y otros azúcares de hexosa. Cuando se digiere totalmente por un cóctel de enzimas hemicelulolíticas adecuadas la fracción enriquecida en hemicelulosa soluble 289 debería producir un jarabe enriquecido principalmente en azúcares C5. Los términos "enzima celulolítica" y "enzima hemicelulolítica" y sus cócteles, significan una o más (por ejemplo, "varias") enzimas que hidrolizan un material que contiene celulosa o hemicelulosa, respectivamente. Los ejemplos de dichas enzimas se proporcionan en la solicitud provisional de Estados Unidos pendiente No. 61/538,211 titulada Cellulolytic Enzyme Compositions and Uses Thereof. No obstante, los presentes solicitantes descubrieron que los cócteles de enzimas celuloliticas y hemicelulolíticas convencionales disponibles para la digestión de celulosa y hemicelulosa, no funcionaron de forma eficaz con las fracciones de pulpa de celulosa y hemicelulosa soluble preparadas mediante el tratamiento con ácido acético del rastrojo de maíz como la biomasa lignocelulósica. Los resultados iniciales demostraron que la hidrólisis enzimática del jarabe C5 solubilizado y la pulpa C6 procedió lentamente, incluso con una carga alta de enzimas, y la cantidad de monosacáridos liberados fue menor a lo previsto.

Hidrólisis de hemicelulosa 289 inicial. Se llevó a cabo hidrólisis enzimática de la fracción de hemicelulosa soluble 289 para convertir los oligómeros de hemicelulosa soluble a monómeros para su fermentación. El análisis del total de carbohidratos de esta fracción a través del método de fenol-ácido sulfúrico indicó una concentración total de carbohidratos de un 65% p/p con base en una masa seca. La hidrólisis enzimática inicial empleó cócteles de enzimas comerciales disponibles en Novozymes A/S (Bagsvaard, Dinamarca) con los nombres comerciales Cellic CTec (celulasa(s) y Viscozyme L (pectinasa(s)) mezclados en una relación 4:1 que se utilizó a una velocidad de dosificación enzimática de un 2% p/p de base seca de sólidos de hemicelulosa soluble 289 diluidos hasta un 10% p/vol con 50 mM de amortiguador de citrato a pH 5.0. Las muestras se incubaron a 50°C durante cinco dias. Los resultados se proporcionan en la tabla 3 a continuación. Estos indican un rendimiento de un 82.7% de monómeros del total de carbohidratos después de la hidrólisis enzimática. Solamente aproximadamente un 80% del total de carbohidratos se encontró en la forma de oligómeros de hemicelulosa hidrolizable en ácido, por lo que el porcentaje de oligómeros de hemicelulosa convertido a azúcares monoméricos fue solamente de aproximadamente un 65%.

Tabla 3 Resultados de la hidrólisis enzimática de hemicelulosa a partir de rastrojo de maíz Hidrólisis de la pulpa de celulosa 218 inicial. También se llevó a cabo la hidrólisis enzimática de la pulpa de celulosa 218 preparada tal como se describió anteriormente. Se utilizó un cóctel de dos enzimas comerciales de Novozymes (Cellic CTec2 (celulasa(s)) Cellic HTec2 (xilanasa(s)) para la hidrólisis enzimática de la fracción de pulpa de celulosa. También se probaron otras mezclas de enzimas comerciales y no comerciales. La pulpa de celulosa 218 analizada por el método de análisis de fibra ANKOM™ tuvo un promedio de un 86.7%, un 1.8% y un 1.7% en una base seca p/p de celulosa, hemicelulosa y lignina, respectivamente, para seis muestras de pulpa de celulosa 218. Se llevó a cabo hidrólisis enzimática volumétrica en ambas cargas de bajos sólidos (10%) y altos sólidos (20%). La hidrólisis enzimática de bajos sólidos produjo una conversión de un 87.8% de la pulpa de celulosa 218 a glucosa y xilosa, mientras que los experimentos de hidrólisis enzimática de altos sólidos con un 20% de carga de sólidos secos proporcionaron una conversión de un 82.6% a glucosa y xilosa (tabla 4). La hidrólisis enzimática en ambos experimentos se llevó a cabo a 50°C durante cinco dias. La dosificación de enzimas para la hidrólisis enzimática de bajos sólidos fue de 12 mg de proteina enzimática/g de sólidos secos de pulpa. Para la hidrólisis enzimática de altos sólidos la dosificación fue de 33 mg de proteina enzimática/g de sólidos secos de pulpa.

Tabla 4 Hidrólisis enzimática de pulpa de celulosa 218 obtenida a partir de rastrojo de maíz en un 10 a un 20 % de sólidos secos Los resultados anteriores mostraron menos conversión de la fracción de hemicelulosa soluble 289 y la fracción de pulpa de celulosa 218 a azúcares monoméricos que es necesaria para hacer que la fermentación posterior sea económicamente práctica. Estos materiales se prepararon mediante exposición de la biomasa al calor en presencia de altas concentraciones de ácido acético (>70 %). Se especuló que puede haberse sustituido algo de los azúcares libres y unidos con grupos acetilo y que esta acetilación puede inhibir al menos parcialmente la actividad enzimática. Para probar esto, las muestras de la pulpa de celulosa 218 se trataron con una base para catalizar la desesterificación del grupo acetato. El resultado se evaluó mediante Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR). La figura 3 ilustra la diferencia en los espectros de FTIR de pulpa de celulosa de rastrojo de maíz (traza superior) y pulpa de rastrojo de maíz tratado con hidróxido de amonio (traza inferior). La figura 4 muestra los espectros de FTIR entre 1150 cm-1 y 2000 c -1, donde se indican tres enlaces importantes de éster representados por el éster C=0 que se extiende en 1725 cm-1, el C-H que se extiende en el grupo -0(C=0)-CH3 en 1366 cm-1 y el -CO- que se extiende del grupo acetilo en 1242 crrrl. La ausencia de un pico en 1700 cm-1 que representa la absorción de un grupo carboxilico confirmó que la muestra tratada con alcalino está libre de ácido acético esterificado.

Fue este resultado que indicó que la hidrólisis de ácido acético de biomasa lignocelulósica 10 conforme a la figura 2 resultó en una pulpa de celulosa 218 que se acetiló. Más generalmente, el tratamiento de una biomasa lignocelulósica 10 por un ácido C1-C2 resulta en una fracción significativa de la pulpa de celulosa 218 asi como también la fracción de hemicelulosa soluble 289 que se acetila por la hidrólisis de ácido C1-C2210 y etapas de lavado 220 (es decir, las fracciones de carbohidratos contendrán ésteres de formilo o acetilo). Por lo tanto, la producción de materia prima adecuada de jarabes de azúcar C5 y C6 para la fermentación mediante digestión enzimática requiere la desacilación de los ésteres antes de, o junto con, la digestión de los polímeros de celulosa u oligómeros de hemicelulosa con los cócteles de enzimas adecuados.

Los ésteres de carbohidratos formilados que se prepararon cuando el ácido C1-C2 es ácido fórmico son termolábiles. Por consiguiente, una pulpa de celulosa formilada 218 o fracción de hemicelulosa soluble 289 puede desformilarse mediante incubación del material en una solución acuosa a una temperatura de 50°C a 95°C durante 0.5 a 4 horas, que es suficiente para desformilar los carbohidratos tal como se describió por ejemplo en Chempolis, Patente Estadounidense No. 6,252,109. No obstante, los carbohidratos acetilados son más estables que los ésteres formilados. Los ésteres de acetilo pueden desacetilarse mediante tratamiento con un alcalino (base). Las bases adecuadas incluyen amoniaco (hidróxido de amonio) y cáustico (hidróxido de sodio). Por consiguiente, la pulpa de celulosa 218 y las fracciones de hemicelulosa soluble se trataron mediante el contacto con bases alcalinas antes de las digestiones enzimáticas. El ácido acético tratado con preparaciones de muestras de pulpa de rastrojo de maíz 218 se diluyó con agua para formar una mezcla de un 8% de sólidos. Se agregó NaOH para ajustar el pH a 13. La mezcla se calentó hasta hervirse, y se mantuvo en ebullición durante 10 min. Se utilizó ácido fosfórico para ajustar el pH a 5.0 después de que la mezcla de reacción alcanzara temperatura ambiente. Se calentó una pulpa de celulosa 218 de control de forma similar al mismo tiempo y con el mismo contenido de sólidos sin tratamiento de hidróxido de sodio o ajuste de pH. Las muestras tratadas con alcalino se ajustaron hasta un 5% de mezcla de sólidos disueltos y se analizaron para detectar el ácido acético con los resultados mostrados en la tabla 5.

Tabla 5 Liberación de ácido acético de la pulpa de celulosa 218 mediante base Los resultados indicaron que se liberó más ácido acético mediante el tratamiento alcalino en comparación con el control sin tratar. El ácido acético que se liberó mediante el tratamiento alcalino templado proporcionó confirmación adicional de que los grupos acetilo se unen mediante enlace covalente a las moléculas de fibras de pulpa de carbohidratos a través de enlaces de éster formados durante las etapas de tratamiento con ácido acético. El grado de esterificación en diversas fracciones de pulpa de celulosa 218 preparadas mediante los procesos descritos en la presente varió de un grado de substitución de 0.05 a 0.2 (es decir, de un 5% a un 20% de los residuos de azúcar son acetilados) que corresponde de un 1.4% a un 6.6% p/p de contenido de acetilo de la masa de la fracción de pulpa de celulosa.

Para confirmar si la desesterificación mejoraría la digestión enzimática, las muestras de pulpa de celulosa 218 tratadas preparadas anteriormente se sometieron a hidrólisis enzimática a un 5% de contenido de sólidos con amortiguador de citrato y una mezcla de enzimas de celulasa comercial de Novozymes (Cellic Ctec). Los tratamientos enzimáticos se llevaron a cabo en una incubadora giratoria (Daigger FinePCR Combi D24) a 50°C durante 96 horas. Se analizaron las muestras tratadas con enzimas para detectar los azúcares mediante HPLC. La tabla 6 proporciona un resumen de los resultados analíticos.

Tabla 6 Impacto de tratamiento base sobre la liberación enzi ática de glucosa des la pulpa de celulosa de rastrojo de maíz 218 Los resultados indicaron que el tratamiento enzimático de pulpa de celulosa 218 desesterificada alcalina resulta en una liberación sustancialmente mayor de glucosa y xilosa. Los resultados respaldaron además el hallazgo de que los ésteres de acetato limitaron el acceso enzimático a la celulosa en las digestiones enzimáticas mencionadas anteriormente mediante el uso de diversas mezclas de enzimas celulolíticas y hemiceluloliticas. Probablemente, mediante la eliminación de ésteres de acetato, las enzimas pueden acceder y unirse al sustrato mejor y, por lo tanto, hidrolizan más polímeros de fibras de pulpa de celulosa 218 y hemicelulosa 289, lo que resulta en una liberación de más glucosa y otros azúcares monoméricos. Los resultados también indican que el calentamiento durante 10 a 30 minutos en un autoclave a 121°C, con amoníaco a una concentración de un 0.1% a un 1%, o a una temperatura inferior a 50°C durante 1 a 10 horas, con amoniaco de un 0.5 a un 5% es suficiente para liberar la mayoría de los grupos acetilo de la pulpa.

Detergentes. Se descubrió además que los detergentes no iónicos pueden aumentar de forma sustancial la actividad de preparaciones enzimáticas hemiceluloliticas y celuloliticas. Las muestras de pulpa de celulosa 218 se trataron con NaOH alcalino seguidas de tratamiento con una mezcla de celulasa de enzima comercial. Se analizaron varios químicos detergentes, incluido Tween-20 (monolaurato de sorbitán polioxietilenado), Tween-40 (monopalmitato de sorbitán polioxietilenado), Tween-60 (monoestearato de sorbitán polioxietilenado) y tritón X-100 (polietoxilato 4-octilfenol) para determinar su función sobre la hidrólisis enzimática de la pulpa. La reacción de enzimas contenía un 5% de sólidos de pulpa p/p de 50 mM de amortiguador de citrato, la mezcla de enzimas de celulasa comercial Cellic Ctec II, con o sin detergentes, por ejemplo, Tween-40 a un 0.2% p/p de contenido Después de 6 días, se analizaron las mezclas resultantes para detectar la glucosa mediante HPLC.

Tabla 7 Impacto de Tween 40 sobre la liberación de glucosa de la pulpa de celulosa 218 En otra prueba, la pulpa celulósica 218 de rastrojo de maíz tratado con ácido acético preparada tal como se describió en la presente pero que no se desacetiló mediante tratamiento base se secó y trató con mezcla de celulasa de Novozyme Cellic CTec2, mezclas de hemicelulasa Novozymes pectinasa Viscozyme L o xilanasa Htec2, en dosis de altas y bajas de enzimas, con o sin Tween 40. Los resultados proporcionados en la tabla 8 indicaron que Viscozyme liberó consistentemente más azúcar que HTec2 y, más importante, que la inclusión de Tween 40 en la etapa de tratamiento, resultó en una mayor liberación del evento de azúcar cuando no se desacetiló la pulpa de celulosa 218. Los resultados indicaron también que la dosis de altas enzimas puede superar al menos parcialmente la inhibición de las celulasas mediante acetilación de la pulpa celulósica durante el pretratamiento. Esto sugiere además que las mezclas de enzimas de celulasa analizadas tienen un nivel bajo de actividad de esterasa que está presente y que la inclusión de más actividad de esterasa en la mezcla puede ser útil en la reducción de la carga enzimática de celulasa.

Tabla 8 Liberación de glucosa mejorada de la pulpa de celulosa con celulasas/Tween 40 En otra prueba, la pulpa de celulosa acetilada 218 obtenida después del lavado con acetato de etilo se lavó completamente con agua después de la filtración para eliminar todo ácido acético libre. Se agregó NH4OH a la muestra lavada hasta una concentración final de 0.5% (v/p). Las muestras se trataron a 121°C durante 30 minutos para desacetilar la muestra. Se agregaron ácido fosfórico, amortiguador y enzimas comerciales (dosificadas a 3% del DS) y Tween-40 (agregado a 0.5% p/v) a las muestras tratadas con base para preparar una mezcla de reacción con un 15% de sólidos. Las muestras se colocaron en una incubadora a 50°C y se rotaron a 20 rpm. Después de 2 dias de incubación, la pulpa de celulosa 215 comenzó a hacerse liquida. Al tercer dia se midió el contenido de glucosa. Las muestras adicionales se eliminaron diariamente después de verificar la glucosa. La glucosa liberada por la reacción enzimática se gráfica en la figura 5 Después de 7 dias de incubación a 50°C, se liberó la mayoría de la glucosa que se estimó que se encontraba presente en la pulpa de celulosa 218. La composición del hidrolisado después de 9 días fue (en glucosa al 12.56% p/p (base de materiales disueltos) (84% de DM), xilosa al 1.73% (11.5% de DM), cenizas al 2.0% (13.3% de DM) y ácido acético al 0.56% (3.7% de DM).

Las alícuotas del hidrolisado tratado con enzimas de 9 días se fermentaron mediante diversas cepas de levadura a 30°C en matraces de agitación con tapón rotados a 150 rpm. El cultivo se inoculó a una velocidad de revestimiento de 250 millones de células/ml. Las muestras se extrajeron durante la fermentación a las 24 horas y 48 horas. Estas muestras se analizaron para detectar los azúcares, ácidos orgánicos y etanol. Los resultados indican que una de las cepas de levadura analizadas que se diseñaron para utilizar xilosa para su fermentación (a saber, S. cerevisíae 424a, disponible en Purdue Research Foundation, Lafayette, IN) produjo etanol al 5.6% (v/v) en 24 horas y utilizó xilosa al 50% dentro de las 48 horas.

Los resultados resumidos en las tablas 7 y 8 indicaron que la adición de detergente a una variedad de reacciones enzimáticas celulolíticas y hemicelulolíticas resulta en una liberación sustancialmente mayor de glucosa en comparación con la muestra tratada con control sin la adición de Tween 40 Otros detergentes no iónicos que también pueden ser adecuados para mejorar la actividad enzimática de preparaciones enzimáticas celulolíticas y hemicelulolíticas incluyen, a modo no taxativo, Tween-20, Tween-60, Tween-80 y Tritón X-100 La cantidad de detergente para su uso debería variar de un 0.01% a un 5% v/p de la mezcla de reacción.

Incorporación de estearasas. Aunque tal como se describió anteriormente, la desesterificación catalizada por base de la pulpa de celulosa acilada 218 y las fracciones de hemicelulosa 289 mejora la digestión enzimática, requiere materiales extra y produce una mezcla de reacción básica a la que se debe ajustar su pH antes de la digestión enzimática de las fracciones de pulpa de celulosa 218 y hemicelulosa soluble 289. No obstante, se descubrió sorprendentemente que estas fracciones también pueden desacetilarse eficazmente mediante el cotratamiento con una enzima de esterasa. Este descubrimiento se basó en parte en el análisis de ácido acético liberado cuando se trató una pulpa de celulosa 218 con un cóctel de hemicelulasas y celulasas comerciales de Novozymes (Cellic CTec2 y HTec2). Dichas preparaciones enzimáticas no se purifican mayormente para obtener una proteina con un tipo especifico de actividad enzimática pero son cócteles de varias actividades enzimáticas parcialmente purificadas que contienen actividades residuales de otras enzimas que se copurifican en el proceso de preparación. Con una carga alta de enzimas, se observó algo de desacetilación de la pulpa de celulosa 218 consistente con un bajo nivel de actividad de tipo enzimas de estearasas que está presente en la mezcla enzimática. Esto formó la base para buscar la incorporación de más actividad de esterasa mediante la adición de preparaciones adicionales de actividades de esterasa a cócteles de preparaciones enzimáticas celuloliticas y hemiceluloliticas.

Una esterasa adecuada para preparar jarabes C5 y C6 hechos mediante tratamiento con ácido C1-C2 de las fracciones de pulpa de celulosa y hemicelulosa preparadas tal como se describe en la presente debería mostrar al menos una actividad que cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de al menos uno de: un xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, celulosa acetilada y arabinosa acetilada. La solicitud de patente estadounidense pendiente No.61/538,211 titulada Cellulolytic Enzyme Compositions and Uses Thereof describe al menos un ejemplo de dicha esterasa indicada como esterasa de acetilxilano (AXE) que puede utilizarse para lograr una digestión mejorada de las fracciones de pulpa celulósica 218 y hemicelulosa soluble 289 preparadas tal como se describe en la presente para proporcionar jarabes C6 y C5 mejorados. AXE es una carboxilxilestearasa (EC.3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo y p-nitrofenilacetato. Su actividad se midió mediante la desacetilación de p-nitrofenilacetato en amortiguador de acetato a pH 5.0, que proporciona el producto colorimétrico p-nitrofenolato. Una unidad de AXE se define como la cantidad de enzimas que libera 1 mmo? de p-nitrofenolato por minuto a 25°C. La solicitud de patente estadounidense pendiente No. 61/538,211 titulada Cellulolytic Enzyme Compositions and Uses Thereof proporciona datos adicionales que demuestran que la incorporación de dicha actividad de esterasa para la digestión de fracciones de pulpa 218 y hemicelulosa soluble 289 descritas en la presente mejora la conversión del material a jarabes C6 y C5.

Fermentaciones. Las preparaciones de materiales de hemicelulosa soluble 289 y la pulpa de celulosa reducida en hemicelulosa y lignina 218 realizadas conforme a los procesos descritos en la presente se utilizan para preparar azúcares C5 y C6 adecuados como materias primas para microorganismos empleados para preparar una variedad de productos mediante fermentación. Una variedad de protocolos para el uso de dichos materiales es posible, en función del organismo empleado y el producto de fermentación que se está preparando. La mayoría de los microorganismos pueden utilizar la paleta de azúcares C5 y C6 preparados mediante la digestión de estos materiales como una fuente de carbono para el crecimiento celular (acumulación de biomasa). No obstante, la acumulación de biomasa es el único factor pertinente a la economía de la producción del producto de fermentación final. Por ejemplo, mientras que una variedad de levadura puede utilizar azúcares C5 para la acumulación de biomasa en condiciones de crecimiento aeróbico, la mayoría de la levadura no produce etanol mediante la fermentación en dichas condiciones. A la inversa, en condiciones anaeróbicas donde la levadura sí produce etanol a partir de glucosa y otros azúcares C6, la levadura Saccharomyces no tiene las sendas metabólicas necesarias para desviar los azúcares C5 D-xilosa y L-arabinosa en la producción de etanol, a menos que se haya modificado genéticamente con actividades enzimáticas exógenas para desviar los azúcares C5 hacia la senda glucolítica. En contraste, las cepas modificadas genéticamente de la bacteria Zymomonas mobilis tienen la capacidad de producir etanol mediante fermentación en cualquier azúcar C5 o C6 en condiciones anaeróbicas. Incluso Zymomonas, como levadura y la mayoría de otros microorganismos muestran una preferencia por la absorción de glucosa primero antes de la absorción de otros azúcares C6 o C5.

Diversas variaciones para la digestión y fermentación de los azúcares C5 y C6 producidos forman la hemicelulosa 289 y pulpa de celulosa 218 preparadas mediante los métodos proporcionados en la presente. En una realización, la hemicelulosa 289 y la pulpa de celulosa 218 se digieren primero por separado con enzimas para formar azúcares C5 y C6 individuales. Posteriormente, estas materias primas se suministran al microorganismo para producir el producto de fermentación. Cuando la digestión enzimática se lleva a cabo individualmente a partir de la fermentación posterior para crear un jarabe, esto se conoce como hidrólisis y fermentación individual con la abreviatura SHF.

En un proceso de SHF, la fracción de hemicelulosa 289 preparada mediante los procesos de la invención se digiere con un cóctel de enzimas adecuado que contiene celulasa, hemicelulasa, pectinasa, esterasa y opcionalmente actividades de proteasa a temperaturas de hasta 70°C y a un pH de 4.0 a 6.0 con mezcla continua para proporcionar un jarabe de azúcar enriquecido en C5. En la realización preferida, las digestiones enzimáticas de la fracción de hemicelulosa 289 se llevan a cabo de 50 a 65°C a un pH de 5.0 durante 1 a 7 dias. Para proporcionar la mayor cantidad de azúcares, las mezclas de reacción de digestión enzimática también contienen un detergente no iónico como Tween 40 tal como se discutió anteriormente en la presente. El uso de detergentes permite que el contenido de sólidos de la fracción de pulpa de celulosa 218 o hemicelulosa soluble se encuentre en el intervalo de un 10% a un 25% p/p. El jarabe de azúcar C5 que resulta de las digestiones se utiliza directamente como una materia prima en el medio de fermentación para acumular biomasa, o para acumular biomasa y producir el producto de fermentación deseado.

De modo similar, la pulpa de celulosa 218 preparada tal como se describe en la presente puede someterse a digestión enzimática después de suspenderse en una solución amortiguadora acuosa a un pH de 4.5 a 5.5 en un 10 a 25 % de sólidos secos mediante el uso de una mezcla de celulasa de enzimas que incluye una esterasa a una temperatura de 50°C durante 5 dias para proporcionar una materia prima de fermentación compuesta por el jarabe enriquecido en azúcar C6 Nuevamente, se incluye un detergente no iónico tal como Tween 40 en la mezcla de digestión que permite el uso de un contenido alto de sólidos de un 10 a 25% de pulpa de celulosa para maximizar el rendimiento de los azúcares C6.

Si el producto de fermentación deseado es etanol y el microorganismo de fermentación es una cepa industrial común de la cepa S. cerevisiae, la levadura se cultiva individualmente en un jarabe de azúcar C5 en condiciones aeróbicas durante un tiempo suficiente para acumular biomasa en una primera etapa. En una segunda etapa, el caldo de fermentación se alimenta con una fuente de azúcar C6, preferentemente glucosa o sacarosa o sus mezclas, y la fermentación se lleva a cabo en condiciones anaeróbicas durante un tiempo suficiente para acumular etanol. La fuente de azúcar C6 puede consistir totalmente en el jarabe C6 preparado a partir de la pulpa de celulosa 218 tal como se describe en la presente.

Si el producto de fermentación deseado es etanol y el microorganismo de fermentación es una cepa modificada genéticamente de S. cerevisiae, la levadura se cultiva individualmente en un jarabe de azúcar C5 en condiciones anaeróbicas durante un tiempo suficiente para acumular biomasa y la primera porción de etanol en una primera etapa. En una segunda etapa, el caldo de fermentación se complementa con una fuente de azúcar C6, preferentemente glucosa o sacarosa o sus mezclas, y la fermentación continúa en condiciones anaeróbicas durante un tiempo suficiente para acumular una segunda porción de etanol. La fuente de azúcar C6 puede incluir el jarabe C6 preparado a partir de la pulpa de celulosa 218 tal como se describe en la presente.

Un proceso de SHF para fermentar el etanol se realizó mediante el uso del jarabe C6 obtenido a partir de la digestión de la pulpa de celulosa 218 en altas enzimas de altos sólidos (20%) descrita en la tabla 4 anterior. Se probaron varias cepas comerciales y no comerciales incluidas las cepas recombinantes modificadas genéticamente de xilosa de S. cerevisiae capaces de fermentar azúcares C5 para preparar etanol. Las cepas probadas incluyen una cepa de producción Y500 Saccharomyces cerevisiae interna (Archer Daniels Midland Company, Decatur, IL), una cepa modificada genéticamente interna capaz de realizar la fermentación de D- xilosa conocida como 134-12 que deriva de Y-500, una cepa comercial obtenida de la división de Fermentis del grupo LeSaffre (Milwaukee, WI) conocida como ER2 y una cepa GMO de Saccharomyces cerevisiae modificada genéticamente para la fermentación de xilosa por Nancy Ho de la Universidad de Purdue (Purdue Research Foundation, West Lafayette, IN) que se conoce como 424a. Para los experimentos iniciales volumétricos, se realizaron pruebas de fermentación y sacarificación individuales para determinar la capacidad de fermentación mediante el uso de la cepa recombinante modificada genéticamente xilosa 424a, que se describió en Sedlak et al Enz. Microbial Technol . 33, 19-28 (2003). La tabla 9 muestra el consumo de glucosa (dextrosa) y xilosa y la producción concomitante de un 8.5% v/v de rendimiento de etanol en un periodo de 48 horas mediante el uso de jarabes C6 y C5 a partir de pulpa de rastrojo de maíz desacetilado.

Tabla 9 Producción de etanol a partir de jarabe C6 de ácido acético tratado con pulpa de celulosa 218 Ácido Glicerol acétic Se consumió casi toda la dextrosa y un 56% de la xilosa en las primeras 24 horas.

Se llevaron a cabo estudios adicionales de procesos de SHF para fermentar etanol mediante el uso de jarabe C6 obtenido de la digestión de la pulpa de celulosa de rastrojo de maíz 218 para producir una solución de etanol que será económica para recuperar mediante destilación. La destilación económica se obtiene normalmente con al menos un 6.5% de etanol, que sugiere que las soluciones de azúcar necesarias para obtener esta concentración debe ser de aproximadamente un 10%. Las soluciones de azúcar a partir de la hidrólisis enzimática en un 10% en peso sugieren además que la hidrólisis enzimática debe llevarse a cabo con una carga de altos sólidos, entre un 15 y un 20% en peso. La hidrólisis enzimática de altos sólidos presenta varios problemas, tales como mezcla inadecuada, transferencia térmica y altas viscosidades. Se probaron varias estrategias para producir una solución de azúcar concentrada a partir de hidrólisis enzimática, incluida la hidrólisis enzimática de bajos sólidos acoplados a concentración evaporativa, adición progresiva de sólidos durante la hidrólisis enzimática de bajos sólidos y finalmente hidrólisis enzimática de altos sólidos con adición de tensioactivos. Los experimentos iniciales resultaron en etanol al 2.2% v/v a partir de la fermentación de hidrólisis enzimática de bajos sólidos (6%) de pulpa de celulosa 218 con dos concentraciones evaporativas. (Tabla 10) Los experimentos posteriores produjeron etanol al 3% v/v a partir de la fermentación del material producido por hidrólisis enzimática de un 9% de sólidos de pulpa de celulosa 218 con la adición de pulpa de celulosa 218 a un 14% de sólidos totales tras la solubilización de los sólidos iniciales. (Tabla 11) El etanol se produjo en un 6% v/v de concentración a partir del material que se concentró evaporativamente dos veces a partir de la hidrólisis enzimática de un 9% de sólidos de pulpa de celulosa 218. (Tabla 12) La concentración evaporativa agrega una etapa costosa para la producción comercial de etanol, por lo que se analizó la alternativa de hidrólisis enzimática de altos sólidos de la pulpa de celulosa 218 con la adición de tensioactivos. Varias cepas de levadura produjeron etanol a partir de un 6.8-7.1% v/v durante la fermentación en un matraz de agitación de hidrólisis enzimática de altos sólidos de un 16.5% de sólidos de pulpa de celulosa 218 con adición de tensioactivos. (Tabla 13) Finalmente, el material producido mediante hidrólisis enzimática de altos sólidos a un 20% de sólidos de pulpa de celulosa 218 con adición de tensioactivos se fermentó en matraces de agitación mediante la cepa de levadura 424a y produjo etanol al 8.3% v/v. (Tabla 14) Un resumen gráfico de los datos, incluidos los sólidos secos de pulpa, concentración de azúcar y concentración de etanol producidos, de la tablas 10 a 14 se presenta en la figura 6.

Tabla 10 Fermentación de matraz de agitación de jarabe C6 6% de sólidos secos y 2X concentrado Tabla 11 5 Fermentación de matraz de agitación de jarabe C6 9% de sólidos secos, con aumento secuencial de un 5% de sólidos secos Tabla 12 Fermentación de matraz de agitación de jarabe C6 9% de sólidos secos g 2X concentrado Tabla 13 Fermentación de matraz de agitación de jarabe C6 16.5% de sólidos secos con varias cepas de Saccharamyces cerevisiae Tabla 14 Fermentación de matraz de agitación de jarabe C6 20% de sólidos secos con cepa Saccharomyces cerevisiae recombinante 424a Un proceso alternativo que puede utilizarse se conoce como sacarificación y fermentación simultánea (abreviado: SSF). En dicho proceso, la digestión enzimática de la fracción de hemicelulosa 289 o la fracción de pulpa de celulosa 218 se realiza en un medio que también incluye los microorganismos. Mientras los azúcares se liberan mediante el proceso de digestión, son consumidos por los microorganismos para la acumulación de biomasa y/o producción del producto de fermentación. Opcionalmente, también se puede suministrar una fuente de azúcar individual a la mezcla de digestión/fermentación durante el proceso. Un beneficio de un proceso de SSF es que el consumo de los azúcares liberados previene la inhibición de la retroalimentación de cualquier enzima de digestión que puede ser sensible a la inhibición de la retroalimentación por el azúcar. El proceso de SSF puede llevarse a cabo a un pH de 4 a 6 de 30 a 60 ° C durante 5 a 7 dias en función de la dosificación de enzimas, la composición de mezcla de enzimas utilizada, la termoestabilidad de las enzimas, la resistencia al calor y a los inhibidores de los microorganismos utilizados asi como las concentraciones de partida de los sólidos secos en la fermentación. Se realizó un experimento de matraz de agitación SSF mediante el uso del jarabe C6 obtenido a partir de la digestión de la pulpa de celulosa 218 en altas enzimas/altos sólidos (20%) a 40°C. Los resultados del experimento de matraz de agitación de SSF se muestran en la tabla 15, donde los matraces de agitación con un 20% p/p de sólidos secos de pulpa de celulosa 218 no se digirieron hasta el punto de licuefacción en 24 horas y no pudieron someterse a muestreo.

Tabla 15 Sacarificación y fermentación simultánea de matraz de agitación a 40°C Una variación de un proceso de SSF, es un proceso semi SSF donde la fermentación se lleva a cabo en etapas, típicamente, pero no necesariamente con diversas materias primas. En una primera etapa, un SHF típico se lleva a cabo utilizando como materia prima un jarabe C5 o C6 preparado previamente mediante la hidrólisis de la hemicelulosa soluble 289 y la pulpa de celulosa 218. En esta fase inicial la biomasa se acumula con o sin la realización del producto de fermentación deseado. En una segunda fase, se agrega el medio de fermentación que contiene la biomasa acumulada al medio que contiene la hemicelulosa 289 o pulpa de celulosa 218 en presencia de las enzimas que se hidrolizan de forma tal que la fermentación de los azúcares liberados ocurra simultáneamente con su liberación hidrolítica mediante las enzimas.

La figura 7 ilustra un método óptimo para un proceso semi SSF de dos etapas. En la primera fase se utiliza una primera porción del jarabe enriquecido en C5 obtenido de la hidrólisis enzimática de la fracción de hemicelulosa soluble 218 para acumular biomasa mediante crecimiento aeróbico en un propagador de microorganismos. En la realización ilustrada, la levadura es un etanológeno competente C5 tal como la cepa de levadura 424a capaz de producir etanol a partir de azúcares C5. A continuación la levadura propagada se utiliza para inocular un medio de fermentación suministrado con una segunda porción del jarabe enriquecido en C5 y cultivado anaeróbicamente durante un tiempo suficiente para agotar los azúcares y producir una primera porción de etanol. La figura 8 es una gráfica que ilustra el curso del tiempo para la producción de etanol y el uso simultáneo de la xilosa del azúcar C5 durante una primera etapa ejemplar llevada a cabo en matraces de agitación de laboratorio por duplicado.

Mientras tanto, en la preparación de la segunda fase, la pulpa de celulosa 218 preparada tal como se describe en la presente, se trata con un cóctel de enzimas celulolíticas durante un tiempo suficiente para liberar parcialmente una primera porción de azúcares C6 de la pulpa de celulosa 218. En la segunda fase, se utiliza el cultivo de levadura resultante de la fermentación anaeróbica en el jarabe enriquecido en C5 mencionado anteriormente para inocular un medio mayor que contiene la pulpa de celulosa digerida parcialmente y la primera porción de azúcares C6. Esta segunda fase de fermentación continúa en condiciones anaeróbicas durante un tiempo suficiente para hidrolizar además la pulpa de celulosa en azúcares C6 adicionales y para producir etanol. Este método producirá una concentración suficiente de etanol (al menos un 8% v/v) para que sea económico para la destilación y recuperación.

Dicho proceso semi SSF se llevó a cabo en dos etapas en un análisis de laboratorio. La primera etapa utilizó un caldo de fermentación obtenido mediante la fermentación de la levadura de fermentación de xilosa 424a en un jarabe C5 obtenido a partir de la digestión enzimática de una fracción de hemicelulosa 289 de rastrojo de maíz en un matraz de agitación no inoculado que contenia 50 mi del jarabe C5 purificado. El jarabe C5 se trató para eliminar los productos de degradación tóxicos que se forman durante el pretratamiento tal como furfural, hidroximetilfurfural (HMF), fenólicos, ácidos orgánicos que consisten principalmente en ácido acético y otros orgánicos mediante el uso de una combinación de extracción de solventes para eliminar furfural, HMF y fenólicos, cromatografía de intercambio de iones mediante el uso de resinas cargadas para eliminar ácidos y/o evaporación para quitar componentes volátiles. Se utilizó un inoculo de un 25 % para un segundo medio que contenía el jarabe C5 en matraces sellados rotados a 100 rpm que se incubaron a 30°C en condiciones de crecimiento anaeróbico. Después de 72 horas, se utilizó el caldo de esta etapa para inocular 150 mi de un medio que contenía una pulpa de celulosa 218 de rastrojo de maíz que se trató previamente durante 72 horas con un cóctel de enzimas celulolíticas. Este cóctel celulolítico consistió en las enzimas descritas en el párrafo 0027. Tal como se muestra en la tabla 16, después de 72 horas de fermentación del jarabe C6/pulpa, se obtuvo una producción de aproximadamente un 8.8% v/v de etanol por duplicado con una utilización concomitante de un 98.5% de la glucosa disponible y aproximadamente un 57% de la xilosa disponible.

Tabla 16 Sacarificación y fermentación semi simultánea de matraz de agitación de jarabe C5 y jarabe C6 Los ejemplos a continuación ilustran los pasos tomados en ejemplos de prácticas de ciertos aspectos de la presente divulgación y no pretenden limitar o ejemplificar los modos en que la invención puede realizarse por un entendido en la téenica.

Ejemplo 1 Procesamiento de ácido acético/acetato de etilo de rastrojo de maíz Se agregó 1.5 kg de rastrojo de maíz cortado que tenia un 92% de contenido de sólidos (1380 gramos) y un 8% de humedad a un reactor giratorio encamisado. Se agregaron quince bolas de cerámica de 2.5 pulgadas (500g) y 7 litros de ácido acético al 70% y se selló el reactor. Se comenzó la rotación del reactor y se inyectó vapor a la camisa. En 10 minutos, la temperatura interna del reactor alcanzó 165°C. La temperatura se mantuvo durante 2 minutos y después se discontinuó la inyección de vapor. Se liberó lentamente vapor desde la camisa para disminuir la temperatura interna del reactor hasta 150°C durante 3 minutos. Después el reactor se dejó enfriar durante un periodo de media hora hasta 100°C. Más tarde, se agregó agua fría para llevar la temperatura del reactor hasta 60°C y se abrió el reactor. El rastrojo cocido se filtró sobre un embudo Buchner y se prensó. Se recogieron cinco litros de un filtrado de hidrolisado de ácido acético.

Se utilizaron cinco litros de ácido acético al 99% calentados hasta una temperatura de 50°C para solubilizar y lavar la hemicelulosa y la lignina residual de la torta y se recogieron por separado. Se agregaron cuatro litros de acetato de etilo para lavar la torta de ácido acético y se filtró el lavado para obtener un filtrado y torta de acetato de etilo. Se quitó la torta del embudo, se ahuecó y se secó al aire para formar la muestra A (810 gramos).

El primer filtrado de ácido acético se evaporó hasta 1.2 litros. El segundo filtrado de ácido acético se agregó al primero y se evaporó nuevamente hasta un volumen final de 1.2 litros. El filtrado de acetato de etilo se agregó a la mezcla de hidrolisado evaporado y esto se evaporó hasta un jarabe de aproximadamente 800 mi. Se agregó este jarabe tibio a 2 litros de acetato de etilo para precipitar la hemicelulosa y la lignina (muestra B, 475 gramos). El filtrado se concentró a un jarabe pesado y se agregó a 600 mi de acetato de etilo para precipitar otros 50 gramos de material (muestra C). El filtrado residual se evaporó a un jarabe pesado que contenía 210 gramos de sólidos disueltos (muestra D). Se dispersaron diez gramos de la muestra B y se colocaron en 65 i de agua caliente para disolver la fracción soluble en agua, después se filtraron y el filtrado se retuvo (muestra E).

Estas muestras se analizaron para detectar los sólidos disueltos, las formas de azúcar hidrolizada, los metales, N, P asi como el ácido acético. Las tablas a continuación resumen los resultados de varios análisis informados en g/kg a menos que se indique lo contrario.

Tabla 17 Sólidos disueltos para la muestra A Tabla 18 Elementos inorgánicos para muestras B-D Tabla 19 Análisis de azúcar de muestras B-D Tabla 20 Análisis misceláneo de muestras B-D *HMF = HidroxiMetilFurfural, AcMF = AcetoxiMetilFurfural (éster acético de HMF) Tabla 21 Azúcares, lignina, ácido acético y elementos en la muestra E .

Ejemplo 2 Separación líquido/ líquido de rastrojo de maíz procesado con ácido acético/acetato de etilo El rastrojo de maíz cortado se puso en contacto con ácido acético al 70%, se calentó y filtró sustancialmente tal como se describió en el ejemplo 1. El filtrado se concentró mediante evaporación hasta un 40% de sólidos disueltos, lo que formó una fase acuosa concentrada de lignina y hemicelulosa. La fase acuosa concentrada de lignina y hemicelulosa (1250 mi) se puso en contacto con una primera cantidad de acetato de etilo (1250 mi), que se ajustó cuidadosamente para prevenir la formación de un precipitado y la inducción de la separación de fases y se mezcló. La mezcla se separó fácilmente en dos fases: La fase inferior comprendió una fase acuosa pesada gomosa que contenía la mayoría de los azúcares y la lignina insoluble en solvente orgánico (aproximadamente la mitad de la lignina) y se redujo en contenido de ácido acético. La fase superior comprendió una fase de sobrenadantes orgánicos que contenía lignina soluble en solvente orgánico, sales de acetato, acetato de etilo y ácido acético. Después de que se decantó la fase de sobrenadantes orgánicos, el volumen de fase acuosa pesada fue de aproximadamente 500 mi. La fase acuosa pesada se puso en contacto (se lavó) con acetato de etilo (500 mi) y se mezcló a 50 °C. Se dividió más ácido acético nuevamente en la fase de acetato de etilo, lo que causó una disminución adicional en la cantidad de ácido acético en la fase acuosa pesada que contenia azúcar y lignina. La mezcla se separó nuevamente, mediante la formación de un segundo sobrenadante orgánico en comparación con la fase acuosa pesada y el segundo sobrenadante orgánico se decantó. El acetato de etilo (500 mi) se puso en contacto nuevamente con la fase acuosa pesada con mezcla a 50 °C. La mezcla se separó nuevamente, lo que formó una primera fase que comprendía una fase acuosa pesada lavada y un tercer sobrenadante orgánico. Después de decantar el tercer sobrenadante orgánico, se combinaron y mezclaron los sobrenadantes orgánicos, lo que formó una segunda fase que comprendía sobrenadantes orgánicos; se formó una pequeña cantidad de un precipitado alquitranado y se separó y agregó a la fase acuosa pesada lavada.

La fase acuosa pesada lavada se puso en contacto con agua suficiente para inducir la precipitación de la lignina (1250 mi), después de lo cual se formó un precipitado esponjoso de lignina insoluble y orgánica. La mezcla se calentó hasta 94 °C con mezcla, después de lo cual el precipitado esponjoso de lignina se coaguló. La mezcla se dejó enfriar hasta 50 °C con mezcla y después se filtró. Después de la filtración, se obtuvo una torta de lignina. La torta de lignina se lavó con 400 mi de agua y se secó para proporcionar lignina insoluble en solvente orgánico (100 gramos de sólidos secos). El filtrado que comprende una fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar (muestra F, 1650 mL, tabla 22) contenia solamente ácido acético al 6.1%.

Tabla 22 Sólidos secos, azúcares, lignina, ácido acético y elementos en la muestra F.

"Como tal" denota azúcares libres; "hidrolizado" denota azúcares recuperados después de hidrólisis analítica.

Una submuestra de fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar se acidificó hasta un pH de 2.8 de ácido sulfúrico y se puso en contacto con un volumen equivalente de acetato de etilo. La extracción de acetato de etilo quitó fácilmente la pequeña cantidad de ácido acético remanente, mientras se formaron dos fases liquidas y se separaron fácilmente sin formación de emulsión. Se formó una tercera fase que comprendía azúcares C5 + C6 reducidos en ácido acético que contenían 36.9 g/kg de ácido acético y se quitó con facilidad. La fase de azúcares C5 + C6 reducidos en ácido acético se volvió a extraer con acetato de etilo, lo que redujo adicionalmente el contenido de ácido acético hasta 23.3 g/kg. Pueden combinarse las dos fracciones de acetato de etilo para formar una cuarta fase orgánica que comprende ácido acético recuperado. La fase de azúcares C5 + C6 reducidos en ácido acético se enriqueció en azúcares C5 y C6 y fue adecuada para la fermentación debido al bajo contenido de ácido acético.

La segunda fase que contenía sobrenadantes orgánicos se sometió a evaporación para recuperar el acetato de etilo y el ácido acético separados de un jarabe de sobrenadante acuoso (0.4 partes, tablas 23 y 24, muestra G). El jarabe de sobrenadante acuoso se encontrana enriquecido en lignina soluble en solvente orgánico y sales de acetato y tenía un contenido reducido de acetato de etilo y ácido acético. El jarabe del sobrenadante acuoso se puso en contacto con un volumen equivalente de agua para formar una mezcla de dos fases que comprendía una quinta fase acuosa enriquecida en sales de acetato y una sexta fase enriquecida en lignina soluble en solvente orgánico. La mezcla de dos fases se calentó hasta 90 °C con agitación para evaporar el acetato de etilo y extraer los componentes solubles en agua, tales como sales de acetato, en la quinta fase acuosa. Tras enfriar hasta 40 °C, se eliminó la quinta fase acuosa. El lavado con agua de la sexta fase se repitió dos veces más. La sexta fase orgánica lavada con agua se enfrió, molió y secó para proporcionar un polvo de lignina soluble en solvente orgánico (135 gramos). La quinta fase acuosa se combinó con el agua de lavado y se evaporó hasta una solución salina de acetato acuosa (144 gramos). Esta fase acuosa puede secarse y utilizarse para su fertilización.

Mediante la conducción de separaciones líquido/líquido de esta forma, se fraccionó el rastrojo de maíz cortado en azúcares C5 + C6 reducidos en ácido acético, una lignina soluble en solvente orgánico, una lignina insoluble en solvente orgánico y una solución salina de acetato acuosa.

Además, se previno la formación de emulsión, se utilizaron volúmenes sustancialmente reducidos de acetato de etilo y se recuperaron con facilidad tanto el acetato de etilo como el ácido acético.

Ejemplo 3 Separación liquido/liquido de rastrojo de maíz procesado con ácido acético/acetato de etilo El rastrojo de maíz (1500 gramos, 92% de sólidos secos) se hidrolizó a 163-171 °C durante 10 minutos en el reactor giratorio con 7.5 litros de una solución de ácido acético al -70% sustancialmente tal como se describió en el ejemplo 1. El reactor se enfrió hasta 121 °C durante un periodo de 30 minutos y se enfrió hasta 60 °C con agua fria durante un periodo de 10 minutos. El rastrojo cocido se presionó y filtró para recuperar un primer hidrolizado separado de una torta de lignocelulosa acetilada. La torta de lignocelulosa acetilada se puso en contacto con una segunda cantidad de ácido acético mediante su contacto tres veces con un litro de ácido acético al 70% a 60 °C y se filtró para proporcionar una torta de lignocelulosa acilada lavada con ácido (aproximadamente 1.5 litros en volumen), y aproximadamente 8 litros de lavado con ácido. La torta de celulosa de acetilo lavada con ácido se puso en contacto dos veces con un litro de acetato de etilo y se filtró para recuperar aproximadamente 3 litros de lavado de acetato de etilo separado de una pulpa de celulosa de acetilo lavado con acetato de etilo (aproximadamente 1.5 litros). El lavado de acetato de etilo se combinó con el primer hidrolizado ácido para formar un extracto de solvente orgánico ácido que comprendía solubles acéticos combinados. El ácido acético se recuperó del extracto de solvente orgánico ácido que comprendía solubles de acético combinado mediante evaporación a 1.3 litros, mediante la formación de una fase acuosa de lignina y hemicelulosa concentrada enriquecida en hemicelulosa y lignina (evaporar (concentrar)). Esto se combinó con lavado de acetato de etilo a partir de acetilcelulosa lavada con ácido, y el acetato de etilo se condensó mediante evaporación a 1 litro de volumen, mediante la formación de una fase acuosa de lignina y hemicelulosa concentrada enriquecida en hemicelulosa y lignina (tablas 23 a 25, muestra H, densidad 1.25 g/ml). La fase acuosa concentrada de lignina y hemicelulosa (muestra H) comprendía ácido acético al 37% y sólidos secos al 52.9%. Los sólidos secos contenían azúcares C5 al 5.39%, azúcares C6 al 0.76% y azúcares C5 y C6 al 15.5% y 4.2%, respectivamente, obtenidos tras la hidrólisis de polisacáridos; esto se correspondió con un grado de hidrólisis de un 23.8% de hemicelulosa en el tratamiento hidrolítico inicial.

Para efectuar la separación de la fase acuosa concentrada de lignina y hemicelulosa mediante separación líquido/líquido, se puso en contacto una sequnda cantidad de acetato de etilo con la fase acuosa concentrada de lignina y hemicelulosa. Esta cantidad de acetato de etilo (1.5 litros de acetato de etilo agregados a un litro de hemicelulosa y lignina concentrada) se escogió para inducir la separación de fases y evitar la formación de un precipitado. Esta mezcla se dejó separar en una fase acuosa pesada lavada que contenia la mayoría de los azúcares C5 y azúcares C6 con la lignina soluble y orgánica (tablas 23 a 25, muestra I, sólidos secos al 61.6 %, 700 mi), y una segunda fase que comprendía sobrenadantes orgánicos que comprendían lignina soluble en solvente orgánico, sales de acetato, acetato de etilo y ácido acético (tablas 23 y 24, muestra J, sólidos secos al 12.3%, 1780 mi).

La fase acuosa pesada (400 mi, tablas 23 a 25, muestra I) se puso en contacto con agua (800 mi, agua a temperatura ambiente) y se agitó. Después de reposar durante 45 minutos, se observó una solución marrón transparente (aproximadamente 1200 mi) y un precipitado (200 mi). La fase superior (fase acuosa pesada lavada con agua enriquecida en azúcares C5 y azúcares C6) se decantó y el precipitado se extrajo con 300 mi de agua y se filtró para proporcionar una torta de lignina insoluble y orgánica. El filtrado se agregó a la fase acuosa pesada lavada con agua enriquecida en azúcares C5 y azúcares C6 para formar un jarabe de azúcar C5 + C6 (corriente de hemicelulosa, 1650 mi, sólidos secos al 9.7%, tablas 23 a 25, muestra K).

El sobrenadante J se condensó mediante evaporación para proporcionar un condensado de acetato de etilo y ácido acético y para formar un jarabe de sobrenadante acuoso (300 mi). El jarabe de sobrenadante acuoso se mantuvo a 70 °C y se puso en contacto (se agitó) con un volumen equivalente a 70 °C de agua para formar una mezcla de dos fases. Esta mezcla se dejó enfriar hasta 40 °C sin una etapa de calentamiento a 90 °C. La fase acuosa superior se decantó y la fase orgánica inferior se lavó dos veces con 300 i de agua caliente. La fase orgánica lavada con agua que contenia lignina soluble en solvente orgánico se recogió y se dejó enfriar y solidificar (295 gramos). Las fases acuosas se combinaron para proporcionar una solución de sales de acetato (1000 mi, sólidos secos al 4.3%, tablas 23 a 25, muestra L). Se proporciona información composicional sobre las muestras G a L en las tablas 23 a 25.

Mediante la conducción de separaciones liquido/líquido de este modo, el rastrojo de maíz cortado se fraccionó en una fase acuosa pesada lavada con agua enriquecida en azúcares C5 y azúcares C6 y con un contenido reducido de ácido acético, lignina insoluble en solvente orgánico, lignina soluble en solvente orgánico, una solución de sales de acetato y una solución de acetato de etilo recuperado con ácido acético. Además, se evitó la formación de la emulsión, se obvió el uso de ácido sulfúrico y se utilizaron volúmenes sustancialmente reducidos de acetato de etilo.

Tabla 23 Análisis de azúcar de muestras G-L 5 Tabla 24 Análisis misceláneo de muestras G-L Tabla 25 Elementos inorgánicos y cenizas para muestras H, I, K y L Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para procesar biomasa lignocelulósica que comprende: a. poner en contacto la biomasa lignocelulósica con una primera cantidad de ácido acético; b. calentar la biomasa lignocelulósica puesta en contacto a una temperatura y durante un tiempo suficiente para liberar hidroliticamente una primera porción de hemicelulosa y lignina, lo que forma un liquido hidrolizado y una torta lignocelulósica acilada; c. separar la torta lignocelulósica acilada del liquido hidrolizado; d. poner en contacto la torta de lignocelulosa acilada con una segunda cantidad del ácido acético para lavar la hemicelulosa y la lignina de la torta lignocelulósica acilada y separar un liquido de lavado ácido de la torta lignocelulósica acilada lavada con ácido; e. poner en contacto la torta de lignocelulosa acilada lavada con ácido con una primera cantidad de un solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 para lavar el ácido acético, la hemicelulosa y la lignina de la torta lignocelulósica acilada lavada con ácido y recuperar el liquido de lavado de solvente miscible en ácido C1-C2 de forma separada de la torta de lignocelulosa acilada lavada con solvente; f. combinar el líquido de lavado de solvente con al menos uno del hidrolizado y el líquido de lavado ácido que forma un extracto de solvente orgánico ácido; g. condensar el extracto de solvente orgánico ácido para formar una fase acuosa concentrada de he icelulosa y lignina enriquecida en hemicelulosa y lignina; y, h. agregar a la fase acuosa concentrada de hemicelulosa y lignina una segunda cantidad de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 suficiente para inducir la partición de las fases en una primera fase que comprende una fase acuosa pesada lavada enriquecida en azúcares C5 y C6 y lignina insoluble en solvente orgánico y una segunda fase que comprende una fase de sobrenadante orgánico que comprende lignina soluble en solvente orgánico, sales de acetato, solvente miscible en ácido C1-C2 y ácido acético.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además a. poner en contacto la fase acuosa pesada lavada con una cantidad de agua suficiente para inducir la precipitación; b. calentar la fase acuosa pesada lavada puesta en contacto con agua a una temperatura y durante un tiempo suficiente para inducir la coagulación lo que forma lignina insoluble en solvente orgánico coagulada y una fracción enriquecida en hemicelulosa/ azúcar enriquecida en azúcares C5 y C6; y, c. recuperar la lignina insoluble en solvente orgánico de forma separada de la fracción enriquecida en hemicelulosa/ azúcar.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende además a. poner en contacto la fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar con al menos un ácido para formar una fracción enriquecida en hemicelulosa/azúcar ácida; y, b. poner en contacto la fracción enriquecida en hemicelulosa/ azúcar ácida con una cantidad de solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 suficiente para extraer el ácido acético del jarabe de azúcar C5 y C6 e inducir la partición de fases en una tercera fase que comprende jarabe de azúcar C5 y C6 reducido en ácido acético enriquecido en azúcares C5 y C6 y con un contenido reducido en ácido acético y una cuarta fase orgánica que comprende el ácido acético recuperado con un contenido reducido en azúcares C5 y C6 con respecto a la tercera fase.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además a. someter la segunda fase a evaporación para recuperar el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 y ácido acético de forma separada del jarabe de sobrenadante acuoso enriquecido en lignina soluble en solvente orgánico.

5. El método de la reivindicación 4 que comprende además poner en contacto el jarabe de sobrenadante acuoso con agua suficiente para inducir la separación de fases y obtener una quinta fase que comprende una fase acuosa enriquecida en sales de acetato y con un contenido reducido en lignina soluble en solvente orgánico y una sexta fase que comprende una fase enriquecida en lignina soluble en solvente orgánico.

6. El método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde la condensación se realiza mediante evaporación del ácido acético y el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2.

7. El método de la reivindicación 6, donde el ácido acético y el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 se separan y recuperan mediante destilación.

8. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además poner en contacto la fase enriquecida en azúcares C5 y C6 con un microorganismo para preparar un producto de fermentación deseado.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 no es un solvente orgánico halogenado.

10. Una composición que comprende lignina insoluble en solvente orgánico obtenida mediante el método de la reivindicación 2.

11. La composición que comprende lignina insoluble en solvente orgánico de conformidad con la reivindicación 10 donde el solvente orgánico miscible en ácido C1-C2 es acetato de etilo .

12. Una composición obtenida mediante el método de la reivindicación 2 o la reivindicación 11, donde la lignina insoluble en solvente orgánico o la lignina soluble en solvente orgánico comprende lignina derivada de madera blanda como coniferas, picea, cedro, pino y secoya; lignina derivada de madera dura como arce, álamo, roble, eucalipto y tilo; lignina derivada de cañas como paja, maíz, cañóla, avena, arroz, sorgo, trigo, soja, cebada, espelta y algodón; lignina derivada de grama como bambú, miscanthus, caña de azúcar, pasto varilla, pasto cinto, gramíneas y cualquiera de sus combinaciones.

13. Una composición que comprende lignina soluble en solvente orgánico obtenida mediante el método de la reivindicación 5.

14. Una composición obtenida mediante el método de la reivindicación 5 o la reivindicación 13, donde la lignina insoluble en solvente orgánico comprende lignina derivada de madera blanda como coniferas, pícea, cedro, pino y secoya; lignina derivada de madera dura como arce, álamo, roble, eucalipto y tilo; lignina derivada de cañas como paja, maíz, cañóla, avena, arroz, sorgo, trigo, soja, cebada, espelta y algodón; lignina derivada de grama como bambú, miscanthus, caña de azúcar, pasto varilla, pasto cinto, gramíneas y cualquiera de sus combinaciones.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la biomasa lignocelulósica tiene un contenido de agua no mayor a un 40% p/p.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la biomasa lignocelulósica tiene un contenido de agua no mayor a un 20% p/p.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la biomasa lignocelulósica tiene un contenido de agua no mayor a un 10% p/p.