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MX2014011944A - Compuestos de nitroxilo activados con succinimida y metodos para el uso de los mismos para nitroxilacion de proteinas. - Google Patents

Compuestos de nitroxilo activados con succinimida y metodos para el uso de los mismos para nitroxilacion de proteinas.

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MX2014011944A
MX2014011944A MX2014011944A MX2014011944A MX2014011944A MX 2014011944 A MX2014011944 A MX 2014011944A MX 2014011944 A MX2014011944 A MX 2014011944A MX 2014011944 A MX2014011944 A MX 2014011944A MX 2014011944 A MX2014011944 A MX 2014011944A
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MX
Mexico
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protein
lysine
hemoglobin
nitroxylated
peg
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MX2014011944A
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Inventor
Kim D Vandegriff
Ashok Malavalli
Gnel Mkrtchyan
Original Assignee
Sangart Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Sangart Inc filed Critical Sangart Inc
Publication of MX2014011944A publication Critical patent/MX2014011944A/es
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos de nitroxilo activado con succinimida y métodos para la síntesis de dichos compuestos. La presente invención también se refiere al uso de compuestos de nitroxilo activado con succinimida para preparar proteínas nitroxiladas, por ejemplo, hemoproteínas nitroxiladas (por ejemplo, la hemoglobina nitroxilada y la mioglobina nitroxilada). Las proteínas nitroxiladas opcionalmente también son conjugan con un óxido de polialquileno (PAO), por ejemplo con un polietilenglicol (PEG). Las hemoproteínas polinitroxiladas son útiles como agentes terapéuticos de oxígeno (OTAs) . La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas de las proteínas nitroxiladas y los métodos para el uso de las proteínas nitroxiladas en el tratamiento de varias efecciones.

Description

COMPUESTOS DE NITROXILO ACTIVADOS CON SUCCINIMIDA Y MÉTODOS PARA EL USO DE LOS MISMOS PARA NITROXILACIÓN DE PROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a compuestos de nitroxilo activado con succinimida y métodos para la sintesis de compuestos de nitroxilo activado con succinimida. La presente invención también se refiere al uso de compuestos de nitroxilo activado con succinimida para preparar proteínas nitroxiladas, por ejemplo, hemoproteínas nitroxiladas (por ejemplo, la hemoglobina nitroxilada y la mioglobina nitroxilada). Las proteínas nitroxiladas opcionalmente también se conjugan con un óxido poliaquileno (PAO), por ejemplo, a un polietilenglicol (PEG). Las hemoproteínas polinitroxiladas son útiles como agentes terapéuticos de oxígeno (OTA, por sus siglas en inglés) y son capaces de suministrar oxígeno molecular, monóxido de carbono, óxido nítrico y mezclas de estos. Por lo tanto, la invención incluye además composiciones farmacéuticas de las proteínas nitroxiladas y los métodos para el uso de proteínas nitroxiladas en el tratamiento de varias afecciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Hace tiempo que los portadores de oxígeno basados en hemoglobina ("HBOC", por sus siglas en inglés) son asociados a la vasoconstricción atribuida a la depuración de óxido nítrico (NO) mediante hemo. Se ha demostrado que portadores de oxígeno son útiles como agentes terapéuticos de oxígeno (a los que en algunos casos se hace referencia como "expansores del plasma que transportan oxígeno") tales como la hemoglobina estabilizada (Hb), tienen una eficiencia limitada, debido a que depuran óxido nítrico, lo que causa vasoconstricción e hipertensión. La propensión de estas soluciones de transporte de oxígeno a causar vasoconstricción puede manifestarse como hipertensión arterial en animales y en personas. Aunque no se comprenden totalmente los mecanismos subyacentes a los efectos vasoconstrictores de los HBOC, se ha sugerido que el hierro hemo puede combinarse en forma rápida e irreversible con NO endógeno, un vasodilatador potente, y de este modo ocasionar la vasoconstricción.
En parte debido a dichos efectos de vasoconstricción, no existen hasta el momento portadores de oxígeno completamente exitosos como agentes terapéuticos de oxígeno (OTA), aunque los productos que comprenden Hb libre modificada han sido los más prometedores. El Ejército de Estados Unidos desarrolló Hb humana reticulada entre cadenas a con bis-dibromosalicilfumarato (ao¡Hb) como un sustituto de los glóbulos rojos modelo, pero luego de que se observaran grandes aumentos de la resistencia vascular pulmonar y sistémica se abandonó el modelo (Hess, J. et ál., 1991, Blood 78: 356D). Una versión comercial de dicho producto también fue dejada de lado cuando se obtuvieron resultados decepcionantes en el ensayo clínico de fase III (Winslow, R. M., 2000, Vox Sang 79:1-20).
Se han desarrollado dos enfoques moleculares que pretenden evitar la actividad de unión a NO de la Hb. El primer enfoque utiliza la mutagénesis dirigida al sitio de la bolsa hemo distal en un intento de crear una hemoglobina recombinante con afinidad de unión a NO reducida (Eich, RF et ál., 1996, Biochem. 35:6976-83). El segundo enfoque utiliza un enfoque de modificación química donde el tamaño del Hb se aumentó a través de oligomerización en un intento de reducir o posiblemente inhibir completamente la extravasación de Hb del espacio vascular en el espacio intersticial (Hess, J.R. et ál., 1978, J. Appl. Physiol. 74:1769-78; Muldoon, S.M. et ál., 1996, J. Lab. Clin. Med.128:579-83; Macdonald, V.W. et ál., 1994, Biotechnology 22:565-75; Furchgott, R., 1984, Ann.
Rev. Pharmacol. 24:175-97; y Kilbourne, R. et ál., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun.199:155-62).
De hecho, se han producido Hb recombinantes con tasas de unión de asociación reducida para NO que son menos hipertensivas en experimentos de carga superior de ratas (Doherty, D.H. et ál. 1998, Nature Biotechnology 16:672-676 y Lemon, D.D. et ál. 1996, Biotech 24:378). Sin embargo, estudios realizados sugieren que la unión a NO puede no ser la única explicación posible para la vasoactividad de Hb. Se ha observado que determinadas moléculas de Hb grandes, tales como aquellas modificadas con polietilenglicol (PEG), prácticamente no presentaban vasoconstricción aunque sus velocidades de asociación a NO fueron idénticas a las de aaHb con hipertensión muy elevada (Rohlfs, R.J. et ál. 1998, J Biol. Chem. 273:12128-12134). Asimismo, se observó un nivel extraordinario de eficacia de PEG-Hb en la prevención de las consecuencias de hemorragias cuando se administró mediante exanguinotransfusión antes de la hemorragia (Winslow, R.M. et ál. 1998, J. Appl. Physiol.85:993-1003).
La conjugación de PEG con Hb reduce su antigenicidad y prolonga su semivida en circulación. Sin embargo, se ha informado que la reacción de conjugación con PEG tiene como consecuencia la disociación de tetrámeros de Hb en subunidades diméricas ab, lo que ocasiona hemoglobinuria grave en ratas que recibieron conjugados de PEG de unidades monoméricas de Hb mediante exanguinotransfusiones por debajo de 40.000 Daltons ("Da") (Iwashita y Ajisaka "Organ-Directed Toxicity: Chem. Indicies Mech., Proc. Symp., Brown et ál. 1981, Eds. Pergamon, Oxford, England páginas 97-101). Enzon, Inc. preparó un Hb conjugado con óxido de polialquileno ("PAO") con un peso molecular mayor que 84.000 Daltons (patente estadounidense n.° 5,650,388) que llevaba alrededor de 10 copias de cadenas PEG-5000 unidas a Hb y sus grupos amino OÍ y amino e. Al describir este grado de sustitución se planteó que evita la nefrotoxicidad clínicamente significativa asociada a la hemoglobinuria en mamíferos. Sin embargo, la reacción de conjugación tuvo como resultado una población heterogénea de conjugados y contenía otros reactivos no deseables que debieron ser eliminados mediante cromatografía en columna.
Normalmente, la conjugación con PEG es llevada a cabo a través de la reacción de un resto de PEG activado con un grupo funcional en la superficie de biomoléculas. Los grupos funcionales más comunes son los grupos amino de lisina, grupos imidazol de residuos de histidina y el extremo N de las proteínas; grupos tiol de los residuos cisteína y los grupos hidroxilo de la serina, treonina y tirosina y el extremo C de la proteina. Por lo general, PEG se activa mediante la conversión del extremo hidroxilo a un resto reactivo capaz de reaccionar con dichos grupos funcionales en un grupo levemente acuoso. Uno de los PEG monofuncionales más comunes utilizado para la conjugación de productos biofar acéuticos terapéuticos es metoxiPEG ("mPEG-OH"), el que presenta un único grupo funcional (es decir, hidroxilo) y reduce al mínimo los problemas de entrecruzamiento y de agregación que están asociados a PEG bifuncional. Sin embargo, mPEG-OH suele contaminarse con PEG bifuncional de peso molecular elevado (es decir, "PEG diol"), que puede variar hasta un máximo de 10 a 15 % (Dust J.M. et ál.1990, Macromolecule 23:3742-3746) debido a su proceso de producción. Este diol PEG bifuncional tiene aproximadamente el doble del tamaño que el PEG monofuncional deseado. El problema de la contaminación se ve agravado al aumentar el peso molecular del PEG. La pureza de mPEG-OH es especialmente crítica para la producción de productos bioterapéuticos PEGilados debido a que la EDA requiere un nivel elevado de reproducibilidad en los procesos de producción y de calidad del producto farmacológico final.
La conjugación de Hb con PAO ha sido llevada a cabo tanto en estados de oxigenación como de desoxigenación. La patente estadounidense n.° 6,844,317 describe la conjugación de Hb en estado oxigenado o "R" al equilibrar la Hb con la atmósfera antes de conjugarla para aumentar la afinidad por el oxigeno del conjugado PEG-Hb resultante. Otras fuentes describe una etapa de desoxigenación anterior a la conjugación para reducir la afinidad por el oxigeno y aumentar la estabilidad estructural, lo que permite a la Hb resistir las tensiones físicas de la modificación química, diafiltrado y/o pasteurización y filtrado estéril (patente estadounidense n.° 5,234,903). Para la reticulación intramolecular de Hb se sugiere que puede ser necesaria la desoxigenación de la Hb antes de la modificación para exponer la lisina 99 de la cadena a al reactivo de reticulación (patente estadounidense n.° 5,234,903).
La cinética de tiolado de Hb con 2-iminotiolano antes de la conjugación con PEG fue estudiada por Acharya et ál. (patente estadounidense n.° 7,501,499). Se ha señalado que aumentar la concentración de iminotiolano de 10 veces, lo que introduce un promedio de 5 tioles extrínsecos por tetrámero, a 30 veces, prácticamente duplicó la cantidad de tioles extrínsecos en la Hb. Sin embargo, el aumento de tamaño observado luego de la conjugación con PEG únicamente fue marginal, incluso con el doble de tioles. Esto sugiere que la reacción de conjugación en presencia de un exceso molar de 20 veces de PEG-5000 maleimidilo cubrió la superficie de la Hb con tioles menos reactivos, lo que tuvo como consecuencia interferencia esférica que se opuso a modificaciones adicionales de la Hb con tioles más reactivos. Como consecuencia, para alcanzar el grado deseado de la conjugación de Hb modificado (es decir, PEG 6+1 por molécula de Hb), Acharya et ál. se sometió el Hb a tiolación con un exceso molar 8-15 de iminotiolano, y luego se reaccionó el Hb tiolado con un exceso molar de 16-30 veces de maleimidilo PEG-5000. Sin embargo, estas concentraciones de reactivos en exceso molar elevadas aumentan significativamente el costo de ? preparación de HBOC en producción a gran escala y aumentan la heterogeneidad del producto final. Además, tales excesos molares elevados de PEG-5000 maleimidilo también resultan en un producto más heterogéneo con la producción de una cantidad mayor de reactivos secundarios no deseados.
En estudios previos se observó que el tamaño molecular de la hemoglobina de superficie modificada debía ser lo suficientemente grande como para evitar ser eliminada por los riñones y para lograr la semivida en circulación deseada.
Blumenstein, J. et ál. determinaron que esto podía lograrse con un peso molecular de 84.000 Daltons (Da) o más ( Blood Substitutes and Plasma Expanders, Alan R. Liss, editores, Nueva York, N.Y., págs. 205-212 (1978)). En dicho estudio, los autores conjugaron dextrano de diversos pesos moleculares, con Hb. Se informó que un conjugado de Hb (con un peso molecular de 64.000 Da) y dextrano (con un peso molecular de 20.000 Da) "fue eliminado lentamente de la circulación y casi imperceptiblemente a través de los riñones". Asimismo, se observó que el aumento del peso molecular por encima de 84.000 Da no alteró en forma significativa dichas curvas de eliminación. La reticulación intramolecular une químicamente las subunidades de la unidad de hemoglobina tetramérica entre sí para prevenir la formación de dímeros que sean excretados en forma prematura por los riñones. (Ver, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,296,465).
Los nitróxidos son compuestos antioxidantes bien establecidos de baja toxicidad que atenúan daño oxidativo en modelos de animales de enfermedad inflamatoria y conservan gas NO biodisponible. Se cree que ejercen efectos protectores principalmente al actuar como miméticos de SOD o depuradores radicales. Por lo tanto, los compuestos polinitroxilados tienen propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. No se debe confundir esto con combinar HBOC con moléculas donantes de óxido nítrico (NO), que se ha informado que aumentan la relajación vascular. Ver, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0311657. Sin embargo, los nitróxidos miméticos de SOD tienen una semivida de plasma corta debido a su pequeño tamaño, y por lo tanto es difícil mantener la eficacia antioxidante de estas moléculas in vivo.
En vista de lo antemencionado, existe una necesidad en la téenica para agentes terapéuticos de oxígeno que no causan vasoconstricción e hipertensión y que tienen propiedades antioxidantes y antiinflamatorias.
Además, los métodos actuales para activar nitróxidos para utilizar como agentes de nitroxilación son procesos de múltiples etapas y costosos. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos simples y económicos para elaborar compuestos de nitróxido activado para utilizar como agentes de nitroxilación.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se refiere a un agente de nitroxilación de la fórmula (I): donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo Ci-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; n es 0 o 1; y m es 0 o 1.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II): que comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula (III) con carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en presencia de una base orgánica; donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo Ci-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; y m es 0 o 1.
Aun otro aspecto de la presente invención está también dirigida a un método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV): que comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula (V) con N-hidroxisuccinimida (NHS) en presencia de N,N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC); donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo C1-C4; Y es CH2; y m es 0 o 1.
Un aspecto adicional es una proteina nitroxilada que comprende al menos un grupo amino nitroxilado y la proteina nitroxilada puede tener la estructura (VI): donde Z representa la proteina; cada Ri, R2, R3, y R4 son independientemente alquilo Ci-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo, o silicio; Y es CH2; m es 0 o 1; n es la cantidad promedio de los polímeros activados con PEG conjugados con la proteína, el grupo -NH- es un grupo amina de la proteína y N es un nitrógeno de la proteína.
Aun otro aspecto de la invención es una proteína nitroxilada que puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteína nitroxilada que tiene la estructura la estructura (VII): donde Z representa la proteína; cada Ri, R2, R3, y R4 son independientemente alquilo C1-C4; Y es CH2; m es 0 o 1; n es la cantidad promedio de los polímeros activados con PEG conjugados con la proteína, el grupo -NH- es un grupo amina de la proteína; y N es un nitrógeno de la proteína.
Otro aspecto es una proteína nitroxilada que tiene un PEG conjugado que es una maleimida-PEG, donde la maleimida-PEG conjugada con un resto tiol intrínseco de un residuo de cisteína o conjugado con un resto tiol de un residuo de lisina tiolado tiene la estructura (VIII) donde Z representa la proteína, S es el grupo tiol de la proteína, R3 es un grupo fenileno o alquileno, X es un grupo extremo, m es la cantidad promedio de los polímeros de PEG activados conjugados con la proteína, y n representa la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
Un aspecto adicional es una proteína nitroxilada que tiene un PEG conjugado que es una maleimida-PEG, donde la maleimida-PEG conjugada con un resto tiol intrínseco de un residuo de cisteína o conjugado con un resto tiol de un residuo de lisina tiolado tiene la estructura (VIII) donde Z representa la proteína, S es el grupo tiol de la proteina, R3 es un grupo fenileno o alquileno, X es un grupo extremo, m es la cantidad promedio de los polímeros de PEG activados conjugados con la proteína, y n representa la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
Otro aspecto de la invención es un método para preparar una proteína nitroxilada que comprende hacer reaccionar la proteína con un agente de nitroxilación de la fórmula (IV): donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo C1-C4; Y es CH2; y m es 0 o 1. El método de la reivindicación G2, donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente -CH3.
Un aspecto adicional es un método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la maleimida-PEG conjugada con un resto tiol intrínseco de un residuo de cisteína tiene la estructura (VIII) donde Z representa la proteina, R3 es un grupo fenileno o alquileno, S es el grupo tiol de la proteina, m es la cantidad promedio de los polímeros de PEG activados conjugados con la proteína, y n representa la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los resultados de la espectroscopia de masas de alta precisión ESI-TOF de 4-hidroxi-2,2,6,6- tetrametilpiperidin-1-oxil (TEMPOL) La Figura 2 muestra los resultados de la espectroscopia de masas de alta precisión ESI-TOF que confirma la estructura molecular de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC).
La Figura 3 muestra los resultados de la cromatografía en capa fina (TLC, por sus siglas en inglés) realizada en TEMPOL, carbonato de N'-Disuccinimidilo (DSC), N-hidroxi-succinimida (NHS), productos de reacción de la reacción de TEMPOL y DSC a las 6 horas, y el producto de la reacción 4-STC final.
La Figura 4 muestra el espectro de la resonancia paramagnética electrónica (EPR) para TEMPOL y hemoglobina PEGilada (MP4) antes y después de la polinitroxilación (PN-MP4).
La Figura 5 muestra perfiles de análisis de exclusión por tamaño de la hemoglobina PEGilada (PEG-Hb) y la hemoglobina PEGilada polinitroxilada (PEG-Hb-PN).
La Figura 6 muestra un espectro de UV-Vis característico de la hemoglobina PEGilada polinitroxilada (PEG-Hb-PN).
La Figura 7 muestra el espectro UV-Vis para la hemoglobina plasmática luego de la administración de PEG-Hb-PN a las ratas.
La Figura 8 muestra los resultados representativos de un experimento donde la hemoglobina PEGilada fue nitroxilada utilizando 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) a un exceso molar de 1:5-1:100 sobre la hemoglobina PEGilada.
Las Figuras 9 y 13 muestran el espectro MALDI-TOF para la albúmina de suero humana (HSA).
Las Figuras 10-12 y 14-16 muestran el espectro MALDI-TOF para HSA polinitroxilada utilizando 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato a un exceso molar de 1:5-1:100 sobre HSA.
La Figura 17 muestra los resultados representativos de un experimento donde la HSA fue nitroxilada utilizando 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) a un exceso molar de 1:5-1:100 sobre HSA.
DEFINICIONES Cuando se utilizan los términos "uno", "una" o "un" en la presente descripción, estos significan "al menos uno" o "uno o más" excepto que se indique lo contrario.
Tal como se usan en la presente, "óxido de polioxiaquileno activado" o "PAO activado" hace referencia a una molécula de PAO que tiene al menos un grupo funcional. Un grupo funcional es un resto reactivo que interactúa con grupos carboxilo, sulfhidrilos o aminas libres en una molécula a conjugarse con PAO. Por ejemplo, uno de dichos grupos funcionales que reacciona con sulfhidrilos libres es un grupo maleimida. Un grupo funcional que reacciona con aminas libres es un grupo succinimida.
"Desoxihemoglobina" o "hemoglobina no ligada" significan cualquier hemoglobina en la que no se encuentran ligandos exógenos unidos a hemo.
En general, "hemoglobina" o "Hb" hace referencia a una hemoproteina que transporta oxigeno. En seres humanos, cada molécula de Hb tiene 4 subunidades, 2 subunidades de cadena a y 2 subunidades de cadena b, que se organizan en una estructura tetramérica. Además, cada subunidad contiene un grupo hemo que es el centro que contiene hierro que en estado ferroso (Fe2+) se une a los ligandos 02, NO o CO. Por lo tanto, cada molécula de Hb puede unirse hasta a 4 moléculas de ligando y producir Hb02, HbNO o HbCO compuestos ligados, respectivamente. De manera adicional, la hemoglobina puede ligarse a mezclas de 02, NO y CO.
"Portadores de oxigeno basados en hemoglobina" (HBOC) hace referencia a hemoglobinas que transportan oxigeno, pero que también son útiles para transportar otros gases moleculares, tales como óxido nítrico y monóxido de carbono.
"Afinidad elevada por oxígeno" hace referencia a hemoglobina que ha sido modificada para presentar mayor afinidad por oxígeno que la hemoglobina libre de estro as (SFH). Por lo tanto, una Hb con "afinidad elevada por oxígeno" tiene un P50 inferior al de SFH, cuyo P50 es de 15 mmHg según se midió a 37 °C y pH 7,4.
"Hemoglobina ligada" significa hemoglobina en la que un ligando exógeno se encuentra unido a hemo. Ligandos usuales preferidos incluyen oxígeno, monóxido de carbono y óxido nítrico.
"MalPEG" hace referencia a polietilenglicol de maleimidilo e incluye un resto maleimidilo unido a polietilenglicol a través de un enlazador.
"MalPEG-Hb" hace referencia a Hb con la que se conjugó PEG activado con maleimidilo. La conjugación es llevada a cabo mediante la reacción de MalPEG con grupos tiol (y, en menor medida, con grupos amino) en la Hb para formar MalPEG-Hb. Los grupos tiol se encuentran en residuos cisteína presentes en la secuencia de aminoácidos de Hb, tal como los dos tioles intrínsecos en 3Cys 93, y también pueden ser introducidos mediante la modificación de grupos amino superficiales para que contengan un grupo tiol. Un ejemplo de MalPEG-Hb conocido como MP4 (Sangart, Inc.) tiene la siguiente fórmula: donde Hb es hemoglobina; S es un grupo tiol en la hemoglobina; n es la cantidad de unidades de oxietileno del polímero de óxido de polialguileno de 5000 Dalton y m es la cantidad promedio de polímeros de óxido de polialguileno activado con maleimidilo conjugados con la hemoglobina y es 7-8.
"Methemoglobina" o "metHb" hace referencia a una forma oxidada de Hb que contiene hierro en estado férrico. MetHb no actúa como portador de oxigeno o CO. Tal como se usa en la presente, la expresión "% de methemoglobina" hace referencia al porcentaje de Hb oxidada respecto al total de Hb.
"Metoxi-PEG" o "mPEG-OH" hace referencia a PEG donde el hidrógeno del extremo hidroxilo es reemplazado con un grupo metilo (—CH3).
"Hemoglobina modificada" o "Hb modificada" hacen referencia a Hb que fue alterada mediante una reacción química, tal como reticulación intramolecular e intermolecular, polimerización, conjugación, y/o téenicas de recombinación, de forma que la Hb deje de encontrarse en su estado nativo. Tal como se usa en la presente, los términos "hemoglobina" o "Hb" hacen referencia tanto a la Hb no modificada nativa como a la Hb modificada, a menos que se indique lo contrario.
La "actividad de nitrito reductasa" o "NRA" es la capacidad de la hemoglobina o de una proteína basada en hemoglobina para reducir nitrito a óxido nítrico. La "actividad de nitrito reductasa máxima" es la tasa máxima de reducción de nitrito a óxido nítrico de la que es capaz la hemoglobina o una proteína basada en hemoglobina. La "actividad de nitrito reductasa inicial" es la tasa inicial de reducción de nitrito a óxido nítrico de la hemoglobina o una proteína basada en hemoglobina cuando se añade nitrito a la proteína totalmente desoxigenada.
La expresión "no oxigenada" significa que la hemoproteína o hemoglobina se encuentra en estado no ligado, desoxigenado o se encuentra ligado con un gas que no es 02, tal como NO o CO.
"Afinidad por oxígeno" hace referencia a la avidez con la que un portador de oxígeno, tal como Hb, se une a oxígeno molecular. Esta característica es definida por la curva de equilibrio de oxígeno, la que representa el grado de saturación de moléculas de Hb con oxígeno (eje Y) en función de la presión parcial de oxígeno (eje X). La posición de la curva es indicada por el valor de "P50", el cual representa la presión parcial de oxígeno a la que el portador de oxígeno se encuentra saturado al 50 % y se relaciona en forma inversa a la afinidad por el oxígeno. Por lo tanto, cuanto menor sea el P50, mayor es la afinidad por el oxígeno. La afinidad del oxígeno de la sangre entera (y los componentes de la sangre entera, tal como glóbulos rojos y Hb) se puede medir a través de una variedad de métodos conocidos en la téenica, (ver, por ejemplo, Winslow, R.M. et ál., J. Biol. Chem.1977, 252:2331-37). La afinidad del oxigeno también se puede determinar utilizando un analizador HEMOX™ (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA) comercialmente disponible. (ver, por ejemplo, Vandegriff y Shrager en "Methods in Enzymology" (Everse et ál., eds.) 232:460 (1994)) ; y Vandegriff, et ál., Anal.
Biochem. 256(1): 107-116 (1998)).
Tal como se usa en la presente, la expresión "agente terapéutico de oxígeno" hace referencia a una hemoproteína capaz de unirse a oxigeno molecular y transportarlo a células/tejidos/órganos que lo necesitan. Cuando son administrados en forma de hemoproteínas ligadas a CO o NO y una vez que CO o NO se liberan del grupo hemo, los grupos hemo quedan libres para unirse a oxigeno molecular y transportarlo.
"Polietilenglicol" o "PEG" hace referencia a un polímero de fórmula química general H(OCH2CH2)n OH en la que "n" mayor o igual que 4, preferentemente, de alrededor de 45 a alrededor de 500, más preferentemente, de alrededor de 70 a alrededor de 250, y más preferentemente de alrededor de 90 a alrededor de 140, o alrededor de 115. El polímero puede estar sustituido o no sustituido, y el grupo terminal hidroxilo puede ser reemplazado con un grupo terminal convencional diferente, tal como metoxi o carboxilo. PEG se encuentran comercialmente disponibles en .diferentes fuentes (por ejemplo, Carbowax™ (Dow Chemical, Midland, MI), Poly-G® (Arch Chemicals, Norwalk, CT) y Solbase).
"Hemoglobina conjugada con polietilenglicol", "conjugado de PEG-Hb" o "PEG-Hb" hacen referencia a Hb a la que se une al menos un PEG en forma covalente.
"Solución" hace referencia a una mezcla liquida y la expresión "solución acuosa" hace referencia a una solución que contiene algo de agua y que también puede contener una o más sustancias liquidas con agua para formar una solución multicomponente.
"Hemoglobina libre de estromas" o "SFH" hace referencia a Hb en la que se han eliminado las membranas de glóbulos rojos.
La "hemoglobina modificada en la superficie" hace referencia a la hemoglobina a la que se han unido grupos químicos, normalmente polímeros, tales como dextrano u óxido de polialquileno. La expresión "hemoglobina oxigenada modificada en la superficie" hace referencia a Hb en estado "R" cuando se modifica su superficie.
La "actividad terminal" es un indicio del porcentaje de PAO que pueden funcionalizarse con un resto capaz de reaccionar con un grupo reactivo de la hemoproteina o hemoglobina. "Actividad terminal 100 %" indica que el exceso molar de PAO utilizado en la reacción de conjugación es expresado en base a que la totalidad de PAO tiene un resto capaz de reaccionar con un grupo reactivo de la hemoproteina o hemoglobina. Por ejemplo, si un Mal-PEG disponible tiene una actividad terminal de 80 %, de forma tal que el 80 % de los PEG se funcionalicen con Mal y Mal-PEG se utiliza en exceso molar de 20 veces respecto a la hemoglobina, entonces dicha relación molar puede ser expresada como un exceso molar de 16 veces de Mal-PEG respecto a la hemoglobina en base a una actividad terminal de 100 %.
"Tiolado" hace referencia a un proceso que aumenta la cantidad de grupos sulfhidrilo en una molécula. Por ejemplo, la reacción de una proteina con 2-iminotriolano (2-IT) convierte aminas libres en la superficie de la proteína en grupos sulfhidrilo. Entonces, dichos grupos sulfhidrilo se encuentran disponibles para reaccionar con un resto reactivo tiol, tal como maleimida.
"Hemoglobina no ligada" hace referencia a una hemoglobina que contiene al menos un resto hemo que no se encuentra ligado a un gas molecular tal como oxígeno, monóxido de carbono u óxido nítrico. Por ello, se considera que la hemoglobina "no se encuentra ligada" si únicamente uno de los restos hemo no se encuentra ligado a un gas molecular.
El término "hemoproteína" tal como se usa en la presente se refiere a cualquier cadena de proteínas simple o múltiple que tiene un resto hemo que se une a gases, tales como oxígeno, óxido nítrico o monóxido de carbono.
El término "nitróxido" tal como se usa en la presente se refiere a radicales libres de nitróxido estable, sus precursores y derivados de estos. Este término no debe confundirse con las moléculas donantes de óxido nítrico.
DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención generalmente se refiere a compuestos de nitroxilo activado con succinimida que se pueden utilizar para nitroxilar proteínas. Por ejemplo, tales compuestos de nitroxilo se pueden utilizar para nitroxilar una hemoproteina tal como la hemoglobina. La nitroxilación de una hemoproteina con los compuestos de nitroxilo activados con succinimida contrarresta la oxidación de NO y otras biomoléculas por sustancias oxidativas, tales como superóxido y peróxido de hidrógeno. Las hemoproteinas polinitroxiladas de la presente invención son útiles como (OTA) que son capaces de suministrar oxigeno molecular, monóxido de carbono, óxido nítrico y mezclas de estos.
Reactivos de nitróxido succinimidilo La presente invención se refiere a reactivos de nitróxido succinimidilo que se pueden utilizar para someter los grupos amino de proteína a nitroxilación. Los reactivos de nitróxido succinimidilo generalmente comprenden una succinimida unido a un grupo nitróxido, por ejemplo, un grupo nitróxido TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-piperidina-1-oxil) o PROXYL (2,2,5,5-tetrametilpirrolidina-N-oxil). La unión entre la succinimida y el nitróxido puede ser, por ejemplo, un enlace carboxi o un enlace carbonato. Tales reactivos, por ejemplo los carbonatos de succinimidilo nitroxilo, son altamente reactivos, lo que hace que el acoplamiento entre las aminas de proteínas y la succinimida sea altamente eficiente.
Por ejemplo, la presente invención se refiere a un agente de nitroxilación de la fórmula (I): donde cada uno de Ri, R2, R3 y F es independientemente alquilo Ci-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; n es O o l; ym es O o l.
El agente de nitroxilación de la fórmula (I) puede tener una estructura donde X, Y, n, y m son tal como se definieron anteriormente y cada uno de Ri, R2, R3 y F es -CH3.
Además, el agente de nitroxilación de la fórmula (I) puede tener una estructura donde Ri, R2, R3, R4, Y, n y m son como se definen anteriormente y X es oxigeno o azufre.
Además, el agente de nitroxilación de la fórmula (I) puede tener una estructura donde Ri, R2, R3, R4, Y, n y m son tal como se definieron anteriormente y X es oxigeno.
El agente de nitroxilación de la fórmula (I) también puede tener una estructura donde Y, n, y m son tal como se definieron anteriormente, X es oxigeno y cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es —CH3.
Adicionalmente, el agente de nitroxilación de la fórmula (I) puede tener una estructura donde Ri, R2, R3, R4, Y y m son tal como se definieron anteriormente y n es 0.
El agente de nitroxilación de la fórmula (I) también puede tener una estructura donde Ri, R2, R3, R4, Y y m son tal como se definieron anteriormente y n es 1.
Además, el agente de nitroxilación de la fórmula (I) puede tener una estructura donde Ri, R2, R3, R4, Y y n son tal como se definieron anteriormente y m es 0.
El agente de nitroxilación de la fórmula (I) también puede tener una estructura donde Ri, R2, R3, R4, Y y n son tal como se definieron anteriormente y m es 1.
Por ejemplo, el agente de nitroxilación de la fórmula (I) se puede seleccionar de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC), 3-Succinimidil-PROXYL-Carbonato (3-SPC), 4-succinimidil-carboxi-TEMPO (4-SCT) y 3-Succinimidil-Carboxi-PROXYL (3-SCP). Las estructuras de cada uno de estos compuestos se muestra debajo: 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC; 1-(((2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi)-4-oxicarbonil)oxi)-2,5-pirrolidinediona) 3-Succinimidil-PROXYL-Carbonato (3-SPC;1-(((2,2,5,5 tetrametil-l-pirrolidiniloxi)-3-oxicarbonil)oxi)-2,5-pirrolidinediona) 4-succinimidil-carboxi-TEMPO (4-SCT; 1-(((2,2,6,6-tetrametil 1-piperidiniloxi)-4-carbonil)oxi)-2,5-pirrolidinediona) 3-Succinimidil-Carboxi-PROXYL (3-SCP; 1-(((2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi)-3-carbonil)oxi-2,5-pirrolidinediona).
Por ejemplo, el agente de nitroxilación de la fórmula (I) puede tener la siguiente estructura: Métodos para la sintesis de reactivos de nitróxido de succinimidilo Los reactivos de nitróxido de succinimidilo se puede sintetizar usando la química de activación de una etapa que utiliza los reactivos fácilmente disponibles. Además, la reacción de activación se puede realizar en condiciones leves.
Por lo tanto, la invención se refiere además a un método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II): que comprende reaccionar un compuesto que tiene la fórmula (III) . con carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en la presencia de una base orgánica, donde cada uno de R1, R2, R3, y R4 es independientemente alquilo Ci-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo, o silicio; Y es CH2; y m es 0 o 1.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde X, Y y m son como están definidos anteriormente y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Ri, R2, R3, y R4, Y, y m son como están definidos anteriormente y X es oxigeno o azufre.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Rlr R2, R3, Y R4, Y, Y m son como están definidos anteriormente y X es oxigeno.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Y y m son como están definidos anteriormente, X es oxigeno y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Ri, R2, R3, Y R4, X, y Y son como están definidos anteriormente y m es 0.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Ri, R2, R3, y R4, X, y Y son como están definidos anteriormente y m es 1.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Ri, R2, R3, Y R4, X, Y y m son como están definidos anteriormente y donde la base orgánica comprende trietilamina (TEA), N,N-diisopropiletilamina, 4- dimetilaminopiridina, piridina, N-metilpiperidina, o una combinación de estos.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Ri, R2, R3, y R4, X, Y, y m son como están definidos anteriormente y donde la base orgánica comprende trietilamina.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II) puede tener las estructuras de las Fórmulas (II) y (III) donde Ri, R2, R3 y R4, X, Y y m son como están definidos anteriormente, donde la base orgánica comprende trietilamina y donde el compuesto de la fórmula (III), el carbonato de N,N'-disuccinimidilo y la trietilamina están presentes en una relación de alrededor de 1:2:3.
En cualquiera de los métodos anteriores para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II), la reacción se puede llevar a cabo a una temperatura de alrededor de 2°C a alrededor de 30 °C; alrededor de 15 °C a alrededor de 25 °C; alrededor de 4 °C; o alrededor de 20 °C.
En cualquiera de los métodos anteriores para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II), la reacción se puede dejar continuar por alrededor de tres a alrededor de seis horas.
En cualquiera de los métodos anteriores para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II), la reacción se puede llevar a cabo en un solvente aprótico polar. El solventes aprótico polar puede comprender acetonitrilo,(ACN), tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo (EtOAc), acetona, dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO), o una combinación de estos. Por ejemplo, el solvente aprótico polar puede comprender acetonitrilo.
Un esquema de reacción para la preparación de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato se muestra a continuación.
Carbonato de N,N*-clisuceinimiclilo Tal como se muestra anteriormente, 4-hidroxi-TEMPO (4-Hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina 1-oxil) se usa para preparar 4-succinmidil- TEMPO-carbonato utilizando la química de activación de una etapa. La activación de TEMPOL a 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato se logra por la reacción de TEMPOL con N,N'-Disuccinimidil-Carbonato en la presencia de la trietilamina. La base orgánica (TEA en el esquema de reacción anterior) se utiliza como un catalizador que desprotona el grupo -OH del nitróxido de hidroxilo (TEMPOL en el esquema de reacción anterior), haciendo que sea más reactivo para que pueda actuar'como un neutrófilo y atacar el carbonilo electrofílico de N,N'-Disuccinimidilo-Carbonato (DSC).
La invención está también dirigida a un método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV): que comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula (V) con N-hidroxisuccinimida (NHS) en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC); donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo Ci-C4; Y es CH2; y m es 0 o 1.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV) puede usar las estructuras de las Fórmulas (IV) y (V) donde Y y m son como están definidos anteriormente, en relación con las fórmulas (IV) y (V) donde cada uno de Rx, R2, R3, y R4 es independientemente -CH3.
En el método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV), el compuesto de la fórmula (IV), el N-hidroxisuccinimida y el N,N'-dicilohexilcarbodiimida pueden estar presentes en una mezcla de reacción en una relación molar de alrededor de 1:1,1:1,1.
El método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV) puede usar las estructuras de las Fórmulas (IV) y (V) donde Y y Ri, R2, R3, y R4 son como están definidos anteriormente en relación con las fórmulas (IV) y (V) y m es 0. El método también puede usar las estructuras donde m es 1.
En cualquiera de los métodos anteriores para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV), la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C; alrededor de 15 °C a alrededor de 25 °C; alrededor de 4 °C; o alrededor de 20 °C.
En cualquiera de los métodos anteriores para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (II), la reacción se deja continuar por alrededor de 6 a alrededor de 24 horas.
En cualquiera de los métodos anteriores para prepara un agente de nitroxilación de la fórmula (IV), la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,2 a alrededor de 7,6; o a un pH de alrededor de 7,4.
Las proteínas nitroxliadas y las proteínas modificadas con PAO nitroxilado La presente invención también se refiere a proteínas nitroxiladas que tienen al menos un grupo amino nitroxilado. Las proteínas nitroxiladas también se conjugan opcionalmente con una o más moléculas de óxido de polialquileno (PAO), por ejemplo, a uno o más moléculas de polietilenglicol (PEG).
Los óxidos de polietileno que pueden ser utilizados en la conjugación de proteína incluye, de modo no taxativo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno y un copolímero de óxido de polipropileno/polietileno. El PAO tiene un peso molecular de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons, preferentemente, de alrededor de 3.000 a alrededor de 10.000 Daltons. Más preferentemente, de alrededor de 4.000 a alrededor de 6.000 Daltons y más preferentemente, de alrededor de 5.000 Daltons. El PAO que se utiliza más comúnmente en la actualidad para modificar la superficie de proteínas es PEG, debido a su naturaleza farmacéuticamente aceptable y a su disponibilidad comercial. El PEG se encuentra disponible en una variedad de pesos moleculares, según la cantidad de subunidades repetidas de óxido de etileno (es decir, -CH2CH2O-) en la molécula, para lograr un peso molecular deseado conforme a la cantidad y el tamaño de las moléculas de PEG conjugadas con una proteína.
Se convierte uno de los grupos terminales del polímero de PAO, o ambos, en un grupo funcional reactivo ("activado"). Por ejemplo, se ha utilizado PEG-OH para preparar PEG-haluro, mesilato o tosilato, que luego se convierte en PEG-amina (PEG-NH2) mediante una reacción de desplazamiento nucleofílico con amoníaco acuoso (Zalipsky, S. et ál., 1983, Eur. Polym. J. 19:1177-1183), azida de sodio o ftalimida de potasio. Luego se puede conjugar el PEG activado con una proteína mediante la interacción del grupo amino PEG (-NH2) con un grupo carboxilo (-COOH) de la proteína.
Además de la funcionalización de PEG con un grupo amino y de su conversión a un grupo malei ida, son utilizados en la téenica los PEG así activados. Por ejemplo, es posible activar PEG con carbonato de p-nitrofenilo, aldehido, aminopropilo, aminoetilo, tiol, aminoxi, hidrazida y yodoacetamida, entre otros. Tal PEG funcional puede conjugarse con las cadenas de aminoácidos superficiales de las proteínas a través de métodos conocidos.
PEG-NH2 puede funcionalizarse adicionalmente para conjugarse con grupos diferentes a carboxilo. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6,828,401 describe la reacción de PEG-NH2 con maleimida para formar mPEG-maleimida. En dicha reacción, se hace reaccionar mPEG-OH con un reactivo de tosilación (cloruro de p-toluenosulfonilo) y un catalizador básico (trietilenamina) en presencia de un solvente orgánico (diclorometano) para producir mPEG-tosilato. Entonces, se hace reaccionar el mPEG-tosilato con amoniaco acuoso al 28 % y anhídrido de ácido maleico en una mezcla de solvente orgánico de N,N-dimetilacetamida (DMAc) y N-ciclohexilpirrolidinona (CHP) para producir un compuesto de ácido maleámico. Dicho compuesto reacciona, luego, con pentafluorofeniltrifluoroacetato en presencia de diclorometano para producir mPEG-maleimida.
De manera alternativa, es posible producir mPEG-maleimida al hacer reaccionar mPEG-OH con un reactivo de tosilación (cloruro de p-toluenosulfonilo) y un catalizador básico (trietilenamina) en presencia de un solvente orgánico (diclorometano) para producir mPEG-tosilato. Entonces se hace reaccionar mPEG-tosilato con amoníaco al 28 % para preparar mPEG-NH2. Luego se hace reaccionar mPEG-NH2 con N-metoxicarbonilmaleimida (MCM) en presencia de bicarbonato de sodio (NaHCO3) para producir mPEG-maleimida.
En la Tabla 1 a continuación se presentan ejemplos no taxativos de cadenas laterales de residuos aminoácidos de Hb humana que pueden ser modificados con reacciones químicas con aminas para conjugar la PAO: Tabla 1 - Química de reacciones de aminas y posibles sitios de modificación Un método para aumentar la cantidad de sitios de conjugación disponibles en la Hb implica la introducción de grupos sulfhidrilo (también conocido como tiolado), los que tienden a ser más reactivos con MalPEG que con las aminas libres. Se conoce una variedad de métodos de tiolado de proteínas. En un método, se hace reaccionar las aminas libres de proteínas con 3-(2-piridilditio) propionato de succinimidilo, seguido por la reducción con ditiotreitol (DTT) o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Esta reacción libera el cromóforo 2-piridinotiona que puede ser utilizado para determinar el grado de tiolado. Las aminas también pueden ser indirectamente tioladas mediante reacción con succinimidilacetiltioacetato, seguido por hidroxilamina 50 mM o hidrazina a pH casi neutro.
Otro método descrito en la patente estadounidense n.° 5,585,484 mantiene la carga positiva del grupo amino (a o e) de la Hb luego de la conjugación. Dicho método comprende la amidación de los grupos amino e de Hb con 2-IT para introducir grupos sulfhidrilo en la proteína. Este enfoque presenta al menos dos ventajas adicionales respecto a la química de succinimidilo previamente utilizada: 1) la reactividad y selectividad elevadas de grupos maleimido con grupos sulfhidrilo facilita la modificación prácticamente cuantitativa de tioles con un exceso limitado de reactivos y 2) la latencia del grupo tiol de 2-IT y su generación únicamente in situ como consecuencia de la reacción del reactivo con los grupos amino de la proteínas. Estas ventajas proveen un beneficio adicional: permiten la incubación simultánea de Hb tanto con reactivos de tiolado y de pegilación para decorar la superficie.
Por ejemplo, es posible conjugar MalPEG con Hb mediante el tiolado de la amina de la Hb para introducir grupos tiol en la superficie de la Hb. Los dos grupos tioles intrínsecos de Hb que se encuentran disponibles para reaccionar se encuentran en pCys93 y los grupos tioles agregados en la superficie de la Hb pueden reaccionar con la malei ida de PAO maleimidilo para formar un conjugado de Hb pegilada.
Maleimida-PEG incluye un enlazador para unir la maleimida al PEG. Los enlazadores pueden incluir, de modo no taxativo, alquílenos tales como etileno, propileno o isopropileno, fenileno, amida (-NH-C(O)-) o carbamato de fenilo (por ejemplo, -Ph-NH-C(0)-).
En la Tabla 2 a continuación se presentan ejemplos no taxativos de cadenas laterales de residuos aminoácidos que pueden ser modificados con reacciones químicas con tioles: Tabla 2 - Química de reacciones de tioles y posibles sitios de modificación Es posible regular el peso molecular de PAO-Hb mediante la reacción de conjugación. La lógica tradicional sugiere que aumentar las relaciones molares de los reactivos aumentaría la cantidad de moléculas de PEG unidas a Hb. Esto incluye tanto el proceso de tiolado de Hb (es decir, aumento de relación molar del agente de tiolado respecto a Hb) y el proceso de conjugación (es decir, aumentar la relación molar de PEG activado con tiol respecto a Hb tiolado). Sin embargo, estas relaciones molares en exceso tuvieron como consecuencia la unión de únicamente moléculas de PEG 6±1 por Hb (véase la patente estadounidense n.° 7,501,499).
Recientemente se determinó que una cantidad mayor de moléculas de PAO podía unirse a Hb mediante el uso de relaciones molares menores de los reactivos. Se determinó la cantidad de grupos tioles disponibles en Hb, antes y después del tiolado y luego de la conjugación, mediante el ensayo colorimétrico con ditiopiridina (Ampulski, R.S. et ál., 1969, Biochem. Biophys. Acta 32:163-169). La Hb humana contiene dos grupos tioles reactivos intrínsecos· en los residuos p93cys, lo que se confirmó con la reacción con ditiopiridina. Luego del tiolado de SFH con 2-IT, la cantidad de grupos tiol reactivos aumentó de 2 a más de 7. En este ejemplo, se unió un promedio de 8 moléculas de PEG a Hb. Esto se logró con un exceso molar de 7,5 veces de 2-IT respecto a SFH en la reacción de tiolado y un exceso molar de 12 veces de MalPEG respecto a Hb tiolada en la reacción de conjugación.
La hemoglobina se conjuga con óxido de polialquileno cuando se encuentra en estado oxidado para aumentar la afinidad por el oxígeno del conjugado Hb-PAO.
Proteínas nitroxiladas Las proteínas nitroxiladas tienen al menos un grupo amino nitroxilado. La proteína nitroxilada comprende al menos un grupo amino nitroxilado y la proteína nitroxilada puede tener la estructura (VI): donde Z representa la proteína; cada uno de Ri, R2, R3, y R4 son independientemente alquilo C1-C4; X es oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; m es 0 o 1; n es la cantidad promedio de los polímeros activados con PEG conjugados con la proteína, el grupo -NH- es un grupo amina de la proteína, y N es un nitrógeno de la proteína.
La proteína nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteína nitroxilada puede tener la estructura (VI) donde Ri, R2, R3, R4, Y, m, n, y Z son como se definen anteriormente en relación con la fórmula (VI) y X es oxigeno o azufre.
La proteina nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteina nitroxilada puede tener la estructura (VI) donde Ri, R2, R3, R4, Y, m, n, y Z son como se definen anteriormente en relación con la fórmula (VI) y X es oxigeno.
La proteina nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteina nitroxilada puede tener la estructura (VI) donde Y, m, n, y Z son como se definen anteriormente en relación con la fórmula (VI), X es oxigeno y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
La proteina nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteina nitroxilada gue tiene la estructura la estructura (VII): donde Z representa la proteína; cada Ri, R2, R3, y R4 son independientemente alquilo Ci-C4; Y es CH2; m es 0 o 1; n es la cantidad promedio de los polímeros activados con PEG conjugados con la proteína, el grupo -NH- es un grupo amina de la proteína; y N es un nitrógeno de la proteína.
La proteína nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteína nitroxilada puede tener la estructura (VI) o (VII) donde X, Y, m, n y Z son como se definen anteriormente en relación con la fórmula (VI) o (VII) y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
La proteína nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteína nitroxilada tiene la estructura (VI) o (VII) donde Ri, R2, R3, R4, X, Y, M, n, y Z son como se definen en relación con la fórmula (VI) o (VII) y m es 0.
La proteína nitroxilada puede comprender al menos un grupo amino nitroxilado, la proteína nitroxilada tiene la estructura (VI) o (VII) donde Ri, R2, R3, R4, X, Y, M, n, y Z son como se definen en relación con las fórmulas (VI) o (VII) y donde m es 1.
En cualquiera de las proteínas nitroxiladas anteriores, el al menos un grupo amino nitroxilado puede ser el grupo amino de extremo N de la proteína o un grupo amino épsilon (e) de un residuo de lisina.
Las proteínas nitroxiladas pueden ser adecuadamente proteínas polinitroxiladas. Por ejemplo, para las proteínas nitroxiladas que tienen estructuras de las fórmulas (VI) o (VII), n es el alrededor de 1 a alrededor de 25, n es al menos alrededor de 2; n es al menos alrededor de 5; n es al menos alrededor de 10; o n es alrededor de 15 a alrededor de 20.
La proteína polinitroxilada puede ser una hemoproteína polinitroxilada.
Las hemoproteínas son útiles en la práctica de la presente invención. Además de la hemoglobina tetra érica (Hb), esta incluye hemoproteínas recombinantes o naturales de cadena simple (monoméricas), tales como las descritas en BMC Structural Biology, 11:13, que se puede acceder en http://www.biomedcentral.com/content/pdf/I472-6807-11-13.pdf. Otros ejemplos de hemoproteínas se pueden encontrar en The Journal of Experimental Biology, 201: 1085-1098 (1998).
Es posible emplear una variedad de Hb en la presente invención. La Hb puede ser obtenida de fuentes animales, tal como hemoglobina humana, bovina, porcina o equina. Se prefiere la Hb humana. La Hb puede ser obtenida de fuentes naturales o puede ser producida a través de métodos recombinantes conocidos.
Las hemoglobinas de la presente invención presentan una mayor afinidad por el oxigeno que la de la hemoglobina sin estromas. Esto implica que las hemoglobinas tendrán un P50 inferior que 15 mmHg medido a 37 °C y pH 7,4, preferentemente, de alrededor de 2 a alrededor de 10 mmHg y más preferentemente, de alrededor de 2 a alrededor de 8 mmHg, o alrededor de 2 a alrededor de 5 mmHg.
Por ejemplo, la proteina nitroxilada puede comprender una subunidad de hemoglobina a, una subunidad de hemoglobina b, un tetrámero de hemoglobina o una mioglobina.
La proteina nitroxilada puede comprender una subunidad de hemoglobina a, una subunidad de hemoglobina b, un tetrámero de hemoglobina, una mioglobina, o una albúmina.
Donde la proteina nitroxilada es una albúmina, la proteina nitroxilada puede comprender una albúmina de suero. La albúmina de suero puede comprender albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés). HSA es un polipéptido único que tiene 585 aminoácidos. BSA contiene 60 lisinas, 17 pares de puentes de disulfuro y una cisteina libre, y tiene un peso molecular de aproximadamente ~67 kD.
La proteina nitroxilada puede comprender una subunidad de hemoglobina a o una subunidad de hemoglobina b o un tetrámero de hemoglobina. La proteina nitroxilada puede comprender una subunidad de hemoglobina a animal, una subunidad de hemoglobina b animal o un tetrámero de hemoglobina que comprende subunidades de hemoglobina a y subunidades b animales.
La proteina nitroxilada puede comprender una subunidad de hemoglobina a humana, una subunidad de hemoglobina b humana o un tetrámero de hemoglobina que comprende subunidades de hemoglobina a y subunidades b humanas.
Donde la proteina nitroxilada es un tetrámero de hemoglobina, la hemoglobina puede estar reticulada intramolecularmente. Las hemoglobinas reticuladas intramolecularmente previenen la disociación en dimeros y para evitar el aclaramiento por los riñones, lo que extiende la semivida en circulación. Una variedad de métodos se conocen en la téenica para la reticulación intramolecular Hb. Los reactivos de reticulación química incluyen glutaraldehído (patente estadounidense n.° 7,005,414), polialdehídos (patente estadounidense n.° 4,857,636), diaspirina (patente estadounidense n.° 4,529,719), piridoxil-5'-fosfato (patente estadounidense n.° 4,529,719) trimesoiltris(metil fosfato) (patente estadounidense n.° 5,250,665), dialquinas (para la reacción con hemoglobina que tiene un enlazador de azida. Ver Foot et ál., Chem. Commun. 2009, 7315-7317; Yang et ál., Chem. Commun. 2010, 46: 7557-7559) y las hemoglobinas se pueden reticular con metodologías recombinantes.
Por ejemplo, el tetrámero de hemoglobina puede comprender un dímero a reticulado o un dímero bb reticulado.
Tal como se muestra en la Tabla 1 anteriormente, las subunidades a y b de los residuos de valina de extremo N de hemoglobina humana que se pueden nitroxilar en el grupo amino de extremo N. Además, las subunidades a y b de la hemoglobina humana contienen una cantidad de grupos lisina que se pueden nitroxilar en el grupo amino e.
Además, la proteina nitroxilada puede comprender una subunidad a de hemoglobina humana. La subunidad a de hemoglobina humana se puede nitroxilar en el grupo amino a del residuo de valina de extremo N. Además, la subunidad a de hemoglobina se puede nitroxilar en el grupo amino e de un residuo de lisina que se selecciona del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61, lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139, y una combinación de estos.
La proteina nitroxilada también puede comprender una subunidad b de hemoglobina humana. La subunidad b de hemoglobina humana se puede nitroxilar en el grupo amino a del residuo de valina de extremo N. La subunidad b de hemoglobina también se puede nitroxilar en el grupo amino e de un residuo de lisina que se selecciona del grupo que consiste en lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina-66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144, y una combinación de estos.
Además, la proteina nitroxilada puede comprender un tetrámero de hemoglobina y el tetrámero de hemoglobina puede comprender alrededor de diecisiete grupos amino nitroxilados.
Proteínas conjugadas con PAO y nitroxiladas La proteina nitroxilada también se puede conjugar con un óxido de polioxiaquileno (PAO). El PAO puede ser un polietilenglicol (PEG).
El PEG puede tener un peso molecular promedio de alrededor de 2000 a alrededor de 20.000 Daltons; alrededor de 3.000 a alrededor de 10.000 Daltons; alrededor de 4.000 a alrededor de 6.000 Daltons; o alrededor de 5.000 Daltons.
La proteina nitroxilada también se puede conjugar con un PEG que es un maleimida-PEG. La maleimida se puede unir con el PEG mediante un enlazador de fenileno o alquileno. El enlazador de alquileno puede ser un enlazador de etileno.
También, la proteina nitroxilada puede tener un PEG conjugado que es un maleimida-PEG conjugado con un resto tiol de la proteina que se selecciona del grupo que consiste en un resto tiol de un residuo de cisteina de la proteina, un resto de tiol de un residuo de lisina tiolada de la proteina y una combinación de estos.
La proteína nitroxilada puede tener un PEG conjugado que es un maleimida-PEG, donde el maleimida-PEG conjugado con un resto tiol intrínseco de una residuo de cisterna o conjugado con un resto tiol de un residuo de lisina tiolado tiene la estructura (VIII ) donde Z representa la proteina, S es el grupo tiol de la proteína, R3 es un grupo fenileno o alquileno, X es un grupo extremo, m es la cantidad promedio de los polímeros de PEG activados conjugados con la proteína, y n representa la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
La proteína nitroxilada puede tener la estructura de la fórmula (VIII) donde R3 es etileno.
La proteína nitroxilada puede tener la estructura de la fórmula (VIII) donde m es alrededor de 6 a alrededor de 10.
La proteína nitroxilada puede tener la estructura de la fórmula (VIII) donde X es metoxi (-OCH3) o carboxilato (-COOH).
La proteína nitroxilada puede tener la estructura de la fórmula (VIII) donde la maleimida-PEG está conjugada con un resto tiol de un residuo de cisteína-93 de una subunidad b de hemoglobina.
La proteína nitroxilada que tiene la estructura de la fórmula (VIII) donde la maleimida-PEG está conjugada con un resto tiol de un residuo de U sina tiolada de una subunidad a o una subunidad b de hemoglobina. La proteína nitroxilada que tiene la estructura de la fórmula (VIII) donde el residuo de lisina tiolada es un residuo de lisina'tiolada de una subunidad a de hemoglobina humana que seleccionada del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61, lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139 y una combinación de estas. La proteína nitroxilada de la fórmula (VIII) donde el residuo de lisina tiolado es un residuo de lisina tiolado de una subunidad b de hemoglobina humana seleccionada del grupo que consiste en lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina-66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144 y una combinación de estos.
Tetrámeros de hemoglobina nitroxilados Un tetrámero de hemoglobina que comprende al menos una subunidad a o al menos una subunidad b de cualquiera de las hemoglobinas nitroxiladas descritas en la presente.
Estos tetrámeros de hemoglobina pueden tener al menos una subunidad a y al menos una subunidad b de cualquiera de las hemoglobinas nitroxiladas descritas en la presente.
Los tetrámeros de hemoglobina pueden comprender dos subunidades a y dos subunidades b de cualquiera de las hemoglobinas nitroxiladas descritas en la presente.
Los tetrámeros de hemoglobina descritos en la presente donde la hemoglobina está conjugada con un promedio de 5 a 10 moléculas de PAO por tetrámero, la hemoglobina está conjugada con un promedio de 7,1 a 8,9 moléculas de PAO por tetrámero.
El tetrámero de hemoglobina donde la hemoglobina está oxigenada.
El tetrámero de hemoglobina donde la hemoglobina está desoxigenada.
El tetrámero de hemoglobina donde la hemoglobina está ligada con CO, NO, o una mezcla de CO y NO.
Los conjugados de hemoglobina de la invención puede encontrarse en forma oxigenada o desoxigenada, pueden estar unidos a CO o NO, o pueden ser una mezcla que incluye dos o más de estas cuatro formas. Se prepara Hb02 mediante el equilibrio de hemoglobina no oxigenada con aire, gas de 02 puro o mezclas de gas 02/nitrógeno.
La desoxigenación puede ser llevada a cabo mediante cualquier método conocido en la téenica. Un método sencillo es la exposición de la solución de hemoglobina a un gas inerte, tal como nitrógeno, argón o helio. Para garantizar que la desoxigenación sea relativamente homogénea, se hace circular la solución de Hb durante el proceso. Puede controlarse la desoxigenación para que alcance niveles deseados mediante el uso de un cooximetro 682 (Instrument Laboratories). Si se deseara una reoxigenación parcial, podría exponerse Hb desoxigenada a oxigeno o a una mezcla de gas que contiene oxigeno, tal como el aire.
Es posible lograr un intercambio de gases para reemplazar oxigeno molecular con otro gas a través de una membrana permeable al gas, tal como una membrana de acetato de celulosa o polipropileno. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 2006/0234915. Los dispositivos de intercambio de gases comercialmente disponibles que emplean estas membranas incluyen el dispositivo de fibras huecas microporosas de polipropileno Celgard™ de Hoechst-Celanese (Dallas, TX) o el oxigenador de fibras huecas Cell-Pharm™ de American Laboratory (East Lyme, CT). En el dispositivo Celgard™ de Hoechst-Celanese, se desoxigena la Hb oxigenada al hacer pasar una solución acuosa de Hb a través de filtros huecos microporosos de .polipropileno a 10-100 ml/min/pies2 mientras que se purga el sistema con nitrógeno a 5-20 psi. En general, se hace circular la Hb durante alrededor de 5 a 30 minutos para lograr el porcentaje de desoxiHb deseado. Otro método para producir Hb desoxigenada comprende la exposición de una solución de Hb a un agente reductor químico, tal como ascorbato de sodio, ditionato de sodio y bisulfito de sodio. La Hb se desoxigena parcialmente mediante el ajuste de la concentración del agente reductor, el tiempo de reacción y la temperatura. De manera alternativa, puede emplearse un agente reductor para desoxigenar en forma significativa la Hb y luego, puede reintroducirse el oxigeno para formar un producto parcialmente desoxigenado. Por ejemplo, se puede exponer Hb a una concentración de 100 mM de bisulfito de sodio durante alrededor de una hora antes de agregar los antioxidantes.
Es posible ligar la Hb a CO a través de cualquier método conocido de formación de oxihemoglobina, mediante la sustitución de CO por 02. Usualmente, esto implica la introducción de una fuente de CO en una solución de hemoglobina, de forma tal que la hemoglobina se liga a CO en lugar del 02 (K. D. Vandegriff et ál., Biochem. J.382:183-189 (2004)). Debido a que la hemoglobina tiene una mayor afinidad por CO que por el oxigeno, no es necesario desoxigenar la hemoglobina en primer lugar. Por consiguiente, la forma más conveniente para formar complejos CO-Hb implica la introducción de CO 100 % gaseoso en una solución de hemoglobina.
HbNO puede ser preparado mediante la reacción de hemoglobina desoxigenada con óxido nítrico gaseoso o mediante la exposición de CO-Hb a NO gaseoso, de forma tal que NO se intercambie con CO. Asimismo, HbNO también puede ser producido mediante la reacción de hemoglobina desoxigenada con una molécula donante de NO pequeña tipo PROLI NONOate™ (es decir, 1-(hidroxi-NNO-azoxi)-L-prolina, sal disódica; Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan).
Debe tenerse en cuenta que la hemoglobina a la que se une NO, un radical libre, a los grupos laterales de aminoácidos en la cadena de globina no son complejos NO-Hb como los definidos en la presente debido a que dichos compuestos no contienen NO (no iónico) diatómico como un ligando en el bolsillo del hemo en lugar de oxigeno. Por ejemplo, se forma nitrosilhemoglobina cuando se expone hemoglobina nativa a un donador de NO en condiciones que hacen que se una a grupos sulfhidrilo libres (patente estadounidense n.° 6,627,738). Tales nitrosilhemoglobinas también portan oxigeno, mientras que los complejos de NO-Hb de' la presente invención no lo hacen. Además, cuando se forma la hemoglobina modificada mediante una reacción dirigida a los restos sulfhidrilo, tal como se describió anteriormente, dichos restos dejan de estar disponibles para unión a NO.
Los métodos para la nitroxilación de proteínas y proteínas modificadas con PAO.
La presente invención también se refiere a métodos para la nitroxilación de proteínas, incluyendo proteínas modificadas con PAO. Los métodos de la presente invención proporcionan nitroxilación específica del sitio y se puede realizar en condiciones de reacción favorables. La hemoglobina PEGilada-nitroxilada producida utilizando estos métodos ha mejorado el tiempo de circulación y estabilidad de las proteínas, así como también una alta afinidad por el oxígeno.
La proteína nitroxilada se puede preparar reaccionando la proteína con un agente de nitroxilación de la fórmula (II) donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo C1-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; y m es 0 o 1.
El método para elaborar una proteína nitroxilada donde el agente de nitroxilación de la fórmula (II) tiene Ri, R2, R3, R4, Y, y m como se define en relación con fórmula (II) y X es oxigeno o azufre.
El método para elaborar una proteina nitroxilada donde el agente de nitroxilación de la fórmula (II) tiene Ri, R2, R3, R4, Y, y m como se define en relación con fórmula (II) y X es oxigeno.
El método para elaborar una proteina nitroxilada donde el agente de nitroxilación de la fórmula (II) tiene Y y m como se definió en relación con la fórmula (II), X es oxigeno y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
Un método para preparar una proteina nitroxilada que comprende reaccionar la proteina con un agente de nitroxilación de la fórmula (IV): donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo Ci~C4; Y es CH2; y m es 0 o 1. El método de la reivindicación G2, donde cada uno de Ri, R2, R3 y R4 es independientemente -CH3.
El método para elaborar una proteina nitroxilada donde el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) tiene X, Y y m como se definió en relación con la fórmula (II) o (IV) y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
El método para elaborar una proteina nitroxilada donde el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) tiene Ri, R2, R3, R4, X y Y como se define en relación con fórmula (II) o (IV) y m es 0.
El método para elaborar una proteina nitroxilada donde el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) tiene Ri, R2 , R3, R4, X e Y como se define en relación con fórmula (II) o (IV) y m es 1.
El método para hacer una proteina nitroxilada donde la relación del agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) está presente en un exceso molar de alrededor de 5 a alrededor de 100 veces sobre la proteina.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la proteína comprende una subunidad a o una subunidad b de un tetrámero de hemoglobina. El método donde la proteína comprende un tetrámero de hemoglobina. El método donde el tetrámero de hemoglobina es un tetrámero de hemoglobina no oxigenado. El método donde el tetrámero de hemoglobina no oxigenado es un tetrámero de hemoglobina ligado a CO. El método donde el tetrámero de hemoglobina es un tetrámero de hemoglobina desoxigenado.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la reacción es llevada a cabo a una temperatura de alrededor de 2°C a alrededor de 30°C; alrededor de 15°C a alrededor de 25°C; alrededor de 2°C a alrededor de 8°C; alrededor de 4°C; o alrededor de 20°C.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la reacción se deja continuar durante alrededor de tres a alrededor de 20 horas; alrededor de tres a alrededor de seis horas; o alrededor de 16 horas.
El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la reacción se lleva a cabo en un solvente acuoso.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la reacción es llevada a cabo a un pH de alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5; un pH de alrededor de 7,5 o un pH de alrededor de 7,2.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la proteína comprende un tetrámero de hemoglobina, la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,2 y una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 8 °C y se deja continuar por alrededor de dieciséis horas, y donde el método proporciona un tetrámero de hemoglobina nitroxilado que tiene alrededor de 17 grupos amino nitroxilados.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV), donde la proteína comprende un tetrámero de hemoglobina, y el agente de nitroxilación está presente a un exceso molar de alrededor de 10 a alrededor de 100 veces sobre el tetrámero de hemoglobina.
El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde el producto de la reacción es una proteina nitroxilada de la fórmula (VI) o (VII) o un tetrámero de hemoglobina descrito en la presente.
El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) que comprende además conjugar la proteina con un óxido de polialquileno (PA0) El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) que comprende además agregar PAO valerato succinimidilo a la proteina en el diluyente acuoso para formar una proteina conjugada con PAO-valerato. El método comprende además mezclar la proteina con 2-iminotiolano (2-IT) en un diluyente acuoso para formar una proteina tiolada, y agregar PAO-maleimida a la proteina tiolada en el diluyente acuoso para formar una proteina conjugada de PAO-maleimida. El método donde el PAO es un polietilenglicol (PEG).
El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) que comprende además conjugar la proteína con un óxido de polialquileno (PAO) y donde el PAO es un polietilenglicol (PEG) donde el PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons; alrededor de 3.000 a alrededor de 10.000 Daltons; alrededor de 2.000 a alrededor de 6.000 Daltons; o alrededor de 5.000 Daltons.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde el PEG es una maleimida-PEG. El método donde la maleimida se encuentra enlazada al PEG a través de un enlace alquileno o fenileno. El método donde el enlazador alquileno en un enlazador etileno. El método donde la maleimida-PEG se conjuga con un resto tiol de la proteína seleccionado de un grupo que consiste en un resto de tiol intrínseco de un residuo cisteína de la proteína, un resto tiol de un residuo lisina tiolada de la proteína o una combinación de ellos.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la maleimida-PEG conjugada con un resto tiol intrínseco de un residuo de cisteína tiene la estructura (VIII) donde Z representa la proteína, R3 es un grupo fenileno o alquileno, S es el grupo tiol de la proteína, m es la cantidad promedio de los polímeros de PEG activados conjugados con la proteína, y n representa la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
El método donde la maleimida-PEG conjugada con un resto tiol intrínseco de un residuo de cisteína tiene la estructura (VIII) donde R3 es etileno. El método donde la proteína comprende una subunidad de hemoglobina a, una subunidad de hemoglobina b, un tetrámero de hemoglobina, una mioglobina, o una albúmina. El método donde la proteína comprende una albúmina de suero. El método donde la albúmina de suero comprende albúmina de suero humano (HSA). El método donde la proteína comprende un tetrámero de hemoglobina.
El método donde el tetrámero de hemoglobina comprende un dímero aa reticulado o un dimero bb reticulado. El método donde la maleimida-PEG está conjugada con un resto tiol de un residuo de cisteína-93 de una subunidad b de hemoglobina. El método donde la maleimida-PEG está conjugada con un resto tiol de un residuo de lisina tiolado de una subunidad de hemoglobina a o una subunidad de hemoglobina b. El método donde el residuo de lisina tiolada es un residuo de lisina tiolada de una subunidad a de hemoglobina humana seleccionada del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61, lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139 y una combinación de estas. El método donde el residuo de lisina tiolado es un residuo de lisina tiolado de una subunidad b de hemoglobina humana seleccionada del grupo que consiste en lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina-66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144, y una combinación de estos.
El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde 2-iminitiolano está presente a una concentración de exceso molar de entre alrededor de 7 a alrededor de 15 veces sobre la concentración de la proteina; un exceso molar de entre alrededor de 7 y alrededor de 8 veces sobre la concentración de la proteína; o un exceso molar de entre alrededor de 7-.5 veces sobre la concentración de la proteína.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la PAO-maleimida está presente a una concentración de exceso molar de entre alrededor de 9 a alrededor de 20 veces sobre la concentración de la proteína; un exceso molar de entre alrededor de 9 y alrededor de 15 veces sobre la concentración de la proteína; o un exceso molar de alrededor de 12 veces sobre la concentración de la proteína.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la etapa de tiolación es llevada a cabo a un pH de alrededor de 7 y alrededor de 9; o a un pH de alrededor de 8,5.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la etapa de agregar la PAO-maleimida a la proteína tiolada para formar una proteína conjugada con PAO-maleimida es llevada a cabo a un pH de alrededor de 6,5 y alrededor de 8,5; o a un pH de alrededor de 7,5.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde el PEG es un SVA-PEG. El método donde la succinimida está enlazada al PEG a través de -C(O)-(CH2)4-. El SVA-PEG se puede conjugar con un resto amino de la proteína seleccionada de un resto amino e de una residuo de lisina de la proteína, un resto amino OÍde un residuo de valina terminal de la proteína o una combinación de estos. El SVA-PEG también se puede conjugar con un resto amino e de una residuo de lisina de la proteína, un resto amino a de un residuo de valina terminal de la proteína tiene la estructura (IX) donde Z es la proteina, N es un nitrógeno de la proteína, X es un grupo terminal, m es la cantidad de los polímeros de PEG activados conjugados con la proteína, y n es la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
X es un grupo terminal de PAO, y puede ser hidroxi, ariloxi tal como benciloxi, o un alcoxi C1-C20, más preferentemente un grupo alcoxi C1-C10, y aun más preferentemente un grupo alcoxi C1-C5 tal como metoxi o etoxi.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde para la fórmula IX, m es en promedio de alrededor de 6 a alrededor de 10 moléculas PAO por tetrámero. El SVA-PEG está conjugado con un resto amino e de un residuo de lisina de una subunidad a de hemoglobina o una subunidad b de hemoglobina. El SVA-PEG está conjugado con un resto amino a de un residuo de valina terminal de una subunidad a de hemoglobina o una subunidad b de hemoglobina.
El método para elaborar una proteína nitroxilada utilizando un agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde para la fórmula IX, el residuo de lisina es un residuo de lisina de una subunidad a de hemoglobina humana seleccionada del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61,. lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139 y una combinación de estas. El residuo de lisina es un residuo de lisina de una subunidad b de hemoglobina seleccionada del grupo que consiste en lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina- 66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144, y una combinación de estos.
El método para elaborar una proteina nitroxilada utilizando el agente de nitroxilación de la fórmula (II) o (IV) donde la proteina está conjugada con PAO antes de la nitroxilación de la proteina. La etapa de agregar el PAO-maleimida a la proteina tiolada para formar una proteina conjugada de PAO-maleimida se puede realizar simultáneamente con la nitroxilación de la proteina. La etapa de agregar el PAO valerato succinimidilo a la proteina para formar una proteina conjugada de PAO-valerato se realiza simultáneamente con la nitroxilación de la proteina.
En cualquiera de los métodos antemencionados, el grado de sustitución de nitroxilo se puede evaluar y cuantificar utilizando resonancia paramagnética electrónica (EPR) o espectroscopia de masas MALDI-TOF.
Composiciones farmacéuticas Los conjugados de PAO-Hb de la presente invención pueden formularse como una composición farmacéutica que comprende el conjugado PAO-Hb en un portador farmacéuticamente aceptable para administración parenteral, tal como un diluyente acuoso. La concentración del conjugado PAO-Hb en el portador puede variar conforme a la aplicación. Preferentemente, la concentración del conjugado PAO-Hb varia de alrededor de 0,1 g/dl a alrededor de 10 g/dl, más preferentemente, de alrededor de 2,0 g/dl a alrededor de 8,0 g/dl y más preferentemente, de 4,0 a alrededor de 6,0 g/dl. La selección de una concentración adecuada de hemoglobina depende de las propiedades (oncóticas) osmóticas coloidales del producto final de hemoglobina. Preferentemente, las composiciones de la invención son normooncóticas en comparación con sangre entera o hiperoncótica en comparación con plasma. Es posible ajustar la concentración de hemoglobina para obtener la presión oncótica deseada para cada indicación.
Cuando la composición se formula como una composición parenteral, la solución generalmente comprende un portador de electrolitos fisiológicamente compatible isosmótico con sangre entera y que mantiene las propiedades de administración y transporte de CO, NO u oxigeno reversibles de la hemoglobina.
El portador farmacéuticamente aceptable puede ser un diluyente acuoso. El diluyente acuoso puede comprender una solución acuosa de un coloide o una solución acuosa de un componente que no porta oxigeno, tal como una solución de proteínas tales como albúmina, una solución acuosa de glicoproteínas, una solución acuosa de polisacáridos o una combinación de ellas. El diluyente acuoso puede comprender una solución acuosa libre de células.
Diluyentes acuosos adecuados incluyen, de modo no taxativo, solución salina fisiológica, una mezcla de solución salina y glucosa, solución de Ringer, solución láctica de Ringer, solución de Locke-Ringer, solución de Krebs-Ringer, solución salina equilibrada de Hartmann, solución de dextrosa-ácido cítrico-citrato de sodio heparinizada, una solución de acetato, una solución de electrolitos mútiples (por ejemplo, Plasma Lyte® o Plasma Lyte-A® de Baxter International, Deerfield, IL), una solución de lactobionato y sustitutos de plasma poliméricos, tales como óxido de polietileno, polivinilpirrolidona, polivinilalcohol, un condensado de propilenglicol-óxido de etileno o una combinación de ellos.
La composición también puede comprender rellenos, sales u otros materiales conocidos en la téenica y farmacéuticamente aceptables, cuya selección dependerá de la forma de dosificación, la afección que se trata, el fin particular al que se apunta, conforme a lo decidido por el experto en el área, y las propiedades de tales aditivos. Por ejemplo, la composición puede incluir soluciones amortiguadoras fisiológicas, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manitol o sorbitol), alcoholes o polialcoholes, sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, cloruro de potasio o de sodio), tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 80), antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes de presión oncótica (por ejemplo, albúmina o polietilenglicoles) o agentes reductores (por ejemplo, ácido ascórbico, glutatión o N-acetil cisteina).
Las composiciones farmacéuticas tienen una viscosidad de al menos alrededor de 2 centipoise (cP). Más específicamente, la viscosidad varía de alrededor de 2 a alrededor de 5 cP y particularmente, de alrededor de 2,5 a alrededor de 4,5 cP.
Para evitar complicaciones al momento de la administración, la composición farmacéutica tiene una pureza elevada, es decir, es libre de estromas, fosfolípidos y pirógenos, tiene un nivel de endotoxinas que no supera 0,25 EU/ml, según se determina mediante ensayo de LAL (lisado de amebocitos de Limulus) y presenta menos de 8 % de metemoglobina.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en forma parenteral, tal como mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular, o como soluciones parenterales de gran volumen. Las composiciones también pueden ser administradas mediante sonda.
Una dosis usual de conjugado de hemoglobina como agente terapéutico puede variar de alrededor de 1 a alrededor de 15.000 miligramos de hemoglobina por kilogramo de peso corporal del paciente. Por ejemplo, cuando se utiliza como agente terapéutico con oxigeno, la dosis puede variar entre 100 y 7.500 mg/kg peso corporal del paciente, más preferentemente, de 500 a 5.000 mg/kg peso corporal del paciente y más preferentemente, de 700 a 3.000 mg/kg peso corporal. Por lo tanto, una dosis usual para un paciente humano puede variar de un gramo a más de 1.000 gramos. Se observará que no es necesario que el contenido unitario de ingredientes activos contenidos en una dosis individual de cada forma de dosificación constituya por si mismo una cantidad eficaz, ya que la cantidad eficaz necesaria se puede alcanzar mediante la administración de varias dosis individuales. La selección de la dosis depende de la forma de dosificación utilizada, la afección que se trata y el fin particular que se busca conforme a lo determinado por los expertos en la téenica.
Metodos de tratamiento Los conjugados PAO-Hb y las composiciones farmacéuticas pueden ser utilizados para administrar oxígeno, CO y/o NO a un sujeto. Un método de administración de oxígeno, óxido nítrico, monóxido de carbono o mezclas de ellos al tejido y de reducción de nitrito para producir óxido nítrico endógeno (NO) adicional en la microvasculatura incluye la administración del conjugado de hemoglobina o de la composición a un sujeto que lo necesita, en el que, luego de la administración, la hemoglobina se desliga y convierte nitrito en óxido nítrico en la microvasculatura.
Los conjugados de hemoglobina y las composiciones de estos de la invención se pueden utilizar: para tratar insuficiencia hepática aguda, beta talasemia, una quemadura, isquemia aguda crónica de' las extremidades inferiores, intoxicación con dióxido de carbono o cianuro, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (por ejemplo, exacerbación grave), insuficiencia cardíaca congestiva (por ejemplo, insuficiencia cardíaca grave, insuficiencia cardíaca grave), hipoxia (por ejemplo, debido a la altura, que incluyen edema pulmonar, síndrome de descompresión), malaria (por ejemplo, malaria cerebral (eventos oclusivos de Falciparum), isquemia orgánica (por ejemplo, isquemia intestinal grave (torsión), isquemia intestinal aguda (embolia), shock cardiogénico, isquemia orgánica vascular grave, apoplejía (antes de tomografía computada), apoplejía (después de tomografía computada), infarto de miocardio/isquemia cardíaca grave), enfermedad vascular periférica, porfiria, preeclampsia en el embarazo, sepsis, anemia falciforme (por ejemplo, ataque isquémico transitorio/apoplejía, secuestro esplénico, secuestro hepático, priapismo), enfermedades de la retina/afecciones infraoculares (por ejemplo, oclusión de la arteria retinal central, oclusión de la vena central), torsión testicular, traumatismo/shock (por ejemplo, shock hemorrágio traumático, shock hemorrágico no traumático, uso en el campo (militar/emergencia)/prehospitalario, traumatismo cerebral, contusión pulmonar), úlceras o vasoespasmos; como adjunto a la angioplastía y a la cirugía plástica (colgajos cutáneos) (por ejemplo, tratamiento grave, tratamiento crónico) o como un adjunto para implantar un dispositivo de asistencia ventricular; como un sustituto de sangre (por ejemplo, en casos de pérdida de sangre grave, testigos de Jehová, dificultad para encontrar un paciente compatible, grupo de sangre raro, crisis aplástica falciforme, gestión de anemia perioperatoria de células falciformes, anemia hemolítica grave (autoinmuntaria), anemia hemolítica grave (toxina) u otra anemia refractaria, un cardioprotector, un criopreservador, un adjunto a la hemodiálisis, un agente oncológico (por ejemplo, adjunto a la radioterapia o guimioterapia, tumores sólidos), un conservador de órganos (por ejemplo, ex vivo, en donante, en receptor), un agente para mejorar el rendimiento (por ejemplo, civil/atleta, militar),, un adjunto a la cirugía (por ejemplo, bypass cardiopulmonar (cebador), bypass cardiopulmonar (ajuste), isquemia pulmonar, acondicionamiento prequirúrgico, ruptura de aneurisma aórtico, reemplazo de aorta torácica (disección o aneurisma), o un agente cicatrizante de heridas; en imaginología (rayos X o imagen por resonancia magnética (IRM)); para mejorar la función pulmonar (por ejemplo, lesión pulmonar grave, lesión pulmonar crónica, neumonía viral transitoria, síndrome de dificultad respiratoria .neonatal); o una combinación de ellos. Dichos usos incluyen la administración del conjugado o composición a un sujeto que lo necesita.
Además, las hemoglobinas y composiciones de la invención pueden ser utilizadas para tratar shock hemorrágico no traumático, traumatismos previos al ingreso hospitalario, shock hemorrágico traumático, lesión pulmonar grave, síndrome de dificultad respiratoria aguda en adultos, apoplejía, cáncer de tumor sólido, degradación orgánica (ex vivo), degradación orgánica (en el receptor), sepsis aguda/shock séptico, infarto de miocardio/isquemia cardiaca, shock cardiogénico, insuficiencia cardiaca aguda, embolia pulmonar, diversas afecciones quirúrgicas (por ejemplo, como adjunto a la angioplastia, como adjunto a la reparación de aorta torácica, como adjunto a los procedimientos de bypass cardiopulmonar, como solución de cebado para bypass cardiopulmonar) o una combinación de ellos.
Los diversos contextos clínicos en los que resultan útiles las hemoglobinas y composiciones de la presente invención incluyen los siguientes: Traumatismo. Una pérdida grave de sangre entera puede tener como consecuencia un desplazamiento de fluidos en los espacios intersticial e intracelular para reemplazar el volumen perdido de sangre con el desvío de la sangre de los órganos de baja prioridad, los que incluyen la piel y los intestinos. La derivación de sangre de los órganos reduce los niveles de 02 en dichos órganos, y en algunos casos los elimina, lo que tiene como resultado la muerte progresiva de tejidos. La meta principal es oxigenar los tejidos afectados. Este tipo de traumatismo puede ocurrir en un entorno prehospitalario o puede ocasionar shock hemorrágico traumático o lesión cerebral traumática.
Isquemia. Los conjugados y sus composiciones pueden ser utilizados para administrar oxigeno, CO y/o NO a áreas en las que no pueden penetrar los glóbulos rojos u otros muchos agentes terapéuticos de oxigeno. Estas áreas pueden incluir cualesquiera áreas de tejido ubicadas posteriormente a las obstrucciones del flujo de glóbulos rojos, tales como áreas posteriores a trombos, oclusiones de células falciformes, oclusiones arteriales, balón para angioplastia, instrumentos quirúrgicos y cualesquiera tejidos que padezcan de falta de oxigeno o se encuentren en estado de hipoxia. Todos los tipos de isquemia en tejidos pueden ser tratados, lo que incluye, por ejemplo, apoplejía, apoplejía incipiente, ataques isquémicos transitorios, miocardio aturdido e hibernante, angina inestable o grave, angina incipiente, infarto y similares. En particular, las afecciones que resultan en isquemia incluye insuficiencia cardiaca grave, shock cardiogénico, infarto de miocardio/isquemia cardíaca, apoplejía, embolia pulmonar, shock hemorrágico no traumático o traumatismo cerebrovascular.
Hemodilución. En la presente solicitud, los agentes terapéuticos son administrados para reemplazar (o sustituir) los niveles de 02 de la sangre autóloga extraída. Esto permite el uso de la sangre autóloga extraída en transfusiones necesarias durante la cirugía y luego de ella. Un procedimiento de bypass cardiopulmonar es uno de estos tipos de cirugía que requiere la extracción de sangre antes del procedimiento quirúrgico.
Sepsis/Shock séptico. En casos de sepsis, algunos pacientes pueden presentar hipertensión a pesar de la terapia con gran cantidad de fluidos y del tratamiento con agentes vasoconstrictores. En dichos casos, la sobreproducción de óxido nítrico (NO) tiene como consecuencia el descenso de la presión sanguínea. Por lo tanto, la hemoglobina es un agente deseable para el tratamiento de estos pacientes, dado que la hemoglobina se une a NO con gran avidez.
Hipoxemia. Cuando un paciente presenta una lesión pulmonar grave ocasionada ya sea por neumonía o pancreatitis, puede observarse hipoxia que puede ser aliviada mediante la provisión de hemoglobina o composiciones de la presente invención para oxigenar los tejidos afectados.
Cáncer. La administración de 02 al núcleo interno hipóxico de una masa tumoral sólida aumenta su sensibilidad a radioterapia y quimioterapia. Debido a que la microvasculatura de un tumor es diferente a la de otros tejidos, su sensibilización mediante el aumento de niveles de 02 requiere que el 02 se descargue en el núcleo hipóxico. En otras palabras, P50 debería ser muy bajo para evitar la descarga temprana de 02, para aumentar los niveles de 02, con el fin de garantizar la sensibilización óptima del tumor a tratamientos posteriores de radiación y quimioterapia.
Cirugía. Es posible utilizar las hemoglobinas y composiciones de la invención en el trascurso de diversos procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, pueden ser utilizados como adjunto a la angioplastía o de reparación de aorta torácica, durante un procedimiento de bypass cadiopulmonar o como solución cebadora cardiopulmonar.
Perfusión orgánica. Durante el período de tiempo en el que se mantiene un órgano ex vivo o en un receptor de donación de órganos, mantener el contenido de 02 ayuda a preservar la integridad celular y estructural y minimiza la formación de infartos. Las hemoglobinas y composiciones pueden cumplir con los requisitos de oxígeno para dicho órgano.
Es posible utilizar las hemoglobinas y sus composiciones en sujetos no humanos, tales como animales domésticos (por ejemplo, en ganado y animales de compañía tales como perros, gatos, caballos, pájaros, reptiles). Se contempla que la presente invención encuentra utilidad en el tratamiento de emergencia de los animales domésticos y salvajes que tienen una pérdida de sangre debido a una herida, anemias hemolíticas, etc. Los usos veterinarios incluyen tratamiento por pérdida de sangre por heridas, anemia hemolítica, anemia infecciosa equina, anemia infecciosa felina, infecciones bacterianas, fragmentación del Factor IV, hiperesplenia y esplenomegalia, síndrome hemorrágico aviar, anemia hipoplástica, anemia aplásica, afecciones hemolíticas inmunitarias idiopáticas, deficiencia de hierro, anemia hemolitica isoinmunitaria, . anemia hemolítica microangiopática, parasitismo o daño cerebral provocado por la anestesia administrada para procedimientos quirúrgicos.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Síntesis de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC; 1-(((2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi)-4-oxicarbonil)oxi)-2,5-pirrolidinediona) Un gramo de 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPOL) se disolvió en 20 mL de acetonitrilo anhidro y se mezcló durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez que se disolvió el TEMPOL, se agregaron 2,975 g de carbonato de N,N'-Disuccinimidilo (DSC) (2 eq) y 2,425 mL de trietilamina (3,0 eq) a la reacción. La reacción se realizó a temperatura ambiente, en condiciones anaeróbicas durante 6-8 horas. Luego que terminó la reacción, el solvente se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con solución acuosa saturada de CuSO4. La fase orgánica se separó y se agregó 0,5 g de Na2S04 por gramo de TEMPOL a la fase orgánica. La solución se mezcló durante 15 minutos a temperatura ambiente seguido de filtrado. La solución filtrada se evaporó a presión reducida. El producto, 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato, se precipitó al agregar n-heptano, se filtró y se secó al vacio a temperatura ambiente.
Un esquema de reacción para la preparación de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato se muestra a continuación.
. Ejemplo 2. Análisis de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) Se realizó espectroscopia de masas de alta precisión ESI-TOF en el material de partida TEMPOL y el producto final 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) para confirmar la conversión de TEMPOL a 4-STC (Figuras 1 y 2).
Además, tal como se mostró en la Figura 3, se realizó cromatografía en capa fina en los materiales de partida TEMPOL (carril 1) y carbonato de N,N'-Disuccinimidilo (DSC, vía 3), y el producto de reacción a las 6 horas (carril 4) y el producto final 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato luego de la precipitación (carril 5). El carril 2 se cargó con N-hidroxi-succinimida (NHS), un subproducto de la reacción que se libera de DSC durante la reacción. Tal como se puede ver de la Figura 3, el producto final no contiene ninguno de los materiales de partida o los subproductos.
Ejemplo 3. Sintesis de 3-Succinimidil-PROXYL-Carbonato (3-SPC; 1-(((2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi)-3-oxicarbonil)oxi)-2,5-pirrolidinediona) 3-Succinimidiyl-PROXYL-Carbonato se puede preparar utilizando un método similar a aquellos descritos anteriormente en el Ejemplo 1 para 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato, utilizando 3-hidroxi-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-l-oxilo en vez de TEMPOL como material de partida.
Ejemplo 4. Síntesis de 4-succinimidil-carboxi-TEMPO (4-SCT; 1-(((2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxi)-4-carbonil)oxi)-2,5-pirrolidinediona) Un gramo de 4-Carboxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-l-oxilo (4-Carboxi TEMPO) se disolvió en 75 mL de tetrahidrofurano y se mezcló durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez que se disolvió el 4-Carboxi TEMPO, se agregaron 0,632 g de N-Hidroxisuccinimida (NHS) (1,1 eq) y 1,15 g de N,N'-Diciclohexilcarbodiimida (1,1 eq) a la reacción. La reacción se realizó a temperatura ambiente, en condiciones anaeróbicas durante 24 horas. Luego que terminó la reacción, la solución se filtró y se evaporó a presión reducida. Se disolvió el residuo en acetato de etilo y se lavó con agua. La fase orgánica se separó y se agregó 0,5 g de Na2SO4 por gramo de 4-Carboxi-TEMPO a la fase orgánica. La solución se mezcló durante 15 minutos a temperatura ambiente seguido de filtrado. La solución filtrada se evaporó a presión reducida. El producto, 4-Succinimidíl-Carboxi-TEMPO, se precipitó al agregar n-heptano, se filtró y se secó al vacio a temperatura ambiente.
Un esquema de reacción para la preparación de 4-Succinimidil-Carboxi-TEMPO se muestra a continuación: i i l i Ejemplo 5. Sintesis de 3-Succinimidil-Carboxi-PROXYL (3- SCP; 1-(((2,2,5,5-te rame il-1-pirrolidiniloxi)-3 carbonil) oxi-2 , 5-pirrolidined±ona) . 3-Succinimidil-Carboxi Proxil se puede sintetizar utilizando la misma química descrita anteriormente en el Ejemplo 3 para 4-Succinimidil-Carboxi-TEMPO, utilizando 3-carbox,i-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-1-oxilo (3-Carboxi PROXYL) en vez de 4-Carboxi TEMPO como material de partida.
Ejemplo 6. Preparación de hemoglobina PESilada polinitroxilada (PN-PEG-Hb) La hemoglobina polinitroxilada se preparó en un proceso de dos etapas: a) Preparación de hemoglobina conjugada con PEG y b) Polinitroxilación de PEG-Hb.
Se conjugó PEG con hemoglobina sin estroma (SFH, por sus siglas en inglés) al reaccionar el SFH con exceso molar de 9 veces de 2-iminotiolano (2-IT) durante 2,5 horas y un exceso molar de 16 veces de maleimida PEG 500 (MalPEG5000) durante 2 horas. Las reacciones de tiolación y PEGilación se realizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un pH de 7,4. Tal como se mostró en el esquema de reacción debajo, los residuos de lisina tiolados de 2-iminotiolano y el MalPEG5000 reaccionan con fióles intrínsecos de los residuos p-Cys93 y residuos de lisina tiolados: «I «i .
Ri, R2 y R3 representan lo que resta de la cadena principal de hemoglobina, R4 es etileno, y n representa el número de unidades de oxietileno en una cadena PEG de 5.000 dalton. Aunque el esquema de reacción anterior muestra la tiolación y la pegilación como etapas separadas, la reacción se realiza como una reacción en "un solo recipiente", con el SFH, 2-IT y MalPEG5000 incluido en una sola mezcla de reacción.
La polinitroxilación del PEG-Hb se realizó utilizando carboxi-PEG-Hb. La reacción se realizó utilizando un exceso molar de 30 veces de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) sobre hemoglobina en una atmósfera de CO a temperatura ambiente o en condiciones de refrigeración. La cantidad de grupos nitroxilo por molécula de hemoglobina puede ser variada al variar el exceso molar de 4-STC sobre hemoglobina, la temperatura a la que la reacción se lleva a cabo, y/o el tiempo de reacción. La hemoglobina polinitroxilada se purificó utilizando filtrado de flujo tangencial de 70 kDa y el producto final se filtró en condiciones estériles y se almacenó en una atmósfera de CO. Un esquema de reacción para la preparación de PN-PEG-Hb a partir de PEG-Hb se muestra a continuación: - - [ - - MP4-PN Ri , R2 y R3 representa el resto de la cadena principal de hemoglobina.
Ejemplo 7. Caracterización de hemoglobina PEGilada polinitroxilada (PN-PEG-Hb) La Figura 4 muestra el espectro de la resonancia paramagnética electrónica (EPR) para electrones no emparejados de TE POL (panel superior), y hemoglobina PEGilada (MP4) antes (panel central) y después (panel inferior) de la polinitroxilación (PN-MP4).
La Figura 5 presenta perfiles de análisis de exclusión por tamaño de la hemoglobina PEGilada (PEG-Hb, panel superior) y la hemoglobina PEGilada polinitroxilada (PEG-Hb-PN, panel inferior). Los análisis de exclusión por tamaño se realizaron utilizando una columna Superóse 12 y se eluyó la proteina utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS).
La Figura 6 muestra un espectro de UV-Visible característico de la hemoglobina PEGilada polinitroxilada (PEG-Hb-PN).
La estabilidad del PEG-Hb-PN se evaluó in vivo al administrar 10 % de carga superior en ratas. La Figura 7 muestra un espectro UV-Vis de hemoglobina plasmática al final de la infusión y a una hora luego de la infusión.
La Figura 8 muestra los resultados de un experimento donde la hemoglobina PEGilada (MP4) fue nitroxilada utilizando un exceso molar de 5, 10, 20, 30, 50 o 100 veces de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC). El grado de nitroxilación aumentó en una manera dependiente de la dosis mientras que el exceso molar de 4-STC aumentó de 5 a 30 veces. El grado de nitroxilación fue aproximadamente el mismo cuando se utilizó un exceso molar de 30, 50 o 100 veces de 4-STC.
Ejemplo 8. Preparación de albúmina polinitroxilada (PN- Alb) La polinitroxilación de la albúmina se realizó utilizando una solución de albúmina de suero humano al 25 %. La cantidad de grupos de nitroxilo por molécula de albúmina varió al variar el exceso molar de 4-STC sobre albúmina. La reacción se realizó utilizando un exceso molar de 5, 10, 20, 30, 50 o 100 veces de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) sobre albúmina a pH de 7,4 durante 17 a 24 horas a temperatura ambiente o en condiciones de refrigeración. La albúmina polinitroxilada se purificó mediante filtrado con gel y se analizó mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF para identificar la cantidad de números de nitroxilo por molécula de albúmina. Un esquema de reacción para la separación de PN-Albúmina de la albúmina utilizando 4-Succinimidil-TEMPO- Carbonato (4-STC) se muestra a continuación: i l i Ri y R2 representa el resto de la cadena principal de albúmina.
El espectro de masas MALDI-TOF se muestra en las Figuras 9 y 13 (HSA no nitroxilada) y 10-12 y 14-16 (HSA nitroxilada utilizando un exceso molar de 5, 10, 20, 30, 50 o 100 veces de 4-STC, respectivamente). La Figura 17 proporciona una representación gráfica de estos datos, y muestra que el grado de nitroxilación aumentó en una manera dependiente de la dosis mientras que el exceso molar de 4-STC aumentó de 5 a 100 veces.
Ejemplo 9. Preparación de albúmina PEGilada polinitroxilada (PN-PEG-Alb).
La albúmina PEGilada polinitroxilada se preparó en un proceso de dos etapas: a) Preparación de albúmina conjugada con PEG y b) Polinitroxilación de PEG-Alb.
Se conjugó PEG con albúmina al reaccionar la albúmina con exceso molar de 9 veces de 2-iminotiolano (2-IT) durante 2,5 horas y un exceso molar de 16 veces de maleimida PEG 5000 (MalPEG5000) durante 2 horas. Las reacciones de tiolación y PEGilación se realizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un pH de 7,4. Luego de 2 horas de PEGilación, el conjugado de PEG-albúmina se pasó por un filtrado de flujo tangencial de 70 kDa para quitar los reactivos sin reaccionar y formular en amortiguador de formulación. La polinitroxilación se realizó al hacer reaccionar PEG-albúmina con 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) utilizando un exceso molar de 100 veces de 4-Succinimidil-TEMPO-Carbonato (4-STC) sobre albúmina a temperatura ambiente o en condiciones de refrigeración. La cantidad de grupos nitroxilo por molécula de albúmina puede ser variada al variar el exceso molar de 4-STC sobre albúmina, la temperatura a la que la reacción se lleva a cabo y/o el tiempo de reacción. La albúmina polinitroxilada se purificó utilizando filtrado de flujo tangencial de 70 kDa. Un esquema de reacción para la preparación de PN-PEG-Alb a partir de PEG-Alb se muestra a continuación: - Rj Residuo de lisina de albúmina 111 Albúmina tiolada i - - - Ri, R2 y R3 representan lo que resta de la cadena principal de albúmina, R4 es etileno, y n representa el número de unidades de oxietileno en una cadena PEG de 5.000 dalton.

Claims (157)

REIVINDICACIONES
1. Un agente de nitroxilación de la fórmula (I): donde: cada Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo C1-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; n es 0 o 1; y m es 0 o 1.
2. Un método para preparar el agente de nitroxilación de la fórmula (II) que comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula (III) . con carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en la presencia de una base orgánica; donde cada Ri, R2, R3 y R4 es independientemente alquilo Ci-C4; X es oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; y m es 0 o 1.
3. Un método para preparar un agente de nitroxilación de la fórmula (IV) que comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula (V) con N-hidroxisuccinimida (NHS) en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC); donde cada Ri, R2, R3, y R4 es independientemente alquilo Ci~C4; Y es CH2; y m es 0 o 1.
4. Una proteina nitroxilada que tiene la estructura (VI): donde Z representa la proteina; cada uno de Ri, R2, R3, y R4 son independientemente alquilo C1-C4; X es oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; m es 0 o 1; n es 0 o 1; p es la cantidad promedio de polímeros de PEG activados conjugados con la proteína; y N es un nitrógeno de la proteína.
5. Un método para preparar una proteína nitroxilada que comprende reaccionar la proteína con un agente de nitroxilación de la fórmula (II) donde cada Ri, R2, R3, y R4 es independientemente alquilo Ci~C4; X es oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio; Y es CH2; y m es O o 1.
6. Un método para preparar una proteina nitroxilada que comprende reaccionar la proteina con un agente de nitroxilación de la fórmula (IV): donde cada Ri, R2, R3, y R4 es independientemente alquilo Ci~ Y es CH2; y m es 0 o 1.
7. Un agente de nitroxilación, proteina de nitroxilación, o método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada una de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
8. Un agente de nitroxilación de las reivindicaciones 1 o 7, donde n es 1.
9. Un agente de nitroxilación de la reivindicación 8, donde X es oxigeno o azufre.
10. Un agente de nitroxilación de la reivindicación 8, donde X es oxigeno.
11. Un agente de nitroxilación de la reivindicación 8, donde X es oxigeno y cada uno de Ri, R2, R3, y R4 es -CH3.
12. Un agente de nitroxilación de las reivindicaciones 1 o 7, donde n es 0.
13. Un agente de nitroxilación, proteina de nitroxilación o método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde m es 0.
14. Un agente de nitroxilación, proteina de nitroxilación o método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde m es 1.
15. Un agente de nitroxilación de la reivindicación 1 que se selecciona del grupo que consiste en:
16. Un agente de nitroxilación de la reivindicación 1, donde el agente de nitroxilación es:
17. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 7, 13 y 14, donde la base orgánica comprende trietilamina (TEA), N,N- diisopropiletilamina, 4-dimetilaminopiridina, piridina, N- metilpiperidina, o una combinación de estos.
18. Un método de la reivindicación 17, donde la base orgánica comprende trietilamina.
19. Un método de la reivindicación 18, donde el compuesto de la fórmula (III), el carbonato de N,N'-disuccinimidilo y la trietilamina están presentes en una relación de alrededor de 1:2:3.
20. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 7, 13, 14 y 17-19, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C.
21. Un método de la reivindicación 20, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 15 °C a alrededor de 25 °C.
22. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 7, 13, 14 y 17-21, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 4°C.
23. Un método de la reivindicación 21, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 20 °C.
24. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 7, 13, 14 y 17-23, donde se dejó que la reacción continuara por alrededor de tres a alrededor de seis horas.
25. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 7, 13, 14 y 17-24, donde la reacción se lleva a cabo en un solvente aprótico polar.
26. Un método de la reivindicación 25, donde el solvente aprótico polar comprende acetonitrilo (ACN), tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo (EtOAc), acetona, dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO) o una combinación de estos.
27. Un método de la reivindicación 26, donde el solvente aprótico polar comprende acetonitrilo.
28. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 13 y 14, donde el compuesto de la fórmula (IV), la N-hidroxisuccinamida y la N,N'-diciclohexilcarbodiimida están presentes en una relación molar de alrededor de 1:1,1:1,1.
29. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, donde m es 0.
30. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, donde m es 1.
31. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 13, 14 y 28-30, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C.
32. Un método de la reivindicación 31, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 15 °C a alrededor de 25 °C.
33. Un método de la reivindicación 31, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 4 °C.
34. Un método de la reivindicación 31, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 20 °C.
35. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 13, 14 y 28-34, donde se dejó que la reacción continuara por alrededor de 6 a alrededor de 24 horas.
36. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 13, 14 y 28-35, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,2 a alrededor de 7,6.
37. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 13, 14 y 28-36, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,4.
38. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29 y 30, donde el grupo amino de extremo N de la proteina está nitroxilado.
39. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29 y 30, donde al menos un grupo amino épsilon (e) de un residuo de lisina está nitroxilado.
40. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29, 30, 38 y 39, donde p es alrededor de 1 a alrededor de 25.
41. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29, 30, 38 y 39, donde p es alrededor de 2.
42. Una proteina nitroxilada de la reivindicación 41, donde p es al menos alrededor de 10.
43. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 40, donde p es alrededor de 15 a alrededor de 20.
44. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29, 30 y 38-43, donde la proteína comprende una subunidad a de hemoglobina (Hb), una subunidad b de hemoglobina, un tetrámero de hemoglobina, una mioglobina o una albúmina.
45. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 44, donde la proteína comprende una albúmina de suero.
46. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 45, donde albúmina de suero comprende albúmina de suero humano (HSA).
47. La proteína nitroxilada de la reivindicación 44, donde la proteina comprende una subunidad a de hemoglobina o una subunidad b de hemoglobina o un tetrámero de hemoglobina.
48. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 44, donde la proteína comprende una subunidad a de hemoglobina humana, una subunidad b de hemoglobina humana o un tetrámero de hemoglobina que comprende subunidades a de hemoglobina y subunidades b de hemoglobina.
49. Una proteína nitroxilada de ' cualquiera de las reivindicaciones 44, 47 o 48, donde el tetrámero de hemoglobina comprende un dímero aa reticulado o un dímero bb reticulado.
50. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 49, donde la proteína nitroxilada comprende una subunidad a de hemoglobina humana.
51. La proteína nitroxilada de la reivindicación 50, donde la subunidad a de hemoglobina humana está nitroxilada en el grupo amino a del residuo de valina de extremo N.
52. La proteína nitroxilada de la reivindicación 50 o 51, donde la subunidad a de hemoglobina humana se nitroxila en el grupo amino e de un residuo de lisina que se selecciona del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61, lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139, y una combinación de estos.
53. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 50, donde la proteína nitroxilada comprende una subunidad b de hemoglobina humana.
54. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 53, donde la subunidad b de hemoglobina humana.· está nitroxilada en el grupo amino a del residuo de valina de extremo N.
55. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 53 o 54, donde la subunidad a de hemoglobina humana se nitroxila en el grupo amino e de un residuo de lisina que se selecciona del grupo que consiste lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina-66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144 y una combinación de estos
56. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 44-55, donde la proteína comprende tetrámero de hemoglobina y el tetrámero de hemoglobina comprende alrededor de diecisiete grupos amino nitroxilados.
57. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29, 30 y 38-56, donde la proteína nitroxilada se conjuga con un óxido de polialquileno (PAO).
58. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 57, donde el PAO es un polietilenglicol (PEG).
59. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 58, donde el PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
60. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 58, donde el PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 3.000 a alrededor de 10.000 Daltons.
61. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 58, donde el PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 4.000 a alrededor de 6.000 Daltons.
62. La proteina nitroxilada de la reivindicación 61, donde el PEG presenta un peso molecular promedio de alrededor de 5.000 Daltons.
63. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 58-62, donde el PEG es una maleimida-PEG.
64. Una proteina nitroxilada de la reivindicación 63, donde la maleimida se encuentra unida al PEG a través de un enlazador alquileno o fenileno.
65. Una proteina nitroxilada de la reivindicación 64, donde el enlazador alquileno es un enlazador etileno.
66. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 63-65, donde la maleimida-PEG se conjuga con un resto tiol de la proteina seleccionada de un grupo que consiste en un resto de tiol intrínseco de un residuo cisteína de la proteína, un resto tiol de un residuo lisina tiolada de la proteína o una combinación de ellos.
67. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 66, donde la maleimida-PEG conjugada con un resto tiol intrínseco de un residuo de cisteína o conjugado con un resto tiol de un residuo de lisina tiolado tiene la estructura (VIII) donde Z representa la proteina, S es un tiol de la proteina, R3 es un grupo alquileno o fenileno, X es un grupo terminal, m es la cantidad promedio de polímeros de PEG activados conjugado con la proteína, y n representa la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20000 Daltons.
68. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 67, donde R3 es etileno.
69. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 67 o 68, donde m es alrededor de 6 a alrededor de 10.
70. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 67-69, donde X es metoxi (-OCH3) o carboxilato (-COOH).
71. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 63-70, donde la maleimida-PEG se conjuga con un resto tiol de un residuo de cisteína-93 de una subunidad b de hemoglobina.
72. Una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 63-71, donde la maleimida-PEG se conjuga con un resto tiol de un residuo de lisina tiolado de una subunidad a o subunidad b de hemoglobina.
73. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 72, donde el residuo de lisina tiolada es un residuo de lisina tiolada de una subunidad a de hemoglobina humana seleccionada del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61, lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139 y una combinación de estas.
74. Una proteína nitroxilada de reivindicación 72, donde el residuo de lisina tiolado es un residuo de lisina tiolado de una subunidad b de hemoglobina seleccionada del grupo que consiste en lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina-66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144 y una combinación de estos.
75. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 58-62, donde el PEG es un PEG valerato succinimidilo (SVA-PEG).
76. Una proteina nitroxilada de la reivindicación 75, donde el SVA-PEG se conjuga con un resto amino de la proteina seleccionada de un resto amino e de una residuo de lisina de la proteina, un resto amino a de un residuo de valina terminal de la proteina o una combinación de estos.
77. Una proteina nitroxilada de la reivindicación 76, donde el SVA-PEG conjugado con un resto amino e de un residuo de lisina de la proteína, un resto amino a de un resid.uo de valina terminal de la proteína tiene la estructura (IX) donde: Z es la proteina, N es un grupo amino de la proteina X es un grupo terminal, m es la cantidad de polímeros de PEG activados conjugado con la proteína, y n es la cantidad promedio de unidades de oxietileno de un PEG gue tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 a alrededor de 20.000 Daltons.
78. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 77, donde X es metoxi (-OCH3) o carboxilato (-COOH).
79. Una proteína nitroxilada de la reivindicación 77 o 78, donde m es en promedio de alrededor de 6 a alrededor de 10 moléculas de PAO por tetrámero.
80. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 75-79, donde el SVA-PEG se conjuga con un resto amino e de un residuo de lisina de una subunidad OÍ O subunidad b de hemoglobina.
81. Una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 75-80, donde el SVA-PEG se conjuga con un resto amino a de un residuo de valina terminal de una subunidad a o subunidad b de hemoglobina.
82. Una proteina nitroxilada de la reivindicación 80 u 81, donde el residuo de lisina es un residuo de lisina de una subunidad a de hemoglobina humana seleccionada del grupo que consiste en lisina-7, lisina-11, lisina-16, lisina-40, lisina-56, lisina-60, lisina-61, lisina-90, lisina-99, lisina-127, lisina-139 y una combinación de estas.
83. Una proteina nitroxilada de reivindicación .80 u 81, donde el residuo de lisina es un residuo de lisina de una subunidad b de hemoglobina seleccionada del grupo que consiste en lisina-8, lisina-17, lisina-59, lisina-61, lisina-65, lisina-66, lisina-82, lisina-95, lisina-120, lisina-132, lisina-144 y una combinación de estos.
84. Un tetrámero de hemoglobina que comprende al menos una subunidad a de cualquiera de las reivindicaciones 44, 47, 48, 50-52, 57-70, 72, 73 y 75-82 o al menos una subunidad b de cualquiera de las reivindicaciones 44, 47, 48, 53-55, 57-72, 74-81 y 83.
85. El tetrámero de hemoglobina de la reivindicación 84 que comprende al menos una subunidad a de cualquiera de las reivindicaciones 44, 47, 48, 50-52, 57-70, 72, 73 y 75-82 y al menos una subunidad b de cualquiera de las reivindicaciones 44, 47, 48, 53-55, 57-72, 74-81 y 83.
86. El tetrámero de hemoglobina de la reivindicación 85 que comprende dos subunidades a de cualquiera de las reivindicaciones 44, 47, 48, 50-52, 57-70, 72, 73 y 75-82 y dos subunidades b de cualquiera de las reivindicaciones 44, 47, 48, 53-55, 57-72, 74-81 y 83.
87. Un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las reivindicaciones 84-86, donde la hemoglobina se conjuga con un promedio de 5 a 10 moléculas de PAO por tetrámero.
88. Un tetrámero de hemoglobina de la reivindicación 87, donde la hemoglobina se conjuga con un promedio de alrededor de 7,1 a 8,9 moléculas de PAO por tetrámero.
89. Un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las ivindicaciones 84-88, donde la hemoglobina está oxigenada
90. Un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las reivindicaciones 84-89, donde la hemoglobina está desoxigenada.
91. Un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las reivindicaciones 84-90, donde la hemoglobina está ligada con CO, NO, o una mezcla de CO y NO.
92. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29 y 30, donde la relación del agente de nitroxilación se presenta en un exceso molar de alrededor de 5 veces a alrededor de 100 veces sobre la proteína.
93. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92, donde la proteína comprende una subunidad a o b de un tetrámero de hemoglobina.
94. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30, 92 y 93, donde la proteina comprende un tetrámero de hemoglobina.
95. Un método de la reivindicación 94, donde el tetrámero de hemoglobina es un tetrámero de hemoglobina no oxigenado
96. Un método de la reivindicación 95, donde el tetrámero de hemoglobina no oxigenado es un tetrámero de hemoglobina ligado con CO.
97. Un método de la reivindicación 95, donde el tetrámero de hemoglobina es un tetrámero de hemoglobina desoxigenado.
98. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-97, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C.
99. Un método de la reivindicación 98, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 15 °C a alrededor de 25 °C.
100. Un método de la reivindicación 98, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 8 °C.
101. Un método de la reivindicación 98, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 4 °C.
102. Un método de la reivindicación 98, donde la reacción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 20 °C.
103. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-102, donde se dejó que la reacción continuara por alrededor de tres a alrededor de 20 horas.
104. Un método de la reivindicación 103, donde se deja que la reacción continúe por alrededor de tres a seis horas.
105. Un método de la reivindicación 103, donde se deja que la reacción continúe por alrededor de 16 horas.
106. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-105, donde la reacción se lleva a cabo en un solvente acuoso.
107. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-106, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5.
108. Un método de la reivindicación 107, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,5.
109. Un método de la reivindicación 107, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,2.
110. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30, 92-109, donde la proteina comprende un tetrámero de hemoglobina, la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,2 y una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 8 °C y se deja continuar por alrededor de dieciséis horas, y donde el método proporciona un tetrámero de hemoglobina nitroxilado que tiene alrededor de 17 grupos amino nitroxilados.
111. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-110, donde la proteina comprende un tetrámero de hemoglobina, y el agente de nitroxilación está presente a un exceso molar de alrededor de 10 a alrededor de 100 veces sobre el tetrámero de hemoglobina.
112. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-111, donde el producto de la reacción es una proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29, 30 y 38-83 o un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las reivindicaciones 84-91.
113. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, 13, 14, 29, 30 y 92-112, que comprende además conjugar la proteina con un óxido de polialquileno (PAO).
114. Un método de la reivindicación 113, que comprende además: agregar PAO valerato succinimidilo a la proteina en el diluyente acuoso para formar una proteina conjugada con PAO-valerato.
115. Un método de la reivindicación 113, que comprende además: mezclar la proteina con 2-iminotiolano (2-IT) en un diluyente acuoso para formar una proteina tiolada; y agregar PAO-maleimida a la proteina tiolada en el diluyente acuoso para formar una proteina conjugada de PAO-maleimida.
116. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 113-115, donde la proteina comprende un tetrámero de hemoglobina.
117. Un método de la reivindicación 113 o 116, donde el tetrámero de hemoglobina comprende un dimero aa reticulado o un dimero bb reticulado.
118. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-117, donde el 2-iminitiolano está presente a una concentración de exceso molar de alrededor de 7 a alrededor de 15 veces sobre la concentración de la proteína.
119. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-117, donde el 2-iminotiolano está presente a una concentración de exceso molar de alrededor de 7 a alrededor de 8 veces sobre la concentración de la proteína.
120. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-117, donde el 2-iminotiolano está presente a una concentración de exceso molar de alrededor de 7-.5 veces sobre la concentración de la proteína.
121. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-120, donde el PAO-maleimida está presente a una concentración de exceso molar de alrededor'de,9 a alrededor de 20 veces sobre la concentración de la proteína.
122. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-120, donde el PAO-maleimida está presente a una concentración de exceso molar de alrededor de 9 a alrededor de 15 veces sobre la concentración de la proteína.
123. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-120, donde el PAO-maleimida está presente a una concentración de exceso molar de alrededor de 12 veces sobre la concentración de la proteina.
124. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-123, donde la etapa de tiolación se lleva a cabo a un pH de entre alrededor de 7 a alrededor de 9.
125. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-123, donde la etapa de tiolación se lleva a cabo a un pH de entre alrededor de 8,5.
126. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-125, donde la etapa de agregar PAO-maleimida a la proteina tiolada para formar una,proteina conjugada PAO-maleimida se lleva a cabo a un pH de entre alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5.
127. El método de cualquiera de las reivindicaciones 115-125, donde la etapa de agregar PAO-maleimida a la proteina tiolada para formar una proteina conjugada PAO-maleimida se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7,5.
128. El método de cualquiera de las reivindicaciones 113-127, donde la proteína se conjuga con PAO antes de la nitroxilación de la proteína.
129. El método de la reivindicación 115-128, donde la etapa de agregar el PAO-maleimida a la proteína tiolada para formar una proteína conjugada de PAO-maleimida se realiza simultáneamente con la nitroxilación de la proteína.
130. El método de la reivindicación 114-129, donde la etapa de agregar el PAO valerato succinimidilo a la proteína para formar una proteína conjugada de PAO-valerato se realiza simultáneamente con la nitroxilación de la proteína.
131. Una composición farmacéutica que comprende una proteína nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29, 30 y 38-83 o un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las reivindicaciones 84-91 y un portador farmacéuticamente aceptable.
132. Una composición farmacéutica de la reivindicación 131, donde la composición es normooncótica con la sangre.
133. Una composición farmacéutica de reivindicación 131 o 132, donde la composición es hiperoncótica en comparación con la sangre.
134. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-133, donde el portador farmacéuticamente aceptable comprende un diluyente acuoso.
135. Una composición farmacéutica de la reivindicación 134, donde el diluyente acuoso comprende una solución acuosa de una solución acuosa o un coloide de un componente que no transporta oxigeno.
136. Una composición farmacéutica de la reivindicación 134 o 135, donde el diluyente acuoso comprende una solución sin células acuosa.
137. Una composición farmacéutica de ,cualquiera de las reivindicaciones 134-136, donde el diluyente acuoso comprende una solución acuosa de proteínas, una solución acuosa de glicoproteínas, una solución acuosa de polisacáridos o una combinación de estos.
138. Una composición farmacéutica de cualquiera de las 134-137, donde el diluyente acuoso comprende una solución sin células acuosa de albúmina.
139. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-138, donde el portador farmacéuticamente aceptable comprende suero fisiológico, una mezcla de solución salina-glucosa, solución de Ringer, solución de Ringer lactada, solución de Locke-Ringer, solución de Krebs-Ringer, solución salina de Hartmann balanceada, solución de dextrosa-ácido citrico-citrato de sodio heparinizada, una solución de acetato, una solución de electrolitos múltiple, una solución de lactobionato, un sustituto de plasma polimérico o una combinación de estas.
140. Una composición farmacéutica de la reivindicación 139, donde el sustituto de plasma polimérico comprende óxido de polietileno, pirrolidona de polivinilo, alcohol de polivinilo, un condensado de óxido de etileno-propilenglicol o una combinación de estos.
141. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-140, donde el portador farmacéuticamente aceptable comprende un relleno, una sal, un amortiguador fisiológico, un carbohidrato, un alcohol, un polialcohol, un antioxidante, un agente antibacteriano, un agente de presión oncótica, un agente reductor, o una combinación de estos.
142. La composición farmacéutica de la reivindicación 141 donde el agente reductor comprende, ácido ascórbico, glutationa, N-acetilcisteina, o una combinación de estos.
143. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-142 para su uso en el tratamiento de insuficiencia hepática aguda, beta talasemia, una quemadura, isquemia aguda crónica de las extremidades, intoxicación con dióxido de carbono o cianuro, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardiaca congestiva, hipoxia, malaria, isquemia orgánica, enfermedad vascular periférica, porfiria, preeclampsia en el embarazo, sepsis, anemia falciforme, enfermedades de la retina, una afección infraocular, torsión testicular, traumatismo, shock, traumatismo cerebral, úlceras, vasoespasmos o una combinación de ellos.
144. Una composición farmacéutica de la reivindicación 143 en que la isquemia orgánica comprende isquemia intestinal aguda (torsión), isquemia intestinal aguda (embolia), shock cardiogénico, isquemia orgánica vascular aguda, apoplejía, infarto de miocardio o isquemia cardíaca grave.
145. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-142 para su uso en el tratamiento del shock hemorrágico sin traumatismo, traumatismo prehospitalario, shock hemorrágico por traumatismo, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, lesión cerebral por traumatismo, apoplejía, cáncer de tumor sólido, degradación orgánica (ex vivo) , degradación orgánica (en receptor), sepsis aguda, shock séptico, infarto de miocardio, isquemia cardíaca, shock cardiogénico, insuficiencia cardíaca aguda, embolia pulmonar o una combinación de ellos.
146. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-142 para ser utilizadas como adjunto a la angioplastía, adjunto a la cirugía plástica o como adjunto a la implantación de un dispositivo de asistencia ventricular; como un sustituto de la sangre, cardioprotectores, crioconservantes, adjuntos a la hemodiálisis, un agente oncológico, un conservante de órganos, un agente de mejora de rendimiento, un adjunto a la cirugía o un agente de cicatrización de heridas; en imaginología; para mejorar la función pulmonar o una combinación de ellos.
147. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-142 para el tratamiento veterinario de pérdida de sangre por heridas, anemia hemolitica, anemia infecciosa, infecciones bacterianas, fragmentación del Factor IV, hiperesplenia y esplenomegalia, síndrome hemorrágico aviar, anemia hipoplástica, anemia aplásica, afecciones hemolíticas inmunitarias idiopáticas, deficiencia de hierro, anemia hemolitica isoinmunitaria, anemia hemolitica microangiopática, parasitismo o daño cerebral provocado por la anestesia administrada para procedimientos quirúrgicos.
148. Un método de tratamiento que comprende la administración a un sujeto que lo necesite de un tetrámero de hemoglobina de cualquiera de las reivindicaciones 84-91 o una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-147.
149. Un método de tratamiento de la,reivindicación 148, donde el sujeto es un animal.
150. El método de tratamiento de la reivindicación 149, donde el sujeto es un ser humano.
151. Un método de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 148-150 en que el método es un método para el tratamiento de insuficiencia hepática aguda, beta talasemia, un^ quemadura, isquemia aguda crónica de las extremidades, intoxicación con dióxido de carbono o cianuro, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardiaca congestiva, hipoxia, malaria, isquemia orgánica enfermedad vascular periférica, porfiria, preeclampsia en el embarazo, sepsis, anemia fálciforme, enfermedades de la retina, una afección .infraocular, torsión testicular, traumatismo, shock, traumatismo cerebral, úlceras, vasoespasmos o una combinación de ellos.
152. El método de tratamiento de la reivindicación 151 en que la isquemia orgánica comprende isquemia intestinal aguda (torsión), isquemia intestinal aguda (embolia), shock cardiogénico, isquemia orgánica vascular aguda, apoplejía, infarto de miocardio o isquemia cardíaca grave.
153. Un método de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 148-150 en que el método es un método para el tratamiento del shock heroorrágico sin traumatismo, traumatismo prehospitalario, shock hemorrágico por traumatismo, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, lesión cerebral por traumatismo, apoplejía, cáncer de tumor sólido, degradación orgánica (ex vivo) , degradación orgánica (en receptor), sepsis aguda, shock séptico, infarto de miocardio, isquemia cardiaca, shock cardiogénico, insuficiencia cardiaca aguda, embolia pulmonar o una combinación de ellos.
154. Un método de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 148-150 en que el tetrámero de la hemoglobina o la composición farmacéutica se administran como adjunto a laangioplastía, como adjunto a la cirugía plástica o como adjunto a la implantación de un dispositivo de asistencia ventricular; como sustitutos de sangre, cardioprotectores, crioconservantes, adjunto a a la hemodiálisis, agentes oncológicos, conservantes de órganos, un agente de mejora de rendimiento, adjunto a la cirugía o un agente de cicatrización de heridas; en imaginología; para mejorar la función pulmonar o una combinación de ellos.
155. Un método de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 148-150 en que el tetrámero de hemoglobina o la composición farmacéutica se administran como adjunto a la angioplastia, como adjuntos a las reparaciones de la aorta torácica, como adjuntos al bypass cardiopulmonar o como una solución de cebado para el bypass cardiopulmonar.
156. Un método de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 148 o 149 en que el sujeto es un animal no humano y el método es un método para el tratamiento veterinario de pérdida de sangre por heridas, anemia hemolítica, anemia infecciosa, infecciones bacterianas, fragmentación del Factor IV, hiperesplenia y esplenomegalia, síndrome hemorrágico aviar, anemia hipoplástica, anemia aplásica, afecciones hemolíticas inmunitarias idiopáticas, deficiencia de hierro, anemia hemolítica isoinmunitaria, anemia hemolítica microangiopática, parasitismo o daño cerebral provocado por la anestesia administrada para procedimientos quirúrgicos.
157. Un método para la administración de oxígeno, óxido nítrico, monóxido de carbono o mezclas de ellos al tejido y la reducción de nitrito a óxido nítrico (NO) en la microvasculatura, el método comprende la administración de la proteina nitroxilada de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 13, 14, 29 30 y 38-83 o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 131-147 a un sujeto que lo necesite, en que tras la administración, 1 la hemoglobina se desliga y convierte nitrito en óxido nítrico en la microvasculatura.
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